BR122023023164A2 - Bactéria geneticamente modificada fixadora de c1 capaz de produzir pelo menos um produto derivado de corismato, e, método de fabricação de um produto de fermentação - Google Patents

Abstract

bactéria geneticamente modificada fixadora de c1 capaz de produzir pelo menos um produto derivado de corismato, e, método de fabricação de um produto de fermentação. a invenção apresenta micro-organismos geneticamente modificados e métodos para fabricação de produtos derivados de corismato, tais como ácido para-hidroxibenzoico, salicilato, 2-aminobenzoato, 2,3-dihidroxibenzoato, e ácido carboxílico 4-hidróxi-ciclohexano. geralmente, o micro-organismo compreende pelo menos uma corismato piruvato liase exógena, (b) uma isocorismato sintase exógena, (c) uma isocorismato piruvato liase exógena, e (d) uma prefanato sintase compreendendo uma mutação disruptiva.

Description

Descrição das Técnicas Relacionadas

[001] Este pedido de patente reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos No. 62/167,101 depositado em 27 de maio de 2015, cuja totalidade está incorporada no presente pedido como referência.

Campo da Invenção

[002] O presente pedido se refere a micro-organismos geneticamente modificados e métodos para a fabricação de produtos derivados de corismato através da fermentação microbiana, em particular, pela fermentação microbiana de um substrato gasoso.

Fundamentos da Invenção

[003] A geração atual de produtos químicos básicos biologicamente obtidos que utilizam tanto os cultivos alimentícios ou não-alimentícios para produzir açúcar ou matérias-primas à base de celulose possuem desvantagens com relação ao uso da terra, segurança alimentar, volatilidade do abastecimento, e questões ambientais.

[004] Há muito tempo reconheceu-se que os processos catalíticos podem ser utilizados para a conversão de gases contendo monóxido de carbono (CO) e/ou dióxido de carbono (CO2) e hidrogênio (H2) em uma variedade de combustíveis e produtos químicos. Contudo, os micro organismos também podem ser utilizados para converter tais gases em combustíveis e produtos químicos biologicamente. Os processos biológicos possuem muitas vantagens sobre os processos catalíticos, incluindo maior especificidade, maior rendimento, custos de energia reduzidos, e maior resistência catalítica à intoxicação.

[005] O CO é o principal subproduto livre de alto teor energético da combustão incompleta de materiais orgânicos tais como o carvão ou óleo, e produtos derivados de óleos. Por exemplo, foi relatado que a indústria do aço na Austrália produz e libera mais de 500.000 toneladas de CO na atmosfera anualmente.

[006] A habilidade de micro-organismos se desenvolverem no CO como uma fonte única de carbono foi descoberta pela primeira vez em 1903. Isso foi posteriormente considerado com uma propriedade dos micro organismos que usam a via bioquímica acetilcoenzima A (Acetil-CoA) de crescimento autotrófico, também conhecida como a via de Wood-Ljungdahl. Um grande número de micro-organismos incluindo micro-organismos fotossintéticos, metanogênicos e acetogênicos têm demonstrado metabolizar o CO para vários produtos finais, quais sejam, CO2, H2, metano, n-butanol, acetato e etanol.

[007] O composto aromático ácido para-hidróxibenzóico (pHBA) é um monômero fundamental usado em polímeros de cristal líquido e também usado como precursor na produção de ésteres para-hidróxibenzoato ou para- hidróxibenzóico, comumente conhecidos como parabenos. Os polímeros de cristal líquido incluem Kevlar e Vectran, que possuem múltiplos usos. Os parabenos e seus sais são utilizados em uma gama de indústrias incluindo de cosméticos, farmacêutica e indústria alimentícia. São conservantes efetivos e podem ser utilizados por suas propriedades bactericidas e fungicidas em formulações cosméticas e alimentares.

[008] Assim, permanece uma necessidade por micro-organismos e métodos para a fabricação de pHBA adicionais e outros produtos de valor elevado derivados de corismato.

Descrição da Invenção

[009] A invenção se refere a um micro-organismo geneticamente modificado capaz de fabricar produtos derivados de corismato. Particularmente, a invenção se refere a um micro-organismo geneticamente modificado capaz de fabricar ao menos um produto derivado de corismato, em que a bactéria compreende pelo menos uma (a) corismato piruvato liase exógena (EC 4.1.3.40), (b) uma isocorismato sintase exógena (EC 5.4.4.2), (c) uma isocorismato piruvato liase exógena (EC 4.2.99.21), e (d) uma prefanato sintase (EC 5.4.99.5) compreendendo uma mutação disruptiva. Em realizações específicas, o micro-organismo geneticamente modificado é uma bactéria fixadora de C1, tal como a bactéria Clostridium, capaz de produzir pelo menos um produto derivado de corismato pela fermentação de um substrato gasoso contendo C1.

[0010] Por exemplo, a corismato piruvato liase pode ser ubiC, a isocorismato sintase pode ser pchA, a isocorismato piruvato liase pode ser pchB, e a prefanato sintase pode ser pheA. A mutação disruptiva na prefanato sintase pode reduzir ou eliminar a expressão ou atividade da prefanato sintase. Tal mutação disruptiva pode gerar uma bactéria que produz uma quantidade reduzida de prefanato ou produtos derivados de prefanato se comparado a uma bactéria parental e/ou a uma bactéria que não produz considerável tirosina ou fenilalanina.

[0011] O micro-organismo da invenção pode compreender pelo menos um ácido nucleico que codifica pelo menos uma (a) corismato piruvato liase exógena, (b) uma isocorismato sintase exógena, (c) uma isocorismato piruvato liase exógena, e (d) uma prefanato sintase compreendendo uma mutação disruptiva. Em algumas realizações, o ácido nucleico é códon otimizado para expressão em Clostridium.

[0012] O produto derivado de corismato pode ser qualquer produto fabricado direta ou indiretamente a partir de corismato. Em particular, o produto derivado de corismato pode compreender um anel de carbono de 6 membros, por exemplo, um anel de benzeno ou de ciclohexano, substituído com um grupo carboxila ou ânion carboxilato e posteriormente substituído com um ou mais grupos de OH e/ou um ou mais grupos de NH2. Os produtos derivados de corismato incluem, mas não são limitados a, ácido para- hidróxibenzóico, salicilato, 2-aminobenzoato, dihidróxibenzoato, e ácido carboxílico 4-hidróxi-ciclohexano.

[0013] Em uma realização, o micro-organismo da invenção expressa uma corismato piruvato liase de ubiC e produz um produto de ácido para- hidróxibenzóico derivado de corismato. Em uma realização o micro organismo da invenção posteriormente expressa uma DAHP sintase insensível a retroalimentação.

[0014] Em uma realização, o micro-organismo da invenção expressa uma isocorismato sintase de pchA e uma isocorismato piruvato liase de pchB e forma um produto derivado de corismato de salicilato. Em uma realização o micro-organismo da invenção posteriormente expressa uma DAHP sintase insensível a retroalimentação.

[0015] Em uma realização, o micro-organismo da invenção compreende uma prefanato sintase compreendendo uma mutação disruptiva e produz um produto derivado de ácido 2-aminobenzoato, 2,3- dihidróxibenzoato, e carboxílico 4-hidróxi-ciclohexano derivado de corismato.

[0016] Em uma realização, o micro-organismo da invenção produz pelo menos um produto derivado de corismato não produzido por um micro organismo parental ou uma maior quantidade de pelo menos um produto derivado de corismato do que o micro-organismo parental.

[0017] Em uma realização, a bactéria da invenção é derivada de uma bactéria parental fixadora de C1. Em uma realização preferencial, a bactéria da invenção é derivada de uma bactéria parental selecionada do grupo constituído por Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, e Clostridium ragsdalei. Em uma realização específica preferencial, a bactéria da invenção é derivada de uma bactéria parental de Clostridium autoethanogenum depositada sob DSMZ tendo o número de acesso DSM23693.

[0018] A invenção, ainda, se refere a um método de produzir um produto de fermentação, compreendendo a fermentação de um micro organismo da invenção na presença de um substrato gasoso contendo C1. De um modo geral, o produto de fermentação é um produto derivado de corismato. Em uma realização preferencial, o substrato gasoso compreende pelo menos uma fonte de carbono C1.

Breve Descrição das Figuras

[0019] A Fig. 1 é um diagrama que mostra a produção de corismato através de uma via do chiquimato nativa em Clostridia.

[0020] A Fig. 2 é um diagrama que mostra a via para a produção de pHBA em uma bactéria Clostridium geneticamente modificada.

[0021] A Fig. 3 é um diagrama que mostra a via para a produção de salicilato em uma bactéria Clostridium geneticamente modificada.

[0022] A Fig. 4 é um diagrama que mostra a via para a produção de produtos aromáticos em uma bactéria Clostridium geneticamente modificada compreendendo uma mutação disruptiva em um ácido nucleico que codifica pheA.

[0023] A Fig. 5 é um gráfico de uma curva padrão que mostra a quantificação de padrões pHBA autênticos.

[0024] A Fig. 6a é um gráfico que mostra a contagem total de íon de padrões autênticos (i) padrões autênticos de pHBA (trimetil silano) preparado no meio de cultura sobrenadante de C. autoethanogenum LZ1561, (ii) padrão autêntico de pHBA (trimetil silano) preparado na água, e (iii) espectro de massas de pHBA trimetil silano.

[0025] A Fig. 6b é um gráfico que mostra o monitoramento de íon selecionado de amostras de fermentação e padrões: (i) C. autoethanogenum LZ1561 sem plasmídeo pARO_01, (ii) e (iii) amostras de C. autoethanogenum LZ1561 carregando plasmídeo pARO_01, (iv) padrão autêntico de pHBA, e (v) comparação de contagem de íon total entre a inserção na base de dados do Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia (em inglês: NIST - National Institute of Standards and Technology) para pHBA e pico de pHBA do LZ1561/pARO_01.

[0026] A Fig. 7 é um diagrama de um plasmídeo pARO_01. A corismato piruvato liase (ubiC) e a sintase DAHP (aroG*) que não reage ao retorno estão sob o controle do promotor Wood-Ljungdahl (Pwl). Outras características do vetor de transporte também são apresentadas.

[0027] A Fig. 8 é um gráfico que mostra o acúmulo de biomassa em estirpes de teste. A biomassa foi calculada através da medição da absorção de amostras de culturas a 600 nm em diferentes momentos. Os dados representam a média de culturas replicadas n=3 a ± 1 de desvio padrão. LZ1561 se refere a C. autoethanogenum LZ1561 não transformada. pARO_01(1) e pARO_01(2) são réplicas biológicas de C. autoethanogenum LZ1561 transformada com o plasmídeo pARO_01.

[0028] As Figs. 9a e 9b são gráficos que mostram o acúmulo de p- hidróxibenzoato em estirpes de teste. A Fig. 9a mostra a quantificação de pHBA detectado em cada amostra a 24, 96, 144, e 192 momentos de uma hora. Três culturas replicadas foram amostradas pela estirpe de controle negativo (C. autoethanogenum LZ1561) e pelas duas réplicas biológicas de C. autoethanogenum LZ1561 carregando pARO_01. A Fig. 9b mostra a média de réplicas técnicas n=3 a ± 1 de desvio padrão.

[0029] A Fig. 10 é um gráfico mostrando a produção de novos compostos aromáticos em uma bactéria Clostridium geneticamente modificada compreendendo uma mutação disruptiva em um ácido - hidróxi- ciclohexano, ácido 2-aminobenzóico, e ácido 3,4-dihidróxibenzóico, ao passo que a estirpe de controle (LZ1561) não produz.

