KR102390716B1 - 코리스메이트-유도된 산물의 생산을 위한 유전적으로 조작된 미생물들 - Google Patents

코리스메이트-유도된 산물의 생산을 위한 유전적으로 조작된 미생물들 Download PDF

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Abstract

본 발명은 코리스메이트-유도된 산물들, 이를 테면 파라-히드록시벤조산, 살리실레이트, 2-아미노벤조에이트, 2,3-디히드록시벤조에이트그리고 4-히드록시시클로헥산 카르복실산을 생산하는 유전적으로 조작된 미생물과 그 방법을 제공한다. 전형적으로, 상기 미생물은 (a) 외생성 코리스메이트 피루베이트 분해효소, (b) 외생성 이소코리스메이트 합성효소, (c) 외생성 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소, 그리고 (d) 파괴성 돌연변이를 포함하는 프레페네이트 합성효소중 적어도 하나를 포함한다.

Description

코리스메이트-유도된 산물의 생산을 위한 유전적으로 조작된 미생물들
관련 출원들에 대한 교차 참조
본 출원은 2015년 5월 27일자로 제출된 미국 가특허 출원 번호 62/167,101에 대해 우선권을 주장하며, 이 출원의 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.
발명의 분야
본 발명은 미생물 발효, 구체적으로 가스 기질의 미생물 발효에 의한 코리스메이트(chorismate)-유도된 산물들을 만드는 방법 및 유전적으로 조작된 미생물들에 관한 것이다.
현재 당(sugar)이나 셀룰로오스-기반 공급공급원을 생산하기 위해 식품 또는 비-식품 작물을 사용하는 생물학적으로 생산된 화학 물질 상품은 토지 이용, 식량 확보, 공급 변동성 및 환경 문제와 관련된 단점을 가지고 있다.
일산화탄소 (CO) 및/또는 이산화탄소 (CO2) 및 수소 (H2)를 함유하는 가스를 다양한 연료 및 화학 물질로 전환시키는데 촉매 공정이 사용될 수 있다는 것은 오랫동안 인지되어 왔다. 그러나, 미생물은 또한 그러한 기체를 생물학적으로 연료 및 화학 물질로 전환시키는데 사용될 수도 있다. 생물학적 공정은 촉매 공정과 비교하여 더 높은 특이성, 더 높은 수율, 더 낮은 에너지 비용 및 중독에 대한 촉매의 더 큰 저항성을 포함한, 몇 가지 이점이 있다.
CO는 석탄, 오일 및 오일-유래 산물과 같은 유기 물질의 불완전 연소의 자유 에너지-풍부한 주요 부산물이다. 예를 들면, 호주의 철강 산업은 매년 50 만 톤 이상의 CO를 만들고, 이를 대기로 방출한다고 보고된 바 있다.
CO를 유일한 탄소원으로 하여 성장할 수 있는 미생물의 능력이 1903년에 처음 발견되었다. 이것은 나중에 자가영양성(autotrophic) 성장의 아세틸 코엔자임 A (아세틸-CoA) 생화학적 경로를 사용하는 미생물의 특성으로 확인되었는데, 이것은 우드-융둘 (Wood-Ljungdahl) 경로로도 알려져 있다. 일산화탄소영양성광합성, 메탄생성 및 초산생성 미생물을 비롯한 많은 수의 혐기성 미생물이 CO를 CO2, H2, 메탄, n-부탄올, 아세테이트 및 에탄올과 같은 다양한 최종 산물로 대사시키는 것으로 나타났다.
방향족 화합물 파라-히드록시벤조산 (pHBA)은 액정(liquid crystal) 중합체에 사용되는 주요 단량체이며, 또한 일반적으로 파라벤으로 불리는 파라히드록시벤조에이트 또는 파라히드록시벤조산 에스테르의 제조를 위한 전구물질로 사용된다. 액정 중합체는 여러 용도를 갖는 케블러(Kevlar)와 벡트란(Vectran)을 포함한다. 파라벤 및 및 그 염은 화장품, 제약 및 식품 산업을 포함한 다양한 산업 분야에서 사용된다. 그들은 효과적인 보존제이며, 화장품 및 식품 제제의 살균 및 살진균 효과를 위해 사용될 수 있다.
따라서, pHBA 및 다른 고-부가 가치의 코리메이트-유도된 산물을 생산하기 위한 추가적인 미생물 및 방법이 여전히 요구된다.
본 발명은 코리스메이트-유도된 생산물들을 만들 수 있는 유전적으로 조작된 미생물을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 적어도 하나 코리스메이트-유도된 생산물을 만들 수 있는 유전적으로 조작된 미생물을 제공하며, 이때 상기 세균은 (a) 외생성 코리스메이트 피루베이트 분해효소 (EC 4.1.3.40), (b) 외생성 이소코리스메이트 합성효소 (EC　5.4.4.2), (c) 외생성 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소 (EC 4.2.99.21), 그리고 (d) 파괴성 돌연변이를 포함하는 프레페네이트 합성효소 (EC　5.4.99.5)중 적어도 하나를 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 유전적으로 조작된 미생물은 C1-고정 세균, 이를 테면 C1-함유 가스 기질의 발효에 의해 적어도 하나 코리스메이트-유도된 산물을 만들 수 있는 클로스트리듐(Clostridium) 세균이다.
예를 들면, 상기 코리스메이트 피루베이트 분해효소는 ubiC일 수 있고, 상기 이소코리스메이트 합성효소는 pchA일 수 있고, 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소는 pchB일 수 있고, 그리고 프레페네이트 합성효소는 pheA일 수 있다. 프레페네이트 합성효소에서 파괴성 돌연변이(disruptive mutation)는 프레페네이트 합성효소의 발현 또는 활성을 감소 또는 제거할 수 있다. 이러한 파괴성 돌연변이로 인하여 모계 세균 및/또는 실질적으로 티로신 또는 페닐알라닌을 만들지 않는 세균과 비교하였을 때, 프레페네이트 또는 프레페네이트-유도된 산물들의 생산량이 감소된 세균이 만들어질 수 있다.
본 발명의 미생물은 (a) 상기 외생성 코리스메이트 피루베이트 분해효소, (b) 상기 외생성 이소코리스메이트 합성효소, (c) 상기 외생성 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소, 그리고 (d) 파괴성 돌연변이를 포함하는 프레페네이트 합성효소중 적어도 하나를 암호화하는 적어도 하나의 핵산을 포함할 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 핵산은 클로스트리듐에서 발현에 최적화되도록 코돈 최적화된다.
상기 코리스메이트-유도된 산물은 코리스메이트로부터 직접 또는 간접적으로 만들어지는 임의의 산물이다. 구체적으로, 상기 코리스메이트-유도된 산물은 6-원자의 탄소 환, 예를 들면, 카르복실 기 또는 카르복실레이트 음이온으로 치환되고, 그리고 하나 또는 그 이상의 OH 기 및/또는 하나 또는 그 이상의 NH2 기로 추가 치환된, 벤젠 또는 시클로헥산 환을 포함할 수 있다. 코리스메이트-유도된 산물들은 파라-히드록시벤조산, 살리실레이트, 2-아미노벤조에이트, 디히드록시벤조에이트그리고 4-히드록시시클로헥산 카르복실산을 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 코리스메이트 피루베이트 분해효소, ubiC를 발현시키고, 파라-히드록시벤조산의 코리스메이트-유도된 산물을 만든다. 한 구체예에서 본 발명의 미생물은 피드백-비감성(feedback-insensitive) DAHP 합성효소를 더 발현시킨다.
한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 이소코리스메이트 합성효소, pchA 및 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소, pchB를 발현시키고, 살리실레이트의 코리스메이트-유도된 산물을 만든다. 한 구체예에서 본 발명의 미생물은 피드백-비감성(feedback-insensitive) DAHP 합성효소를 더 발현시킨다.
한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 파괴성 돌연변이를 포함하는 프레페네이트 합성효소를 포함하며, 2-아미노벤조에이트, 2,3-디히드록시벤조에이트3,4-디히드록시벤조에이트 및 4-히드록시시클로헥산 카르복실산의 하나 또는 그 이상의 코리스메이트-유도된 산물을 만든다.
한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 모계 미생물에 의해 만들어지지 않는 적어도 하나 코리스메이트-유도된 산물을 만들거나, 또는 모계 미생물에 의해 만들어지는 양보다 더 많은 양으로 적어도 하나 코리스메이트-유도된 산물을 만든다.
한 구체예에서, 본 발명의 세균은 C1-고정 모계 세균으로부터 유도된다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 세균은 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리듐 리중다레이(Clostridium ljungdahlii), 그리고 클로스트리듐 라가스다레이(Clostridium ragsdalei)로 구성된 집단에서 선택된 모계 세균으로부터 유도된다. 특별히 바람직한 구체예에서, 본 발명의 세균은 DSMZ 수탁 번호 DSM23693으로 기탁된 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum) 모계 세균으로부터 유도된다.
본 발명은 C1-함유 가스 기질 존재하여 본 발명의 미생물을 발효시키는 것을 포함하는 발효 산물을 만드는 방법을 더 제공한다. 일반적으로, 상기 발효 산물은 코리스메이트-유도된 산물이다. 바람직한 구체예에서, 상기 가스 기질은 적어도 하나 C1 탄소 공급원을 포함한다.
도 1은 클로스트리디아(clostridia)에서 자생(native) 쉬키메이트(shikimate) 경로를 통하여 코리스메이트를 만드는 것을 보여주는 도표다.
도 2는 유전적으로 조작된 클로스트리듐 세균에서 pHBA 생산 경로를 보여주는 도표다.
도 3은 유전적으로 조작된 클로스트리듐 세균에서 살리실레이트 생산 경로를 보여주는 도표다.
도 4는 pheA를 암호화하는 핵산에 파괴성 돌연변이가 포함된 유전적으로 조작된 클로스트리듐 세균에서 방향족 산물들의 생산 경로를 보여주는 도표다.
도 5는 정통(authentic) pHBA 표준의 정량화를 보여주는 표준 곡선 그래프다.
도 6a는 정통 표준의 총 이온 카운트를 나타내는 그래프이다: (i) C.　오토에타노게눔 LZ1561 배양 배지의 상청액에서 준비된 정통 표준의 pHBA (트리메틸실레이트화된), (ii) 물에서 준비된 정통 표준의 pHBA (트리메틸실레이트화된), 그리고 (iii) 트리메틸실레이트화된 pHBA의 질량 스펙트럼.
도 6b는 발효 시료 및 표준의 선택된 이온 모니터링을 보여주는 그래프다: (i) pARO_01 플라스미드없는 C.　오토에타노게눔 LZ1561, (ii)와 (iii) pARO_01 플라스미드를 품고 있는 C.　오토에타노게눔 LZ1561에서 얻은 시료, (iv) 정통 표준의 pHBA, 그리고 (v) LZ1561/pARO_01에서 pHBA 및 pHBA 정점에 대한 NIST 데이터베이스 엔트리 간의 총 이온 카운트 비교.
도 7은 pARO_01 플라스미드의 그림이다. 상기 코리스메이트 피루베이트 분해효소 (ubiC) 및 피드백-비감성 DAHP 합성효소 (aroG*)는 우드-융둘 프로모터 (Pwl)의 제어 하에 있다. 다른 셔틀 벡터 특징들 또한 나타낸다.
도 8은 테스트 균주들에서 바이오매스(biomass) 축적을 보여주는 그래프다. 바이오매스는 상이한 시점에서 600nm에서 배양 시료의 흡광도를 측정함으로서 평가되었다. 데이터 포인터는 n=3 레플리케이트(replicate) 배양물의 평균 ± 1 표준 편차를 나타낸다. LZ1561은 형질변환안된 C.　오토에타노게눔 LZ1561을 지칭한다. pARO_01(1) 및 pARO_01(2)는 pARO_01 플라스미드로 형질변환된 C.　오토에타노게눔 LZ1561의 생물학적 레플리케이트이다.
도 9a 및 9b는 테스트 균주들에서 p-히드록시벤조에이트 축척을 나타내는 그래프다. 도 9a는 24, 96, 144, 그리고 192 시간(hr) 시점에서 각 시료에서 탐지된 pHBA의 정량화를 나타낸다. 3가지 레플리케이트 배양물은 음성 대조균주 (C.　오토에타노게눔 LZ1561) 그리고 pARO_01을 품고있는 C.　오토에타노게눔 LZ1561의 2개 생물학적 레플리케이트의 시료다. 도 9b는 n=3 기술적 레플리케이트의 평균 ± 1 SD이다.
도 10은 pheA를 암호화하는 핵산에 파괴성 돌연변이가 포함된 유전적으로 조작된 클로스트리듐 세균에서 방향족 화합물들의 생산을 보여주는 도표다. ΔpheA 균주는 4-히드록시 시클로헥산 카르복실산, 2-아미노벤조산, 그리고 3,4-디히드록시벤조산을 만들지만, 대조균주 (LZ1561)는 만들지 않는다.
도 11a는 살리실레이트 생합성 경로의 유도와 함께, 그리고 이 경로의 유도없이, 살리실레이트 생산 균주의 바이오매스 성장을 보여주는 그래프다.
도 11b는 살리실레이트 생합성 경로의 유도와 함께, 그리고 이 경로의 유도없이, 테스트 균주의 액체 배양물 안에서 살리실레이트 축척 차이를 보여주는 그래프다.
