KR102363768B1

KR102363768B1 - 세파졸린 생산성이 증가된 페니실린 g 아실라제 변이체 및 이의 이용

Info

Publication number: KR102363768B1
Application number: KR1020190147086A
Authority: KR
Inventors: 신용철; 박철; 왕은선; 윤영성; 김나리; 강미숙
Original assignee: 아미코젠주식회사
Priority date: 2019-11-15
Filing date: 2019-11-15
Publication date: 2022-02-16
Also published as: KR20210059533A; CN115397979A; WO2021096298A1

Abstract

본 발명은 세파졸린 생산성이 증가된 페니실린 G 아실라제 변이체 및 이의 이용에 관한 것으로, 본 발명에서 개시하는 특유의 변이 형태를 지니는 Achromobacter sp. CCM 4824 유래 페니실린 G 아실라제 변이체들은, 이의 야생형 효소 및 기존에 알려진 다른 변이형태 대비, 특이적으로 세파졸린에 대한 합성활성이 매우 높으면서도, 세파졸린 합성에 사용되는 기질에 대한 분해활성 대비 합성비율(S/H ratio)이 현저히 높아, 산업적 적용에 있어서 유의한 수준으로 세파졸린 생산성이 현저하게 증가된 것이 특징이다.

Description

세파졸린 생산성이 증가된 페니실린 G 아실라제 변이체 및 이의 이용{Mutants of penicillin G acylase with increased production of cefazolin, and uses thereof}

본 발명은 세파졸린 생산성이 증가된 페니실린 G 아실라제 변이체 및 이의 이용에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 알파 서브유닛; 및 서열번호 2로 표시되는 베타 서브유닛을 포함하는 야생형 페니실린 G 아실라제 단백질(Achromobacter sp. CCM 4824 유래) 서열 중에서, A116αT, I156αN, N169αT, M3βV, S54βG, T64βA, H173βN, T251βA, T388βA, R478βH, E486βA, D541βE 및 Y555βC로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 변이 페니실린 G 아실라제, 및 이를 이용한 세파졸린의 합성(제조) 방법에 대한 것이다.

반합성 β-락탐 화합물의 합성 과정에는 β-락탐 핵 구조를 보유하는 화합물과 여기에 결합되어 측쇄가 될 화합물(아실 공여체)이 기질로 사용된다. 상기 기질 혼합물에 페니실린 G 아실라제를 넣어줌에 따라 활성화된 측쇄와 β-락탐 핵의 효소적 커플링(coupling) 반응이 일어나는데, 페니실린 G 아실라제 효소는 활성화된 측쇄(즉 아실 공여체)로부터 β-락탐 핵으로의 아실기의 전이(아실화)를 촉진한다. 한편 상기 효소는 아실 공여체로 사용되는 활성화된 측쇄와 합성된 β-락탐 화합물을 가수분해하는 활성 또한 보유하고 있어, 반합성 β-락탐 화합물의 생산성에 문제가 된다. 특히 산업적 및 경제적 측면에서 기질들을 1:1의 비율로 하여 합성반응을 시키는 것이 생산공정 및 생산 효율에 있어서 유리한 것임을 고려하였을 때, 특히 기질 분해 반응을 낮추어 더 많은 기질이 합성 반응에 사용될 수 있도록 하는 것이 중요한 해결 과제이다.

특히, 기존 세파졸린의 효소적 합성법에서는 통상적으로 반응 물질로서 TzAA에 메틸, 에틸, 프로필 등의 그룹을 결합시킨 에스테르 화합물을 사용하여 오고 있다. 통상적인 기존의 방법 및 수단에 따라 TzAA의 에스테르 화합물 및 MMTD-7-ACA로 부터 세파졸린을 합성하는 경우에는, 페니실린 지 아미다제(페니실린 G 아실라제)의 효소 활성에 의해 합성이 진행됨과 동시에 TzAA의 에스테르 화합물이 자연적으로 가수분해되며, 즉 생촉매로서 사용되는 페니실린 지 아미다제(페니실린 G 아실라제)가 한편으로는 가수분해 작용을 하여 테트라졸-1-아세트산과 상응하는 알콜로 분해하는 반응이 경쟁적으로 일어나게 된다. 이러한 반응의 구체적 일례를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 보는 바와 같이 효소반응으로 세파졸린을 합성(S)하기 위한 기질로는, 일례로 테트라졸릴 아세틱 애시드 메틸 에스터 (tetrazolyl acetic acid methyl ester, 본 명세서에서 “TzAAMe”라 약칭함)와 7-아미노-3-(2-메틸-1,3,4-티아디아졸-5-일)-티오메틸-3-세펨-4-카르복실 애시드 (7-amino-3-(2-methyl- 1,3,4-thiadiazol-5-yl)-thiomethyl-3-cephem-4-carboxylic acid, 본 명세서에서 “TDA”라 약칭함)가 사용될 수 있다. 기질인 TzAAMe는 효소에 의해 가수분해되어 테트라졸릴 아세틱 애시드(tetrazolyl acetic acid, 본 명세서에서 “TzAA”라 약칭함)으로 전환되기도 하며(H1), 합성된 세파졸린도 효소에 의해 가수분해(H2)되어 TzAA가 만들어지기도 한다. 따라서 세파졸린의 생산성을 높이기 위해서는 합성반응(S)은 높이고, 분해반응(H1, H2)를 낮추는 것이 중요하다.

따라서, 가급적 가수분해되는 비율을 줄여줌으로써 TzAA 에스테르 화합물의 사용량을 절감할 수 있는데, 이와 같이 가수분해 비율을 줄이기 위해서는 효소 반응을 가능한 한 낮은 pH 에서 진행시키는 것이 바람직한 것으로 알려졌으나 이 방법은 세파졸린 합성 반응의 최적 조건과 MMTD-7-ACA의 용해도 문제때문에 제약을 받으므로, 지금까지는 세파졸린 합성시 TzAAMe를 MMTD-7-ACA 에 대해서 당량비로 2 배 이상 가하여 반응을 진행시키는 방법을 사용하여 오기도 하였다.

또한 같은 효소를 사용한다고 하여도, 구체적 항생제 종류에 따라서는 그 합성 수율에 현격한 차이가 발생할 수 있다. cephalexin, cefaclor 및 cephradine과 같이 benzyl ring을 보유하는 구조의 항생제와 amoxicillin, cefadroxil 및 cefprozil과 같이 phenolic ring을 보유하는 구조의 항생제들은 구조적으로 유사성이 높으나, 세파졸린의 경우 tetrazole ring을 보유하는 구조로서, 전술한 항생제들과는 구조적으로 차이가 상당하기 때문에, 같은 효소를 사용하더라도 세파졸린의 수득 효율이 상대적으로 현격히 낮은 상황이 발생된다. 일례로 KR101985911 문헌(특허문헌 1)에 개시된 효소의 경우, 세파렉신, 세프프로질, 세파클로르, 세프라딘, 세파드록실 및 아목시실린의 반합성 β-락탐계 항생물질들에 대하여 고효율의 다중 합성능을 가져 우수한 생산성을 가지는 것으로 알려졌지만, 세파졸린에 대해서는 산업적인 수준으로 효용성이 있을 정도로 현격히 생산성 효율을 높이지는 못하였다. 아직까지 산업적 수준이 적용에 충분할 정도로 세파졸린 생산성이 높은 효소는 알려지지 않았다.

KR

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B

이에 본 발명자들은 세파졸린 생산성을 높일 수 있는 방법을 연구하던 중, 본원 발명에서 개시하는 특유의 변이를 보유하는 페니실린 G 아실라제 변이체가 야생형(Achromobacter sp. CCM 4824 균주 로부터 유래) 대비 특이적으로 세파졸린에 대한 합성능이 현저히 증가되었을 뿐만 아니라 S/H 비가 현저히 높은 수준으로 개선되어, 세파졸린에 대한 고효율의 생산성을 가지는 것을 확인하여 본원 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은, 서열번호 1로 표시되는 알파 서브유닛; 및 서열번호 2로 표시되는 베타 서브유닛을 포함하는 야생형 페니실린 G 아실라제 단백질 서열 중에서, A116αT, I156αN, N169αT, M3βV, S54βG, T64βA, H173βN, T251βA, T388βA, R478βH, E486βA, D541βE 및 Y555βC로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 변이 페니실린 G 아실라제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 변이 페니실린 G 아실라제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 발현벡터에 의해 형질전환 된 숙주세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 본원 발명의 변이 페니실린 G 아실라제를 포함하는 세파졸린(cefazolin) 제조용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 테트라졸릴아세트산 에스테르와 3-[5-메틸-1,3,4-티오디아졸-2-일]-7-아미노세팔로스포린산으로부터 세파졸린(cefazolin)을 효소적으로 합성하는 방법에 있어서, 상기 본원 발명의 변이 페니실린 G 아실라제를 사용하는 것을 특징으로 하는 세파졸린의 효소적 합성(제조) 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

서열번호 1로 표시되는 알파 서브유닛; 및 서열번호 2로 표시되는 베타 서브유닛을 포함하는 야생형 페니실린 G 아실라제 단백질 서열 중에서, A116αT, I156αN, N169αT, M3βV, S54βG, T64βA, H173βN, T251βA, T388βA, R478βH, E486βA, D541βE 및 Y555βC로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 변이 페니실린 G 아실라제를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 변이 페니실린 G 아실라제를 암화화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 발현벡터에 의해 형질전환 된 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 본원 발명의 변이 페니실린 G 아실라제를 포함하는 세파졸린(cefazolin) 제조용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 테트라졸릴 아세트산 에스테르와 3-[5-메틸-1,3,4-티오디아졸-2-일]-7-아미노세팔로스포린산으로부터 세파졸린(cefazolin)을 효소적으로 합성하는 방법에 있어서, 상기 본원 발명의 변이 페니실린 G 아실라제를 사용하는 것을 특징으로 하는 세파졸린의 효소적 합성(제조) 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 명세서에서 용어 "단백질"은 "폴리펩타이드(polypeptide)" 또는 “펩타이드(peptide)"와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.

본 발명에서 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드" 는 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다.

본 명세서에서 용어 "발현(expression)"이라 함은 세포에서 단백질 또는 핵산의 생성을 의미한다.

본 명세서에 사용된 아미노산의 일문자(삼문자)는 생화학 분야에서의 표준 약어 규정에 따라 다음의 아미노산을 의미한다: A(Ala): 알라닌; C(Cys): 시스테인; D(Asp):아스파르트산; E(Glu): 글루탐산; F(Phe): 페닐알라닌; G(Gly): 글라이신; H(His): 히스티딘; I(IIe): 이소류신; K(Lys): 라이신; L(Leu): 류신; M(Met): 메티오닌; N(Asn): 아스파라긴; P(Pro): 프롤린; Q(Gln): 글루타민; R(Arg): 아르기닌; S(Ser): 세린; T(Thr): 트레오닌; V(Val): 발린; W(Trp): 트립토판; Y(Tyr): 티로신.

본 명세서에 표기되는 "(아미노산일문자)(아미노산위치)(아미노산일문자)"는 천연형(야생형) 폴리펩타이드의 해당 아미노산 위치에서 선행 표기된 아미노산이 후행 표기된 아미노산으로 치환된다는 것을 의미한다. 예를 들면, I156αN는 천연형 폴리펩타이드 α-서브유닛(본 발명에서, 서열번호 1의 야생형 APA α-서브유닛)의 156번에 해당하는 이소류신이 아스파라긴으로 치환된다는 것을 가리키며, M3βV는 천연형 폴리펩타이드 β-서브유닛(본 발명에서, 서열번호 2의 야생형 APA β-서브유닛)의 3번째 메티오닌이 발린으로 치환되는 것을 의미한다.

본 명세서에서 용어 MMTD-7-ACA는, MMTD(Mercepto-5-methyl-1,3,4- thiadiazole)과 7-ACA(7- amino cephalosporanic acid)의 반응 산물을 의미하는 것으로서,‘3-[5-메틸-1,3,4-티오디아졸-2-일]-7-아미노세팔로스포린산’등 으로도 표기된다. 이는 세파졸린 항생제 합성 반응에 있어서 기질로 사용되며 β-락탐 핵구조를 보유하는 화합물이다. 상기 MMTD와 7-ACA 반응 산물은 당업계에 여러 가지 표현으로 알려져 있으나, 본 발명에서는 당업계에 실질적으로 동등한 것으로 간주되는 물질들을 모두 포함하는 의미이다. 이에 제한되지 않으나, 본 발명에서 일례로 바람직하게 TDA(7-amino-3-(2-methyl- 1,3,4-thiadiazol-5-yl)-thiomethyl-3-cephem-4-carboxylic acid)가 사용될 수 있다.

