JP2012519485A - エタノール生産細菌及びエタノール生産におけるそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
本発明は、米国エネルギー省から与えられた、契約番号第DE−FG02−96ER20222、DE−FG36−08GO88142、及びDE−FC36−GO17058による米国政府の支援によってなされた。米国政府は本発明に対してある特定の権利を有している。
dkgA遺伝子は、アスコルビン酸の生成における重要な工程である、2,5−ジケト−D−グルコン酸の還元を触媒するということが示されている(Habrych et al. 2002. Biotechnol. Prog. 18:257-2, Yum et al. 1999 Appl. Environ. Microbiol. 65:3341-3346)。この酵素はメチルグリオキサールの還元において機能するとも考えられている(Jeudy er al. 2006. Proteins 62:302-307, Ko et al. 2005. J. Bacteriol 187:5782-5789)。
yqfA遺伝子の機能は知られていないが、脂肪酸代謝に関連している(McCue et al. 2001. Nucleic Acids Res. 29:774-782)酸化還元酵素の膜サブユニットではないかと提案されている(Karp et al. 2007 Nucleic Acids Res. 35:7577-7590)。
従って、フルフラールの存在下で生育してエタノールを生産できる微生物を産生する能力は、代替エネルギー源の産生に極めて重要である。
本発明は単離された細菌に関し、ここで細菌は参照する細菌と比較するとフルフラールに対する耐性が増大している。
本明細書で用いられる「単離された」は、他の細菌による汚染を部分的に受けるか又は全く受けていないことを意味する。単離された細菌は、単離された細菌の特性又は機能に影響を及ぼさない他の細菌の少量の存在下に生存できる。単離された細菌は一般に、少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、98%、又は99%純粋であろう。本発明による単離された細菌は少なくとも98%又は少なくとも99%純粋であることが好ましい。
一実施態様では、用語遺伝子は、フルフラール還元酵素、例えば、これに限定されないが、yqhD及びdkgAを包含するNADPH依存性フルフラール還元酵素をコードする何れの遺伝子も包含する。
一実施態様では、遺伝子又はポリヌクレオチド断片は、炭化水素のエタノールへの生物変換の少なくとも一工程に関連している。
有機体内の遺伝子は、本明細書で定義されているオペロンに群生していて、オペロンは遺伝子間DNAによって他の遺伝子及び/又はオペロンから分離している。
本発明は、フルフラール及び/又は5−HMFに対して耐性な細菌に関している。本発明は、非組み換え細菌、及び組み換え細菌の両方を提供する。
一実施態様では、調節タンパク質は抑制因子である。
別の実施態様では、調節タンパク質は誘導因子である。
本発明の方法によれば、調節は、これに限定されないが、yqhD又はyqhDとdkgA遺伝子を、参照する細菌と比較して、異なった調節タンパク質の制御下又は追加の調節タンパク質の制御下に置くことを包含する、当該技術分野で公知の各種方法によって修正される。一実施態様では、調節タンパク質は抑制因子である。これに代わる実施態様では、調節タンパク質は誘導因子である。
本発明は、yqhC遺伝子を、参照する細菌と比較して、修正又は欠失することによるyqhD又はyqhDとdkgA遺伝子の調節も提供する。
別の態様では、本発明はオリゴ糖源からエタノールを生産する方法を提供する。方法は、それによってオリゴ糖源からエタノールを生産するために、オリゴ糖を上記のような本発明の非組み換え型細菌又は宿主細胞と接触させることを含有する。方法の特定の実施態様では、オリゴ糖は、リグノセルロース、ヘミセルロース、セルロース、ペクチン及びこれらの何れかの組み合わせよりなる群から選ばれる。
本発明は、フルフラール及び/又は5−HMFに対して増大した耐性を有している細菌を提供する。細菌は、エタノールを生産するために、そして特に、フルフラールの存在下又は非存在下に、オリゴ糖を本発明の細菌と接触させ、それによってオリゴ糖源からエタノールを生産することによるという、オリゴ糖源からエタノールを生産するために、用いることができる。
