CN103421823A

CN103421823A - 源于雷氟松氏菌的短链脱氢酶、编码基因、载体、工程菌及应用

Info

Publication number: CN103421823A
Application number: CN2013101896727A
Authority: CN
Inventors: 王普; 王能强; 黄金
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Aiji Taikang Jiaxing Biotechnology Co ltd
Priority date: 2013-05-20
Filing date: 2013-05-20
Publication date: 2013-12-04
Anticipated expiration: 2033-05-20
Also published as: CN103421823B

Abstract

本发明公开了一种来源于雷氟松氏菌的短链脱氢酶、编码基因、载体、工程菌及在制备手性醇中的应用，所述基因具有与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列90%以上同源性；以本发明构建的重组大肠杆菌BL21/pET28a(+)-SDR为酶源，可将3,5-双三氟甲基苯乙酮、对三氟甲基苯乙酮、4-羟基-2-丁酮、乙酰乙酸乙酯、4-氯乙酰乙酸乙酯和乙酰乙酸叔丁酯等底物，通过催化不对称还原反应制备得到相应的(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇、对三氟甲基苯乙醇、2-羟基-丁醇、3-羟基丁酸乙酯、4-氯-3羟基丁酸乙酯和3-羟基丁酸叔丁酯等手性化合物。

Description

源于雷氟松氏菌的短链脱氢酶、编码基因、载体、工程菌及应用

（一）技术领域

本发明涉及一种短链脱氢酶，特别涉及一种来源于雷氟松氏菌（Leifsonia xyli HS0904）菌株的短链脱氢酶基因、酶、重组表达载体、基因工程菌，及其在制备手性醇中的应用。

（二）背景技术

短链脱氢酶/还原酶广泛存在于植物、动物及微生物中。短链脱氢酶/还原酶（short-chain dehydrogenases/reductases,SDR）可催化诸如3,5-双三氟甲基苯乙酮、对三氟甲基苯乙酮、4-羟基-2-丁酮、乙酰乙酸乙酯、4-氯乙酰乙酸乙酯和乙酰乙酸叔丁酯等的不对称还原制备得到相应的(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇、对三氟甲基苯乙醇、2-羟基-丁醇、3-羟基丁酸乙酯、4-氯-3羟基丁酸乙酯和3-羟基丁酸叔丁酯等手性化合物，这些手性化合物在医药、化工等领域具有重要的作用。

目前已有不同来源的短链脱氢酶/还原酶基因分别被克隆和测序，并且实现了在不同宿主中的表达。然而野生型短链脱氢酶/还原酶活力较低，限制了其大规模的制备及应用，因此，构建表达活性高的短链脱氢酶/还原酶基因工程菌具有实际的应用意义。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种来源于雷氟松氏菌（Leifsonia xyli HS0904）菌株的短链脱氢酶、编码基因、重组表达载体、基因工程菌，及其在制备手性醇中的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明涉及一种来源于雷氟松氏菌（Leifsonia xyli HS0904）的短链脱氢酶基因，所述基因具有与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列90%以上同源性，优选所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。所述雷氟松氏菌（Leifsonia xyli HS0904）已在中国发明专利ZL201010523043.X中公开，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072；保藏编号为CCTCC M2010241，保藏日期：2010年9月21日。

该序列由如下方法获得：

利用PCR技术，在引物1（ATGGCNCARTAYGAYGTNGC，R=A/G，Y=C/T，N=A/G/C/T）、引物2（YYAYTGNGCNGTRTAKCCYCC，R=A/G，Y=C/T，K=G/T，N=A/G/C/T）的作用下，以来源于雷氟松氏菌（Leifsonia xyli HS0904）菌株的总基因组DNA为模板，克隆得到约750bp的短链脱氢酶基因片段。将该片段连接到pMD19-T载体上获得克隆载体pMD19-T-SDR，将含有目的基因的载体pMD19-T-SDR转化至大肠杆菌DH5α获得含pMD19-T-SDR的重组大肠杆菌DH5α/pMD19-T-SDR。