도 12는 pheA를 암호화하는 핵산에 파괴성 돌연변이가 포함된 유전적으로 조작된 클로스트리듐 세균에서 발효에 의해 생산된 4-히드록시 시클로헥산 카르복실산, 2-아미노벤조산, 그리고 3,4-디히드록시벤조산의 농도를 보여주는 그래프다.
도 13은 코리스메이트 피루베이트 분해효소 (EC 4.1.3.40)의 예시적인 공급원을 확인하는 표다.
도 14는 이소코리스메이트 합성효소 (EC 5.4.4.2)의 예시적인 공급원을 확인하는 표다.
도 15는 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소 (EC 4.2.99.21)의 예시적인 공급원을 확인하는 표다.
클로스트리디아(Clostridia) 는 쉬키메이트 경로를 통하여 포스포에놀피루베이트와 에리트로스-4-포스페이트로부터 코리스메이트를 자생적으로 생산하는데, 이것은 방향족 아미노산 트립토판, 티로신, 그리고 페닐알라닌의 전구물질이다 (도 1). 이 경로는 Bentley,　Crit Rev Biochem Mol Biol, 25.5: 307-384, 1990에서 상세하게 기술된다. 본 발명은 가스 기질의 발효에 의해 적어도 하나 코리스메이트-유도된 산물을 만들 수 있는 유전적으로 조작된 세균을 제공한다.
발명자들은 코리스메이트-유도된 산물이 실질적으로 생산될 수 있고, C1-탄소 공급원로부터 회수될 수 있음을 증명하였다. 본 발명은 주요 탄소 및 에너지 공급원으로써 C1-함유 가스 기질을 이용하여 적어도 하나 코리스메이트-유도된 산물을 만드는 방법을 제공한다. 이 방식에서, 본 발명은 당- 또는 셀룰로오스-기반의 기질에 의존하는 공정보다 여러가지 장점을 갖는다. 예를 들면, 당- 또는 셀룰로오스-기반의 기질은 전형적으로 식품 (가령, 사탕수수)에 또한 유용하며, 이들의 집중적인 토지 이용은 환경에 부정적인 영향을 미친다. 또한, 본 발명은 임의로 폐가스 (예를 들어, 산업 공정으로부터 나오는 CO)를 사용하여 코리스메이트-유도된 산물의 제조를 위한 대안적인 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 폐가스로부터 수입원을 제공하고, 또한 가스가 대기로 타오를 경우 발생되는 탄소 배출을 줄이기 위해 폐가스 안에 탄소를 포획한다.
종속영양성(Heterotrophic) 미생물들, 이를 테면 대장균(E.　coli )과 S. 세르비시에(s.　cerevisiae)는 해당작용을 통하여 상대적으로 높은 수준의 ATP를 만든다. 대조적으로, C1-탄소 공급원 (가령, CO 또는 CO2)를 이용하는 미생물들은 ATP 이용성이 저조하다. 예를 들면, 전형적인 일산화탄소영양성 미생물인 C.　오토에타노게눔(C.　autoethanogenum)의 반응 역학 분석에서 pHBA, 코리스메이트-유도된 산물)을 생산할 때, 고정된 CO mol 당 -0.4 ATP의 예상 ATP 수율을 제시한다. 이와 같이, 에너지 제약으로 인해 pHBA가 생성되지 않을 것으로 예상된다. 유사하게, 자가영양성 조건 하에서 그러한 화합물을 생산하는 대사 부하로 인하여, 일산화탄소영양성 미생물에 의해 다른 코리스메이트-유도된 산물이 생산될 것으로 기대되지는 않는다. 그러나, 놀랍게도, 본 발명자들은 가스 기질로부터 다수의 코리스메이트-유도된 산물들이 만들어질 수 있음을 보여 주었다. 또한, 전술한 산물은 산업 폐기물 가스로부터 제조될 수 있고, 이점은 다른 기질에 비해 실용적, 경제적 및 환경적 이점을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 (a) 외생성 코리스메이트 피루베이트 분해효소를 암호화하는 핵산, (b) 외생성 이소코리스메이트 합성효소 (a.k.a., 이소코리스메이트 뮤타제)를 암호화하는 핵산, (c) 외생성 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소를 암호화하는 핵산, 그리고 (d) 파괴성 돌연변이를 포함하는 프레페네이트 합성효소를 암호화하는 핵산중 최소 한가지를 도입시킴으로써, 적어도 하나 코리스메이트-유도된 산물을 만들 수 있는 유전적으로 조작된 미생물들을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 상기 유전적으로 조작된 미생물은 가스 기질의 발효에 의해 적어도 하나 코리스메이트-유도된 산물을 만들 수 있는 C1-고정 세균이다. 바람직한 구체예들에서, 상기 C1-고정 세균은 클로스트리듐 세균이다.
“코리스메이트-유도된 산물(chorismate-derived product)” 또는 “코리스메이트로부터 유도된 산물(product derived from chorismate)”, 또는 유사한 용어들은 코리스메이트 (또는 코리스민산)으로부터 직접 또는 간접적으로 만들어진 산물들을 포괄한다. 코리스메이트-유도된 산물들은 전형적으로 6-원자의 탄소 환, 예를 들면, 카르복실 기 또는 카르복실레이트 음이온으로 치환되고, 그리고 하나 또는 그 이상의 OH 기 및/또는 하나 또는 그 이상의 NH2 기로 추가 치환된, 벤젠 또는 시클로헥산 환을 포함할 수 있다. 구체적으로, 코리스메이트-유도된 산물들은 파라-히드록시벤조산, 살리실레이트, 2-아미노벤조에이트, 2,3-디히드록시벤조에이트3,4-디히드록시벤조에이트그리고 4-히드록시시클로헥산 카르복실산을 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
본 발명의 미생물은 유비퀴논 생합성의 제 1 단계에서 코리스메이트로부터 파라-히드록시벤조산과 피루베이트로의 전환을 촉매하는 외생성 코리스메이트 피루베이트 분해효소 효소 (EC 4.1.3.40)를 포함할 수 있다. 상기 효소는 이러한 효소를 갖는 임의의 미생물로부터 유도될 수 있다. 상기 효소는 UbiC 효소일 수 있다. UbiC 효소는 대장균(Escherichia coli), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 씨트로박터 플레운디(Citrobacter freundii), 또는 UbiC 효소를 갖는 임의의 다른 미생물로부터 유도될 수 있다. 한 구체예에서, UbiC 효소는 대장균(escherichia coli)으로부터 유도되며, 서열번호: 1 또는 이의 기능적 등가 변이체를 포함한다.
유사하게, 본 발명의 미생물은 외생성 코리스메이트 피루베이트 분해효소를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 상기 핵산은 코리스메이트 피루베이트 분해효소 유전자를 갖는 임의의 미생물로부터 유도된 코리스메이트 피루베이트 분해효소 유전자일 수 있다. 상기 코리스메이트 피루베이트 분해효소 유전자는 ubiC 유전자일 수 있다. 상기 ubiC 유전자는 대장균(Escherichia coli), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 씨트로박터 플레운디(Citrobacter freundii), 또는 UbiC 유전자를 갖는 임의의 다른 미생물로부터 유도될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 ubiC 유전자는 대장균(Escherichia coli)으로부터 유도되며, 서열번호: 2 또는 이의 기능적 등가 변이체를 포함한다.
상기 UbiC 효소 또는 ubiC 유전자는 용해도, 안정성, 또는 다른 유전자/효소 성질을 개선시키기 위하여 또한 변형(가령, 돌연변이)될 수 있다. 이러한 변형은 산물의 역가를 증가시킬 수 있다. 실시예 4는 파라-히드록시벤조산 잔류(retention)를 통하여 산물 억제를 감소시키도록 UbiC 효소를 조작하는 실험 프로토콜을 기술한다. 한 가지 특정 변형은 ubiC 유전자를 조작하여, 시스테인 대신 두 개의 표면-활성 세린을 갖는 UbiC 효소를 발현시키는 것이다. 상기 세린 잔기로 인하여 단백질 응집은 감소되고, 이로 인하여 용해도는 개선된다. 따라서, 특정 구체예에서, UbiC 효소는 적어도 하나 표면-활성 시스테인을 세린으로 대체시키는 돌연변이를 포함한다.
대체 구체예에서, 상기 코리스메이트 피루베이트 분해효소 (EC 4.1.3.40)는 예를 들면, 도 13에서 확인되는 임의의 공급원이거나, 또는 이로부터 유도될 수 있다.
외생성 코리스메이트 피루베이트 분해효소 (가령, ubiC) 또는 외생성 코리스메이트 피루베이트 분해효소를 암호화하는 핵산 (가령, ubiC)의 도입으로 본 발명의 미생물에 의해 코리스메이트-유도된 산물인 파라-히드록시벤조산이 생산된다. 파라-히드록시벤조산의 생산은 도 2에서 설명된다. 아세토박테리움 우디(Acetobacterium woodii), 알칼리박테이룸 바치(Alkalibaculum bacchii), 블라우티아 프루덕타(Blautia producta), 부티리박테리움 메틸로트로피쿰(Butyribacterium methylotrophicum), 클로스트리듐 아세티쿰(Clostridium aceticum), 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 카르복시디보란스(Clostridium carboxidivorans), 클로스트리듐 코스카티(Clostridium coskatii), 클로스트리듐 드라케이(Clostridium drakei), 클로스트리듐 포르미코아세티쿰(Clostridium formicoaceticum), 클로스트리듐 리중다레이, 클로스트리듐 마그눔(Clostridium magnum), 클로스트리듐 라가스다레이, 클로스트리듐 스카토로게네스(Clostridium scatologenes), 유박테리움 리모숨(Eubacterium limosum), 모오렐라 테르마우토트로피카(Moorella thermthermautotrophica), 모오렐라 테르모아세티카(Moorella thermoacetica), 옥소박터 펜니기(Oxobacter pfennigii), 스포로무사 오바타(Sporomusa ovata), 스포로무사 실바세티카(Sporomusa silvacetica), 스포로무사 스페로이데스(Sporomusa sphaeroides), 그리고 테르모안에어로박터 키부이(Thermoanaerobacter kivui) 종들을 포함하는 C1 고정 세균은 자생적으로 파라-히드록시벤조산을 만들지 않는다. 사실, 유비퀴논은 일반적으로 호기성 호흡 미생물에서만 생산되기 때문에, 일산화탄소영양성 미생물에서는 코리스메이트 피루베이트 분해효소를 일반적으로 찾아볼 수 없다. 아미노산 대신 pHBA를 생산하는 코리스메이트의 전환은 미생물의 성장이나 생존에 악영향을 미칠 것으로 예상되지만, 본 발명자들은 이들 미생물이 표준 조건 하에서 생존 및 성장을 현저하게 저해하는 정도로 영향을 주지 않는다는 것을 보여 주었다.
파라-히드록시벤조산은 또한 예를 들면, pHBA, 4-히드록시벤조산, p-히드록시벤조산, 또는 파라-히드록시벤조에이트로 지칭될 수 있다. 본원에서 사용되는 이들 용어중 임의의 것과 관련하여, 이 분자의 산 및 음이온 형태 모두가 포함된다.
Figure 112017116259310-pct00001
본 발명의 미생물은 코리스메이트의 이소코리스메이트로의 전환을 촉매하는 이소코리스메이트 뮤타제(EC 5.4.4.2)로도 지칭되는, 외생성 이소코리스메이트 합성효소 효소를 포함할 수 있다. 상기 효소는 이러한 효소를 갖는 임의의 미생물로부터 유도될 수 있다. 상기 효소는 PchA 효소일 수 있다. PchA 효소는 슈도모나스 에어루기노사 또는 PchA 효소를 보유하는 임의의 다른 미생물로부터 유도될 수 있다. 한 구체예에서, PchA 효소는 슈도모나스 에어루기노사 (Pseudomonas aeruginosa)로부터 유도되며, 서열번호: 3 또는 이의 기능적 등가 변이체를 포함한다.
유사하게, 본 발명의 미생물은 외생성 이소코리스메이트 합성효소를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 상기 핵산은 이소코리스메이트 합성효소 유전자를 갖는 임의의 미생물로부터 유도된 이소코리스메이트 합성효소 유전자일 수 있다. 이소코리스메이트 합성효소 유전자는 pchA 유전자일 수 있다. pchA 유전자는 슈도모나스 에어루기노사 또는 pchA 유전자를 보유하는 임의의 다른 미생물로부터 유도될 수 있다. 한 구체예에서, pchA 유전자는 슈도모나스 에어루기노사로부터 유도되며, 서열번호: 4 또는 이의 기능적 등가 변이체를 포함한다.
대체 구체예에서, 이소코리스메이트 합성효소 (EC 5.4.4.2)는 도 14에서 확인되는 임의의 공급원이거나, 또는 이로부터 유도될 수 있다.
본 발명의 미생물은 이소코리스메이트를 살리실레이트와 피루베이트로의 전환을 촉매하는 외생성 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소 효소 (EC 4.2.99.21)를 포함할 수 있다. 상기 효소는 이러한 효소를 갖는 임의의 미생물로부터 유도될 수 있다. 상기 효소는 PchB 효소일 수 있다. PchB 효소는 슈도모나스 에어루기노사 또는 PchB 효소를 보유하는 임의의 다른 미생물로부터 유도될 수 있다. 한 구체예에서, PchB 효소는 슈도모나스 에어루기노사 로부터 유도되며, 서열번호: 5 또는 이의 기능적 등가 변이체를 포함한다.