[0030] A Fig. 11a é um gráfico que mostra o crescimento da biomassa da estirpe de produção de salicilato com e sem indução da via de salicilato biossintético.

[0031] A Fig. 11b é um gráfico que mostra a diferença no acúmulo de salicilato em culturas líquidas da estirpe de teste com e sem indução da via de salicilato biossintético.

[0032] A Fig. 12 é um gráfico que mostra a concentração de ácido 4- hidróxi-ciclohexano, ácido 2-aminobenzóico, e ácido 3,4-dihidróxibenzóico produzido pela fermentação de uma bactéria Clostridium modificada compreendendo uma mutação disruptiva em um ácido nucleico que codifica pheA.

[0033] A Fig. 13 é uma tabela que identifica fontes demonstrativas de corismato piruvato liase (EC 4.1.3.40).

[0034] A Fig. 14 é uma tabela que identifica fontes demonstrativas de isocorismato sintase (EC 5.4.4.2).

[0035] A Fig. 15 é uma tabela que identifica fontes demonstrativas de isocorismato piruvato liase (EC 4.2.99.21).

Descrição Detalhada da Invenção

[0036] A Clostridia naturalmente produz corismato, o qual serve como precursor dos aminoácidos aromáticos triptofano, tirosina, e fenilalanina, do fosfoenolpirúvico e eritrose-4-fosfato através da via do chiquimato (Fig. 1). A via é descrita detalhadamente em Bentley, Crit Rev Biochem Mol Biol, 25.5: 307-384, 1990. A invenção se refere a uma bactéria geneticamente modificada capaz de fabricar pelo menos um produto derivado de corismato através da fermentação de um substrato gasoso.

[0037] Os inventores demonstraram que os produtos derivados de corismato podem ser produzidos de modo sustentável e recuperados de uma fonte de carbono C1. A invenção se refere a um método para produzir pelo menos um produto derivado de corismato usando um substrato gasoso contendo C1 como fonte principal de carbono e energia. Desta forma, a presente invenção possui diversas vantagens com relação aos processos que dependem de substratos com base em açúcar - ou celulose. Por exemplo, os substratos com base em açúcar - ou celulose - são tipicamente úteis para alimentos (ex.: cana de açúcar) e seu uso extensivo da terra tem consequências negativas ao ambiente. Ainda, a invenção se refere a um método alternativo para a fabricação de produtos derivados de corismato, opcionalmente pelo uso de gases residuais (ex.: CO de processos industriais). Adicionalmente, a invenção se refere a uma fonte de receita a partir dos gases residuais e, ainda, captura o carbono nesses gases residuais para reduzir as emissões de carbono que ocorreriam se os gases fossem queimados na atmosfera.

[0038] Micro-organismos heterotróficos tais como E. coli e S. cerevisiae produzem níveis relativamente altos de ATP através da glicólise. Em contraste, os micro-organismos que usam fontes de carbono C1 (ex.: CO ou CO2) possuem disponibilidade baixa de ATP. Por exemplo, a análise das cinéticas das reações em um micro-organismo carboxidotrófico C. autoethanogenumtípico dá o rendimento de ATP previsto na produção de pHBA, um produto derivado de corismato de -0,4 ATP por mol de CO fixado. Assim, não seria esperado que nenhum pHBA fosse produzido devido às restrições de energia. Da mesma forma, não seria esperado que outros produtos derivados de corismato fossem produzidos por um micro-organismo carboxidotrófico devido à responsabilidade de produzir tais compostos sob condições autotróficas. Os inventores surpreendentemente mostraram, no entanto, que diversos produtos derivados de corismato podem ser produzidos a partir de um substrato gasoso. Adicionalmente, mencionados produtos podem ser produzidos a partir de gases residuais industriais que fornecem benefícios práticos, econômicos e ambientais com relação a outros substratos.

[0039] Particularmente, a invenção se refere a micro-organismos geneticamente modificados capazes de fabricar ao menos um produto derivado de corismato pela introdução de pelo menos um (a) ácido nucleico que codifica uma corismato piruvato liase exógena, (b) ácido nucleico que codifica uma isocorismato sintase exógena (também conhecida como isocorismato mutase), (c) ácido nucleico que codifica uma isocorismato piruvato liase exógena, e (d) ácido nucleico que codifica uma prefanato sintase compreendendo uma mutação disruptiva. Em uma realização preferencial, o micro-organismo geneticamente modificado é uma bactéria fixadora de C1 capaz de produzir pelo menos um produto derivado de corismato pela fermentação de um substrato gasoso. Em realizações preferenciais, a bactéria fixadora de C1 é uma bactéria Clostridium.

[0040] Um “produto derivado de corismato” ou termos similares englobam produtos fabricados direta ou indiretamente do corismato (ou ácido corísmico). Os produtos derivados de corismato geralmente compreendem um anel de carbono de 6 membros, por exemplo, um anel de benzeno ou ciclohexano, substituído com um grupo carboxila ou ânion carboxilato e posteriormente substituído com um ou mais grupos de OH e/ou um ou mais grupos de NH2. Especificamente, os produtos derivados de corismato incluem, mas não são limitados a, ácido para-hidróxibenzóico, salicilato, 2- aminobenzoato, 2,3-dihidróxibenzoato, 3,4-dihidróxibenzoato, e ácido carboxílico 4-hidróxi-ciclohexano.

[0041] O micro-organismo da invenção pode compreender uma corismato piruvato liase exógena (EC 4.1.3.40) que catalisa a conversão de corismato para ácido para-hidróxibenzóico e piruvato na primeira etapa definida de biossíntese da ubiquinona. A enzima pode ser derivada de qualquer micro-organismo que contenha tal enzima. A enzima pode ser uma enzima UbiC. A enzima UbiC pode ser derivada de Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Citrobacter freundii, ou qualquer outro micr-oorganismo que possua a enzima UbiC. Em uma realização, a enzima UbiC é derivada de Escherichia coli e compreende a SEQ ID NO: 1 ou uma variante dessa funcionalmente equivalente.

[0042] Da mesma maneira, o micro-organismo da invenção deve compreender um ácido nucleico que codifica uma corismato piruvato liase exógena. O ácido nucleico pode ser um gene corismato piruvato liase de qualquer micro-organismo contendo tal gene. O gene corismato piruvato liasepode ser um gene ubiC. O gene ubiC pode ser derivado de Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Citrobacter freundii, ou qualquer outro micro organismo contendo tal gene. Em uma realização, o gene ubiCé derivado de Escherichia coli e compreende a SEQ ID NO: 2 ou códon-otimizado ou uma variante desse funcionalmente equivalente.

[0043] A enzima UbiC ou o gene ubiC podem também ser modificados (por exemplo, mutados) para melhorar a solubilidade, a estabilidade, ou outras propriedades do(a) gene/enzima. Essas modificações podem resultar em maiores titulações do produto. O Exemplo 4 descreve um protocolo experimental para modificar a enzima UbiC a fim de reduzir a inibição de produto através da retenção do ácido para-hidróxibenzóico. Uma modificação particular envolve a modificação do gene ubiC para expressar a enzima UbiC com duas serinas de superfície-ativa invés de cisteínas. Os resíduos de serina resultam em menos agregação de proteína e, por sua vez, em solubilidade aperfeiçoada. Assim, em uma realização específica, a enzima UbiC compreende uma mutação para substituir pelo menos uma cisteína de superfície-ativa com uma serina.

[0044] Em realizações alternativas, a corismato piruvato liase (EC 4.1.3.40) pode ser ou pede ser derivada de, por exemplo, quaisquer fontes identificadas na Fig. 13.

[0045] A introdução de uma corismato piruvato liase exógena (por exemplo, ubiC), ou um ácido nucleico que codifica uma corismato piruvato liase exógena (por exemplo, ubiC) resulta na produção de ácido para- hidróxibenzóico, de um produto derivado de corismato, pelo micro-organismo da invenção. A produção de ácido para-hidróxibenzóico é ilustrada na Fig. 2. As bactérias fixadoras de C1 incluindo as espécies Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Blautia producta, Butyribacterium methylotrophicum, Clostridium aceticum, Clostridium autoethanogenum, Clostridium carboxidivorans, Clostridium coskatii, Clostridium drakei, Clostridium formicoaceticum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium magnum, Clostridium ragsdalei, Clostridium scatologenes, Eubacterium limosum, Moorella thermautotrophica, Moorella thermoacetica, Oxobacter pfennigii, Sporomusa ovata, Sporomusa silvacetica, Sporomusa sphaeroides, e Thermoanaerobacter kivui, não produzem ácido para-hidróxibenzóico naturalmente. Na verdade, uma vez que a ubiquinona é geralmente produzida em micro-organismos de respiração aeróbia, a corismato piruvato liase não é comumente encontrada em micro-organismos carboxidotróficos. Embora seja esperado que o desvio de corismato para produzir pHBA invés de aminoácidos teria efeitos prejudiciais no crescimento ou sobrevivência do micro-organismo, os inventores demonstraram que o micro-organismo não é afetado a um grau que significantemente comprometa a sobrevivência e crescimento sob condições regulares.

[0046] O ácido para-hidróxibenzóico pode também ser conhecido, por exemplo, como pHBA, ácido 4-hidróxibenzóico, ácido p-hidróxibenzóico, ou para-hidróxibenzoato. Referências a quaisquer um desses termos, conforme usados no presente documento, englobam tanto a forma do ácido como a forma aniônica da molécula.

[0047] O micro-organismo da invenção deve compreender uma enzima isocorismato sintase exógena, também conhecida como isocorismato mutase, (EC 5.4.4.2) que catalisa a conversão de corismato em isocorismato. A enzima pode ser derivada de qualquer micro-organismo que contenha tal enzima. A enzima pode ser uma enzima PchA. A enzima PchA pode ser derivada de Pseudomonas aeruginosa ou de qualquer outro micro-organismo que contenha uma enzima PchA. Em uma realização, a enzima PchA é derivada de Pseudomonas aeruginosa e compreende a SEQ ID NO: 3 ou uma variante desta funcionalmente equivalente.

[0048] Da mesma forma, o micro-organismo da invenção pode compreender um ácido nucleico que codifica uma isocorismato sintase exógena. O ácido nucleico pode ser um gene da isocorismato sintase derivado de qualquer micro-organismo contendo tal gene. O gene da isocorismato sintase pode ser um gene pchA. O gene pchA pode ser derivado de Pseudomonas aeruginosa ou qualquer outro micro-organismo contendo um gene pchA. Em uma realização, o gene pchAé derivado de Pseudomonas aeruginosa e compreende a SEQ ID NO: 4 ou um códon otimizado ou variante deste funcionalmente equivalente.

[0049] Em realizações alternativas, a isocorismato sintase (EC 5.4.4.2) pode ser ou pode ser derivada, por exemplo, de quaisquer umas das fontes identificadas na Fig. 14.

[0050] O micro-organismo da invenção pode compreender uma corismato piruvato liase exógena (EC 4.2.99.21) que catalisa a conversão de isocorismato para salicilato e piruvato. A enzima pode ser derivada de qualquer micro-organismo que contenha tal enzima. A enzima pode ser uma enzima PchB. A enzima PchB pode ser derivada de Pseudomonas aeruginosa ou de qualquer outro micro-organismo contendo a enzima PchB. Em uma realização, a enzima PchB é derivada de Pseudomonas aeruginosa e compreende a SEQ ID NO: 5 ou uma variante desta funcionalmente equivalente.

