CN103320403A

CN103320403A - 酮还原酶lek突变体及应用

Info

Publication number: CN103320403A
Application number: CN2013102446845A
Authority: CN
Inventors: 谢恬; 殷晓浦; 叶婷婷; 沈凌宏; 曹丹; 王秋岩; 谌容; 裴晓林
Original assignee: Hangzhou Normal University
Current assignee: Hangzhou Normal University
Priority date: 2013-06-18
Filing date: 2013-06-18
Publication date: 2013-09-25
Anticipated expiration: 2033-06-18
Also published as: CN103320403B

Abstract

本发明公开了一种酮还原酶LEK突变体及在生物催化制备（R）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用，所述酮还原酶LEK具有SEQ.ID.NO.2所示氨基酸序列，酮还原酶LEK突变体是将酮还原酶LEK氨基酸位点第209位的S突变G获得的突变体S209G，本发明开发R型酮还原酶，即酮还原酶LEK，再经定点突变改造该酶并建立辅酶再生循环反应体系，催化制备(R)-CHBE的转化率达到100%和e.e.值大于99%，同时该酶Km值较低，为6.05mM；催化反应体系不需要添加昂贵的辅酶NADPH，降低生产成本；而且在较高底物浓度下可大量制备光学纯度高的产物，生产效率较高，有利于工业化生产。

Description

酮还原酶LEK突变体及应用

（一）技术领域

本发明涉及一种酮还原酶及生物催化合成手性化学中间体的方法，特别是涉及来源于路德酵母的酮还原酶LEK及其突变株，以及该酮还原酶LEK或突变株能够选择性的还原底物，生成R型的CHBE，其e.e.值大于99％。

（二）背景技术

β羟基酯是医药、农药、材料及其它精细化工原料的重要组成部分，如4-氯-3-羟基丁酸乙酯（CHBE），是一种重要的有机合成的中间体，分子中有三个功能基团（-OH，-Cl，-COOH），可经由氯的置换反应，还原反应等，引入多种药物中间体。其手性单体（R/S）-CHBE都是非常有前景的手性物质。R-CHBE可以作为合成L-肉毒碱（Eui S C,Joo R E,Lee J K,Lee S H,Lee S G.Highly stereoselective formation ofoptically pure2,4-oxozolidinedione via diastereoselective dihodroxylation of(4S)-3-(CE)-3’-substituted-2’-propenoyl)-4-isopropopyl-2-oxazolidinone.Tetrahedron:Asymmetry,1995,6(4):871-872.），(-)-大内酰亚胺A（Marino J P,McClure M S,Holub DP,Comasseto J V,Tucci F C.Stereocontrolled synthesis of(-)-macrolactin A.J Am ChemSoc,2002,124(8):1664-1668.），R-γ-氨基-β-羟基丁酸（Kolb H C,Bennani Y L,Sharpless K B.Short and practiceal syntheses of(R)-(-)-amino-hydroxybutyric acid.Tetrahedron:Asymmetry,1993,4(1):133-141.）的关键中间体，还可以转化为负霉素（Davies S G,Ichihara O.Asymmetric synthesis of(+)-negamycin.Tetrahedron:Asymmetry,1996,7(7):1919-1922.）。(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，可用于合成HGM-CoA还原酶抑制剂（他汀类药物，2007年全球销售额达到160亿美金）和β-1,4-二氢吡啶类钙离子通道阻断剂（Kita K,Kataoka M,Shimizu S.Diversity of4-chloroacetoacetateethyl ester-reducing enzymes in yeasts and their application to chiral alcohol synthesis.JBiosci Bioengi,1999,88(6):591-598.）等药物，具有重要的应用价值和广阔的市场。

目前以4-氯乙酰乙酸乙酯为原材料来制备CHBE主要有化学法（手性钌催化剂还原法）和生物催化法两种方法。化学不对称合成方法采用手性催化剂如2,2’-二联苯膦基-1,1’-联萘钌配合物(2,2’-bos(dipHenyIpHospHino)-1,1’-binapHthyl rutheniumcomplex)作为不对称还原催化剂，该方法反应条件苛刻，需使用高压氢，对反应器要求较高；反应须在高温下进行，能耗比较高；所用的含铑或钌的催化剂价格昂贵且不易获得，因此成本较高；同时由于以金属为催化剂，使得很多制备的药物中金属含量超标，达不到安全使用的标准，无形中增加了生产成本（Kitamura M,Ohkuma T,Takayaa H,Noyori R.A practical Asymmetric Synthesis of Carmtine.Tetrahedron Lett,1988,29(13):1555-1556.）。生物催化法在制备高对映体过量的手性化合物方面具有效率高、成本低、装置简单、对环境污染小等优势，近年来受到广泛关注。生物不对称还原方法利用可以还原4-氯乙酰乙酸乙酯的重组酶，例如短链脱氢酶，酮还原酶等来不对称还原得到手性的4-氯-3-羟基丁酸乙酯。

微生物是羰基还原酶和醇脱氢酶的好来源，大量的文献报道了微生物来源的酶法制备手性CHBE的情况。

1990年有人（Shimizu S,Kataoka M,Morishuta A,Katoh M,Morikawa T,Miyoshi T,Yamada H.Microbial asymmetric reduction of ethyl4-chloro-3-oxobutanoate to opticallyactive ethyl4-chloro-3-hydroxybutanoate.Biotechnology Lett,1990,12(8):593-596.）用微生物菌体进行COBE的还原反应生成(S)-CHBE，产率为85％，光学纯度91％e.e.。同年，还有人（Sakayu S,Kataoka M,Katoh M,Morikawa T,Miyoshi T,Yamada H,Stereoselective reduction of ethyl4-chloro-3-oxobutanoate by a microbial aldethdereductase in an organic solvent-water dipHasic system.Appl Environ Microbiol,1990,56(8):2374-2377）用能同时表达乙醛还原酶和葡萄糖脱氢酶基因的大肠杆菌转化细胞作为催化剂，在有机溶剂-水(乙酸正丁酯-水50mL/50mL)两相体系中催化反应，50小时后，(R)-CHBE的摩尔转化率为62.5%，e.e.值为92.2%。