유사하게, 본 발명의 미생물은 외생성 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 상기 핵산은 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소 유전자를 갖는 임의의 미생물로부터 유도된 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소 유전자일 수 있다. 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소 유전자는 pchB 유전자일 수 있다. pchB 유전자는 슈도모나스 에어루기노사 또는 pchB 유전자를 보유하는 임의의 다른 미생물로부터 유도될 수 있다. 한 구체예에서, pchB 유전자는 슈도모나스 에어루기노사로부터 유도되며, 서열번호: 6 또는 이의 기능적 등가 변이체를 포함한다.
대체 구체예에서, 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소 (EC 4.2.99.21) 예를 들면, 도 15에서 확인되는 임의의 공급원이거나, 또는 이로부터 유도될 수 있다.
(1) 외생성 이소코리스메이트 합성효소 (가령, pchA) 및 (2) 외생성 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소 (가령, pchB)의 도입으로 본 발명의 미생물에 의한 코리스메이트-유도된 산물인, 살리실레이트가 생산된다. 살리실레이트의 생산은 도 3에서 설명되며, 이에 따르면 코리스메이트는 이소코리스메이트 합성효소에 의해 이소코리스메이트로 전환되고, 그 다음 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소에 의해 살리실레이트와 피루베이트로 더 전환된다. 아세토박테리움 우디, 알칼리박테이룸 바치, 블라우티아 프루덕타, 부티리박테리움 메틸로트로피쿰, 클로스트리듐 아세티쿰, 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 카르복시디보란스, 클로스트리듐 코스카티, 클로스트리듐 드라케이, 클로스트리듐 포르미코아세티쿰, 클로스트리듐 리중다레이, 클로스트리듐 마그눔, 클로스트리듐 라가스다레이, 클로스트리듐 스카토로게네스, 유박테리움 리모숨, 모오렐라 테르마우토트로피카, 모오렐라 테르모아세티카, 옥소박터 펜니기, 스포로무사 오바타, 스포로무사 실바세티카, 스포로무사 스페로이데스, 그리고 테르모안에어로박터 키부이 종이 포함된 C1 고정 세균은 자생적으로 살리실레이트를 생산하지 않는다.
살리실레이트는 예를 들면, 2-히드록시벤조에이트살리실산, 또는 2-히드록시벤조산으로도 지칭될 수 있다. 본원에서 사용되는 이들 용어중 임의의 것과 관련하여, 이 분자의 산 및 음이온 형태 모두가 포함된다.
Figure 112017116259310-pct00002
(d) 파괴성 돌연변이를 포함하는 프레페네이트 합성효소
본 발명의 미생물은 파괴성 돌연변이가 포함된 프레페네이트 합성효소 효소 (EC　5.4.99.5)를 포함할 수 있다. 프레페네이트 합성효소 전형적으로 코리스메이트의 프레페네이트로의 전환 (가령, 코리스메이트 ↔ 프레페네이트 뮤타제 반응)을 촉매한다. 따라서, 파괴성 돌연변이가 포함된 프레페네이트 합성효소는 코리스메이트를 프레페네이트로 전환시키지 못하거나, 또는 전환 능력이 떨어진다. 파괴성 돌연변이를 포함하는 프레페네이트 합성효소는 파괴성 돌연변이가 포함된 pheA일 수 있다. 프레페네이트 합성효소는 코리스메이트 뮤타제라고도 지칭될 수 있다.
일부 구체예들에서, pheA는 프레페네이트 합성효소 (가령, 코리스메이트 뮤타제) (EC　5.4.99.5) 및 프레페네이트 탈수효소 (EC　4.2.1.51) 반응 모두를 실행하는 이중기능성 효소일 수 있다. 별도 효소에 의해 이들 두 반응이 실행되는 미생물에서, EC　5.4.99.5 활성을 해체시키면 프레페네이트 또는 프레페네이트의 하류 화합물의 생산이 상당히 감소하거나, 또는 생산되지 않는 결과를 초래할 것이고, 한편 EC　4.2.1.51 활성만 해체시키면 프레페네이트는 여전히 생산될 수 있기 때문에 동일한 표현형을 얻지 못할 것이다. 한 구체예에서, pheA는 클로스트리듐 오토에타노게눔으로부터 유도되며, 서열번호: 11 또는 이의 기능적 등가 변이체를 포함한다.
유사하게, 본 발명의 미생물은 파괴성 돌연변이를 포함하는 프레페네이트 합성효소를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 상기 핵산은 파괴성 돌연변이가 포함된 pheA 유전자일 수 있다. 한 구체예에서, 상기 파괴성 돌연변이는 pheA 유전자의 녹아웃(knockout) 돌연변이다. 한 구체예에서, pheA 유전자는 클로스트리듐 오토에타노게눔로부터 유도되며, 서열번호:　10 또는 코돈-최적화된 또는 이의 기능적 등가 변이체를 포함한다.
파괴성 프레페네이트 합성효소로 인하여 페닐알라닌 및 티로신의 생산은 감소 또는 생산되지 않는다. 놀랍게도, 파괴성 프레페네이트 합성효소로 인하여 일반적으로 추가 산물들이 생산되지 않거나, 또는 매우 낮은 수준으로 생산되는 결과를 또한 초래한다.
구체적으로, 프레페네이트 합성효소 (가령, pheA) 또는 프레페네이트 합성효소를 암호화하는 핵산 (가령, pheA) 안에 파괴성 돌연변이의 도입으로 본 미생물에 의해 2-아미노벤조에이트, 디히드록시벤조에이트 그리고 4-히드록시시클로헥산 카르복실산중 하나 또는 그 이상이 생산되는데, 이들 모두 코리스메이트-유도된 산물이다. 이들 산물들의 생산 경로는 도 4에서 설명된다. 클로스트리디아(clostridia) 이를 테면 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 리중다레이, 그리고 클로스트리듐 라가스다레이 종을 포함한 많은 미생물들은 자생적으로 이들 산물을 만들지 않거나, 또는 이들 산물을 매우 낮은 수준으로 만든다.
pheA의 예시적인 공급원이 제시된다. 그러나, pheA에 대한 다른 적합한 공급원이 이용가능할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, 프레페네이트 탈수 효소는 다음의 공급원 중 어느 하나이거나, 또는 이로부터 유도될 수 있으며, 그 서열은 공개적으로 이용 가능하다:
Figure 112017116259310-pct00003
Figure 112017116259310-pct00004
2-아미노벤조에이트는 예를 들면, 2-아미노벤조산, o-아미노벤조산, 안트라닐산, 안트라닐레이트, 또는 비타민 L1로도 또한 지칭될 수 있다. 본원에서 사용되는 이들 용어중 임의의 것과 관련하여, 이 분자의 산 및 음이온 형태 모두가 포함된다.
Figure 112017116259310-pct00005
디히드록시벤조에이트는 예를 들면, 2,3-디히드록시벤조에이트, 2,3-디히드록시벤조산, 3,4-디히드록시벤조에이트, 3,4-디히드록시벤조산 또는 트로토카테큐산으로도 지칭될 수 있다. 본원에서 사용되는 이들 용어중 임의의 것과 관련하여, 이 분자의 산 및 음이온 형태 모두가 포함된다.
Figure 112017116259310-pct00006
Figure 112017116259310-pct00007
Figure 112017116259310-pct00008
4-히드록시시클로헥산 카르복실산은 예를 들면, cis-4-히드록시시클로헥산 카르복실산 또는 4-히드록시시클로헥산-1-카르복실레이트로도 또한 지칭될 수 있다. 본원에서 사용되는 이들 용어중 임의의 것과 관련하여, 이 분자의 산 및 음이온 형태 모두가 포함된다.
Figure 112017116259310-pct00009
또 다른 구체예에서, 본 발명의 미생물은 쉬키메이트 경로 (도 1)의 첫번째 단계를 촉매하는 피드백-비감성 DAHP 합성효소 DAHP 합성효소를 암호화하는 핵산을 더 포함할 수 있는데, 이때 에리트로스-4-포스페이트와 포스포에놀피루베이트는 3-데옥시-D-아라비노헵토소네이트-7-포스페이트로 전환된다. 본 발명자들은 상기 경로에서 이 단계는 대장균의 경우 설명된 바와 같이(Hu et al. J. Basic Microbiol. 2003, 43:399-406), 방향족 아미노산 (트립토판, 페닐알라닌, 티로신)에 의한 피드백 억제를 받는 것으로 본다. 따라서, 선행기술에 근거하여 본 발명자들은 피드백 비감수성 DAHP 합성 효소를 개발하였으며, 이로써 상기 피드백 억제에 의해 감소된 코리스메이트-유도된 산물로의 유출 위험이 감소될 것으로 본다. 적절한 DAHP 합성효소를 암호화하는 핵산은 당분야의 당업자들에게 공지되어 있다. 그러나, 예시를 통하여, DAHP 합성효소가 암호화된 핵산은 대장균, 클로스트리듐 베이헤린키(Clostridium beijerinckii), 또는 사카로미세스 세르비시에(Saccharomyces cerevisiae)로부터 유도될 수 있다. 한 구체예에서, DAHP 합성효소는 대장균의 피드백-비감성 DAHP 합성효소일 수 있고, 서열번호: 7의 핵산 서열 및 서열번호: 8의 아미노산 서열을 갖는다. 상기 피드백-비감성 DAHP 합성효소는 전술한 효소중 하나를 암호화하는 유전자와 동일한 벡터, 또는 상이한 벡터로 도입될 수 있다. 상기 피드백-비감성 DAHP 합성효소는 자체 고유 프로모터를 가지거나, 또는 바이시스트로닉(bicistronic) 정렬로 전술한 효소중 하나에 대한 프로모터를 따를 수 있으며, 이때 단일 프로모터는 상기 효소와 피드백-비감성 DAHP 합성효소 모두를 암호화하는 단일 mRNA의 전사를 구동한다.
한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 외생성 코리스메이트 피루베이트 분해효소 효소 (EC 4.1.3.40), 그리고 외생성 피드백-비감성 DAHP 합성효소를 포함할 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 미생물은 외생성 UbiC 효소, 그리고 외생성 피드백-비감성 DAHP 합성효소를 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 서열번호: 1의 핵산 서열을 갖는 외생성 ubiC 유전자, 그리고 서열번호: 7의 핵산 서열을 갖는 외생성 피드백-비감성 DAHP 합성효소를 포함한다. 한 구체예에서, 외생성 코리스메이트 피루베이트 분해효소 효소와 외생성 피드백-비감성 DAHP 합성효소를 모두 포함하는 미생물은 피드백-비감성 DAHP 합성효소가 없는 미생물과 비교하였을 때, 파라-히드록시벤조산을 더 많이 생산한다는 것이 실증된다.
유사하게, 본 발명의 미생물은 외생성 코리스메이트 피루베이트 분해효소와 피드백-비감성 DAHP 합성효소를 모두 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 (i) 외생성 이소코리스메이트 뮤타제, (EC　5.4.4.2), (ii) 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소 효소 (EC 4.2.99.21), 그리고 (iii) 외생성 피드백-비감성 DAHP 합성효소를 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 미생물은 외생성 PchA 효소, 외생성 PchB 효소, 그리고 외생성 피드백-비감성 DAHP 합성효소를 포함한다. 한 구체예에서, 외생성 피드백-비감성 DAHP 합성효소를 포함하는 미생물은 피드백-비감성 DAHP 합성효소가 없는 미생물과 비교하였을 때, 살리실산을 더 많이 생산한다는 것이 실증된다.
유사하게, 본 발명의 미생물은 외생성 코리스메이트 피루베이트 분해효소와 피드백-비감성 DAHP 합성효소를 모두 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다.
또다른 구체예에서, 본 발명의 미생물은 피드백-비감성 DAHP 합성효소를 포함하지 않고, 대신 단지 내생성 DAHP 합성효소만을 포함한다. 방향족 아미노산의 생산 또는 자연 농도가 피드백 저해를 유도하지 않을 정도로 충분히 낮을 것으로 예상되는 경우, 피드백-비감성 DAHP 합성 효소의 도입은 필요없다.
본 발명의 미생물은 임의의 농도 또는 임의의 양으로 코리스메이트-유도된 산물들을 만들 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 적어도 약 5 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L, 30 mg/L, 50 mg/L, 75 mg/L, 100 mg/L, 200 mg/L, 500 mg/L, 750 mg/L, 1g/L, 1.5g/L 또는 2 g/L의 농도로 코리스메이트-유도된 산물들을 만든다. 한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 적어도 10 mg/L, 50gm/L, 100mg/L, 500mg/L,800mg/L, 또는 1g/L의 농도로 적어도 하나 코리스메이트-유도된 산물을 만든다.
더욱이, 본 발명의 미생물은 특정 선택성 또는 최소 선택성으로 산물을 만들도록 조작될 수 있다. 한 구체예에서, 표적 코리스메이트-유도된 산물은 본 발명의 미생물에 의해 만들어지는 모든 발효 산물의 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50%, 또는 75%를 차지한다. 한 구체예에서, 표적 코리스메이트-유도된 산물은 본 발명의 미생물에 의해 만들어지는 모든 발효 산물의 적어도 10%를 차지하고, 따라서 본 발명의 미생물은 표적 코리스메이트-유도된 산물에 대하여 적어도 10%의 선택성을 갖는다. 또다른 구체예에서, 표적 코리스메이트-유도된 산물은 본 발명의 미생물에 의해 만들어지는 모든 발효 산물의 적어도 30%를 차지하고, 따라서 본 발명의 미생물은 표적 코리스메이트-유도된 산물에 대하여 적어도 30%의 선택성을 갖는다.
본 발명은 가스 기질 존재하여 본 발명의 미생물을 발효시키는 것으로 포함하는 발효 산물, 구체적으로 코리스메이트-유도된 산물을 만드는 방법을 더 제공한다.