[0051] Do mesmo modo, o micro-organismo da invenção pode compreender um ácido nucleico que codifica uma corismato piruvato liase exógena. O ácido nucleico pode ser um gene liase isocorismato piruvato derivado de qualquer micro-organismo contendo tal gene. O gene isocorismato piruvato liase pode ser um gene pchB. O gene pchB pode ser derivado de Pseudomonas aeruginosa ou qualquer outro micro-organismo contendo um gene pchB. Em uma realização, o gene pchBé derivado de Pseudomonas aeruginosa e compreende a SEQ ID NO: 6 ou um códon otimizado ou uma variante desse funcionalmente equivalente.

[0052] Em realizações alternativas, a isocorismato piruvato liase (EC 4.2.99.21) pode ser ou pode ser derivada de, por exemplo, quaisquer uma das fontes identificadas na Fig. 15.

[0053] A introdução de (1) uma isocorismato sintase exógena (ex.: pchA) e (2) uma isocorismato piruvato liase exógena (ex.: pchB) resulta na produção de salicilato, um produto derivado de corismato, pelo micro organismo da invenção. A produção de salicilato conforme ilustrado na Fig. 3, segundo a qual o corismato é convertido para isocorismato pela isocorismato sintase e então posteriormente convertido em piruvato pela isocorismato piruvato liase. As bactérias fixadoras de C1 incluindo as espécies Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Blautia producta, Butyribacterium methylotrophicum, Clostridium aceticum, Clostridium autoethanogenum, Clostridium carboxidivorans, Clostridium coskatii, Clostridium drakei, Clostridium formicoaceticum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium magnum, Clostridium ragsdalei, Clostridium scatologenes, Eubacterium limosum, Moorella thermautotrophica, Moorella thermoacetica, Oxobacter pfennigii, Sporomusa ovata, Sporomusa silvacetica, Sporomusa sphaeroides, e Thermoanaerobacter kivui, não produzem salicilato naturalmente.

[0054] O salicilato pode também ser conhecido, por exemplo, como 2-hidróxibenzoato, ácido salicílico, ou ácido 2-hidróxibenzóico. Referências a quaisquer um desses termos, conforme usados no presente documento, englobam tanto a forma do ácido como a forma aniônica da molécula. (d) prefanato sintase compreendendo uma mutação disruptiva

[0055] O micro-organismo da invenção pode compreender uma enzima prefanato sintase (EC 5.4.99.5) compreendendo uma mutação disruptiva. Uma prefanato sintase geralmente catalisa a conversão de prefanato). Desta forma, uma enzima prefanato sintase compreendendo uma mutação disruptiva é incapaz, ou menos capaz de catalisar a conversão de corismato para prefanato. A prefanato sintase compreendendo uma mutação disruptiva pode ser pheA compreendendo uma mutação disruptiva. A prefanato sintase também pode ser conhecida como mutase corismato.

[0056] Em algumas realizações, a pheA pode ser uma enzima funcional que carrega tanto a prefanato sintase (ex.: mutase corismato) (EC 5.4.99.5) e as reações da prefanato desidratase (EC 4.2.1.51). Em micro organismos onde essas duas reações são carregadas por enzimas separadas, nocautear a atividade EC 5.4.99.5 resultará em uma produção significantemente reduzida ou na eliminação da produção de prefanato ou compostos derivados de prefanato, enquanto nocautear a atividade EC 4.2.1.51 sozinha não resultaria no mesmo fenótipo, uma vez que o prefanato pode ainda ser produzido. Em uma realização, a pheA é derivada de Clostridium autoethanogenum e compreende a SEQ ID NO: 11 ou uma variante desta funcionalmente equivalente.

[0057] Do mesmo modo, o micro-organismo da invenção pode compreender um ácido nucleico que codifica a prefanato sintase compreendendo uma mutação disruptiva. O ácido nucleico pode ser um gene pheA compreendendo uma mutação disruptiva. Em uma realização, a mutação disruptiva é uma mutação nocaute de um gene pheA. Em uma realização, o gene pheAé derivado de Clostridium autoethanogenum e compreende a SEQ ID NO: 10 ou um códon otimizado ou uma variante deste funcionalmente equivalente.

[0058] A prefanato sintase disruptiva resulta na redução ou na eliminação da produção de fenilalanina e tirosina. Surpreendentemente, a prefanato sintase disruptiva também resulta na produção de produtos adicionais que não são geralmente produzidos ou que são produzidos apenas em níveis muito baixos.

[0059] Em particular, a introdução de uma mutação disruptiva a uma prefanato sintase (ex.: pheA) ou um ácido nucleico que codifica a prefanato sintase (ex.: pheA) resulta na produção de um ou mais 2-aminobenzoato, dihidróxibenzoato, e ácido carboxílico 4-hidróxi-ciclohexano, todos os produtos derivados de corismato, pelo micro-organismo da invenção. As vias de produção desses produtos são ilustradas na Fig. 4. Muitos micro organismos, incluindo espécies de Clostridia tais como Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, e Clostridium ragsdalei, não fabricam esses produtos naturalmente ou apenas os produzem em níveis muito baixos.

[0060] Fontes demonstrativas de pheA são fornecidas. No entanto, deveria ser apreciado que outras fontes adequadas para pheA podem estar disponíveis. A prefanato desidratase é ou deve ser derivada, por exemplo, de quaisquer umas das seguintes fontes, cujas sequências estão publicamente disponíveis.

[0061] O ácido 2-aminobenzoato pode também ser descrito como, por exemplo, ácido 2-aminobenzóico, ácido o-aminobenzóico, ácido antranílico, antranilato, ou vitamina L1. Referências a quaisquer um desses termos, conforme usados no presente documento, englobam tanto a forma do ácido como a forma aniônica da molécula.

[0062] O ácido dihidróxibenzoato pode ser descrito como, por exemplo, 2,3-dihidróxibenzoato, ácido 2,3-dihidróxibenzóico, 3,4- dihidróxibenzoato, ácido 3,4-dihidróxibenzóico ou ácido Protocatecuico. Referências a quaisquer um desses termos, conforme usados no presente documento, englobam tanto a forma do ácido como a forma aniônica da molécula.

[0063] O ácido carboxílico 4-hidróxi-ciclohexano pode também ser descrito como, por exemplo, ácido carboxílico cis-4-hidróxi-ciclohexano ou 4-hidróxi-ciclohexano-1-carboxilato. Referências a quaisquer um desses termos, conforme usados no presente documento, englobam tanto a forma do ácido como a forma aniônica da molécula.

[0064] Em outra realização, o micro-organismo da invenção também compreende um ácido nucleico que codifica uma DAHP sintase insensível a retroalimentação a DAHP sintase catalisa a primeira etapa definida na via do chiquimato (Fig. 1) na qual eritrose-4-fosfato e fosfoenolpiruvato são convertidos para 3-deoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato. Os inventores acreditam que esta etapa na via seja sujeita à inibição de retorno pelos aminoácidos aromáticos (triptofano, tirosina e fenilalanina) como descrito para E. coli (Hu et al. J. Basic Microbiol. 2003, 43:399-406). Assim, com base no estado da técnica, os inventores desenvolveram uma DAHP sintase insensível a retroalimentação, a qual acredita-se reduzir o risco de fluxo de produtos derivados de corismato serem diminuídos por esta inibição do retorno. Os ácidos nucleicos que codificam as sintases DAHP apropriadas são conhecidos pelos técnicos no assunto. No entanto, a título exemplificativo, o ácido nucleico que codifica a sintase DAHP pode ser derivado de Escherichia coli, Clostridium beijerinckii, ou Saccharomyces cerevisiae. Em uma realização, a sintase DAHP pode ser uma sintase que não reage ao retorno de Escherichia coli, contendo a sequência do ácido nucleico SEQ ID NO: 7 e a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 8. A DAHP sintase insensível a retroalimentação pode ser introduzida no mesmo vetor que um gene que codifica uma das enzimas anteriormente mencionadas ou em um vetor diferente. A DAHP sintase insensível a retroalimentação pode ter seu próprio promotor ou pode seguir o promotor de uma das enzimas anteriormente mencionadas em um arranjo bicistrônico, em que um único promotor carrega a transcrição de um RNA mensageiro que codifica tanto a enzima como a DAHP sintase insensível a retroalimentação.

[0065] Em uma realização, o micro-organismo da invenção compreende uma enzima corismato piruvato liase exógena (EC 4.1.3.40), e uma DAHP sintase insensível a retroalimentação. Em realizações específicas o micro-organismo compreende uma enzima UbiC exógena, e uma DAHP sintase insensível a retroalimentação exógena. Em uma realização específica, a invenção compreende um gene ubiC exógeno que possui uma sequência de ácido nucleico SEQ ID NO: 1, e uma DAHP sintase insensível a retroalimentação exógena que possui uma sequência de ácido nucleico SEQ ID NO: 7. Em uma realização, o micro-organismo compreende tanto uma enzima corismato piruvato liase exógena como uma DAHP sintase insensível a retroalimentação exógena que expressa uma maior produção de ácido para- hidróxibenzóico se comparado a um micro-organismo sem uma DAHP sintase insensível a retroalimentação.

[0066] Da mesma forma, o micro-organismo da invenção pode compreender um ácido nucleico que codifica tanto uma enzima corismato piruvato liase exógena como uma DAHP sintase insensível a retroalimentação.

[0067] Em uma realização, o micro-organismo da invenção compreende (i) uma isocorismato mutase exógena, (EC 5.4.4.2), (ii) uma enzima isocorismato piruvato liase exógena (EC 4.2.99.21), e (iii) uma DAHP sintase insensível a retroalimentação exógena. Em realizações específicas o micro-organismo compreende uma enzima PchA, uma enzima PchB exógena, e uma DAHP sintase insensível a retroalimentação exógena. Em uma realização, o micro-organismo compreende uma DAHP sintase insensível a retroalimentação exógena que expressa uma maior produção de ácido salicílico se comparado a um micro-organismo sem uma DAHP sintase insensível a retroalimentação.

[0068] Da mesma forma, o micro-organismo da invenção pode compreender um ácido nucleico que codifica tanto uma enzima corismato piruvato liase exógena como uma DAHP sintase insensível a retroalimentação.

[0069] Em outra realização, o micro-organismo da invenção não compreende uma DAHP sintase insensível a retroalimentação e, invés disso, simplesmente compreende uma DAHP sintase endógena. Onde a produção ou concentração natural de aminoácidos aromáticos é esperada como sendo baixa o suficiente para não induzir a inibição do retorno, não é necessário introduzir uma DAHP sintase insensível a retroalimentação.

[0070] O micro-organismo da invenção pode fabricar produtos derivados de corismato em qualquer concentração ou em qualquer quantidade. Em uma realização, o micro-organismo da invenção fabrica produtos derivados de corismato em qualquer concentração de pelo menos cerca de 5 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L, 30 mg/L, 50 mg/L, 75 mg/L, 100 mg/L, 200 mg/L, 500 mg/L, 750 mg/L, 1g/L, 1,5g/L ou 2 g/L. Em uma realização, o micro-organismo da invenção fabrica pelo menos um produto derivado de corismato em qualquer concentração de pelo menos 10 mg/L, 50gm/L, 100mg/L, 500mg/L, 800mg/L ou 1g/L.

[0071] Adicionalmente, o micro-organismo da invenção pode ser modificado para fabricar produtos com uma certa seletividade ou com uma seletividade mínima. Em uma realização, um produto-alvo derivado de corismato corresponde a pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50%, ou 75% de todos os produtos de fermentação produzidos pelo micro organismo da invenção. Em uma realização, o produto-alvo derivado de corismato corresponde a pelo menos cerca de 10% de todos os produtos de fermentação produzidos pelo micro-organismo da invenção, tanto que o micro-organismo da invenção possui seletividade para o produto-alvo derivado de corismato de pelo menos 10%. Em outra realização, o produto- alvo derivado de corismato corresponde a pelo menos cerca de 30% de todos os produtos de fermentação produzidos pelo micro-organismo da invenção, tanto que o micro-organismo da invenção possui seletividade para o produto- alvo derivado de corismato de pelo menos 30%.

