KR20120099315A - 3-하이드록시프로피온산 및 1,3-프로판디올 동시 생산용 재조합미생물 - Google Patents

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Abstract

미생물을 이용하여 3-HP(3-hydroxypropionic acid) 및 1,3-PDO(1,3-propandiol)를 동시에 생산하는 방법에 관한 것으로, 3-HP 및 1,3-PDO 생산유전자들을 동시에 포함하는 재조합 미생물을 이용함으로써 글리세롤 기질이 3-HP 및 1,3-PDO로 전환할 수 있도록 한다.

Description

3-하이드록시프로피온산 및 1,3-프로판디올 동시 생산용 재조합미생물{Recombinant Microorganism For Simultaneously Producing 3-hydroxypropionic acid and 1,3-propandiol}
미생물을 이용하여 3-하이드록시프로피온산(3-HP; 3-hydroxypropionic acid) 및 1,3-프로판디올(1,3-PDO; 1,3-propandiol)을 동시에 생산하는 방법에 관한 것이다.
최근, 석유 가격의 급격한 상승과 심각한 환경 문제가 야기되면서 바이오 기반 연료의 생산이 각광받고 있다. 바이오 기반 연료 중의 하나인 바이오디젤은 식물성 기름이나 동물성 지방으로부터 트리글리세리드의 에스테르 교환반응에 의해 생산된다.
바이오디젤의 대량생산으로 인해 부산물인 글리세롤 생산이 급증하였으며, 바이오디젤 10억 갤런 당 77억 파운드의 글리세롤이 생산되고 있다. 글리세롤 생산이 급증하면서 미국은 연간 32억 파운드, 세계적으로는 80억 파운드가 생산되고 있다. 이에 따라, 최근 2년간 글리세롤의 가격은 10배 정도 하락하였다. 정제되지 않은 글리세롤의 시장가격은 2004년에는 파운드당 5-15 센트이며, 현재는 2.5 센트 수준으로 알려져 있다.
이와 비교하여, 현재 글루코오스(포도당)의 가격은 5 센트 수준으로 알려져 있으며 점차적으로 상승할 것으로 보인다. 현재의 추세를 감안할 때 글리세롤 가격의 지속적 하락이 불가피한 것으로 판단된다.
글리세롤은 미국 에너지성(US DOE)에서 대체 화학원료 중 하나로 선정되는 등 각종 정밀화학 제품의 원료물질로서 사용될 가능성이 높아지는 만큼, 향후 바이오디젤 생산 증가와 함께 글리세롤 이용범위도 확대될 것으로 추정되고 있다. 글리세롤은 화학적/생물학적 방법에 의하여 propanol, glycerol carbonate, propylene glycol, 1,3-propanediol (1,3-PDO) 등으로 전환될 수 있다.
특히, 유전 공학적인 지식과 도구를 바탕으로 대사 경로를 인간이 원하는 대로 조작하는 대사 공학적 접근 방법을 이용하여 개량된 균주를 만들고자 하는 노력이 지속되고 있다.
다양한?대사산물 중에서도, 주된 석유 대체 biochemical인 3-하이드록시프로피온산(3-HP)과 1,3-프로판디올(1,3-PDO)은 각종 흡착제, 접착제, 페인트, 섬유, polyols과 같은 물질의 building block으로 사용되는 등 그 사용범위가 광범위하기 때문에, 글리세롤로부터 3-HP 및 1,3-PDO를 보다 효과적으로 동시생산하는 방법의 개발은 중요성이 더욱 크다고 할 수 있다.
생물 대사공학 및 효소담체 기술을 적용하여, 3-HP 및 1,3-PDO 생산 유전자를 동시에 포함하는 재조합 미생물을 이용하여, 글리세롤의 공급율을 높임으로써 높은수율로 3-HP 및 1,3-PDO로 전환될 수 있다.
일 측면은, 3-하이드록시프로피온산(3-HP) 및 1,3-프로판디올(1,3-PDO) 생산 유전자를 함께 포함하는, 3-HP 및 1,3-PDO 동시 생성용 재조합미생물을 제공한다.
또 다른 측면은, 3-HP 및 1,3-PDO 동시 생성용 미생물 형질전환용 상기유전자들을 포함하는 재조합벡터를 제공한다.
또 다른 측면은, 상기 재조합 미생물을 이용하여 글리세롤로부터 3-HP 및 1,3-PDO로 100% 전환되는, 3-HP 및 1,3-PDO 동시 생산방법을 제공한다.
또 다른 측면은, 상기 재조합 미생물을 이용하여 in vitro 상에서 또는 미생물 세포 표면상에서 3-HP 및 1,3-PDO를 동시에 생산하는 방법을 제공한다.
일 실시예는 3-하이드록시프로피온산(3-HP) 및 1,3-프로판디올(1,3-PDO) 생산유전자를 포함하는, 3-HP 및 1,3-PDO 동시 생성용 재조합미생물을 제공한다.
이 때, 상기 3-하이드록시프로피온산(3-HP) 및 1,3-프로판디올(1,3-PDO) 생산 유전자는 dhaB(glycerol dehydratease), alhH(aldehyde dehydrogenase) 및 dhaT(1,3-propandiol oxidoreductase)를 사용할 수 있다. 특히, 상기, dhaB 및 dhaT 유전자는 K. pneumoniae로부터 유래된 것일 수 있고, 싱기 alhH 유전자는 E, coli로부터 유래된 것일수 있다.
상기 유전자들은 벡터를 이용하여 독립적으로 또는 동시에 형질전환되거나 상기 재조합미생물 염색체상에 삽입될 수 있다. 즉, 상기 벡터는 dhaB(glycerol dehydratease), alhH(aldehyde dehydrogenase) 및 dhaT(1,3-propandiol oxidoreductase)를 각각 독립적으로 또는 2 이상의 유전자를 함께 함유할 수 있다.
또한, 상기 재조합미생물은 자이모모나스(Zymomonas), 에스케리키아(Escherichia), 슈도모나스(Pseudomonas), 알칼리제네스(Alcaligenes), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 버크홀데리아(Burkholderia), 올리고트로파(Oligotropha), 클렙시엘라(Klebsiella), 피치아(Pichia), 칸디아(Candida), 한세눌라(Hansenula), 사카로마이세스(Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 속에 속하는 미생물일 수 있는데, 본 발명의 일 실시예에서는 에스케리키아 콜리(Escherichia coli, 대장균)이다.
다른 실시예는, 상기 재조합미생물을 탄소 기질을 함유하는 배지에서 배양함을 포함하는, 3-HP 및 1,3-PDO를 동시에 생산하는 방법을 제공한다.
상기 탄소 기질은 글루코오스, 수크로오스, 셀룰로오스 및 글리세롤로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 탄소 기질일 수 있다. 그 중에서도 본 발명의 예시는 글리세롤 기질을 사용한다. 본 발명의 예에 따른 3-HP 및 1,3-PDO를 동시에 생산하는 방법은 상기 탄소 기질이 3-HP 및 1,3-PDO로 100% 전환될 수 있다.