본 발명은 가스 기질 존재하에 본 발명의 미생물을 발효시킴으로써 생산되는 코리스메이트-유도된 산물들을 또한 제공한다.
정의 및 배경
용어 “유전적 변형(genetic modification)” 또는 “유전 공학(genetic engineering)”은 넓은 의미로 미생물의 게놈 또는 핵산의 조작을 의미한다. 유전적 변형 방법은 예를 들면, 이종 유전자 발현, 유전자 또는 프로모터 삽입 또는 결손, 핵산 돌연변이, 변경된(altered) 유전자 발현 또는 비활성화, 효소 공학, 지향된(directed) 진화, 지식-기반 설계, 무작위 돌연변이생성 방법, 유전자 셔플링, 그리고 코돈 최적화를 포함한다.
“재조합체(Recombinant)”란 핵산, 단백질, 또는 미생물의 유전적 변형, 조작, 또는 재조합의 산물을 나타낸다. 일반적으로, 상기 “재조합체”라는 용어는 다수 원료, 이를 테면 2 또는 그 이상의 상이한 균주 또는 미생물 종으로부터 유도된 유전 물질을 포함하는 또는 암호화된 핵산, 단백질, 또는 미생물을 의미한다. 상기 “재조합체”라는 용어는 돌연변이된 형태 내생성 핵 또는 단백질이 포함된 돌연변이된 핵산 또는 단백질을 포함하는 미생물을 설명할 때 또한 사용될 수 있다.
"내생성(Endogenous)"은 본 발명의 미생물이 유도된 야생형 또는 모계 미생물에 존재하거나 또는 발현되는 핵산 또는 단백질을 지칭한다. 예를 들면, 내생성 유전자는 본 발명의 미생물이 유도된 야생형 또는 모계 미생물에 자생적으로 존재하는 유전자다. 한 구체예에서, 내생성 유전자의 발현은 외생성 조절 요소, 이를 테면 외생성 프로모터에 의해 제어될 수 있다.
“외생성(Exogenous)”이란 본 발명의 미생물이 유도된 야생형 또는 모계 미생물에 존재하지 않는 핵산 또는 단백질을 지칭한다. 한 구체예에서, 외생성 유전자 또는 효소는 이종 (가령, 상이한) 균주 또는 종으로부터 유도될 수 있으며, 그리고 본 발명의 미생물로 도입되거나 또는 발현될 수 있다. 또다른 구체예에서, 외생성 유전자 또는 효소는 인위적으로 또는 재조합적으로 만들어질 수 있고, 그리고 본 발명의 미생물로 도입되거나 또는 발현될 수 있다. 외생성 핵산은 본 발명의 미생물의 게놈에 통합되거나, 또는 본 발명의 미생물안에 염색체 외의 상태로 있는, 예를 들어 플라스미드에 유지되도록 개작될 수 있다.
“효소 활성(Enzyme activity)”은 효소의 활성, 효소의 양 또는 반응을 촉매하는 효소의 이용가능성을 포함하지만 이에 국한되지는 않는, 효소의 활성을 광범위하게 말한다. 따라서, "증가하는(increasing)" 효소 활성은 효소의 활성을 증가시키거나, 효소의 양을 증가시키거나, 또는 반응을 촉진시키는 효소의 이용가능성을 증가시키는 것을 포함한다.
“돌연변이된(Mutated)”이란 본 발명의 미생물이 유래된 야생형 또는 모계 미생물과 비교하여, 본 발명의 미생물에서 변형된 핵산 또는 단백질을 지칭한다. 한 구체예에서, 상기 돌연변이는 효소를 암호화하는 유전자에서 결손, 삽입, 또는 치환일 수 있다. 또다른 구체예에서, 상기 돌연변이는 효소에서 하나 또는 그 이상의 아미노산의 결손, 삽입, 또는 치환일 수 있다.
구체적으로, “파괴성 돌연변이(disruptive mutation)”는 유전자 또는 효소의 발현 또는 활성을 감소 또는 제거(가령, "파괴")하는 돌연변이다. 상기 파괴성 돌연변이는 이 유전자 또는 효소를 부분적으로 비활성화시키거나, 완전하게 비활성화시키거나, 또는 결손시킬 수 있다. 상기 파괴성 돌연변이는 녹아웃 (KO) 돌연변이일 수 있다. 상기 파괴성 돌연변이는 효소에 의해 만들어진 산물의 생합성을 감소, 방해 또는 차단시키는 임의의 돌연변이일 수 있다. 상기 파괴성 돌연변이는 예를 들면, 효소를 암호화하는 유전자에서 돌연변이, 효소를 암호화하는 유전자의 발현에 관여하는 유전적 조절 요소에서 돌연변이, 효소의 활성을 감소 또는 억제시키는 단백질을 생산하는 핵산의 도입, 또는 효소의 발현을 억제하는 핵산(가령, 안티센스 RNA, siRNA, CRISPR) 또는 단백질의 도입을 포함한다. 상기 파괴성 돌연변이는 당 업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 도입될 수 있다.
“코돈 최적화(Codon optimization)”란 특정 균주 또는 종에서 핵산의 최적화된 또는 개선된 해독을 위하여 핵산, 이를 테면 유전자의 돌연변이를 의미한다. 코돈 최적화로 해독 속도가 빨라지거나 또는 해독 정확도가 높아질 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 유전자는 클로스트리듐, 특히 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 리중다레이, 또는 클로스트리듐 라가스다레이에서 발현을 위하여 코돈 최적화된다. 추가 바람직한 구체예에서, 본 발명의 유전자는 DSMZ 수탁 번호 DSM23693로 기탁된 클로스트리듐 오토에타노게눔 LZ1561에서 발현을 위하여 코돈 최적화된다.
“과다발현된(Overexpressed)”이란 본 발명의 미생물이 유래된 야생형 또는 모계 미생물과 비교하여, 본 발명의 미생물에서 핵산 또는 단백질의 발현이 증가된 것을 지칭한다. 과발현은 유전자 복사 수, 유전자 전사율, 유전자 해독율 또는 효소 분해율의 변형을 포함하여, 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다.
용어 “변이체(variants)”는 선행 기술에 개시되거나, 또는 본원에 예시된 기준 핵산 및 단백질의 서열과 같이, 서열이 기준 핵산 및 단백질의 서열로부터 변화된 핵산 및 단백질을 포함한다. 본 발명은 기준 핵산 또는 단백질과 실질적으로 동일한 기능을 수행하는 변이체 핵산 또는 단백질을 사용하여 실시될 수 있다. 예를 들면, 변이체 단백질은 기준 단백질과 실질적으로 동일한 기능을 수행하거나, 또는 기준 단백질과 실질적으로 동일한 반응을 촉매할 수 있다. 변이체 유전자는 기준 유전자와 동일하거나 실질적으로 동일한 단백질을 암호화할 수 있다. 변이체 프로모터는 기준 프로모터로서 하나 이상의 유전자의 발현을 촉진시키는 실질적으로 동일한 능력을 가질 수 있다.
이러한 핵산 또는 단백질은 본 명세서에서 "기능적으로 대등한 변이체(functionally equivalent variants)"로 지칭될 수 있다. 예로서, 핵산의 기능적으로 대등한 변이체는 대립 유전자(allelic) 변이체, 유전자 단편, 돌연변이된 유전자, 다형성(polymorphisms) 및 이와 유사한 것등을 포함할 수 있다. 다른 미생물의 상동성(Homologous) 유전자 또한 기능적으로 대등한 변이체의 예이다. 이들은 이를 테면 클로스트리듐　아세토부틸리쿰(Clostridium　acetobutylicum), 클로스트리듐 베이헤린키, 또는 클로스트리듐 리중다레이 종에는 상동성 유전자를 포함하는데, 이의 상세는 웹사이트, 이를 테면 Genbank 또는 NCBI에서 공개되어 있다. 기능적으로 대등한 변이체는 또한 특정 미생물에 대한 코돈 최적화의 결과로서 서열이 변화된 핵산을 포함한다. 기능적으로 대등한 핵산 변이체는 기준 핵산에 대하여 적어도 대략적으로 70%, 대략적으로 80%, 대략적으로 85%, 대략적으로 90%, 대략적으로 95%, 대략적으로 98%, 또는 그 이상의 핵산 서열 동일성 (상동성 백분율)을 갖는 것이 바람직할 것이다. 기능적으로 대등한 단백질 변이체는 기준 단백질에 대하여 적어도 대략적으로 70%, 대략적으로 80%, 대략적으로 85%, 대략적으로 90%, 대략적으로 95%, 대략적으로 98%, 또는 그 이상의 아미노산 동일성 (상동성 백분율)을 가지는 것이 바람직할 것이다. 변이체 핵산 또는 단백질의 기능적 등가성은 당 업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 평가할 수 있다.
핵산은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 본 발명의 미생물로 전달될 수 있다. 예를 들면, 핵산은 네이키드(naked) 핵산으로 전달될 수 있거나, 또는 이를 테면, 리포좀과 같은 하나 이상의 물질로 제제화될 수 있다. 상기 핵산은 DNA, RNA, cDNA, 또는 적절한 경우 이의 조합이될 수 있다. 제한(Restriction) 억제제들이 특정 구체예들에서 이용될 수 있다. 추가 벡터는 플라스미드, 바이러스, 박테리오파아지, 코스미드, 및 인공 염색체를 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 핵산은 플라스미드를 이용하여 본 발명의 미생물로 전달된다. 예를 들면, (형질 도입 또는 형질 감염을 포함한) 형질전환은 전기 천공, 초음파처리, 폴리에틸렌 글리콜-매개 형질전환, 화학적 또는 자연적 컴피턴스, 원형질체 형질전환, 프로파아지 유도 또는 접합에 의해 달성될 수 있다. 활성 제한 효소 시스템을 갖는 특정 구체예에서, 핵산을 미생물에 도입하기 전, 핵산의 메틸화가 필요할 수 있다.
더욱이, 핵산은 특정 핵산의 발현을 증가시키거나, 또는 달리 조절하기 위해 프로모터와 같은 조절 요소를 포함하도록 설계될 수 있다. 프로모터는 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터 일 수 있다. 이상적으로는, 상기 프로모터는 우드-융둘(Wood-Ljungdahl) 경로 프로모터, 페레독신 프로모터, 피루베이트:페레독신 산화환원 효소 프로모터, Rnf 복합 오페론 프로모터, ATP 합성 효소 오페론 프로모터, 또는 포스포 트랜스아세틸라제/아세테이트 키나제 오페론 프로모터이다.
"미생물(microorganism)"은 현미경적 유기체, 구체적으로 박테리아, 고균(archea), 바이러스 또는 곰팡이이다. 본 발명의 미생물은 전형적으로 세균이다. 본 명세서에 사용된 "미생물"의 기재는 "세균(bacterium)"를 포괄해야 한다.
“모계(parental) 미생물”이란 본 발명의 미생물을 만들 때 이용된 미생물이다. 상기 모계 미생물은 자연 발생적 미생물 (가령, 야생형 미생물)이거나, 또는 기존에 변형된 미생물 (가령, 돌연변이체 또는 재조합 미생물)일 수 있다. 본 발명의 미생물은 이의 모계 미생물에서 발현되지 않았거나, 또는 과다발현되지 않았던 하나 또는 그 이상의 효소를 발현 또는 과다발현시키도록 변형될 수 있다. 유사하게, 본 발명의 미생물은 이의 모계 미생물에 포함되지 않았던 하나 또는 그 이상의 유전자를 포함하도록 변형될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 모계 미생물은 클로스트리듐　오토에타노게눔, 클로스트리듐 리중다레이, 또는 클로스트리듐 라가스다레이이다. 바람직한 구체예에서, 상기 모계 미생물은 DSMZ 수탁 번호 DSM23693로 기탁된 클로스트리듐　오토에타노게눔 LZ1561이다.
용어 “~로부터 유도된(derived from)"이란 새로운 핵산, 단백질, 또는 미생물을 만들기 위하여, 상이한 (가령, 모계 또는 야생형) 핵산, 단백질, 또는 미생물로부터 변형된 또는 개작된 핵산, 단백질, 또는 미생물을 나타낸다. 이러한 변형 또는 개작(adaptations)에는 전형적으로 핵산 또는 유전자의 삽입, 결손, 돌연변이, 또는 치환이 포함된다. 일반적으로, 본 발명의 미생물은 모계 미생물로부터 유도된다. 한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 클로스트리듐　오토에타노게눔, 클로스트리듐 리중다레이, 또는 클로스트리듐 라가스다레이로부터 유도된다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 DSMZ 수탁 번호 DSM23693로 기탁된 클로스트리듐 오토에타노게눔 LZ1561로부터 유도된다.
본 발명의 미생물은 기능적 특성에 따라 세분될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 미생물은 C1 고정 미생물, 혐기성 미생물, 아세토겐, 에타놀로겐, 일산화탄소요구성 및/또는 메타노겐이거나, 또는 이들로부터 유도될 수 있다. 표 1은 대표적인 미생물 목록을 제공하고, 그 기능적 특성을 제공한다.
