CN102827853B

CN102827853B - 一种卤醇脱卤酶基因突变体及其应用

Info

Publication number: CN102827853B
Application number: CN2012103274184A
Authority: CN
Inventors: 陈峻青; 蔡进; 吉民; 尹晓龙; 漆志文; 石利平; 徐春涛
Original assignee: JIANGSU ALPHA PHARMACEUTICAL CO Ltd; Southeast University
Current assignee: Jiangsu alpha Pharmaceutical Co.,Ltd.; Southeast University
Priority date: 2012-09-06
Filing date: 2012-09-06
Publication date: 2013-07-17
Anticipated expiration: 2032-09-06
Also published as: CN102827853A

Abstract

本发明公开了一种卤醇脱卤酶基因突变体及其应用。一种卤醇脱卤酶基因突变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的卤醇脱卤酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。一种卤醇脱卤酶的制备方法，包括培养本发明所述的含有卤醇脱卤酶基因突变体的基因工程菌，获得重组表达的卤醇脱卤酶。利用本发明所述的卤醇脱卤酶基因突变体构建基因工程菌，并表达制备卤醇脱卤酶，以所述的卤醇脱卤酶为催化剂催化邻卤醇化合物脱卤素反应。将制得的卤醇脱卤酶应用于（R）-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的生产，在相同的生产条件下，产品的产率也有较大提高，达到93.6%；且卤醇脱卤酶用量较少，仅为20.2kg，极大的降低了生产成本。

Description

一种卤醇脱卤酶基因突变体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种卤醇脱卤酶基因突变体及其应用。

背景技术

阿托伐他汀钙是立普妥（lipitor）的活性成分，立普妥是一种羟甲基戊二酰单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，可使体内胆固醇的合成减少，被用于治疗高胆固醇血症和混合型高脂血症，冠心病和脑中风等疾病。

阿托伐他汀钙含两个手性中心的侧链是其药效团，该侧链的合成方法包括利用金属催化剂从手性前体出发进行合成，或利用游离或固定化酶或含酶的完整细胞进行不对称合成或外消旋拆分。由于生物法具有反应条件温和、反应转化率高、对映体选择性高等多种优点，受到研究者的广泛关注。卤醇脱卤酶（HHDH）是一类可以催化邻卤醇类化合物生成环氧化物的酶，因其能够催化邻卤醇与环氧化合物之间的相互转化，可用于合成多种化学中间体，并被用于阿托伐他汀钙中间体的制备。1968年Castro首次在黄杆菌属菌株(Flavobaterium sp.)中发现了卤醇脱卤酶，此后，人们相继筛选到了多种产卤醇脱卤酶的菌株，如发射形土壤杆菌（Agrobacterium radiobacter）AD1，根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens），节杆菌（Arthrobacter sp.）AD2，棒状杆菌（Corynebacterium sp.），分枝杆菌（Mycobacterium sp.）GP1等。在已知的卤醇脱卤酶中，大部分已被克隆、测序及进行体外重组表达研究。目前对卤醇脱卤酶的研究集中于发现催化反应时间短、产物产率高、对映体选择性高且副反应少的卤醇脱卤酶。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种卤醇脱卤酶基因突变体及其编码的卤醇脱卤酶。

本发明的另一目的是提供含有该卤醇脱卤酶基因突变体的重组载体。

本发明的另一目的是提供含有该卤醇脱卤酶基因突变体的基因工程菌。

本发明的又一目的是提供该该卤醇脱卤酶基因突变体的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种卤醇脱卤酶基因突变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所述的卤醇脱卤酶基因突变体编码的卤醇脱卤酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种含有本发明所述的卤醇脱卤酶基因突变体的重组载体。所述的重组载体其可通过本领域常规方法将本发明的卤醇脱卤酶基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述的载体可为本领域常规的各种载体，优选Puc18。

含有本发明的卤醇脱卤酶基因突变体或其重组表达载体的基因工程菌。

本发明基因工程菌优选大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BL21(DE3)或大肠埃希氏菌（Escherichia coli）DH5α作为宿主细胞。将前述重组表达质粒转化至大肠埃希氏菌（Escherichia coli）中，即可得到本发明优选的基因工程菌。

本发明所述的基因工程菌进一步优选大肠杆菌DH5αHhec05（Escherichia coli DH5αHhec05），已于2012年8月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2012320。

