CN111394396B - 一种微生物利用甘油发酵生产1,3-丙二醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种微生物共培养体系利用甘油发酵生产1,3‑丙二醇的方法，通过成功构建重组大肠杆菌Rosseta‑dhaB1dhaB2和Rosseta‑dhaT，将上述重组大肠杆菌共培养，进行种子培养和发酵培养，其中重组大肠杆菌Rosseta‑dhaB1dhaB2实现甘油的利用生产中间代谢产物3‑羟基丙醛(3‑HPA)，重组大肠杆菌Rosseta‑dhaT催化3‑HPA生产1,3‑丙二醇，在发酵过程中，按1:1.5比例接种于发酵培养基，加入60g/L底物甘油与10g/L辅底物葡萄糖。本发明的方法，提高了甘油的转化率和1,3‑丙二醇的产量，且本发明采用酪酸梭菌含有不依赖辅酶B12的甘油脱水酶，降低了生产成本。

Description

一种微生物利用甘油发酵生产1,3-丙二醇的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种微生物利用甘油发酵生产1,3-丙二醇的方法。
背景技术
粗甘油是生产生物柴油中的主要副产物之一，每生产10kg生物柴油将会产生1kg的粗甘油，有报道预计2020年将达到58.7亿磅以上，若粗甘油不能及时有效的利用和处理，将有可能成为新的污染源。因此利用甘油生产高附加值的产品，提高甘油转化率是目前研究的热点。
1,3-丙二醇(1,3-PD)作为一种良好的溶剂、抗冻剂、保护剂，被广泛的应用于食品、医药、化妆品和化工等领域。在食品领域，1,3-丙二醇易于溶解难溶于水的食品添加剂，也可作为食品添加剂，提高食品的营养价值、耐藏性和稳定性。在医药领域，1,3-丙二醇作为中间体合成的聚酯具有安全无毒可生物降解等优点。在化工领域，1,3-丙二醇主要用于合成新型聚酯纤维，使其具有良好的回弹性、固色性等优点。
目前工业上主要采用化学法生产1,3-丙二醇，但化学合成法需要在高温、高压和昂贵的催化剂下进行，生产条件苛刻，原料依赖不可再生资源石油，副产物多导致分离纯化困难，生产成本高。相比之下，生物法生产1,3-丙二醇以其条件温和、绿色环保、选择性好等特点成为研究的重点。
微生物发酵生产1,3-丙二醇现主要采用传统单一菌种发酵，基因工程优化菌种在单一宿主中进行分子表达，往往涉及大量的生物合成基因，这些基因的过表达会过度消耗宿主细胞资源，导致单一宿主的代谢负担过重，因此单一菌种代谢发酵能力的限制是甘油高效转化1,3-丙二醇的瓶颈。此外，微生物利用甘油发酵生产1,3-丙二醇时，甘油脱水酶与1,3-丙二醇脱氢酶是发酵途径中的关键酶，目前微生物生产1,3-丙二醇使用的甘油脱水酶绝大部分为辅酶B12依赖型，辅酶B12是十分昂贵的辅酶，这为工业化生产1,3-丙二醇增加了很高的成本。因此，降低单个菌种代谢压力和减少目标生物合成途径实现1,3-丙二醇的高效生产，同时降低生产成本，是目前亟待解决的问题。
发明内容
针对单一菌种利用甘油发酵生产1,3-丙二醇转化率低、生产成本高的问题，本发明提供了一种微生物利用甘油发酵生产1,3-丙二醇的方法，即通过微生物共培养建立生物合成途径的上游和下游，分别实现甘油的利用和1,3-丙二醇的生产，减少生物合成途径和代谢压力，提高生产效率。
本发明提供了一种微生物利用甘油发酵生产1,3-丙二醇的方法，所述方法包括：
1)扩增甘油脱水酶和甘油脱水酶激活因子的基因dhaB1、dhaB2，经一步无缝克隆法克隆到表达载体pANY1中，经转化、筛选阳性克隆子获得E.coli Rosseta-dhaB1dhaB2重组菌；
2)扩增1,3-丙二醇脱氢酶基因dhaT，经一步无缝克隆法克隆到表达载体pANY1中，经转化、筛选阳性克隆子获得E.coli Rosseta-dhaT重组菌；
3)将E.coli Rosseta-dhaB1dhaB2重组菌和E.coli Rosseta-dhaT重组菌，进行种子培养和发酵培养，发酵培养时以甘油为底物。
本发明中，所述的甘油脱水酶、甘油脱水酶激活因子和1,3-丙二醇脱氢酶来源于酪酸梭菌YJH-09。
本发明中，所述的种子培养过程包括将重组大肠杆菌Rosseta-dhaB1dhaB2、Rosseta-dhaT分别接种于LB-Kan培养基中，过夜培养为一级种子液，再将重组大肠杆菌Rosseta-dhaB1dhaB2、Rosseta-dhaT的一级种子液分别接种于发酵培养基中，过夜培养为二级种子液。
