CN102952814A - 重组耐热短链脱氢酶基因、编码酶、载体、工程菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组耐热短链脱氢酶基因、编码酶、载体、工程菌及应用，所述重组耐热短链脱氢酶基因具有与SEQ ID No.1所示核苷酸序列90%以上同源性；本发明所涉及的重组耐热短链脱氢酶具有高活性、热稳定性好，能高效高选择性地制备手性醇类化合物，可以在葡萄糖脱氢酶GDH或甲酸脱氢酶条件下构建辅酶NADPH或NADH循环再生系统，能大大降低反应过程中辅酶的消耗；本发明方法极大地降低了生产的成本，且反应条件温和，对环境友好，操作简便，在合成药物手性中间体方面具有很好的工业应用前景。

Description

重组耐热短链脱氢酶基因、编码酶、载体、工程菌及应用

（一）技术领域

本发明涉及一种重组耐热短链脱氢酶基因、基因编码酶、重组载体、工程菌及基因编码酶在制备光学手性醇中的应用。

（二）背景技术

短链脱氢酶属于羰基还原酶（EC1.1.1.184）。在生物体中，羰基还原酶既可将酮底物还原为相应的醇，也可催反向反应，将醇氧化为相应的酮或醛；这些反应需要辅助因子的存在，如：NADH、NADPH、NAD或NADP。其中NADH、NADPH作为电子供体，NAD、NADP作为电子受体。在工业上，羰基还原酶已被越来越多的用于还原各类酮产生相应的手性醇；催化形式既可以是全细胞，也可以是纯化过的酶。从实际成本的角度考虑，羰基还原酶在应用于酮还原反应时，往往会涉及到一个辅酶再生系统，如利用葡萄糖脱氢酶(GDH)或甲酸脱氢酶(FDH)进行辅助因子（NADH或NADPH）的再生，从而显著减少辅助因子的用量。

根据底物特异性和酶的动力学参数，羰基还原酶主要分为醛酮还原酶家族、短链脱氢酶家族和中链脱氢酶家族。鉴于有机合成反应中化合物的多样性及反应环境的复杂性，有必要找到更多热稳定较好的羰基还原酶。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种重组耐热短链脱氢酶基因、基因编码酶、重组载体、工程菌及基因编码酶在制备光学手性醇中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种重组耐热短链脱氢酶基因，所述重组耐热短链脱氢酶基因具有与SEQ ID No.1所示核苷酸序列90%以上同源性，优选所述基因核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，所述重组耐热短链脱氢酶基因还包括SEQID No.1所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸序列取代、缺失或添加获得的核苷酸序列。

进一步，SEQ ID No.1所示核苷酸序列全长为747bp，其编码序列从第一个碱基起至第744碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAG，该序列无内含子。

所述SEQ ID No.1所示核苷酸序列为：

atgggcttca aagataaagt ggttgtggtt accggctctg gtcgtggcattggtcgcagt     60

atcgccaaaa tgtatgcaga acatggtgcg aaagtggtta tcgcggatcgtaactttcag    120

gaagccctgg aaacggaacg cctgatttct gaagaaggcg gtgaagccatggcagtgctg    180

gcggatgtta gtaaaccgga agatgtgatc aacctgatgg aaaaaatcgaaaaaagctat    240

ggccgtctgg atattctgat caacaatgcc ggctttggtt gctggaaaagcccgtacgat    300

ctgaccgtgg aagaatggga ttctgttatc aacaccaatc tgcgtggcacgttcctgtgt    360

agccgcgaag cggccaaaat tatgaaaaaa ggcggtggcg gtgcaattgtgaacatcgcc    420

agtacccgcg caatcatgag cgaaccgaat agcgaatctt atgcagcgtctaaaggtggt    480

atcctggcac tgacgcacgc actggcaatt agtctgggtc cggatcgtattcgcgttaac    540

gcaatcagcc cgggctggat tgaaaccggt gaatacgaaa aactgcgtgaaatcgatcat    600

ctgcagcacc cggcaggtcg tgtgggtaaa ccggaagtaa ttgcacgcgcgtgcctgttt    660

ctgaccgcag aagaaaacag cttcatcacg ggtgcgaatc tggttattgatggcggtatg    720

acccggaaga tgatttatga accatag747

本发明提供一种由所述重组耐热短链脱氢酶基因编码的重组耐热短链脱氢酶。

进一步，所述重组耐热短链脱氢酶具有与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列90%以上的同源性，优选所述重组耐热短链脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。

由于密码子的兼并性，编码SEQ ID No.2的氨基酸序列的碱基序列不仅仅局限于SEQ ID No.1，如：不同于SEQ ID No.1，但编码的氨基酸序列与SEQ ID No.1所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；或者是在保持由该重组耐热短链脱氢酶催化活性的前提下，由插入、缺失或替换如序列表中 SEQ.ID NO：2所示的氨基酸序列中至少一个氨基酸而得到的变异的氨基酸序列。