1999年Yasohara等（Yasohara Y,Kizaki N,Hasegawa J,Takahashi S,Wada M,Kataoka M,Shimizu S.Synthesis of optically active ethyl4-chloro-3-hydroxybutanoate bymicrobial reduction.Appl Microbiol Biotechnol,1999,51:847-851）在葡萄糖存在下从200株酵母菌中筛选到了13株有COBE还原为(S)-CHBE能力的菌株，但所得到的结果并不理想，产率低，还原的立体选择性不高且随培养条件而改变。于是考察在水/乙酸正丁酯的双相体系中用细胞丙酮干粉进行还原反应，发现Candida magnoliae在葡萄糖、NADP和GDH的水／乙酸正丁酯的双相体系中可还原90g/L的(S)-CHBE。当细胞经热处理后，还原的立体选择性增加到99%e.e.。

2001年有人报道（Saratani Y,Uheda E,Yamamoto H,Nishimura A,Yoshizako F.Stereoselective reduction of ethyl4-chloro-3-oxobutanoate by fungi.Biosci BiotechnolBiotechem,2001,65(7):1676-1679.）从4个属的具有(S)-对映体还原能力的8个真菌中，筛选出了一株高产率、高光学活性的菌株IF0318555。用其制备的无细胞提取物和细胞丙酮干粉进行COBE的还原转化，得到了99%e.e.的理想结果，但摩尔转化率仅为64%。并证实在IF0318555中至少有两个或多个NADPH的氧化还原酶可将COBE还原为高e.e.的(S)-型对映体，而(R)-型选择酶几乎不存在。

Kizaki等人（Kizaki N,Yasohara Y,Hasegawa J,Wada M,Kataoka M,Shimizu S.Synthesis of optically pure ethyl(s)-4-chloro-3-hydroxybutanoate by Escherichia colitransformant cells coexpressing the carbonyl reductase and glucose dehydrogenase genes.Appl Microbiol brotechnol,2001,55:590-595.）将基因工程的方法用于(S)-CHBE的生产研究。他们用同时表达Candida magnoliae的羰基还原酶(S1)和Bacillus megtertum的葡萄糖脱氢酶(GDH)基因的大肠杆菌细胞，在有机溶剂/水的双相体系中进行反应，有机相中(S)-CHBE积浓度可达430g/L，克分子产量为85%。在水的单相体系中，通过连续添加COBE，该菌种可累积(S)-CHBE达208g/L。这两种情况下，(S)-CHBE的光学纯度均为100%e.e.。

许多专利也报道了COBE还原CHBE菌株的筛选。如Onishi等（US5,413,921）筛选的Alternaria solam IFO7516可将COBE还原为(S)-CHBE，产率98.3%(约9.5g/L),光学纯度97%e.e.。

Matsuyama等人（US5,559,030）从几十株酵母菌、细菌、乳酸细菌中筛选出的Lactobacillus所得(S)-对映体的浓度为10mg/mL，光学纯度99.0%e.e.；Yamagishi等人（US5,700,670、US5,891,685）也在其专利中列举了大量能够用于制备光学活性的CHBE的微生物，并列举了其所属的种类。

国内这方面的研究起步较晚，浙江大学蒋群等（蒋群，梅乐和.4-氯乙酰乙酸乙酯不对称生物还原反应的研究.第二届生物化工学术会议论文集（杭州），2002:435-438）用海藻酸钙包埋法固定化面包酵母，在邻苯二甲酸二丁酯溶液中催化COBE的不对称还原，生成76％e.e.的(R)-CHBE；南昌大学陆豫等（陆豫，赖卫华，许杨等.酵母菌立体专一性还原的研究.南昌大学学报（理科版）,2000,24(1),59-64）用COBE为底物经酵母还原得到59.6%e.e.的(S)-CHBE；黄和等（黄和，杨忠华，姚善泾.面包酵母催化羰基不对称还原合成手性醇的研究.生物加工过程,2004,2(2):52-55）以COBE为模型底物考察了而包酵母对β-羰基酯中的羰基不对称还原情况，产物以(S)-CHBE为主；陕西师范大学的张敏（张敏，魏俊发.(s)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的不对称合成.精细化工中间体,2004,34（1）:33-37）等同样以面包酵母为还原剂，COBE为原料，选择性的合成(s)-CHBE，反应收率为60.5%,e.e.值为98.5%；西北大学的闫婕等（闫婕，陈五岭，秦蓉.酵母细胞催化4-氯-乙酰乙酸乙酯的不对称还原反应.现代化工,2004,24(4):46-48）用酵母催化COBE生成(S)-CHBE，其产率及e.e.值分别为91.7%和97.8%。

对酶分子进行改造来提高催化性能，通常有两种手段，一种是理性／半理性设计，一种是定向进化。理性／半理性设计需要在酶分子的详细信息，如序列，结构，理化性质等信息的基础上，分析关键氨基酸位点并进行定点改造。定向进化通过随机突变，DNA shuffling等手段来得到突变株并进行筛选，工作量比较大。尽管理性／半理性设计需要更多信息，而且要在三维分子结构模型基础上分析，但是得到的突变株所产生的有义突变更多，而且工作量大大减少。因此我们采取了理性／半理性设计的手段，利用定点突变来进行改造酶分子。

（三）发明内容

目前国内外文献报道中用来催化4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE）还原生成（R）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯（(R)-CHBE）的酮还原酶较少，而且报道的酮还原酶合成(R)-CHBE的转化率较低，Km值较高，底物耐受性较差，因此限制了酮还原酶的应用。

本发明通过生物信息学和基因组发掘的手段，开发出e.e.值较高的酮还原酶LEK，并通过定点突变的方法改造酶分子，得到转化率明显提高，同时Km值降低（说明与底物亲和力更强）的酮还原酶LEK突变体。本发明还构建了辅酶再生循环反应体系（即将酮还原酶LEK突变体与葡萄糖脱氢酶GDH2同时加入反应体系），使酮还原酶LEK可以在较短的时间内，在底物浓度较高的情况下合成高光学纯度的产物，同时不需要额外添加昂贵的辅酶NADPH，适合工业化生产(R)-CHBE。

本发明采用的技术方案是：

本发明涉及一种所述酮还原酶LEK的编码基因，所述基因具有SEQ.ID.NO.1所示核苷酸序列90%以上同源性，优选所述基因的核苷酸序列为SEQ.ID.NO.1所示。

5.2.1酮还原酶基因的筛选和分析

经过利用生物信息学手段在NCBI基因数据库中进行筛选和分析，确定在路德酵母（Lodderomyces elongisporus CGMCC2.1589）基因组中的假定蛋白LELG_05392(GenBank Accession No.XM_001523496.1)为酮还原酶的候选研究对象。通过序列和模拟酶的三维结构分析初步确定该蛋白是一种酮还原酶（ketoreductase），命名为LEK。