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Figure 112017116259310-pct00011
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“C1”이란 한 개의 탄소 분자, 예를 들면, CO, CO2, CH4, 또는 CH3OH를 말한다. “C1-옥시게네이트”는 적어도 한 개의 산호 원자를 포함하는 한 개의 탄소 분자, 예를 들면, CO, CO2, 또는 CH3OH를 말한다. “C1-탄소 공급원”이란 본 발명의 미생물을 위한 부분적 또는 유일한 탄소원으로서 작용하는 한 개의 탄소-분자를 지칭한다. 예를 들면, C1-탄소 공급원은 CO, CO2, CH4, CH3OH, 또는 CH2O2중 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는, C1-탄소 공급원은 CO와 CO2중 하나, 또는 이 둘 모두를 포함한다. “C1-고정 미생물(C1-fixing microorganism)”이란 C1- 탄소원으로부터 하나 이상의 산물을 생산하는 능력을 가진 미생물을 말한다. 전형적으로, 본 발명의 미생물은 C1-고정 세균이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 표 1에서 확인된 C1-고정 미생물로부터 유도된다.
"혐기성균(anaerobe)"은 성장하는데 산소를 필요로 하지 않는 미생물이다. 혐기성균은 산소가 존재하면 부정적으로 반응하거나 또는 심지어 죽을 수도 있다. 전형적으로, 본 발명의 미생물은 혐기성균이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 표 1에서 확인된 혐기성균으로부터 유도된다.
"아세토겐(acetogen)"이란 혐기성 호흡의 산물로서 아세테이트 (또는 아세트산)를 생산하거나 생산할 수 있는 미생물이다. 전형적으로, 아세토겐은 에너지 보존 및 아세틸 -CoA 및 아세틸 -CoA 유도 산물, 이를 테면 아세테이트의 합성을 위한 주요 기전으로서, 우드-융돌(Wood-Ljungdahl) 경로를 사용하는 의무적 혐기성 박테리아이다(Ragsdale, Biochim Biophys Acta, 1784: 1873-1898, 2008). 아세토겐은 아세틸-CoA 경로를 (1) CO2로부터 아세틸-CoA의 환원 합성을 위한 기전으로, (2) 말단 전자-수용, 에너지 보존 프로세스로, (3) 세포의 탄소 합성에서 이산화탄소의 고정 (동화) 기전으로 이용한다(Drake, Acetogenic Prokaryotes, In: The Prokaryotes, 3rd edition, p. 354, New York, NY, 2006). 모든 자연 발생적 아세토겐은 C1-고정, 혐기성, 자가영양성, 그리고 비-메탄영양요구성이다. 전형적으로, 본 발명의 미생물은 아세토겐이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 표 1에서 확인된 아세토겐으로부터 유도된다.
“에타놀로겐(ethanologen)” 은 에탄올을 생산하거나 또는 생산할 수 있는 미생물이다. 전형적으로, 본 발명의 미생물은 에타놀로겐이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 표 1에서 확인된 에타놀로겐으로부터 유도된다.
“자가영양요구성(autotroph)”이란 유기 탄소 부재하에 성장할 수 있는 미생물이다. 대신, 자가영양요구성은 무기 탄소 공급원, 이를 테면 CO 및/또는 CO2를 이용한다. 전형적으로, 본 발명의 미생물은 자가영양요구성이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 표 1에서 확인된 자가영양요구성으로부터 유도된다.
“일산화탄소요구성(carboxydotroph)”은 유일한 탄소 공급원로 CO를 이용할 수 있는 미생물이다. 전형적으로, 본 발명의 미생물은 일산화탄소요구성이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 표 1에서 확인된 일산화탄소요구성으로부터 유도된다.
“메탄영양요구성(methanotroph)”은 탄소와 에너지의 유일한 공급원으로써 메탄을 이용할 수 있는 미생물이다. 특정 구체예들에 있어서, 본 발명의 미생물은 메탄영양요구성으로부터 유도된다.
더욱 광범위하게, 본 발명의 미생물은 표 1에서 확인된 임의의 속(genus) 또는 종(species)으로부터 유도될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 클로스트리듐 세균이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 리중다레이, 그리고 클로스트리듐 라가스다레이종을 포함하는 클로스트리디아(clostridia) 클러스트로부터 유도된다. 이들 종은 Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994 (클로스트리듐 오토에타노게눔), Tanner, Int J System Bacteriol, 43: 232-236, 1993 (클로스트리듐 리중다레이), 그리고 Huhnke, WO　2008/028055 (클로스트리듐 라가스다레이)에서 최초 보고되고, 특징화되었다.
이들 3 종은 많은 유사성을 가진다. 구체적으로, 이들 종은 클로스트리듐 속의 모두 C1-고정, 혐기성, 초산생성, 에타놀로겐, 그리고 일산화탄소영양성 구성원이다. 이 종들은 유사한 유전자형과 표현형, 그리고 에너지 보존과 발효 대사의 방식을 가지고 있다. 더욱이, 이들 종은 99% 이상의 동일성을 가지고, 약 22-30 mol%의 DNA G　+　C 함량을 보유한 16S rRNA DNA를 갖는 클로스트리디아 rRNA 상동성 군 I에 군집되며, 그램-음성이며, 형태와 크기가 유사하고(0.5-0.7 x 3-5 μm 사이에서 대수적으로 성장하는 세포), 중온성(mesophilic) (30-37　℃에서 최적으로 성장)이며, pH 약 4-7.5 (최적의 pH는 약 5.5-6임)의 유사한 pH 범위를 갖고, 사이토크롬이 결여되어 있고, 그리고 Rnf 보합체를 통하여 에너지를 보존한다. 또한, 이들 종에서 카르복시산은 상응하는 알코올로 환원되었다.(Perez, Biotechnol Bioeng, 110:1066-1077, 2012). 중요한 것은, 이 종들은 모두 CO를 함유한 기체에서 강한 자가영양성 (autotrophic) 성장을 보이고, 주요 발효 산물로써 에탄올과 아세테이트 (또는 아세트산)를 생산하며, 특정 조건에서 2,3-부탄디올과 젖산을 소량 생산한다.
그러나, 이들 세 종은 또한 많은 차이점을 가지고 있다. 이 종들은 상이한 출처로부터 분리되었다: 클로스트리듐 오토에타노게눔은 토끼 장으로부터, 클로스트리듐 리중다레이는 양계장 폐기물로부터, 그리고 클로스트리듐 라가스다레이는 담수 침전물로부터 분리되었다. 이들 종은 다양한 당 (예, 람노오스, 아라비노스), 산 (예, 글루코 네이트, 시트르산), 아미노산 (예, 아르기닌, 히스티딘) 및 기타 기질 (예, 베타인, 부탄올)의 용도에서 상이하다. 더욱이, 이들 종은 특정 비타민(가령, 티아민, 바이오틴)에 대하여 영양요구성이 상이하다. 이들 종은 우드-융둘(Wood-Ljungdahl) 경로 유전자와 단백질의 핵산과 아미노산 서열에서 차이가 있지만, 이들 유전자와 단백질의 일반적인 체계와 수는 모든 종에서 동일하다는 것이 밝혀졌다(Kopke, Curr Opin Biotechnol, 22: 320-325, 2011).
따라서, 요약하면, 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 리중다레이, 또는 클로스트리듐 라가스다레이 의 특징중 많은 것들은 이종에 특이적이지 않으며, 클로스트리듐 속의 C1 고정, 혐기성, 아세토 제닉, 에타놀로겐 및 일산화탄소영양성 구성원에 대하여 오히려 일반적인 특징이다. 그러나, 이 종들은 사실상 구별되기 때문에, 이들 종의 유전자 변형 또는 조작은 이들 종의 또다른 것에서 동일한 효과를 가지지 않을 수도 있다. 예를 들어, 성장, 수행 또는 산물의 생산에 있어서 차이가 관찰될 수 있다,
본 발명의 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 리중다레이, 또는 클로스트리듐 라가스다레이.의 분리주 또는 돌연변이체로부터 또한 유도될 수 있다. 클로스트리듐 오토에타노게눔 의 분리주 및 돌연변이체는 JA1-1 (DSM10061) (Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994), LBS1560 (DSM19630) (WO　2009/064200), 그리고 LZ1561 (DSM23693)을 포함한다. 클로스트리듐 리중다레이 의 분리주 및 돌연변이체는 ATCC 49587 (Tanner, Int J Syst Bacteriol, 43: 232-236, 1993), PETCT (DSM13528, ATCC 55383), ERI-2 (ATCC 55380) (US　5,593,886), C-01 (ATCC 55988) (US　6,368,819), O-52 (ATCC 55989) (US　6,368,819), 그리고 OTA-1 (Tirado-Acevedo, Production of bioethanol from synthesis gas using Clostridium ljungdahlii, PhD thesis, North Carolina State University, 2010)를 포함한다. 클로스트리듐 라가스다레이의 분리주 및 돌연변이체는 PI 1 (ATCC BAA-622, ATCC PTA-7826) (WO　2008/028055)를 포함한다.
“기질(Substrate)”이란 본 발명의 미생물의 탄소 및/또는 에너지 공급원을 지칭한다. 전형적으로, 상기 기질은 가스이며, C1-탄소 공급원, 예를 들면, CO, CO2, 및/또는 CH4를 포함한다. 바람직하게는, 상기 기질은 CO 또는 CO + CO2의 C1-탄소 공급원을 포함한다. 상기 기질은 다른 비-탄소 성분들, 이를 테면 H2, N2, 또는 전자를 더 포함할 수 있다.
상기 기질은 일반적으로 적어도 소량의 CO, 이를 테면 약 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 mol%의 CO를 포함할 수 있다. 상기 기질은 일정 범위의 CO, 이를 테면 약 20-80, 30-70, 또는 40-60 mol%의 CO를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 기질은 약 40-70 mol%의 CO (가령, 제강 공장 또는 고로 가스), 약 20-30 mol%의 CO (가령, 기본 산소 가마 가스), 또는 약 15-45 mol%의 CO (가령, 합성 가스)를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 기질은 상대적으로 저량의 CO, 이를 테면 약 1-10 또는 1-20 mol%의 CO를 포함할 수 있다. 본 발명의 미생물은 전형적으로 상기 기질에 있는 적어도 일부분의 CO를 산물로 전환시킨다.
상기 기질은 약간의 양의 H2를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 기질은 약 1, 2, 5, 10, 15, 20, 또는 30 mol%의 H2를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기질은 상대적으로 많은 양의 H2, 이를 테면 약 60, 70, 80, 또는 90 mol%의 H2를 포함할 수 있다. 추가 구체예들에서, 상기 기질은 실질적으로 H2를 포함하지 않는다.
상기 기질은 약간의 양의 CO2를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 기질은 약 1-80 또는 1-30 mol%의 CO2를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기질은 약 20, 15, 10, 또는 5 mol% 미만의 CO2를 포함할 수 있다. 또다른 구체예에서, 상기 기질은 실질적으로 CO2를 포함하지 않는다.
상기 기질은 전형적으로 가스이지만, 상기 기질은 대체 형태로 또한 제공될 수 있다. 예를 들면, 상기 기질은 마이크로버블 분산 생성기를 사용하여 CO-함유 가스로 포화된 액체에 용해될 수 있다. 추가의 예로써, 기질은 고체 지지체 상에 흡착될 수 있다.
기질 및/또는 C1-탄소 공급원은 산업 공정의 부산물, 또는 자동차 배기 가스 또는 바이오매스 가스화와 같은 일부 다른 공급원로부터 얻어지는 폐가스일 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 산업 공정은 철 금속 산물 제조, 이를 테면 제강 제조, 비-철 산물 제조, 석유 정제 공정, 석탄 가스화, 전력 생산, 카본 블랙 생산, 암모니아 생산, 메탄올 생산, 그리고 코크 제조로 구성된 집단에서 선택된다. 이들 구체예에서, 상기 기질 및/또는 C1-탄소 공급원은 대기로 방출되기 전에 임의의 편리한 방법을 사용하여 산업 공정으로부터 포획될 수 있다.
상기 기질 및/또는 C1-탄소 공급원은 합성 가스일 수 있는데, 이를 테면, 석탄 또는 정제 잔류물의 가스화, 바이오매스의 가스화 또는 천연 가스의 개질에 의해 얻어진 합성 가스일 수 있다. 상기 기질의 조성은 반응의 효율 및/또는 비용에 중요한 영향을 미칠 수 있다. 예를 들면, 산소(O2)의 존재는 혐기성 발효 공정의 효과를 감소시킬 수 있다. 상기 기질의 조성에 따라, 기질을 처리하거나, 문지러거나 또는 여과하여 독소, 원하지 않는 성분, 또는 먼지 입자와 같은 임의의 원하지 않는 불순물을 제거하고, 그리고/또는 바람직한 성분의 농도를 증가시키는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 미생물은 배양되어, 하나 또는 그 이상의 산물이 만들어질 수 있다. 예를 들면, 클로스트리듐 오토에타노게눔은 다음을 생산하거나 또는 생산하도록 조작될 수 있다: 에탄올 (WO　2007/117157), 아세테이트 (WO　2007/117157), 부탄올 (WO　2008/115080 및 WO 2012/053905), 부티레이트 (WO　2008/115080), 2,3-부탄디올 (WO　2009/151342), 젖산염 (WO　2011/112103), 부텐 (WO　2012/024522), 부타디엔 (WO　2012/024522), 메틸 에틸 케톤 (2-부탄온) (WO　2012/024522 및 WO　2013/185123), 에틸렌 (WO　2012/026833), 아세톤 (WO　2012/115527), 이소프로판올 (WO　2012/115527), 지질 (WO　2013/036147), 3-히드록시프로피오네이트 (3-HP) (WO　2013/180581), 이소프렌 (WO　2013/180584), 지방산 (WO　2013/191567), 2-부탄올 (WO　2013/185123), 1,2-프로판디올 (WO　2014/0369152), 그리고 1-프로판올 (WO　2014/0369152). 하나 또는 그 이상의 표적 산물에 추가하여, 본 발명의 미생물은 에탄올, 아세테이트, 및/또는 2,3-부탄디올을 또한 만들 수 있다.