所述氨基酸序列SEQ.ID NO ：2为：

Met Gly Phe Lys Asp Lys Val Val Val Val Thr GlySer

1             510

Gly Arg Gly Ile Gly Arg Ser Ile Ala Lys Met TyrAla

    15              2025

Glu His Gly Ala Lys Val Val Ile Ala Asp Arg AsnPhe

           30              35

Gln Glu Ala Leu Glu Thr Glu Arg Leu Ile Ser GluGlu

40                4550

Gly Gly Glu Ala Met Ala Val Leu Ala Asp Val SerLys

55                6065

Pro Glu Asp Val Ile Asn Leu Met Glu Lys Ile GluLys

              7075

Ser Tyr Gly Arg Leu Asp Ile Leu Ile Asn Asn AlaGly

    80               8590

Phe Gly Cys Trp Lys Ser Pro Tyr Asp Leu Thr ValGlu

           95              100

Glu Trp Asp Ser Val Ile Asn Thr Asn Leu Arg GlyThr

105              110115

Phe Leu Cys Ser Arg Glu Ala Ala Lys Ile Met LysLys

       120              125130

Gly Gly Gly Gly Ala Ile Val Asn Ile Ala Ser ThrArg

              135             140

Ala Ile Met Ser Glu Pro Asn Ser Glu Ser Tyr AlaAla

   145              150155

Ser Lys Gly Gly Ile Leu Ala Leu Thr His Ala LeuAla

160              165

Ile Ser Leu Gly Pro Asp Arg Ile Arg Val Asn AlaIle

170             175180

Ser Pro Gly Trp Ile Glu Thr Gly Glu Tyr Glu LysLeu

      185              190195

Arg Glu Ile Asp His Leu Gln His Pro Ala Gly ArgVal

             200              205

Gly Lys Pro Glu Asp Ile Ala Arg Ala Cys Leu PheLeu

   210              215220

Thr Ala Glu Glu Asn Ser Phe Ile Thr Gly Ala AsnLeu

          225              230

Val Ile Asp Gly Gly Met Thr Arg Lys Met Ile TyrGlu

235             240245

Pro

248

本发明提供一种含有所述重组耐热短链脱氢酶基因的重组载体。

所述重组载体可通过本领域常规方法将本发明的重组耐热短链脱氢酶基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述的载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选质粒为 pET28a。较佳的，可通过下述方法制得本发明的重组表达载体：将重组耐热短链脱氢酶基因产物和表达载体pET28a均分别用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切，形成互补的粘性末端，经T4 DNA连接酶连接，形成含有本发明的重组耐热短链脱氢酶基因的重组表达质粒 pET28a-SDR3。

本发明还提供一种含有所述重组耐热短链脱氢酶基因或所述重组载体的重组基因工程菌。

进一步，所述重组基因工程菌可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足重组质粒可稳定地自行复制，且所携带的本发明的重组耐热短链脱氢酶基因可被有效表达即可。较佳的，宿主菌是大肠杆菌，更佳的为重组大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)。本发明的重组表达转化体（即重组基因工程菌）可以按照本领域的常规方法制备而得，一般将前述重组载体 pET28a-SDR3转化至 E.coli BL21(DE3)中，即可得本发明优选的重组基因工程菌株，即 E.coli BL21(DE3)/pET28a-SDR3。

本发明所述重组耐热短链脱氢酶基因在制备重组耐热短链脱氢酶中的应用为：构建含重组耐热短链脱氢酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至所述宿主体内，将获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离纯化得到含重组耐热短链脱氢酶的菌体细胞。

此外，本发明还提供一种由所述重组耐热短链脱氢酶基因编码的重组耐热短链脱氢酶在制备光学活性手性醇中的应用是在pH值为6.0~8.0的缓冲溶液中，以前手性羰基化合物为底物，以重组耐热短链脱氢酶为酶源，加入葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和辅酶NADP⁺或辅酶NAD⁺构成反应体系进行生物转化反应，反应完全后，将反应液后处理获得所述光学活性手性醇；所述前手性羰基化合物为α-酮酯或脂肪酮。

进一步，所述反应液后处理方法为：反应完全后，将反应液用正己烷萃取，取上层有机相，用氮气吹扫除去正己烷，获得所述光学活性手性醇。

进一步，所述重组耐热短链脱氢酶是以含重组耐热短链脱氢酶的重组基因工程菌发酵培养获得的菌体细胞或菌体细胞破碎后的上清液作为酶源，以含重组耐热短链脱氢酶的重组基因工程菌发酵培养获得的菌体细胞为酶源时，所述酶源的质量用量以菌体细胞的干重计为1~10g/L（即酶源的用量为1～ 20U/L反应体系），优选5 g/L。