본 명세서에서 용어 ‘TzAA 에스테르’화합물은 ‘테트라졸릴 아세트산 에스테르’를 의미하는 것으로, TzAA에 메틸, 에틸, 프로필 등의 그룹을 결합시킨 에스테르 화합물을 의미하며, 본 명세서에서 ‘테트라졸-1-아세트산 에스테르’등으로도 표기될 수 있다. 이는 세파졸린 합성 반응에서 기질로 사용되며 아실 공여체 역할을 한다. 상기 ‘TzAA 에스테르’화합물은 이에 제한되지 않으나, 본 발명에서 일례로 바람직하게 TzAAMe(테트라졸-1-아세트산 메틸에스테르)가 사용될 수 있다.

본 발명은, 세파졸린에 대한 생산성이 증가된 Achromobacter sp . CCM 4824 유래 페니실린 G 아실라제 변이체를 제공한다.

본 명세서에서 Achromobacter sp. CCM 4824 유래 페니실린 G 아실라제 단백질을‘APA’로 칭하였으며, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 유전자 서열을 ‘apa’로 표기하였다.

Achromobacter sp. CCM 4824 유래 페니실린 G 아실라제(APA) 야생형은 서열번호 1로 표시되는 α-서브유닛과 서열번호 2로 표시되는 β-서브유닛을 포함한다. 구체적으로 야생형 APA는, 전구체(precursor)형으로서 서열번호 1로 표시되는 알파 서브유닛과 서열번호 2로 표시되는 베타 서브유닛이 스페이서 펩타이드(spacer peptide, 예를들어 서열번호 3)에 의하여 연결되어 구성된 단일 사슬 폴리펩티드(예를들어, 서열번호 4)로서 발현되며, 그 후 세포 내에서 자기 촉매적 프로세싱(autocatalytic processing)을 통해 스페이서 펩타이드가 제거되어 상기 알파 서브유닛과 베타 서브유닛으로 구성된 성숙형(mature)의 활성 이량체 형태를 갖게 된다. 일례로, 서열번호 4로 표시되는 전구체형의 야생형 APA는 예를들어 NCBI genbank AY919310.1로 알려진 염기서열의 폴리뉴클레오타이드에 의해서 암호화 될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

Achromobacter sp. CCM 4824 균주 유래 페니실린 G 아실라제(APA 야생형)는 기존에 공지된 다른 생물 유래의 동종 효소에 비해 우수한 이점이 있는 것으로 보고되고 있다. 예를들어 Achromobacter xylosoxidans 유래 효소와 비교하여 열안정성이 우수하며, 또한 낮은 기질농도에서 E. coli 유래 효소와 비교하여 β-락탐 항생제합성에 대한 촉매 활성이 더 우수한 것으로 보고되었다(Stanislav Becka et al., Penicillin G acylase from Achromobacter sp. CCM 4824, Appl Microbiol Biotechnol DOI 10.1007/s00253-013-4945-3). 그러나, Achromobacter sp. CCM 4824 균주 유래 페니실린 G 아실라제(APA) 야생형 단백질 역시, 본 명세서 실시예들에 기재된 바와 같이, 합성활성 대비 기질 및 생성물 분해활성이 상당 수준으로 일어난다는 문제를 가지고 있다. 한편, 기존에 여러가지 미생물로부터 유래된 페니실린 G 아실라아제에 대해서 변이체를 제작하여 산업적으로 이용하고자 하는 시도들이 있었으나, 이들은 분해반응 및 S/H가 고려되지 않은 채 전환율만 보고되거나 합성반응에만 초점이 맞추어져 개발이 되는 등 각각의 특정 반응에만 초점이 맞추어져 개발이 되었다는 한계점 등이 있었다. 이에 실제 이들은 산업적 수준에 적용하는데 있어서 여전히 불충분한 효과를 가졌으며, 예를 들면 CN105483105A 특허에서 개시하는 일부 아미노산 변이체가 아목시실린 등의 소수 항생제에 대한 기질 전환율이 90~120분 후에 99%인 것으로 개시하고 있지만, 실질적으로 상기 변이체는 야생형에 비해서 합성능력은 단지 약 2배로 개선되었을 뿐이고 이러한 합성 능력에 대하여 S/H 값이 단지 약 3.9배 정도로 되는데 그쳤다(아목시실린 기준). 이러한 개량 정도로는 실제 산업단위에 적용하는데 있어서 공정 효율면에서 한계가 있다. 즉, 효소 개량에 있어서, 이의 비교우위를 판단하기 위해서는 합성활성증가 뿐만아니라, 분해활성 감소 및 S/H 값의 증가를 평가하는 것이 선행되어야한다.

이에 반해, 본 발명의 변이체 중 대표적 일례로 ZSH1-13 변이체는 세파졸린 합성활성이 야생형 대비 12.5 배로 현저히 증가하였을 뿐만 아니라, 이러한 합성 활성에 더하여 S/H ratio는 야생형 대비 6.1 배를 나타내었다. 뿐만아니라 또 다른 일례로서 ZSH2-5 변이체(ZSH1-13 변이체를 기반으로 개발됨)는 변이체는 세파졸린 합성활성이 야생형 대비 43 배로 현저히 증가하였을 뿐만 아니라, 이러한 합성 활성에 더하여 S/H ratio는 야생형 대비 19.8 배를 나타내었다. 특히, 무수한 단계를 거쳐 생성된 다양한 변이체들 중, 최종적으로 선발된 ZSH3-1 변이체(ZSH2-5 변이체를 기반으로 개발됨)의 경우 세파졸린 합성활성이 야생형 대비 65 배로 현저히 증가하였을 뿐만 아니라, 이러한 합성 활성에 더하여 S/H ratio는 야생형 대비 36.7 배를 나타내었다. 이에 본 발명에서 제공하는 변이 APA에 의하면 세파졸린을 고효율로 생산할 수 있다. 이는 생산 공정에 사용할 수 있는 월등한 개량으로서, 기존 기술 대비 상당한 수준의 기술적인 진보를 의미 한다.

이처럼 본 발명에서 개시하는 특유의 변이(특히 치환) 형태를 지니는 Achromobacter sp. CCM 4824 유래 페니실린 G 아실라제 변이체 들은 세파졸린에 대하여 고효율의 합성능을 가지는 것이 특징이다. 본원 발명에서 용어‘고효율’이란 합성 생성물의 생산량 및 속도가 증가되었을 뿐만아니라 S/H 비율(ratio)이 높은 것을 의미하는 것이다.

이에 본 발명에서 최초로 개시하는 APA 변이 형태는 다음과 같다. 본원 발명의 변이 페니실린 G 아실라제(이하, 본 명세서에서 변이 APA로 혼용하여 표기)는, 상기 서열번호 1로 표시되는 알파 서브유닛 및 서열번호 2로 표시되는 베타 서브유닛을 포함하는 야생형 페니실린 G 아실라제 단백질 서열 중에서, A116α, I156α, N169α, M3β, S54β, T64β, H173β, T251β, T388β, R478β, E486β, D541β 및 Y555β로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 한다.

구체적으로 상기 돌연변이는 상기 서열번호 1로 표시되는 알파 서브유닛 및 서열번호 2로 표시되는 베타 서브유닛을 포함하는 야생형 페니실린 G 아실라제 단백질 서열 중에서, A116αT, I156αN, N169αT, M3βV, S54βG, T64βA, H173βN, T251βA, T388βA, R478βH, E486βA, D541βE 및 Y555βC로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 것을 특징으로 한다.

예를 들어, 상기 서열번호 1로 표시되는 알파 서브유닛 및 서열번호 2로 표시되는 베타 서브유닛을 포함하는 야생형 페니실린 G 아실라제 단백질 서열 중에서, A116αT 치환을 포함하는 폴리펩타이드, I156αN 치환을 포함하는 폴리펩타이드, N169αT 치환을 포함하는 폴리펩타이드, H173βN 치환을 포함하는 폴리펩타이드, T251βA 치환을 포함하는 폴리펩타이드, E486βA 치환을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 Y555βC 치환을 포함하는 폴리펩타이드 등과 같이 하나의 변이 부위(site)를 가지는 것일 수 있으며, 또는

예를들어 상기 서열번호 1로 표시되는 알파 서브유닛 및 서열번호 2로 표시되는 베타 서브유닛을 포함하는 야생형 페니실린 G 아실라제 단백질 서열 중에서, A116αT, I156αN, N169αT, M3βV, S54βG, T64βA, H173βN, T251βA, T388βA, R478βH, E486βA, D541βE 및 Y555βC로 이루어지는 군에서 임의로 선택된 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개 또는 13개의 변이 부위를 포함하는 폴리펩타이드와 같이 다중 변이 부위를 가지는 것일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

바람직하게 본원 발명의 변이 페니실린 G 아실라제(변이 APA)는, 상기 야생형 페니실린 G 아실라제 단백질 서열 중에서 I156αN, N169αT, H173βN, T251βA, E486βA 및 Y555βC의 6개 변이 부위를 포함하는 것일 수 있다(ZSH1-13 참조). 더욱 바람직하게, 본원 발명의 변이 페니실린 G 아실라제는 서열번호 5로 표시되는 알파 서브유닛 및 서열번호 6으로 표시되는 베타 서브유닛을 포함하는 것일 수 있다. 이의 바람직한 제공 형태로서, ⅰ) 서열번호 5로 표시되는 알파 서브유닛과 서열번호 6으로 표시되는 베타 서브유닛이 스페이서 펩타이드(예를들어, 서열번호 3)에 의하여 연결되어 구성된 단일 사슬 폴리펩타이드(예를들어, 서열번호 7) 형태인 전구체(precursor)형 단백질로서 제공될 수 있고, 또는 ⅱ) 서열번호 5로 표시되는 알파 서브유닛 및 서열번호 6으로 표시되는 베타 서브유닛으로 구성된 성숙형(mature) 단백질로 제공될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한 본 발명은 상기 변이 APA에 추가적인 아미노산 잔기의 변형을 포함할 수 있다. 상기 용어‘변형’은 아미노산 잔기의 결실, 치환 또는 부가를 의미한다. 상기 추가적인 아미노산 잔기의 변형은 본 발명 변이 APA의 세파졸린 합성활성 증가 및 상기 합성에 이용되는 기질에 대한 분해 활성의 감소를 목적으로 수행되는 것으로서, 상기 목적을 달성할 수 있는 한 아미노산 잔기의 변형 형태(종류) 및 위치는 특별히 제한되지 않는다.

바람직하게, 상기 야생형 대비 I156αN, N169αT, H173βN, T251βA, E486βA 및 Y555βC의 6개 변이 부위를 포함하는 변이 APA 서열 중에서, G49αF, T201αS, M3βV, T64βA, T225βN 및 T388βA로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 변이를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게 상기 서열번호 5로 표시되는 알파 서브유닛 및 서열번호 6으로 표시되는 베타 서브유닛을 포함하는 변이 APA 서열 중에서, G49αF, T201αS, M3βV, T64βA, T225βN 및 T388βA로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 변이를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

예를 들어, 상기 서열번호 5로 표시되는 알파 서브유닛 및 서열번호 6으로 표시되는 베타 서브유닛을 포함하는 변이 APA 서열 중에서, G49αF 치환을 포함하는 폴리펩타이드, T201αS 치환을 포함하는 폴리펩타이드, M3βV 치환을 포함하는 폴리펩타이드, T64βA 치환을 포함하는 폴리펩타이드, T225βN 치환을 포함하는 폴리펩타이드 또는 T388βA 치환을 포함하는 폴리펩타이드와 같이 하나의 변이부위를 추가적으로 포함하는 것일 수 있으며, 또는

예를 들어, 상기 서열번호 5로 표시되는 알파 서브유닛 및 서열번호 6으로 표시되는 베타 서브유닛을 포함하는 변이 APA 서열 중에서, G49αF, T201αS, M3βV, T64βA, T225βN 및 T388βA로 이루어지는 군에서 임의로 선택된 2개의 변이, 3개의 변이, 4개의 변이, 5개의 변이 또는 6개의 변이를 포함하는 폴리펩타이드와 같이 다중 변이 부위를 추가적으로 포함하는 것일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

