CN103805671B - 一种制备头孢氨苄的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备头孢氨苄的方法,该方法是将左旋苯甘氨酸酯类衍生物与7-ADCA按照摩尔比为1.15~1.6:1的比例投料,再按照7-ADCA1~2倍的投料量加入催化剂青霉素酰化酶进行酰化反应;其中所述的青霉素酰化酶其编码的基因序列如SEQ ID NO:3所示。本发明有效克服了酶缩合反应过程中的逆反应,由此大大降低了侧链的使用量、避免了侧链过高消耗所导致的产品杂质多的问题,由此也避免了目的产物难以纯化的问题。与此同时,本发明方法还大大提高了7-ADCA的转化率(采用本发明方法可使7-ADCA平均转化率达到98%以上),由此也进一步提高了产品品质,降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及抗生素合成技术,具体的说是一种制备头孢氨苄的方法。
背景技术
头孢氨苄,英文名称Cephalexin,是一种半合成β-内酰胺类抗生素,具有广谱抗菌作用,对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抗菌作用,其作用机理是通过抑制细胞壁的合成,使细胞内容物膨胀至破裂溶解,从而达到杀菌作用。
头孢氨苄的合成工艺主要有化学方法合成和酶法合成两种,化学合成法是在二氯甲烷溶剂中从左旋苯甘氨酸乙基邓钾盐混酐后,与经过羧基保护的7ADCA进行反应,经化学方法缩合而得到头孢氨苄。最终每生产1kg头孢氨苄会产生10kg以上的三废。在这种情况下,酶法合成工艺逐渐受到更多的关注和研究。酶法合成技术是在青霉素酰化酶的催化下,通过用侧链(即左旋苯甘氨酸衍生物,如苯甘氨酸甲(乙)酯及其盐、苯甘氨酰胺及其盐等)对7-ADCA进行酰化反应来生产头孢氨苄,使侧链与7-ADCA缩合制得头孢氨苄。这一工艺已被专利文献广泛描述,如CN100368554C、CN1063491C及CN02826109.7等。与传统的化学方法相比较,酶法合成无论从降低成本、简化工艺,还是从环境友好等方面考虑,都具有明显优势。但其仍有许多不尽人意之处。如:现有酶法合成头孢氨苄的工艺其酶缩合反应过程中存在较严重的酶解反应,即反应产物在酶的作用下再度逆分解成原料,由此大大影响了正反应产率。为提高酶缩合反应的产率,生产者通常是加大侧链对母核的投料量,有的甚至过量4~6倍(摩尔比),由此又造成侧链过高消耗,并在产品中引入了不需要的杂质,最终导致产物纯度低以及产品分离、纯化困难等诸多问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备头孢氨苄的新方法,以解决现有工艺存在侧链投料量大、酶解反应严重、产品纯度低、制备成本高,环境污染严重等问题。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
一种制备头孢氨苄的方法,该方法是将左旋苯甘氨酸酯类衍生物与7-ADCA按照摩尔比为1.15~1.6:1的比例投料,再按照1~2倍于7-ADCA的投料量加入催化剂青霉素酰化酶进行酰化反应;其中所述的青霉素酰化酶其编码的基因序列如SEQ ID NO:3所示。
具体的,本发明的方法包括以下步骤:
a)将左旋苯甘氨酸酯类衍生物在30~120min内缓慢加入到7-ADCA水溶液中,然后加入所 述的青霉素酰化酶,在15~25℃进行酰化反应;反应过程中PH维持在6.0~7.2;
b)待反应终止后,过滤80~120目筛网,即得到滤物——青霉素酰化酶,滤液——头孢氨苄混悬液;
c)将头孢氨苄混悬液过滤,得到头孢氨苄粗粉。
所述左旋苯甘氨酸酯类衍生物为左旋苯甘氨酸甲酯及其盐、苯甘氨酸乙酯及其盐中的任意一种。
优选的,所述左旋苯甘氨酸酯类衍生物为左旋苯甘氨酸甲酯盐。
所述左旋苯甘氨酸甲酯盐为左旋苯甘氨酸甲酯盐酸盐或左旋苯甘氨酸甲酯硫酸盐。
加入到所述7-ADCA水溶液中的左旋苯甘氨酸甲酯盐为左旋苯甘氨酸甲酯盐固体、左旋苯甘氨酸甲酯盐溶液或左旋苯甘氨酸甲酯盐混悬液。
所述7-ADCA水溶液其质量浓度为10~15%,其水溶液的温度为15~25℃,PH为7.8~8.0。
a)步所述酰化反应过程中,使用氨水维持PH在6.0~7.2。
待a)步所述酰化反应的反应液出现浑浊之后,开始向反应液中缓慢加入纯化水。