상기 배양은 1차적으로 글루코오스를 함유하는 배지에서 배양하여 dhaB, alhH 및 dhaT를 과발현시키는 단계 및 2차적으로 글리세롤을 함유하는 배지에서 배양하는 단계를 포함한다. 특히, 상기 배양은 비타민 B12를 조효소로 사용할 수 있다.
또한, 상기 배양은 혐기적 조건 또는 호기적 조건에서 수행할 수 있고, 일 예시에서는 혐기적 조건에서 배양하였다.
다른 실시예에서는 하기 단계들을 포함하는 in vitro 상에서 3-HP 및 1,3-PDO를 동시에 생산하는 방법을 제공한다.
상기 재조합미생물을 글루코오스가 함유된 배지에서 배양하여 dhaB, alhH 및 dhaT를 과발현시키는 단계; 상기 미생물로부터 glycerol dehydratease, aldehyde dehydrogenase 및 1,3-propandiol oxidoreductase 효소들을 수득하여 고정화시키는(immobilization) 단계; 및 상기 수득된 효소들을 in vitro 상에서 글리세롤과 반응시키는 단계.
또 다른 실시예에서는 상기 재조합미생물 및 세포 표면발현 기술을 이용하여, 미생물 세포 표면에 glycerol dehydratease, aldehyde dehydrogenase 및 1,3-propandiol oxidoreductase 효소들을 발현시켜 글리세롤과 반응시키는 단계를 포함하는, 3-HP 및 1,3-PDO를 동시에 생산하는 방법을 제공한다.
이러한 3-하이드록시프로피온산(3-HP) 및 1,3-프로판디올(1,3-PDO) 생산 유전자를 함께 포함하는, 3-HP 및 1,3-PDO 동시 생성용 재조합미생물은 비타민 B12를 조효소로 필요하지 않고 글리세롤을 3-HP 및 1,3-PDO로 100% 전환시키는 균주로서, 효과적인 미생물시스템을 구축할 수 있다.
따라서, 3-HP 및 1,3-PDO를 동시에 생산할 수 있을 뿐만 아니라 생산성도 우수하므로, 바이오 연료생산 산업에서 매우 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
도 1은 글리세롤을 이용한 3-HP/1,3-PDO 생산경로를 도식화하여 나타낸 그림이다.
도 2는 본 발명의 3-HP/1,3-PDO 생산 유전자군을 함유하는 재조합벡터의 도식도이다.
도 3은 본 발명의 3-HP/1,3-PDO 생산 유전자들의 발현을 확인한 웨스턴 블럿 분석 사진이다.
도 4 및 도 5는 HPLC를 이용하여 3-HP 생산을 분석한 그래프이다.
도 6은 HPLC를 이용하여 1,3-PDO 생산을 분석한 그래프이다
여기에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
"대사 조작(metabolic engineering)"은 미생물에서 원하는 대사산물의 생산을 위하여, 생합성 유전자, 오페론과 연관된 유전자, 그리고 이들 폴리뉴클레오티드의 제어 요소(control elements)의 합리적 경로 디자인과 어셈블리를 수반한다. "대사 조작된"은 원하는 경로를 유도하는 중간생성물과 경쟁하는 경쟁대사 경로(competing metabolic pathway)의 감소, 파괴 또는 적중을 비롯한, 유전자 조작과 적절한 배양조건을 이용한 전사(transcription), 전이(translation), 단백질 안정성(protein stability)과 단백질 기능성(protein functionality)의 조절과 최적화에 의한 대사 흐름(metabolic flux)의 최적화를 더욱 포함할 수 있다. 생합성 유전자는 호스트에 외래성이거나, 또는 돌연변이유발(mutagenesis), 재조합(recombination) 및/또는 내인성 숙주세포에서 이종 발현제어 서열과의 연관에 의해 변형됨으로써, 숙주미생물에 이종성일 수 있다. 일 견지에서, 폴리뉴클레오티드가 숙주 생물체에 이종 발생성인 경우에, 폴리뉴클레오티드는 코돈(codon) 최적화될 수 있다.
"기질"은 효소의 작용에 의해 다른 화합물로 전환되거나 전환되게 되어있는 임의의 물질 또는 화합물을 지칭한다. 상기용어는 단일 화합물뿐만 아니라 용제, 혼합물 및 최소한 하나의 기질을 포함하는 다른 재료와 같은 화합물의 조합 및 이들의 유도체를 포괄한다. 게다가, 용어"기질"은 바이오매스(biomass) 유도된 설탕과 같은 출발 재료로서 사용하기 적합한 탄소 공급원을 제공하는 화합물뿐만 아니라 본 명세서에 기재된 대사 조작 미생물과 연관된 경로에서 사용되는 중간생성물과 최종 대사산물을 포괄한다. 미생물에 의해 통상적으로 사용되는 적합한 탄소 기질을 포괄한다.
"기능" 및 "기능성" 등은 생물학적 또는 효소적 기능을 의미한다.
"외래"는 일반적으로 야생형 세포 또는 유기체에서 자연적으로 발생하는 것이 아니고, 전형적으로 분자생물학 기술, 즉, 재조합 미생물을 생성하기 위한 공학적 처리로 세포에 도입된 폴리뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드를 의미한다.
"재조합" 미생물은 전형적으로, 예컨대 플라스미드 또는 벡터에 하나 이상의 외래 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
"벡터"라는 용어는 숙주세포에 삽입되어 숙주세포 게놈과 재조합되고 이에 삽입되거나, 또는 에피좀으로서 자발적으로 복제하는 컴피턴트 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 핵산을 의미한다. 이러한 벡터로는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 등이 있다.
"형질전환 또는 트랜스펙션"은 세포 외부 DNA가, 수반물질이 있고 없는 상태로 숙주 세포로 들어가는 과정을 말한다. "트랜스펙션된 세포"란 세포 외부 DNA가 세포 내로 도입되어 세포 외부 DNA를 가지고 있는 세포를 가리킨다. DNA는 세포로 도입되어 핵산이 염색체에 삽입되거나 혹은 염색체 외 물질로 복제될 수 있다.
"숙주 세포"는 본 발명의 임의의 재조합 벡터(들) 또는 단리된 폴리뉴클레오티드의 수용체일 수 있거나, 수용체인 개별 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일숙주 세포의 자손일 수 있으며, 자손은 자연적, 우발적 또는 인공 돌연변이 및/또는 변화로 인해 원래의 모 세포와 완전히 동일하지 않아도 된다(형태 또는 총 DNA 상보면에서). 숙주 세포는 생체내 또는 시험관 내에서 본 발명의 재조합 벡터 또는 폴리뉴클레오티드로 형질감염되거나, 형질전환되거나 또는 감염된 세포를 포함한다. 본 발명의 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포는 재조합 숙주 세포, 재조합 세포 또는 재조합 미생물이다.