本発明を、限定と見なしてはならない、以下の実施例によって更に説明する。特に明記しない限り、実施例を通して以下の材料及び方法が用いられる。
菌株、培地及び生育条件
本研究で用いられる菌株及びプラスミドを表1に載せてある。プラスミド及び菌株の構築はL培地(Miller 1992 A short course in bacterial genetics. CSHL Press. Plainview, New York)を用いて行った。必要に応じて抗生物質を含めた。温度条件付きプラスミドは30℃で生育して、その他のものは37℃で生育した。エタノール生産性菌株は、固体培地には20g/Lのキシロースを、そして発酵実験で用いた液体培地には50g/L又はそれ以上のキシロースを補完したAM1無機塩培地(Martinez et al. 2007 Biotechnol. Lett. 29:397-404)中で保持した。菌株大腸菌LY168株(Jarboe et al. 2007. Adv. Biochem. Engin/Biotechnol. 108:237-261)はKO11の誘導体であって、本研究の出発点としての役割を果たした。菌株大腸菌W(ATCC9637)が、最初に大腸菌Bの誘導体であると報告された(Ohta et al. 1991. Appl. Environ. Microbiol. 57:893-900)KO11に対する親株であることに注目されたい。
LY168株は、ヘミセルロース加水分解物中の糖の発酵に関して既に記載されている(Jarboe et al., 2007 Adv. Biochem. Engin/Biotechnol. 108:237-261)。基質領域(乳糖利用の回復、エンドグルカナーゼの組み込み、及びセロビオース利用の組み込み)を改善するために幾つかの修正が行われてLY180が得られた。組み込みに用いた線状DNA断片は図1に示されていて、GenBank に寄託されている。lacZlacYlacAcynX’を含有している断片A(Datsenko et al. 2000 PNAS 97:6640-6645, Jantama et al. 2008 Biotech. Bioeng. 30:881-893)を用いる二重相同組み換えによって、lacYのFRT領域を天然大腸菌ATCC9637と置き換えた。組み込み株を乳糖発酵に関して直接選択した。frdA::Zmfrg celYEc(Erwinia chrysanthemi)の下流にあるfrdB領域を、2段階法を用いる二重相同組み換え(Jantama et al. 2008 Biotech. Bioeng. 30:881-893)によって削除した。断片B(frdB’、cat−sacBカセット、及びfrdC’)をクロラムフェニコール耐性に対する選択を最初に組み込んだ。次いで、cat−sacBカセットを、蔗糖に対する耐性を選択して、frdA’、Zymomonas mobilis プロモーター断片、E.crysanthemi celY、及びfrdC’からなる断片Cと置き換えた。この置換体もFRT部位を欠失していた。セロビオース利用(casAB)をコードする Klevsiella oxytoca 遺伝子を、2段階法を用いる二重相同組み換え(Jantama et al. 2008 Biotech. Bioeng. 30:881-893)によって、1dhAに組み込んだ。1dhAのFRT部位をクロラムフェニコール耐性に対する選択と置き換えるために、断片D(1dhA’、cat−sacBカセット、casAB、及び’1dhA)を用いた。次いで、cat−sacBカセットを、1dhA’、Z. mobilis 由来のプロモーター断片、及びK.oxytoca casA’よりなる断片Eと置き換えた。セロビオース発酵に対する直接選択によって、組み込み株を単離した。表現型及びPCR産物の分析によって、全ての構築物を確認した。
100g/Lのキシロース及び0.5g/Lのフルフラールで補完した350mLのAM1を含有している500ml容器にLY180を植菌した(初期接種、50mgdcw/L、37℃、150rpm、pH6.5)。培養液は、24時間間隔で、又は細胞量が330mgdcw/Lを越えたときに、新しい発酵槽内へ連続希釈した。フルフラールは生育を許容して1.3g/Lまで漸増した。54回連続移植後に、耐性菌を単離してEMFR9と命名した。