具体的,所述a)步,将从开始反应至反应液开始出现浑浊的时间记为A,当反应时间为2~3×A时,开始缓慢加入纯化水,并在加入纯化水的过程中用HPLC法判断反应终点。
具体的,所加入纯化水的量与反应液的体积比为0.15~0.5∶1;所述加入纯化水的过程用时20~60min。
优选的,所述左旋苯甘氨酸酯类衍生物与所述7-ADCA按照摩尔比为1.15~1.3∶1的比例投料。
进一步的,所述c)步,用头孢氨苄混悬液过滤后的滤液洗涤所得到的青霉素酰化酶,然后过滤80~120目筛网,得到滤物——青霉素酰化酶,滤液——头孢氨苄混悬液,然后将头孢氨苄混悬液再次过滤,得到头孢氨苄粗粉;重复本步骤,收集98%以上的头孢氨苄粗粉。
更进一步的,将上述所收集的全部的头孢氨苄粗粉与最后所得滤液混合后,用硫酸调PH至0.1~2.5,然后过0.45μm滤膜过滤后得料液,将料液温度升高至30~60℃、用氨水调节料液PH至4.0~6.0,然后养晶、过滤、水洗涤、丙酮洗涤,最后干燥,得终产物。
上述青霉素酰化酶的制备方法如下:
1)构建SEQ ID NO:3所示的青霉素酰化酶的编码基因:
1.1)根据Genebank中无色杆菌属CCM4824青霉素酰化酶蛋白序列(SEQ ID NO:1,Genebank:AY919310.1),将其第330位苯丙氨酸替换为丙氨酸,第415位赖氨酸替换为精氨酸,第770位 亮氨酸替换为苯丙氨酸,在这三个位置引入突变位点,即得到如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列;
1.2)根据SEQ ID NO:2所示氨基酸序列,使用在线设计工具Jcat反向设计出核苷酸序列,针对宿主大肠杆菌表达所需的优选密码子和基因高效表达所需的G+C碱基含量,优化上述设计的核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示序列,SEQ ID NO:3所示序列与野生型基因序列SEQ ID NO:4相比:大肠杆菌稀有密码子从野生型(SEQ ID NO:4)的55个降低到了2个,G+C碱基含量由野生型(SEQ ID NO:4)的68.75%下降到57.25%;同时在设计过程中去除BamHI酶切位点,有利后期基因操作。通过上述系列设计有利于宿主菌大肠杆菌高效表达该基因(SEQ ID NO:3)。
2)构建含有1)步所述编码基因的重组载体:
所述重组载体所用到的质粒为PET系列诱导型载体,优选PET28质粒;
2.1)将SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列进行全基因合成,获得ASPGA基因;
2.2)将所述PET28质粒和所述ASPGA基因分别使用BamHⅠ和HindⅢ双酶切体系进行酶切,分别得到ASPGA基因片段和PET28质粒片段;
2.3)使用T4连接酶对ASPGA基因片段和PET28质粒片段进行连接,将连接后的产物转化到宿主菌中,然后涂布到LB培养抗性平板,然后挑取生长出的阳性克隆接种到LB液体培养基进行培养后,提取质粒即得到所构建的重组载体——表达载体PET28-ASPGA。
3)构建含有2)步所述重组载体的重组菌株:
在E.coli BL21(DE3)或E.coli JM109(DE3)感受态细胞悬液中加入所述重组载体混匀,然后经过冷却、热激、冷却、复苏等步骤,完成转化,吸取转化后的细胞涂布加有卡那霉素抗生素的平板,倒置培养,生长出的菌株即为重组菌株——转化体BL21(DE3)/PET28-ASPGA或转化体JM109(DE3)/PET28-ASPGA;
构建重组菌株时所用的宿主细胞可选择生工生物工程(上海)有限公司出售的E.coliBL21(DE3)或E.coli JM109(DE3)。
4)步骤3)所述重组菌株的诱导表达:
挑取上述重组菌株的单菌落于含Kan(浓度50μg/ml)的LB液体培养基中,37℃、200r/min条件下培养8~10h后成为活化种子,然后将活化种子以2%的接种量接种到M9培养基中(装液量为50ml/250ml),23℃、200r/min条件下培养14h后,加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)使其终浓度为0.05mM,进行诱导表达,继续培养12h,得菌液。
5)粗制酶液的制备及其进一步的分离纯化和固定化