本发明中，所述的发酵培养过程将Rosseta-dhaB1dhaB2与Rosseta-dhaT的二级种子液按体积比例接种于发酵培养基中，进行摇瓶发酵，接种量为1～5mL，转速50～200rpm/min，温度为30～37℃，发酵时间12～60h，pH控制在5.5～7.5，待OD值达到0.6时，加入IPTG同时加入底物甘油与辅底物葡萄糖。
本发明中，所述的底物甘油浓度为30～80g/L，更优选的浓度为60g/L。
本发明中，所述的辅底物葡萄糖浓度为0～10g/L，更优选的浓度为10g/L。
本发明中，所述Rosseta-dhaB1dhaB2与Rosseta-dhaT的二级种子液体积比例为1.5:1～1:2.5，更优选的体积比例为1:1.5。
本发明中，IPTG的终浓度为0.1～1mmol/L，更优选的终浓度为0.1mmol/L。
本发明中，所述的发酵培养基包括yeast extract 5.0g/L,Na2HPO4 6.0g/L,KH2PO4 3.0g/L,NH4Cl 2.0g/L,NaCl 0.5g/L,MgSO4·7H2O g/L。
本发明的技术方案与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1)本发明以来源于可再生资源生物柴油的副产物甘油为底物，降低了生产成本。
2)本发明首次选择酪酸梭菌YJH-09为代谢途径中关键酶的基因来源菌，现有技术中生产1,3-丙二醇时，主要采用依赖于B12的甘油脱水酶，其中辅酶B12价格昂贵，本发明选择的酪酸梭菌YJH-09含有不依赖辅酶B12的甘油脱水酶，降低了生产成本。
3)本发明首次采用模块化共培养体系，重组大肠杆菌Rosseta-dhaB1dhaB2与Rosseta-dhaT混合利用甘油生产1,3-丙二醇，代谢途径的上下游各自在一个独立的宿主菌种，相比于在单一宿主菌中构建一条完整的代谢途径，共培养体系中独立的宿主菌承担更少的生物合成途径和代谢压力，从而提高了甘油的转化率。
4)本发明选择葡萄糖为共底物，在发酵过程中，提高了1,3-丙二醇的产量和甘油的转化率。
附图说明
图1为微生物共培养体系利用甘油发酵生产1,3-丙二醇的方法的示意图；
图2为诱导后的甘油脱水酶及甘油脱水酶激活因子的SDS-PAGE电泳图；
图3为诱导后的1,3-丙二醇脱氢酶的SDS-PAGE电泳图；
图4为重组大肠杆菌Rosseta-dhaB1dhaB2与Rosseta-dhaT不同接种比例产生的1,3-丙二醇含量图；
图5为不同底物甘油浓度产生的1,3-丙二醇含量图；
图6为添加不同辅底物葡萄糖浓度与不添加葡萄糖产生的1,3-丙二醇含量对比图。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明中，若无特殊说明，所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。
实施例1
1、重组大肠杆菌Rosseta-dhaB1dhaB2的构建与表达
1)根据酪酸梭菌VPI 1718(GenBank号:AY112989)的相关甘油脱水酶(GDHt)、甘油脱水酶激活因子(GDHt active factor)的基因序列和表达载体pANY1多克隆位点的特征，利用生物信息学软件NTI设计合成引物为：上游引物F:5'-GGGGGATCCACTAGTAGGCCTATGATAAGTAAAGGATTTAG-3'和下游引物R:5'-CAGGAGCTCCCATGGAGGCCTTTAATGATGATGATGATGGTGCTCAGCTCCAATTGTGCAAG-3'，下划线部分为StuI酶切位点，波浪线部分为与pANY1质粒同源的上下游同源臂；
2)以酪酸梭菌YJH-09基因组DNA为模板，PCR扩增目的基因，PCR扩增反应参数：预变性：95℃5min，变性：94℃2min，退火：55℃30s，延伸：72℃90s，循环：30个；终止延伸：72℃10min。
3)所得的PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小约为3.3Kb的电泳条带，用普通DNA产物纯化试剂盒或琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对扩增片段进行纯化。
4)严格按照无缝克隆试剂盒说明书进行重组反应，获得重组质粒pANY1-dhaB1dhaB2，随后将该重组质粒转化42℃热击转化至E.coli Rosseta(DE3)感受态细胞中，其中E.coli Rosseta(DE3)购买自Invitrogen公司。