“선택성(Selectivity)”이란 미생물에 의해 만들어진 모든 발효 산물에 대하여 표적 산물의 생산 비율을 지칭한다. 본 발명의 미생물은 특정 선택성 또는 최소 선택성으로 산물을 만들도록 조작될 수 있다. 한 구체예에서, 표적 산물은 본 발명의 미생물에 의해 만들어지는 모든 발효 산물의 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50%, 또는 75%를 차지한다. 한 구체예에서, 상기 표적 산물은 본 발명의 미생물에 의해 만들어지는 모든 발효 산물의 적어도 10%를 차지하고, 따라서 본 발명의 미생물은 상기 표적 산물에 대하여 적어도 10%의 선택성을 갖는다. 또다른 구체예에서, 상기 표적 산물은 본 발명의 미생물에 의해 만들어지는 모든 발효 산물의 적어도 30%를 차지하고, 따라서 본 발명의 미생물은 상기 표적 산물에 대하여 적어도 30%의 선택성을 갖는다.
전형적으로, 상기 배양은 생물반응장치에서 실행된다. 용어 “생물반응장치(bioreactor)”는 연속 교반 탱크 반응기 (CSTR), 고정화 셀 반응기 (ICR), 살수 배드 반응기 (TBR), 버블 칼럼 (bubble column), 가스 리프트 발효기(gas lift fermenter), 고정 믹서(static mixer), 또는 가스-액체 접촉에 적합한 기타 용기 또는 장치와 같은 하나 또는 그 이상의 용기, 타워 또는 파이핑 배열로 구성된 배양/발효 장치를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 생물반응장치는 제 1 성장 반응기 및 제 2 배양/발효 반응기를 포함할 수 있다. 상기 기질은 이들 반응기 중 하나 또는 모두에 제공될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "배양(culture)"과 "발효(fermentation)"는 호환적으로 사용된다. 이들 용어는 배양/발효 과정의 성장 단계와 산물 생합성 단계를 모두 포함한다.
배양은 일반적으로 미생물의 성장을 허용하는데 충분한 양분, 비타민 및/또는 미네랄을 함유하는 수성 배양 배지에서 유지된다. 바람직하게는, 수성 배양 배지는 혐기성 미생물 성장 배지, 이를 테면, 최소 혐기성 미생물 성장 배지이다. 적합한 배지는 당분야에 공지되어 있다.
배양/발효는 표적 산물의 생산에 적절한 조건 하에서 실시하는 것이 바람직하다. 고려해야 할 반응 조건은 압력 (또는 분압), 온도, 기체 유속, 액체 유속, 배지 pH, 배지 산화환원 전위, 교반 속도 (연속 교반 탱크 반응기를 사용하는 경우), 접종 수준, 액상의 기체가 제한적이 되지 않도록 최대 가스 기질 농도, 그리고 산물 억제를 피하기 위하여 최대 산물의 농도를 포함한다. 구체적으로, 기체-제한 조건 하에서 배양으로 인하여 산물이 소모될 수 있기 때문에, 기질의 유입 속도는 액상 기체 농도가 제한되지 않도록 조정될 수 있다.
고압에서 생물반응장치를 작동시키면 기체상으로부터 액체상으로 기체량 전달 속도가 증가된다. 따라서, 일반적으로 대기압보다 높은 압력에서 배양/발효를 수행하는 것이 바람직하다. 또한, 주어진 기체 전환율은 부분적으로 기질 잔류 시간에 대한 함수이며, 잔류 시간은 생물반응장치의 필요 용적량을 결정하기 때문에, 가압 시스템의 사용으로 요구되는 생물반응장치의 용적을 크게 감소시킬 수 있고, 결과적으로 배양/발효 장비의 자본 비용은 절감될 수 있다. 다시, 생물반응장치 안에 액체 용적을 주입 기체 유속으로 나눈 것으로 정의되는 잔류 시간은 대기압보다 오히려 상승된 압력으로 생물반응장치가 유지될 때, 또한 감소될 수 있다는 것을 의미한다. 최적의 반응 조건은 사용된 특정 미생물에 따라 부분적으로 달라질 것이다. 그러나, 일반적으로, 대기압보다 높은 압력에서 발효시키는 것이 바람직하다. 또한, 주어진 기체 전환율은 부분적으로 기질 잔류 시간에 대한 함수이며, 원하는 잔류 시간을 얻는 것은 생물반응장치의 필요 용적량을 결정하기 때문에, 가압 시스템의 사용으로 요구되는 생물반응장치의 용적을 크게 감소시킬 수 있고, 결과적으로 발효 장비의 자본 비용은 절감될 수 있다.
표적 산물은 당업계에 공지된 임의의 방법 또는 방법의 조합, 예를 들어 분별 증류, 증발, 투석증발(pervaporation), 가스 스트리핑, 상 분리 및 액체 추출이 포함된 추출 발효를 사용하여 발효액으로부터 분리 또는 정제될 수 있다 . 특정 구체예들에 있어서, 표적 산물들은 생물반응장치로부터 발효액의 일부를 연속적으로 제거하고, 발효액으로부터 미생물 세포를 분리하고 (통상적으로 여과를 통하여), 그리고 발효액으로부터 하나 이상의 표적 산물을 회수한다. 알코올 및/또는 아세톤은 예를 들면, 증류에 의해 회수될 수 있다. 산은 예를 들면, 활성탄에서 흡착시킴으로써, 회수될 수 있다. 분리된 미생물 세포들은 생물반응장치로 되돌려보내는 것이 바람직하다. 표적 산물이 제거된 후에 남아있는 무-세포 투과액(permeate)도 생물반응장치로 되돌려보내는 것이 바람직하다. 생물반응장치로 되돌리기에 앞서, 배지를 보충하기 위해, 비타민 B와 같은 추가 영양분을 무-세포 투과액에 첨가할 수 있다.
실시예
하기 실시예들은 본 발명을 추가로 설명하지만, 본 발명의 범주를 어떤 방식으로도 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1
본 실시예는 C. 오토에타노게눔 및 C.　리중다레이를 배양하는 일반적인 방법을 기술한다.
C. 오토에타노게눔 DSM10061 및 DSM23693 (DSM10061의 유도물) 그리고 C.　리중다레이 DSM13528는 DSMZ (The German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Inhoffenstraße 7 B, 38124 Braunschweig, Germany)에서 구하였다.
균주들은 표준 혐기성 기술을 이용하여 37 ℃, PETC 배지, pH　5.6에서 성장시켰다 (Hungate, Methods Microbiol, 3B: 117-132, 1969; Wolfe, Adv Microbiol Physiol, 6: 107-146, 1971). 과당 (종속영양성 성장) 또는 공간 부분에서 30 psi의 CO-함유하는 제강 가스 (뉴질랜드 New Zealand Steel site에서 수집; 조성: 44% CO, 32% N2, 22% CO2, 2% H2) (자가영양성 성장)를 기질로 이용하였다. 고체 배지의 경우, 1.2 % 박토 한천(bacto agar) (BD, Franklin Lakes, NJ 07417, USA)가 추가되었다.
Figure 112017116259310-pct00013
Figure 112017116259310-pct00014
Figure 112017116259310-pct00015
실시예 2
본 실시예는 p-히드록시벤조에이트 발현 플라스미드를 포함하는 균주의 구축을 실증한다.
코리스메이트 피루베이트 분해효소 (ubiC)의 뉴클레오티드 서열(서열번호: 1)은 C.　오토에타노게눔 코돈-사용 표(GeneArt)에 따라 최적화시키고 (서열번호: 2), 우드-융돌(Wood-Ljungdahl) 경로 프로모터 (US 20110256600)의 제어 하에 pMTL8315 발현 벡터 (도 7) 안으로 클론시켰다. 피드백-비감성 돌연변이체 3-데옥시-D-아라비노-헵툴로소네이트-7-포스페이트 (DAHP) 합성효소 (aroG*)의 코딩 서열 (서열번호: 8)은 바이시스트로닉 형식에서 ubiC에 따라 또한 포함되었다 (도 7). 플라스미드 pARO_01 (서열번호: 9)는 공여자로써 대장균 균주 CA434와 접합을 통하여 C.　오토에타노게눔 LZ1561 (DSM23693)으로 형질변환되었다. 공여자 균주는 25 μg/mL 클로람페니콜 및 100 μg/mL 스펙티노마이신이 보충된 LB 배지에서 하룻밤 동안 성장되었다. 1.5 mL의 배양물로부터 세포는 원심분리를 통하여 수거하고, 인산염 완충 염수 (PBS)로 세척되었다. 혐기성 작업대 안에서, 공여자 세포 펠렛을 200 μL의 지수적으로 성장한 수령체 LZ1561에 재현탁시켰다. 접합 혼합물을 PETC-MES 한천 배지 상에 찍어넣고, 37　℃에서 배양하였다. 24 시간 후, 이 세포들을 접합 플레이트로부터 긁어내고, 7.5 μg 티암페니콜/mL (Sigma) 및 10 μg 트리메토프림/mL (Sigma)이 보충된 PETC-MES 한천 배지상에 도말하였다. 플라스미드를 품고있는 3개의 콜로니 (가령 생물학적 트리플리케이트) 분리주는 7.5 μg 티암페니콜/mL와 탄소 공급원으로써 제강 배지 가스를 모의한 가스 혼합물 (50 % CO, 10 % H2, 30 % CO2, 10 % N2, 이하 본 출원에서는 “제강 가스(mill gas)”로 지칭됨)이 함유된 PETC-MES 액체 배지에서 성장되었다.
액체 배양물은 티암페니콜과 22 psi의 제강 가스를 담고 있는 혈청 병 안에 10 mL PETC-MES 배지에서 성장되었다. 바이오매스 (도 8)와 pHBA (도 9a 및 도 9b)를 측정하기 위하여 시료를 매일 채취하였다.
pHBA를 측정하기 위하여, 시료 (100 μL)에 10 μL 0.1N NaOH를 찔러넣고, 냉동시키고, 그 다음 동결건조시켰다.　 그 다음 이 시료는 100 μL BSTFA + TCMS (99:1) 및 피리딘 100 μL으로 유도화되었다.　 그 다음 이 시료는 60　℃에서 30 분간 항온처리되어, 카르복실산 기능기의 트리메틸실일 유도체가 형성되었다. 　 GC-MS 방법의 상세는 다음과 같다: 주사. 용적. 1uL; 주사. T 250　℃; 분할 비 10:1. 초기 T 50　℃ (5 분 유지); 최종 T 220　℃ (20℃/min); 항속(const. flow) 1　mL/min (He 운반체 가스); 컬럼 Zebron ZB-5MS 30m x 0.25mm x 0.25μm. Varian Ion Trap 4000, 풀 스캔 모드 40-400 m/z에서 작동. Tune PFTBA
도 9a에서, LZ1561 (대조 균주)는 3개의 기술적 레플리케이트 (가령, 성장 및 시료채취 3회)를 갖는다. pARO_01를 갖는 LZ1561의 2개 생물학적 레플리케이트도 또한 준비되었고, 이들 각각은 3개의 기술적 레플리케이트를 가진다. “기술적 레플리케이트(Technical replicate)”란 별도의 실험에서 각 균주를 성장시키고, 시료채취하는 것을 말하며, “생물학적 레플리케이트(biological replicate)”는 스크래취(scratch)로부터 균주를 재생하는 것을 말한다. 이러한 방식으로, 레플리케이트는 이 미생물의 배경 생물학적 변이를 설명하는 반면, 기술적 레플리케이트는 배양, 샘플링 및 분석 방법을 포함한 기술적 측면으로 인한 변이를 설명한다. 도 9a는 pHBA가 별도 경우에서 반복적으로 생산되었다는 것을 보여준다. 도 8과 도 9b는 성장 및 pHBA 생산성의 전반적으로 나타낸다.
실시예 3
본 실시예는 가스 발효를 통하여 p-히드록시벤조에이트의 생산을 실증한다.
플라스미드 pARO_01 (서열번호: 9)를 품고 있는 C. 오토에타노게눔은 실시예 1에서 설명된 바와 같이, 제강 가스에서 성장되었다. 실시예 1에서 실행된 것과 같이, 배양물의 GC-MS 분석에서 코리스메이트 피루베이트 분해효소를 발현시키는 세균에 의해 pHBA가 만들어졌다는 것이 확인되었다. 이 방법을 이용한 pHBA 분석의 선형 범위는 0-12.5 mg/mL (도 5)이었다.
pHBA는 pHBA 표준의 잔류 시간 및 특징적인 단편 이온과 NIST 질량 분석 데이터베이스로부터의 예측된 특성 이온을 비교하여 검증되었다 (도 6).
pMTL8315 발현 벡터 상에 암호화된 코리스메이트-피루베이트 분해효소를 발현시키는 모든 배양물에서 pHBA 생산이 관찰되었다. 임의의 하나의 배양물에서 관찰된 pHBA의 정점 역가는 8일 후 17 mg pHBA/L이었다(도 9b). 상기 발현 벡터가 없는 대조 시료에서 pHBA는 관찰되지 않았다.
배양물에 존재하는 상기 유전적으로 조작된 세균에 의해 pHBA는 탐지가능한 수준으로 생성되었다.
실시예 4
본 실시예는 효소 공학을 통하여 pHBA의 생산을 증가시키는 실험 프로토콜을 실증한다.