对重组质粒进行测序，利用软件对测序结果进行分析，结果表明该序列含有一个长为756bp的开放阅读框，该基因核苷酸序列为SEQ IDNO.1：

1 ATGGCGCAGT ACGACGTGGC CGGACGGTCC GCGATCGTGA CCGGAGGCGG

51 CTCGGGCATC GGGCGCGCCA TCGCCCTCAC CCTCGCGGCG AGCGGAGCGG

101 CCGTCCTCGT CACCGACCTG AACGAGGAAA ACGCAAATGC CGTCGTGGCG

151 GAGATCAGCG CCGCGGGCGG CACCGCGCGG GCACTCGCCG GCGATGTGAC

201 CGACCCGGCC TTCGCCGAGG CCAGCGTCGC GGCCGCGAAC GAGCTGGCCC

251 CGCTGCGCAT CGCCGTCAAC AACGCCGGCA TCGGCGGAGC GGCAGCACCG

301 GTCGGCGACT ACCCGCTCGA CTCGTGGCGC AAGGTCATCG AGGTCAACCT

351 CAACGCCGTC TTCTACGGGA TGCAGGCGCA GCTCGACGCG ATCGGCGCGA

401 ACGGCGGCGG CGCGATCGTC AACATGGCGT CCATCCTGGG CAGCGTCGGC

451 TTCGCCAACT CGTCGGCGTA CGTCACCGCG AAGCACGCGC TGCTCGGCCT

501 GACGCAGAAC GCGGCGCTGG AGTACGCCGG CAAGAACGTC CGTGTCGTCG

551 CGGTCGGCCC CGGCTTCATC CGCACCCCGC TCGTGGCGTC GAACATGGAC

601 GCGGACACCC TCGCCTTCCT CGAGGGCAAG CACGCGCTCG GCCGCCTGGG

651 CGAGCCGGAG GAGGTCGCCT CGCTGGTCGC GTTCCTCGCC TCCGACGCCG

701 CCAGCTTCAT CACCGGCAGC TACCACCTGG TCGACGGAGG CTACACAGCA

751 CAATAG

任何对SEQ ID NO.1所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入处理获得的核苷酸序列，只要其与该核苷酸具有90%以上的同源性，均属于本发明的保护范围。

本发明还涉及一种由所述短链脱氢酶基因编码的短链脱氢酶，所述短链脱氢酶具有与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列95%以上同源性，优选所述短链脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

利用软件对该基因序列（SEQ ID NO.1所示核苷酸）进行分析，并推知其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示：

1 MAQYDVAGRS AIVTGGGSGI GRAIALTLAA SGAAVLVTDL NEENANAVVA

51 EISAAGGTAR ALAGDVTDPA FAEASVAAAN ELAPLRIAVN NAGIGGAAAP

101 VGDYPLDSWR KVIEVNLNAV FYGMQAQLDA IGANGGGAIV NMASILGSVG

151 FANSSAYVTA KHALLGLTQN AALEYAGKNV RVVAVGPGFI RTPLVASNMD

201 ADTLAFLEGK HALGRLGEPE EVASLVAFLA SDAASFITGS YHLVDGGYTA

251 Q

任何对SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中氨基酸进行缺失、插入或替换的处理获得的多肽片段或其变体，只要其与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有95%以上同源性，均属于本发明的保护范围。

本发明还涉及一种含有所述短链脱氢酶基因的重组载体及一种由所述重组载体构建的重组基因工程菌。

根据测序结果设计表达引物3（

CCATGGCGCAGTACGACGTGG，下划线部分为Nco I酶切位点，斜体部分为保护碱基）和引物4（

AAGCTTCTATTGTGCTGTGTAGCCTC，下划线部分为Hind III酶切位点，斜体部分为保护碱基），以重组质粒pMD19-T-SDR为模板，通过PCR扩增得到了用于表达的短链脱氢酶基因。本发明将短链脱氢酶基因同表达载体pET28a(+)连接，构建了含有短链脱氢酶基因的表达重组质粒pET28a(+)-SDR。将表达质粒pET28a(+)-SDR转化至大肠杆菌BL21 菌株中，获得含有表达重组质粒pET28a(+)-SDR的重组大肠杆菌BL21/pET28a(+)-SDR，即所述重组基因工程菌。

本发明还涉及一种所述短链脱氢酶基因在构建短链脱氢酶中的应用，所述应用为：构建含有所述短链脱氢酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，对获得的重组基因工程菌进行诱导培养，从培养液中分离得到含有重组短链脱氢酶的菌体细胞。