"효소 반응 조건"이란 효소가 기능 하도록 허용하는 환경에서 이용가능한 임의의 필수적인 조건(즉, 온도, pH, 물질 비저해)과 같은 요인을 의미한다. 효소 반응조건은 시험관에서와 같은 시험관내, 또는 세포내와 같은 생체내일 수 있다.
"~로부터 얻은" 또는 "~유래의" 이란 예를 들어, 소정 유기체, 전형적으로 미생물과 같은 특정 공급원으로부터 단리되거나, 이로부터 유도된 폴리뉴클레오티드 추출물 또는 폴리펩티드 추출물 등과 같은 샘플을 의미한다. 또한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 특정유기체 또는 미생물로부터 단리되거나, 이로부터 유도된 상황도 의미할 수 있다
"약"이라는 것은 참조양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.
여기에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
재조합 미생물을 이용하여 3-하이드록시프로피온산(3-HP) 및 1,3-프로판디올(1,3-PDO)을 동시에 생산하는 방법에 관한 것으로, 글리세롤(Glycerol)로부터 3-HP 및 1,3-PDO로 전환되는 경로를 활용하여, 유전자를 동시에 과발현시킴으로써 글리세롤을 높은 수율로 기질로 사용할 수 있게 함으로써 최종 산물인 3-HP 및 1,3-PDO의 생산 효율을 높일 수 있다.
당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에게 공지된 표준 클로닝 기술 및 통상적인 방법을 이용하여, 목적하는 유전자를 기본 벡터에 삽입하여 형질전환시킨 재조합미생물을 배양함으로써 구현할 수 있다. 따라서, 3-하이드록시프로피온산(3-HP) 및 1,3-프로판디올(1,3-PDO)과 같은 범용 화학물질로 전환시키는 방법, 효소, 재조합 미생물 및 미생물 시스템을 제공한다.
또 다른 예는 미생물을 이용한 3-하이드록시프로피온산(3-HP) 및 1,3-프로판디올(1,3-PDO)의 동시 생산에 관한 것이다.
3-하이드록시프로피온산 (3-HP)은 25℃에서 pKa 4.51인 약산으로서, 구조적으로 탄소 3개를 가지는 비카이랄 유기산으로 젖산(2-하이드록시프로피온산)과 이성질체이다. 또한 비결정질이고, 시럽과 같은 연한 노란색을 띠며, 비중은 1.25, 굴절률은 1.45이다.
3-하이드록시프로피온산 (3-HP)은 유기산으로서, 3-HP의 칼슘염은 구연산이나 말산의 칼슘염보다 물에 대한 용해도가 100배 정도 높아서, 보일러, 산업시설 등의 스케일 방지용으로 유용성이 있는 물질이다. 또한 3-HP는 몇몇 화학공정에 있어서 중요한 합성 중간체이다. 특히, 산화반응에 의한 말론산 생산, 알코올과 함께 에스테르화 반응에 의한 특이목적의 폴리에스테르 생산, 환원반응에 의한 1,3-프로판디올 생산 등을 포함하여 몇몇 화학물질과 폴리머의 생산에 중요하다.
또한, 1,3-PDO는 최근 상용화되어 용도가 확대되고 있는 폴리트리메틸렌 테레프탈레이트 (polytrimethylene terephthalate, PTT)의 단량체로 이용될 수 있는 중요한 원료물질이며, 또한 윤활제와 용매로도 사용될 수 있다. 생물학적 1,3-PDO 생산공정은 상온ㆍ상압의 조건에서 비교적 적은 에너지를 소모하므로, 경제적이고 환경친화적이면서 또한 화학적 공정에 비해 높은 수율을 나타내는 장점이 있어 최근 많은 연구가 진행되고 있다.
그러나, 지금까지 보고된 3-HP, 1,3-PDO 생산 연구는 생산량은 10~20g/L으로 낮았다. 또한, 생산량을 늘리기 위해 고농도 세포배양을 할 경우 생육저해 현상이 나타나며, 발효시간의 장기화로 인해 생산성이 많이 떨어지는 문제점이 있었다.
[3-HP 및 1,3-PDO 생합성 경로]
생물의 고유에너지 생성 경로를 활용하는 대사 조작된 3-HP 및 1,3-PDO 생합성 경로를 포함한다.
이는 생물연료를 생산하기 위한 생합성 경로에서 생물의 고유 대사산물을 활용하는 더욱 호스트-친화적인 생물연료 시스템을 제공한다.
"대사 경로"로도 지칭되는 용어 "생합성 경로"는 하나의 화학 종을 다른 종으로 전환(transmuting)시키기 위한 동화(anabolic) 또는 이화(catabolic) 생화학 작용의 세트를 지시한다. 유전자 산물은 병렬로 또는 직렬로 동일기질에 작용하여 동일산물을 생산하거나, 또는 동일 기질과 대사 최종 산물 사이의 대사 중간생성물(즉, 대사 산물)에 작용하거나 또는 이를 생산하면, 동일한 "대사경로"에 속한다.
일 예의 생합성 경로는 탄소원을 기질로 사용한다. 예를 들어, 단당류, 올리고당류, 다당류, 및 C1 기질 또는 그 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 탄소공급원을 사용할 수 있다. 구체적으로, 알기네이트, 한천, 카라게난, 푸코이단, 펙틴, 글루로네이트, 만누로네이트, 만니톨, 릭소스, 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 글리세롤, 크실리톨, 글루코오스, 수크로오스, 만노스, 갈락토스, 크실로스, 크실란, 만난, 아라비난, 아라비노스, 글루쿠로네이트,갈락투로네이트(디- 및 트리-갈락투로네이트 포한), 람노스 등을 들 수 있으나 이들로만 한정되지 않는다. 본 발명의 실시예는 글리세롤을 사용한다.
상기 3-HP 및 1,3-PDO 생합성 경로 설명을 위해, 일 구체예로 글리세롤을 이용한 "글리세롤(Glycerol) 3-HP 및 1,3-PDO 생합성 경로"를 도 1에 도식화하여 나타내었다.
도 1을 참조하면, 우선, 생합성 경로는 3-HP 및 1,3-PDO 생산 유전자들을 함께(동시에) 발현시킨다.
본 발명의 실시에서, 3-HP 및 1,3-PDO 생산 유전자들은 dhaB(glycerol dehydratease), alhH(aldehyde dehydrogenase) 및 dhaT(1,3-propandiol oxidoreductase)로서, 각 유전자들이 발현하여 glycerol dehydratease, aldehyde dehydrogenase 및 1,3-propandiol oxidoreductase 효소들을 생성하고, 이들 효소의 활성을 이용하여 3-HP 및 1,3-PDO를 동시에 생산한다.