UbiC는 pHBA의 잔류를 통하여 산물 억제를 받는다. ubiC를 암호화하는 핵산 서열은 상기 효소에 의한 산물 잔류에 관여하는 아미노산이 돌연변이되도록 변형되어, 이 산물의 방출은 증가될 수 있다. 이를 위하여, pHBA 결합에 관여하는 아미노산은 결합 산물을 가진 구조의 분석에 의해 동정된다. 산물 저해는 pHBA 결합 및 잔류에 관여하는 아미노산을 돌연변이시킴으로써 최소화된다. pHBA 수율에 있어서 가장 큰 촉매 효능을 갖는 효소를 확인하기 위해, ubiC 돌연변이체의 표적 라이브러리를 만들 수 있고, 이때 pHBA-결합 아미노산의 다양한 조합이 변형되고, 이러한 돌연변이 효소는 효소 분석법으로 분석할 수 있다. 그 다음 대부분 pHBA 생산성이 개선된 균주들을 입증하기 위하여, 개선된 돌연변이체들이 C.　오토에타노게눔 LZ1561에서 발현된다.
실시예 5
본 실시예는 살리실레이트 발현 플라스미드를 포함하는 균주의 구축을 실증한다.
pchA (서열번호: 4) 및 pchB (서열번호: 6)의 뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화되었고, 테트라사이클린-유도성 프로모터의 제어 하에 발현 벡터 안으로 클론되었다. 이 플라스미드는 공여자로써 대장균 균주 CA434와 접합을 통하여 C.　오토에타노게눔 LZ1561 (DSM23693)으로 형질변환되었다. 공여자 균주는 25 μg/mL 클로람페니콜 및 100 μg/mL 스펙티노마이신이 보충된 LB 배지에서 하룻밤 동안 성장되었다. 1.5 mL의 배양물로부터 세포는 원심분리를 통하여 수거하고, 인산염 완충 염수 (PBS)로 세척되었다. 혐기성 작업대 안에서, 공여자 세포 펠렛을 200 μL의 지수적으로 성장한 수령체 C. 오토에타노게눔에 재현탁시켰다. 접합 혼합물을 PETC-MES 한천 배지 상에 찍어넣고, 37　℃에서 배양하였다. 24 시간 후, 이 세포들을 접합 플레이트로부터 긁어내고, 7.5 μg 티암페니콜/mL (Sigma) 및 10 μg 트리메토프림/mL (Sigma)이 보충된 PETC-MES 한천 배지상에 도말하였다. 플라스미드를 품고 있는 3개의 콜로니 (가령 생물학적 트리플리케이트) 분리주는 7.5 μg 티암페니콜/mL와 탄소 공급원으로써 제강 가스가 함유된 PETC-MES 액체 배지에서 성장되었다.
액체 배양물은 티암페니콜과 22 psi의 제강 가스를 담고 있는 혈청 병 안에 10 mL PETC-MES 배지에서 성장되었다.
바이오매스를 분광광도계로 모니터링하였다 OD600 nm = 0.3에서 40 ng 무수물테트라사이클린/mL을 추가하여 살리실레이트 생합성 경로의 발현을 유도하였다. 듀플리케이트 배양물 (3개의 생물학적 트리플리케이트의 기술적 레플리케이트)는 무수물테트라사이클린 없이 성장되었고, 살리실레이트 생합성 경로은 유도안된 상태로 유지되었다. 시료를 매일 채취하였다.
Agilent CP-SIL 5CB-MS (50 m × 0.25 μm × 0.25 μm) 컬럼 및 오토샘플러가 구비된 Thermo Scientific ISQ LT GCMS를 이용하여, 기체 크로마토그래피 질량 분석(GCMS)에 의해 살리실레이트 농도가 측정되었다.　 600 μL의 아세토니트릴과 50 μL 0.1N NaOH로 300 μL의 시료를 희석하여 시료를 준비하였다. 상기 시료는 볼텍스한 후, 14,000 rpm에서 3분 동안 원심분리되었고; 800 μL의 상청액은 유리 바이알로 이동된 후, 시료는 Thermo SpeedVac®에서 건조되었다. 건조 후, 이 시료는 22 mg/ml 메톡시아민 HCl이 포함된 100 μL의 피리딘 용액에 현탁되었고, 그 다음 봉해진 유리 바이알에서 60℃에서 60분간 가열되었다. 이후, 300 μL N,O-비스트리플로오르아세타미드(BSTFA)가 추가되었고, 봉해진 유리 바이알에서 60℃에서 60분간 가열되었다. 분석을 위하여 시료는 1.5 μL 주사를 이용하여 오토샘플러로 옮겨진다: 분할 비는 20대 1, 그리고 유입 온도는 250℃임. 크로마토크래피는 80　℃ (유지 없음)에서 분당 3　℃의 경사로 140℃까지, 그리고 분당 20　℃의 경사로 230℃까지 오븐 프로그램과, 최종 4-분의 유지로 실시되었다. 컬럼 유속은 분당 38 cm2이며, 운반 가스는 헬륨이다. 　 MS 이온 공급원은 280　℃에서 유지되었다. 정량화(Quantitation)는 정량화 이온을 위하여 267m/z를 이용하여 실행하였고, 퀄리파이어(qualifier) 이온으로서 135 및 45m/z가 사용되었다.
도 11a은 유도된 시료와 유도안된 시료에서 바이오매스 성장을 비교한 것을 나타낸다. 도 11b에서 살리실레이트가 반복적으로 생산되었다는 것을 보여준다.
실시예 6
본 실시예는 코리스메이트-유도된 산물들의 강화된 생산을 위한 pheA 녹아웃을 실증하였다.
pheA (가령, C. 오토에타노게눔, CAETHG_0905 (CP006763.1:973789..974925)에서)는 효소 프레페네이트 합성효소를 암호화하는 유전자다. 프레페네이트 합성효소는 코리스메이트가 방향족 아미노산 페닐알라닌 및 티로신의 전구물질인 프레페네이트로 전환을 촉매한다. pheA 기능은 ClosTron 방법 (Heap et al., J Microbiol Methods. 2010, 80(1):49-55)을 이용하여 이 유전자를 파괴함으로써 녹아웃되었다. ClosTron 플라스미드 pMTL007C-E2는 DNA2.0에 의해 생성되었고 공여자로써 대장균 균주 CA434 와 접합을 통하여 C.　오토에타노게눔 LZ1561 (DSM23693)으로 형질변환되었다. 공여자 균주는 25 μg/mL 클로람페니콜이 보충된 LB 배지에서 하룻밤 동안 성장되었다. 1.5 mL의 배양물로부터 세포는 원심분리를 통하여 수거하고, 인산염 완충 염수 (PBS)로 세척되었다. 혐기성 작업대 안에서, 공여자 세포 펠렛을 200 μL의 지수적으로 성장한 수령체 C. 오토에타노게눔 LZ1561에 재현탁시켰다. 접합 혼합물을 PETC 한천 배지 상에 찍어넣고, 37　℃에서 배양하였다. 24 시간 후, 이 세포들을 접합 플레이트로부터 긁어내고, 500 μL PBS에 재현탁시키고, 그리고 7.5 μg/mL 티암페니콜 (Sigma) 및 10 μg/mL 트리메토프림 (Sigma)이 보충된 PETC 한천 배지 상에 도말하였다. 플라스미드를 품고있는 분리주는 탄소원으로 제강 가스와 함께 7.5 μg 티암페니콜/mL을 함유하는 PETC-MES 액체 배지에서 성장되었다.
항생제 클라리트로마이신 (5 μg/mL)이 함유된 PETC 고체 배지 상에 콜로니를 스트리킹하였다(streaked). 이 단계는 인트론 재표적 서열을 게놈에 통합하기 위해 선택되었다. 인트론 서열을 표적 부위에 통합시키면, 게놈에서 1800개의 염기쌍의 삽입을 초래하고, 이들은 콜로니 PCR에 의해 스크리닝되었다. 포지티브 ClosTron 돌연변이체의 PCR 산물은 정제되고, 서열화되어, 삽입 부위가 확인되었다.
액체 배양물은 클라리트로마이신과 22 psi의 제강 가스를 담고 있는 혈청 병안에 10 mL PETC-MES 배지에서 성장되었다. 이 혈청 병으로부터 글리세롤 스톡이 준비되었다.
생물반응장치 실험은 2 L BioFlo 115 워터 재킷 시스템(New Brunswick Scientific Corp., Edison, NJ)에서 실행되었는데, 작업 용적은 1.5　L이다. 상기 CSTR 시스템에는 6개-블레이드의 Rushton 임펠러 2개가 장착되어 있으며, 배플(baffles)은 발효액의 혼합과 가스의 액체량 이동을 개선시킨다. pH 및 산화-환원 전위 (ORP) 전극 (Broadley-James Corporation)은 해드플레이트를 통하여 삽입되었고, 5분 간격으로 이들의 판독이 기록되었다. 수산화암모늄 5 M 용액의 자동 첨가에 의해 pH는 5.0으로 유지되었다.
접종물은 글리세롤 스톡으로부터 준비되었다. 1 mL의 글리세롤 스톡은 탄소원으로 22 psi 제강 가스를 가진 PETC 배지 50ml로 전달되었다. 상기 배양물은 가시적인 성장이 관찰될 때까지 2-3일 동안 37　℃에서 배양되었다. 그 다음 이 배양물을 이용하여 1L-Schott 병 안에 200 mL의 새로운 배지를 접종하였고, 제강 가스는 22 psi 압력으로 추가되었다. Schott 병은 발효통으로 이동하기에 앞서 다시 24-36시간 동안 배양되었다.
교반은 200　rpm로 설정되었으며, 가스 유속은 35　mL/min/L으로 설정되었다. 하루 뒤, 교반 속도는 4시간 간격으로 25 rpm씩 증분되어 최대 값 900 rpm이 되도록 하였다. 가스 유속은 표적 CO 수취가 이루어질 수 있는 최대 유속으로 4시간 간격으로 25 mL/min/L 씩 증가되었다. Na2S는 발효 전체 과정에 걸쳐 추가되는데, 초기 발효 속도 0.3 mL/h이며, 이후 헤드스페이스에서 H2S 농도가 200~ppm 아래로 떨어지면, 0.2　mL/h씩 증분되어 증가시켰다. H2S 농도와 함께, CO 및 H2 소비, 그리고 CO2 생산은 기체 크로마토그래피(GC)를 사용하여 매시간 측정되었다 HPLC를 사용하여 세포 질량 및 대사산물 농도를 결정하기 위해, 발효 과정에 걸쳐 일정한 간격으로 발효기로부터 액체 시료를 채취했다.
배치(batch) 모드로 시작한 후, OD가 2의 값에 도달하면 발효기를 연속 모드로 전환시켰다. 배지 및 양분 유입 속도는 하나 또는 이상의 정밀 연동 펌프 (Masterflex L/S 디지털 구동 펌프)에 의해 제어되었으며, 발효기 용적은 CSTR로부터 발효액 제거를 위해 펌프를 작동시키는 레벨 프로브를 사용하여 일정하게 유지되었다. 희석 비율은 한 단계에서 0.5 일-1 로 설정되었으며, 24시간 간격으로 1 일-1 에서 1.7 일-1 로 증가되었다.
상기 발효에 추가되는 추가 장비는 공극 크기가 0.2 μm이며, 표면적이 1,200 cm2인 중공 섬유막(GE Healthcare)이다. 이 막은 발효에서 세포 농도를 증가시키는데 사용되었다. 이 발효액을 막을 통해 고속으로 펌핑한 후, 발효기로 다시 되돌려 보내고, 무-세포 여과액의 흐름은 배지 펌프 속도보다 느린 속도로 여과액 탱크로 펌핑했다. 이로 인하여 발효통 안의 세균 세포의 잔류류 시간이 증가되었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, GC-MS를 이용하여 3가지 새로운 화합물이 동정되었다. 이들 화합물은 cis-4-히드록시시클로헥산 카르복실산, 3,4-디히드록시벤조산, 그리고 2-아미노벤조산이다. 이들 화합물은 오직 pheA::CT 배양에서만 탐지되었고, 모계 균주 (LZ1561) 배양에서는 탐지되지 않았다.
3,4 디히드록시 벤조산, 2-아미노벤조산 및 cis-4-히드록시시클로헥산카르복실산 농도는 Agilent CP-SIL 5CB-MS (50 m × 0.25 μm × 0.25 μm) 컬럼, 오토샘플러, 그리고 불꽃 이온화 탐지기(FID)가 구비된 Agilent 6890N GC를 이용하여 기체 크로마토그래피(GC) 질량 분석에 의해 측정되었다.　 시료는 400 μL의 시료를 400 μL의 아세토니트릴로 희석시키고, 14,000 rpm에서 3분 동안 원심분리하여 준비되었고; 이 상청액은 유리 바이알로 이동된 후, 시료는 Thermo SpeedVac®에서 건조되었다. 건조후, 이 시료는 400 μL의 N,O-비스트리플로오르아세타미드(BSTFA) 및 피리딘(3:1 비율)의 용액에 재현탁되었고, 봉해진 유리 바이알에서 60℃에서 60분간 가열되었다. 시료는 1 μL 주사를 이용하여 분석을 위한 오토샘플러로 옮겨진다: 분할 비는 30대 1, 그리고 유입 온도는 250℃임. 크로마토크래피는 70　℃ (유지 없음)에서 분당 3　℃의 경사로 110℃까지, 그리고 분당 15　℃의 경사로 230℃까지, 그리고 분당 40　℃의 최종 경사로 310℃까지의 오븐 프로그램과, 최종 3-분의 유지로 실시되었다. 컬럼 유속은 분당 1.8 ml이며, 운반 가스는 헬륨이다. 　 FID는 320　℃에서 유지되었으며, 수소는 40 ml/min에서, 공기는 400 ml/min에서, 그리고 메이커업 가스(makeup gas)로써 헬륨은 20 ml/min로 유지되었다.