5.2.2酮还原酶LEK的基因序列（SEQ.ID.NO.1）

ATGCCAGCTCAATTGACTTTAAACACTTCAGAAATCGCTTTAAACACCGGGGCAAAGATTCCACAAGTTGGTTTGGGAACATGGCAAGCCACCGAAGAAGACGCTGCATACAAGGCAGTCTTGGCAGCCTTGAACAATGGCTACAAGCACATTGACACTGCAGCCATCTACAAGAATGAAGAACAAGTTGGAAAGGCAATTGCTGAAGCAAAACTTCCAAGACAAGAATTGTTTGTCACCACCAAGTTGTGGAATGCCGACCACAAGCGCGTTGAAGAGGCATTGGACGAATCATTGAAGAAGTTGGGTCTCGACTATGTAGACTTGTACTTGATCCACTGGCCAGTATCCAAGAACCCAGAAACTGAAGAGCCATACACCGACCACGATTTCGTTGACACTTGGAAAACATTGCAAAAAATCTACAAGGAAGGCAAGAAGGTCAAGGCCATTGGTGTTTCAAACTTTACCGTCAAGAAATTGGAAAAGTTGTTAAACTCTGAGGGCGTTGATGTCGTTCCCGCAGTCAACCAAGTAGAGGCACACCCATTGCTCACACAACCTGAATTGGTTGACTACTTGAGATCCAAAAACATTGTTTTGGAAGCATACTCTCCATTGGGCTCAACCGACTCGCCACTTTTCAAGAACAAGACCATTGTCGAGATTGCTGAAAAGAATGGAGTAGAGCCAGCACAAGTCTTGATCTCATGGGCCGTACAAAGAAACACCGTTGTGCTTCCTAAATCCGTCACTGAGTCAAGAGTCATCTCCAACATCAAGACATTCACCTTGTCAAAGGAAGACTTTGAGGCATTGAGCAACCTCTCGGAGAAAGATGGCGTTGTTAGAACATGTAACCCAAAGTTTAACAACTTTGATGATTAA

本发明涉及一种酮还原酶LEK，所述酮还原酶LEK具有SEQ.ID.NO.2所示氨基酸序列95%以上同源性，优选所述酮还原酶LEK的氨基酸序列为SEQ.ID.NO.2所示。

5.2.3酮还原酶LEK的氨基酸序列（SEQ.ID.NO.2）

MPAQLTLNTSEIALNTGAKIPQVGLGTWQATEEDAAYKAVLAALNNGYKHIDTAAIYKNEEQVGKAIAEAKLPRQELFVTTKLWNADHKRVEEALDESLKKLGLDYVDLYLIHWPVSKNPETEEPYTDHDFVDTWKTLQKIYKEGKKVKAIGVSNFTVKKLEKLLNSEGVDVVPAVNQVEAHPLLTQPELVDYLRSKNIVLEAYSPLGSTDSPLFKNKTIVEIAEKNGVEPAQVLISWAVQRNTVVLPKSVTESRVISNIKTFTLSKEDFEALSNLSEKDGVVRTCNPKFNNFDD

本发明提供一种所述酮还原酶LEK在生物催化制备（R）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用，所述的应用为：以酮还原酶LEK发酵培养后的湿菌体和葡萄糖脱氢酶GDH2发酵培养后的湿菌体以质量比1：0.6～0.8的混合菌体为催化剂，以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，在葡萄糖的作用下，于无水乙醇和磷酸盐缓冲液（pH值为5.5～7.5）中构成转化体系，在30℃、180rpm条件下进行转化反应，反应完全后将反应液用等体积的乙酸乙酯萃取，取上层有机相用无水硫酸钠脱水后用旋转蒸发器蒸干，再用异丙醇溶解，经滤膜过滤，获得所述（R）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯；反应体系中所述催化剂的质量用量以酮还原酶LEK发酵培养后的湿菌体质量计为16.00～18.00g/L，所述底物初始浓度为8.00～18.30g/L反应体系，所述葡萄糖用量为17.00～18.00g/L反应体系，所述无水乙醇的体积终浓度为7～15%。

本发明还涉及一种所述酮还原酶LEK的编码基因构建的重组载体以及所述重组载体转化获得的重组基因工程菌。

5.2.4酮还原酶LEK基因的制备

根据以上基因序列设计引物，其中上游引物设计BamHⅠ酶切位点，下游引物设计HindⅢ酶切位点，具体引物序列如下：

上游引物P1：5’-GCGCGGATCCATGCCAGCTCAATTGACTTTAAACAC-3’；下游引物P2：5’-GCGCGAAGCTTATCATCAAAGTTGTTAAACTTTGGG-3’。采用PCR方法进行目的片段的扩增。与T载体连接后，将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，通过菌筛选和质粒提取试剂盒获得LEK-T重组质粒。

5.2.5酮还原酶LEK的表达和纯化

利用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ对重组质粒LEK-T和质粒pET28a分别进行双酶切，酶切后回收的DNA片断通过粘性末端连接，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，通过菌筛选和质粒提取试剂盒获得pET28a-LEK质粒。将重组质粒pET28a-LEK转化感受态细胞E.coli BL21(DE3)菌株，挑单菌落PCR验证后，37℃培养12h至OD₆₀₀=0.6，加入IPTG终浓度为0.1mmol/L，25℃诱导表达15h。

发酵培养物离心所得沉淀洗涤后，悬浮于PBS缓冲液（即为含酮还原酶LEK的菌体），超声破碎细胞，收集上清和沉淀，SDS-PAGE检测目的蛋白表达。

取过膜后的上清加到镍柱，孵育4h。用含不同浓度咪唑的PBS洗脱，收集样品，制备纯化酶。

5.2.6酶学性质研究

酶活测定方法：依次加入DMSO、COBE、PBS、NADPH和酶，于30℃，340nm处测酶活动力学曲线。测定酶学性质，酶的Km值、最适温度、最适pH、温度稳定性、pH稳定性和金属离子稳定性。

本发明还涉及一种由所述酮还原酶LEK获得的突变体，所述酮还原酶LEK突变体为下列之一：（1）将酮还原酶LEK氨基酸位点第28位的W突变为A获得突变体W28A；（2）将酮还原酶LEK氨基酸位点第28位的W突变M获得的突变体W28M；（3）将酮还原酶LEK氨基酸位点第207位的L突变F获得的突变体L207F；（4）将酮还原酶LEK氨基酸位点第209位的S突变G获得的突变体S209G；（5）将酮还原酶LEK氨基酸位点第209位的S突变H获得的突变体S209H，优选将酮还原酶LEK氨基酸位点第209位的S突变G获得的突变体S209G。