5.1)将4)步得到的菌液离心,收集菌体,然后加入与菌液等体积的磷酸盐缓冲液(0.02M, PH8.0)重悬,使用超声细胞破壁仪破壁20min,然后离心取上清,即为粗制酶液;
5.2)粗制酶液1L,使用0.01M的盐酸调整PH至5.5,于50℃下保温30min,然后离心除去沉淀;在上清液中加入15%(质量体积比)的硫酸铵,充分混合后离心除去沉淀,然后在上清液中再次加入15%(质量体积比)的硫酸铵,充分混合后离心收集沉淀;将沉淀溶解于200ml磷酸盐缓冲液(0.2M,PH8.0)中,即得到浓缩酶液;
5.3)取浓缩酶液200ml,加入磷酸盐使其终浓度为0.4M,并调节PH至6.8~7.2,然后加入活化好的LX-1000HA载体20g,于25℃、150rpm条件下搅拌固定化24h,真空抽滤后收集固定化酶,用2倍体积去离子水冲洗3-5遍,过滤收集得到固定化酶,即为a)步所述其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的青霉素酰化酶。
本发明有效克服了酶缩合反应过程中的逆反应,由此大大降低了侧链的使用量、避免了侧链过高消耗所导致的产品杂质多的问题,由此也避免了目的产物难以纯化的问题。与此同时,本发明方法还大大提高了7-ADCA的转化率(采用本发明方法可使7-ADCA平均转化率达到95%以上),由此也进一步提高了产品品质,降低了生产成本。
附图说明
图1是本发明所述其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的青霉素酰化酶的重组载体。
图2是本发明所制备的头孢氨苄的HPLC谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步说明,但不以任何方式意味着对本发明的保护范围做任何限制。
以下实施例1~6中,进行HPLC分析的条件为:
填充剂:十八烷基硅烷键合硅胶;
流动相A:0.01mol/L醋酸钠水溶液(用冰醋酸调节pH值至5.0);流动相B:甲醇;流速为1.0ml/min,梯度洗脱,见表1;
检测波长:220nm;
取杂质对照品溶液10μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸峰、α-苯甘氨酸峰、PGME峰和CEX峰的分离度应符合要求。
表1:
以下实施例16中,7-ADCA溶液的配制如下:
称取15.0g的7-ADCA加入到100~150ml纯化水中,滴加氨水控制PH为7.8~8.0,得到7-ADCA的溶液,控温到15~25℃,备用。
实施例1~6中采用的青霉素酰化酶为编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的特定青霉素酰化酶。
实施例1
1)取D-苯甘氨酸甲酯硫酸盐固体(以左旋苯甘氨酸甲酯计13.0g),缓慢加入到7-ADCA水溶液中(100ml,质量浓度15%),用时30~120min,以保证体系PH值自然下降,并用氨水保持PH在6.0~7.2;然后加入特定的青霉素酰化酶15g,在15~25℃下开始反应。
2)将从开始反应至开始出现浑浊的时间记为A,当反应时间达2~3×A时,开始缓慢加入25ml纯化水,用时20~60分钟,同时在加入纯化水的过程中采用HPLC方法判断反应终点。
以上1)~2)操作过程中,始终使用氨水保持体系的PH在6.0~7.2;
至此,根据HPLC检测出的7-ADCA浓度计算,本反应的转化率为98%。
3)待应终止后,将反应液过100目筛网,分别得到青霉素酰化酶和头孢氨苄混悬液,将头孢氨苄混悬液过滤,分别得到头孢氨苄粗粉和滤液。
4)用所得滤液洗涤青霉素酰化酶,重新过100目筛网,再次分离出所述青霉素酰化酶后,将得到的混悬液再次进行过滤,过滤后得到头孢氨苄粗粉和滤液,将本步得到头孢氨苄粗粉与3)步得到的头孢氨苄粗粉合并;
重复本步骤,收集得到全部的头孢氨苄粗粉和滤液。
5)将4)步所得全部头孢氨苄粗粉与滤液混合,然后用硫酸调PH至0.1~2.5,然后过0.45μm滤膜过滤后得料液,将料液温度升高至30~60℃、用氨水调节料液PH至4.0~6.0,然后养晶30min、过滤、水洗涤、丙酮洗涤,最后干燥,得终产物。
所得终产物——头孢氨苄的质量为20.2,经测定纯度为99.9%。
实施例2
1)取D-苯甘氨酸甲酯硫酸盐固体(以左旋苯甘氨酸甲酯计17.5g)溶解于40~60ml水中制成D-苯甘氨酸甲酯硫酸盐溶液,缓慢加入到7-ADCA水溶液中(120ml,质量浓度12.5%),用时30~120min,以保证体系PH值自然下降,并用氨水保持PH在6.0~7.2;然后加入特定的青霉素酰化酶20g,在15~25℃下开始反应。