进一步，本发明所述重组耐热短链脱氢酶基因编码的重组耐热短链脱氢酶在制备光学活性手性醇中的应用优选按如下方法进行：在pH值为6.0~8.0的缓冲溶液中，以前手性羰基化合物为底物，以含重组耐热短链脱氢酶的重组基因工程菌发酵培养获得的菌体细胞或菌体细胞经细胞破碎后的上清液冻干作为酶源，加入葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和辅酶NADP⁺或辅酶NAD⁺构成反应体系，在20~ 40℃进行生物转化反应，反应完全后，将反应液用正己烷萃取，取上层有机相，用氮气吹扫除去正己烷，获得所述光学活性手性醇；所述底物为α-酮酯、β-酮酯、芳香酮或脂肪酮，优选α-酮酯或脂肪酮，最优选为α-酮酯。

所述的不对称还原反应的各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择，所述底物优选如下：α-酮酯、脂肪族酮及其他含酮基化合物或醛类化合物，更优选为苯甲酰甲酸乙酯、2-氧代-4-苯基丁酸乙酯或丙酮酸乙酯等。

本发明所述含重组耐热短链脱氢酶的重组基因工程菌发酵培养获得的菌体细胞制备方法为：将含重组耐热短链脱氢酶的重组基因工程菌株（E.coli BL21(DE3)/pET28a-SDR3）接种至含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中培养，在37℃、180r/min下震荡培养12h，然后将培养液以体积比1:100接种至新鲜的含50μg/ml卡那霉素的 LB培养基中，在37℃、180r/min下震荡培养至培养液的光密度 OD₆₀₀达到 0.5~ 0.7(优选0.6)时，加入终浓度为 0.1~1mmol/L(优选0.5mmol/L)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG)，37℃、100r/min下继续诱导8~24小时（优选15h），将诱导培养液离心，获得菌体细胞。将菌体细胞重新悬浮于预冷的Tris-HCl缓冲液(Tris-HCl浓度为10～100mM，pH6.0~8.0，优选20Mm，pH8.0)后进行细胞超声破碎，离心收集上清液，再冻干（-80℃干燥48h）就能得到本发明的重组耐热短链脱氢酶的酶粉，即酶源。

本发明由所述重组耐热短链脱氢酶基因编码的重组耐热短链脱氢酶在制备光学活性手性醇中的应用中所述反应液的 pH为 6~ 8，通过使用磷酸盐缓冲液进行控制。所述的磷酸盐缓冲液较佳的如磷酸 -磷酸钾或磷酸 -磷酸钠缓冲液。磷酸盐缓冲液的浓度较佳的为0.05-0.2mol/L，所述的浓度是指缓冲溶液中共轭酸碱的总浓度。反应过程中也可以滴加碱液，如碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠、氢氧化钾、氨水等的水溶液以维持反应液 pH恒定在 pH 6-8的范围。

更进一步，所述的应用推荐按如下步骤进行：将含重组耐热短链脱氢酶的重组基因工程菌发酵培养获得的菌体细胞或菌体细胞经细胞破碎后的上清液冻干获得的酶粉作为酶源，悬浮于pH值6.0~8.0的缓冲溶液中，分别加入底物、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和辅酶NADP⁺或辅酶NAD⁺构成反应体系，在20~ 40℃下磁力搅拌5~36h，反应结束后，反应液用正己烷萃取，取上层有机相，用氮气吹扫除去正己烷（或用其它方法蒸干正己烷即可），获得所述光学活性手性醇；所述底物为4-甲氧基苯丙酮、环庚酮、3-甲基-2-戊酮、乙酰乙酸乙酯、环戊酮、3-庚酮、2-戊酮、苯乙酮、苄基丙酮、2-己酮、丙酰基乙酸乙酯、4-甲基-2-戊酮、苯甲酰乙酸乙酯、环已酮、丙酮酸乙酯、丁酰乙酸乙酯、2-氧代-4-苯基丁酸乙酯或苯甲酰甲酸乙酯，优选为丙酮酸乙酯、丁酰乙酸乙酯、2-氧代-4-苯基丁酸乙酯或苯甲酰甲酸乙酯；所述底物的初始浓度为1～100g/L反应体系（优选5~10g/L），所述酶源的用量为1～ 20U/L反应体系（优选20U/L），所述葡萄糖与底物的质量比为1~2:1（优选2:1），所述葡萄糖脱氢酶的用量为1～ 20U/L反应体系（优选20U/L），所述辅酶NADP⁺或辅酶NAD⁺的终浓度为0.1~1.0mmol/L反应体系（优选0.25~1 mmol/L反应体系）。

本发明中，优选重组耐热短链脱氢酶的酶粉为反应催化剂，需要加入辅酶 NADP+或NAD+ 的用量较佳的不超过 1.0mmol/L，能达到极其优良的效果。如果用静息细胞作催化剂则不需要加入辅酶，只需要利用细胞内所含的辅酶即可。