가장 바람직하게, 본 발명의 변이 APA는 상기 서열번호 5로 표시되는 알파 서브유닛 및 서열번호 6으로 표시되는 베타 서브유닛을 포함하는 변이 APA에서, M3βV, T64βA 및 T388βA의 3개 변이(치환) 부위를 추가로 포함하는 것일 수 있다(야생형 대비 총 9개의 치환부위 포함, ZSH2-5 참조). 더욱 바람직하게, 본원 발명의 변이 APA는 서열번호 5로 표시되는 알파 서브유닛 및 서열번호 8로 표시되는 베타 서브유닛을 포함하는 것일 수 있다. 이의 바람직한 제공 형태로서, ⅰ) 서열번호 5로 표시되는 알파 서브유닛과 서열번호 8로 표시되는 베타 서브유닛이 스페이서 펩타이드(예를들어, 서열번호 3)에 의하여 연결되어 구성된 단일 사슬 폴리펩타이드(예를들어, 서열번호 9)형태인 전구체형 단백질로서 제공될 수 있고, 또는 ⅱ) 서열번호 5로 표시되는 알파 서브유닛 및 서열번호 8로 표시되는 베타 서브유닛으로 구성된 성숙형 단백질로 제공될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한 본원 발명은, 상기 변이 APA에 대하여 더욱 추가된 변이를 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다. 바람직하게, 상기 야생형 대비 I156αN, N169αT, M3βV, T64βA, H173βN, T251βA, T388βA, E486βA 및 Y555βC의 9개 변이 부위를 포함하는 변이 APA 서열 중에서, S54βG, S150βT, N226βT, A310βD, R478βH 및 D541βE로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 변이를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게 상기 서열번호 5로 표시되는 알파 서브유닛 및 서열번호 8로 표시되는 베타 서브유닛을 포함하는 변이 APA 서열 중에서, S54βG, S150βT, N226βT, A310βD, R478βH 및 D541βE로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 변이를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

예를들어, 상기 서열번호 5로 표시되는 알파 서브유닛 및 서열번호 8로 표시되는 베타 서브유닛을 포함하는 변이 APA 서열 중에서, S54βG 치환을 포함하는 폴리펩타이드, S150βT 치환을 포함하는 폴리펩타이드, N226βT 치환을 포함하는 폴리펩타이드, A310βD 치환을 포함하는 폴리펩타이드, R478βH 치환을 포함하는 폴리펩타이드 또는 D541βE 치환을 포함하는 폴리펩타이드와 같이 하나의 변이부위를 추가적으로 포함하는 것일 수 있으며, 또는

예를들어, 상기 서열번호 5로 표시되는 알파 서브유닛 및 서열번호 8로 표시되는 베타 서브유닛을 포함하는 변이 APA 서열 중에서, S54βG, S150βT, N226βT, A310βD, R478βH 및 D541βE로 이루어지는 군에서 임의로 선택된 2개의 변이, 3개의 변이, 4개의 변이, 5개의 변이, 또는 6개의 변이 부위를 포함하는 폴리펩타이드와 같이 다중 변이 부위를 가지는 것일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

가장 바람직하게 본원 발명의 변이 APA는, 상기 서열번호 5로 표시되는 알파 서브유닛 및 서열번호 8로 표시되는 베타 서브유닛을 포함하는 변이 APA에서, S54βG, R478βH 및 D541βE의 3개 변이(치환) 부위를 추가로 포함하는 것일 수 있다(야생형 대비 총 12개의 치환부위 포함, ZSH3-1 참조). 더욱 바람직하게, 본원 발명의 변이 APA는 서열번호 5로 표시되는 알파 서브유닛 및 서열번호 10으로 표시되는 베타 서브유닛을 포함하는 것일 수 있다. 이의 바람직한 제공형태로서, ⅰ) 서열번호 5로 표시되는 알파 서브유닛과 서열번호 10으로 표시되는 베타 서브유닛이 스페이서 펩타이드(예를들어, 서열번호 3)에 의하여 연결되어 구성된 단일 사슬 폴리펩타이드(예를들어, 서열번호 11)형태인 전구체형 단백질로서 제공될 수 있고, 또는 ⅱ) 서열번호 5로 표시되는 알파 서브유닛 및 서열번호 10으로 표시되는 베타 서브유닛으로 구성된 성숙형 단백질로 제공될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

한편, 본 발명은 상기 변이 페니실린 G 아실라제(변이 APA)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 변이 APA 폴리펩타이드를 암호화할 수 있는 한 폴리뉴클레오티드를 구성하는 염기 조합이 특별히 제한되지 않는다. 아미노산 서열이 밝혀진 경우, 당업계에 공지된 코돈 정보에 기초하여 상기 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제조하는 기술은 당업계에 주지되어있다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함하여 단쇄 또는 이중쇄의 형태의 핵산분자로서 제공될 수 있다.

본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명에서 용어“재조합 발현벡터”란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 핵산(RNA)을 발현할 수 있는 벡터로서, 폴리뉴클레오티드(유전자) 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

본 발명에서 용어,“작동가능하게 연결된(operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 즉, 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어 본 발명의 변이 APA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열)이 발현 조절 서열에 의해 유전자 발현이 가능하게 되는 방식으로 연결된 것을 의미하는 것으로, 예를들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어야 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

본 발명의 재조합 발현벡터는 상기 변이 APA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따라 벡터 내에 클로닝된 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 적절한 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드(유전자) 서열과 발현 조절서열은 벡터를 포함하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커 및/또는 복제 기원(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함 될 수 있다. 또한 상기 발현벡터는 발현조절 서열 및 필요에 따라 막표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 상기 발현 조절 서열(expression control sequence)이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 등을 포함한다. 상기 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.

시그널 서열에는 숙주가 에쉐리키아속균인 경우에는 PhoA 시그널 서열, OmpA 시그널 서열 등이, 숙주가 바실러스속균인 경우에는 α-아밀라아제 시그널 서열, 서브틸리신 시그널 서열 등이, 숙주가 효모인 경우에는 MFα 시그널 서열, SUC2 시그널 서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 시그널서열, α-인터페론 시그널 서열, 항체 분자 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 발현벡터는 클로닝분야에서 통상적으로 사용되는 벡터라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 예를들어 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 상기 플라스미드에는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119, pET-22b(+)), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 등이 있으며, 상기 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 백시니아 바이러스와 같은 동물바이러스, 배큘로바이러스와 같은 곤충 바이러스 등이 사용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일실시예에서는 pBC-KS(+)를 사용한 바 있다.

본 발명은 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 숙주세포 및 미생물을 제공한다.

상기 형질전환은 핵산(본 발명의 변이 APA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드)을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기천공법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO₄) 침전, 염화 칼슘(CaCl₂) 침전, 실리콘 탄화물 위스터(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG(polyethylenglycol)에 의한 침전법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민, 열충격(heat shock)법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment) 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.

상기 숙주세포(host cell)는 임의의 수단(예: 전기충격법, 칼슘 포스파타제 침전법, 미세주입법, 형질전환법, 바이러스 감염 등)에 의해 세포 내로 도입된 이종성 DNA를 포함하는 원핵 또는 진핵 세포를 의미한다.

본 발명에서 상기 숙주세포는 클로닝 분야에서 통상적으로 사용되는 모든 종류의 단세포 유기체, 예컨대 각종 박테리아(예컨대, Clostridia속, 대장균, 등) 등의 원핵세포 미생물, 효모 등의 하등 진핵세포 미생물과 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 당업자가 목적하는 바에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명에서 상기 숙주세포는 클로스트리디아 속(Clostridia spp., 예컨대, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, 또는 Clostridium saccharobutylicum 등), 에세리치아 속(Escherichia spp.), 아세토박터 속(Acetobacter spp., 예컨대 Acetobacter turbidans, Acetobacter pasteurianus 등), 아에로모나스 속(Aeromonas spp.), 알칼리제네스 속(Alcaligenes spp.), 아파노클라디움 속(Aphanocladium spp.), 바실러스 속(Bacillus spp.), 세팔로스포리움 속(Cephalosporium spp.), 플라보박테리움 속(Flavobacterium spp.), 클루이베라 속(Kluyvera spp.), 미코플라나 속(Mycoplana spp.), 프로타미노박터 속(Protaminobacter spp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas spp.), 아크로모박터 속(Achromobacter spp.) 및 잔토모나스 속(Xanthomonas spp., 예컨대 Xanthomonas citri 등)으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 속(genus) 미생물일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

상기 에세리치아 속 미생물은 바람직하게 에세리치아 콜라이(대장균, Escherichia coli)일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 상기 변이 APA를 발현하도록 형질전환된 미생물로서 에세리치아 콜라이 MC1061/pBC-ZSH3-1(Escherichia coli MC1061/pBC-ZSH3-1, 기탁번호 KCTC 13991BP)의 균주를 제공한다. 상기 에세리치아 콜라이 MC1061/pBC-ZSH3-1은 서열번호 5로 표시되는 알파 서브유닛 및 서열번호 10으로 표시되는 베타 서브유닛을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 상기 유닛들로 구성되는 폴리펩타이드를 발현한다. 즉, 상기 에세리치아 콜라이 MC1061/pBC-ZSH3-1은 서열번호 5 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터에 의해 형질전환된 것이다.

또한 본 발명은, 전술한 본원 발명의 변이 페니실린 G 아실라제를 포함하는 세파졸린 제조용(합성용) 조성물을 제공한다.

전술한 바와 같이 본원 발명의 변이 APA는 세파졸린을 합성하는데 있어서 현저한 이점을 제공한다. 따라서 본원 발명은, 상기 본원 발명의 변이 APA들의 세파졸린 합성을 위한 용도를 제공한다.

본 발명에 따른 변이 APA는 전술한 서열 정보를 참조로 하여 당업계에 공지된 단백질 제조 방법에 의해 제조될 수 있으며, 이에 제한되지 않으나 일례로 유전공학적 방법에 의해 작제될 수 있다. 예를들면, 통상적인 방법에 따라 상기 변이 APA 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 작제한다. 상기 핵산은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(Biosearch 또는 Applied Biosystems 사에서 판매하는 것)을 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 작제된 핵산은 이에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 핵산의 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence, 예를들어 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 핵산이 발현되기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 핵산에 의해 발현된, 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 회수한다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 그리고 상기와 같이 제조된 본 발명의 변이 APA를 목적산물 제조를 위해서 그대로 사용하거나 또는 정제하여 사용하는 것이 가능하다. 변이 APA 효소의 분리정제는 기존에 밝혀진 APA의 성질을 이용하여 다양한 크로마토그래피 방법에 의한 단백질 분리 방법을 그대로 사용하거나 실험 목적에 맞게 약간 변형하여 사용 가능하다. 또한, 히스티딘 펩티드와 니켈 컬럼 성분과의 결합력 또는 섬유소 결합부위 (cellulose binding domain, CBD), 섬유소와의 결합력 등과 같은 특정 결합력 성질을 이용한 친화성 크로마토그래피 (affinity chromatography) 방법에 의해 변이 APA를 정제하는 것도 가능하다.

상기에서 "실질적으로 순수한 폴리펩티드(substally pure polypeptide)"라 함은 본 발명에 따른 폴리펩티드가 숙주세포로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 폴리펩티드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Editions; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie ＆ Fink(eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.

또한, 본 발명의 변이 APA는 당업계에 공지된 화학적 합성(Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983)에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 이들로 한정되는 것은 아니지만 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함된다(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on ＆ Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989).

본 발명의 변이 APA는 유리(free) 상태뿐만 아니라 고정화시킨 상태로 사용하는 것이 가능하다. 변이 APA의 고정화는, 당업계에 공지된 통상적인 단백질 고정 방법에 의해 가능한데, 담체로서는 섬유소, 전분, 덱스트란, 아가로즈(agarose) 등의 천연 폴리머; 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리메타크릴레이트(polymethacylate), 유퍼짓 C(Eupergit C) 등의 합성 폴리머; 또는 실리카(silica), 벤토나이트(bentonite), 금속과 같은 미네랄 등이 사용 가능하다. 또한, 이들 담체에 공유결합, 이온결합, 소수성 결합, 물리적 흡착, 마이크로 인캡슐레이션(microencapsulation) 등에 의해 변이 APA를 결합시키는 것이 가능하다. 아울러, 이들 담체-효소 결합체가 글루타르알데히드 (glutaraldehyde), 시아노겐 브로마이드(cyanogen bromide) 등의 작용에 의해 공유결합을 형성함으로써 변이 APA를 고정화시키는 것도 가능하다. 또한, 더욱 바람직한 방법으로는 변이 APA를 따로 정제할 필요가 없이 변이 APA를 함유한 미생물 세포를 그대로 고정화하여 사용하는 것도 가능하다. 이와 같은 전세포 고정화 (whole cell immobilization)시 미생물에 함유된 변이 APA의 반응성을 높이기 위하여 세포에 구멍을 내거나 표면발현 등의 기술을 적용할 수도 있다.

본 발명의 상기 세파졸린 제조용 조성물에서, 상기 용어‘변이 APA를 포함’는 조성물에 처음부터 변이 APA 폴리펩타이드 자체를 포함하는 직접적 방식뿐만 아니라, 상기 변이 APA를 암호화(코딩)하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환된 숙주세포(미생물)로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 이상의 것을 조성물 내에 포함하여 궁극적으로 변이 APA의 생성을 유도하는 간접적인 방식을 모두 포함하는 의미이다.