本发明还提供一种所述由酮还原酶LEK获得的突变体在生物催化制备（R）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用，所述的应用为：以酮还原酶LEK突变体（优选突变体S209G）发酵培养后的湿菌体和葡萄糖脱氢酶GDH2发酵培养后的湿菌体以质量比1：0.6～0.8的混合菌体为催化剂，以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，在葡萄糖的作用下，于无水乙醇和磷酸盐缓冲液（pH值为5.5～7.5）中构成转化体系，在30℃、180rpm条件下进行转化反应，反应完全后将反应液用等体积的乙酸乙酯萃取，取上层有机相用无水硫酸钠脱水后用旋转蒸发器蒸干，再用异丙醇溶解，经滤膜过滤，获得所述（R）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯；所述催化剂的质量用量以LEK突变体发酵培养后的湿菌体质量计为16.00～18.00g/L反应体系，所述底物初始浓度为8.00～18.30g/L反应体系，所述葡萄糖用量为17.00～18.00g/L反应体系，所述无水乙醇的体积终浓度为7～15%。

进一步，所述酮还原酶LEK突变体发酵培养后的湿菌体按如下方法制备：将酮还原酶LEK突变体（优选突变体S209G）菌株接种至LB培养基中，37℃下培养过夜，取菌液以体积浓度1%的接种量转接到含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、180r/min震荡培养至菌液OD₆₀₀值为0.4～0.6，再加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L，于25℃、140r/min诱导表达12～17h（优选15h），将诱导培养液离心，收集湿菌体，即获得所述酮还原酶LEK突变体（优选突变体S209G）发酵培养后的湿菌体。所述葡萄糖脱氢酶GDH2发酵培养后的湿菌体的制备方法同酮还原酶LEK突变体发酵培养后的湿菌体的制备。

5.2.7定点突变

根据酶基因序列和酶三维结构，分析活性位点和保守位点，确定突变株，根据重叠延伸PCR方法进行定点突变。设计一对含有目的突变位点的引物，通过两轮PCR获得定点突变基因。再将突变基因导入质粒pET28a和宿主细胞E.coli BL21(DE3)中，构建表达菌株。通过与亲本酶LEK相同的方法诱导表达。

5.2.8双菌耦合催化的辅酶再生循环体系

利用两种菌，分别表达酮还原酶LEK和葡萄糖脱氢酶GDH2，形成辅酶再生循环体系，制备产物(R)-CHBE，并用GC和HPLC检测产物。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明开发R型酮还原酶，即酮还原酶LEK，再经定点突变改造该酶并建立辅酶再生循环反应体系，催化制备(R)-CHBE的转化率达到100%和e.e.值大于99%，同时该酶Km值较低，为6.05mM。催化反应体系不需要添加昂贵的辅酶NADPH，降低生产成本；而且在较高底物浓度下可大量制备光学纯度高的产物，生产效率较高，有利于工业化生产。

（四）附图说明

图1为酮还原酶LEK的三维分子结构示意图；

图2为酮还原酶LEK和高度同源蛋白的进化树；

图3为酮还原酶LEK的表达纯化蛋白电泳图：泳道M：蛋白分子量；泳道1：诱导前菌体蛋白；泳道2：诱导后可溶性上清；泳道3：未结合到镍柱上的蛋白；泳道4-12：分别用10,20,60,100,200,250,300,400,和500mM咪唑洗脱蛋白的洗脱液；

图4为温度对酮还原酶LEK酶活(a)及稳定性(b)的影响；

图5为pH值对酮还原酶LEK酶活(a)及稳定性(b)的影响；

图6为COBE的气相色谱标准曲线；

图7为CHBE的气相色谱标准曲线。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例

6.1材料

6.1.1菌种和质粒

菌种Lodderomyces elongisporus CGMCC2.1589购自中国普通微生物菌种保藏中心；菌种Thermoplasma acidophilum DSM1728购自德国微生物菌种保藏中心DSMZ；菌株pET22b-gdh2-E.coli BL21是实验室中已经构建好并保存的基因工程菌，具体构建方法是将来源于Thermoplasma acidophilum DSM1728的葡萄糖脱氢酶GDH2，（Zhou L.P.,Zhao Y.,Wang H.F.,Ding J.X.,2004.Cloning and expression of glucosedehydrogenase from Bacillus Subtilis,J.Jiangsu University(medicine edition).14(1),7-10.）通过双酶切位点NdeⅠ/BamHⅠ与载体pET22b连接获得的表达菌株。质粒pET28a、质粒pET22b、质粒pETDuet-1、E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)购于北京全式金生物技术有限公司。

6.1.2主要试剂

pMD-19T试剂盒、Taq酶、dNTP mixture、IPTG、high-ligation、LA Taq DNAPolymorase、pyrobest DNA Polymorase和限制性内切酶购于TAKARA公司、4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)购于Alfa Aesar，酵母基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、普通质粒小提试剂盒、普通DNA产物纯化试剂盒购于TIANGEN公司，BCA蛋白分析试剂盒购于Thermo公司。

6.2方法

6.2.1酮还原酶LEK基因的获得

用酵母基因组DNA提取试剂盒提取路德酵母（Lodderomyces elongisporus）基因组DNA，即假定蛋白LELG_05392基因序列，作为PCR反应的DNA模板。

根据Lodderomyces elongisporus中假定蛋白LELG_05392(GenBank AccessionNo.XM_001523496.1)的基因序列设计引物。在目的基因两端分别引入酶切位点，上游引物引入BamHⅠ酶切位点，下游引物引入HindⅢ酶切位点。采用PCR方法进行目的基因的扩增。

上游引物lek-F1：5’-GCGCGGATCCATGCCAGCTCAATTGACTTTAAACAC-3’；

下游引物lek-R2：5’-GCGCGAAGCTTATCATCAAAGTTGTTAAACTTTGGG-3’。

PCR扩增反应体系：

反应总体积：25μL，其中DNA模板为上述提取的路德酵母基因组DNA。向灭菌的PCR管中加入上述反应体系，并混匀。

PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的基因，即获得SEQ.ID.NO1所示的酮还原酶LEK基因。

6.2.2酮还原酶LEK的表达和纯化

6.2.2.1基因工程菌的构建

将SEQ.ID.NO1所示酮还原酶LEK基因与pMD-19T载体连接，连接产物转化到E.coli DH5α感受态细胞中。验证后，用普通质粒提取试剂盒提取lek-T重组质粒。