本发明所述重组耐热短链脱氢酶的酶活力单位的定义为：每分钟消耗1mmol底物所需要的酶量为一个酶活单位（1U）。

本发明中，所述的生物转化反应的温度较佳的为 20～ 40℃。所述的生物转化反应的时间以反应完全为准，一般为 5~36小时。不对称还原反应结束后，可按本领域常规方法从反应液中提取手性醇。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：（1）本发明所涉及的重组耐热短链脱氢酶具有高活性、热稳定性好，70℃处理 15min后仍较为稳定，残余相对酶活达95%以上；（2）本发明的重组耐热短链脱氢酶高效高选择性地制备手性醇类化合物，可以在葡萄糖脱氢酶GDH或甲酸脱氢酶条件下构建辅酶NADPH或NADH循环再生系统，能大大降低反应过程中辅酶的消耗；（3）由于本发明的重组耐热短链脱氢酶具有较高的热稳定性，可以回收利用，并且反应体系中只需要额外添加少量的辅酶（辅酶的质量用量为底物质量的1/1000，辅酶在反应体系中的浓度不超过1Mm），极大地降低了生产的成本，且反应条件温和，对环境友好，操作简便，在合成药物手性中间体方面具有很好的工业应用前景。

（四）附图说明

图 1、为pET28a--SDR3质粒经限制性内切酶EcoR I和Xoh I酶切后产物电泳结果图，泳道M为Marker DL2000，泳道1为pET28a-SDR3质粒酶切产物。

图 2、目的基因表达产物的SDS-PAGE电泳图，泳道M为蛋白Marker，泳道1为诱导组沉淀，泳道2为诱导组上清，泳道3为对照组沉淀，泳道4为对照组上清。

图3、重组质粒pET28a--SDR3的构建示意图。

图4、重组耐热短链脱氢酶催化苯甲酰甲酸乙酯制备s-扁桃酸乙酯的液相色谱图，a为扁桃酸乙酯标准品，b为产物s-扁桃酸乙酯。

图5、EOPB反应后液相色谱图：12.655分钟的峰为R-EHPB，峰面积为295743，13.910分钟的峰为S-EHPB，峰面积为208899。

图6、丙酮酸乙酯反应后液相色谱图：9.635分钟的峰为R-乳酸乙酯，峰面积为93256；10.786分钟的峰为S-乳酸乙酯，峰面积为28313。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

下列实施例中材料的来源为：

表达质粒 pET28a购自Novagen公司。

E.coli DH5α和 E.coli BL21(DE3)感受态细胞，2×Taq PCR MasterMix，琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。

Clone EZ重组克隆试剂盒购自 GenScript公司。

LB培养基终浓度组成为：100ml蒸馏水中，加入1g氯化钠、1g蛋白胨和0.5g酵母提取物，自然pH值。

实施例 1 重组耐热短链脱氢酶基因的高效表达基因和表达载体的人工构建

通过对genebank的检索与分析确定本发明的重组耐热短链脱氢酶基因（SDR3）DNA序列。在保证重组耐热短链脱氢酶的氨基酸序列不变的情况下，将编码重组耐热短链脱氢酶基因的密码子，全部换成在大肠杆菌中使用频率最高的密码子，改建的由重组耐热短链脱氢酶基因序列推断出的DNA序列如序列表SEQ ID NO ：1所示，在金斯瑞生物科技基因合成序列为SEQ ID  NO: 1所示的SDR3 DNA。然后将合成的SDR3 DNA克隆到大肠杆菌高效表达载体pET28a中，并经IPTG诱导在E.coli BL21(DE3)基因工程菌中高效表达。

将上述人工合成的重组耐热短链脱氢酶DNA序列（SDR3）用限制性内切酶EcoR I和Xho I进行双酶切，用割胶回收的方法，回收约750bp大小的 DNA片段；用同样的限制性内切酶酶切pET28a质粒载体，酶切产物用AxyPrep PCR纯化试剂盒回收；将回收的750bp目的DNA片段与pET28a载体片段进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。从E.coli DH5α受体菌中提取pGEM-T-SDR3质粒，进行双酶切检测鉴定，阳性克隆转化E.coli BL21(DE3)表达菌株中。重组载体的构建过程见图3所示，具体实验方法如下：

按照超纯水，人工合成pGEM-T-SDR3质粒和pET28a质粒、酶切缓冲液、限制性内切酶EcoR I和Xho I的顺序加到PCR管中，用枪头吸打几次，充分混匀后，用小型离心机离心（3000rpm，1 min）将管壁上的液体集中于管底，37℃水浴4h后，95℃水浴10分钟终止酶切。切取含目的条带的胶块后以AxyPrep DNA胶回收试剂盒纯化回收750bp目的DNA片段。由于经EcoR I和Xho I酶切的pET28a载体，切掉的片段只有34bp，AxyPrep PCR纯化试剂盒只能回收长度大于75bp的DNA片段，所以同样可以使用该试剂盒选择性地回收酶切后的线性载体。

酶切体系（50μL）：

将上述酶切体系用质量浓度0.7%琼脂糖凝胶电泳检测，分析双酶切结果，结果见图1所示，其中750bp左右的片段是需回收的SDR3基因目的片段，较大的片段是线性pET28a。