本发明还提供一种所述短链脱氢酶在制备手性醇中的应用，所述的应用为：以含短链脱氢酶基因的重组工程菌经发酵培养获得的菌体细胞或是菌体细胞再经超声破碎、分离纯化后获得的酶液作为酶源，分别加入pH值为6.0～9.0的缓冲溶液、底物和/或异丙醇和/或辅酶NADH构成不对称还原反应体系，在20～37℃、100～300rpm条件下振荡反应1～4h，反应结束后，反应液用含十二烷的正己烷（优选每5mL正己烷含有10μL十二烷）萃取，离心，取上层有机相，获得含所述手性醇的粗品（所述粗品的分离纯化方法为：反应液用正己烷萃取，取正己烷层液体，经旋转蒸发器蒸馏浓缩5倍，然后加入少量的硅胶混匀后，转移至含有硅胶的层析柱中，表面再添加少量的硅胶，然后以石油醚︰乙酸乙酯=8︰1（v/v）为洗脱剂进行洗脱分离，收集合并含有产物的洗脱液，将含有产物的洗脱液经旋转蒸发器蒸干，即得所述的手性醇纯品）；所述底物为3,5-双三氟甲基苯乙酮、对三氟甲基苯乙酮、4-羟基-2-丁酮、乙酰乙酸乙酯、4-氯乙酰乙酸乙酯或乙酰乙酸叔丁酯；所述底物的初始浓度为0.5～300g/L（优选12.5g/L）反应体系，所述酶源的用量以湿菌体质量计为20～300g/L（优选20g/L）反应体系，所述酶源以酶液形式加入时，酶源的用量以酶液体积计为0.1～0.2mL/2mL反应体系，酶液比活力为3.58U/mL（即酶液中酶蛋白浓度为0.134mg/mL，酶液比活力为26.7U/mg），所述异丙醇质量终浓度为0～50%，所述辅酶NADH加入量为0～10mmol/L反应体系。

本发明所述不对称还原反应体系为下列之一：（1）含短链脱氢酶基因的重组工程菌经发酵培养获得的菌体细胞作为酶源，加入pH值为6.0～9.0的缓冲溶液、底物和异丙醇，构成反应体系；（2）将含短链脱氢酶基因的重组工程菌经发酵培养获得的菌体细胞再经超声破碎、分离纯化后获得的酶液作为酶源，加入pH值为6.0～9.0的缓冲溶液、底物和辅酶NADH，构成反应体系。

进一步，所述酶源按如下方法之一制备：（1）湿菌体的制备：将含短链脱氢酶基因的重组工程菌接种至含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中培养，20～37℃、100～200rpm振荡培养6～12h，将培养液以体积比1:100接种至新鲜的含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃、200rpm振荡培养至培养液的OD₆₀₀达到0.6～0.9时，向培养液中加入终浓度为0.1～1.5mmol/L的IPTG，20～37℃、200rpm继续诱导培养6～12h，将所得培养液离心，收集湿菌体，即为酶源；（2）酶液的制备：将含短链脱氢酶基因的重组工程菌经发酵培养获得的湿菌体加入50mM、pH7.5的Tris-HCl缓冲液中进行超声波破碎，得到粗酶液，超声处理条件为：超声处理2s后，间歇5s，反复处理共30min；将粗酶液先经DEAE-Sepharose离子交换层析，以pH7.5、含0～1M NaCl的Tris-HCl缓冲液（由50mM的Tris-HCl缓冲液添加NaCl配制）为洗脱剂进行梯度洗脱，收集含有酶活的洗脱液a，将洗脱液a进行Octyl-Sepharose疏水层析，用pH7.5含0.5～0M硫酸铵的Tris-HCl缓冲液（由50mM的Tris-HCl缓冲液添加硫酸铵配制）进行梯度洗脱，收集含有酶活的洗脱液b，将洗脱液b进行High Q离子交换层析，用pH7.5、含0～0.5M NaCl的Tris-HCl缓冲液（由50mM的Tris-HCl缓冲液添加NaCl配制）进行梯度洗脱，收集含有酶活的洗脱液c，将洗脱液c进行Superdex200凝胶过滤层析，用50mM、pH7.5的Tris-HCl缓冲液洗脱，收集含有酶活的洗脱液d，得到所述酶液，即酶源；所述DEAE-Sepharose离子交换层析的条件为：用50mM，pH7.5的Tris-HCl缓冲液平衡柱子（1.6cm×20cm,GE Healthcare Life Science,Piscataway,NJ,USA）后上样，再经50mM，pH7.5的Tris-HCl缓冲液平衡后，用含0～1M NaCl的Tris-HCl（50mM，pH7.5）缓冲液进行梯度洗脱（流速1ml/min，时间为120min），收集含有酶活的洗脱液；所述Octyl-Sepharose疏水层析的条件为：用含0.5M硫酸铵的Tris-HCl（50mM，pH7.5）缓冲液平衡柱子（1.6cm×20cm,GE Healthcare Life Science,Piscataway,NJ,USA）后上样，再经含0.5M硫酸铵的Tris-HCl（50mM，pH7.5）缓冲液平衡后，用含0.5～0M硫酸铵的Tris-HCl（50mM，pH7.5）缓冲液进行梯度洗脱（流速1ml/min，时间为120min），收集含有酶活的洗脱液；所述High Q离子交换层析的条件为：用50mM，pH7.5的Tris-HCl缓冲液平衡柱子（1.6cm×20cm,Bio-RAD）后上样，再经50mM，pH7.5的Tris-HCl缓冲液平衡后，用含0～0.5M NaCl的Tris-HCl（50mM，pH7.5）缓冲液进行梯度洗脱（流速1ml/min，时间为120min），收集含有酶活的洗脱液；Superdex200凝胶过滤层析的条件为：用50mM，pH7.5的Tris-HCl缓冲液平衡柱子（1.6cm×60cm,GE Healthcare Life Science,Piscataway,NJ,USA）后上样，再用该缓冲液洗脱（流速0.5ml/min），收集含有酶活的洗脱液。