구체적으로 본원 발명은,

테트라졸릴아세트산 에스테르와 3-[5- 메틸 -1,3,4- 티오디아졸 -2-일]-7- 아미노세팔로스포린산으로부터 세파졸린( cefazolin )을 효소적으로 합성하는 방법에 있어서 , 상기 본원 발명의 변이 페니실린 G 아실라제를 사용하는 것을 특징으로 하는 세파졸린의 효소적 합성(제조) 방법을 제공한다.

상기 세파졸린 합성(제조) 과정 중 제공되는 본원 발명의 상기 변이 APA 효소는, 상기 변이 APA 폴리펩타이드를 함유하는 조성물 또는 상기 변이 APA 생산균주 배양물의 형태로 제공될 수 있고, 상기 변이 APA를 유리(free) 상태 또는 고정화 시킨 상태로 제공될 수 있으나, 이제 제한되지 않으며 전술한 바를 참고로 이해된다.

본 발명의 변이 APA 효소의 활성이 손실되지 않는 조건이라면, 전술한 합성 과정들 중 각 기질들의 반응 조건이 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 수용액(물 또는 완충용액) 상에서 이루어지는 것일 수 있으며, 바람직한 반응 혼합액의 pH는 pH5 내지 pH9 범위 내에서, 바람직한 반응시간은 0.1 내지 24시간 범위 내에서, 바람직한 반응온도는 3 내지 30℃ 범위 내에서 선택될 수 있다. 상기 조건들은 1회 반응에 사용되는 반응기질 및 효소의 양과 원하는 공정 속도 및 효율 등에 따라 당업자가 적의선택하여 조절할 수 있다.

세파졸린 합성(제조) 과정 중 기질로서 제공되는 MMTD-7-ACA(3-[5-메틸-1,3,4-티오디아졸-2-일]-7-아미노세팔로스포린산)와 TzAA 에스테르(테트라졸릴아세트산 에스테르)가 반응혼합물 내에 첨가되는 농도 및 비율은 특별히 제한되지 않으나, 예를들어 MMTD-7-ACA: TzAA 에스테르 비율은 1:1 내지 1:1.5 일 수 있고, 바람직하게 산업적 경제적 측면에서의 본 발명의 이점을 고려하였을 때 1:1의 비율로 사용될 수 있다.

상기 반응 혼합물에서 본 발명의 변이 APA의 첨가량은 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 0.1~100 U/㎖ 범위 내일 수 있으며, 바람직하게는 반응 혼합물 내에 포함되는 기질 화합물들의 총량에 대하여 2~10%(w/w)의 비율로 포함될 수 있다.

반응 과정에서 최종 생성된 세파졸린은 당업계에 공지된 통상의 화합물 정제방법(예를들어, 크로마토그래피 등)에 의해 반응액으로부터 분리 및 정제될 수 있다.

본 발명에서 개시하는 특유의 변이 형태를 지니는 Achromobacter sp. CCM 4824 유래 페니실린 G 아실라제 변이체들은, 세파졸린(Cefazolin)에 대하여 특이적으로 생산성이 현저하게 증가된 것이 특징이다. 구체적으로 본 발명의 변이 APA들은 이의 야생형 효소 및 기존에 알려진 다른 변이형태 대비, 특이적으로 세파졸린(cefazolin)에 대한 합성활성이 매우 높으면서도, 세파졸린 합성에 사용되는 기질에 대한 분해활성 대비 합성비율(S/H ratio)이 현저히 높아, 산업적 적용에 있어서 유의한 수준으로 세파졸린 생산성이 현저하게 증가된 것이 특징이다.

도 1은 본원 발명의 변이체들 중 대표적으로 ZSH1-13 변이체, ZSH2-5 변이체 및 ZSH3-1 변이체의 아미노산 치환 부위를 나타낸다.
도 2는 전구체(기질)인 TzAAMe 및 TDA로부터 효소반응을 통하여 세파졸린을 합성하는 반응(S)과, 분해 반응으로서 상기 전구체 중 TzAAMe의 TzAA로의 가수분해반응(H1) 및 상기 세파졸린의 TzAAMe 및 TDA로의 가수분해반응(H2)을 나타낸다.
도 3은 ZSH3-1 변이체에 의한 세파졸린 합성 반응에 있어서, 시간에 따른 세파졸린 전환율, 잔존 TzAAMe양, TzAA의 생성량을 나타낸 데이터이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : Achromobacter sp . CCM 4824 유래 페니실린 G 아실라제 (Penicillin G acylase , APA ) 야생형의 제조

1-1. Achromobacter sp . CCM 4824 유래 페니실린 G 아실라제 (Penicillin G acylase , APA ) 야생형을 발현하는 유전자의 합성

야생형 APA(Achromobacter sp. CCM 4824 유래 페니실린 G 아실라제)는 전구체(precursor)형으로서 서열번호 1로 표시되는 알파 서브유닛과 서열번호 2로 표시되는 베타 서브유닛이 서열번호 3으로 표시되는 스페이서(spacer) 펩타이드에 의하여 연결된 단일 사슬 폴리펩티드(서열번호 4)로서 발현되며, 그 후 세포 내에서 자기 촉매적 프로세싱(autocatalytic processing)을 통해 상기 알파 서브유닛과 베타 서브유닛으로 구성된 성숙형(mature)의 활성 이량체 형태를 갖게 된다. 서열번호 4의 야생형 APA 전구체를 발현하는 유전자(‘apa 유전자’로 약칭)를 바이오니아(대전, 한국) 회사에 의뢰하여 합성하였다.

1-2. 야생형 APA를 발현하는 재조합 벡터(pBC-APA)의 제조

상기 실시예 1-1에서 수득된 apa 유전자를 pBC-KS(+) 벡터(Stratagene사, 미국)의 XbaI과 NotI 제한효소 인식부위에 삽입하여 야생형 APA를 발현하기 위한 pBC-APA 플라스미드를 제작하였다. 구체적인 제조방법은 다음과 같다.

상기 apa 유전자 DNA 산물(약 2.6 kb 크기)을 제한효소 XbaI과 NotI로 절단한 후, 정제 키트 (QIAquick Gel Extraction Kit ; QIAGEN사, 독일)로 정제하여 이를 삽입 DNA로 사용하였다. 또한, pBC KS(+) 벡터(Stratagene사, 미국) DNA를 제한효소 XbaI과 NotI로 절단하고 CIP로 탈인산화 시킨 DNA 단편을 벡터 DNA로 사용하였다. 상기 삽입 DNA와 벡터 DNA를 T4 DNA 리가제 (New England Biolabs, 스웨덴)를 이용하여 16℃에서 12~16시간 동안 접합(ligation) 시킨 후, 접합액을 이용하여 전기천공법(electrophoration)으로 E. coli MC1061 균주에 형질전환을 수행하였다. 상기 균주를 20 μg/mL 농도의 클로람페니콜 항생제를 함유한 LB 한천배지에 도말하여 30℃에서 하룻밤 정치 배양함으로써 형질전환체들을 선별하였다. 이 형질전환체로부터 플라스미드를 분리하여 삽입 DNA의 염기서열을 결정함으로써, apa 유전자를 포함하는 pBC-APA 플라스미드를 최종 수득하였다. 상기 pBC-APA 플라스미드는 야생형 APA 단백질을 발현한다.

Cefazolin에 대하여 높은 수준의 합성능을 나타냄과 동시에, 반응 기질을 가수분해하는 활성이 현저히 감소된 변이체를 제조하고자 하기 실시예 2 및 3과 같은 무수한 과정을 수행하였으며, 하기 실시예 2 및 실시예 3은 무수한 과정들 중의 일례를 대표적으로 보여준다. 이하에서 제조되는 변이체들은 알파 서브유닛과 베타 서브유닛 각각에 대한 아미노산 위치에 대해 구체적 변이 형태로 표시한다.

실시예 2 : cefazolin 합성활성이 높은 변이체의 제조 및 선별

2-1. 에러 유발성 중합효소연쇄반응(error prone PCR)에 의한 1차 변이체 라이브러리의 제조

cefazolin 합성활성이 증가된 변이 APA를 제조하기 위해서 상기 실시예 1에서 합성한 apa 유전자의 염기서열에 인위적으로 무작위 돌연변이를 유발하였고, 이를 위해 에러 유발성 중합효소연쇄반응(error prone PCR)을 수행함으로써 돌연변이 라이브러리를 제조하였다. 구체적인 돌연변이 라이브러리의 제조과정은 하기에 설명한 바와 같다.

구체적으로, 에러 유발성 중합효소 연쇄반응은 Diversity PCR Random Mutagenesis kit (Clontech사, 미국)를 사용하여 1,000 bp당 1-2개의 돌연변이가 일어나도록 하였다. PCR 반응액의 조성은 주형 DNA로서 1 ng/μL의 pBC-APA 플라스미드를 사용하고, 각 10 pmol의 T3 프라이머(서열번호 12)와 T7 프라이머(서열번호 13), 2 mM dGTP, 50X Diversity dNTP mix, 10X TITANIUM Taq buffer, TITANIUM Taq polymerase로 최종부피는 50 μL로 수행하였다. PCR 반응조건은 반응 혼합액을 96℃에서 2분 동안 전-변성시키고 변성을 96℃에서 30초, 어닐링을 52℃에서 30초 및 중합을 68℃에서 3분 동안 수행하는 반응을 18회 반복한 후 68℃에서 5분 동안 후-중합시켰다. 상기 조건의 에러 유발성 중합효소 연쇄반응을 수행하여 약 2.7 kb 크기의 변이체 DNA 단편을 증폭하였다.

상기 PCR을 통해 얻은 변이 유전자 즉, 2.7kb의 PCR 산물을 제한효소 XbaI과 NotI로 절단한 후 정제 키트 (QIAquick Gel Extraction Kit ; QIAGEN사, 독일)를 사용하여 정제한 후 삽입 DNA로 사용하였고, pBC-KS(+) 벡터 DNA를 제한효소 XbaI과 NotI로 절단하고 CIP로 탈인산화시킨 DNA 단편을 벡터 DNA로 사용하였다. 상기의 삽입 DNA와 벡터 DNA를 T4 DNA 리가제 (New England Biolabs, 스웨덴)를 이용하여 16℃에서 16시간 동안 접합시킨 후, 접합액을 이용하여 전기천공법에 의한 E. coli MC1061 균주의 형질전환을 수행하였다. 상기 균주를 20 μg/mL 농도의 클로람페니콜 항생제를 함유한 LB 한천배지에 도말하여 30℃에서 하룻밤 정치 배양함으로써 무작위 돌연변이 라이브러리를 제조하였다.

상기 돌연변이 라이브러리로부터 Cefazolin 합성에 대한 반응성이 증가된 변이 APA를 하기와 같은 방법으로 탐색하였다. Cefazolin 합성을위한 반응기질 및 구체적 화학반응 과정은 도 2에 도시되었다. 돌연변이가 유발된 변이 apa 유전자를 함유한 E. coli MC1061 형질전환체를 클로람페니콜 항생제가 함유된 LB 액체배지가 160μl씩 분주된 96-웰 플레이트에 접종한 후, 23℃, 165 rpm 조건으로 60~70시간 동안 진탕 배양하였다. 그 후 상기 96-웰 플레이트에서 20μl씩의 배양액을 취하여 이를 새로운 96-웰 플레이트로 옮기고 105 μL의 세포 분해용액(1.25mg/mL 라이소자임(lysozyme), 1.25 mM EDTA, 0.375% Triton X-100)을 넣은 후 25℃에서 2시간 동안 방치하고, 10℃에서 1시간 동안 방치하였다. 그 후, 100 mM Ammonium phosphate (pH 7.5) 완충용액에 10mM TDA 및 이를 기준으로 1:1 기질비율인 10mM의 TzAAMe를 녹여 제조한 기질용액 125μL를 첨가한 후 10℃에서 16~18시간 동안 합성반응을 수행하였다. 합성반응을 수행한 후 반응액 중의 상등액 40 μL를 새로운 96-웰 플레이트로 옮겼다. 여기에 반응 정지액 0.2 N HCl 100 μL를 첨가하여 효소반응을 정지시킨 후 HPLC를 사용하여 Cefazolin 합성활성이 증가된 변이체를 탐색하였다. HPLC 분석 조건은 0.01 M Potassium phosphate (pH 6.8)와 Methanol (7:3)을 용매로 사용하였고, 컬럼은 YMC-Triart C18, 250*4.6mm를 사용하였으며, 10 μL를 주입하여 0.8 mL/min으로 흘려서 270 nm에서 12분간 분석하였다.