5)重组质粒通过PCR及测序验证，得到的甘油脱水酶和甘油脱水酶激活因子的基因序列如序列1所示，重组菌构建成功，命名为E.coli Rosseta-dhaB1dhaB2。
6)甘油脱水酶和甘油脱水酶激活因子基因的表达：Rosseta-dhaB1dhaB2基因工程菌接种于3mL LB-Kan培养基中，LB-Kan培养基的成分以及终浓度为：胰化蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，kan 50μg/L，37℃振荡培养过夜，次日以1％的接种量将种子液转接至新鲜LB-Kan培养基中，37℃培养至菌体OD为0.6时，加入IPTG至终浓度0.1mmol/L进行诱导表达10h左右,通过SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达，结果如图2所示，结果在88kDa左右有一条明显蛋白带，表明甘油脱水酶蛋白基因得到获得高效表达，在34kDa左右有一条明显蛋白带，表明甘油脱水酶激活因子得到获得高效表达。
2、重组大肠杆菌Rosseta-dhaT的构建与表达
根据酪酸梭菌VPI 1718(GenBank号:AY112989)的1,3-丙二醇脱氢酶(PDOR)的基因序列和表达载体pANY1多克隆位点的特征，利用生物信息学软件NTI设计合成引物为：上游引物F:5'-GGGGGATCCACTAGTAGGCCTATGAGAATGTATGATTATTT-3'和下游引物R:5'-CAGGAG CTCCCATGGAGGCCTTTAATAAGCAGCCTTAAAA-3'，下划线部分为StuI酶切位点，波浪线部分为与pANY1质粒同源的上下游同源臂；
2)以酪酸梭菌YJH-09基因组DNA为模板，PCR扩增目的基因，PCR扩增反应参数：预变性：95℃5min，变性：94℃2min，退火：55℃30s，延伸：72℃90s，循环：30个；终止延伸：72℃10min。
3)所得的PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小约为1.2Kb的电泳条带，用普通DNA产物纯化试剂盒或琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对扩增片段进行纯化。
4)严格按照无缝克隆试剂盒说明书进行重组反应，获得重组质粒pANY1-dhaT，随后将该重组质粒转化42℃热击转化至E.coli Rosseta(DE3)感受态细胞中，其中E.coliRosseta(DE3)购买自Invitrogen公司。
5)重组质粒通过PCR及测序验证，得到的1,3-丙二醇脱氢酶的基因序列如序列2所示，重组菌构建成功，命名为E.coli Rosseta-dhaT。
6)1,3-丙二醇脱氢酶基因的表达：Rosseta-dhaT基因工程菌接种于3mL LB-Kan培养基中，LB-Kan培养基的成分以及终浓度为：胰化蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，kan 50μg/L，37℃振荡培养过夜，次日以1％的接种量将种子液转接至新鲜LB-Kan培养基中，37℃培养至菌体OD为0.6时，加入IPTG至终浓度0.1mmol/L进行诱导表达10h左右,通过SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达，结果如图3所示，结果在46kDa左右有一条明显蛋白带，表明1,3-丙二醇脱氢酶蛋白基因得到获得高效表达。
3、重组大肠杆菌Rosseta-dhaB1dhaB2与Rosseta-dhaT共培养甘油转化体系的构建
1)将上述构建的大肠杆菌Rosseta-dhaB1dhaB2，Rosseta-dhaT接种于5mL LB-Kan培养基中，37℃过夜培养为一级种子液，再将重组大肠杆菌Rosseta-dhaB1dhaB2，Rosseta-dhaT分别接种于发酵培养基中，37℃过夜培养为二级种子液，发酵培养基包括：yeastextract 5.0g/L,Na2HPO4 6.0g/L,KH2PO4 3.0g/L,NH4Cl 2.0g/L,NaCl 0.5g/L,MgSO4·7H2O g/L。