一种卤醇脱卤酶的制备方法，包括如下步骤：培养本发明所述的含有卤醇脱卤酶基因突变体的基因工程菌，获得重组表达的卤醇脱卤酶。

所述的培养包括药摇培养或发酵培养；优选发酵培养。

所述的发酵培养优选的发酵培养基的组成为：酵母提取物20g/L，甘油10g/L，NaCl 6g/L，磷酸氢二钾4.2g/L，磷酸二氢钾8.5g/L，硫酸铵0.5g/L，硫酸亚铁1.0g/L，硫酸锌七水合物0.5g/L，氯化钙二水合物0.06g/L，硫酸锰二水合物0.2g/L，硫酸铜七水合物0.6g/L，氯化钴六水合物0.9g/L。

所述的发酵培养优选的生产罐发酵条件是：罐温37℃，搅拌转速900rpm左右，发酵过程中控制DO 30%以上，空气流量1:1.5vvm，甘油残余量1%以下。

发酵过程采用常规的两阶段控制策略：发酵前期即菌体生长阶段，控制发酵液pH 6.8左右，罐温35-37℃；发酵后期即添加IPTG之后的卤醇脱卤酶诱导表达阶段，控制发酵液pH 7.0左右，罐温为28-30℃。以使发酵前期菌体大量繁殖，发酵后期卤醇脱卤酶大量表达。

所述的卤醇脱卤酶基因突变体在邻卤醇化合物脱卤素反应中的应用，利用本发明所述的卤醇脱卤酶基因突变体构建基因工程菌，并表达制备卤醇脱卤酶，以所述的卤醇脱卤酶为催化剂催化邻卤醇化合物脱卤素反应。

所述的邻卤醇化合物脱卤素反应的底物的结构式为

其中，X为卤素；

R为烷基，苯基或带有取代基的苯基。

所述的邻卤醇化合物脱卤素反应的反应方程式为：

其中，X为卤素；

R为烷基，苯基或带有取代基的苯基。

所述的卤醇脱卤酶优选分两批加入，以缩短反应时间，降低酶用量。

有益效果：

本发明以NCBI登录号为AF397296的卤醇脱卤酶基因为模板，通过对其进行突变，从而获得该卤醇脱卤酶基因突变体，其基因序列为SEQ ID NO.1。本发明以此为基础，构建了含有该卤醇脱卤酶基因突变体的工程菌，通过培养该基因工程菌制备卤醇脱卤酶，利用优化的发酵条件，极大的提高了所制备的卤醇脱卤酶的产量和催化活性（酶活989U）。将制得的卤醇脱卤酶应用于（R）-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的生产，在相同的生产条件下，产品的产率也有较大提高，达到93.6%（专利CN 102168117报道为86.29%）；且卤醇脱卤酶用量较少，仅为20.2kg（专利CN 102168117报道为64kg），极大的降低了生产成本。

生物样品保藏信息

大肠杆菌DH5αHhec05（Escherichia coli DH5αHhec05），于2012年8月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国，武汉，武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M 2012320。

具体实施方式

实施例1基因工程菌的建立

通过NCBI查阅卤醇脱卤酶的基因（NCBI登录号为AF397296）；人工合成卤醇脱卤酶基因片段，以该基因片段为模板，PCR扩增卤醇脱卤酶的基因片段（片段两端加Hind3和EcoR1内切酶片段），其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，并利用Hind3和EcoR1内切酶位点将卤醇脱卤酶基因插入至Puc18质粒中，将连接后载体转入大肠杆菌DH5α中建立卤醇脱卤酶基因工程菌。其中，PCR反应扩增卤醇脱卤酶引物为：正向引物F1：5’-TACAGTTGGCGTTAACATTG-3’（SEQ ID NO.4），反向引物F2：5’-CCGGACCATACGGGCTCATC-3’（SEQ ID NO.5）。

实施例2卤醇脱卤酶突变体基因的获得

本研究利用易错PCR随机突变的方法，对卤醇脱卤酶进行了蛋白质工程改造。易错PCR是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件，如提高镁离子浓度、加入锰离子、改变体系中四种的dNTPs浓度或运用低保真度DNA聚合酶等，来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。