도 12는 발효 운용 과정에 걸쳐 cis-4-히드록시시클로헥산 카르복실산, 3,4-디히드록시벤조산, 그리고 2-아미노벤조산의 농도를 보여준다. 도 12에 나타난 바와 같이, 발효 6일차에 화합물 cis-4-히드록시시클로헥산카르복실산는 약 0.9g/L의 농도로 증가되었다. 2-아미노벤조산는 발효 8-9일차에 약 0.45g/L의 농도로 축적되었다. 3,4-디히드록시벤조산은 더 적은 양으로 생성되었는데, 6-8일차에 대략 0.3g/L의 농도에서 정점을 찍었다. 6일차에 관찰된 cis-4-히드록시시클로헥산카르복실산, 2-아미노벤조산 및 3,4-디히드록시벤조산의 전체 축적은 >1.3 g/L이었다.
cis-4-히드록시시클로헥산카르복실산 생산에 대하여 문헌에서 공지된 것은 거의 없다. GC-MS를 이용하여 어린이 소변에서 cis-4 히드록시시클로헥산카르복실산이 탐지되었다는 유일한 보고가 있다. 이 화합물은 장내 세균 대사의 부산물로 이라고 가설이 있다 (Kronick, Clinica Chimica Acta, 132: 205-208, 1983). 이 화합물은 반응 기전이 피루베이트 분자의 절단에 이어, NAD(P)H를 통하여 제공될 수 있는 추가 2.5 H2 분자를 필요로 하는 환원에 의해 설명될 수 있기 때문에, 코리스메이트 또는 프레파네이트의 직접적인 반응 산물로 보인다.
2-아미노벤조산은 상기 코리스메이트에서 트립토판 경로의 알려진 중간산물이다. 안트라닐레이트 합성효소는 아민화에 이어 코리스메이트의 방향족화를 촉매하여, 트립토판 분자의 방향족 골격을 얻게 된다. 안트라닐레이트 합성효소의 유전자 발현은 고도로 조절되고, 최종 산물 트립토판에 의한 피드백 억제를 받게되는 것으로 알려져 있다 (Dosselaere, Crit Rev Microbiol, 27: 75-131, 2001). 2-아미노벤조산은 성장이 멈출 때만 발효액으로 분비되며, 이것은 성장이 중단될 때, 더 이상 반응하지 않은 과다유출 산물임을 나타낸다.
본원에 인용된 출판물, 특허 출원 및 특허를 포함하는 모든 문헌은 각각의 문헌이 개별적으로, 그리고 참고 문헌으로 인용된 것으로서 본원에 그 전문이 기재되어있는 것과 동일한 정도로 참고 자료에 편입된다. 이 명세의 선행 기술에 대한 언급은 선행 기술이 임의의 나라에서 노력 분야에서 일반적인 지식의 일부를 구성한다는 것을 인정하는 것이 아니며, 그렇게 받아들여서도 안된다.
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본 발명의 바람직한 구체예들이 본원에 기술된다. 상기 바람직한 구체예들의 변형은 전술한 설명을 읽음으로써 당업자에게 자명해질 수 있다. 본 발명자는 숙련된 기술자들이 그러한 변형을 적절하게 사용할 것을 기대하며, 본 발명자는 본 발명이 본원에 구체적으로 기술된 것과 다르게 실시되도록 만들었다. 따라서, 본 발명은 적용 가능한 법률에 의해 허용된 바와 같이, 본 명세서에 첨부된 청구 범위에 기재된 주제의 모든 변경 및 등가물을 포함한다. 또한, 본원에서 달리 지시되지 않는 한 또는 문맥에 의해 명확하게 모순되지 않는 한, 모든 가능한 변형에서 상기 언급 된 요소의 임의의 조합이 본 발명에 포함된다.
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Gln Thr Ser Glu Ser His Pro Leu Arg Gln Phe 675 680 685 His Phe Thr Ser Trp Pro Asp His Gly Val Pro Asp Thr Thr Asp Leu 690 695 700 Leu Ile Asn Phe Arg Tyr Leu Val Arg Asp Tyr Met Lys Gln Ser Pro 705 710 715 720 Pro Glu Ser Pro Ile Leu Val His Cys Ser Ala Gly Val Gly Arg Thr 725 730 735 Gly Thr Phe Ile Ala Ile Asp Arg Leu Ile Tyr Gln Ile Glu Asn Glu 740 745 750 Asn Thr Val Asp Val Tyr Gly Ile Val Tyr Asp Leu Arg Met His Arg 755 760 765 Pro Leu Met Val Gln Thr Glu Asp Gln Tyr Val Phe Leu Asn Gln Cys 770 775 780 Val Leu Asp Ile Val Arg Ser Gln Lys Asp Ser Lys Val Asp Leu Ile 785 790 795 800 Tyr Gln Asn Thr Thr Ala Met Thr Ile Tyr Glu Asn Leu Ala Pro Val 805 810 815 Thr Thr Phe Gly Lys Thr Asn Gly Tyr Ile Ala 820 825 <210> 59 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2a self-cleaving peptide <400> 59 Arg Ala Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20 <210> 60 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2a self-cleaving peptide <400> 60 Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20 <210> 61 <211> 563 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> dual SH2 domains from SHP-2 fused to ZAP70 kinase domain <400> 61 Trp Phe His Pro Asn Ile Thr Gly Val Glu Ala Glu Asn Leu Leu Leu 1 5 10 15 Thr Arg Gly Val Asp Gly Ser Phe Leu Ala Arg Pro Ser Lys Ser Asn 20 25 30 Pro Gly Asp Phe Thr Leu Ser Val Arg Arg Asn Gly Ala Val Thr His 35 40 45 Ile Lys Ile Gln Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Asp Leu Tyr Gly Gly Glu 50 55 60 Lys Phe Ala Thr Leu Ala Glu Leu Val Gln Tyr Tyr Met Glu His His 65 70 75 80 Gly Gln Leu Lys Glu Lys Asn Gly Asp Val Ile Glu Leu Lys Tyr Pro 85 90 95 Leu Asn Cys Ala Asp Pro Thr Ser Glu Arg Trp Phe His Gly His Leu 100 105 110 Ser Gly Lys Glu Ala Glu Lys Leu Leu Thr Glu Lys Gly Lys His Gly 115 120 125 Ser Phe Leu Val Arg Glu Ser Gln Ser His Pro Gly Asp Phe Val Leu 130 135 140 Ser Val Arg Thr Gly Asp Asp Lys Gly Glu Ser Asn Asp Gly Lys Ser 145 150 155 160 Lys Val 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SHP-2 SH2 domain fused to an Akt kinase domain <400> 62 Trp Phe His Pro Asn Ile Thr Gly Val Glu Ala Glu Asn Leu Leu Leu 1 5 10 15 Thr Arg Gly Val Asp Gly Ser Phe Leu Ala Arg Pro Ser Lys Ser Asn 20 25 30 Pro Gly Asp Phe Thr Leu Ser Val Arg Arg Asn Gly Ala Val Thr His 35 40 45 Ile Lys Ile Gln Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Asp Leu Tyr Gly Gly Glu 50 55 60 Lys Phe Ala Thr Leu Ala Glu Leu Val Gln Tyr Tyr Met Glu His His 65 70 75 80 Gly Gln Leu Lys Glu Lys Asn Gly Asp Val Ile Glu Leu Lys Tyr Pro 85 90 95 Leu Asn Cys Ala Asp Pro Thr Ser Glu Arg Trp Phe His Gly His Leu 100 105 110 Ser Gly Lys Glu Ala Glu Lys Leu Leu Thr Glu Lys Gly Lys His Gly 115 120 125 Ser Phe Leu Val Arg Glu Ser Gln Ser His Pro Gly Asp Phe Val Leu 130 135 140 Ser Val Arg Thr Gly Asp Asp Lys Gly Glu Ser Asn Asp Gly Lys Ser 145 150 155 160 Lys Val Thr His Val Met Ile Arg Cys Gln Glu Leu Lys Tyr Asp Val 165 170 175 Gly Gly Gly Glu Arg Phe Asp Ser Leu Thr Asp Leu Val Glu His Tyr 180 185 190 Lys Lys Asn Pro Met Val Glu Thr Leu Gly 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occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa may be Ile, Val or Leu <400> 63 Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa 1 5

Claims (24)

  1. 적어도 하나의 코리스메이트-유도된 산물을 생산할 수 있는 유전적으로 조작된 일산화탄소영양성 초산생성 (carboxydotrophic acetogenic) 세균으로서, 상기 세균은 다음 중 적어도 하나를 포함하는, 세균:
    a. 외생성 코리스메이트 피루베이트 분해효소 (EC 4.1.3.40),
    b. 외생성 이소코리스메이트 합성효소 (EC　5.4.4.2),
    c. 외생성 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소 (EC 4.2.99.21), 및
    d. 프레페네이트 합성효소를 부분적으로 비활성화시키거나, 완전하게 비활성화시키거나, 결손시키거나, 또는 녹아웃시키는 파괴성 돌연변이를 포함하는 프레페네이트 합성효소 (EC　5.4.99.5).
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 세균은 가스 기질의 발효에 의해, 적어도 하나의 코리스메이트-유도된 산물을 생산할 수 있는 클로스트리듐(Clostridium) 세균인, 세균.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 코리스메이트 피루베이트 분해효소는 ubiC인, 세균.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 이소코리스메이트 합성효소는 pchA인, 세균.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소는 pchB인, 세균.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 프레페네이트 합성효소는 pheA인, 세균.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 파괴성 돌연변이는 프레페네이트 합성효소의 발현 또는 활성을 감소시키거나 제거하는 것인, 세균.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 세균은 모계 세균과 비교하였을 때 감소된 양의 프레페네이트 또는 프레페네이트-유도된 산물들을 생산하는 것인, 세균.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 세균은 티로신 또는 페닐알라닌을 생산하지 않는 것인, 세균.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 세균은 다음 중 적어도 하나를 암호화하는 적어도 하나의 핵산을 포함하는 것인, 세균:
    a.　 상기 외생성 코리스메이트 피루베이트 분해효소,
    b.　 상기 외생성 이소코리스메이트 합성효소,
    c.　 상기 외생성 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소, 및
    d.　　파괴성 돌연변이를 포함하는 상기 프레페네이트 합성효소.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 핵산은 클로스트리듐(Clostridium)에서 발현을 위하여 코돈 최적화된 것인, 세균.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 코리스메이트-유도된 산물은 카르복실 기 또는 카르복실레이트 음이온으로 치환되고, 하나 이상의 OH 기 및/또는 하나 이상의 NH2 기로 추가로 치환된, 6-원자의 탄소 환을 포함하는 것인, 세균.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 코리스메이트-유도된 산물은 파라-히드록시벤조산, 살리실레이트, 2-아미노벤조에이트, 디히드록시벤조에이트, 4-히드록시시클로헥산 카르복실산, 및 이의 염 및 이온으로 구성된 군에서 선택되는 것인, 세균.
  14. 청구항 1에 있어서, 상기 세균은 ubiC인 코리스메이트 피루베이트 분해효소를 발현시키고, 파라-히드록시벤조산인 코리스메이트-유도된 산물을 생산하는 것인, 세균.
  15. 청구항 1에 있어서, 상기 세균은 pchA인 이소코리스메이트 합성효소 및 pchB인 이소코리스메이트 피루베이트 분해효소를 발현시키고, 살리실레이트인 코리스메이트-유도된 산물을 생산하는 것인, 세균.
  16. 청구항 14 또는 15에 있어서, 상기 세균은 피드백-비감성 DAHP 합성효소를 추가로 발현시키는 것인, 세균.
  17. 청구항 1에 있어서, 상기 세균은 파괴성 돌연변이를 포함하는 프레페네이트 합성효소를 포함하고, 2-아미노벤조에이트, 2,3-디히드록시벤조에이트 또는 4-히드록시시클로헥산 카르복실산인 코리스메이트-유도된 산물을 생산하는 것인, 세균.
  18. 청구항 1에 있어서, 상기 세균은 모계 세균에 의해 생산되지 않는 적어도 하나의 코리스메이트-유도된 산물을 생산하는 것인, 세균.
  19. 청구항 1에 있어서, 상기 세균은 모계 세균보다 더 많은 양의 적어도 하나의 코리스메이트-유도된 산물을 생산하는 것인, 세균.
  20. 청구항 1에 있어서, 상기 세균은 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리듐 리중다레이(Clostridium ljungdahlii), 및 클로스트리듐 라가스다레이(Clostridium ragsdalei)로 구성된 군으로부터 선택된 모계 세균으로부터 유도된 것인, 세균.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum)은 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum) DSM23693인, 세균.
  22. 청구항 2에 있어서, 상기 가스 기질은 CO, CO2, 및 H2 중 적어도 하나를 포함하는 것인, 세균.
  23. 발효 산물을 생산하는 방법으로서,
    발효 산물을 생산하기 위하여 가스 기질의 존재하에 청구항 1의 세균을 발효시키는 단계를 포함하는, 방법.
  24. 청구항 23에 있어서, 상기 가스 기질은 CO, CO2, 및 H2 중 적어도 하나를 포함하는 것인, 방법.
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