2)将步骤1培养的Rosseta-dhaB1dhaB2与Rosseta-dhaT的二级种子液按1:1.5比例接种于大肠发酵培养基中进行摇瓶发酵，250mL摇瓶装液量为100ml，待OD值达到0.6时，加入IPTG使得终浓度为0.1mM同时再加入30g/L的底物甘油，37℃发酵24h，培养过保持厌氧条件。
3)发酵液转化后离心，用高效液相色谱检测转化液成分，通过计算，甘油转化为1,3-丙二醇的转化率为62.8％。
实施例2
甘油脱水酶酶活的测定：
1)取适量实施例1中已成功表达的Rosseta-dhaB1dhaB2菌液，4℃离心10min，收集菌泥，用0.1mol/L pH 7.4的磷酸钾缓冲液洗涤两次，离心后用适量的磷酸钾缓冲液重悬菌体，冰浴中超声破碎，10000rpm，4℃离心10min，上清即为粗酶液。
2)甘油脱水酶活力测定方法：在最适温度及最适pH条件下，按上述反应，每分钟催化生成1μmoL丙醛所需的酶量定义为一个酶活单位。采用MBTH(3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazine)法测定，GDHt能催化底物甘油(或l,2-丙二醇)生成醛类物质，醛类物质再与MBTH发生显色反应，形成踪类浅粉色的吖嗪衍生物，该化合物在305nm有最大吸值。其中，1.0mL的总体积中按终浓度混合以下成分：0.2mol/L甘油(或l,2-丙二醇)，0.05mol/L KCL，0.035mol mol/L磷酸钾缓冲液pH8.0，适量粗酶液；反应条件：37℃水浴10min，加入0.5mL的0.1％MBTH和1.0ml 0.1mol/L的柠檬酸钾(pH3.6)终至反应，37℃水浴15min后加入1.0mL水，在305nm处测定吸光值。
3)利用粗酶液测定甘油脱水酶的酶活，酶活为54U/mL，比酶活为78U/mg，约为酪酸梭菌中甘油脱水酶酶活的16倍，结果表明获得具有甘油脱水酶高酶活的基因工程菌。
实施例3
1,3-丙二醇脱氢酶酶活的测定：
1)取适量实施例1中已成功表达的Rosseta-dhaT菌液，4℃离心10min，收集菌泥，用0.1mol/L pH 7.4的磷酸钾缓冲液洗涤两次，离心后用适量的磷酸钾缓冲液重悬菌体，冰浴中超声破碎，10000rpm，4℃离心10min，上清即为粗酶液。
2)1,3-丙二醇脱氢酶还原活力测定方法：在最适温度及最适pH条件下，按上述反应，每分钟生成1μmoL 1,3-PD所需的酶量定义为一个酶活单位。1.0mL的总体积中按终浓度混合以下成分：27mmol/L丙醛，0.37mmol/L NADH，35mmol/L(NH4)2(SO4)2，100mmol/L碳酸钾缓冲液(pH9.0)，适量酶液，立即测定340nm的OD变化。
3)利用粗酶液测定1,3-丙二醇脱氢酶的酶活，酶活为72U/mL，比酶活为105U/mg，约为酪酸梭菌中1,3-丙二醇脱氢酶酶活的22倍，结果表明获得1,3-丙二醇脱氢酶高酶活的基因工程菌。
实施例4
其他条件同实施例1，在重组大肠杆菌Rosseta-dhaB1dhaB2与Rosseta-dhaT共培养时，添加的二级种子液Rosseta-dhaB1dhaB2与Rosseta-dhaT的比例为1.5:1，1:1，1:1.5,1:2和1:2.5，高效液相色谱测定在不同接种比例下1,3-丙二醇的产量，结果如图4所示，结果表明，当添加的Rosseta-dhaB1dhaB2与Rosseta-dhaT的比例为1:1.5，1,3-丙二醇的含量最高。
实施例5
其他条件同实施例1，在重组大肠杆菌Rosseta-dhaB1dhaB2与Rosseta-dhaT共培养发酵过程中的甘油浓度设置为30,40,50,60,70,80g/L，发酵液转化后离心，用高效液相色谱检测1,3-丙二醇的含量，结果如图5所示，结果表明，当甘油的浓度为60g/L时，1,3-丙二醇的含量最高。
实施例6
1)将实施例1中构建的大肠杆菌Rosseta-dhaB1dhaB2，Rosseta-dhaT接种于5mLLB-Kan培养基中，37℃过夜培养为一级种子液，再将重组大肠杆菌Rosseta-dhaB1dhaB2，Rosseta-dhaT分别接种于发酵培养基中，37℃过夜培养为二级种子液，发酵培养基包括：yeast extract 5.0g/L,Na2HPO4 6.0g/L,KH2PO4 3.0g/L,NH4Cl 2.0g/L,NaCl 0.5g/L,MgSO4·7H2O g/L。