利用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ对重组质粒lek-T和质粒pET28a分别进行双酶切，酶切回收后的DNA片断通过粘性末端连接，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，通过验证和质粒提取试剂盒获得pET28a-lek质粒。将该质粒转化到E.coliDH5α感受态细胞中，挑单菌落PCR验证其是否含有目的基因，验证正确的，提取质粒，再转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，构建表达菌株pET28a-lek-E.coliBL21(DE3)。

6.2.2.2酮还原酶LEK的表达

将pET28a-lek-E.coli BL21(DE3)菌株接种到LB培养基中，37℃下培养过夜，取1mL菌液转接到100mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中（接种量1%），37℃、180r/min震荡培养约3h至菌液OD₆₀₀值为0.6。取1mL菌液作不加IPTG的未诱导对照，其余菌液加入IPTG至最终浓度为0.1mmol/L，于25℃、140r/min诱导表达15h。

将诱导表达完成的培养液在4℃、6000r/min条件下离心15min，弃上清培养基，收集菌体（即获得酮还原酶LEK发酵培养后的湿菌体）。加入PBS(pH7.4)洗涤菌体，再离心，重复洗涤一次。离心收集的菌体用10mL PBS(pH7.4)重悬。置于冰水混合物中，用超声破碎仪破碎菌体细胞（每工作3s，间隔6s，工作时间10min）。细胞破碎液在4℃低温下以12000r/min离心15min，收集上清液即为含酮还原酶LEK的粗酶，沉淀用等体积的PBS重悬。取部分上清液和沉淀液进行SDS-PAGE电泳检测目的蛋白表达。

6.2.2.3酮还原酶LEK的纯化

镍柱再生后，将制备的上清液（即步骤6.2.2.2获得的含酮还原酶LEK的粗酶）20mL经0.45μm的滤膜过滤后上样，4℃恒温层析柜中孵育4h。将孵育后的液体放出，并进行凝胶电泳分析，检测上清液中目的蛋白是否被吸附，再继续用咪唑终浓度分别10mM、20mM、60mM、100mM的washing buffer（含上述不同咪唑浓度的PBS）、200mM、250mM、300mM、400mM和500mM的elution buffer（含上述不同咪唑浓度的PBS）逐步进行梯度洗脱，分别收集洗脱液，每一步的洗脱液分别取20μL进行SDS-PAGE蛋白电泳检测。测定每一个纯化步骤中所得溶液中的蛋白浓度。根据蛋白浓度值及蛋白电泳图的结果将含目的蛋白浓度较高的洗脱液在透析膜（截留分子量为1KDa）中进行透析，用夹子密封透析袋后，放置于事先配制好的5L透析液（pH7.4的PBS）中，4℃恒温层析柜中透析12h。再将透析袋放置在平板中，加少许PEG20000于层析柜中浓缩。取浓缩后的截留液，获得纯化的表达蛋白，即酮还原酶LEK的纯酶，用于后续酶学性质测定。

6.2.3酮还原酶LEK的酶学性质研究

6.2.3.1酶活测定

酶活测定的原理为还原型辅酶NAD(P)H在340nm处有明显的吸收峰，而氧化型辅酶NAD(P)⁺在此波长下则没有吸收峰。在酮还原酶催化的反应过程中，辅酶NADPH被氧化引起340nm处的吸光度发生变化，可使用紫外可见分光光度计测定酮还原酶的酶活。酮还原酶的酶活单位定义：在一定温度和pH的条件下，1分钟消耗1μmolNADPH称为一个酶活单位（U）。酶比活力是指每毫克蛋白质中所含酶的催化活力。

计算公式如下：

U（酶活力）=△A×V/6.22

U/mg（酶比活力）=△A×V/(6.22×M)

△A为1min内340nm处吸光度的变化，V为反应液的体积（mL），M为酶液中的蛋白质量（mg），6.22为摩尔吸收系数（L/mol/cm）。

酶活测定的方法：按顺序加入15μL溶剂DMSO（二甲基亚砜）、1μL底物COBE、464μL缓冲液PBS（pH7.4）、0.05mg NADPH和15μL纯酶（6.2.2.3制备），反应体系总体积500μL，混匀后，加入比色皿中，立即测定混合液在340nm下吸光度的动力学变化并记录。

6.2.3.2转化COBE的酶活和酶动力学常数测定

测定酮还原酶LEK转化COBE的酶活时，先依次加入15μL DMSO、1μL COBE、464μL PBS（pH7.4）、0.05mg NADPH和15μL纯酶（步骤6.2.2.3制备），反应体系总体积500μL，混匀后，立即测定混合液在30℃条件下，于340nm处吸光度的动力学变化曲线。根据酶活动力学曲线得出每分钟内吸光度值的变化值，每个测定3组平行数据。

按照酶活测定方法，分别设定各种不同的底物COBE浓度，加入反应体系，检测反应速度（与酶活力计算方法相同，用V表示）。按照Lineweaver-Burk双倒数法作图，即以1/V-1/[S]作图，得出一直线，横轴截距为-1/Km，纵轴截距为1/Vmax，从而测定酮还原酶LEK对底物COBE的米氏常数Km和Vmax值。

6.2.3.3酶的底物谱测定

酮还原酶LEK的底物谱主要包括醛和酮类化合物，为系统研究酶的底物谱，对底物进行分类如下：

脂肪类醛：苯甲醛、正丁醛、正戊醛、戊二醛、辛醛；

酮类：2,3-戊二酮、2,3-丁二酮、丁酮、2-辛酮、3-戊酮、2,4-戊二酮、苯丁酮、4-甲基戊酮、COBE。

测定酶转化不同底物的酶活力。反应体系：DMSO100μL，底物终浓度为5mM，PBS缓冲液（pH7.4），纯酶（步骤6.2.2.3制备）75μL，0.25mg NADPH，反应体系总体积3mL，混合均匀。30℃下，立即测定混合液在340nm波长处的酶活动力学曲线。

6.2.3.4酶的最适反应温度测定

取离心管，各加入15μL DMSO，1μL COBE，460μL PBS（pH7.4），分别在4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃和50℃保温10min后，再加入0.05mg NADPH和前述方法制备的纯酶（步骤6.2.2.3制备）20μL，反应体系总体积500μL，混匀后，加入比色皿中，立即测定不同温度下混合液在340nm处测吸光值，制作酶活动力学曲线。

6.2.3.5酶的最适反应pH测定

取离心管，各加入15μL DMSO，1μL COBE，460μL不同pH值的缓冲液，pH值分别为4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9和9.5，再加入20μL纯酶（步骤6.2.2.3制备）和0.05mg NADPH，反应体系总体积500μL，混匀后，在30℃下，立即测定混合液在340nm处吸光值，制作酶活动力学曲线。