[0072] A invenção se refere ainda a um método de produção de um produto de fermentação, especialmente um produto derivado de corismato, compreendendo a fermentação do micro-organismo da invenção na presença de um substrato gasoso.

[0073] A invenção também se refere a produtos derivados de corismato produzidos pela fermentação do micro-organismo da invenção na presença de um substrato gasoso. Definições e Antecedentes

[0074] O termo “modificação genética” ou “engenharia genética” de modo geral se refere à manipulação do genoma ou ácidos nucleicos de um micro-organismo. Métodos de modificação genética incluem, por exemplo, expressão heteróloga do gene, gene ou inserção de promotor ou exclusão, mutação do ácido nucleico, expressão do gene alterada ou inativação, modificação de enzima, evolução direcionada, design com base no conhecimento, métodos de mutagênese aleatória, embaralhamento de gene, e otimização de códon.

[0075] “Recombinante indica que um ácido nucleico, proteína, ou micro-organismo é produto de modificação, engenharia, ou recombinação nucleico, proteína, ou micro-organismo que contenha ou seja codificado por material genético derivado de múltiplas fontes, tais como duas ou mais estirpes de micro-organismos. Conforme usado no presente descrever um micro-organismo que compreende um ácido nucleico mutado ou proteína, incluindo uma forma mutada de um ácido nucleico endógeno ou proteína.

[0076] “Endógeno” se refere a um ácido nucleico ou proteína que esteja presente ou expressa no micro-organismo do tipo selvagem ou parental do qual o micro-organismo da invenção é derivado. Por exemplo, um gene endógeno é um gene que está naturalmente presente no micro-organismo do tipo selvagem ou parental do qual o micro-organismo da invenção é derivado. Em uma realização, a expressão de um gene endógeno pode ser controlada por um elemento exógeno regulatório, tal como um promotor exógeno.

[0077] “Exógeno” se refere a um ácido nucleico ou proteína que não esteja presente no micro-organismo do tipo selvagem ou parental do qual o micro-organismo da invenção é derivado. Em uma realização, um gene exógeno ou enzima pode ser derivado de uma estirpe ou espécie heteróloga (ou seja, diferente) e introduzido ao, ou expressado no micro-organismo da invenção. Em outra realização, um gene exógeno ou enzima pode ser artificialmente ou recombinantemente criado e introduzido ao, ou expressado no micro-organismo da invenção. Ácidos nucleicos exógenos podem ser adaptados para se integrarem ao genoma do micro-organismo da invenção ou permanecer em um estado extra cromossômico no micro-organismo da invenção, por exemplo, em um plasmídeo.

[0078] “Atividade da enzima” no geral se refere à atividade enzimática, incluindo, mas não limitada, à atividade de uma enzima, a quantidade de uma enzima, ou a disponibilidade de uma enzima catalisar uma reação da atividade de uma enzima, aumentando a quantidade de uma enzima, ou aumentando a disponibilidade de uma enzima catalisar uma reação.

[0079] “Mutado” se refere a um ácido nucleico ou proteína que foi modificado no micro-organismo da invenção se comparado com o micro-organismo do tipo selvagem ou parental do qual o micro-organismo da invenção é derivado. Em uma realização, a mutação pode ser uma exclusão, inserção, ou substituição em um gene que codifica uma enzima. Em outra realização, a mutação pode ser uma exclusão, inserção, ou substituição em um ou mais aminoácidos em uma enzima.

[0080] Em particular, uma “mutação disruptiva” é uma mutação que reduz ou elimina (ou seja, prejudica) a expressão ou atividade de um gene ou enzima. A mutação disruptiva pode parcialmente inativar, completamente inativar, ou eliminar o gene ou enzima. A mutação disruptiva pode ser uma mutação nocaute (KO, do inglês knockout). A mutação disruptiva pode ser qualquer mutação que reduza, previna ou bloqueie a biossíntese de um produto fabricado por uma enzima. A mutação disruptiva pode incluir, por exemplo, uma mutação em um gene que codifica uma enzima, uma mutação em um elemento regulatório envolvido na expressão de um gene que codifica uma enzima, a introdução de um ácido nucleico que produza uma proteína que reduz ou inibe a atividade de uma enzima, ou a introdução de um ácido nucleico (ex.: RNA antisenso, siRNA, CRISPR) ou proteína que iniba a expressão de uma enzima. A mutação disruptiva pode ser introduzida usando qualquer método conhecido do estado da técnica.

[0081] A “otimização de códon” se refere à mutação de um ácido nucleico, tal como um gene, para a tradução otimizada ou aperfeiçoada do ácido nucleico em uma estirpe ou espécie particular. A otimização de códon pode resultar em taxas de tradução mais rápidas ou tradução de maior precisão. Em uma realização preferencial, os genes da invenção são códon otimizado para a expressão em Clostridium, especialmente Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, ou Clostridium ragsdalei. Em ainda outra realização preferencial, os genes da invenção são códon otimizado para a expressão em Clostridium autoethanogenum LZ1561, que foi depositado sob DSMZ com número de acesso DSM23693.

[0082] “Com super expressão” se refere a um aumento na expressão de um ácido nucleico ou proteína no micro-organismo da invenção se comparado com o micro-organismo do tipo selvagem ou parental do qual o micro-organismo da invenção é derivado. A super expressão pode ser atingida através de quaisquer meios conhecidos do estado da técnica, incluindo o número de cópia do gene modificador, taxa de transcrição do gene, taxa de tradução do gene, ou taxa de degradação da enzima.

[0083] O termo “variantes” inclui ácidos nucleicos e proteínas cujas sequências variam da sequência de um ácido nucleico de referência e proteína, assim como uma sequência de um ácido nucleico de referência e proteína apresentados no estado da técnica ou exemplificado no presente documento. A invenção pode ser realizada usando ácidos nucleicos variantes ou proteínas que desempenhem substancialmente a mesma função como o ácido nucleico de referência ou proteína. Por exemplo, uma proteína variante pode desempenhar substancialmente a mesma função ou catalisar substancialmente a mesma reação da proteína de referência. Um gene variante pode codificar a mesma ou substancialmente a mesma proteína de um gene de referência. Um promotor variante pode ter substancialmente a mesma habilidade de promover a expressão de um ou mais genes como um promotor de referência.

[0084] Mencionados ácidos nucleicos ou proteínas podem ser apresentados no presente documento como “variantes funcionalmente equivalentes”. A título exemplificativo, as variantes funcionalmente equivalentes de um ácido nucleico podem incluir variantes alélicas, fragmentos de um gene, genes mutados, polimorfismos e similares. Os genes homólogos de outros micro-organismos também são exemplos de variantes funcionalmente equivalentes. Esses incluem os genes homólogos em espécies tais como Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, ou Clostridium ljungdahlii, detalhes dos quais são publicamente disponíveis em websites como os do Genbank ou do Centro Nacional de Informações Biotecnológicas (no inglês, NCBI). Variantes funcionalmente equivalentes também incluem ácidos nucleicos cujas sequências variam como resultado da otimização de códon para um micro-organismo particular. Uma variante funcionalmente equivalente de um ácido nucleico terá preferencialmente pelo menos aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 98%, ou identidade de sequência (percentual de homologia) do ácido nucleico maior com o ácido nucleico de referência. Uma variante funcionalmente equivalente de uma proteína terá pelo menos aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 98%, ou identidade de sequência (percentual de homologia) de aminoácido maior com a proteína de referência. A equivalência funcional de um ácido nucleico variante ou proteína pode ser avaliada usando qualquer método conhecido do estado da técnica.

[0085] Os ácidos nucleicos podem ser transmitidos a um micro organismo da invenção usando qualquer método conhecido do estado da técnica. Por exemplo, os ácidos nucleicos podem ser transferidos como ácidos nucleicos “nus” ou podem ser formulados com um ou mais agentes, assim como os lipossomos. Os ácidos nucleicos podem ser DNA, RNA, cDNA, ou combinações desses, como é apropriado. A restrição de inibidores pode ser usada em algumas realizações. Vetores adicionais podem incluir plasmídeos, vírus, bacteriófagos, cosmídeos e cromossomos artificiais. Em uma realização preferencial, os ácidos nucleicos são encaminhados para os micro-organismos da invenção usando um plasmídeo. A título de exemplo, a transformação (incluindo a transdução ou transfecção) pode ser atingida pela electroporação, ultrasonicação, transformação mediada do polietileno glicol, competência química ou natural, transformação protoplástica, indução prófase, ou conjugação. Em certas realizações contendo sistemas ativos de restrição de enzima, pode ser necessário metilar um ácido nucleico antes da introdução do ácido nucleico em um micro-organismo.

[0086] Adicionalmente, os ácidos nucleicos podem ser projetados para compreender um elemento regulatório, tal como um promotor, para aumentar ou, caso contrário, controlar a expressão de um ácido nucleico específico. O promotor pode ser um promotor constitutivo ou um promotor induzível. Preferencialmente, o promotor é um promotor de via Wood- Ljungdahl, um promotor ferredoxina, um piruvato, um promotor oxidorredutase ferredoxina, um promotor operon Rnf complexo, um promotor operon sintase ATP, ou um promotor operon cinase fosfotransacetilase/acetato.

[0087] Um “micro-organismo” é um organismo microscópico, especialmente uma bactéria, arquea, vírus ou fungo. O micro-organismo da invenção é geralmente uma bactéria. Conforme usado neste documento, a menção da palavra “micro-organismo” deve ser considerada englobando “bactéria”.

[0088] Um “micro-organismo parental” é um micro-organismo usado para gerar um micro-organismo da invenção. O micro-organismo parental pode ser um micro-organismo naturalmente presente (ex.: um micro organismo do tipo selvagem) ou um micro-organismo que foi previamente modificado (ex.: um micro-organismo mutante ou recombinante). O micro organismo da invenção pode ser modificado para expressar ou super expressar uma ou mais enzimas que não foram expressadas ou super expressadas no micro-organismo parental. Da mesma forma, o micro-organismo da invenção pode ser modificado para conter um ou mais genes que não foram incluídos pelo micro-organismo parental. Em uma realização, o micro-organismo parental é Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, ou Clostridium ragsdalei. Em uma realização preferencial, o micro-organismo parental é Clostridium autoethanogenum LZ1561, o qual foi depositado sob DSMZ número DSM23693.

[0089] O termo “derivado de” indica que um ácido nucleico, proteína, ou micro-organismo é modificado ou adaptado de um ácido nucleico diferente (ex.: um do tipo selvagem ou parental), proteína, ou micro-organismo, para produzir um novo ácido nucleico, proteína ou micro-organismo. Mencionadas modificações ou adaptações geralmente incluem inserção, exclusão, mutação, ou substituição de ácidos nucleicos ou genes. De um modo geral, o micro-organismo da invenção é derivado de um micro-organismo parental. Em uma realização, o micro-organismo da invenção é derivado de Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, ou Clostridium ragsdalei. Em uma realização preferencial, o micro-organismo da invenção é derivado de Clostridium autoethanogenum LZ1561, o qual foi depositado sob DSMZ número DSM23693.