2)将从开始反应至开始出现浑浊的时间记为A,当反应时间达2~3×A时,开始缓慢加入40ml纯化水,用时20~60分钟,同时在加入纯化水的过程中采用HPLC方法判断反应终点。
以上1)~2)操作过程中,始终使用氨水保持体系的PH在6.0~7.2;
至此,根据HPLC检测出的7-ADCA浓度计算,本反应的转化率为99%。
3)待应终止后,将反应液过120目筛网,分别得到青霉素酰化酶和头孢氨苄混悬液,将头孢氨苄混悬液过滤,分别得到头孢氨苄粗粉和滤液。
4)用所得滤液洗涤青霉素酰化酶,重新过120目筛网,再次分离出所述青霉素酰化酶后,将得到的混悬液再次进行过滤,过滤后得到头孢氨苄粗粉和滤液,将本步得到头孢氨苄粗粉与3)步得到的头孢氨苄粗粉合并;
重复本步骤,收集得到全部的头孢氨苄粗粉和滤液。
5)将4)步所得全部头孢氨苄粗粉与滤液混合后,用硫酸调PH至0.1~2.5,然后过0.45μm滤膜过滤后得料液,将料液温度升高至30~60℃、用氨水调节料液PH至4.0~6.0,然后养晶30min、过滤、水洗涤、丙酮洗涤,最后干燥,得终产物。
所得终产物——头孢氨苄的质量为20.1g,经测定纯度为99.9%。
实施例3
1)取D-苯甘氨酸甲酯硫酸盐固体(以左旋苯甘氨酸甲酯计19.0g)溶解于10~20ml水中制成D-苯甘氨酸甲酯硫酸盐混悬液,缓慢加入到7-ADCA水溶液中(150ml,质量浓度10%),用时30~120min,以保证体系PH值自然下降,并用氨水保持PH在6.0~7.2;然后加入特定的青霉素酰化酶30g,在15~25℃下开始反应,并采用HPLC方法判断反应终点。
以上1)~2)操作过程中,始终使用氨水保持体系的PH在6.0~7.2;
至此,根据HPLC检测出的7-ADCA浓度计算,本反应的转化率为99%。
3)待应终止后,将反应液过80目筛网,分别得到青霉素酰化酶和头孢氨苄混悬液,将头孢氨苄混悬液过滤,分别得到头孢氨苄粗粉和滤液。
4)用所得滤液洗涤青霉素酰化酶,重新过80目筛网,再次分离出所述青霉素酰化酶后,将得到的混悬液再次进行过滤,过滤后得到头孢氨苄粗粉和滤液,将本步得到头孢氨苄粗粉与3) 步得到的头孢氨苄粗粉合并;
重复本步骤,收集得到全部的头孢氨苄粗粉和滤液。
5)将4)步所得全部头孢氨苄粗粉与滤液混合后,用硫酸调PH至0.1~2.5,然后过0.45μm滤膜过滤后得料液,将料液温度升高至30~60℃、用氨水调节料液PH至4.0~6.0,然后养晶30min、过滤、水洗涤、丙酮洗涤,最后干燥,得终产物。
所得终产物——头孢氨苄的质量为20.2g,经测定纯度为99.4%。
实施例4
1)取D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐固体(以左旋苯甘氨酸甲酯计13.0g),缓慢加入到7-ADCA溶液中(120ml,质量浓度12.5%),用时30~120min,以保证体系PH值自然下降,并用氨水保持PH在6.0~7.2;然后加入特定的青霉素酰化酶30g,在15~25℃下开始反应。
2)将从开始反应至开始出现浑浊的时间记为A,当反应时间达2~3×A时,开始缓慢加入40ml纯化水,用时20~60分钟,同时在加入纯化水的过程中采用HPLC方法判断反应终点。
以上1)~2)操作过程中,始终使用氨水保持体系的PH在6.0~7.2;
至此,根据HPLC检测出的7-ADCA浓度计算,本反应的转化率为98%。
3)待应终止后,将反应液过100目筛网,分别得到青霉素酰化酶和头孢氨苄混悬液,将头孢氨苄混悬液过滤,分别得到头孢氨苄粗粉和滤液。
4)用所得滤液洗涤青霉素酰化酶,重新过100目筛网,再次分离出所述青霉素酰化酶后,将得到的混悬液再次进行过滤,过滤后得到头孢氨苄粗粉和滤液,将本步得到头孢氨苄粗粉与3)步得到的头孢氨苄粗粉合并;
重复本步骤,收集得到全部的头孢氨苄粗粉和滤液。
5)将4)步所得全部头孢氨苄粗粉与滤液混合后,用硫酸调PH至0.1~2.5,然后过0.45μm滤膜过滤后得料液,将料液温度升高至30~60℃、用氨水调节料液PH至4.0~6.0,然后养晶30min、过滤、水洗涤、丙酮洗涤,最后干燥,得终产物。
所得终产物——头孢氨苄的质量为20.2g,经测定纯度为99.9%。
实施例5