특히, 상기 생합성 경로에서, 산화환원 불균형(Redox imbalance) 문제를 해결하기 위해, dhaT 유전자를 도입함으로써 NADH/NAD+ recycling을 가능하게 한다.
상기 dhaB 유전자는 K. pneumoniae 또는 C. butyricum로부터 유래될 수 있고, dhaT 유전자는 K. pneumoniae로부터 유래될 수 있으며, alhH 유전자는 E, coli로부터 유래될 수 있다.
이처럼, 일 실시예에서는 dhaB, alhH 및 dhaT의 동시 과발현을 통해 NADH/NAD+ 재생(regeneration) 및 글리세롤 흡수율(glycerol uptake rate)을 높일 수 있다.
상기 생합성 경로에는 다양한 효소들이 사용되고, 이렇게 사용되는 다양한 효소들은 앞서 언급하고 있는 여러 대사산물을 생산한다.
상기 효소를 인코딩하는 적합한 폴리뉴클레오티드는 이를 제공하는 임의의 생물학적 공급원으로부터 유래될 수 있고, 이의동족체는 다양한 자료베이스를 참조하여 확인될 수 있다.
생합성 효소를 인코딩하는 고유 DNA서열은 본 발명의 구체예를 단순히 예시하기 위하여 본 명세서에서 언급되고, 여기에 개시된 방법에 활용되는 효소의 폴리펩티드 및 단백질의 아미노산 서열을 인코딩하는 임의의 서열의 DNA 화합물을 포함한다. 유사한 방식으로, 폴리펩티드는 전형적으로, 원하는 활성의 손실이나 중대한 손실 없이, 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및 삽입을 허용할 수 있다. 여기에 기술된 특정 단백질의 효소적 동화 또는 이화 활성을 갖는다면, 상기 기준 폴리펩티드(reference polypeptide)와 상이한 아미노산 서열을 갖는 변형되거나 변이된 폴리펩티드 역시 포함한다. 더 나아가, 본 명세서에 도시된 DNA 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열은 단지 본 발명의 구체예를 예시한다.
여기에서 열거된 각 유전자와 폴리펩티드/효소에 대한 서열은 인터넷에서 이용 가능한 자료베이스를 사용하여 용이하게 확인할 수 있다(http:(//)eecoli.kaist.ac.kr/main.html). 이에 더하여, 이들 아미노산 서열과 핵산 서열은 당분야에서 통상적으로 이용되는 알고리즘(BLAST 등)을 이용하여 동일성에 대하여 용이하게 비교할 수 있다.
[재조합 미생물]
적합한 기질로부터 상기 3-HP/1,3-PDO 동시 생산을 위한 생화학 경로를 포함하는 대사 조작미생물(재조합 미생물)을 제공한다.
일 예의 대사 조작미생물은 생물의 게놈내에서 또는 생물내에서 게놈 외부에 하나 이상의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 미생물은 야생형 생물체에서 발견되는 유전자의 감소(reduction), 파괴(disruption) 또는 적중(knockout) 및/또는 이종(heterologous) 폴리뉴클레오티드의 도입(introduction)을 포함한다.
따라서, 본 발명의 일 실시예는, 3-하이드록시프로피온산(3-HP) 및 1,3-프로판디올(1,3-PDO) 생산유전자를 포함하는, 3-HP 및 1,3-PDO 동시 생성용 재조합 미생물에 관한 것이다. 일 구체예로, 상기 재조합 미생물은 3-HP 및 1,3-PDO 생산 유전자 dhaB(glycerol dehydratease), alhH(aldehyde dehydrogenase) 및 dhaT(1,3-propandiol oxidoreductase)를 함께(동시에) 함유한다.
앞서 설명한 바와 같이, 상기 dhaB 유전자는 K. pneumoniae 또는 C. butyricum로부터 유래될 수 있고, dhaT 유전자는 K. pneumoniae로부터 유래될 수 있으며, alhH 유전자는 E, coli로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 K. pneumoniae 유래의 3-HP 및 1,3-PDO 생산 유전자군 dahB1B2B3, gdrAB, dhaT 그리고, E. coli 유래의 aldH 유전자를 사용하였다.
상기 3-하이드록시프로피온산(3-HP) 및 1,3-프로판디올(1,3-PDO) 생산 유전자를 미생물에 도입하는 것은 공지된 통상의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 상기 효소들의 유전자를 포함하는 벡터를 제작하고, 이러한 재조합 벡터로 미생물을 형질전환시키는 방법을 이용할 수 있다.
재조합벡터
벡터(vector)는 적합한 숙주 미생물 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다.　
벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다.　적당한 숙주 미생물로 형질전환되면 벡터는 숙주게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로 본 발명에서 플라스미드(plasmid)와 벡터(vector)는 때로 상호 교환적으로 사용된다.　
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 도입된 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는 해당 유전자가 선택된 발현 숙주내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다.　예를 들어, 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현벡터 내에 포함되게 된다.　발현 숙주가 진핵세포인 경우에는 발현 벡터는 진핵 발현 숙주내에서 유용한 발현마커를 더 포함하여야만 한다.
"작동 가능하게 연결된"이란 언급된 구성요소들이 그 일반적 기능을 수행하도록 구성되어 있는 요소들의 배열을 말한다. 따라서, 코딩 서열(예를 들어, 관심있는 항원을 코딩하는 서열)에 작동 가능하게 연결된 특정 프로모터는 조절 단백질 및 적절한 효소가 존재할 경우 코딩서열의 발현을 가능하게 할 수 있다. 일부 경우, 특정 조절요소가 이들이 코딩 서열의 발현을 지시하는 기능을 할 수 있는 한 코딩 서열에 인접할 필요는 없다.
발현조절서열(expression control sequence)이라는 표현은 특정한 숙주생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다.　그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.　전사 개시 및 조절 부위를 함유하는 것 이외에, 발현벡터는 또한 전사종결에 필요한 서열 및 전사 영역에서 전사에 대한 리보좀 결합 부위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 전사체의 적절한 폴리아데닐화 반응을 위해 발현 구조체에 폴리아데닐화 시그날이 포함될 수 있다. 폴리아데닐화 시그날의 성질은 본 발명의 성공적인 실행에 중요한 것으로 보지는 않으며, 임의서열이 이용될 수 있다. 이 밖에도 당업자들이라면 발현 벡터에 유용한 다수의 조절서열을 알 수 있을 것이다. 또한, 상기벡터는 재조합 벡터 작제물을 함유하는 세포의 부차 집단을 선택할 수 있는 선택 마커를 포함할 수 있다. 마커는 본원에 개시된 융합서열을 함유하는 동일 벡터에 함유될 수 있거나, 별도의 벡터상에 존재할 수도있다. 선택성 마커는 발현되었을 때, 선택성 마커를 포함하지 않는 세로로부터 세포의 용이한 확인, 분리 선별을 할 수 있도록 세포에 확인가능한 특징을 부여하는 핵산 서열을 말한다. 당분야에 공지된 임의선택성 마커도 본 발명의 핵산에서 선택성 마커로 사용될 수 있다.