フルフラール耐性を、小発酵槽(37℃、150rpm、pH6.5、可動範囲350ml)中で、100g/Lのキシロースを含有しているAM1培地(Martinez et al. 2007 Biotechnol. Lett. 29:397-404)を用いて比較した。種培養物を、およそ33mgdcw/Lに植菌した。サンプルを定期的に採取して細胞量、エタノール、及びフルフラールを測定した。
サトウキビ絞りかすのヘミセルロース加水分解物を、高温及び高圧で希硫酸を用いて製造し、そして Verenium Corporation (Boston, MA)から入手した。この加水分解物は82g/Lの総糖(主にキシロース)、1.4g/Lのフルフラール、及びその他の成分を含有していた。加水分解物を、AM1培地の無機成分で補完し、45%のKOHを用いてpH6.5に調節して、完全AM1(80g/Lのキシロース含有)で希釈した。加水分解物の希釈サンプルを13mm×100mmの培養試験管に分配し(4mLずつ)、17gdcw/Lの初期細胞密度で植菌して、37℃で培養した。細胞量(遠心分離及び培養液に再懸濁後)及びエタノール濃度を48時間後に測定した。
培養物を、670mg dcw/Lの密度まで小発酵槽で生育した。フルフラール(0.5g/L)を添加して、培養を集菌15分前まで続けた。全てのサンプルを直ちにエタノール−ドライアイス浴中で冷却し、遠心分離で集菌し、Quiagen RNA Later (Valencia, CA)に再懸濁して、精製するまで−80℃で保管した。Quiagen RNeasy Mini Kit を用いてRNAを精製して、マイクロアレイ比較のためにNimbleGen (Madison, WI)に送った。ArrayStar ソフトウェア(DNA Star, Madison, WI)でデータを解析した。
発現研究(リボソーム結合部位、コード領域、及び200bp末端領域)のために酸化還元酵素遺伝子を、Bio-Rad iCycler (Hercules, CA)を用いてLY180株のゲノムDNAから増幅し、pCR 2.1−TOPOベクターにライゲートして、Invitrogen TOPO TA Cloning Kit (Carlsbad, CA)を用いて大腸菌TOP10F’にクローン化した。QuiaPrep Spin Mini Prep Kit を用いてプラスミドを精製した。遺伝子の配向性をPCRで確立した。
yqhD及びdkgA遺伝子の両方をNovagen pET−15bベクター内にクローン化して、大腸菌BL21(DE3)内にHis標識化タンパク質として発現した。細胞をIPTGでおよそ1.3gdcw/Lまで生育し、100mMのリン酸緩衝液で洗浄して、Mp Fast Prep-24 (MP Biomedical, solon OH)及び Lysing Matrix B を用いて溶解した。粗製抽出物を0.22μmのPVDF(ポリフッ化ビニリデン)フィルターに通して、更に1mLのHiTrap ニッケルカラムを用いて精製した。精製した酵素を、Thermo Slide-A-Lyser を用いて100mMのリン酸緩衝液中で透析して、Thermo BCA Assay Kit を用いて定量した。YqhD及びDkgAの純度は、SDS−PAGEによって90%より大きいと評価された。SDS−PAGEゲル内にそれぞれに対する一本のバンドが観察された。精製したタンパク質のおよその大きさは、それぞれの予測値43kD及び31kDに一致した。明確なKcat値及び明確なKm値を両方の精製酵素についてNADPH及びフルフラールを用いて測定した。
培養物が670mgdcw/L密度まで生育している(対数増殖期中期)発酵槽を用いて全細胞フルフラール代謝を測定した。初期濃度0.5g/Lでフルフラールを添加した。フルフラール及び細胞量を測定するために、培養の0時点並びに15、30、及び60分後にサンプルを採取した。フルフラール代謝の具体的な速度を各試験間隔の間の平均細胞量を用いて算出した。結果を、マイクロモル/分/mg dcwで表した。
嫌気的試験管培養物を50g/Lのキシロースを含有しているAM1培地で生育して、対数増殖期中期(0.7〜1.0g dcw/L)に集菌した。細胞を、100mMのリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)20mLで1度洗浄し、およそ6.5g dcw/Lでリン酸緩衝液に再懸濁して、MP FastPrep-24 細胞破砕器及び Lysing Matrix B を用いて20分間溶解した。破片を遠心分離(13,000xg、10分)で除去して上澄液を、NADH及びNADPHのフルフラール依存性酸化を測定するために用いた。アッセイは、100mMのリン酸緩衝液(pH7.0)、20mMのフルフラール、及び0.2mMの還元体(NADPH又はNADH)を含んでいた。フルフラール依存性活性(マイクロモル/分/mgタンパク質)を340nmにおける吸光度の変化として測定した。活性の80%以上がNADPH依存性であった。