2)将步骤1)培养的Rosseta-dhaB1dhaB2与Rosseta-dhaT的二级种子液按1:1.5接种于大肠发酵培养基中进行摇瓶发酵，250mL摇瓶装液量为100mL，待OD值达到0.6时，加入IPTG使得终浓度为0.1mM同时再加入30g/L的底物甘油与2g/L的辅底物葡萄糖，37℃发酵24h，培养过程保持厌氧条件。
3)发酵液转化后离心，用高效液相色谱检测转化液成分，通过计算，甘油转化为1,3-丙二醇的转化率为77.5％。
实施例7
其他条件同实施例4，通过添加不同浓度的葡萄糖与不添加葡萄糖的体系作比较，所述的葡萄糖浓度为0、2、4、6、8、10g/L，发酵液转化后离心，用高效液相色谱检测转化液成分，如图6所示，当辅底物葡萄糖的浓度为10g/L，1,3-丙二醇的产量最高。
实施例8
1)将实施例1中构建的大肠杆菌Rosseta-dhaB1dhaB2，Rosseta-dhaT接种于5mLLB-Kan培养基中，37℃过夜培养为一级种子液，再将重组大肠杆菌Rosseta-dhaB1dhaB2，Rosseta-dhaT分别接种于发酵培养基中，37℃过夜培养为二级种子液，发酵培养基包括：yeast extract 5.0g/L,Na2HPO4 6.0g/L,KH2PO4 3.0g/L,NH4Cl 2.0g/L,NaCl 0.5g/L,MgSO4·7H2O g/L。
2)将步骤1)培养的Rosseta-dhaB1dhaB2与Rosseta-dhaT的二级种子液按1:1.5接种于大肠发酵培养基中进行发酵罐发酵，10L的发酵罐进行5L的发酵体系，待OD值达到0.6时，加入IPTG使得终浓度为0.1mM同时再加入60g/L的底物甘油与10g/L的辅底物葡萄糖，发酵控制条件：温度37℃，搅拌速度为200rpm，过程中以氨水调节pH使其控制为7，发酵通入氮气以保持厌氧环境，氮气通入量为4vvm，全发酵过程时间为60h。
3)发酵液转化后离心，用高效液相色谱检测转化液成分，在产物中，1,3-丙二醇的浓度为53.3g/L，甘油残留浓度为1.2g/L，通过计算，甘油转化为1,3-丙二醇的转化率为88.9％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏大学
<120> 一种微生物利用甘油发酵生产1,3-丙二醇的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3306
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgataagta aaggatttag tacccaaaca gaaagaataa atattttaaa ggctcaaata 60
ttaaatgcta aaccatgtgt tgagtcagaa agggcaatat taataacaga atcatttaaa 120
caaacagaag gccagccagc aattttaaga agagcattgg cattgaaaca catacttgaa 180
aatatcccta taacaattag agatcaagaa cttatagtgg gaagtttaac taaagaacca 240
aggtcttcac aagtatttcc tgagttttct aataagtggt tacaagatga attggataga 300
ttaaataaga gaactggaga tgcattccaa atttcagaag aaagtaaaga aaaattaaaa 360
gatgtctttg agtattggaa tggaaaaaca acaagtgagt tagcaacttc atatatgaca 420
gaggaaacaa gagaggcagt aaattgtgat gtatttactg taggaaacta ctattataat 480
ggcgtaggac atgtatctgt agattatgga aaagtattaa gggttggatt taatgggatt 540
ataaatgagg ctaaggaaca attagaaaaa agcagaagta tagatcctga ttttataaag 600
aaagaaaaat tcctaaatag tgttattatc tcatgcgaag ctgcaataac atatgtaaat 660
agatatgcta aaaaggctaa agagattgca gataatacaa gtgatgcaaa aagaaaagct 720