本发明所述洗脱液a、洗脱液b、洗脱液c和洗脱液d均为洗脱液，为便于区分不同步骤获得的洗脱液不同而命名，字母本身没有含义。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：

本发明提供了一种来源于雷氟松氏菌（Leifsonia xyli HS0904）短链脱氢酶基因的核苷酸序列，并将该基因与表达载体连接，构建得到含该基因的表达重组质粒pET28a(+)-SDR，转化至大肠杆菌BL21中，获得含有表达重组质粒pET28a(+)-SDR的重组大肠杆菌BL21/pET28a(+)-SDR；可应用本发明构建的重组大肠杆菌BL21/pET28a(+)-SDR为酶源进行生物催化反应，可将3,5-双三氟甲基苯乙酮、对三氟甲基苯乙酮、4-羟基-2-丁酮、乙酰乙酸乙酯、4-氯乙酰乙酸乙酯或乙酰乙酸叔丁酯等底物，通过不对称还原反应制备得到相应的(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇、对三氟甲基苯乙醇、2-羟基-丁醇、3-羟基丁酸乙酯、4-氯-3羟基丁酸乙酯或3-羟基丁酸叔丁酯等手性化合物，其酶比活（1.49U/g）是以雷氟松氏菌（Leifsonia xyli HS0904）(0.117U/g)为酶源细胞时的12.7倍。

（四）附图说明

图1为克隆载体pMD19-T-SDR图谱。

图2为pET28a(+)-SDR重组质粒图谱。

图3为短链脱氢酶基因PCR扩增agarose电泳图。

图4为含有表达重组质粒pET28a(+)-SDR的重组大肠杆菌BL21/pET28a(+)-SDR的菌落PCR扩增agarose电泳图。

图5为3,5-双三氟甲基苯乙酮标准品和内标物（十二烷）的气相色谱图。

图6为3,5-双三氟甲基苯乙醇标准品和内标物（十二烷）的气相色谱图。

图7为实施例3中上层有机相的气相色谱图。

图8为对三氟甲基苯乙酮标准品和内标物（十二烷）的气相色谱图。

图9为制备对三氟甲基苯乙醇获得的上层有机相的气相色谱图。

图10为制备3-羟基丁酸乙酯获得的上层有机相的气相色谱图。

图11为制备4-氯-3-羟基丁酸乙酯获得的上层有机相的气相色谱图。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：来源于雷氟松氏菌的短链脱氢酶、编码基因

用核酸提取试剂盒（Axygen Co.）提取雷氟松氏菌（Leifsonia xyli HS0904）菌株的总基因组DNA，（该菌株已在中国发明专利ZL201010523043.X中作为新菌株予以保护，并保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC M2010241，保藏日期：2010年9月21日），以该基因组DNA为模板，在引物1（ATGGCNCARTAYGAYGTNGC）、引物2（YYAYTGNGCNGTRTAKCCYCC）的作用下进行PCR扩增。