상기와 같은 방법으로 7개의 변이체에서 cefazolin 합성 활성이 증가됨을 확인하였다. 7개 변이체는 유전자의 염기서열 결정을 통하여, 야생형 대비 각각 A116αT(ZEP1-9), I156αN(ZEP1-10), H173βN(ZEP1-12), Y555βC(ZEP1-13), E486βA(ZEP1-18), N169αT(ZEP1-26), 또는 T251βA(ZEP1-33) 로 돌연변이 되었음을 확인하였다.

2-2. 위치지정 돌연변이(DNA shuffling)에 의한 2차 변이체 라이브러리의 제조_ ZSH1 -13 개량 균주 선발

추가적으로 cefazolin 합성활성이 증가된 변이 페니실린 G 아실라제를 개량하기 위해 에러 유발성 중합효소연쇄반응에서 얻은 개량균주의 활성을 바탕으로 7개의 아미노산 잔기(A116αT, I156αN, N169αT, H173βN, T251βA, E486βA, Y555βC)에 대한 위치지정 돌연변이 라이브러리를 제조하였다.

구체적으로는, A116α 아미노산이 변이된 라이브러리를 제조하기 위하여, 야생형APA를 주형으로 하고 M13R 프라이머(서열번호 15)와 SH116a-R 프라이머(서열번호 17)를 사용해 PCR을 수행하여 약 510 bp 크기의 PCR 산물을 회수하였고, A116α, I156α, N169α 아미노산이 변이된 라이브러리를 제조하기 위해서 야생형 APA와 ZEP1-10을 주형으로 하고 SH116a-F 프라이머(서열번호 16)와 SH169a-R 프라이머(서열번호 19)를 사용해 PCR을 수행하여 약 160 bp 크기의 PCR 산물을 회수하였으며, N169α, H173β, T251β 아미노산이 변이된 라이브러리를 제조하기 위해 야생형 APA, ZEP1-12를 주형으로 하고 SH169a-F 프라이머(서열번호 18)와 SH251b-R 프라이머(서열번호 21)를 사용해 PCR을 수행하여 약 1,100 bp 크기의 PCR을 회수하였다. 또한 T251β, E486β, Y555β 아미노산을 변이시키기 위해 야생형 APA, ZEP1-18를 주형으로 하고 SH251b-F 프라이머(서열번호 20), SH555b-R 프라이머(서열번호 23)를 사용해 PCR을 수행하여 약 910 bp 크기의 PCR을 회수하였고, Y555β 아미노산을 변이시키기 위해 야생형 APA를 주형으로 하고 SH555b-F 프라이머(서열번호 22), M13F 프라이머(서열번호 14)를 사용해 PCR을 수행하여 약 100 bp 크기의 PCR 산물을 회수하였다.

PCR 반응액의 조성은 각각의 주형 DNA, 프라이머, pfu-x buffer, dNTPs mix, pfu-x polymerase로 최종부피는 100 μL로 조정하여 수행하였다. PCR 반응조건은 반응 혼합액을 96℃에서 3분 동안 전-변성시키고 변성을 96℃에서 30초, 어닐링을 52℃에서 30초 및 중합을 68℃에서 2분 동안 수행하는 반응을 18회 반복한 후 68℃에서 5분 동안 후-중합시켰다.

상기 조건에서 얻은 약 510 bp의 PCR산물과 160 bp의 PCR산물, 1,100 bp의 PCR산물, 910 bp의 PCR산물 및 약 100 bp의 PCR산물을 혼합하고 여기에 T3 프라이머 (서열번호 12)와 T7 프라이머(서열번호 13)를 사용해 PCR을 수행하여, 약 2.7 kb 크기의 다중 변이체 DNA 단편을 증폭하였다. 이렇게 얻은 약 2.7 kb의 PCR 산물을 실시예 2-1의 방법과 동일하게 pBC KS(+) 벡터 DNA에 삽입하고 E. coli MC1061 균주의 형질전환을 수행하여 위치지정 돌연변이체 라이브러리를 제조하였다.

상기 위치지정 돌연변이 라이브러리로부터 cefazolin 합성활성에 대한 반응성이 증가된 변이체를 실시예 2-1의 방법과 동일하게 탐색한 결과, 야생형 APA 대비 cefazolin 합성활성이 증대된 6중 변이체(I156αN, N169αT, H173βN, T251βA, E486βA 및 Y555βC)를 선발하여 ZSH1-13으로 명명하였다. ZSH1-13은 서열번호 5의 알파 서브유닛과 서열번호 6의 베타 서브유닛을 발현한다.

2-3. 에러 유발성 중합효소연쇄반응(error prone PCR)에 의한 3차 변이체 라이브러리의 제조

상기 실시예 2-2에서 제조된 ZSH1-13 변이체의 cefazolin 합성 활성을 추가적으로 더욱 증가시키기 위해서, ZSH1-13의 DNA를 주형 DNA로 사용하여 실시예 2-1의 방법과 동일하게 에러 유발성 돌연변이 라이브러리를 제조하였다.

그 후 cefazolin 합성능력에 대한 탐색에서는, 100 mM Ammonium phosphate (pH 7.5) 완충용액에 20mM TDA 및 이를 기준으로 1:1 기질비율인 20mM의 TzAAMe를 녹여 제조한 기질용액 125 μL를 첨가한 후 반응 온도를 낮추어 6℃에서 17~18시간 동안 합성반응을 수행하였다. 상기 기질 농도와 비율, 기질반응 온도를 제외하고는 모두 실시예 2-1에 기재된 방법과 동일하게 수행되었다.

상기 제작된 에러 유발성 돌연변이 라이브러리를 탐색한 결과 6개의 변이체에서 ZSH1-13 대비 cefazolin 합성활성이 증가함을 확인하였다. 아미노산 서열분석을 통하여 6개 변이체는 상기 ZSH1-13에 대하여 각각 T64βA(ZEP2-7), G49αF(ZEP2-9), T388βA(ZEP2-13), T201αS(ZEP2-17), M3βV(ZEP2-21) 또는 T225βN(ZEP2-54)로 돌연변이 되었음을 확인하였다.

2-4. 위치지정 돌연변이에 의한 4차 돌연변이체 라이브러리의 제조_ZSH2-5 개량 균주 선발

Cefazolin 합성활성이 더욱 증진된 변이체를 얻기 위하여 상기 실시예 2-3에서 얻은 개량균주들의 활성을 바탕으로, ZSH1-13 플라스미드 DNA를 주형 DNA로 사용하여 6개의 아미노산 잔기(G49αF, T201αS, M3βV, T64βA, T225βN, T388βA)에 대한 위치지정돌연변이 라이브러리를 제조하였다. 본 실시예에서 PCR 반응조건은 상기 실시예 2-2에서 전술한 방법과 동일하게 수행되었다.

구체적으로, G49α, T201α 아미노산이 변이된 라이브러리를 제조하기 위해서 ZSH1-13과 ZEP2-9를 주형으로 하고 M13R 프라이머(서열번호 15)와 SH201a-R 프라이머(서열번호 25)를 사용해 PCR를 수행하여 약 770 bp 크기의 PCR 산물을 회수하였고, T201α, M3β, T64β 아미노산이 변이된 라이브러리를 제조하기 위해서 ZSH1-13, ZEP2-21를 주형으로 하여 SH201a-F 프라이머(서열번호 24), SH64b-R 프라이머(서열번호 27)를 사용해 PCR를 수행하여 약 440 bp 크기의 PCR 산물을 회수하였으며, T64β, T225β, T388β 아미노산이 변이된 라이브러리를 제조하기 위해 ZSH1-13, ZEP2-54를 주형으로 하여 SH64b-F 프라이머(서열번호 26)와 SH388b-R 프라이머(서열번호 29)를 사용해 PCR를 수행하여 약 970 bp 크기의 PCR산물을 회수하였고, T388β 아미노산을 변이시키기 위해 ZSH1-13을 주형으로 하여 SH388b-F 프라이머(서열번호 28)와 M13F프라이머(서열번호 14)를 사용해 PCR를 수행하여 약 600 bp크기의 PCR 산물을 회수하였다.

상기 조건에서 얻은 약 770 bp의 PCR 산물과 440 bp 크기의 PCR 산물, 970 bp 크기의 PCR 산물 및 600 bp 크기의 PCR 산물을 혼합하고 여기에 T3 프라이머(서열번호 12)와 T7 프라이머(서열번호 13)를 사용해 PCR을 수행하여, 약 2.7 kb 크기의 다중 변이체 DNA 단편을 증폭하였다. 이렇게 얻은 약 2.7 kb의 PCR 산물을 실시예 2-1의 방법과 동일하게 pBC KS(+) 벡터 DNA에 삽입하고 E. coli MC1061 균주의 형질전환을 수행하여 위치지정 돌연변이체 라이브러리를 제조하였다.

그 후 상기 실시예 2-3의 방법과 동일한 방법으로 라이브러리를 탐색한 결과, ZSH1-13대비 cefazolin 합성활성이 현저히 증가한 변이체로서, ZSH1-13에 대하여 M3βV, T64βA 및 T388βA가 추가로 변이된 균주를 선발하여 ZSH2-5로 명명하였다. 상기 ZSH2-5는 서열번호 5로 표시되는 알파 서브유닛과 서열번호 8로 표시되는 베타 서브유닛을 발현한다.

실시예 3 : 높은 합성능과 동시에 기질분해 활성이 감소된 , 고효율의 cefazolin 합성 변이체의 제조 및 선별

3-1. 에러 유발성 중합효소연쇄반응(error prone PCR)에 의한 5차 변이체 라이브러리의 제조

상기 실시예 2-4에서 제조된 ZSH2-5 변이체의 cefazolin 합성활성 증가 및 반응 기질(대표적으로, TzAAMe) 분해활성 감소를 위해서, ZSH2-5를 주형 DNA로 사용하여 실시예 2-1의 방법과 동일하게 에러 유발성 돌연변이 라이브러리를 제조하였다. 그 후 cefazolin 합성능력에 대한 탐색을 실시예 2-3에 기재된 방법과 동일하게 진행하였다. 또한 기질인 TzAAMe 분해활성에 대한 반응성 탐색에서는, 30 μL 효소액을 96-웰 플레이트로 옮긴 후, 100 mM Ammonium phosphate (pH7.5) 완충용액에 5 mM TDA 및 이를 기준으로 하여 1:1.5 비율인 7.5 mM TzAAMe를 함께 용해시켜 제조한 기질 용액 125 μL를 첨가하고 반응온도를 10℃로 높여 18~20시간 동안 합성반응을 수행하였다. 상기 기질 농도와 기질 반응 온도를 제외하고는 모두 실시예 2-3 에 기재된 방법과 동일하게 수행되었다.

이렇게 상기 제작된 에러 유발성 돌연변이 라이브러리의 Cefazolin 합성 활성 및 기질 분해 활성을 탐색한 결과, 6개의 변이체에서 ZSH2-5 대비 cefazolin 합성 활성의 증가 및 TzAAMe 분해 활성이 감소됨을 확인하였다. 아미노산 서열 분석을 통하여, 6개 변이체는 상기 ZSH2-5에 대하여 각각 S54βG(ZEP3-2), S150βT(ZEP3-11), R478βH(ZEP3-14), N226βT (ZEP3-26), A310βD(ZEP3-33), 또는 D541βE(ZEP3-48)로 돌연변이 되었음을 확인하였다.

3-2. 위치지정 돌연변이에 의한 6차 돌연변이체 라이브러리의 제조_ZSH3-1 개량 균주 선발

상기 실시예 3-1에서 얻은 개량균주들의 활성을 바탕으로, ZSH2-5의 DNA를 주형 DNA로 사용하여 6개의 아미노산 잔기(S54βG, S150βT, N226βT, A310βD, R478βH, D541βE)에 대한 위치지정돌연변이 라이브러리를 제조하였다. 본 실시예에서 PCR 반응조건은 상기 실시예 2-2에서 전술한 방법과 동일하게 수행되었다.