gaattaaatg aaatagcaaa aatttgttca aaagtttcag gagaaggagc taaatctttc 780
tatgaagcat gtcaattatt ttggtttatt catgcaataa taaatataga atctaatgga 840
cattctattt ctccagccag atttgatcaa tacatgtatc catattatga aaatgataaa 900
aatataacag ataagtttgc tcaagaatta atagattgta tctggattaa attaaatgat 960
attaataaag taagagatga gatttcaact aaacattttg gtggttaccc aatgtatcaa 1020
aacttaattg ttgggggtca aaattcagaa ggaaaagatg caactaataa agtatcatat 1080
atggcattag aagcagctgt ccatgtaaag ttgcctcagc catctttgtc agtaagaata 1140
tggaataaga ctccagatga atttttgctt agagcagcag aattaactag agaagggtta 1200
ggacttcctg cttattataa tgatgaagtt attattccag cattagtttc tagaggtctt 1260
acattagaag atgcaagaga ctacggaatc attggatgtg ttgaaccaca aaagccagga 1320
aaaacagaag gatggcatga ttcagcattc tttaatcttg caagaatagt agagttaact 1380
ataaattctg gatttgataa aaataaacag attggaccta aaactcaaaa ttttgaagaa 1440
atgaaatcct ttgatgaatt catgaaagct tataaagccc aaatggagta ttttgtaaaa 1500
catatgtgct gtgctgataa ttgcatagat attgcacatg cagaaagagc tccattacct 1560
ttcttgtcat caatggttga taattgtatc ggaaaaggaa agagccttca agatggtggt 1620
gcagaatata acttcagtgg accacaaggt gttggagtag ctaatattgg agattcatta 1680
gttgcagtta aaaaaattgt gtttgatgaa aataagatta ctccttcaga attaaagaaa 1740
acattaaata atgattttaa aaattcagaa gaaatacagg ccttactaaa aaatactcct 1800
aagtttggaa atgatattga tgaagttgat aatttagcta gagagggtgc attagtatac 1860
tgtagagaag ttaataaata tacaaatcca aggggaggaa attttcaacc aggattatat 1920
ccatcttcaa ttaatgtata ttttggaagc ttaacaggtg ctactccaga tggaaggaaa 1980
tccggacaac cattagctga tggggtttct ccatcaagag gctgtgatgt atctggacct 2040
actgcagctt gtaactcagt tagtaaatta gatcatttta tagcttcaaa tggaacttta 2100
tttaatcaaa aattccatcc gtcagcatta aaaggtgata atggattaat gaatttatca 2160
tcattaataa gaagttattt tgatcaaaag ggatttcatg ttcaatttaa tgtaatagat 2220
aaaaaaatat tacttgcagc acaaaaaaat cctgaaaaat atcaagattt aattgttaga 2280
gttgcaggat atagtgcaca gttcatttct ttagataaat ctattcaaaa tgatattatt 2340