本研究采用较低的Taq聚合酶在特定措施下很容易向扩增产物中掺入随机突变的原理，同时利用Mn²⁺替代天然辅助因子Mg²⁺增加易错概率。

100μL PCR体系如下:10×PCR Buffer 10μL，dATP(100mmol/L)0.2μL，dGTP(100mmol/L)0.2μL，dCTP(100mmol/L)1μL，dTTP(100mmol/L)1μL，MgCl₂(5mmol/L)20μL，MnCl₂(0.2mmol/L)1μL，F1Primer(10μmol/L)1μL，F2Primer(10μmol/L)1μL，大量抽提Puc18-Hhec质粒DNA 1μL，Taq DNA Polymerase 2U，再加入灭菌超纯水到100μL。

PCR反应条件为：95℃预变性10min；94℃变性45s，55℃变性45s及72℃变性90s进行30个循环；于72℃下继续延伸10min，冷却至4℃。

实验流程：

按照实施例1的方法PCR扩增卤醇脱卤酶基因并利用Hind3和EcoR1内切酶位点将基因插入至Puc18质粒中得到Puc18-Hhec质粒，作为基因突变模板；

易错PCR扩增卤醇脱卤酶的基因，扩增后基因片段链接至Puc18-T载体，将连接后载体转入之大肠杆菌DH5α中建立扩展卤醇脱卤酶基因突变文库；

利用大肠杆菌DH5α为宿主，Puc18质粒为载体，表达卤醇脱卤酶，通过测定醇脱卤酶活性（方法见实施例3），高通量筛选高活性突变株；

突变后高活性卤醇脱卤酶基因进行鉴定。筛选出的高活性卤醇脱卤酶突变体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

卤醇脱卤酶引物为：正向引物F1：5’-TACAGTTGGCGTTAACATTG-3’（SEQ ID NO.4）

反向引物F2：5’-CCGGACCATACGGGCTCATC-3’（SEQ ID NO.5）

按实施例1所述方法构建表达该卤醇脱卤酶突变体的基因工程菌，并将其命名为E.coliDH5αHhec 05，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2012320。

实施例3卤醇脱卤酶的制备及酶活测定

将实施例1或实施例2所得的重组大肠杆菌接种至含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基（蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，Nacl 10g/L，pH7.0）中，于37℃，200rpm的摇床中振荡培养12小时以上。转接2mL菌体培养液于50mL含50μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中，置于同样条件下振荡培养，定时测量菌液在600nm下的吸光值以监测菌体生长密度。当菌液的OD600值在0.8-1.0时，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.8mmol/L，将培养液置于37℃，200rpm的摇床中诱导表达10h。此后通过离心收集菌体，经细胞破碎、离心、浓缩、冷冻干燥等处理得到卤醇脱卤酶或卤醇脱卤酶突变体的粉末。

卤醇脱卤酶酶活力的测定方法为：30℃恒温条件下，在含有5mmol/L(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯（2-溴乙醇）的50mM Tris/SO₄缓冲液（pH8.0）中，每分钟降解底物生产1μmol溴离子的酶量定义为一个单位（U）。

据此测定野生型卤醇脱卤酶的酶活为109U，筛选出的卤醇脱卤酶突变体的酶活为386U。

实施例4重组卤醇脱卤酶的发酵生产

发酵培养基成分为：酵母提取物20g/L，甘油10g/L，NaCl 6g/L，磷酸氢二钾4.2g/L，磷酸二氢钾8.5g/L，硫酸铵0.5g/L，硫酸亚铁1.0g/L，硫酸锌七水合物0.5g/L，氯化钙二水合物0.06g/L，硫酸锰二水合物0.2g/L，硫酸铜七水合物0.6g/L，氯化钴六水合物0.9g/L。发酵液pH 6.8-7.0，罐温35-37℃，搅拌转速900rpm左右，发酵过程中控制DO 30%以上，空气流量1:1.5vvm，甘油残余量1%以下。接入OD600为1.2的保藏号为CCTCC NO：M 2012320的基因工程菌E.coli DH5αHhec 06种子液，接入量为发酵液体积的6%，发酵前期即菌体生长阶段，控制发酵液pH 6.8左右，罐温28-30℃，当发酵液OD600达50时加入IPTG至终浓度1mmol/L以诱导卤醇脱卤酶的表达，此后继续发酵15小时,控制发酵液pH 7.0左右，罐温为28-30℃。发酵过程中用氨水调节pH值。当发酵液中甘油含量低于5g/L时，为维持培养物的生长，补加如下组成的物料：甘油200g/L，硫酸亚铁100mg/L，硫酸锌七水合物50mg/L，氯化钙二水合物10mg/L，硫酸锰二水合物20mg/L，硫酸铜七水合物50mg/L，氯化钴六水合物80mg/L，pH 7.0。发酵结束后将培养物冷却至4℃保存。