구체적으로, S54β 아미노산이 변이된 라이브러리를 제조하기 위해서 ZSH2-5를 주형으로 하여 M13R 프라이머(서열번호 15)와 SH54b-R 프라이머(서열번호 31)를 사용해 약 1,180 bp 크기의 PCR 산물을 회수하였고, S54β, S150β, N226β 아미노산이 변이된 라이브러리를 제조하기 위해서 ZSH2-5, ZEP3-11를 주형으로 하고 SH54b-F 프라이머(서열번호 30), SH226b-R 프라이머(서열번호 33)를 사용해 PCR을 수행하여 약 520 bp 크기의 PCR 산물을 회수하였고, N226β, A310β, R478β 아미노산이 변이된 라이브러리를 제조하기 위해 ZSH2-5, ZEP3-33을 주형으로 하고 SH226b-F 프라이머(서열번호 32)와 SH478b-R 프라이머(서열번호 35)를 사용해 PCR을 수행하여 약 760 bp 크기의 PCR 산물을 회수하였으며, R478β, D541β 아미노산이 변이된 라이브러리를 제조하기 위해 ZSH2-5, ZEP3-48를 주형으로 하고 SH478b-F 프라이머(서열번호 34), M13F 프라이머(서열번호 14)를 사용해 PCR을 수행하여 약 340 bp 크기의 PCR 산물을 회수하였다. 상기 1,180bp 크기의 PCR 산물과 520 bp 크기의 PCR 산물, 760 bp 크기의 PCR 산물 및 340 bp 크기의 PCR 산물을 혼합하고, T3 프라이머(서열번호 12)와 T7 프라이머(서열번호 13)를 사용해 PCR을 수행하여 약 2.7 kb 크기의 다중 변이체 DNA 단편을 증폭하였다. 이렇게 얻은 약 2.7 kb의 PCR 산물을 실시예 2-1의 방법과 동일하게 pBC KS(+) 벡터 DNA에 삽입하고 E. coli MC1061 균주의 형질전환을 수행하여 위치지정 돌연변이체 라이브러리를 제조하였다.

그 후 상기 실시예 3-1의 방법과 동일한 방법으로 라이브러리의 활성을 탐색한 결과, ZSH2-5 대비 cefazolin 합성 활성이 현저히 증가된 것으로 나타나고 기질(TzAAMe) 분해 활성이 현저히 감소된 변이체로서, S54βG, R478βH 및 D541βE가 추가로 변이된 균주를 선발하여 ZSH3-1로 명명하였다. ZSH3-1은 서열번호 5로 표시되는 알파 서브유닛과 서열번호 10으로 표시되는 베타 서브유닛을 발현한다.

3-3. 균주기탁

제조된 변이 효소들 중, 가장 좋은 활성을 나타낸 ZSH3-1 변이 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 pBC-ZSH3-1 플라스미드로 형질전환 된 E. coli MC1061 균주를 “Escherichia coli MC1061/pBC-ZSH3-1”라 명명하였고, 2019년 10월 11일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(기탁번호: KCTC 13991BP).

상기 실시예 2 내지 실시예 3에 기술된 바 있는 대표적인 각 변이체들의 Cefazolin 합성효율 비교 평가 결과를 이하의 실시예에서 기술한다.

실시예 4 : APA 변이체들의 세파졸린(Cefazolin) 활성 효율 비교

4-1. 효소액 제조

제조한 APA 변이체들의 활성 정도를 비교하기 위해서, 각 효소액을 하기와 같이 제조하였다. 상기 실시예 2 내지 실시예 3에서 제조한 각각의 APA 변이체를 코딩하는 유전자들을 상기 실시예 1-2에 기재된 것과 동일한 방법으로 pBC-KS(+) 벡터에 삽입한 후, 각 발현 벡터들을 E. coli MC1061의 대장균 균주에 형질전환하였다. 대장균 형질전환체 각각을 20 μg/mL 클로람페니콜이 함유된 3 mL의 LB배지 (1% Bacto-tryptone, 0.5% Yeast Extract, 0.5% NaCl)에 접종한 후 28℃, 200 rpm 조건으로 16시간 동안 진탕배양하였다. 그 후에 배양액 350 μL를 20 μg/mL 클로람페니콜이 함유된 35 mL의 새로운 LB 배지에 접종한 후 23℃, 190 rpm 조건으로 48시간 동안 진탕배양하였다. 이 배양액을 원심분리(4℃, 8000 rpm, 10분)하여 균체를 회수한 후, 0.05 M ammonium phosphate (pH 7.5) 완충용액으로 1회 세척하였다. 이 균체를 35 mL의 동일 완충용액에 현탁한 후 4℃에서 초음파 파쇄기(Vibra Cell VC750, Sonics & Materials Inc, 미국)로 5분 동안 파쇄하고 4℃, 13,500 rpm 조건으로 20분 동안 원심분리하여 상등액을 취함으로써 각각의 APA 변이체 효소액을 제조하였다.

4-2. Cefazolin 합성 활성 측정

Cefazolin 합성활성을 측정하기 위해서, TDA와 TzAAMe를 0.05 M ammonium phosphate (pH 7.5) 완충용액에 각각 10 mM 농도로 녹여 기질용액을 제조하였다. 기질용액 500 μL에 상기 실시예 4-1의 각 APA 변이체 효소액 500 μL를 첨가하여 25℃에서 효소반응을 10분 시킨 후 반응액 500 μL를 취하고, 여기에 0.2N HCl용액을 500 μL을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 그 후에 필터링(filtration)하고, 상기 실시예 2-1과 동일한 조건으로 HPLC분석하고, 표준물질의 정량곡선과 비교하여 정량하였다. 이때, 본 명세서에서 1 단위(unit, U)는 분당 1 μmole의 cefazolin을 생성할 수 있는 효소의 양으로 정의한다. 한편, 기질에 대한 비활성은 효소액 중의 단백질 양을 브래드포드의 방법 (Bradford, M., Anal. Biochem. 72: 248-254, 1976)에 따라 측정한 후에 1 mg 단백질에 해당하는 활성 단위로 표시하였다.

아실라제	Cefazolin synthesis		TzAAMe hydrolysis
아실라제	Specific activity (U/mg protein)	Fold	Specific activity (U/mg protein)	S/H ratio＊	Relative S/H ratio (Fold)
APA	0.2	1.0	4.2	0.05	1.0
ZSH1-13	2.5	12.5	8.6	0.3	6.1
ZSH2-5	8.6	43.0	9.1	0.9	19.8
ZSH3-1	13.1	65.5	7.5	1.7	36.7

*, Cefazolin synthesis 활성 / TzAAMe hydrolysis 활성

표 1은 본원 발명의 변이체들 중 대표적으로 ZSH1-13변이체, ZSH2-5변이체 및 ZSH3-1 변이체와 야생형 APA 간의 Cefazolin 합성 활성을 비교적으로 나타낸다. 표 1에서 보는 바와 같이, 야생형 APA와 비교하여 본원 발명의 변이체들은 연속적인 개량에 의해 cefazolin 합성 수율이 증가되었다. ZSH1-13은 야생형에 비해 약 12.5배 합성 수율이 증가되었고, ZSH2-5는 야생형 APA에 비해 약 43.0배 증가하였으며, 최종 변이체인 ZSH3-1은 야생형 APA에 비해 약 65.5배 증가하여, 현저히 높은 cefazolin 생산률을 나타냈다.

4-3. 반응 기질 TzAAMe 분해 활성 및 S/H ratio 측정

마찬가지로 APA 변이체들에 대한 TzAAMe 분해활성 정도를 측정하기 위해, 15 mM TzAAMe을 0.1 M Ammonium phosphate (pH 7.5) 완충용액에 녹인 기질용액을 제조하였다. 이 기질용액 100 μl에 상기 변이체들 각각의 효소액 100 μl를 첨가하여 25℃에서 효소반응을 10분 시킨 후, 상기 반응액 100 μl에 0.2 N HCl용액 100 μl를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 그 후에 상기 실시예 4-2와 동일한 방법으로 필터링(filtration) 및 HPLC 분석하여, 가수분해된 TzAAMe (hydrolyzed TzAAMe, 즉 TzAA)의 양을 산출하고 표준물질의 정량곡선과 비교하여 정량하였다. 이때, 1 단위(unit, U)는 분당 1 μmole의 TzAA를 생성할 수 있는 효소의 양으로 정의한다. 상기방법으로 도출한 TzAAMe 분해 활성과 실시예 4-2에서 얻은 Cefazolin 합성 활성의 값으로 S/H ratio를 측정하였다.

상기 표 1에서 보는 바와 같이, 야생형 APA와 비교하여 본원 발명의 변이체들은 상대적인 TzAAMe 분해 활성이 감소하여, TzAAMe 분해 활성 대비 Cefazolin 합성 활성의 비율(S/H ratio)이 현저히 증가한 것을 확인하였다. 특히, ZSH1-13, ZSH2-5, ZSH3-1의 순서로 S/H ratio가 높아졌으며, 최종 변이체인 ZSH3-1은 야생형 APA에비해 S/H ratio가 약 36.7배 증가하였다.

4-4. TDA 및 TzAAMe 으로부터 세파졸린 전환율 측정

시간 경과에 따른 Cefazolin의 전환율을 측정하기 위해서는, 전구체인 TDA 전환율을 측정하는 것으로 Cefazolin의 합성수율을 유추할 수 있다. 최종 변이체인 ZSH3-1를 이용하여 TDA 전환율을 측정하였다. 구체적으로, 클로람페니콜이 함유된 LB 배지의 양을 1L로 한 것 이외에는 상기 실시예 4-1과 동일한 방법으로 균주를 배양하였다. 배양한 세포현탁액은 4℃에서 8,000 rpm으로 10분간 원심분리하고 상층액을 제거한 후 cell pellet을 얻었다. 90 ml의 0.1 M ammonium phosphate buffer 로 현탁한 다음 초음파 파쇄기를 이용하여 20분간 세포 파쇄를 실행하였다. 이 효소액을 분리정제하기 위해 파쇄한 균체를 10℃에서 2시간 동안 정치시킨 다음 원심분리(4℃, 10,000 rpm, 30분)하여 상등액을 취하였다. 이 용액을 TDA 전환반응 실험에 사용하였다.

이렇게 제조된 분리정제액(상등액)을 3 U/ml 사용하였고, 0.1 M ammonium phosphate (pH 7.5) 완충용액에 각각 200 mM TDA와 240 mM TzAAMe를 넣어 기질 비율 1:1.2, 총 50 mL로 제조한 기질용액과 반응시켰다. 10℃에서 2시간동안 cefazolin 합성반응을 진행하면서 TDA 전환율과 TzAAMe 잔존양, TzAA 생성양을 HPLC로 상기 실시예 4-2와 동일한 방법으로 분석하였다.

그 결과 도 3에서 보는 바와 같이, 본원 발명의 ZSH3-1 변이 효소는 시간이 경과함에 따라 높은 TDA 전환율을 보였으며, TzAA는 세파졸린 합성 반응 초기와 거의 유사한 정도로 거의 생성되지 않았음이 확인되었다. 이로서 본 발명의 ZSH3-1 변이효소는 Cefazolin을 고효율로 합성할 뿐만 아니라 동시에 TzAAMe의 TzAA로의 분해율 및 세파졸린의 분해율을 현저하게 낮추어줌으로써 Cefazolin의 생산성이 뛰어남을 확인하였다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 세파졸린 생산성이 증가된 페니실린 G 아실라제 변이체 및 이의 이용에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 알파 서브유닛; 및 서열번호 2로 표시되는 베타 서브유닛을 포함하는 야생형 페니실린 G 아실라제 단백질(Achromobacter sp. CCM 4824 유래) 서열 중에서, A116αT, I156αN, N169αT, M3βV, S54βG, T64βA, H173βN, T251βA, T388βA, R478βH, E486βA, D541βE 및 Y555βC로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 변이 페니실린 G 아실라제, 및 이를 이용한 세파졸린의 합성(제조) 방법에 대한 것이다.

본 발명에서 개시하는 특유의 변이 형태를 지니는 Achromobacter sp. CCM 4824 유래 페니실린 G 아실라제 변이체들은, 이의 야생형 효소 및 기존에 알려진 다른 변이형태 대비, 특이적으로 세파졸린(cefazolin)에 대한 합성활성이 매우 높으면서도, 세파졸린 합성에 사용되는 기질에 대한 분해활성 대비 합성비율(S/H ratio)이 현저히 높아, 산업적 적용에 있어서 유의한 수준으로 세파졸린 생산성이 현저하게 증가되었으므로, 산업상 이용가능성이 높다.