1)取D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐固体(以左旋苯甘氨酸甲酯计16.5g)溶解于40~60ml水中制成D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐溶液,缓慢加入到7-ADCA溶液中(100ml,质量浓度为15%),用时30~120min,以保证体系PH值自然下降,并用氨水保持PH在6.0~7.2;然后加入特定的青霉素酰化酶15~30g,在15~25℃下开始反应。
2)将从开始反应至开始出现浑浊的时间记为A,当反应时间达2~3×A时,开始缓慢加入25ml纯化水,用时20~60分钟,同时在加入纯化水的过程中采用HPLC方法判断反应终点。
以上1)~2)操作过程中,始终使用氨水保持体系的PH在6.0~7.2;
至此,根据HPLC检测出的7-ADCA浓度计算,本反应的转化率为99%。
3)待应终止后,将反应液过100目筛网,分别得到青霉素酰化酶和头孢氨苄混悬液,将头孢氨苄混悬液过滤,分别得到头孢氨苄粗粉和滤液。
4)用所得滤液洗涤青霉素酰化酶,重新过100目筛网,再次分离出所述青霉素酰化酶后,将得到的混悬液再次进行过滤,过滤后得到头孢氨苄粗粉和滤液,将本步得到头孢氨苄粗粉与3)步得到的头孢氨苄粗粉合并;
重复本步骤,收集得到全部的头孢氨苄粗粉和滤液。
5)将4)步所得全部头孢氨苄粗粉与滤液混合后,用硫酸调PH至0.1~2.5,然后过0.45μm滤膜过滤后得料液,将料液温度升高至30~60℃、用氨水调节料液PH至4.0~6.0,然后养晶30min、过滤、水洗涤、丙酮洗涤,最后干燥,得终产物。
所得终产物——头孢氨苄的质量为20.0g,经测定纯度为99.9%。
实施例6
1)取D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐固体(以左旋苯甘氨酸甲酯计19.0g)溶解于10~20ml水中制成D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐混悬液,缓慢加入到7-ADCA溶液中(100ml,质量浓度为15%),用时30~120min,以保证体系PH值自然下降,并用氨水保持PH在6.0~7.2;然后加入特定的青霉素酰化酶15g,在15~25℃下开始反应。
2)将从开始反应至开始出现浑浊的时间记为A,当反应时间达2~3×A时,开始缓慢加入50ml纯化水,用时20~60分钟,同时在加入纯化水的过程中采用HPLC方法判断反应终点。
以上1)~2)操作过程中,始终使用氨水保持体系的PH在6.0~7.2;
至此,根据HPLC检测出的7-ADCA浓度计算,本反应的转化率为99%。
3)待应终止后,将反应液过100目筛网,分别得到青霉素酰化酶和头孢氨苄混悬液,将头孢氨苄混悬液过滤,分别得到头孢氨苄粗粉和滤液。
4)用所得滤液洗涤青霉素酰化酶,重新过100目筛网,再次分离出所述青霉素酰化酶后,将得到的混悬液再次进行过滤,过滤后得到头孢氨苄粗粉和滤液,将本步得到头孢氨苄粗粉与3)步得到的头孢氨苄粗粉合并;
重复本步骤,收集得到全部的头孢氨苄粗粉和滤液。
5)将4)步所得全部头孢氨苄粗粉与滤液混合后,用硫酸调PH至0.1~2.5,然后过0.45μm滤膜过滤后得料液,将料液温度升高至30~60℃、用氨水调节料液PH至4.0~6.0,然后养晶30min、过滤、水洗涤、丙酮洗涤,最后干燥,得终产物。
所得终产物——头孢氨苄的质量为20.2g,经测定纯度为99.9%。
以上实施例1~6所用到的特定的青霉素酰化酶,其制备方法见以下实施例7~13。
缩写说明:PGA:青霉素G酰化酶;7-ADCA:7-氨基去乙氧基头孢烷酸;PGME?HCL:D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐。
实施例7:基因设计及基因合成
(1)基因设计:
(1.1)根据Genebank中无色杆菌属CCM4824青霉素酰化酶氨基酸序列(SEQ ID NO:1,Genebank:AY919310.1),将其第330位苯丙氨酸替换为丙氨酸,第415位赖氨酸替换为精氨酸,第770位亮氨酸替换为苯丙氨酸,这些位点引入突变位点,得到如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列,然后利用在线设计工具Jcat(http://www.jcat.de/)反向设计出引入突变位点后的核苷酸序列;