본 발명의 실시에서, 목적하는 DNA 서열(효소를 코딩하는 서열)을 발현시키기 위하여 매우 다양한 발현 조절서열 중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다.　유용한 발현조절서열의 예로는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함될 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 재조합 벡터로는 플라스미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 코스미드 벡터, YAC(Yeast Artificial Chromosome) 벡터를 포함한 다양한 벡터들이 도입될 수 있다.　일 예에서 플라스미드 벡터를 이용한다.
그러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질 전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다.　적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.
통상적으로, 하나 이상의 제한 효소로 DNA 서열 및 벡터를 절단하고 단편들을 함께 결찰하여 최종적으로 발현될 DNA 서열을 벡터에 결합시킨다. 제한효소 소화처리 및 결찰은 당업자들에게 익히 알려졌다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서 3-하이드록시프로피온산(3-HP) 및 1,3-프로판디올(1,3-PDO) 생산 유전자를 포함하는 재조합벡터에 관한 것이다. 대표적인 벡터의 모식도를 도 2에 도시하였다.
미생물 숙주
한편, 본 발명의 실시에 따른 재조합 벡터는 적절한 미생물 숙주세포로 통상의 방법으로 형질전환할 수 있다. 3-HP 및 1,3-PDO 동시 생성용 미생물 숙주는 박테리아, 시아노박테리아, 사상균 및 효모 등으로부터 선택될 수 있다.
3-HP 및 1,3-PDO 동시 생성을 위하여 선택되는 미생물 숙주는 3-HP 및 1,3-PDO에 대하여 내성이어야 하며, 탄수화물을 3-HP 및 1,3-PDO로 전환시킬 수 있어야 한다. 적합한 미생물 숙주의 선택기준은 하기를 포함한다: 3-HP 및 1,3-PDO에 대한 고유내성, 높은 글루코오스 및 글리세롤 이용률, 유전자 조작을 위한 유전학적 도구의 이용가능성, 및 안정한 염색체 변경을 생성하는 능력.
상기에 설명된 기준을 근거로 하면, 3-HP 및 1,3-PDO 동시 생성에 적합한 미생물 숙주는, 이에 제한되지는 않지만, 자이모모나스(Zymomonas), 에스케리키아(Escherichia), 슈도모나스(Pseudomonas), 알칼리제네스(Alcaligenes), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 버크홀데리아(Burkholderia), 올리고트로파(Oligotropha), 클렙시엘라(Klebsiella), 피치아(Pichia), 칸디아(Candida), 한세눌라(Hansenula), 사카로마이세스(Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 속에 속하는 미생물을 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 에스케리키아 콜리(E. coli, 대장균)를 사용하였다.
또한, 상기 미생물 숙주는 다양한 유전자의 결실에 의해 탄소 흐름에 대한 경쟁경로의 불활성화를 위하여 조작될 수 있다.
재조합 미생물의 제작
발효가능한 탄소기질의 3-HP 및 1,3-PDO 전환을 위한 효소 경로를 코딩할 필요한 유전자를 포함하는 재조합 유기체를 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 제작할 수 있다. 상기 유전자들은 벡터 등을 이용하여 독립적으로 또는 동시에 형질전환되거나 상기 재조합미생물 염색체 상에 삽입되어 있을 수 있다.
박테리아 게놈으로부터 원하는 유전자를 얻는 방법은 분자생물학 분야에서 일반적이며 잘 알려져 있다. 예를 들어, 당해 유전자의 서열이 공지되어 있는 경우, 적합한 게놈 라이브러리가 제한 엔도뉴클레아제 절단에 의해 생성될 수 있으며, 원하는 유전자 서열에 상보적인 프로브를 이용하여 스크리닝될 수 있다. 일단 당해 서열이 단리되면, 그 DNA는 표준 프라이머-유도 증폭 방법, 예를 들어 폴리머라아제 연쇄 반응을 이용하여 증폭되어 적절한 벡터를 이용한 형질전환에 적합한 양의 DNA가 얻어질 수 있다. 이종숙주에서의 발현을 위한 코돈 최적화 도구는 쉽게 이용가능하다. 코돈 최적화를 위한 일부 도구는 숙주 유기체의 GC 함량을 기반으로 하여 이용가능하다.
일단 관련 경로유전자가 동정되어 단리되면, 이 유전자는 당업계에 잘 알려진 수단에 의해 적합한 발현숙주를 형질전환시킬 수 있다. 형질전환(transformation), 형질도입(transduction), 또는 형질감염(transfection))은 전기천공(electroporation), 극미 주입(microinjection), 유전자총(biolistics)(또는 입자폭격 매개된 전달), 또는 아그로박테리움 매개된 형질전환 등을 비롯한 다수의 수단 중에서 하나에 의해 달성될 수 있다.
다양한 숙주세포의 형질전환에 유용한 벡터 또는 카세트는 일반적이며, 전형적으로, 상기벡터 또는 카세트는 관련 유전자, 선별가능한 마커, 및 자가 복제 또는 염색체 통합을 허용하는 서열의 전사 및 번역을 유도하는 서열을 포함한다. 적합한 벡터는 전사 개시제어부를 품고 있는 유전자의 5'의 영역 및 전사 종결을 제어하는 DNA 단편의 3'의 영역을 포함한다. 둘 모두의 제어영역은 형질전환된 숙주세포에 대하여 상동성인 유전자로부터 유래될 수 있지만, 그러한 제어영역은 생산 숙주로서 선택된 특정 종에 자생적이지 않은 유전자로부터 또한 유래될 수도 있음이 이해되어야 한다.
원하는 숙주세포에서 관련 경로의 코딩 영역의 발현을 유도하는 데 유용한 개시제어 영역 또는 프로모터는 많이 있으며, 당업자에게 친숙하다. 실질적으로 이들 유전자 요소를 유도할 수 있는 임의의 프로모터가 본 발명에 적합하며, 이는 CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI(사카로마이세스에서의 발현에 유용함); 및 lac, ara, tet, trp, lPL,lPR, T7, tac, 및 trc (에스케리키아 콜라이, 알칼리제네스, 및 슈도모나스에서의 발현에 유용함) 프로모터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
종결 제어 영역은 바람직한 숙주에 자생적인 다양한 유전자로부터 또한 유래될 수도 있다. 선택적으로, 종결 부위는 불필요할 수도 있지만, 포함되는 것이 좋다.