将双酶切回收的SDR3基因目的片段与线性pET28a(+)按如下比例配成连接体系，置于PCR仪16℃恒温16h，得到重组质粒pET28a-SDR3。

连接体系（10μL）：

在含50μL感受态细胞（E.coli DH5α）的EP管中加入10μL连接产物，轻轻混匀，冰浴30min，转入42℃水浴中热击90s，快速转至冰浴中2min，取出后加入500μL 无抗性LB培养基，37℃，180r/min摇床培养1h后涂布于含30μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃倒置培养16h后挑取单菌落，活化培养后使用AxyPrep质粒DNA小量提取试剂盒提取质粒进行双酶切检测鉴定阳性克隆。将含有阳性克隆的E.coli DH5α菌株于8%（体积浓度）甘油中，-20℃冰箱保存。

同样方式构建含有pET28a-SDR3的表达菌株E.coli BL21- pET28a-SDR3（DE3），置于终浓度为8%（体积）甘油中，-20℃冰箱保存。

实施例 2 重组基因工程菌的培养及重组耐热短链脱氢酶酶粉制备

取实施案例1中得到的表达菌株E.coli BL21- pET28a-SDR3（DE3），分别接种于两个5mL含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基的试管中，37℃，180r/min培养12h后，将培养液以体积比1：100的比例接种于新鲜的100mL含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃培养1.5~2h，至菌液OD₆₀₀约为0.6，再加入24mg/mL的IPTG溶液至IPTG终浓度为0.5mmol/L，25℃、100r/min诱导培养12h，然后4℃，4000r/m离心20min后弃上清，用蒸馏水悬浮菌体（即沉淀）洗涤，同样条件下离心，即得到重组耐热短链脱氢酶的菌体细胞。

将菌体细胞重新悬浮于20mL 预冷的Tris-HCl(20mM，pH 8.0)缓冲液后进行细胞超声破碎，工作条件为功率80W，工作5秒，间歇5秒，共进行20min，此过程中细胞始终保持在冰浴中，防止蛋白热变性，破碎混合液10000r/mim离心10分钟，得到上清液，即酶液，沉淀用20mlTris-HCl(20mM，pH 8.0)缓冲液溶解，用于后续电泳检测。按上述同样的方法表达含空白质粒pET28a的菌株 E.coli BL21- pET28a，得到对照组酶液和沉淀溶液。

将上述4组样品液进行电泳检测，本实验中表达的目标蛋白大小在25-35kDa左右，根据目的蛋白大小，分离胶选用10% SDS-PAGE，浓缩胶采用5%SDS-PAGE。

电泳参数：样品上样10μL，Marker上样10μL，浓缩胶电压50V，分离胶电压200V。

电泳完毕后，取出胶加入适量考马斯亮蓝染色液在脱色摇床染色2h后更换脱色液，每2h更换一次，最后脱色过夜，观察电泳结果。

结果如图2所示，重组质粒pET28a-SDR3转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导后，细胞裂解液上清有一条明显的分子量在25kD~35kD之间蛋白条带，大约为33kDa（泳道2所示），目的基因SDR3在大肠杆菌成功的异源表达。细胞裂解液沉淀中并没有发现25kD~35kD之间的条带（泳道1所示），说明目的蛋白没有以包涵体的形式聚集。同样条件下转化空白质粒pET28a的菌株 E.coli BL21- pET28a（泳道4所示）及其沉淀（泳道3所示）没有发现25kD~35kD之间的条带。

将上述酶液经过70℃热处理5分钟后，10000r/mim离心10分钟，取上清液在-80℃冷冻干燥48h，得到重组耐热短链脱氢酶干酶粉0.1g。

实施例3 重组耐热短链脱氢酶活力测定和酶的热稳定性

酶活测定依据Vallee&Hoch法：在340nm还原型辅酶NAD(P)H有明显吸收而氧化型辅酶NAD(P)+无吸收，因此在氧化还原反应中，辅酶被氧化或还原会引起340nm吸光度的变化。故可通过测定反应过程中340nm出辅酶吸光度的变化来衡量氧化还原酶的活力。

酶活单位的定义为：每分钟消耗1mmol底物所需要的酶量为一个酶活单位（1U）。

测定方法如下：在1.5ml EP管中加10μl 二甲基亚砜（DMSO），用于底物助溶；分别加底物2-5μL（保持摩尔浓度为20mM）（底物见表1所示），混匀；加20μL 10mg/ml的NADH溶液（终浓度0.25mM），混匀；加20Mm pH8.0的Tris-Hcl缓冲液至1ml，混匀，制成待测液；将上述1ml待测液加入到比色皿，放入分光光度计中；加10μL酶液（将实施例2制备的酶粉用超纯水配制成1mg/ml的酶液），迅速在340 nm读取吸光值。3分钟后再记录一次吸光值，相对酶活力按公式（1）计算，结果见表1所示。