(1.2)根据宿主大肠杆菌基因表达所需的优选密码子和基因高效表达所需的G+C碱基含量,优化上述反向设计出的核苷酸序列,优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示,该序列与无色杆菌属CCM4824青霉素酰化酶核苷酸序列(如SEQ ID NO:4所示)相比:①大肠杆菌稀有密码子从55个降低到了2个;②G+C碱基含量由68.75%下降到57.25%;③优化设计过程中去除了序列中间出现的BamHⅠ酶切位点,有利后期基因操作。通过上述优化设计后,有利于宿主菌大肠杆菌高效表达该基因。
(2)基因合成:根据SEQ ID NO:3所示基因序列进行全基因合成(由生工生物工程(上海)有限公司完成),获得ASPGA基因。
实施例8:表达载体PET28-ASPGA(即重组载体)的构建
(1)对实施例7获得的ASPGA基因使用BamHⅠ和HindⅢ双酶切,酶切体系如下:
其中ASPGA基因的浓度为2μg/5μL;
将上述酶切体系在37℃下保温4h,然后采用DNA凝胶回收试剂盒(生工生物工程(上海)有限公司)纯化得到目的ASPGA基因片段。
(2)对PET28质粒(Novagen公司)使用BamHⅠ和HindⅢ双酶切,酶切体系如下:
其中PET28质粒的浓度为2μg/5μL;
将上述酶切体系在37℃下保温4h,然后采用DNA凝胶回收试剂盒(生工生物工程(上海)有限公司)纯化得到目的PET28质粒片段。
(3)使用T4连接酶对所得ASPGA基因片段和PET28质粒片段进行连接,连接体系如下:
将上述连接体系在16℃下保温4h,然后采用热激方法转化到宿主菌E.coli DH5α中,然后涂布到LB培养抗性平板,37℃下培养8~10h。
上述热激方法的具体操作步骤参照J.萨姆布鲁克等,《分子克隆试验指南第三版》第1章方案25或方案26进行。
上述涂布到LB培养抗性平板时所用到的LB抗性平板的培养基的配方见《分子克隆试验指南第三版》第一章。
(4)随机挑取步骤(3)培养的抗性平板上生长的阳性克隆菌落,接种到LB液体培养基,37℃、200rpm条件下培养8~10h后,使用质粒快速提取试剂盒(生工生物工程(上海)有限公司)提取质粒,即得到所构建的表达载体PET28-ASPGA(见图1)。
上述LB液体培养基的配方见《分子克隆试验指南第三版》第一章。
实施例9:转化体BL21(DE3)/PET28-ASPGA(即重组菌株)的构建
(1)挑取大肠杆菌BL21(DE3)单菌落接种到LB试管,37℃下震荡培养8~10h后,取培养液0.5ml加入到含50mlLB的三角瓶中,37℃下剧烈震荡培养约2h使菌体生长到对数前期。
(2)将处于生长对数前期的大肠杆菌培养液转移到用冰预冷的聚丙烯管(容量50ml)中,在冰上放置10min后,4℃、4000rpm低温离心,然后弃去上清,加入6ml用冰预冷的CaCl2溶液(浓度0.1mol/L)重悬菌体沉淀,然后在冰上放置30min,再次4℃、4000rpm低温离心,然后弃去上清,加入1.2ml冰预冷的CaCl2溶液(浓度0.1mol/L)重悬菌体沉淀,即得大肠杆菌感受态细胞。
如果需要制备于-70℃保存的感受态细胞,则用含20%甘油的CaCl2溶液(浓度0.1mol/L)代替上述CaCl2溶液(浓度0.1mol/L)。
所制备的感受态细胞与4℃下放置5~24h后可用于转化。
(3)取200μl感受态细胞悬液,加入实施例8所制备的重组质粒(体积<10μl,所含重组质粒<50ng),轻轻混匀,在冰上放置30min,然后放42℃热水浴静止热激90s,再立即放冰上冷却,然后加入500μl的LB液体培养基,混匀后放37℃低速摇床复苏45min,然后吸取转化后的菌体细胞涂布加有抗生素的平板上,放37℃下倒置培养,生长出的菌落即为转化体BL21(DE3)/PET28-ASPGA。
实施例10:转化体BL21(DE3)/PET28-ASPGA的诱导表达
挑取上述转化体BL21(DE3)/PET28-ASPGA的单菌落于含Kan(浓度50μg/ml)的LB液体培养基中,37℃、200r/min条件下培养8~10h后成为活化种子,然后将活化种子以2%的接种量接种到M9培养基中(装液量为50ml/250ml),23℃、200r/min条件下培养14h后,加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)使其终浓度为0.05mM,进行诱导表达,继续培养12h,得菌液。