PCR反应体系各组分加入量（总体积50μL）：Pfu DNA Polymerase mix25μL，克隆引物1、引物2各3μL（100μM），基因组DNA1μL，无核酸水18μL。采用Biorad PCR仪扩增，PCR反应条件为：预变性95℃5min，然后进行温度循环95℃30s，55℃30s，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min，终止反应温度为4℃。取10μL用1%琼脂糖凝胶电泳检测。切胶回收该片段并纯化，利用Taq DNA聚合酶向片段5’端引入碱基A。将回收并纯化的片段与pMD19-T载体进行连接，得到克隆重组质粒pMD19-T-SDR，见图1。将该重组质粒电转化至大肠杆菌DH5a中，利用蓝白斑筛选系统进行筛选，随机挑取白色克隆，经菌落PCR检测，获得阳性克隆后测序，利用软件分析结果。结果表明：利用引物1、引物2扩增得到的片段含有一个开放阅读框，长度为756bp，核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

实施例2：载体及重组基因工程菌

根据实施例1分析结果设计表达引物3和引物4，并分别在引物3和4中引入了Nco I和Hind III限制性酶切位点。在引物3（

CCATGGCGCAGTACGACGTGG，下划线部分为Nco I酶切位点，斜体部分为保护碱基）和引物4 （ AAGCTTCTATTGTGCTGTGTAGCCTC，下划线部分为Hind III酶切位点，斜体部分为保护碱基）的引发下，利用高保真Pyrobest DNA聚合酶进行扩增，获得长为756bp的短链脱氢酶基因片段（SEQ ID NO.1），测序后利用Nco I和Hind III限制性内切酶对扩增片段进行处理，并利用T4DNA连接酶将该片段同用相同的限制性内切酶处理的表达载体pET28a(+)进行连接，构建表达载体pET28a(+)-SDR，pET28a(+)-SDR重组质粒图谱见图2所示。将构建的表达载体pET28a(+)-SDR电转化至大肠杆菌BL21中，涂平板37℃下培养过夜，随机挑取克隆进行菌落PCR扩增鉴定，并测序。利用软件分析结果。结果表明：利用引物3、引物4扩增得到与SEQ ID NO.1相同的基因片段，即该阳性的菌体为重组菌BL21/pET28a(+)-SDR。

实施例3：

将经实施例2验证后的含有表达重组质粒pET28a(+)-SDR的重组大肠杆菌BL21/pET28a(+)-SDR，用含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基在37℃、200rpm振荡培养12h，再以体积浓度1%接种量接种到新鲜的含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养至菌体浓度OD₆₀₀为0.6～0.9左右，再向培养液中加入终浓度为0.1mM的异丙基-B-D-硫代半乳糖苷（IPTG），置于30℃、200rpm下诱导培养10h，4℃、10000rpm离心10min，收集菌体，用生理盐水洗涤菌体两次，收集湿菌体（即重组菌全细胞）。

以湿菌体为转化用酶源，以3,5-双三氟甲基苯乙酮为底物进行转化反应，制备得到(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇。转化体系（5mL）及转化操作条件如下：在50mL转化瓶中加入0.1g湿菌体、0.5mL异丙醇和终浓度为50mmol/L（12.5g/L）的底物，4.5mL0.2M磷酸缓冲液（pH7.2），30℃下，200rpm转化1h，用5mL含有10μL十二烷的正己烷萃取，离心后收集上层有机相，即获得含有(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的粗品。采用气相色谱法测得(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的光学纯度大于99.9%，酶活力为1.49U/g湿菌体。

气相色谱法测定酶活力和光学纯度的条件为：日本岛津GC-2014气相色谱仪，色谱柱为Varian CP-Chirasil-Dex手性毛细管气相色谱柱（25m×0.25mm×0.25μm,DF=0.25）。载气为氮气，流量为2mL/min；进样量1μL，分流比为1:15；检测器和进样口温度均为250℃；色谱柱温度80～180℃；升温速度：4℃/min；检测器为FID。

3,5-双三氟甲基苯乙酮标准品和内标物（十二烷）的气相色谱图见图5，3,5-双三氟甲基苯乙醇标准品和内标物（十二烷）的气相色谱图图6。构建基因工程菌的短链脱氢酶生物还原反应萃取液（上层有机相）气相色谱图见图7。