相对酶活力(U)=（ΔOD340×V×1000） /（6220×L×Δt） 公式（1）；

ΔOD340: 吸光度变化；V: 反应体系总体积(1mL)；Δt:反应时间(3min)； e: 摩尔吸光系数， 6.22 mL/(mol·cm)；L: 石英比色杯光程(1cm)。

重组耐热短链脱氢酶（SDR3）对各种测定的酮类均有一定的作用，其中丙酮酸乙酯、丁酰乙酸乙酯、苯甲酰甲酸乙酯、2-氧代-基丁酸乙酯以及环己酮是其较好的底物。重组耐热短链脱氢酶（SDR3）对丁酰乙酸乙酯酶活为1.93U/mL，以该化合物为100%活性参照底物，标注对各底物的相对活性如表1。由表可见重组耐热短链脱氢酶（SDR3）对酮酯类底物的活性很高，而对脂肪族酮、芳香酮、环酮活性相对较低。

表1重组耐热短链脱氢酶相对活性

酶的热稳定性：在20 mM Tris–HCl pH8.0缓冲液中，将重组耐热短链脱氢酶酶液0.5ml（将实施例2制备的酶粉用超纯水配制成1 mg/ml的酶液）分别在70℃、75℃、80℃、85℃、90℃下保温15min后取出按标准方法70℃测定残余酶活力。

热稳定性研究表明，该重组耐热短链脱氢酶在70℃下保温15min处理，较为稳定，残余相对酶活达91.8%，当温度高于75℃后，酶活急剧下降，其中85℃保温15min后剩余相对酶活只有0.6%。结合酶热处理的结果选取70℃、15min处理的酶液作为不对称还原的催化剂。

实施例 4重组耐热短链脱氢酶催化苯甲酸甲酰乙酯的不对称还原

取0.02mg(反应体系中初始酶活20U/L)实施例 2所得的重组耐热短链脱氢酶的酶粉悬浮于 2ml磷酸-磷酸钠缓冲液 (100mmol/L，pH 7.5)中，加入0.02mg(反应体系中初始酶活20U/L)葡萄糖脱氢酶GDH，10mg底物苯甲酸甲酰乙酯，20mg葡萄糖和 2μmol辅酶NADP⁺构成反应体系，在 30℃，磁力搅拌下反应 22h。反应结束后反应液用2ml正己烷进行萃取，取小部分上层正己烷溶液用液相色谱 (手性色谱柱(Chiralcel OD-H,Japan,Daicel chemical,0.46φ×25，流动相：正己烷/异丙醇=93/7，v/v，1mL/min，柱温：40℃，检测波长：UV254nm紫外检测器)分析测定底物转化率和还原产物（s-扁桃酸乙酯）的 ee值。以扁桃酸乙酯标准品作为参照，液相色谱图见图4所示，结果如下：转化率 98％；ee值＞99.9％。将剩余部分上层正己烷溶液用氮气吹扫除去正己烷，获得s-扁桃酸乙酯，产率为80%。

实施例 5重组耐热短链脱氢酶催化2-氧代-4-苯基丁酸乙酯的不对称还原

取0.02mg(反应体系中初始酶活20U/L)实施例 2所得的重组耐热短链脱氢酶的酶粉悬浮于 2ml磷酸-磷酸钠缓冲液 (100mmol/L，pH 7.5)中，加入0.02mg(反应体系中初始酶活20U/L)葡萄糖脱氢酶GDH，9.8微升底物2-氧代-4-苯基丁酸乙酯，20mg葡萄糖和 2μmol辅酶NADP⁺构成反应体系，在 30℃，磁力搅拌下反应 12h。反应结束后反应液用2ml乙酸乙酯进行萃取，取小部分上层乙酸乙酯溶液用液相色谱(手性色谱柱(Chiralcel IC,Japan, Daicel chemical,0.46φ×25，流动相：正己烷/异丙醇=95/5，v/v，1mL/min，柱温：40℃，检测波长：UV254nm紫外检测器)分析测定底物转化率和还原产物（R-EHPB）的 ee值。液相色谱图见图5所示，12.655分钟的峰为R-EHPB，峰面积为295743：13.910分钟的峰为S-EHPB峰面积为208899。结果：转化率 54％；ee值17％。

实施例 6重组耐热短链脱氢酶催化丙酮酸乙酯的不对称还原

取0.02mg(反应体系中初始酶活20U/L)实施例 2所得的重组耐热短链脱氢酶的酶粉悬浮于 2ml磷酸-磷酸钠缓冲液 (100mmol/L，pH 7.5)中，加入0.02mg(反应体系中初始酶活20U/L)葡萄糖脱氢酶GDH，9.8微升底物丙酮酸乙酯，20mg葡萄糖和 0.5μmol辅酶NADP⁺构成反应体系，在25℃，磁力搅拌下反应 24h。反应结束后，取0.2ml反应液用1ml乙酸乙酯进行萃取，取0.ml上层乙酸乙酯溶液用氮气吹扫除去乙酸乙酯，再加入1ml正己烷混合均匀后用液相色谱 (手性色谱柱(ChiralcelAS-H,Japan, Daicel chemical,0.46φ×25，流动相：正己烷/异丙醇=98/2，v/v，1mL/min，柱温：40℃，检测波长：UV215nm紫外检测器)分析测定底物转化率和还原产物（R-乳酸乙酯）的 ee值。液相色谱图见图6所示，9.63分钟的峰为R-乳酸乙酯，峰面积为93256；10.786分钟的峰为S-乳酸乙酯，峰面积为28313。结果：转化率 87％；ee值54％。