上述M9培养基的配制如下:
①配制1M的MgSO4:MgSO4·7H2O2.46g,加双蒸水10ml溶解,高压灭菌备用;
②配制1M的CaCl2:CaCl2·6H2O2.191g,加双蒸水10ml溶解,高压灭菌备用;
③配制5×M9盐溶液:Na2PO4·7H2O12.8g、KH2PO43.0g、NaCl0.5g、NH4Cl1.0g,加双蒸水200ml溶解,121℃灭菌15分钟备用;
④配制20%的葡萄糖溶液:4g葡萄糖加双蒸水20ml溶解,0.22微米滤器过滤除菌;
量取上述5×M9盐溶液200ml、1M的MgSO42ml、20%的葡萄糖溶液20ml、1M的CaCl20.1ml混匀,然后加灭菌双蒸水至1000ml,即为M9培养基。
实施例11:粗制酶液的制备及其活性测定
将实施例9得到的菌液离心,收集菌体,然后加入与菌液等体积的磷酸盐缓冲液(0.02M,PH8.0)重悬,使用超声细胞破壁仪破壁20min,然后离心取上清,即为粗制酶液,备用。
采用碱滴定方法测定上述粗制酶液中的酶活性:
仪器用具:分析天平,机械搅拌器,PH计(精度±0.1PH),酶水解反应瓶(四口烧瓶)。
试剂溶液:
氢氧化钠滴定液:C(NaOH)=0.1mol/L;
磷酸盐缓冲液:称取KH2PO40.68g于250ml纯化水中得溶液Ⅰ;称取K2HPO4·3H2O2.28g于500ml纯化水中得溶液Ⅱ;用溶液Ⅰ调节溶液Ⅱ使其PH值为8.0,即为磷酸盐缓冲液;
青霉素钾盐溶液(10%):称取青霉素钾盐50.0g,溶于约400ml的磷盐缓冲液中,并用氢氧化钠滴定液调节PH至8.0,然后用磷酸盐缓冲液定容至500ml(临用时配制)。
测定步骤:精密量取制备好的粗制酶液5ml、预热至28℃的青霉素钾盐溶液(10%)100ml于酶水解反应瓶中,28℃下开始反应并不断搅拌,反应过程中用0.1mol/L氢氧化钠滴定液保持反应液PH为8.0,同时记录10min内氢氧化钠滴定液消耗的体积。
酶活性计算:
式中:V表示测定10min内氢氧化钠滴定液消耗量,单位为ml;C表示氢氧化钠滴定液的浓度,单位为mol/L;1000表示折微摩尔浓度换算系数;t表示测定酶反应时间,单位为min;m表示加入的粗制酶液的体积(单位为ml)或表示固化酶的质量(单位为g);
酶活性定义:单位体积(ml)的酶液或单位质量的(g)的固定化酶1min内每水解1μmol青霉素G为1个单位(U)。
使用上述公式,计算得所制备的粗制酶液的活性为5U/ml。
实施例12:粗制酶液的分离纯化及固定化
(1)分离纯化:取实施例11制备的粗制酶液1L,使用0.01M的盐酸调整PH至5.5,于50℃下保温30min,然后离心除去沉淀;在上清液中加入15%(质量体积比)的硫酸铵,充分混合后离心除去沉淀,然后在上清液中再次加入15%(质量体积比)的硫酸铵,充分混合后离心收集沉淀;将沉淀溶解于200ml磷酸盐缓冲液(0.2M,PH8.0)中,即得到浓缩酶液;
使用实施例11中给出的测定方法和计算公式,计算出浓缩酶液的活性为18U/ml。
(2)载体活化:
(2.1)量取戊二醛(浓度为50%)40ml、磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)4.76g,加去离子水溶解,然后定容至1L;然后用40%磷酸调节PH至7.8~8.2;
(2.2)称取LX-1000HA型载体(西安蓝晓科技有限公司)250g加入到(2.1)步所配制的溶液中,在25℃、PH7.8~8.2条件下搅拌活化1h后,过滤收集载体,用去离子水冲洗后滤干;
(3)固定化:取浓缩酶液200ml,加入磷酸盐使其终浓度为0.4M,并调节PH至6.8~7.2,然后加入活化好的LX-1000HA载体20g,于25℃、150rpm条件下搅拌固定化24h,真空抽滤收集固定化酶,然后用2倍体积去离子水冲洗3~5遍,过滤收集得到固定化酶。
使用实施例11中给出的测定方法和计算公式,计算出固定化酶(湿重)的活性为30U/g。
所制备得到的固定化酶即为本发明所用特定的青霉素酰化酶。
实施例13:固定化酶在头孢氨苄合成中的应用