酶活力定义为：30℃，每分钟催化形成1μmol产物为1个活力单位（U）。

实施例4～9：诱导温度对酶活力的影响

将经实施例2验证后的含有表达重组质粒pET28a(+)-SDR的重组大肠杆菌BL21/pET28a(+)-SDR用含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基在37℃、200rpm振荡培养12h，再以体积浓度1%接种量接种到新鲜的含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养至菌体浓度OD₆₀₀约为0.6～0.9左右，再向培养液加入终浓度为0.1mM的异丙基-B-D-硫代半乳糖苷（IPTG），分别置于20℃、25℃、28℃、30℃、33℃、37℃、200rpm下诱导培养10h，4℃、10000rpm离心10min，收集菌体，用生理盐水洗涤菌体两次，收集湿菌体，即重组菌全细胞。

以湿菌体为转化用酶源，以3,5-双三氟甲基苯乙酮为底物，进行转化制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇。转化体系（5mL）及转化操作条件如下：在50mL转化瓶中加入0.1g湿菌体、0.5mL异丙醇和终浓度为50mmol/L（12.5g/L）的底物，4.5mL0.2M磷酸缓冲液（pH7.2），30℃、200rpm条件下转化1h，用5mL含有10μL十二烷的正己烷萃取，离心后收集上层有机相，即获得含(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的粗品。采用气相色谱法测定(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的光学纯度（大于99.9%）和酶活力（表1）。

表1诱导温度对酶活力的影响

Figure 2013101896727100002DEST_PATH_IMAGE001

实施例10～16：诱导剂（IPTG）浓度对酶活力的影响

将经实施例2验证后的含有表达重组质粒pET28a(+)-SDR的重组大肠杆菌BL21/pET28a(+)-SDR用含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基在37℃、200rpm振荡培养12h，再以体积浓度1%接种量接种到新鲜的含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养至菌体浓度OD₆₀₀约为0.6～0.9左右，再加入终浓度为0mM、0.1mM、0.2mM、0.5mM、0.8mM、1.0mM、1.5mM的异丙基-B-D-硫代半乳糖苷（IPTG），于33℃、200rpm诱导培养10h，4℃、10000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤菌体两次，收集重组菌细胞。

以该重组菌细胞为转化用酶源，以3,5-双三氟甲基苯乙酮为底物，进行转化制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇。转化体系（5mL）及转化操作条件如下：在50mL转化瓶中加入0.1g湿菌体、0.5mL异丙醇和终浓度为50mmol/L（12.5g/L）的底物，4.5mL0.2M磷酸缓冲液（pH7.2），30℃、200rpm条件下转化1h，用5mL含有10μL十二烷的正己烷萃取，离心后收集上层有机相，即含(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的粗品，采用气相色谱法测定(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的光学纯度（大于99.9%）和酶活力（表2）。

表2诱导剂（IPTG）浓度对酶活力的影响

实施例17～20：诱导时间对酶活力的影响

将经实施例2验证后的含有表达重组质粒pET28a(+)-SDR的重组大肠杆菌BL21/pET28a(+)-SDR用含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基在37℃、200rpm振荡培养12h，再以体积浓度1%接种量接种到新鲜的含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养至菌体浓度OD₆₀₀约为0.6～0.9左右，再加入终浓度为0.5mM的异丙基-B-D-硫代半乳糖苷（IPTG），于33℃、200rpm条件下分别诱导培养6h、8h、10h和12h，4℃、10000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤菌体两次，收集湿菌体。

以湿菌体为转化用酶源，以3,5-双三氟甲基苯乙酮为底物，进行转化制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇。转化体系（5mL）及转化操作条件如下：在50mL转化瓶中加入0.1g湿菌体、0.5mL异丙醇和终浓度为50mmol/L（12.5g/L）的底物，4.5mL0.2M磷酸缓冲液（pH7.2），30℃、200rpm条件下转化1h，用5mL含有10μL十二烷的正己烷萃取，离心后收集上层有机相，即含(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的粗品，采用气相色谱法测定(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的光学纯度（大于99.9%）和酶活力（表3）。

表3诱导时间对酶活力的影响

实施例21～29：

以实施例18获得的含有表达重组质粒pET28a(+)-SDR的重组大肠杆菌BL21/pET28a(+)-SDR湿菌体作为转化用酶源，以3,5-双三氟甲基苯乙酮为底物，进行转化制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇。转化体系（5mL）及转化操作条件如下：在50mL转化瓶中加入0.25g湿菌体、终浓度为50mmol/L（12.5g/L）的底物，分别添加体积终浓度0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%和40%的异丙醇，再添加相应体积的0.2M磷酸缓冲液（pH7.2）使得反应体系为5mL，30℃、200rpm条件下转化3h，以考察辅助底物异丙醇的添加对产率的影响。反应结束后用5mL含有10μL十二烷的正己烷萃取，离心后收集上层有机相，即含(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的粗品，采用气相色谱法测定(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的光学纯度（大于99.9%）和产率（表4）。