炎イオン化検出器及び15メートルの HP-PlotQ megaboreカラムを備えた Agilent 6890N ガスクロマトグラフ(Palo Alto, CA)を用いてエタノールを測定した。Bausch & Lomb Spectronic 70 分光光度計を用いて550nmにおける光学密度を測定することによって、乾燥細胞重量を見積もった。1.0のOD550nmはおよそ333.3mg dcw/Lに相当する。
AM1最少培地で生育した細菌培養物から、Quiagen DNeasy Blood and Tissue kit を用いて、ゲノムDNAを作成した。目的の領域を Quiagen Taq PCR master mix でPCR増幅して、得られたPCR産物を QIAquick PCR purification kit で精製した。2−log DNAラダー(NEB)中のバンドに対応するDNAを定量した後、ABI3130DNAシークエンサー上で分析するために、DNAをフロリダ大学の Sanger sequencing core に提出した。得られた配列データを集めて、Vector NTI ソフトウェア(Invitrogen)を用いて比較した。
350mLのAM1−10%キシロース培地を含有しているフリーカー中で0.66dcw/Lの細胞密度まで生育した培養物を、0.5g/Lにフルフラールを添加する直前、並びに添加の15、30、及び60分後にサンプリングした。細菌細胞を遠心分離で除去した後に培養液中の残存フルフラール濃度を測定した。既に記載されているように、分光光度法を用いた。
適切なレポータープラスミドを担持している大腸菌の培養物をAM1−5%キシロース中で、OD0.2〜0.4まで生育した。フルフラールの添加後、細胞をペレット化し、Quiagen Qproteome 細菌溶解緩衝液中に再懸濁して、−80℃で保管した。溶解物を2分間37℃で解凍して、白色の96ウェルプレートに移した。等量(50μL)の PerkinElmer BriteLite 試薬を各ウェルに添加して、Promega Glomax 96-well 光度計で発光を測定した。
フルフラールに対する耐性を、BioScreen C growth curve machine を用いて、規定濃度のフルフラールを含有しているAM1−5%キシロース培地における生育によって評価した。培養物を振盪している37℃の水浴中でODが0.4〜0.6になるまで生育し、OD=0.3に希釈して、次いで350uLの培地を含有している100ウェルハニカムプレートの各ウェルに50μLを植菌した。37℃で65時間の培養期間にわたり、読み取り直前に10秒振とうして、30分間隔で光学密度を測定した。菌株とフルフラール濃度のそれぞれの組み合わせに対して10の複製を用いた。
蛍ルシフェラーゼ遺伝子をpBAD24(Guzman et al. 1995 J. Bacteriol. 177: 4121-4130)に転写して、araC遺伝子及びpBADプロモーター領域をLY180中のyqhD遺伝子上流の150−bp領域と置き換えて、プラスミドpLOI4900を構築した。この推定yqhDプロモーター領域をプライマーPCT6及びPCT7を用いてPCR増幅した(表2)。
LY180中のyqhC遺伝子を、相同組み換えによって欠失した。最初に、pKD4(Datsenko et al. 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645)由来のカナマイシン(kan)カセットを、yqhCコード領域の両面にある領域と隣接した。プライマーyqhC_ko_revの配列は、yqhCの下流領域との隣接部に一致する領域に特異的であった。yqhC_ko_revは、yqhC遺伝子の3’末端の配列と相同な41−bp尾部を含有していて、kanカセットの末端の19bpにも一致している。yqhCの上流末端に、プライマーPCT48及びpCT49を用いて、yqhCの5’末端からyqhD遺伝子内に伸びている418−bp断片のPCR増幅によって隣接領域を作成した。kanカセットをpKD4から、プライマーPCT46及びPCT47で増幅し、次いでXhoI部位を介してPCT47及びPCT48にライゲーションすることによってPCT48プラスPCT49PCR産物(yqhC隣接上流)に結合した。最後に、このkan上流隣接構築物を最外部プライマーyqhC_ko_rev及びPCT49でPCR増幅して、41−bp下流隣接部及び418−bp上流隣接部の間がkanカセットで構成される線状DNAを作成した。レッドリコンビナーゼによる組み換えを用いてLY180内のyqhC遺伝子をkanカセットで置き換えて、LY180ΔyqhCを作成した。得られた菌株をPCR解析及びシークエンシングで確認した。