[0090] O micro-organismo da invenção pode ser posteriormente classificado com base nas características funcionais. Por exemplo, o micro organismo da invenção pode ser um micro-organismo fixador de C1 ou derivado deste, um anaeróbio, um acetógeno, um etanologênico, um carboxidotrófico, e/ou um metanogênio. A Tabela 1 apresenta uma lista representante de micro-organismos e identifica suas características funcionais. 1 Acetobacterium woodi pode produzir etanol a partir da frutose, mas não a partir do gás. 2 Não foi analisado se o Clostridium magnum pode se desenvolver no CO. 3 Uma estirpe de Moorella thermoacetica, Moorella sp. HUC22-1, foi verificada por produzir etanol a partir do gás. 4 Não foi analisado se Sporomusa ovata pode se desenvolver no CO. 5 Não foi analisado se Sporomusa silvacetica pode se desenvolver no CO. 6 Não foi analisado se Sporomusa sphaeroides pode se desenvolver no CO.

[0091] “C1” se refere a uma molécula de um carbono, por exemplo, CO, CO2, CH4 ou CH3OH. “C1 oxigenado” se refere a uma molécula de um carbono que também compreende pelo menos um átomo de oxigênio, por exemplo, CO, CO2 ou CH3OH. “Fonte de Carbono C1” se refere a uma molécula de um carbono que serve como fonte parcial ou exclusiva para o micro-organismo da invenção. Por exemplo, uma fonte de carbono C1 pode compreender um ou mais CO, CO2, CH4, CH3OH ou CH2O2. Preferencialmente, a fonte de carbono C1 compreende um ou ambos o CO e CO2. Um “micro-organismo fixador de C1” é um micro-organismo que possui a habilidade de produzir um ou mais produtos de uma fonte de carbono C1. O micro-organismo é geralmente uma bactéria fixadora de C1. Em uma realização preferencial, o micro-organismo da invenção é um micro organismo fixador de C1 ou derivado deste, identificado na Tabela 1.

[0092] Um “anaeróbio” é um micro-organismo que não necessita de oxigênio para se desenvolver. Um anaeróbio pode reagir negativamente ou até morrer se o oxigênio estiver presente. Geralmente, o micro-organismo da invenção é um anaeróbio. Em uma realização preferencial, o micro-organismo da invenção é derivado de um anaeróbio identificado na Tabela 1.

[0093] Um “acetógeno” é um micro-organismo que produz ou é capaz de produzir acetato (ou ácido acético) como produto da respiração anaeróbica. Geralmente, os acetógenos são obrigatoriamente bactérias anaeróbicas que utilizam a via de Wood-Ljungdahl como seu mecanismo de conservação de energia principal e para a sintase de acetil-CoA e de produtos derivados de acetil-CoA, como o acetato (Ragsdale, Biochim Biophys Acta, 1784: 1873-1898, 2008). Os acetógenos usam a via acetil-CoA como (1) um mecanismo para a sintase redutiva de acetil-CoA do CO2, (2) aceitação de elétron terminal, processo de conservação de energia, (3) mecanismo para fixação (assimilação) de CO2 na sintase do carbono da célula (Drake, Acetogenic Prokaryotes, In: The Prokaryotes, 3rd edition, p. 354, New York, NY, 2006). Todos os acetógenos surgidos naturalmente são fixadores de C1, anaeróbicos, autotróficos, e não-metanotróficos. Geralmente, o micro-organismo da invenção é um acetógeno. Em uma realização preferencial, o micro organismo da invenção é derivado de um acetógeno identificado na Tabela 1.

[0094] Um “etanologênico” é um micro-organismo que produz ou é capaz de produzir etanol. Geralmente, o micro-organismo da invenção é um etanologênico. Em uma realização preferencial, o micro-organismo da invenção é derivado de um etanologênico identificado na Tabela 1.

[0095] Um “autótrofo” é um micro-organismo capaz de se desenvolver na ausência de carbono orgânico. Invés disso, os autótrofos usam fontes de carbono inorgânicas, tais como CO e/ou CO2. Geralmente, o micro organismo da invenção é um autótrofo. Em uma realização preferencial, o micro-organismo da invenção é derivado de um autótrofo identificado na Tabela 1.

[0096] Um “carboxidotrófico” é um micro-organismo capaz de utilizar o CO como fonte única de carbono. Geralmente, o micro-organismo da invenção é um carboxidotrófico. Em uma realização preferencial, o micro organismo da invenção é derivado de um carboxidotrófico identificado na Tabela 1.

[0097] Um “metanotrófico” é um micro-organismo capaz de utilizar o metano como uma fonte única de carbono e energia. Em algumas realizações, o micro-organismo da invenção é derivado de um metanotrófico.

[0098] De modo geral, o micro-organismo da invenção pode ser derivado de quaisquer gêneros ou espécies identificadas na Tabela 1. Em uma realização preferencial, o micro-organismo é uma bactéria Clostridium.

[0099] Em uma realização preferencial, o micro-organismo da invenção é do grupo da Clostridia compreendendo as espécies Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, e Clostridium ragsdalei. Essas espécies foram relatadas pela primeira vez por Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994 (Clostridium autoethanogenum), Tanner, Int J System Bacteriol, 43: 232-236, 1993 (Clostridium ljungdahlii), e Huhnke, WO 2008/028055 (Clostridium ragsdalei).

[00100] Essas três espécies possuem muitas similaridades. Particularmente, todas essas espécies são membros fixadores de C1, anaeróbicos, acetogênicos, etanologênicos, e carboxidotróficos do gênero Clostridium. Essas espécies possuem genótipos e fenótipos e meios de conservação de energia e metabolismo fermentativo similares. Adicionalmente, essas espécies estão agrupadas no grupo I clostridial da homologia de rRNA com 16S rRNA DNA que é mais que 99% idêntico, possui conteúdo de DNA G + C de cerca de 22-30 mol%, são gram positivas, possuem morfologia e tamanho (logaritmo de crescimento das células entre 0,5 0,7 x 3-5 µm) similares, são mesofílicas (crescem perfeitamente a 30-37 °C), possuem concentrações de pH de cerca de 4-7,5 similares (com pH ideal de cerca de 5,5-6), falta de citocromos, e conservam energia através de um RnF complexo. Ainda, a redução do teor de ácidos carboxílicos em seus álcoois correspondentes foi apresentada nessas espécies (Perez, Biotechnol Bioeng, 110:1066-1077, 2012). Sobretudo, essas espécies também apresentam forte crescimento autotrófico em gases que contêm CO, produzem etanol e acetato (ou ácido acético) como produtos principais de fermentação, e produzem pequenas quantidades de 2,3 de butanodiol e ácido lático sob condições específicas.

[00101] Contudo, essas três espécies possuem também algumas diferenças. Essas espécies foram isoladas de diferentes fontes: Clostridium autoethanogenum do intestino de coelho, Clostridium ljungdahlii dos resíduos de frango caipira, e Clostridium ragsdalei de sedimentos da água doce. Essas espécies se diferenciam na utilização de vários açúcares (ex.: ramnose, arabinose), ácidos (ex.: gluconato, citrato), aminoácidos (ex.: arginina, histidina), e outros substratos (ex.: betaína, butanol). Ademais, essas espécies se diferenciam na auxotrofia de certas vitaminas (ex.: tiamina, biotina). Essas espécies possuem diferenças nas sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos de genes e proteínas da via de Wood-Ljungdahl, embora a organização geral e número desses genes e proteínas tenha sido descoberta como sendo a mesma em todas as espécies (Kopke, Curr Opin Biotechnol, 22: 320-325, 2011).

[00102] Assim, em resumo, muitas das características de Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, ou Clostridium ragsdalei não são específicas àquela espécie, porém, invés disso, são características gerais para este grupo de membros fixadores de C1, anaeróbicos, acetogênicos, etanologênicos, e carboxidotróficos do gênero Clostridium. No entanto, uma vez que essas espécies são, na verdade, distintas, a modificação ou manipulação genética de uma dessas espécies pode não ter um efeito idêntico em outra dessas espécies. Por exemplo, as diferenças no cultivo, desempenho, ou fabricação do produto podem ser observadas.

[00103] O micro-organismo da invenção pode ser também derivado de um isolado ou mutante de Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, ou Clostridium ragsdalei. Isolados e mutantes de Clostridium autoethanogenum incluem JA1-1 (DSM10061) (Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994), LBS1560 (DSM19630) (WO 2009/064200), e LZ1561 (DSM23693). Isolados e mutantes de Clostridium ljungdahlii incluem ATCC 49587 (Tanner, Int J Syst Bacteriol, 43: 232-236, 1993), PETCT (DSM13528, ATCC 55383), ERI 2 (ATCC 55380) (US 5,593,886), C 01 (ATCC 55988) (US 6,368,819), O 52 (ATCC 55989) (US 6,368,819), e OTA 1 (Tirado Acevedo, Production of bioethanol from synthesis gas using Clostridium ljungdahlii, PhD thesis, North Carolina State University, 2010). Isolados e mutantes de Clostridium ragsdalei incluem PI 1 (ATCC BAA-622, ATCC PTA-7826) (WO 2008/028055).

[00104] “Substrato” se refere a uma fonte de carbono e/ou de energia para o micro-organismo da invenção. Geralmente, o substrato é gasoso e compreende uma fonte de carbono C1, por exemplo CO, CO2 e/ou CH4. Preferencialmente, o substrato compreende uma fonte de carbono C1 de CO ou CO + CO2. O substrato pode ainda compreender outros componentes que não contêm carbono, tais como H2, N2 ou elétrons.

[00105] O substrato geralmente compreende pelo menos alguma quantidade de CO, tais como cerca de 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 100 mol% de CO. O substrato pode compreender uma variação de CO, tal como cerca de 20-80, 30-70, ou 40-60 mol% de CO. Preferencialmente, o substrato compreende cerca de 40-70 mol% de CO (ex.: siderúrgica ou gás de alto-forno), cerca de 20-30 mol% de CO (ex.: gás de alto-forno básico de oxigênio), ou cerca de 15-45 mol% de CO (ex.: gás de síntese). Em algumas realizações, o substrato pode compreender relativamente baixa quantidade de CO, tal como de cerca de 1-10 ou 1-20 mol% de CO. O micro-organismo da invenção geralmente transforma pelo menos uma porção do CO no substrato para um produto.

[00106] O substrato pode compreender a mesma quantidade de H2. Por exemplo, o substrato pode compreender cerca de 1, 2, 5, 10, 15, 20, ou 30 mol% de H2. Em algumas realizações, o substrato pode compreender relativamente alta quantidade de H2, tal como de cerca de 60, 70, 80, ou 90 mol% de H2. Em realizações posteriores, o substrato não compreende substancialmente nenhum H2.

[00107] O substrato pode compreender alguma quantidade de CO2. Por exemplo, o substrato pode compreender cerca de 1-80 ou 1-30 mol% de CO2. Em algumas realizações, o substrato pode compreender menos que cerca de 20, 15, 10, ou 5 mol% de CO2. Em outra realização, o substrato não compreende substancialmente nenhum CO2.

[00108] Embora o substrato seja geralmente gasoso, o substrato pode ser também fornecido em formas alternativas. Por exemplo, o substrato pode ser dissolvido em um líquido saturado com um gás que contenha CO usando um gerador de dispersão de microbolhas. A título de outro exemplo, o substrato pode ser absorvido por um apoio sólido.

[00109] O substrato e/ou fonte de carbono C1 pode ser um gás residual obtido como bioproduto de um processo industrial ou de alguma outra fonte, tais como gases de escapes veiculares ou gaseificação de biomassa. Em certas realizações, o processo industrial é selecionado a partir do grupo composto de fabricação de produtos de metal ferroso, tais como uma produção da indústria siderúrgica, fabricação de produtos não ferrosos, processos de refinação do petróleo, gaseificação do carvão, produção de energia elétrica, produção de carbono preto, produção de amônia, produção de metanol, e fabricação de coque. Nessas realizações, o substrato e/ou a fonte de carbono C1 pode ser obtido a partir do processo industrial antes de ser lançado para a atmosfera, usando qualquer método conveniente.