将保存的发酵液经5000G离心50min、细胞破碎、冷冻干燥等常规处理，制备得到卤醇脱卤酶冻干粉并于-80℃保存。测定生产得到的卤醇脱卤酶突变体的酶活为989U/mL。

实施例5重组卤醇脱卤酶催化制备（R）-4-氰基-3-羟基丁酸叔乙酯

在5000L反应釜中，釜内加入含有回收的HCN和氰化钠混合的水溶液（氰基含量1.95kmol），并用硫酸调节溶液的pH值至7.0-7.5，期间始终控制温度在30℃以下。之后向釜内投加实施例4方法制备的卤醇脱卤酶（1×10⁷U）10.1kg，再加入400kg底物（S）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯（99%，2.4kmol）。反应过程中，通过补加氰化钠使反应液一直维持pH6.8-7.5，并缓慢升温至40℃，且始终维持该反应温度。反应过程中通过气相色谱法监测反应进程，当底物含量降至50%以下时，再补加卤醇脱卤酶（1×10⁷U）10.1kg，至底物含量降至1%以下时终止反应。反应终止后经脱色、5000G离心50min、萃取等操作，得到产物（R）-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯（沸点270℃），收率93.6%，ee 99.5%。

底物及产物的具体分析条件为：色谱柱为0.3mm毛细管柱30m(DIKMA)，FID检测器。色谱柱温度208℃，气化和检测温度均为230℃，载气流量20-30ml/min，进样量0.3-0.5μL，载气为N₂。

Claims

1.一种卤醇脱卤酶基因突变体，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的卤醇脱卤酶基因突变体编码的卤醇脱卤酶，其特征在于氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

3.一种含有权利要求1所述的卤醇脱卤酶基因突变体的重组载体。

4.含有权利要求1所述的卤醇脱卤酶基因突变体或权利要求3所述的重组载体的基因工程菌。

5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于宿主细胞为大肠埃希氏菌。

6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于所述的基因工程菌命名为大肠杆菌DH5αHhec05，已于2012年8月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2012320。

7.一种卤醇脱卤酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：培养权利要求4～6中任一项所述的基因工程菌，获得重组表达的卤醇脱卤酶。

8.根据权利要求7所述的卤醇脱卤酶的制备方法，其特征在于所述的培养为发酵培养；发酵培养基的组成为：酵母提取物20g/L，甘油10g/L，NaCl 6g/L，磷酸氢二钾4.2g/L，磷酸二氢钾8.5g/L，硫酸铵0.5g/L，硫酸亚铁1.0g/L，硫酸锌七水合物0.5g/L，氯化钙二水合物0.06g/L，硫酸锰二水合物0.2g/L，硫酸铜七水合物0.6g/L，氯化钴六水合物0.9g/L；所述的发酵培养的生产罐发酵条件是：罐温37℃，搅拌转速800～1500rpm，发酵过程中控制DO 30％以上，空气流量1∶1.5vvm，甘油残余量1％以下。

9.根据权利要求8所述的卤醇脱卤酶的制备方法，其特征在于所述的发酵采用两阶段控制策略：发酵前期即菌体生长阶段，控制发酵液pH6.0-7.0，罐温35-37℃；发酵后期即添加IPTG之后的卤醇脱卤酶诱导表达阶段，控制发酵液pH6.5-7.5，罐温为28-30℃。

10.权利要求1所述的卤醇脱卤酶基因突变体在邻卤醇化合物脱卤素反应中的应用，其特征在于利用权利要求1所述的卤醇脱卤酶基因突变体构建基因工程菌，并表达制备卤醇脱卤酶，以所述的卤醇脱卤酶为催化剂催化邻卤醇化合物脱卤素反应。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述的邻卤醇化合物脱卤素反应的底物的结构式为

其中，X为卤素；

R为烷基，苯基或带有取代基的苯基。