先に記載されているようにして(Miller et al. 2009 Appl. Environ. Microbiol. 75:4315-4323)、350mLのAM1−100g/Lキシロース培地を含有しているフレーカー中で細胞密度が0.66g dcw/Lになるまで培養物を生育して、フルフラール(0.5g/L)の添加直前並びに添加後15、30、及び60分後にサンプリングした。遠心分離後の培養液中の残存フルフラールを分光光学方法(Martinez et al. 2000 Biotechnol. Prog. 16: 637-641)を用いて測定した。
適切なレポータープラスミドを担持している大腸菌の培養物をAM1−50g/Lキシロース中でOD0.4まで生育した。培養物をサンプリングした後、フルフラールを添加して、再びサンプリングする前5,15又は30分間培養を続けた。非処理及びフルフラール処理細胞をペレット化し、Qiagen Qproteome 細胞溶解緩衝液中に再懸濁して、−80℃で保管した。溶解物を37℃で2分間解凍して、96ウェルプレート(白色)に移した。等容量(50μL)の PerkinElmer BriteLite 試薬を各ウェルに添加した。Promega Glomax 96ウェル照度計を用いて発光を測定した。
各菌株に対して、4複製培養液(350mL)をOD=1.5(0.66g dcw/L)まで生育してサンプリングした。フルフラール(0.5g/L)を添加して15分培養した後サンプルを採取した。培養液サンプルをドライアイス/エタノール浴中で冷却した。細胞を4℃でペレット化し、RNA Later(Quiagen)に再懸濁して、−80℃で保管した。4発酵物から得た細胞ペレットをプールしてRNA単離(Quiagen RNeasy Mini Kit)に用いた。RNAをDNaseで処理し、再精製して、Agilent Bioanalyzer を用いて品質を評価した。RNAサンプルをNimblegen に付してcDNAに変換し、Cy3で標識化して、大腸菌K12TI8333マイクロアレイチップにハイブリダーゼーションした。このチップは、大腸菌K12のMG1655株に由来する385,000 60−merのプローブを含有していて、遺伝子当たり平均18プローブを有する、各プローブの5複製物を有している。Nimblegen からの正規化発現データを解析のためにArrayStar(DNA star)に取り込んだ。
LY180及びeEMFR9の両方のyqhC−yqhD−dkgA領域のDNA配列は GenBank に寄託されている(受入番号はそれぞれ、GQ478251及びGQ478252)。マイクロアレイのデータは、受入番号GSE17786で、http://ncbi.nlm.nih.gov/geo のGen Expression Omnibus (GEO)に寄託した。
データは、平均値±SD(n≧3)で表している。Graphed Prism ソフトウェア(La Jolla. CA)を用いて、統計比較(両側スチューデントt検定)を行った。
100g/Lのキシロース及び増大する濃度のフルフラール(0.5g/Lの開始濃度〜1.3g/Lの最終濃度)を有するAM1無機塩培地を含有しているpH制御発酵槽中で54回連続移植した後に、LY180のフルフラール耐性誘導体株を単離した。単一工程(固体培地及び培養液)で1.0g/Lのフルフラールに耐性である突然変異体を直接単離する試みは成功しなかった。連続移植の間に、複合的変化と一致して、段階的に改善されたフルフラール耐性が観察された。得られた菌株、EMFR9は、1.0g/Lのフルフラールの存在下で、フルフラールが存在しない親株LY180と同じ速度で、生育してキシロースを発酵した(図2)。EMFR9による生育及びエタノール生産も、フルフラールの非存在下における親株LY180のそれを上回った。