[00110] O substrato e/ou a fonte de carbono C1 pode ser um gás de síntese, como o gás de síntese obtido através da gaseificação de carvão ou resíduos de refinaria, gaseificação de biomassa, ou reforma de gás natural. A composição do substrato pode ter um impacto significativo na eficiência e/ou custo da reação. Por exemplo, a presença do oxigênio (O2) pode reduzir a eficiência de um processo de fermentação anaeróbico. Dependendo da composição do substrato, pode ser desejável tratar, esfregar ou filtrar o substrato para remover quaisquer impurezas indesejáveis, tais como toxinas, componentes indesejáveis, ou partículas de poeira, e/ou aumentar a concentração de componentes desejáveis.

[00111] O micro-organismo da invenção pode ser cultivado para produzir um ou mais produtos. Por exemplo, Clostridium autoethanogenum produz ou pode ser modificado para produzir etanol (WO 2007/117157), acetato (WO 2007/117157), butanol (WO 2008/115080 e WO 2012/053905), butirato (WO 2008/115080), 2,3-butanodiol (WO 2009/151342), lactato (WO 2011/112103), buteno (WO 2012/024522), butadieno (WO 2012/024522), metil-etil-cetona (2-butanona) (WO 2012/024522 e WO 2013/185123), etileno (WO 2012/026833), acetona (WO 2012/115527), isopropanol (WO 2012/115527), lipídios (WO 2013/036147), 3-hidróxipropionato (3-HP) (WO 2013/180581), isopreno (WO 2013/180584), ácidos gordos (WO 2013/191567), 2-butanol (WO 2013/185123), 1,2-propanodiol (WO 2014/0369152), e 1-propanol (WO 2014/0369152). Além de um ou mais produtos-alvo, o micro-organismo da invenção pode também produzir etanol, acetato, e/ou 2,3-butanodiol.

[00112] “Seletividade” se refere à razão da produção de um produto- alvo para a produção de todos os produtos de fermentação produzidos por um micro-organismo. O micro-organismo da invenção pode ser modificado para produzir produtos a uma certa seletividade ou a uma seletividade mínima. Em uma realização, um produto-alvo corresponde a pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50%, ou 75% de todos os produtos de fermentação produzidos pelo micro-organismo da invenção. Em uma realização, o produto-alvo corresponde a pelo menos 10% de todos os produtos de fermentação produzidos pelo micro-organismo da invenção, tanto que o micro-organismo da invenção possui uma seletividade para o produto-alvo de pelo menos 10%. Em uma realização, o produto-alvo corresponde a pelo menos 30% de todos os produtos de fermentação produzidos pelo micro-organismo da invenção, tanto que o micro-organismo da invenção possui uma seletividade para o produto-alvo de pelo menos 30%.

[00113] Geralmente, o cultivo é executado em um biorreator. O termo “biorreator” inclui um dispositivo de cultivo/fermentação que consiste em um ou mais recipientes, torres, ou arranjos de tubulações, tais como um reator tanque agitado contínuo (RPA), reator com células imobilizadas (CSTR - do inglês, immobilized cell reactor), reator de leito gotejante (do inglês trickle bed reactor), coluna de bolhas, fermentador com elevação a gás, misturador estático, ou outros recipientes ou outro dispositivo apropriado para o contato de gás-líquido. Em algumas realizações, o biorreator pode compreender um primeiro reator de crescimento e um segundo reator de cultivo/fermentação. O substrato pode ser disponibilizado para um ou ambos os reatores. Conforme utilizado neste documento, os termos “cultivo” e “fermentação” são empregados sem distinção. Os termos abrangem tanto a fase de crescimento e a fase de biossíntese do produto do processo de cultivo/fermentação.

[00114] O cultivo é geralmente mantido em um meio de cultivo aquoso que contenha nutrientes, vitaminas, e/ou minerais suficientes para permitir o desenvolvimento do micro-organismo. Preferencialmente o meio de cultivo aquoso é um meio de crescimento microbiano anaeróbico, tal como um meio de crescimento microbiano anaeróbico mínimo. Meios adequados são bem conhecidos do estado da técnica.

[00115] O cultivo/fermentação deve ser desejavelmente executado sob condições apropriadas para a produção do produto-alvo. As condições de reação a serem consideradas incluem a pressão (ou pressão parcial), temperatura, taxa de fluxo do gás, taxa de fluxo do líquido, pH do meio, redox potencial do meio, taxa de agitação (se estiver utilizando um reator tanque agitado contínuo), nível inóculo, concentrações de substrato de gás máximas para assegurar que o gás na fase líquida não se torne limitador, e concentrações de produto máximas para evitar recuo do produto. Particularmente, a taxa de introdução do substrato pode ser controlada para assegurar que a concentração de gás na fase líquida não se torne limitadora, uma vez que os produtos podem ser consumidos pelo cultivo mediante condições escassas de gás.

[00116] Operar um biorreator em condições de pressões elevadas possibilita uma taxa maior de transferência da massa do gás da fase gasosa para a fase líquida. Assim, é geralmente preferível executar o cultivo/fermentação em pressões mais elevadas que a pressão atmosférica. Adicionalmente, uma vez que uma dada taxa de conversão do gás é, em parte, uma função do tempo de retenção do substrato e o tempo de retenção determina o volume exigido de um biorreator, o uso de sistemas pressurizados pode reduzir consideravelmente o volume exigido do biorreator e, consequentemente, o custo de capital do cultivo/fermentação do equipamento. Isso, por sua vez, significa que o tempo de retenção, definido quando o volume líquido no biorreator dividido pela taxa de fluxo do gás de entrada, pode ser reduzido quando os biorreatores estiverem mantidos em condições de pressão elevada invés de mantidos na pressão atmosférica. As condições de reação ideais dependerão parcialmente do micro-organismo específico utilizado. No entanto, geralmente, é preferível executar a fermentação em pressões mais elevadas que a pressão atmosférica. Adicionalmente, uma vez que uma dada taxa de conversão do gás é, em parte, uma função do tempo de retenção do substrato e atingir um tempo de retenção desejado, por sua vez, determina o volume exigido de um biorreator, o uso de sistemas pressurizados pode reduzir consideravelmente o volume exigido do biorreator e, consequentemente, o custo de capital do equipamento de fermentação.

[00117] Os produtos-alvo podem ser separados ou purificados de um caldo fermentativo utilizando qualquer método ou combinação de métodos conhecidos do estado da técnica, incluindo, por exemplo, a destilação fracionada, a evaporação, a pervaporação, a remoção de gás, a separação de fase, e a fermentação extrativa, incluindo, por exemplo, a extração líquido- líquido. Em algumas realizações, os produtos-alvo são recuperados de um caldo fermentativo através da remoção contínua de uma porção do caldo do biorreator, separando as células microbianas do caldo (convenientemente pela filtração), e recuperando um ou mais produtos-alvo do caldo. Álcoois e/ou acetona podem ser recuperados, por exemplo, pela destilação. Os ácidos podem ser recuperados, por exemplo, pela absorção em carvão ativado. As células microbianas separadas são preferencialmente devolvidas ao biorreator. O filtrado livre de células remanescente após os produtos-alvo terem sido removidos também deve ser preferencialmente devolvido ao biorreator. Nutrientes adicionais (como a vitamina B) podem ser adicionadas ao filtrado livre de células para reabastecer o meio antes que seja devolvido ao biorreator.

EXEMPLOS

[00118] Os exemplos a seguir melhor esclarecem a invenção, contudo, não devem ser interpretados a fim de limitar o escopo da invenção de modo algum.

Exemplo 1

[00119] Este exemplo descreve métodos comuns de cultivo de C. autoethanogenum e C. ljungdahlii.

[00120] C. autoethanogenum DSM10061 e DSM23693 (um derivado de DSM10061) e C. ljungdahlii DSM13528 foram obtidos de DSMZ (The German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Inhoffenstraße 7 B, 38124 Braunschweig, Germany).

[00121] As estirpes foram cultivadas a 37 °C em um meio PETC a pH 5,6 utilizando técnicas anaeróbicas regulares (Hungate, Methods Microbiol, 3B: 117-132, 1969; Wolfe, Adv Microbiol Physiol, 6: 107-146, 1971). A frutose (crescimento heterotrófico) ou gás de usina siderúrgica contendo 30 CO por polegada quadrada - psi (obtido do sítio eletrônico do Aço da Nova Zelândia (New Zealand Steel) em Glenbrook, NZ; composição: 44% de CO, 32% de N2, 22% de CO2, 2% de H2) na técnica de headspace (crescimento autotrófico) utilizado como substrato. Para meios sólidos, 1,2 % de ágar bacteriológico (BD, Franklin Lakes, NJ 07417, USA) foi adicionado.

Exemplo 2

[00122] Este exemplo demonstra a construção de uma estripe compreendendo uma expressão de plasmídeo p-hidróxibenzoato.

[00123] A sequência nucleotídica para a corismato piruvato liase (ubiC) (SEQ ID NO: 1) foi otimizada (SEQ ID NO: 2) de acordo com a tabela de uso de códon para o C. autoethanogenum pela GeneArt e clonado no vetor de expressão pMTL8315 sob o controle do promotor da via de Wood- Ljungdahl (US 20110256600). A sequência de codificação para uma sintase (DAHP) (aroG*) 3-deoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato mutante que não reage ao retorno também foi incluída em um formato bicistrônico (Fig. 7). O plasmídeo pARO_01 (SEQ ID NO: 9) foi transformado em C. autoethanogenum LZ1561 (DSM23693) através da conjugação com a estirpe de E. coli CA434 como doadora. As estirpes doadoras foram cultivadas da noite para o dia em um meio LB suplementado com 25 µg/ml de cloranfenicol e100 µg/ml de espectinomicina. As células de 1,5 ml de cultivo foram colhidas através a centrifugação e lavadas em tampão fosfato-salino (do inglês, PBS). Dentro de uma estação de trabalho anaeróbica, o conglomerado de célula doadora foi resuspendido em 200 µL do recipiente LZ1561 de crescimento exponencial. A mistura de conjugação foi encontrada no meio ágar PETC-MES e incubada a 37 °C. Após 24 horas as células foram raspadas da lâmina de conjugação e espalhadas em um meio ágar PETC-MES suplementado com 7,5 µg tianfenicol/ml (Sigma) e 10 µg trimetoprima/ml (Sigma). Três colônias que contêm plasmídeo (ex.: tréplicas biológicas) isoladas foram cultivadas em um meio líquido PETC-MES contendo 7,5 µg tianfenicol/ml e com uma mistura de gases que estimula a produção do gás do aço como fonte de carbono (50 % CO, 10 % H2, 30 % CO2, 10 % N2, posteriormente referido com “gás de usina” neste pedido).

[00124] As culturas em meios líquidos foram cultivadas no meio PETC-MES a 10 ml em garrafas de soro contendo tianfenicol e gás de usina a 22 psi. As amostras foram obtidas diariamente para medir a biomassa (Fig. 8) e pHBA (Fig. 9a e Fig. 9b).

[00125] Para medir o pHBA, amostras (100 µL) foram aumentadas com 10 µL 0,1N NaOH, congeladas e então liofilizadas. As amostras foram então derivatizadas com 100 µL de BSTFA + TCMS (99:1) e piridina a 100 µL. As amostras foram então incubadas a 60 °C por 30 minutos para formar derivados de trimetil-silil do grupo funcional do ácido carboxílico. Detalhes do método GC-MS são: Inj. Vol. 1uL; Inj. T 250 °C; proporção de divisão 10:1. Inicial T 50 °C (manter 5 minutos); final T 220 °C (20°C/minuto); fluxo constante 1 ml/minuto (gás transportador de He); coluna Zebron ZB-5MS 30m x 0,25mm x 0,25µm. Varian Ion Trap 4000 operou no modo análise completa 40-400 m/z. Ajuste PFTBA.