"재조합 미생물" 및 "재조합 숙주 세포"라는 용어는 본 명세서에서 동의어로 사용되며, 내인성(endogenous) 폴리뉴클레오티드를 발현하거나 과다 발현하기 위하여, 또는 벡터에 내포된 것들과 같은 비-내인성(nonendogenous) 서열을 발현하기 위하여 유전적으로 변형된 미생물, 또는 내인성 유전자의 발현 감소를 갖는 미생물을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 일반적으로, 앞서 기술된 바와 같은 원하는 대사산물을 생산하기 위한 대사 경로에 관여하는 효소를 인코딩한다. 따라서 본 명세서에 기술된 재조합 미생물들은 모 미생물에 의해 이전에 발현되지 않거나 과다발현되지 않은 표적효소들을 발현하거나 과다발현하도록 유전자 조작되었다. "재조합 미생물" 및 "재조합 숙주 세포"라는 용어는 특정 재조합 미생물뿐만 아니라 이런 미생물의 후손 또는 잠재적 후손을 지칭하는 것으로 이해된다.
일 실시예에서 사용한 재조합 미생물은 dhaB(glycerol dehydratease), alhH(aldehyde dehydrogenase) 및 dhaT(1,3-propandiol oxidoreductase)를 함께 함유하고 있는 구성을 가지는 것을 특징으로 한다.
이 때, 상기미생물은 E. coli일 수 있고, 상기, dhaB 및 dhaT 유전자는 K. pneumoniae로부터 유래되고, 상기 alhH 유전자는 E, coli로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명은 또한, 기탁된 재조합 미생물을 제시한다(기탁번호: KCTC11836BP). 기탁된 미생물들은 단지 전형적이며, 본 발명 실시에 기초하여, 당업자는 3-HP 및 1,3-PDO을 생산하는 본 발명의 미생물에 도달하기 위하여 다른 종 또는 유전형(genotype)의 추가적인 모 생물체를 변형할 수 있다.
[3-HP 생산방법]
또 다른 관점에서 상기 재조합 미생물을 배양하는, 3-HP 및 1,3-PDO를 동시에 생산하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 재조합 미생물을 탄소원을 함유하는 배지에서 배양한 다음, 상기 배양된 미생물로부터 3-HP 및 1,3-PDO을 함께 회수하는, 3-HP 및 1,3-PDO 동시생산 방법을 제공한다. 이때 재조합 미생물의 배양 및 3-HP 및 1,3-PDO의 수득과정은 종래 발효공업에서 통상적으로 알려진 배양방법 및 3-HP 및 1,3-PDO 분리정제방법을 사용하여 수행할 수 있다.
발효 배지
본 발명에서 발효배지는 적합한 탄소기질을 포함하여야 한다. 적합한 기질은 단당류, 올리고당류, 다당류, 및 C1 기질 또는 그 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 탄소 공급원을 사용할 수 있다.
단당류, 예를 들어 글루코오스 및 프룩토스, 올리고당류, 예를 들어 락토스 또는 수크로오스, 다당류, 예를 들어 전분 또는 셀룰로오스 또는 그 혼합물과, 재생 가능한 공급재료로부터의 비정제된 혼합물을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 부가적으로, 탄소 기질은 또한 C1 기질, 예를 들어 이산화탄소, 또는 메탄올일 수 있으며, 이것에 있어서 주요한 생화학적 중간체로의 대사적 전환이 입증되었다. C1 및 C2 기질 외에, 메틸요구(methylotrophic) 유기체는 대사 활성을 위한 다양한 아미노산, 글루코사민 및 메틸아민과 같은 많은 기타 탄소함유 화합물을 이용하는 것으로 또한 공지되어 있다. 예를 들어, 메틸요구 효모는 메틸아민 유래의 탄소를 이용하여 트레할로스 또는 글리세롤을 형성하는 것으로 공지되어 있다 (문헌[Bellion et al., Microb. Growth C1 Compd., [Int. Symp.], 7th (1993), 415-32. (eds): Murrell, J.Collin Kelly, Don P. Publisher: Intercept, Andover, UK]).
상기에 언급된 모든 탄소 기질 및 그 혼합물은 여기에 개시된 효소가 반응할 수 있는 조건을 형성할 수 있으면 어느 것이나 적합한 것으로 생각되지만, 본 발명의 실시에 사용되는 탄소 기질은 글루코오스, 수크로오스, 셀룰로오스, 글리세롤 등일 수 있고, 특정 구체예에서는 글리세롤을 사용한다.
특히, 본 발명의 실시는 1차적으로 글루코오스를 함유하는 배지에서 배양하여 dhaB, alhH 및 dhaT를 과발현시키는 단계 및 2차적으로 글리세롤을 함유하는 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
즉, 글루코오스 함유배지에서 glycerol dehydratease, aldehyde dehydrogenase 및 1,3-propandiol oxidoreductase 효소들을 과발현시킨 후, 글리세롤을 기질로 하여 이들의 활성을 이용한다.
상기 적절한 탄소공급원 외에, 발효배지는 적합한 미네랄, 염, 보조 인자, 완충액 및 3-HP 1,3-PDO 생성에 필요한 효소 경로의 촉진 및 배양물의 성장에 적합한, 당업자에게 공지된 기타 성분을 포함할 수 있다.
배양 조건
전형적으로, 세포는 적절한 배지에서 약 25℃ 내지 약 40℃ 범위의 온도에서 성장시킨다. 그리고 발효에 적합한 pH 범위는 pH 5.0 내지 pH 9.0이다.
사용할 수 있는 성장 배지는 루리아 베르타니(Luria Bertani, LB) 액체배지, 사부로 덱스트로스(Sabouraud Dextrose, SD) 액체 배지 또는 효모 배지(Yeast Medium, YM) 액체배지와 같이 일반적으로 상업적으로 제조된 배지이다. 다른 규정 또는 합성 성장 배지가 또한 사용될 수도 있으며, 특정 미생물의 성장에 적절한 배지는 미생물학 또는 발효과학 분야의 당업자가 알고 있을 것이다.
발효는 호기조건 또는 혐기조건 하에 실시될 수 있으며, 일 실시예에서 혐기 또는 미세호기 조건으로 배양한다.
또한, 본 발명의 상기 배양은 비타민 B12를 조효소로 사용할 수 있다.
산업적 배치 및 연속 발효
배치식 발효방법을 이용할 수 있다. 고전적인 배치 발효는 배지의 조성이 발효시작시에 정해지며, 발효 동안 인공적으로 변경되지 않는 폐쇄 시스템이다. 따라서, 발효의 시작시에 배지에 원하는 유기체 또는 유기체들이 접종되며, 상기 시스템에 어떠한 것도 첨가하지 않고서 발효가 일어나는 것을 가능케 한다. 그러나, 전형적으로 "배치" 발효는 탄소 공급원의 첨가와 관련하여 배치식이며, pH 및 산소 농도와 같은 인자를 제어하려는 시도가 흔히 이루어진다. 배치시스템에서, 이 시스템의 대사산물 및 생물질 조성물은 발효가 중단되는 시점까지 끊임없이 변화한다. 배치배양 내에서 세포는 정적 유도기(static lag phase)를 통하여 고 성장기로, 그리고 마지막으로 성장 속도가 감소되거나 정지되는 정상기로 완화된다.