グルコースとは異なって、キシロース発酵中のNADPHの産生には問題があって(White, D. 2000. The Physiology and Biochemistry of Prokaryotes. 2nd edition. Oxford University Press. New York, NY)、異なった培地におけるフルフラールについてMICを測定してNADPH競合仮説を試験する手法を提供する。50g/Lのキシロースを有する無機塩培地(図4A)では、フルフラールの最小阻止濃度(MIC)はLY180(親株)については約1.0g/Lで、突然変異株EMFR9については2.0g/Lであった。キシロースをグルコースで置き換えるとNADPHプールが増大するはずである。この変化(図4B)はフルフラールのMICをLY180に対して50%(1.5g/L)そしてEMFR9に対して25%(2.5g/L)増大した。キシロース−無機塩培地への少量(1.0g/L)の酵母抽出物の添加は、NADPHを生物合成する必要性を減少することが期待できる。この補完(図4C)は親株LY180に対するフルフラールのMICを2倍(2.0g/L)にして、EMFR9に対するMICを25%(2.5g/L)増大した。全ての培地で、EMFR9は親株LY180よりフルフラールに対して抵抗性であった。グルコース(NADPH産生を増大した)及び酵母抽出物(生物合成の必要性を減少した)の両方はフルフラール耐性を増大した。しかしながら、この利益は、EMFR9における低いレベルのフルフラール還元活性と一致して、突然変異株EMFR9に対するより親株、LY180に対して更に顕著であった。
過去の研究は、大腸菌がフルフラールを毒性の低い化合物(フルフリルアルコール)に還元できるNADPH依存性酵素を含有していることを明らかにしているが、遺伝子は1つも特定されていない(Gutierrez et al. 2006. J. Bacteriol. 121:154-164)。親株LY180の生育前のフルフラールの完全還元への依存性、及びEMFRによるこの依存性の減少は更に、フルフラールの感受性に最も重要である酸化還元酵素に関連している。
酸化還元酵素の間の遺伝子発現の最も大きな変化は、yqhD及びdkgAのサイレンシングであった。YqhD及びDkgAの両者を、his標識化タンパク質としてBL21(λDE3)に発現して、識別可能な均一性にまで精製した。両酵素は、フルフラールのフルフリルアルコールへのNADPH依存性還元を触媒した。フルフラールに対する見掛けのKm値は、YphD(9.0mM)及びDkgA(>130mM)については比較的高かった。このような値では、フルフラールが両酵素の元来の基質であるとは思われない。細胞がフルフラールに透過性であると理論的に仮定すると、YqhD及びDkgAの細胞内活性は、選択のために用いるフルフラール濃度(5〜14mM;0.5〜1.3g/L)の範囲にわたって変化すると期待できる。NADPHに対する見掛けのKm値はYqhD(8μM)及びDkgA(23μM)の両者について非常に低かった。フルフラールの存在下では、両酵素のNADPHに対する高い親和性はNADPHに対する生合成反応と効果的に競合するだろう。経路におけるNADPHの分配は、NADPHに対するKm、NADPHの定常状態のプールサイズ、及び競合する酸化還元酵素活性の相対存在量によって確認できるだろう。
ヘミセルロースの加水分解物は、共同して微生物の生育及び発酵を阻害するように作用する化合物の混合物を含有している(Martinez et al. 2001 Biotechnol. Prog. 17:287-293; Martinez et al. 2000 Biotechnol. Bioengin. 69(5): 526-536; Zaldivar et al. 1999 Biotechnol. Bioeng. 65: 24-33; Zaldivar et al. 1999 Biotechnol. Bioeng. 66: 203-210; Zaldivar et al. 2000. Biotechnol. Bioeng. 68:524-530)。1.4g/Lのフルフラールを含有している中和した加水分解物の希釈物中で生育及び発酵を試験した(図7)。生育及びエタノール生産に対するMIC値(30%加水分解物)は同様であったが、EMFR9は、親のLY180より、3倍の高密度で生育して、20%加水分解物中で10倍を超えてエタノールを多く生産した。フルフラールへの耐性を増大するためのEMFR9の選択には、ヘミセルロース加水分解物に対する耐性の増大を伴っていて、加水分解物毒性の構成要素としてのフルフラールの重要性が確認された。