한국생명공학연구원

KCTC13991BP

20191011

<110> AMICOGEN, INC. <120> Mutants of penicillin G acylase with increased production of cefazolin, and uses thereof <130> NP19-0100 <160> 35 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 247 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-subunit of wild-type Penicillin G acylase (APA) protein from Achromobacter sp. CCM 4824(amino acid sequence) <400> 1 Ala Gln Pro Val Ala Pro Ala Ala Gly Gln Thr Ser Glu Ala Val Ala 1 5 10 15 Ala Arg Pro Gln Thr Ala Asp Gly Lys Val Thr Ile Arg Arg Asp Ala 20 25 30 Tyr Gly Met Pro His Val Tyr Ala Asp Thr Val Tyr Gly Ile Phe Tyr 35 40 45 Gly Tyr Gly Tyr Ala Val Ala Gln Asp Arg Leu Phe Gln Met Glu Met 50 55 60 Ala Arg Arg Ser Thr Gln Gly Arg Val Ala Glu Val Leu Gly Ala Ser 65 70 75 80 Met Val Gly Phe Asp Lys Ser Ile Arg Ala Asn Phe Ser Pro Glu Arg 85 90 95 Ile Gln Arg Gln Leu Ala Ala Leu Pro Ala Ala Asp Arg Gln Val Leu 100 105 110 Asp Gly Tyr Ala Ala Gly Met Asn Ala Trp Leu Ala Arg Val Arg Ala 115 120 125 Gln Pro Gly Gln Leu Met Pro Lys Glu Phe Asn Asp Leu Gly Phe Ala 130 135 140 Pro Ala Asp Trp Thr Ala Tyr Asp Val Ala Met Ile Phe Val Gly Thr 145 150 155 160 Met Ala Asn Arg Phe Ser Asp Ala Asn Ser Glu Ile Asp Asn Leu Ala 165 170 175 Leu Leu Thr Ala Leu Lys Asp Arg His Gly Ala Ala Asp Ala Met Arg 180 185 190 Ile Phe Asn Gln Leu Arg Trp Leu Thr Asp Ser Arg Ala Pro Thr Thr 195 200 205 Val Pro Ala Glu Ala Gly Ser Tyr Gln Pro Pro Val Phe Gln Pro Asp 210 215 220 Gly Ala Asp Pro Leu Ala Tyr Ala Leu Pro Arg Tyr Asp Gly Thr Pro 225 230 235 240 Pro Met Leu Glu Arg Val Val 245 <210> 2 <211> 557 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta-subunit of wild-type Penicillin G acylase (APA) protein from Achromobacter sp. CCM 4824(amino acid sequence) <400> 2 Ser Asn Met Trp Ile Val Gly Arg Asp His Ala Lys Asp Ala Arg Ser 1 5 10 15 Ile Leu Leu Asn Gly Pro Gln Phe Gly Trp Trp Asn Pro Ala Tyr Thr 20 25 30 Tyr Gly Ile Gly Leu His Gly Ala Gly Phe Asp Val Val Gly Asn Thr 35 40 45 Pro Phe Ala Tyr Pro Ser Ile Leu Phe Gly His Asn Ala His Val Thr 50 55 60 Trp Gly Ser Thr Ala Gly Phe Gly Asp Asp Val Asp Ile Phe Ala Glu 65 70 75 80 Lys Leu Asp Pro Ala Asp Arg Thr Arg Tyr Phe His Asp Gly Gln Trp 85 90 95 Lys Thr Leu Glu Lys Arg Thr Asp Leu Ile Leu Val Lys Asp Ala Ala 100 105 110 Pro Val Thr Leu Asp Val Tyr Arg Ser Val His Gly Leu Ile Val Lys 115 120 125 Phe Asp Asp Ala Gln His Val Ala Tyr Ala Lys Ala Arg Ala Trp Glu 130 135 140 Gly Tyr Glu Leu Gln Ser Leu Met Ala Trp Thr Arg Lys Thr Gln Ser 145 150 155 160 Ala Asn Trp Glu Gln Trp Lys Ala Gln Ala Ala Arg His Ala Leu Thr 165 170 175 Ile Asn Trp Tyr Tyr Ala Asp Asp Arg Gly Asn Ile Gly Tyr Ala His 180 185 190 Thr Gly Phe Tyr Pro Arg Arg Arg Pro Gly His Asp Pro Arg Leu Pro 195 200 205 Val Pro Gly Thr Gly Glu Met Asp Trp Leu Gly Leu Leu Pro Phe Ser 210 215 220 Thr Asn Pro Gln Val Tyr Asn Pro Arg Gln Gly Phe Ile Ala Asn Trp 225 230 235 240 Asn Asn Gln Pro Met Arg Gly Tyr Pro Ser Thr Asp Leu Phe Ala Ile 245 250 255 Val Trp Gly Gln Ala Asp Arg Tyr Ala Glu Ile Glu Thr Arg Leu Lys 260 265 270 Ala Met Thr Ala Asn Gly Gly Lys Val Ser Ala Gln Gln Met Trp Asp 275 280 285 Leu Ile Arg Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Val Asn Arg Arg His Phe Leu 290 295 300 Pro Phe Leu Gln Arg Ala Val Gln Gly Leu Pro Ala Asp Asp Pro Arg 305 310 315 320 Val Arg Leu Val Ala Gly Leu Ala Ala Trp Asp Gly Met Met Thr Ser 325 330 335 Glu Arg Gln Pro Gly Tyr Phe Asp Asn Ala Gly Pro Ala Val Met Asp 340 345 350 Ala Trp Leu Arg Ala Met Leu Arg Arg Thr Leu Ala Asp Glu Met Pro 355 360 365 Ala Asp Phe Phe Lys Trp Tyr Ser Ala Thr Gly Tyr Pro Thr Pro Gln 370 375 380 Ala Pro Ala Thr Gly Ser Leu Asn Leu Thr Thr Gly Val Lys Val Leu 385 390 395 400 Phe Asn Ala Leu Ala Gly Pro Glu Ala Gly Val Pro Gln Arg Tyr Asp 405 410 415 Phe Phe Asn Gly Ala Arg Ala Asp Asp Val Ile Leu Ala Ala Leu Asp 420 425 430 Asp Ala Leu Ala Ala Leu Arg Gln Ala Tyr Gly Gln Asp Pro Ala Ala 435 440 445 Trp Lys Ile Pro Ala Pro Pro Met Val Phe Ala Pro Lys Asn Phe Leu 450 455 460 Gly Val Pro Gln Ala Asp Ala Lys Ala Val Leu Cys Tyr Arg Ala Thr 465 470 475 480 Gln Asn Arg Gly Thr Glu Asn Asn Met Thr Val Phe Asp Gly Lys Ser 485 490 495 Val Arg Ala Val Asp Val Val Ala Pro Gly Gln Ser Gly Phe Val Ala 500 505 510 Pro Asp Gly Thr Pro Ser Pro His Thr Arg Asp Gln Phe Asp Leu Tyr 515 520 525 Asn Thr Phe Gly Ser Lys Arg Val Trp Phe Thr Ala Asp Glu Val Arg 530 535 540 Arg Asn Ala Thr Ser Glu Glu Thr Leu Arg Tyr Pro Arg 545 550 555 <210> 3 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> spacer peptide <400> 3 Arg Asp Pro Ala Thr Arg Gly Val Val Asp Gly Ala Pro Ala Thr Leu 1 5 10 15 Arg Ala Gln Leu Ala Ala Gln Tyr Ala Gln Ser Gly Gln Pro Gly Ile 20 25 30 Ala Gly Phe Pro Thr Thr 35 <210> 4 <211> 843 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> wild-type Penicillin G acylase (APA) protein from Achromobacter sp. CCM 4824(amino acid sequence, precursor, full) <400> 4 Met Ala Gln Pro Val Ala Pro Ala Ala Gly Gln Thr Ser Glu Ala Val 1 5 10 15 Ala Ala Arg Pro Gln Thr Ala Asp Gly Lys Val Thr Ile Arg Arg Asp 20 25 30 Ala Tyr Gly Met Pro His Val Tyr Ala Asp Thr Val Tyr Gly Ile Phe 35 40 45 Tyr Gly Tyr Gly Tyr Ala Val Ala Gln Asp Arg Leu Phe Gln Met Glu 50 55 60 Met Ala Arg Arg Ser Thr Gln Gly Arg Val Ala Glu Val Leu Gly Ala 65 70 75 80 Ser Met Val Gly Phe Asp Lys Ser Ile Arg Ala Asn Phe Ser Pro Glu 85 90 95 Arg Ile Gln Arg Gln Leu Ala Ala Leu Pro Ala Ala Asp Arg Gln Val 100 105 110 Leu Asp Gly Tyr Ala Ala Gly Met Asn Ala Trp Leu Ala Arg Val Arg 115 120 125 Ala Gln Pro Gly Gln Leu Met Pro Lys Glu Phe Asn Asp Leu Gly Phe 130 135 140 Ala Pro Ala Asp Trp Thr Ala Tyr Asp Val Ala Met Ile Phe Val Gly 145 150 155 160 Thr Met Ala Asn Arg Phe Ser Asp Ala Asn Ser Glu Ile Asp Asn Leu 165 170 175 Ala Leu Leu Thr Ala Leu Lys Asp Arg His Gly Ala Ala Asp Ala Met 180 185 190 Arg Ile Phe Asn Gln Leu Arg Trp Leu Thr Asp 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Ala Gln His Val Ala Tyr Ala Lys Ala Arg Ala Trp Glu 130 135 140 Gly Tyr Glu Leu Gln Ser Leu Met Ala Trp Thr Arg Lys Thr Gln Ser 145 150 155 160 Ala Asn Trp Glu Gln Trp Lys Ala Gln Ala Ala Arg Asn Ala Leu Thr 165 170 175 Ile Asn Trp Tyr Tyr Ala Asp Asp Arg Gly Asn Ile Gly Tyr Ala His 180 185 190 Thr Gly Phe Tyr Pro Arg Arg Arg Pro Gly His Asp Pro Arg Leu Pro 195 200 205 Val Pro Gly Thr Gly Glu Met Asp Trp Leu Gly Leu Leu Pro Phe Ser 210 215 220 Thr Asn Pro Gln Val Tyr Asn Pro Arg Gln Gly Phe Ile Ala Asn Trp 225 230 235 240 Asn Asn Gln Pro Met Arg Gly Tyr Pro Ser Ala Asp Leu Phe Ala Ile 245 250 255 Val Trp Gly Gln Ala Asp Arg Tyr Ala Glu Ile Glu Thr Arg Leu Lys 260 265 270 Ala Met Thr Ala Asn Gly Gly Lys Val Ser Ala Gln Gln Met Trp Asp 275 280 285 Leu Ile Arg Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Val Asn Arg Arg His Phe Leu 290 295 300 Pro Phe Leu Gln Arg Ala Val Gln Gly Leu Pro Ala Asp Asp Pro Arg 305 310 315 320 Val Arg Leu Val Ala Gly Leu Ala Ala Trp Asp Gly Met Met Thr Ser 325 330 335 Glu Arg Gln 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Gly Tyr Glu Leu Gln Ser Leu Met Ala Trp Thr Arg Lys Thr Gln Ser 145 150 155 160 Ala Asn Trp Glu Gln Trp Lys Ala Gln Ala Ala Arg Asn Ala Leu Thr 165 170 175 Ile Asn Trp Tyr Tyr Ala Asp Asp Arg Gly Asn Ile Gly Tyr Ala His 180 185 190 Thr Gly Phe Tyr Pro Arg Arg Arg Pro Gly His Asp Pro Arg Leu Pro 195 200 205 Val Pro Gly Thr Gly Glu Met Asp Trp Leu Gly Leu Leu Pro Phe Ser 210 215 220 Thr Asn Pro Gln Val Tyr Asn Pro Arg Gln Gly Phe Ile Ala Asn Trp 225 230 235 240 Asn Asn Gln Pro Met Arg Gly Tyr Pro Ser Ala Asp Leu Phe Ala Ile 245 250 255 Val Trp Gly Gln Ala Asp Arg Tyr Ala Glu Ile Glu Thr Arg Leu Lys 260 265 270 Ala Met Thr Ala Asn Gly Gly Lys Val Ser Ala Gln Gln Met Trp Asp 275 280 285 Leu Ile Arg Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Val Asn Arg Arg His Phe Leu 290 295 300 Pro Phe Leu Gln Arg Ala Val Gln Gly Leu Pro Ala Asp Asp Pro Arg 305 310 315 320 Val Arg Leu Val Ala Gly Leu Ala Ala Trp Asp Gly Met Met Thr Ser 325 330 335 Glu Arg Gln Pro Gly Tyr Phe Asp Asn Ala Gly Pro Ala Val Met Asp 340 345 350 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843 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of ZSH3-1 mutant (precursor, full) <400> 11 Met Ala Gln Pro Val Ala Pro Ala Ala Gly Gln Thr Ser Glu Ala Val 1 5 10 15 Ala Ala Arg Pro Gln Thr Ala Asp Gly Lys Val Thr Ile Arg Arg Asp 20 25 30 Ala Tyr Gly Met Pro His Val Tyr Ala Asp Thr Val Tyr Gly Ile Phe 35 40 45 Tyr Gly Tyr Gly Tyr Ala Val Ala Gln Asp Arg Leu Phe Gln Met Glu 50 55 60 Met Ala Arg Arg Ser Thr Gln Gly Arg Val Ala Glu Val Leu Gly Ala 65 70 75 80 Ser Met Val Gly Phe Asp Lys Ser Ile Arg Ala Asn Phe Ser Pro Glu 85 90 95 Arg Ile Gln Arg Gln Leu Ala Ala Leu Pro Ala Ala Asp Arg Gln Val 100 105 110 Leu Asp Gly Tyr Ala Ala Gly Met Asn Ala Trp Leu Ala Arg Val Arg 115 120 125 Ala Gln Pro Gly Gln Leu Met Pro Lys Glu Phe Asn Asp Leu Gly Phe 130 135 140 Ala Pro Ala Asp Trp Thr Ala Tyr Asp Val Ala Met Asn Phe Val Gly 145 150 155 160 Thr Met Ala Asn Arg Phe Ser Asp Ala Thr Ser Glu Ile Asp Asn Leu 165 170 175 Ala Leu Leu Thr Ala Leu Lys Asp Arg His Gly Ala Ala Asp Ala Met 180 185 190 Arg Ile Phe Asn Gln Leu Arg Trp Leu Thr Asp Ser Arg Ala Pro Thr 195 200 205 Thr Val Pro Ala Glu Ala Gly Ser Tyr Gln Pro Pro Val Phe Gln Pro 210 215 220 Asp Gly Ala Asp Pro Leu Ala Tyr Ala Leu Pro Arg Tyr Asp Gly Thr 225 230 235 240 Pro Pro Met Leu Glu Arg Val Val Arg Asp Pro Ala Thr Arg Gly Val 245 250 255 Val Asp Gly Ala Pro Ala Thr Leu Arg Ala Gln Leu Ala Ala Gln Tyr 260 265 270 Ala Gln Ser Gly Gln Pro Gly Ile Ala Gly Phe Pro Thr Thr Ser Asn 275 280 285 Val Trp Ile Val Gly Arg Asp His Ala Lys Asp Ala Arg Ser Ile Leu 290 295 300 Leu Asn Gly Pro Gln Phe Gly Trp Trp Asn Pro Ala Tyr Thr Tyr Gly 305 310 315 320 Ile Gly Leu His Gly Ala Gly Phe Asp Val Val Gly Asn Thr Pro Phe 325 330 335 Ala Tyr Pro Gly Ile Leu Phe Gly His Asn Ala His Val Ala Trp Gly 340 345 350 Ser Thr Ala Gly Phe Gly Asp Asp Val Asp Ile Phe Ala Glu Lys Leu 355 360 365 Asp Pro Ala Asp Arg Thr Arg Tyr Phe His Asp Gly Gln Trp Lys Thr 370 375 380 Leu Glu Lys Arg Thr Asp Leu Ile Leu Val Lys Asp Ala Ala Pro Val 385 390 395 400 Thr Leu Asp Val Tyr Arg Ser Val His Gly Leu Ile Val Lys Phe Asp 405 410 415 Asp Ala Gln His Val Ala Tyr Ala Lys Ala Arg Ala Trp Glu Gly Tyr 420 425 430 Glu Leu Gln Ser Leu Met Ala Trp Thr Arg Lys Thr Gln Ser Ala Asn 435 440 445 Trp Glu Gln Trp Lys Ala Gln Ala Ala Arg Asn Ala Leu Thr Ile Asn 450 455 460 Trp Tyr Tyr Ala Asp Asp Arg Gly Asn Ile Gly Tyr Ala His Thr Gly 465 470 475 480 Phe Tyr Pro Arg Arg Arg Pro Gly His Asp Pro Arg Leu Pro Val Pro 485 490 495 Gly Thr Gly Glu Met Asp Trp Leu Gly Leu Leu Pro Phe Ser Thr Asn 500 505 510 Pro Gln Val Tyr Asn Pro Arg Gln Gly Phe Ile Ala Asn Trp Asn Asn 515 520 525 Gln Pro Met Arg Gly Tyr Pro Ser Ala Asp Leu Phe Ala Ile Val Trp 530 535 540 Gly Gln Ala Asp Arg Tyr Ala Glu Ile Glu Thr Arg Leu Lys Ala Met 545 550 555 560 Thr Ala Asn Gly Gly Lys Val Ser Ala Gln Gln Met Trp Asp Leu Ile 565 570 575 Arg Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Val Asn Arg Arg His Phe Leu Pro Phe 580 585 590 Leu Gln Arg Ala Val Gln Gly Leu Pro Ala Asp Asp Pro Arg Val Arg 595 600 605 Leu Val Ala Gly Leu Ala Ala Trp Asp Gly Met Met Thr Ser Glu Arg 610 615 620 Gln Pro Gly Tyr Phe Asp Asn Ala Gly Pro Ala Val Met Asp Ala Trp 625 630 635 640 Leu Arg Ala Met Leu Arg Arg Thr Leu Ala Asp Glu Met Pro Ala Asp 645 650 655 Phe Phe Lys Trp Tyr Ser Ala Thr Gly Tyr Pro Thr Pro Gln Ala Pro 660 665 670 Ala Ala Gly Ser Leu Asn Leu Thr Thr Gly Val Lys Val Leu Phe Asn 675 680 685 Ala Leu Ala Gly Pro Glu Ala Gly Val Pro Gln Arg Tyr Asp Phe Phe 690 695 700 Asn Gly Ala Arg Ala Asp Asp Val Ile Leu Ala Ala Leu Asp Asp Ala 705 710 715 720 Leu Ala Ala Leu Arg Gln Ala Tyr Gly Gln Asp Pro Ala Ala Trp Lys 725 730 735 Ile Pro Ala Pro Pro Met Val Phe Ala Pro Lys Asn Phe Leu Gly Val 740 745 750 Pro Gln Ala Asp Ala Lys Ala Val Leu Cys Tyr His Ala Thr Gln Asn 755 760 765 Arg Gly Thr Ala Asn Asn Met Thr Val Phe Asp Gly Lys Ser Val Arg 770 775 780 Ala Val Asp Val Val Ala Pro Gly Gln Ser Gly Phe Val Ala Pro Asp 785 790 795 800 Gly Thr Pro Ser Pro His Thr Arg Asp Gln Phe Asp Leu Tyr Asn Thr 805 810 815 Phe Gly Ser Lys Arg Val Trp Phe Thr Ala Glu Glu Val Arg Arg Asn 820 825 830 Ala Thr Ser Glu Glu Thr Leu Arg Cys Pro Arg 835 840 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T3 primer <400> 12 aattaaccct cactaaaggg a 21 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7 primer <400> 13 taatacgact cactataggg 20 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13F primer <400> 14 cgccagggtt ttcccagtca cga 23 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13R primer <400> 15 agcggataac aatttcacac agga 24 <210> 16 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH116a-F <400> 16 gttctggacg gttacrctgc tggcatgaac g 31 <210> 17 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH116a-R <400> 17 cgttcatgcc agcagygtaa ccgtccagaa c 31 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH169a-F <400> 18 cgtttcagcg atgcaamctc cgagatcgac aac 33 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH169a-R <400> 19 gttgtcgatc tcggagkttg catcgctgaa acg 33 <210> 20 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH251b-F <400> 20 gcgcggttac ccaagcrctg atctgttcgc gatc 34 <210> 21 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH251b-R <400> 21 gatcgcgaac agatcagygc ttgggtaacc gcgc 34 <210> 22 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH555b-F <400> 22 gaggagacgc tgcgttrccc gcgttaataa aagc 34 <210> 23 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH555b-R <400> 23 gcttttatta acgcgggyaa cgcagcgtct cctc 34 <210> 24 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH201a-F <400> 24 gctgcgctgg ctgascgatt ctcgtgctc 29 <210> 25 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH201a-R <400> 25 gagcacgaga atcgstcagc cagcgcagc 29 <210> 26 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH64b-F <400> 26 cataacgctc acgtarcctg gggctctact g 31 <210> 27 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH64b-R <400> 27 cagtagagcc ccaggytacg tgagcgttat g 31 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH388b-F <400> 28 cgcaggcacc ggcgrctggt tccctgaacc 30 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH388b-R <400> 29 ggttcaggga accagycgcc ggtgcctgcg 30 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH54b-F <400> 30 cgttcgctta tccgrgyatt ctgtttggcc 30 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH54b-R <400> 31 ggccaaacag aatrcycgga taagcgaacg 30 <210> 32 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH226b-F <400> 32 ctgccgttca gcaccamccc acaggtgtac aac 33 <210> 33 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH226b-R <400> 33 gttgtacacc tgtgggktgg tgctgaacgg cag 33 <210> 34 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH478b-F <400> 34 cggttctgtg ttaccrtgcc acccagaatc g 31 <210> 35 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH478b-R <400> 35 cgattctggg tggcayggta acacagaacc g 31