gcaagaactg aacatgttat gtaaagacag cttttaaagg ggataaaagt aatgagtaag 2400
gagataaaag gcgttttatt taacatacaa aaattttcgt tacatgatgg gcctggaata 2460
agaactatag tattttttaa gggatgttca atgtcgtgct tatggtgcag taatccagaa 2520
tcccaagaga ttaaacctca agtaatgttt aataaaaatt tatgtacaaa atgtggaaga 2580
tgtaaatctg aatgtaaaag tgcagctatt gatatgaatt cagaatatag gatagataaa 2640
agcaaatgta cagagtgtac aaaatgtgtt gataattgct taagcggggc acttgttact 2700
gaaggaagga actacagtgt tgaagacgtt attaaggaat taaaaaaaga tagtgttcaa 2760
tatagaagat caaacggtgg aattacacta tctggagggg aagtattact tcaaccagat 2820
tttgcagtgg agcttttaaa agaatgtaaa tcatatggat ggcacactgc cattgaaaca 2880
gcaatgtatg ttaatagtga atctgtaaaa aaagtaattc catatataga tctggctatg 2940
attgatataa aaagtatgaa tgatgaaatc cataagaaat ttacaggagt gagtaatgaa 3000
ataatattac aaaacattaa attaagtgat gaattagcta aagaaataat aatcagaatt 3060
cctgtaatag aaggatttaa tgcggattta cagagtatag gagcaatagc tcaattttca 3120
aaatcattaa caaatcttaa aagaatagat cttcttccat accataatta tggagaaaat 3180
aagtatcaag caattggaag agagtattct ttgaaagaac taaaatcacc tagtaaagac 3240
aaaatggaaa gattaaaagc tttagttgaa atcatgggaa taccttgcac aattggagct 3300
gagtaa 3306
<210> 2
<211> 1158
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgtatgatt atttagtacc aagtgtaaac tttatgggag caaattcagt atcagtagta 60
ggtgaaagat gcaaaatatt aggtggaaaa aaagcattga tagttacaga taagtttcta 120
aaagatatgg aaggtggagc tgttgaatta acagttaaat atttaaaaga agctggatta 180
gatgttgtat attatgacgg agttgaacca aatccaaaag atgttaatgt tatagaagga 240
ttaaaaatat ttaaagaaga aaattgtgac atgatagtaa ctgtaggtgg aggaagttcg 300
catgattgcg gtaagggaat aggaattgct gcaacacatg aaggagatct ttatgattat 360
gcaggaatag aaacacttgt caatccattg ccaccaatag tagctgtaaa tactactgca 420
ggaactgcta gtgaattaac tcgtcattgt gtattgacta atacaaaaaa gaaaataaaa 480
tttgttatag ttagctggag aaatttgcct ctagtatcta taaatgatcc aatgcttatg 540
gtcaaaaaac ctgcaggatt aacagcagct acaggaatgg atgctttaac acatgcaata 600