또한, 연속식 발효 방법에 적용가능한 것으로 생각된다. 연속식 발효는 규정된 발효 배지가 계속하여 생물 반응기에 첨가되고, 동일한 양의 조절 배지가 프로세싱을 위하여 동시에 제거되는 개방 시스템이다.
특히, 본 발명의 실시는 in vitro 상에서 또는 세포 표면상에서 직접 글리세롤로부터 3-HP 및 1,3-PDO를 동시에 생산할 수도 있다.
즉, 일 구체예에서, 상기 재조합미생물을 글루코오스가 함유된 배지에서 배양하여 dhaB, alhH 및 dhaT를 과발현시키는 단계 상기미생물로부터 glycerol dehydratease, aldehyde dehydrogenase 및 1,3-propandiol oxidoreductase 효소들을 수득하는 단계 및 상기 수득된 효소들을 in vitro 상에서 글리세롤과 반응시키는 단계를 포함하는, in vitro 상에서 3-HP 및 1,3-PDO를 동시에 생산하는 방법을 제공한다.
이러한 방법은 필요한 효소를 담체화(immobilization)하여 in vitro 상에 고정시킴으로써, in vitro 상에서 직접 목적하는 대사산물을 수득할 수 있게 한다.
그리고, 다른 구체예에서, 상기 재조합미생물 및 세포 표면발현(Cell surface display) 기술을 이용하여, 상기 미생물 세포표면에 glycerol dehydratease, aldehyde dehydrogenase 및 1,3-propandiol oxidoreductase 효소들을 발현시켜 글리세롤과 반응시킴으로써 3-HP 및 1,3-PDO를 동시에 생산할 수도 있다.
세포 표면 발현(Cell surface display)은 단백질이나 펩타이드 등을 적절한 표면발현 모체(surface anchoring motif)와 융합시켜서 그램 음성, 양성균, 곰팡이, 효모, 동물세포의 표면에 발현시키는 기술을 말한다. 예를 들어, 박테리아나 효모와 같은 미생물의 표면 단백질을 표면 발현 모체로 사용하여 외래 단백질을 미생물 표면에 안정적으로 발현시키는 것이다. 효소의 세포표면발현은 유전자 조작기술을 통해 빠르고 효과적으로 최종 생촉매로서의 효소제제를 직접 개량할 수 있다는 장점이 있다.
발현벡터로는 특히, 예를 들어, pCDF-Duet-1 및 pRSF-Duet-1 등을 발현벡터로 사용할 수 있다.
상기 설명한 바와 같이, 본 발명의 예에 따른 유전자 재조합 미생물은 3-HP 및 1,3-PDO 생산 유전자인 dhaB(glycerol dehydratease), alhH(aldehyde dehydrogenase) 및 dhaT(1,3-propandiol oxidoreductase)를 동시에 포함하여, 글리세롤 흡수율을 높임으로써 3-HP 및 1,3-PDO의 생산성을 현저히 증진시켰다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
특히, 하기 실시예에서는 본 발명에 따른 유전자를 발현시키기 위하여 특정 발현벡터와 대장균(Escherichia coli) 숙주세포만을 예시하였으나, 다른 종류의 발현벡터와 숙주세포를 사용하는 것 역시 당업자에게 자명한 사항이라 할 것이다.
일반적인 방법
실시예에서 사용한 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, 샘브룩 등의 문헌[Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989] (이하, 본 명세서에서 마니아티스로 지칭됨) 및 마니아티스의 상기 문헌과 실라비(Silhavy) 등의 문헌[Silhavy, et al., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1984] 및 오스벨(Ausubel) 등의 문헌[Ausubel et al ,Current Protocols in Molecular Biology, pub. by Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience, 1987]에 설명되어 있다.
박테리아 배양물의 유지 및 성장에 적합한 재료 및 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 하기 실시예에 사용하기에 적합한 기술은 문헌[Manual of Methods for General Bacteriology, Phillipp etal, eds., American Society for Microbiology, Washington, DC.,1994] 또는 문헌[Thomas D. Brock, Brock, Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1989)]에 설명된 바와 같이 찾아볼 수 있다.
실시예 1: 재조합 E. coli 제작
(1) 유전자 클로닝
K. pneumonia(KCTC1726)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머(dhaF, dhaR, gdrF, gdrR, dhaTF, dhaTR, Bioneer)를 사용하여 PCR을 수행하여 3-HP/1,3-PDO를 코딩하는 유전자인 dhaB1B2B3, gdrAB, dhaT를 증폭하였다. 또한, E. coli의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머(aldHF, aldHR, Bioneer)를 사용하여 PCR을 수행하여 3-HP/1,3-PDO를 코딩하는 유전자인 aldH를 증폭하였다.
(2) 재조합벡터 제작
A. pBJdhaBG
상기에서 증폭된 dhaB1B2B3 및 gdrAB 유전자를 포함하는 PCR 절편을 NcoI, HindIII 제한효소로 절단하고, 이를 같은 제한 효소로 자른 발현벡터(expression vector)인 pCDFDuet-1 (EMD chemicals)에 결합시켜 pCDFDuet-1dhaB1B2B3gdrAB를 제작하고, 이를 pBJdhaBG라고 명명하였다.
B. pJYaldH
상기에서 증폭된 aldH 유전자를 포함하는 PCR 절편을 NcoI, HindIII 제한효소로 절단하고, 이를 같은 제한 효소로 자른 발현벡터인 pCDFDuet-1 (EMD chemicals)에 결합시켜 pCDFDuet-1aldH을 제작하고, 이를 pJYaldH라고 명명하였다.
C. pBJdhaT
상기에서 증폭된 dhaT 유전자를 포함하는 PCR 절편을 NcoI, HindIII 제한효소로 절단하고, 이를 같은 제한 효소로 자른 발현벡터인 pCDFDuet-1 (EMD chemicals)에 결합시켜 pCDFDuet-1dhaT을 제작하고, 이를 pBJdhaT라고 명명하였다.
D. pBJdhaBG - glpF
상기에서 증폭된 dhaB1B2B3 및 gdrAB 유전자를 포함하는 PCR 절편을 NcoI, HindIII 제한효소로 절단하고, 이를 같은 제한 효소로 자른 발현벡터(expression vector)인 pCDFDuet-1 (EMD chemicals)에 결합시켜 pBJdhaBG를 제작하였다.
한편, glpF 유전자를 포함하는 PCR 절편을 NcoI, HindIII 제한효소로 절단하고, 이를 같은 제한 효소로 자른 pBJdhaBG에 결합시켜 pCDFDuet-1dhaB1B2B3gdrABglpF을 제작하고, 이를 pBJdhaBG-glpF라고 명명하였다.