产物的产率由下述公式计算获得：

式中C₀、C_产物分别为反应起始时底物的摩尔浓度和反应结束时产物的摩尔浓度。

表4异丙醇浓度对产率的影响

由上述实验结果可知，将本发明短链脱氢酶基因转化大肠杆菌得到的重组大肠杆菌具有较强的产短链脱氢酶能力，可直接以含酶菌体细胞为酶源进行生物催化反应。

实施例30～35：

（1）将实施例18获得含有表达重组质粒pET28a(+)-SDR的重组大肠杆菌BL21/pET28a(+)-SDR湿菌体4g，加入50mM，pH7.5的Tris-HCl缓冲液后进行超声波破碎（超声处理2s，间歇5s，反复处理共30min）得到粗酶液。将粗酶液按如下步骤进行分离纯化：（1）粗酶液用DEAE-Sepharose（1.6cm×20cm,GE Healthcare Life Science,Piscataway,NJ,USA）离子交换层析分离，条件为：用50mM，pH7.5的Tris-HCl缓冲液平衡柱子后上样，再经50mM，pH7.5的Tris-HCl缓冲液平衡后，用含0～1M NaCl的Tris-HCl（50mM，pH7.5）缓冲液进行梯度洗脱（流速1ml/min，时间为120min），收集含有酶活的洗脱液a；（2）经DEAE-Sepharose离子交换层析分离获得的酶液（即洗脱液a）用Octyl-Sepharose（1.6cm×20cm,GE Healthcare Life Science,Piscataway,NJ,USA）疏水层析进一步分离，条件为：用含有0.5M硫酸铵的Tris-HCl（50mM，pH7.5）缓冲液平衡柱子后上样，再经含0.5M硫酸铵的Tris-HCl（50mM，pH7.5）缓冲液平衡后，用含0.5～0M硫酸铵的Tris-HCl（50mM，pH7.5）缓冲液进行梯度洗脱（流速1ml/min，时间为120min），收集含有酶活的洗脱液b；（3）经Octyl-Sepharose疏水层析分离获得的酶液（即洗脱液b）进一步用High Q（1.6cm×20cm,Bio-RAD）离子交换层析分离，条件为：用50mM，pH7.5的Tris-HCl缓冲液平衡柱子后上样，再经50mM，pH7.5的Tris-HCl缓冲液平衡后，用含0～0.5M NaCl的Tris-HCl（50mM，pH7.5）缓冲液进行梯度洗脱（流速1ml/min，时间为120min），收集含有酶活的洗脱液c；（4）经High Q离子交换层析分离获得的酶液（即洗脱液c），经Superdex200（1.6cm×60cm，GE Healthcare Life Science,Piscataway,NJ,USA）凝胶过滤层析进一步分离纯化，条件为：用50mM，pH7.5的Tris-HCl缓冲液平衡柱子后上样，再用该缓冲液洗脱（流速0.5ml/min），收集含有酶活的洗脱液d（8mL）。

经过以上4个步骤的分离、纯化，所得酶液（即洗脱液d）经SDS-PAGE检测呈现单一条带，纯度可达95％以上。

（2）以步骤（1）获得的电泳纯的酶液（即洗脱液d，酶活力为3.58U/mL（酶活定义为每分钟消耗1μmol的NADH为一个酶活力单位（U））为催化剂，分别以3,5-双三氟甲基苯乙酮（实施例35），对三氟甲基苯乙酮（实施例30）、4-羟基-2-丁酮（实施例31）、乙酰乙酸乙酯（实施例32）、4-氯乙酰乙酸乙酯（实施例33）和乙酰乙酸叔丁酯（实施例34）为底物进行生物催化反应制备相应的(R)-型3,5-双三氟甲基苯乙醇、对三氟甲基苯乙醇、2-羟基-丁醇、3-羟基丁酸乙酯、4-氯-3-羟基丁酸乙酯和3-羟基丁酸叔丁酯。由酶液、底物、pH7.2的磷酸缓冲液和辅酶NADH构成反应体系，反应体系中酶液的终浓度为200μl/2ml反应体系，底物终浓度10mM，辅酶NADH的终浓度10mM，分别在30℃振荡反应4h，反应结束后，反应液用2mL含有4μL内标物十二烷的正己烷萃取，离心，取上层有机相，获得含所述手性醇的粗品，采用气相色谱法测得相应醇的产率见表5。以对三氟甲基苯乙酮、乙酰乙酸乙酯或4-氯乙酰乙酸乙酯为底物制备相应的对三氟甲基苯乙醇、3-羟基丁酸乙酯或4-氯-3-羟基丁酸乙酯获得的上层有机相的气相色谱图分别见图9、图10和图11。