[00126] Na Fig. 9a, a LZ1561 (estirpe de controle) tem três réplicas técnicas (ex.: cultivadas e amostradas três vezes). Duas réplicas técnicas de LZ1561 com pARO_01, também foram preparadas, cada uma com três réplicas técnicas. “Réplicas técnicas” se referem ao cultivo e amostragem de cada estirpe em experimentos separados, enquanto a “réplica biológica” se refere à reprodução da estirpe do zero. Desta forma, asréplicas biológicas são consideradas na variação biológica básica no micro-organismo, enquanto as réplicas técnicas são consideradas na variação devido aos aspectos técnicos incluindo o cultivo, amostragem, e métodos de análise. A Fig. 9a mostra que o pHBA foi produzido repetidamente em ocasiões separadas. As Fig. 8 e Fig. 9b mostram uma representação geral do crescimento e produtividade do pHBA.

Exemplo 3

[00127] Este exemplo mostra a produção de p-hidróxibenzoato através da fermentação de gás.

[00128] C. autoethanogenum abrigando plasmídeo pARO_01 (SEQ ID NO: 9) foram cultivados em gás de usina conforme descrito no Exemplo 1. A análise GC-MS, executada no Exemplo 1 do cultivo, determinou que o pHBA foi produzido pela bactéria expressando a liase corismato piruvato. A faixa linear para análise do pHBA usando este método estendeu-se de 0-12,5 mg/ml (Fig. 5).

[00129] O pHBA foi validado pela comparação do tempo de retenção e fragmentos de íons característicos de um padrão pHBA autêntico e íons característicos previstos no banco de dados de espectrometria da massa da NIST (Fig. 6).

[00130] A produção de pHBA foi observada em todas as culturas expressando a corismato piruvato liase codificado no vetor de expressão pMTL8315. O ponto alto da titulação de pHBA observado em qualquer um dos cultivos foi de 17 mg pHBA/L após oito dias (Fig. 9b). Nenhum pHBA foi observado na amostra de controle sem o vetor de expressão.

[00131] Níveis detectáveis de pHBA foram produzidos pela bactéria geneticamente modificada e presentes na cultura.

Exemplo 4

[00132] Este exemplo mostra um protocolo experimental para aumento da produção de pHBA através da engenharia da enzima.

[00133] O UbiC está sujeito à inibição do produto através da retenção de pHBA. A sequência de ácido nucleico que codifica o ubiC pode ser modificada de forma que os aminoácidos envolvidos na retenção do produto pela enzima sejam mutados e a liberação do produto seja aprimorada. Para fazer isso, os aminoácidos envolvidos na ligação de pHBA são identificados pela análise de estruturas existentes com o produto de ligação. A inibição do produto é então minimizada pela mutação dos aminoácidos envolvidos na ligação e retenção de pHBA. Para identificar enzimas com a melhor eficiência catalítica para o rendimento de pHBA, um conjunto direcionado de mutantes ubiC pode ser produzido onde as combinações diferentes de aminoácidos de ligação do pHBA são alterados, e essas enzimas mutantes podem ser analisadas com um teste de enzima. Mutantes aperfeiçoados são então expressos na C. autoethanogenum LZ1561 para validar as estirpes com a produtividade de pHBA mais aprimorada.

Exemplo 5

[00134] Este exemplo demonstra a construção de uma estirpe compreendendo um plasmídeo de expressão salicilato.

[00135] As sequências de nucleotídeos para pchA (SEQ ID NO: 4) e pchB (SEQ ID NO: 6) foram códon otimizadas e clonadas em um vetor de expressão sob o controle de um promotor tetraciclina induzível. O plasmídeo é transformado em C. autoethanogenum LZ1561 (DSM23693) através da conjugação com a estirpe E. coli CA434 como doadora. As estirpes doadoras foram cultivadas da noite para o dia em um meio LB suplementado com 25 µg/ml de cloranfenicol e100 µg/ml de espectinomicina. As células da cultura de 1,5 ml foram colhidas através da centrifugação e lavadas em tampão fosfato-salino (do inglês, PBS). Dentro de uma estação de trabalho anaeróbica, o conglomerado de célula doadora foi resuspendido em 200 µL do recipiente C. autoethanogenum de crescimento exponencial. A mistura de conjugação foi encontrada no meio ágar PETC-MES e incubada a 37 °C. Após 24 horas as células foram raspadas da lâmina de conjugação e espalhadas em um meio ágar PETC-MES suplementado com 7,5 µg tianfenicol/ml (Sigma) e 10 µg trimetoprima/ml (Sigma). Três colônias que contêm plasmídeo (ex.: tréplicas biológicas) isoladas foram cultivadas em um meio líquido PETC-MES contendo 7,5 µg tianfenicol/ml e com gás de usina como fonte de carbono.

[00136] As culturas em meios líquidos foram cultivadas no meio PETC-MES a 10 ml em garrafas de soro contendo tianfenicol e gás de usina a 22 psi.

[00137] A biomassa foi monitorada espectrofotometricamente. A OD600 nm = 0,3 expressão da via biossintética do salicilato foi induzida pela adição de 40 ng de anidrotetraciclina/ml. Culturas duplicadas (réplicas técnicas das três tréplicas biológicas) foram cultivadas sem a adição de anidrotetraciclina tanto que a via biossintética salicilato permaneceu não induzida. Amostras foram retiradas diariamente.

[00138] As concentrações de salicilato foram medidas usando análise da cromatografia gasosa com detector de massa acoplado (GCMS), utilizando uma Thermo Scientific ISQ LT GCMS equipada com uma coluna de Agilent CP-SIL 5CB-MS (50 m x 0,25 µm x 0,25 µm) e um amostrador automático. As amostras foram preparadas pela diluição de 300 µL da amostra com 600 µL de acetonitrila e 50 µL 0,1N NaOH. As amostras foram misturadas com agitação vórtex e então centrifugadas por 3 minutos a 14.000 rpm; 800 µL do sobrenadante foi transferido para um frasco de vidro e a amostra foi secada em uma Thermo SpeedVac®. Uma vez secas, as amostras foram então suspendidas em uma solução de 100 µL de piridina contendo 22 mg/ml de metoxiamina HCl e então aquecidas em um frasco de vidro selado por 60 minutos a 60°C. Após isso, 300 µL de N,O-Bis trifluoroacetamida (BSTFA) foi acrescentado e então aquecido em um frasco de vidro selado por 60 minutos a 60°C. As amostras foram transferidas para um amostrador automático para análise usando uma injeção de 1,5 µL, uma razão de separação de 20 para 1, e uma temperatura de entrada de 250°C. A cromatografia foi realizada com uma programação do forno de 80 °C (sem espera) para um aumento de 3 °C/minuto para 140°C para um aumento de 20 °C/minuto para 230°C com uma espera final de 4 minutos. A coluna de taxa de fluxo foi de 38 cm2/minuto, tendo o hélio como gás carregador. A fonte de íon da espectrometria da massa (em inglês, MS) foi mantida a 280 °C. A quantização foi realizada usando 267 m/z para um íon de quantificação com 135 and 45 m/z usados como íons qualificadores.

[00139] A Fig. 11a mostra uma comparação do crescimento da biomassa nas amostras induzidas e não induzidas. A Fig. 11b mostra que o salicilato foi produzido repetidamente.

Exemplo 6

[00140] Este exemplo demonstra o nocaute de pheA para a produção aprimorada de produtos derivados de corismato.

[00141] O pheA (ex.: de C. autoethanogenum, CAETHG_0905 (CP006763.1:973789..974925)) é um gene que codifica a enzima prefanato sintase. A prefanato sintase catalisa a conversão de corismato para prefanato, o qual é o precursor dos aminoácidos aromáticos fenilalanina e tirosina. A função do pheA foi nocauteada pela interrupção do gene usando o método ClosTron (Heap et al., J Microbiol Methods. 2010, 80(1):49-55). O plasmídeo ClosTron pMTL007C-E2 foi gerado pelo DNA2.0 e transformado em C. autoethanogenum LZ1561 (DSM23693) pela conjugação com a estirpe E. coli tendo CA434 como doador. As estirpes doadoras foram cultivadas da noite para o dia em um meio LB suplementado com 25 µg/ml de cloranfenicol. As células da cultura de 1,5 ml foram colhidas através da centrifugação e lavadas em tampão fosfato-salino (do inglês, PBS). Dentro de uma estação de trabalho anaeróbica, o conglomerado de célula doadora foi resuspendido em 200 µL do recipiente C. autoethanogenum LZ1561 de crescimento exponencial. A mistura de conjugação foi encontrada no meio ágar PETC e incubada a 37 °C. Após 24 horas as células foram raspadas e resuspendidas em tampão fosfato- salino (do inglês, PBS) em 500 µL e espalhadas em um meio ágar PETC suplementado com 7,5 µg/ml de tianfenicol (Sigma) e 10 µg/ml de trimetoprima (Sigma). Os isolados contendo plasmídeo foram cultivados em um meio líquido PETC-MES contendo 7,5 µg de tianfenicol/ml e com gás de usina como fonte de carbono.

[00142] As colônias foram estriadas em um meio sólido PETC contendo o antibiótico claritromicina (5 µg/ml). Esta etapa foi selecionada para integração do intron redirecionando a sequência para dentro do genoma. A integração da sequência do intron no local de destino resulta em uma inserção de par de bases 1800 no genoma, para o qual foi rastreado com a colônia produto PCRThe PCR dos mutantes positivos ClosTron que foram purificados e sequenciados para confirmar o local de inserção.

[00143] As culturas líquidas foram cultivadas em um meio de 10 ml PETC-MES em garrafas de soro contendo claritromicina e gás de usina a 22 psi. A reserva de glicerol foi preparada a partir desta garrafa de soro.

[00144] Experimentos do biorreator foram conduzidos em um sistema de jaqueta de água 2 L BioFlo 115 (New Brunswick Scientific Corp., Edison, NJ) com um volume de funcionamento de 1,5 L. O sistema CSTR foi equipado com dois rotores Rushton de seis lâminas e os deflectores aprimoram a mistura do caldo fermentativo e do gás para a transferência da massa líquida. Um pH e um eletrodo (Broadley-James Corporation) de potencial de oxirredução (no inglês, ORP) foram inseridos através da placa principal e suas interpretações foram gravadas em intervalos de 5 minutos. O pH foi mantido a 5,0 por uma adição automatizada de uma solução 5 M de hidróxido de amônio.

[00145] O inóculo foi preparado a partir de uma reserva de glicerol. 1 ml de uma reserva de glicerol foi transferido para 50 ml do meio PETC com 22 psi de gás de usina como fonte de carbono. A cultura foi incubada a 37 °C por dois a três dias em um agitador até que fosse notado um crescimento visível. A cultura foi então usada para inocular 200 ml de um meio fresco em uma garrafa Schott de 1L e o gás de usina foi adicionado a uma pressão de 22 psi. A garrafa Schott foi incubada por outras 24 a 36 horas antes de ser transferida aos fermentadores.