6.2.3.6酶的pH稳定性

取离心管，各加入60μL PBS缓冲液，pH分别为4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9和9.5，再分别加入20μL纯酶（步骤6.2.2.3制备），4℃保温1h。另取1.5mL离心管，各加入15μL DMSO，1μL COBE，400μL PBS（pH为7.4）和0.05mgNADPH，再加入在上述各个pH的缓冲液中保温的溶液，反应体系总体积500μL，混匀后，在30℃下，立即测定在340nm处反应液的吸光值，制作酶活动力学曲线。pH稳定性即在各个pH的缓冲液中孵育一段时间后残留酶活百分比。

6.2.3.7酶的热稳定性

取离心管，各加入20μL纯酶（步骤6.2.2.3制备），分别在0℃、4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃和50℃保温30min。另取离心管，各加入15μL DMSO，1μL COBE，460μL PBS（pH为7.4），再加入在上述各个温度下预热30min的酶液、0.05mg NADPH，反应体系总体积500μL，混匀后，于30℃反应，立即测定反应液在340nm处吸光值，制作酶活动力学曲线。热稳定性即在各个温度下孵育一段时间后残留酶活百分比。

6.2.3.8酶的金属离子稳定性

取离心管，各加入20μL纯酶（步骤6.2.2.3制备），再分别加入10μL事先用双蒸水配制好的浓度为1mmol/L Ca²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Li⁺、Mg²⁺、Na⁺、Fe³⁺和Cu²⁺金属离子溶液，4℃保温1h。另取离心管，各加入15μL DMSO，1μL COBE，449μL PBS（pH为7.4）和0.05mg NADPH，再加入在上述各个金属离子中保温的溶液，反应体系总体积500μL，混匀后，于30℃反应，立即测定混合液在340nm处吸光值，制作酶活动力学曲线。金属离子稳定性即在各种金属离子溶液中孵育一段时间后残留酶活百分比。

6.2.4定点突变

6.2.4.1突变基因的获得

根据酶基因序列和酶三维结构分析，研究酮还原酶LEK中关键氨基酸位点，并改造其位点，还要充分考虑氨基酸的电荷、极性、侧链结构、分子大小及空间位阻等特征，确定5个改造对象：W28A、W28M、L207F、S209G和S209H，即将LEK氨基酸位点28位的W分别突变为A和M，207位的L突变为F，209位的S分别突变为G和H。依据大肠杆菌对密码子的偏好性，有针对性的设计突变引物。

W28A的引物：5’-TTGGGAACAATGCAAGCCACC-3’；

W28M的引物,5’-GTTTGGGAACAGCGCAAGCCACCGAAG-3’；

L207F的此物,5’-TACTCTCCATTTGGCTCAACC-3’；

S209H的引物,5’-TCCATTGGGCCATACCGACTC-3’；

S209G的引物5’-ACTCTCCATTGGGCGGTACCGACTCGCCACTT-3’（下划线位置代表突变位点）。

根据重叠延伸PCR方法（即SOE-PCR定点突变方法）进行定点突变，设计一对含有目的突变位点的引物，通过两轮PCR实现氨基酸定点突变。选择自身翻译表达偏好性强的碱基作为突变后碱基。突变位点的一对引物设计时要含有互补末端，将突变位点设计在引物的中间位置。首先，进行第一轮PCR，用全长基因的上游引物和突变位点的下游引物扩增得到前端序列，并用突变位置的上游引物和全长基因的下游引物扩增后端序列。然后，将得到的这两部分基因序列片段进行第二轮PCR，以这两部分序列作模板，用全长基因的上下游引物和Pyrobest DNA polymorase高保真酶扩增，获得突变基因。

第一轮PCR反应体系：

反应体系总体积：25μL，其中DNA template为lek质粒（6.2.2.1制备的pET28a-lek），引物F1和R2分别为lek引物和突变引物。向灭菌的PCR管中加入上述反应体系，并混匀。

PCR扩增结束后，通过琼脂糖凝胶电泳，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒或普通DNA产物纯化试剂盒回收PCR产物，从而获得十个基因片段，作为第二轮PCR反应的模板。

第二轮PCR反应体系：

反应体系总体积：25μL，其中DNA template1和DNA template2为第一轮PCR后的胶回收产物中含同一突变位点的两部分基因片段。向灭菌的PCR管中加入上述反应体系，并混匀。

PCR扩增结束后，通过琼脂糖凝胶电泳，回收PCR产物，获得突变基因，即酮还原酶LEK突变体W28A基因、酮还原酶LEK突变体W28M基因、酮还原酶LEK突变体L207F基因、酮还原酶LEK突变体S209G基因和酮还原酶LEK突变体S209H基因。

6.2.4.2突变株的构建

用pEASY-Blunt Simple Cloning Kit将突变基因片段（步骤6.2.4.1获得）与pEASY-Blunt Simple Cloning Vector连接。pEASY-Blunt Simple Cloning Kit适用于平端克隆，克隆速度快，提供氨苄青霉素和卡那青霉素两种筛选标记。本实验要插入的突变基因片段来源于含有氨苄青霉素基因质粒，因此选择卡那青霉素筛选，避免由于模板带来的污染。

连接反应体系：

DNA 4μL

pEASY-Blunt Simple Cloning Vector 1μL

反应体系总体积：5μL，其中DNA为上述SOE-PCR定点突变方法获得的单个突变基因，即酮还原酶LEK突变体W28A基因、酮还原酶LEK突变体W28M基因、酮还原酶LEK突变体L207F基因、酮还原酶LEK突变体S209G基因和酮还原酶LEK突变体S209H基因。

向灭菌的PCR管中加入上述反应体系，并轻轻混匀，于25℃进行连接反应10min，获得连接产物。反应结束后，将离心管置于冰上。再将连接产物转化到Trans1-T1感受态细胞中。随机挑取平板上的5-10个单菌落加入含有10μL无菌水的灭菌PCR管中，混匀。取其中1μL作为DNA模板，用lek引物（即lek-F1、lek-R2），进行PCR验证。验证阳性的菌送至生工生物工程有限公司进行测序验证突变结果。

用普通质粒提取试剂盒提取连接好的五种克隆突变质粒，利用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ对该质粒和质粒pET28a(+)分别进行双酶切。酶切结束后，通过琼脂糖凝胶回收试剂盒以回收目的DNA片断，二者通过粘性末端采用high-ligation连接酶进行连接。将连接产物转化到E.coli DH5α感受态细胞，氨苄青霉素抗性筛选和PCR阳性筛选出阳性转化子。再提取重组质粒，转化到表达宿主E.coli BL21(DE3)中，通过PCR阳性筛选和质粒提取获得突变株，即酮还原酶LEK突变株W28A、酮还原酶LEK突变株W28M、酮还原酶LEK突变株L207F、酮还原酶LEK突变株S209G和酮还原酶LEK突变株S209H。