表5电泳纯短链脱氢酶的生物催化结果

Claims

1.一种来源于雷氟松氏菌（Leifsonia xyli HS0904）的短链脱氢酶基因，其特征在于所述基因具有与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列90%以上同源性。

2.如权利要求1所述来源于雷氟松氏菌（Leifsonia xyli HS0904）的短链脱氢酶基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

3.一种由权利要求1或2所述短链脱氢酶基因编码的短链脱氢酶。

4.如权利要求3所述短链脱氢酶具有与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列95%以上同源性。

5.如权利要求4所述短链脱氢酶，其特征在于所述短链脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

6.一种含有权利要求1所述短链脱氢酶基因的重组载体。

7.一种由权利要求6所述重组载体构建的重组基因工程菌。

8.一种权利要求1所述短链脱氢酶基因在构建短链脱氢酶中的应用，其特征在于所述应用为：构建含有所述短链脱氢酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，对获得的重组基因工程菌进行诱导培养，从培养液中分离得到含有重组短链脱氢酶的菌体细胞。

9.一种权利要求3或4所述短链脱氢酶在制备手性醇中的应用，其特征在于所述的应用为：以含短链脱氢酶基因的重组工程菌经发酵培养获得的菌体细胞或菌体细胞再经超声破碎、分离纯化后获得的酶液作为酶源，分别加入pH值为6.0～9.0的缓冲溶液、底物和/或异丙醇和/或辅酶NADH构成不对称还原反应体系，在20～37℃、100～300rpm条件下振荡反应1～4h，反应结束后，反应液用含十二烷的正己烷萃取，离心，取上层有机相，获得含所述手性醇的粗品；所述底物为3,5-双三氟甲基苯乙酮、对三氟甲基苯乙酮、4-羟基-2-丁酮、乙酰乙酸乙酯、4-氯乙酰乙酸乙酯或乙酰乙酸叔丁酯；所述底物的初始浓度为0.5～300g/L反应体系，所述酶源以菌体细胞形式加入时，酶源的用量以湿菌体质量计为20～300g/L反应体系，所述酶源以酶液形式加入时，酶源的用量以酶液体积计为0.1～0.2mL/2mL反应体系，酶液比活力为3.58U/mL，所述异丙醇质量终浓度为0～50%，所述辅酶NADH加入量为0～10mmol/L反应体系。

10.如权利要求9所述雷氟松氏菌短链脱氢酶在制备手性醇中的应用，其特征在于所述酶源按如下方法之一制备：（1）湿菌体：将含短链脱氢酶基因的重组工程菌接种至含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中培养，20～37℃、100～200rpm振荡培养6～12h，将培养液以体积比1:100接种至新鲜的含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃、200rpm振荡培养至培养液的OD₆₀₀达到0.6～0.9时，向培养液中加入终浓度为0.1～1.5mmol/L的IPTG，20～37℃、200rpm继续诱导培养6～12h，将所得培养液离心，收集湿菌体，即为酶源；（2）酶液：将含短链脱氢酶基因的重组工程菌经发酵培养获得的湿菌体加入50mM、pH7.5的Tris-HCl缓冲液中进行超声波破碎，得到粗酶液，超声处理条件为：超声处理2s后，间歇5s，反复处理共30min；将粗酶液先经DEAE-Sepharose离子交换层析，以pH7.5、含0～1M NaCl的Tris-HCl缓冲液为洗脱剂进行梯度洗脱，收集含有酶活的洗脱液a，将洗脱液a进行Octyl-Sepharose疏水层析，用pH7.5、含0.5～0M硫酸铵的Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，收集含有酶活的洗脱液b，将洗脱液b进行High Q离子交换层析，用pH7.5、含0～0.5M NaCl的Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，收集含有酶活的洗脱液c，将洗脱液c进行Superdex 200凝胶过滤层析，用50mM、pH7.5的Tris-HCl缓冲液洗脱，收集含有酶活的洗脱液d，得到所述酶液，即酶源。