E. pBJYaldH - dhaT
상기에서 증폭된 aldH 유전자를 포함하는 PCR 절편을 NcoI, HindIII 제한효소로 절단하고, 이를 같은 제한 효소로 자른 발현벡터인 pCDFDuet-1 (EMD chemicals)에 결합시켜 pJYaldH를 제작하였다.
한편, dhaT 유전자를 포함하는 PCR 절편을 NcoI, HindIII 제한효소로 절단하고, 이를 같은 제한 효소로 자른 pJYaldH에 결합시켜 pCDFDuet-1aldHdhaT 을 제작하고, 이를 pBJYaldH-dhaT라고 명명하였다.
(3) 재조합 균주의 제조
상기 제작한 재조합 벡터들을 전기천공 방법으로, 대장균 BL21(DE3) 균주 내로 형질전환하고, IPTG의induction에 의한 T7 promoter의 작동으로 높은 수준의 유전자 발현을 유도하였다.
실시예 2: 웨스턴 블럿 분석
실시에 1에 의해 제조된 재조합 균주들의 glycerol dehydratease, aldehyde dehydrogenase 및 1,3-propandiol oxidoreductase 효소 발현 여부를 확인하기 위하여 웨스턴 블럿 분석을 수행하여 SDS-PAGE상에서 확인하고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
실시예 3 : 형질전환된 대장균을 이용한 3- HP /1,3- PDO 생산
(1) 생산균주의 발효
상기 제조된 미생물 균주는 포도당 함유 배지에서 배양되며 IPTG (01. mM)를 첨가해주어 유전자군을 발현시켰다. 고농도로 배양된 세포들을 수집하여 소량의 포도당과 고농도의 glycerol이 존재하는 배지로 옮긴 후 2차 배양시켰다. 이때 상기 균주는 glycerol을 uptake하여 100% 3-HP 및 1,3-PDO로 전환시키며, 별도의 NAD+/NADH를 요구하지 않았다. 이때의 배양조건은 호기 또는 혐기 조건일 수 있다.
(2) HPLC 분석
3-HP/1,3-PDO 생산을 HPLC를 이용하여 분석하였다.
그 결과를 도 4,5,6 및 이하 표 1에 나타내었다.
Product strain
W.T strain pBJdhaBG + pJYaldH pBJdhaBG + pBJdhaT pBJdhaBG + pBJYaldH-dhaT
3-HP X(0 g/l) O(0.02 g/l) X(0 g/l) O(0.07 g/l)
1,3-PDO X(0 g/l) X(0 g/l) O(0.12 g/l) O(0.05 g/l)
실시예 4: In vitro 3- HP /1,3- PDO 동시 생산 시스템 구축
(1) 효소 담체화 기술이용
Glycerol를 3-HP 및 1,3-PDO로 전환시키는 3가지효소군을 과발현 및 분리/정제하여 일정양의 NAD+/NADH를 첨가한 후 in vitro상에서 glycerol과 반응시켰다. 또한 분리된 효소군은 다양한 담체에 immobilization될 수 있으면 그 상태로 glycerol과 반응하여 3-HP 및 1,3-PDO를 생산할 수 있다.
(2) 세포 표면 발현기술 이용
이와 더불어 미생물의 surface display 기술을 적용하여 세포표면에 효소군을 발현및 부착시켜 glycerol과 반응시켜 3-HP 및 1,3-PDO를 생산할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 실시예일 뿐이며, 이에 의해본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌점은 명백한 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC11836BP 20101231

Claims (17)

  1. 3-하이드록시프로피온산(3-HP) 및 1,3-프로판디올(1,3-PDO) 생산유전자를 포함하는, 3-HP 및 1,3-PDO 동시 생성용 재조합미생물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 3-하이드록시프로피온산(3-HP) 및 1,3-프로판디올(1,3-PDO) 생산 유전자는 dhaB(glycerol dehydratease), alhH(aldehyde dehydrogenase) 및 dhaT(1,3-propandiol oxidoreductase)인, 재조합미생물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 dhaB 유전자는 K. pneumoniae 또는 C. butyricum로부터 유래된, 재조합미생물.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 dhaT 유전자는 K. pneumoniae 로부터 유래된, 재조합미생물.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 alhH 유전자는 E. coli로부터 유래된, 재조합미생물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 재조합미생물은 자이모모나스(Zymomonas), 에스케리키아(Escherichia), 슈도모나스(Pseudomonas), 알칼리제네스(Alcaligenes), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 버크홀데리아(Burkholderia), 올리고트로파(Oligotropha), 클렙시엘라(Klebsiella), 피치아(Pichia), 칸디아(Candida), 한세눌라(Hansenula), 사카로마이세스(Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 속에 속하는 미생물인, 재조합미생물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 재조합미생물은 에스케리키아 콜리(Escherichia coli, 대장균)인, 재조합미생물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 유전자들은 벡터를 이용하여 독립적으로 또는 동시에 형질전환되거나 상기 재조합미생물 염색체상에 삽입되어 있는, 재조합미생물.
  9. 제1항의 재조합미생물을 탄소 기질을 함유하는 배지에서 배양함을 포함하는, 3-HP 및 1,3-PDO를 동시에 생산하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 탄소 기질은 글루코오스, 수크로오스, 셀룰로오스 및 글리세롤로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 탄소 기질인, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 배양은
    1차적으로 글루코오스를 함유하는 배지에서 배양하여 dhaB, alhH 및 dhaT를 과발현시키는 단계 및 2차적으로 글리세롤을 함유하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 배양은 혐기적 조건에서 수행되는, 방법.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 배양은 비타민 B12를 조효소로 사용하는 것인, 방법.
  14. 제9항에 있어서,
    상기 방법은 탄소기질이 3-HP 및 1,3-PDO로 90% 이상 전환되는, 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 탄소기질은 글리세롤인, 방법.
  16. 제9항에 있어서,
    제1항의 재조합미생물을 글루코오스가 함유된 배지에서 배양하여 dhaB, alhH 및 dhaT를 과발현시키는 단계;
    상기 미생물로부터 glycerol dehydratease, aldehyde dehydrogenase 및 1,3-propandiol oxidoreductase 효소들을 수득하여 고정화시키는(immobilization) 단계; 및
    상기 고정화된 효소들을 in vitro 상에서 글리세롤과 반응시키는 단계를 포함하는,
    in vitro 상에서 3-HP 및 1,3-PDO를 동시에 생산하는 방법:
  17. 제1항의 재조합미생물 및 세포 표면발현(cell surface display) 기술을 이용하여, 상기 미생물 세포표면에 glycerol dehydratease, aldehyde dehydrogenase 및 1,3-propandiol oxidoreductase 효소들을 발현시켜 글리세롤과 반응시키는 단계를 포함하는, 3-HP 및 1,3-PDO를 동시에 생산하는 방법.

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