gaagcatatg tatcaaaaga tgcaaatcca gtaacagatg cttcagcaat acaagctatt 660
aaattaattt cacaaaattt aagacaagct gtagctttag gagaaaatct tgaagcaaga 720
gaaaatatgg cttatgcatc attactagca ggaatggcat ttaataatgc taatttagga 780
tatgtacatg caatggctca tcaattaggg ggactgtatg atatggcaca tggtgttgct 840
aatgcaatgc tattaccaca tgttgaacgt tataatatga tatcaaatcc taagaagttt 900
gcagatatag cagaatttat gggagaaaat atatctggac tttctgtaat ggaagcagca 960
gagaaagcca taaatgcaat gttcagactt tcagaggatg ttggaattcc gaaaagtcta 1020
aaggagatgg gagttaaaca agaagatttt gagcatatgg cagaactagc tcttttagat 1080
ggaaatgcat ttagcaatcc aagaaaagga aatgcaaaag atattataaa tatttttaag 1140
gctgcttatt aattaata 1158

Claims (6)

1.一种微生物利用甘油发酵生产1,3-丙二醇的方法，其特征在于，所述方法包括：
1）扩增甘油脱水酶和甘油脱水酶激活因子的基因序列dhaB1、dhaB2，经一步无缝克隆法克隆到表达载体pANY1中，经转化、筛选阳性克隆子获得E.coli Rosseta-dhaB1dhaB2的重组菌；
2）扩增1,3-丙二醇脱氢酶基因dhaT，经一步无缝克隆法克隆到表达载体pANY1中，经转化、筛选阳性克隆子获得E.coli Rosseta-dhaT的重组菌；
3）将E.coli Rosseta-dhaB1dhaB2重组菌和E.coli Rosseta-dhaT重组菌进行种子培养和发酵培养，发酵培养时以甘油为底物，以葡萄糖为辅底物；
所述的底物甘油浓度为60~80g/L；
所述的葡萄糖浓度为2~10g/L；
所述dhaB1dhaB2的核苷酸序列如序列1所示；
所述dhaT的核苷酸序列如序列2所示；
所述的甘油脱水酶、甘油脱水酶激活因子和1,3-丙二醇脱氢酶来源于酪酸梭菌YJH-09。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的种子培养过程包括将重组大肠杆菌Rosseta-dhaB1dhaB2、Rosseta-dhaT 分别接种于LB-Kan培养基中，过夜培养为一级种子液，再将重组大肠杆菌Rosseta-dhaB1dhaB2、Rosseta-dhaT的一级种子液分别接种于发酵培养基中，过夜培养为二级种子液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养过程将Rosseta-dhaB1dhaB2与Rosseta-dhaT的二级种子液按体积比例接种于发酵培养基中，进行摇瓶发酵，接种量为1~5mL，转速50~200rpm/min，温度为30~37℃，发酵时间12~60h，pH控制在5.5~7.5，待OD值达到0.6时，加入IPTG同时加入底物甘油与辅底物葡萄糖。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述Rosseta-dhaB1dhaB2与Rosseta-dhaT的二级种子液体积比例为1.5:1~1:2.5。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的IPTG的终浓度为0.1~1mmol/L。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基包括yeast extract5.0 g/L, Na2HPO4 6.0 g/L, KH2PO4 3.0 g/L, NH4Cl 2.0 g/L, NaCl 0.5 g/L, MgSO4·7H2O g/L。
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