实施例 7重组耐热短链脱氢酶全细胞催化苯甲酸甲酰乙酯的不对称还原

取10mg(反应体系中初始酶活20U/L)实施例 2所得的重组耐热短链脱氢酶的菌体细胞悬浮于 2ml磷酸-磷酸钠缓冲液 (100mmol/L，pH7.5)中，加入0.04mg(反应体系中初始酶活40U/L)葡萄糖脱氢酶GDH，20mg底物苯甲酸甲酰乙酯，40mg葡萄糖和 2μmol辅酶NADP⁺构成反应体系，在 30℃，磁力搅拌下反应 16h。反应结束后反应液用4ml正己烷进行萃取，取小部分上层正己烷溶液用液相色谱 (手性色谱柱(Chiralcel OD-H,Japan, Daicel chemical,0.46φ×25，流动相：正己烷/异丙醇=93/7，v/v，1mL/min，柱温：40℃，检测波长：UV254nm紫外检测器)分析测定底物转化率和还原产物（s-扁桃酸乙酯）的ee值。结果：转化率 99％；ee值＞99.9％。

应理解，在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动和修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  杭州师范大学

 

<120>  重组耐热短链脱氢酶基因、编码酶、载体、工程菌及应用

 

<130> 

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  747

<212>  DNA

<213>  Unknown

 

<220>

<223>  人工序列

 

<400>  1

atgggcttca aagataaagt ggttgtggtt accggctctg gtcgtggcat tggtcgcagt       60

 

atcgccaaaa tgtatgcaga acatggtgcg aaagtggtta tcgcggatcg taactttcag      120

 

gaagccctgg aaacggaacg cctgatttct gaagaaggcg gtgaagccat ggcagtgctg      180

 

gcggatgtta gtaaaccgga agatgtgatc aacctgatgg aaaaaatcga aaaaagctat      240

 

ggccgtctgg atattctgat caacaatgcc ggctttggtt gctggaaaag cccgtacgat      300

 

ctgaccgtgg aagaatggga ttctgttatc aacaccaatc tgcgtggcac gttcctgtgt      360

 

agccgcgaag cggccaaaat tatgaaaaaa ggcggtggcg gtgcaattgt gaacatcgcc      420

 

agtacccgcg caatcatgag cgaaccgaat agcgaatctt atgcagcgtc taaaggtggt      480

 

atcctggcac tgacgcacgc actggcaatt agtctgggtc cggatcgtat tcgcgttaac      540

 

gcaatcagcc cgggctggat tgaaaccggt gaatacgaaa aactgcgtga aatcgatcat      600

 

ctgcagcacc cggcaggtcg tgtgggtaaa ccggaagtaa ttgcacgcgc gtgcctgttt      660

 

ctgaccgcag aagaaaacag cttcatcacg ggtgcgaatc tggttattga tggcggtatg      720

 

acccggaaga tgatttatga accatag                                          747

 

 

<210>  2

<211>  248

<212>  PRT

<213>  Unknown

 

<220>

<223>  人工序列

 

<400>  2

 

Met Gly Phe Lys Asp Lys Val Val Val Val Thr Gly Ser Gly Arg Gly

1               5                   10                  15     

 

 

Ile Gly Arg Ser Ile Ala Lys Met Tyr Ala Glu His Gly Ala Lys Val

            20                  25                  30         

 

 

Val Ile Ala Asp Arg Asn Phe Gln Glu Ala Leu Glu Thr Glu Arg Leu

        35                  40                  45             

 

 

Ile Ser Glu Glu Gly Gly Glu Ala Met Ala Val Leu Ala Asp Val Ser

    50                  55                  60                 

 

 

Lys Pro Glu Asp Val Ile Asn Leu Met Glu Lys Ile Glu Lys Ser Tyr

65                  70                  75                  80 

 

 

Gly Arg Leu Asp Ile Leu Ile Asn Asn Ala Gly Phe Gly Cys Trp Lys

                85                  90                  95     

 

 

Ser Pro Tyr Asp Leu Thr Val Glu Glu Trp Asp Ser Val Ile Asn Thr

            100                 105                 110        

 

 

Asn Leu Arg Gly Thr Phe Leu Cys Ser Arg Glu Ala Ala Lys Ile Met

        115                 120                 125            

 

 

Lys Lys Gly Gly Gly Gly Ala Ile Val Asn Ile Ala Ser Thr Arg Ala

    130                 135                 140                

 