试验一:在四口烧瓶中加入25g(116.7mmol)7-ADCA、25g实例12制备的固定化酶和200ml蒸馏水,进行搅拌混合,控制温度在20℃;使用40%氢氧化钠控制PH在6.8~7.2之间;称取25.8g(127.9mmol)PGME·HCl,在30min内分5次加入反应体系中,反应过程中使用40%氢氧化钠和0.1M盐酸调节PH在6.9~7.2之间;45分钟后,每隔15分钟取样进行高压液相色谱(HPLC)检测,测定反应液中7-ADCA浓度,计算转化率。
上述HPLC检测方法如下:
(1)色谱条件:
高效液相色谱仪Agelent LC1200,SB-C18柱,150×4.6×5,加SB-C18预柱;柱温35℃;
流动相A:甲醇,流动相B:50mM NaH2PO4,PH=5;
0~2min,A∶B=5∶95;2~20min,A∶B=25∶75;20~30min,A∶B=2∶98;流速为1ml/min;
检测波长:225nm;
进样:20μl。
(2)样品制备:取200μl反应液,加水稀释定容至25ml,然后取加水稀释过的反应液1250μl加流动相B定容至25ml,过0.45μm滤膜过滤后,取滤液进样。
检测结果如表2:
表2:头孢氨苄合成中7-ADCA浓度检测结果(7-ADCA/PGME·HCL摩尔比=1∶1.1)
试验二:按照试验一给出的条件,仅仅将PGME·HCL用量降低至24.71g(123.7mmol),其它条件不变,然后进行反应并测定反应液中7-ADCA浓度,结果如表3所示:
表3:头孢氨苄合成中7-ADCA浓度检测结果(7-ADCA/PGME·HCL摩尔比=1∶1.05)
7-ADCA的初始浓度是指加入固定化酶刚刚开始反应时,反应体系内7-ADCA的浓度。
通过以上两次反应可以得出以下结论:所制备的青霉素酰化酶在使用7-ADCA和PGME?HCL为原料进行头孢氨苄合成时,转化率≥97%,最优的≥98%,而且HPLC检测无其它杂质物质出现(见图2)。
以上实施例7~13给出了SEQ ID NO:2所示的青霉素酰化酶的基因设计、重组载体的构建、重组菌株的构建、酶的固定化以及在头孢氨苄合成中的应用的具体实施方式。
在如SEQ ID NO:1所示青霉素酰化酶的氨基酸序列基础上,进行突变(即至少有如下一个位点的突变:第184位天冬酰酸替换为酪氨酸、第330位苯丙氨酸替换为丙氨酸、第415位赖氨酸替换为精氨酸、第454位亮氨酸替换为丙氨酸、第623位天冬氨酸替换为天冬酰胺、第770位亮氨酸替换为苯丙氨酸、第790位甘氨酸替换为丙氨酸)得到的突变体,均可以按照实施例7~13给出的操作方法即条件进行,得到本发明所需的青霉素酰化酶。
Claims (8)
1.一种制备头孢氨苄的方法,其特征在于该方法是,
将左旋苯甘氨酸酯类衍生物与7-ADCA按照摩尔比为1.15~1.6:1的比例投料,再按照1~2倍于7-ADCA的质量比投料量加入催化剂青霉素酰化酶进行酰化反应;其中所述的青霉素酰化酶其编码的基因序列如SEQ ID NO:3所示。
2.根据权利要求1所述的制备头孢氨苄的方法,其特征在于它包括以下步骤:
a)将左旋苯甘氨酸酯类衍生物在30~120min内缓慢加入到7-ADCA水溶液中,然后加入所述的青霉素酰化酶,在15~25℃进行酰化反应;反应过程中PH维持在6.0~7.2;
b)待反应终止后,过滤80~120目筛网,即得到滤物——青霉素酰化酶,滤液——头孢氨苄混悬液;
c)将头孢氨苄混悬液过滤,得到头孢氨苄粗粉。
3.根据权利要求2所述的制备头孢氨苄的方法,其特征在于,所述左旋苯甘氨酸酯类衍生物为左旋苯甘氨酸甲酯及其盐、左旋苯甘氨酸乙酯及其盐中的任意一种。
4.根据权利要求3所述的制备头孢氨苄的方法,其特征是,所述左旋苯甘氨酸甲酯盐为左旋苯甘氨酸甲酯盐酸盐或左旋苯甘氨酸甲酯硫酸盐。
5.根据权利要求3所述的制备头孢氨苄的方法,其特征是,加入到所述7-ADCA水溶液中的左旋苯甘氨酸甲酯盐为左旋苯甘氨酸甲酯盐固体、左旋苯甘氨酸甲酯盐溶液或左旋苯甘氨酸甲酯盐混悬液。
6.根据权利要求2所述的制备头孢氨苄的方法,其特征是,所述7-ADCA水溶液其质量浓度为10~15%,其水溶液的温度为15~25℃,PH为7.8~8.0。
7.根据权利要求2所述的制备头孢氨苄的方法,其特征是,a)步所述酰化反应过程中,使用氨水维持PH在6.0~7.2。
8.根据权利要求2所述的制备头孢氨苄的方法,其特征是,a)步所述酰化反应的反应液出现浑浊之后,向反应液中缓慢加入纯化水。
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