Claims

서열번호 1로 표시되는 알파 서브유닛; 및 서열번호 2로 표시되는 베타 서브유닛을 포함하는 야생형 페니실린 G 아실라제 단백질 서열 중에서, A116αT, I156αN, N169αT, M3βV, H173βN, T251βA, T388βA, R478βH, E486βA, D541βE 및 Y555βC로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 변이 페니실린 G 아실라제.
제1항에 있어서, 상기 야생형 페니실린 G 아실라제 단백질 서열 중에서 I156αN, N169αT, H173βN, T251βA, E486βA 및 Y555βC의 변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 변이 페니실린 G 아실라제.
제2항에 있어서, 상기 변이 페니실린 G 아실라제는
서열번호 5로 표시되는 알파 서브유닛; 및
서열번호 6으로 표시되는 베타 서브유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는 변이 페니실린 G 아실라제.
제2항에 있어서, 상기 변이 페니실린 G 아실라제는 G49αF, T201αS, M3βV, T64βA, T225βN 및 T388βA로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 변이를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 변이 페니실린 G 아실라제.
제4항에 있어서, 상기 변이 페니실린 G 아실라제는 M3βV, T64βA 및 T388βA의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 변이 페니실린 G 아실라제.
제5항에 있어서, 상기 변이 페니실린 G 아실라제는
서열번호 5로 표시되는 알파 서브유닛; 및
서열번호 8로 표시되는 베타 서브유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는 변이 페니실린 G 아실라제.
제4항에 있어서, 상기 변이 페니실린 G 아실라제는 S54βG, S150βT, N226βT, A310βD, R478βH 및 D541βE로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 변이를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 변이 페니실린 G 아실라제.
제7항에 있어서, 상기 변이 페니실린 G 아실라제는 S54βG, R478βH 및 D541βE의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 변이 페니실린 G 아실라제.
제8항에 있어서, 상기 변이 페니실린 G 아실라제는
서열번호 5로 표시되는 알파 서브유닛; 및
서열번호 10으로 표시되는 베타 서브유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는 변이 페니실린 G 아실라제.
제1항 내지 9항 중 어느 한 항의 변이 페니실린 G 아실라제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
제10항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터.
제11항의 발현벡터에 의해 형질전환된 숙주세포.
제12항에 있어서, 상기 숙주세포는 클로스트리디아 속(Clostridia spp.) 에세리치아 속(Escherichia spp.), 아세토박터 속(Acetobacter spp.), 아에로모나스 속 (Aeromonas spp.), 알칼리제네스 속(Alcaligenes spp.), 아파노클라디움 속(Aphanocladium spp.), 바실러스 속(Bacillus spp.), 세팔로스포리움 속(Cephalosporium spp.), 플라보박테리움 속(Flavobacterium spp.), 클루이베라 속(Kluyvera spp.), 미코플라나 속(Mycoplana spp.), 프로타미노박터 속(Protaminobacter spp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas spp.), 아크로모박터 속(Achromobacter spp.) 및 잔토모나스 속(Xanthomonas spp.)으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 속(genus) 미생물인 것을 특징으로 하는 형질전환된 숙주세포.
제13항에 있어서, 상기 에세리치아 속의 미생물은 서열번호 5 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터에 의해 형질전환된 에세리치아 콜라이 MC1061/pBC-ZSH3-1(Escherichia coli MC1061/pBC-ZSH3-1, 기탁번호 KCTC 13991BP)인 것을 특징으로 하는 형질전환된 숙주세포.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 변이 페니실린 G 아실라제를 포함하는 세파졸린(cefazolin) 제조용 조성물.
테트라졸릴아세트산 에스테르와 3-[5-메틸-1,3,4-티오디아졸-2-일]-7-아미노세팔로스포린산으로부터 세파졸린을 효소적으로 합성하는 방법에 있어서, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 변이 페니실린 G 아실라제를 사용하는 것을 특징으로 하는 세파졸린의 효소적 합성 방법.