 

Ile Met Ser Glu Pro Asn Ser Glu Ser Tyr Ala Ala Ser Lys Gly Gly

145                 150                 155                 160

 

 

Ile Leu Ala Leu Thr His Ala Leu Ala Ile Ser Leu Gly Pro Asp Arg

                165                 170                 175    

 

 

Ile Arg Val Asn Ala Ile Ser Pro Gly Trp Ile Glu Thr Gly Glu Tyr

            180                 185                 190        

 

 

Glu Lys Leu Arg Glu Ile Asp His Leu Gln His Pro Ala Gly Arg Val

        195                 200                 205            

 

 

Gly Lys Pro Glu Asp Ile Ala Arg Ala Cys Leu Phe Leu Thr Ala Glu

    210                 215                 220                

 

 

Glu Asn Ser Phe Ile Thr Gly Ala Asn Leu Val Ile Asp Gly Gly Met

225                 230                 235                 240

 

 

Thr Arg Lys Met Ile Tyr Glu Pro

                245            

Claims (10)

1.一种重组耐热短链脱氢酶基因，其特征在于所述基因具有与SEQ IDNo.1所示核苷酸序列90%以上同源性。

2.如权利要求1所述重组耐热短链脱氢酶基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

3.一种由权利要求1或2所述重组耐热短链脱氢酶基因编码的重组耐热短链脱氢酶。

4.如权利要求3所述重组耐热短链脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。

5.一种含有权利要求1所述重组耐热短链脱氢酶基因的重组载体。

6.一种含有权利要求1或5所述重组耐热短链脱氢酶基因或重组载体的重组基因工程菌。

7.一种由权利要求1所述重组耐热短链脱氢酶基因编码的重组耐热短链脱氢酶在制备光学活性手性醇中的应用，其特征在于所述的应用为：在pH值为6.0~8.0的缓冲溶液中，以前手性羰基化合物为底物，以重组耐热短链脱氢酶为酶源，加入葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和辅酶NADP⁺或辅酶NAD⁺构成反应体系进行生物转化反应，反应完全后，将反应液后处理获得所述光学活性手性醇；所述前手性羰基化合物为α-酮酯或脂肪酮。

8.如权利要求7所述重组耐热短链脱氢酶基因编码的重组耐热短链脱氢酶在制备光学活性手性醇中的应用，其特征在于所述重组耐热短链脱氢酶是以含重组耐热短链脱氢酶的重组基因工程菌发酵培养获得的菌体细胞或菌体细胞破碎后的上清液作为酶源。

9.如权利要求8所述重组耐热短链脱氢酶基因编码的重组耐热短链脱氢酶在制备光学活性手性醇中的应用，其特征在于所述的应用为：将含重组耐热短链脱氢酶的重组基因工程菌发酵培养获得的菌体细胞或将菌体细胞经细胞破碎后的上清液冻干获得的酶粉作为酶源悬浮于pH值6.0~8.0的缓冲溶液中，分别加入底物、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和辅酶NADP⁺或辅酶NAD⁺构成反应体系，在20~ 40℃下磁力搅拌5~36h，反应结束后，反应液用正己烷萃取，取上层有机相，氮气吹扫除去正己烷，获得所述光学活性手性醇；所述底物为4-甲氧基苯丙酮、环庚酮、3-甲基-2-戊酮、乙酰乙酸乙酯、环戊酮、3-庚酮、2-戊酮、苯乙酮、苄基丙酮、2-己酮、丙酰基乙酸乙酯、4-甲基-2-戊酮、苯甲酰乙酸乙酯、环已酮、丙酮酸乙酯、丁酰乙酸乙酯、2-氧代-4-苯基丁酸乙酯或苯甲酰甲酸乙酯；所述底物的初始浓度为1～ 100g/L反应体系，所述酶源的用量为1～20U/L反应体系，所述葡萄糖与底物的质量比为1~2:1，所述葡萄糖脱氢酶的用量为1～ 20U/L反应体系，所述还原型辅酶NADPH或辅酶NAD⁺的终浓度为0.1~1.0mmol/L反应体系。

10.如权利要求8~9之一所述重组耐热短链脱氢酶基因编码的重组耐热短链脱氢酶在制备光学活性手性醇中的应用，其特征在于所述的所述含重组耐热短链脱氢酶的重组基因工程菌发酵培养获得的菌体细胞按如下方法制备：将含重组耐热短链脱氢酶的重组基因工程菌接种至含50μg/ml卡那霉素的 LB培养基中培养，37℃、180r/min震荡培养12h，将培养液以体积比1:100接种至新鲜的含50μg/ml卡那霉素的 LB培养基中，37℃、180r/min震荡培养至培养液的OD₆₀₀达到 0.5~ 0.7时，向培养液中加入终浓度为 0.1~1mmol/L的IPTG，37℃、100r/min继续诱导培养 8~24小时，将诱导培养液离心，取菌体细胞，即为酶源。

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