6.2.4.3突变株的表达

将酮还原酶LEK突变株W28A、酮还原酶LEK突变株W28M、酮还原酶LEK突变株L207F、酮还原酶LEK突变株S209G和酮还原酶LEK突变株S209H分别于LB培养基中37℃培养至OD₆₀₀值为0.6后加入终浓度为0.1mmol/L IPTG，25℃诱导表达15h。收集菌体，即获得上述各个酮还原酶LEK突变体发酵培养后的湿菌体。

6.2.5葡萄糖脱氢酶的表达

将菌株pET22b-gdh2-E.coli BL21于LB培养基中37℃培养至OD₆₀₀值为0.6后加入终浓度为0.1mmol/L IPTG，25℃诱导表达15h。收集菌体，获得葡萄糖脱氢酶GDH2表达后的湿菌体。

6.2.6突变酶与亲本酶的催化性能比较

根据步骤6.2.3所述方法测定突变酶与亲本酶的Km值。

利用酮还原酶LEK的基因工程菌和葡萄糖脱氢酶GDH2的基因工程菌耦合表达两种酶，催化不对称还原反应。

双菌耦合催化反应体系：以酮还原酶LEK突变体发酵培养后的湿菌体（步骤6.2.2.2制备的酮还原酶LEK菌体）和葡萄糖脱氢酶GDH2发酵培养后的湿菌体（步骤6.2.4.3制备的酮还原酶LEK突变体菌体）以质量比1：0.74的混合菌体29.95mg为催化剂，以12.18mg4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，在17.55mg葡萄糖的作用下，于0.10mL无水乙醇和0.89mL磷酸盐缓冲液（pH值为7.4）中构成总体积为1mL转化体系，将反应体系于30℃、180r/min条件下反应65min。反应液处理方法：用等体积的乙酸乙酯萃取两次，取上层有机相用无水硫酸钠脱水后，旋转蒸发器蒸干，用1mL异丙醇溶解，经滤膜（孔径0.45μm）过滤，得到待检测样品。利用气相色谱法（GC）和高效液相色谱法（HPLC）检测待检测样品，研究催化反应过程中底物底物转化率及对映体过量值。同样条件下以步骤6.2.2.2制备的酮还原酶LEK菌体作为对照。

GC检测产物CHBE的转化率。气相色谱条件：毛细管柱pEG-20M；载气为氮气；分流比为20：1；流量为1.5mL/min；进样量为1μL；进样口温度为200℃；检测器温度为230℃；柱温为梯度升温，从90℃以6℃/min的升温，速率升至150℃保留2min，以10℃/min升温至180℃，保留15min；氢离子检测器。首先用异丙醇配制一系列浓度梯度的COBE和CHBE标准溶液。配制COBE标准溶液浓度分别为3.7mM、7.4mM、14.8mM、29.6mM、44.4mM和59.2mM，CHBE标准溶液浓度分别为7.4mM、14.8mM、29.6mM、59.2mM、88.8mM和118.4mM。再将不同浓度的标准溶液用气相色谱检测，测得相应的峰面积。以浓度作为横坐标，峰面积为纵坐标，分别制作COBE（图6）和CHBE（图7）的气相色谱标准曲线。

HPLC检测产物对映体过量值（e.e.值）。高效液相色谱条件：手性色谱柱ChiralcelOB-H(4.6×250mm；Daicel Chemical Industries，Japan)，紫外检测器，检测波长为210nm，流动相为正己烷/异丙醇（90/10，V/V），流速为0.8mL/min。

通过GC检测可以获知反应的转化率，计算公式如下：

转化率(g/g%)=C/D×100%

式中C为已转化的COBE浓度，D为反应初始COBE的浓度。

通过HPLC检测可以获知反应产物CHBE的过映体过量值，计算公式如下：

对映体过量值(e.e.%)=(R-S)/(R+S)×100%

式中R为R型产物的浓度，S为S型产物的浓度。

6.3结果与讨论

6.3.1目的基因片段的验证及氨基酸序列分析

经PCR验证和DNA序列测序，将得到的基因片段在NCBI的核酸数据库中进行比对，找到LEK序列中的属于醛酮还原酶（aldo-keto reductase，AKR）家族的保守序列。将LEK氨基酸序列提交到Swiss-model网站，模拟得到蛋白三维结构（图1），具有AKR家族典型的三维结构，因此可以判定LEK是醛酮还原酶家族中的一员。LEK及其同源性高的蛋白质的关系用进化树表示（图2）。通过序列和模拟酶的三维结构分析初步确定该蛋白是一种酮还原酶（ketoreductase），命名为酮还原酶LEK（核苷酸序列为SEQ.ID.NO.1所示，氨基酸序列为SEQ.ID.NO.2所示）。

醛酮还原酶家族结构上有一些共性。第一个共性是都有催化四联体，且以β-折叠的羰基端与辅酶结合。LEK的催化四联体为56D、61Y、82K和114H，这四个氨基酸是负责底物催化的关键氨基酸，并且相对位置高度保守。第二个共性是结构中都具有典型的α-螺旋和β-折叠，并构成保守的(α/β)₈桶状折叠三维结构，其中β折叠的羧基端通过一些环（Loop）与α-螺旋的氨基端结合，这些环大部分柔软、长度可变，使酶能适应不同结构的底物，并控制催化，形成了活性中心。25个相对保守的活性位点位于LEK酶三维结构的环上，为26G、27T、28W、56D、61Y、82K、114H、115W、154S、155N、178Q、204Y、205S、206P、207L、208G、209S、232A、247L、248P、249K、250S、255R、258S和259N。

6.3.2酶的表达与纯化

酮还原酶LEK在构建的基因工程菌细胞内诱导表达，收集的菌体用PBS洗涤后再重悬，重悬液超声破碎并离心后，上清液即可溶性蛋白，有酶活性，而沉淀即包涵体没有蛋白活性。SDS-PAGE电泳鉴定表达产物（图3）可知，未加IPTG诱导的菌体目的蛋白表达量较少，而经IPTG诱导后目的蛋白重组大肠杆菌宿主细胞中表达量明显增加；酮还原酶LEK的可溶性表达量远远超过包涵体表达量。采用BandScan软件分析，结果显示，可溶性目的蛋白约占据了细胞总蛋白含量的40%。表达的目的蛋白有His-tag标签，因此目的蛋白采用Ni-NTA（镍柱）进行亲和层析纯化。经过纯化的LEK蛋白纯度在90％以上（图3）。