[00146] A agitação foi definida a 200 rpm e o fluxo do gás foi definido a 35 ml/min/L. Após um dia, a taxa de agitação foi aumentada por 25 rpm a intervalos de 4 horas para o valor máximo de 900 rpm. O fluxo do gás foi aumentado a 25 ml/min/L a intervalos de 4 horas para a taxa máxima de fluxo que a captação do alvo CO pode ser atingida. O Na2S foi adicionado ao longo do curso da fermentação com uma taxa de bombeamento inicial de 0,3 ml/h e posteriormente aumentada com acréscimos de 0,2 ml/h quando a concentração de H2S no headspace (vão livre) caiu para 200~ppm. O consumo de CO e H2 e a produção de CO2 junto com a concentração de H2S foram medidos de hora em hora usando a cromatografia gasosa (do inglês, GC). Amostras líquidas foram tiradas do fermentador em intervalos regulares ao longo do curso da fermentação para determinar a massa da célula e concentrações metabólitas usando a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE, em inglês: HPLC).

[00147] Após iniciar no modo de lote, o fermentador foi transformado em contínuo quando a DO atingiu o valor 2. As taxas de entrada do meio e do nutriente foram controladas por uma ou mais bombas peristálticas de precisão (Masterflex L/S bombas de acionamento digital) enquanto o volume do fermentador foi mantido constante através do uso de uma sonda de nível que aciona uma bomba para remover o caldo fermentativo do CSTR. A taxa de diluição foi definida em uma etapa para 0,5 dia-1 e depois aumentada para 1 dia-1então para 1,7 dia-1 em intervalos de 24 horas.

[00148] Um equipamento adicional que foi incluído à fermentação foi uma membrana micro porosa (GE Healthcare) com um poro de tamanho 0,2 µm e uma área de superfície de 1.200 cm2. A membrana foi usada para aumentar a concentração da célula na fermentação. O caldo fermentativo foi bombeado em velocidade elevada através da membrana e retornou para o fermentador enquanto um fluxo do filtrado isento de células foi bombeado para o tanque do filtrado em uma taxa mais lenta que a taxa de bombeamento do meio. Isso permitiu que o tempo de retenção da célula das bactérias no fermentador aumentasse.

[00149] Conforme mostrado na Fig. 10, três novos compostos foram identificados usando GC-MS. Estes compostos foram o ácido carboxílico cis- 4-hidróxi-ciclohexano, ácido 3,4-dihidróxibenzóico, e ácido 2- aminobenzóico. Esses compostos só foram detectados nesta cultura pheA::CT e não foram detectados na cultura (LZ1561) da estirpe parental.

[00150] As concentrações do ácido 3,4 dihidróxibenzóico, do ácido 2- aminobenzóico e do ácido carboxílico cis-4-hidróxi-ciclohexano foram medidas usando uma análise de cromatografia gasosa (em inglês, GC), empregando um Agilent 6890N GC equipado com uma coluna Agilent CP- SIL 5CB-MS (50 m x 0,25 µm x 0,25 µm), um amostrador automático e um detector de ionização de chama DIC (no inglês, FID flame ionization detector). As amostras foram preparadas pela diluição de 400 µL da amostra com 400 µL de acetonitrila, seguida de uma centrifugação de 3 minutos a 14.000 rpm; o supernadante foi transferido para um frasco de vidro e a amostra foi secada em um Thermo SpeedVac®. Uma vez secas, as amostras foram então suspendidas em uma solução de 400 µL de N,O-Bis trifluoroacetamida (BSTFA) e piridina (razão 3:1) e aquecidas em um frasco de vidro selado por 60 minutos a 60°C. As amostras foram transferidas para um amostrador automático para análise usando uma injeção de 1 µL, uma razão de separação de 30 para 1, e uma temperatura de entrada de 250°C. A cromatografia foi realizada com uma programação do forno de 70 °C (sem espera) para um aumento de 3 °C/minuto para 110°C para um aumento de 15 °C/minuto para 230°C, seguido de um aumento final de 40°C/minuto a 310°C com uma espera de 3 minutos. A taxa de fluxo da coluna foi de 1,8 ml/minuto, com o hélio como gás carregador. O DIC foi mantido a 320 °C, com o hidrogênio a 40 ml/minuto, ar a 400 ml/minuto, e o hélio a 20 ml/minuto como gás de composição.

[00151] A Fig. 12 mostra a concentração de ácido carboxílico cis- 4-hidróxi-ciclohexano, ácido 3,4-dihidróxibenzóico, e ácido 2-aminobenzóico ao longo do curso da realização da fermentação. Conforme mostrado na Fig. 12, o composto de ácido carboxílico cis-4-hidróxi-ciclohexano aumentou a uma concentração de cerca de 0,9g/L no 6° dia da fermentação, o ácido 2- aminobenzóico acumulou a uma concentração de cerca de 0,45g/L nos 8°-9° dias da fermentação. O ácido 3,4-dihidróxibenzóico foi produzido em menores quantias, atingindo um máximo de concentração de cerca de 0,3g/L entre os 6°-8° dias. Um acúmulo total de ácido carboxílico cis-4-hidróxi- ciclohexano, ácido 2-aminobenzóico e ácido 3,4-dihidróxibenzóico de >1,3 g/L foi observado no 6° dia.

[00152] Pouco se conhece na literatura sobre a produção do ácido carboxílico cis-4-hidróxi-ciclohexano. Há apenas um relatório em que o ácido carboxílico cis-4-hidróxi-ciclohexano foi detectado na amostra de urina de uma criança usando o GC-MS. Cogitou-se a hipótese de que o composto era um subproduto do metabolismo bacteriano entérico (Kronick, Clinica Chimica Acta, 132: 205-208, 1983). Parece provável que este composto seja um produto direto de corismato ou prefanato uma vez que o mecanismo reacional pode ser explicado por uma clivagem da molécula piruvato seguida por uma redução que demanda moléculas com mais de 2,5 H2 que podem ser fornecidas através de NAD(P)H.

[00153] O ácido 2-aminobenzóico é um intermediário conhecido na via corismato para triptofano. A sintase antranilato catalisa a aminação seguida pela aromatização do corismato para obter a base aromática da molécula de triptofano. Sabe-se que que a expressão do gene de sintase antranilato é altamente regulada e sujeita à inibição de retorno pelo produto final triptofano. (Dosselaere, Crit Rev Microbiol, 27: 75-131, 2001). O ácido 2- aminobenzóico só foi secretado no caldo fermentativo quando o cultivo parou indicando que é um produto em excesso que não mais reagia quando o cultivo havia parado.

[00154] Todas as referências, incluindo publicações, pedidos de patentes, e patentes, mencionados no presente documento e pelo presente documento incorporados como referências nos mesmos termos como se cada referência fosse individual e especificamente indicada para ser incorporada como referência e apresentada em sua totalidade no presente documento. A referência a qualquer estado da técnica nesta descrição não é, e não deveria ser considerada, um reconhecimento de que aquele estado da técnica forma parte do conhecimento geral comum em termos de empenho em nenhum país.

[00155] O uso dos termos “um” e “uma” e “o” e “a” e referências similares no contexto de descrição da invenção (especialmente no contexto das reivindicações a seguir) devem ser interpretados a fim de abranger tanto o singular como o plural, salvo indicação contrária no presente documento ou claramente refutado pelo contexto. Os termos “compreende”, “possui”, “inclui”, e “contém” devem ser considerados como termos em aberto (ex.: significando “incluindo, mas não limitado a”) salvo observação contrária. A menção de faixas de valores no presente documento destina-se simplesmente a servir como um método de abreviação de referência individual para cada valor separado dentro da faixa, salvo indicação contrária no presente documento, e cada valor separado é incorporado na descrição como se fosse individualmente mencionado neste documento. Todos os métodos descritos no presente documento podem ser executados em qualquer ordem apropriada salvo indicação contrária no presente documento ou caso esteja claramente refutado pelo contexto. O uso de qualquer ou de todos os exemplos, ou linguagem exemplificativa (ex.: “tal como”) apresentada no presente documento, destina-se simplesmente a melhor esclarecer a invenção e não representa uma limitação ao escopo da invenção salvo exigido o contrário. Nenhuma linguagem na descrição deve ser interpretada no sentido de indicar qualquer elemento não reivindicado como essencial à prática da invenção.

[00156] As realizações preferenciais desta invenção são descritas no presente documento. Variações dessas realizações preferenciais podem se tornar óbvias para as pessoas com conhecimento comum no assunto perante a leitura da descrição supramencionada. Os inventores esperam que as pessoas com expertise no assunto apliquem tais variações conforme apropriado, e a intenção dos inventores para a invenção é que seja praticada apenas como especificamente descrito no presente documento. Assim, esta invenção inclui todas as modificações e equivalentes ao objeto mencionado nas reivindicações anexas ao presente documento como permitido pela legislação cabível. Adicionalmente, qualquer combinação dos elementos supramencionados em todas as suas possíveis variações é abrangida pela invenção salvo indicação contrária no presente documento ou caso esteja claramente refutado pelo contexto.

Claims (14)

1. BACTÉRIA GENETICAMENTE MODIFICADA FIXADORA DE C1 CAPAZ DE PRODUZIR PELO MENOS UM PRODUTO DERIVADO DE CORISMATO, CARACTERIZADA pelo fato de que a bactéria compreende uma prefanato sintase (EC 5.4.99.5) compreendendo uma mutação disruptiva que inativa parcialmente, inativa completamente, deleta, ou nocauteia a prefanato sintase.

2. BACTÉRIA, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a bactéria é uma bactéria Clostridium capaz de produzir pelo menos um produto derivado de corismato através da fermentação de um substrato gasoso.

3. BACTÉRIA, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que prefanato sintase é pheA.

4. BACTÉRIA, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a mutação disruptiva reduz ou elimina a expressão ou atividade da prefanato sintase e em que a bactéria produz: a. uma quantidade reduzida de produtos de prefanato ou derivados deste se comparado a uma bactéria parental; ou b. não produz considerável tirosina ou fenilalanina.

5. BACTÉRIA, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a bactéria compreende pelo menos um ácido nucleico que codifica uma prefanato sintase compreendendo uma mutação disruptiva.

6. BACTÉRIA, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADA pelo fato de que o ácido nucleico é códon otimizado para expressão no Clostridium.

7. BACTÉRIA, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o produto derivado de corismato: a. compreende um anel de carbono de 6 membros substituído com um grupo carboxila ou ânion carboxilato e posteriormente substituído com um ou mais grupos de OH e/ou um ou mais grupos de NH2; ou b. é selecionado do grupo que consiste de um ácido para- hidroxibenzoico, salicilato, 2-aminobenzoato, dihidroxibenzoato, carboxílico 4-hidróxi-ciclohexano, e sais e íons provindos desses.

8. BACTÉRIA, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADA pelo fato de que a bactéria posteriormente expressa uma DAHP sintase insensível a retroalimentação.

9. BACTÉRIA, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a bactéria: a. compreende uma prefanato sintase compreendendo uma mutação disruptiva e produz um produto de ácido 2-aminobenzoato, 2,3- dihidroxibenzoato, ou carboxílico 4-hidróxi-ciclohexano derivado de corismato; b. produz pelo menos um produto derivado de corismato não produzido por uma bactéria parental; ou c. produz uma maior quantidade de pelo menos um produto derivado de corismato do que a bactéria parental.

10. BACTÉRIA, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a bactéria é derivada de uma bactéria parental selecionada do grupo constituído por Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, e Clostridium ragsdalei.

11. BACTÉRIA, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que o Clostridium autoethanogenumé Clostridium autoethanogenum DSM23693.

12. BACTÉRIA, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o substrato gasoso compreende pelo menos um dentre CO, CO2 e H2.

13. MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE UM PRODUTO DE FERMENTAÇÃO, CARACTERIZADO por compreender fermentar a bactéria como definida na reivindicação 1 na presença de um substrato gasoso para produzir um produto de fermentação.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o substrato gasoso compreende pelo menos um dentre CO, CO2 e H2.