6.3.3酶学性质研究

6.3.3.1酶活和酶动力学常数的测定

加入辅酶NADPH的反应体系，在340nm处测吸光值发生变化。而在同样条件下，加入NADH的反应体系，在340nm处测吸光度值没有任何变化。因此可以得知，LEK为仅辅酶NADPH依赖型的醛酮还原酶。以NADPH为辅酶，测定出酮还原酶LEK的酶活力（U）和酶比活力（U/mg）分别为0.01204μmol/min/mg和0.1784μmol/min/mg。

酶对特定底物的Km和Vmax是酶的一个特性常数，Km的大小只与酶的性质有关，与酶的浓度无关。Km可表示酶对底物的亲和力大小，Km愈小，则对底物的亲和力愈大。酮还原酶LEK对底物COBE的米氏常数Km为37.01mM，Vmax为0.6721μmol/min/mg。

6.3.3.2酶的底物谱测定

分别以不同的醛类或者酮类为底物，测定等量的纯酶对各种不同底物的催化活力。实验结果显示，酮还原酶LEK的底物谱包括各种醛类和酮类。LEK对醛类的底物谱较宽，其对多种醛类的酶活力较高。然而，LEK催化酮类化合物的种类不多，具有较高的底物选择性。LEK对苯甲醛、正丁醛、正戊醛、戊二醛、辛醛、2,3-丁二酮、2,3-戊二酮和COBE的相对酶活分别为87.7%、96.7%、74.2%、64.1%、87.4%、87.8%、100%和90.7%。LEK对丁酮、2-辛酮、3-戊酮、2,4-戊二酮、苯丁酮和4-甲基戊酮没有酶活力。

6.3.3.3酶的最适反应温度和热稳定性

酶反应的最适温度研究结果如图4中(a)所示，酮还原酶LEK催化COBE的还原反应最适温度为35℃。随着温度的升高，酶的催化活力也逐渐升高，然而当温度高于45℃以后，酶活显著下降。

研究酶的热稳定性，在不同温度下将酶保温30min后测定其残留酶活，结果如图4中(b)所示，当温度不高于30℃时，酶具有较好的热稳定性，保温30min后，残余活力保持在60%以上。然而，当温度超过45℃时，酶的催化活力全部丧失。

6.3.3.4酶的最适反应pH和pH稳定性

如图5中(a)所示，酮还原酶LEK催化COBE的最适pH值为6.0，并且在pH值5.5-7.5之间，酶活都在70%以上。如图5中(b)所示，表明酮还原酶LEK在pH值5.5-7.5之间比较稳定，不同pH的条件下保温1h后，酶活能保持66%以上。

6.3.3.5酶的金属离子稳定性

许多酮还原酶在催化反应过程中需要金属离子参与，一些金属离子对酮还原酶具有一定的激活作用或者抑制作用。Ca²⁺、Mn²⁺和Li⁺对LEK酮还原酶LEK有激活作用，其中Mn²⁺激活作用最为显著，使酶的活力提高了45%。而Co²⁺、Mg²⁺、Na⁺、Fe³⁺和Cu²⁺抑制酶活，其中Fe²⁺和Cu²⁺抑制作用最强，使酶失活。

6.3.4突变酶与亲本酶的催化性能比较

利用酮还原酶LEK和葡萄糖脱氢酶GDH2的基因工程菌耦合表达两种酶，研究酮还原酶LEK催化制备(R)-CHBE的性能。

通过GC检测并根据GC标准曲线（图6和图7），可得酮还原酶催化反应的转化率。通过HPLC检测可得反应的光学纯度。酮还原酶LEK突变株W28A和酮还原酶LEK突变株S209G的转化率相对于亲本株提高，分别提高了12.71%和27.09%，并且对产物e.e.值没有影响，通过不对称还原反应可生成高光学纯度的(R)-CHBE，而其他突变株对底物的转化率都稍有下降（表1）。除了酮还原酶LEK突变株W28M转化产物的e.e.值下降外，其他突变株转化产物e.e.值都与突变前一致，为99%（表1）。亲本酶LEK、酮还原酶LEK突变株W28A（即突变酶LEKW28A）和酮还原酶LEK突变株S209G（即突变酶LEKS209G）的Km值分别为37.01mM、14.08mM和6.05mM，两个突变酶有更低的Km值，表明突变酶对底物的亲和力更大，有利于酶应用于生物催化制备产物。

表1突变对转化率和e.e.值的影响

Claims

1.一种酮还原酶LEK的突变体，其特征在于所述酮还原酶LEK突变体是将酮还原酶LEK氨基酸位点第209位的S突变为G获得的突变体S209G；所述酮还原酶LEK的氨基酸序列为SEQ.ID.NO.2所示。

2.一种权利要求1所述酮还原酶LEK突变体在生物催化制备（R）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用，其特征在于所述的应用为：以酮还原酶LEK突变体发酵培养后的湿菌体和葡萄糖脱氢酶GDH2发酵培养后的湿菌体以质量比1：0.6～0.8的混合菌体为催化剂，以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，在葡萄糖的作用下，于无水乙醇和磷酸盐缓冲液中构成转化体系，在30℃、180rpm条件下进行转化反应45min～65min，反应完全后将反应液用等体积的乙酸乙酯萃取，取上层有机相用无水硫酸钠脱水后用旋转蒸发器蒸干，再用异丙醇溶解，经滤膜过滤，获得所述（R）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯；所述催化剂的质量用量以酮还原酶LEK突变体发酵培养后的湿菌体质量计为16.00～18.00g/L反应体系，所述底物初始浓度为8.00～18.30g/L反应体系，所述葡萄糖用量为17.00～18.00g/L反应体系，所述无水乙醇的体积终浓度为7～15%。

3.如权利要求2所述酮还原酶LEK突变体在生物催化制备（R）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用，其特征在于所述酮还原酶LEK突变体发酵培养后的湿菌体按如下方法制备：将酮还原酶LEK突变体菌株接种至LB培养基中，37℃下培养过夜，取菌液以体积浓度1%的接种量转接到含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、180r/min震荡培养至菌液OD₆₀₀值为0.4～0.6，再加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L，于25℃、140r/min诱导表达12～17h，将诱导培养液离心，收集湿菌体，即获得所述酮还原酶LEK突变体发酵培养后的湿菌体。