大腸菌のゲノムにおいてyqhCは、YqhCと反対方向に転写されているyqhD及びdkgA遺伝子と隣接している(図8)。
PCRとDNAシークエンシングの併用による、フルフラール耐性株EMFR9のyqhC領域の分析は、EMFR9がyqhC遺伝子内への挿入配列IS10の自然挿入を含有していることを明らかにした(図8)。RNAのマイクロアレイ解析(図9)及びRNAの定量的リアルタイム逆転写(示していない)に基づくと、yqhCの不活性化はyqhD及びdkgAを下方調節する。
LY180内で、全yqhC遺伝子の欠失操作を行った。この構築物において、yqhCオープン・リーディング・フレームを選択可能なカナマイシン耐性カセットと置き換えた。kan−res転写の方向は、隣接yqhD及びdkgA遺伝子と離れて、元のyqhC遺伝子と同じ方向である。
天然由来フルフラール耐性突然変異株EMFR9はyqhD及びdkgAの両方の発現を減少する。これらの酸化還元酵素のレベルの低下は、フルフラールが存在すると、NADPHプールの枯渇を軽減する。先に述べたように、EMFR9は、その他の特性化又は非特性化突然変異に加えて、yqhCコード配列内に存在するIS10挿入配列を有している。
yqhDプロモーターからの転写に対するフルフラールの効果を評価するために、yqhDプロモーターの下流に、蛍ルシフェラーゼレポータを用いてプラスミドpPyqhD−luc(図12)を構築した。pPyqhD−lucを担持しているLY180におけるルシフェラーゼ活性の測定は、フルフラール添加後15分で活性が増大したことを示した(図13)。しかしながら、レポータープラスミドpPyqhD−lucをEMFR9及び更なるフルフラール耐性誘導体EMFR17内に転写すると、フルフラールの添加によるルシフェラーゼの発現は増大せずに(図13)、これらの株はフルフラールが存在すると通常生じるyqhDプロモーター由来の活性を抑制するようになることを示唆した。
大腸菌LY180のフルフラール耐性突然変異株(EMFR9)において2つのNADPH依存性酸化還元酵素(yqhD及びdkgA)のサイレンシングがフルフラール耐性の増大をもたらすことは既に示されている(Miller et al. 2009 Appl. Environ Microbiol 75:4315-4323 )。これらの遺伝子のコード領域に又は直ぐ上流及び下流領域において突然変異は見い出さなかった。第3の隣接遺伝子yqhC(図19)もEMFR内でサイレンシングした。マイクロアレイ分析で、親株LY180におけるフルフラールの添加によってこれら3つの遺伝子は強力に上方調節(>6倍)された(図20A)。
LY180のyqhC遺伝子をカナマイシン耐性カセットで置き換えてLY180ΔyqhCを作り出した。LY180と欠失株のフルフラール耐性をBioScreen C 生育曲線分析器を用いて比較した。得られたプロット(図21A及びB)は、1.0、1.5及び2g/Lフルフラールにおいて、LY180ΔyqhCが親株よりより耐性であることを明確に示した。フルフラール耐性の変化は、野生型yqhC遺伝子のプラスミド経由コピー(pLOI4901)をその天然のプロモーターとともに導入して、フルフラール感受性を十分回復することによる、yqhCの突然変異によって、引き起こされたことも確認された(図21C)。LY180ΔyqhCに空ベクター(pCC1)を存在させると、フルフラール感受性に影響を与えなかった(図21D)。(EMFR9における)IS10の挿入或いは(LY180ΔyqhCにおける)完全欠失の何れかによるyqhCの突然変異は、フルフラール耐性の増大をもたらした。
蛍ルシフェラーゼレポーターの直ぐ上流にyqhDプロモーター(151bp)を用いてプラスミドpLOI4900を構築した(図22A)。このプラスミドを、親株LY180及びLY180ΔyqhCにおける転写制御を検討するために用いた。LY180(pLOI4900)では、フルフラールの添加(1mM、5mM、及び10mM)が5分以内に明白な、ルシフェラーゼ活性の用量依存性増加をもたらした(図22B)。このプラスミドを内部に持つyqhC欠失株においては、フルフラールに依存する応答は観察されなかった(図22C)。発現の定常状態のレベルが両株で観察されたがLY180ΔyqhCでは低かった。
した。LY180(pLOI4900)において、全てがルシフェラーゼ活性を2〜5倍増大した(データは示されていない)。これらは、アセトアルデヒド(1mM)、プロピオンアルデヒド(1mM)、ブチルアルデヒド(1mM)、5−ヒドロキシメチルフルフラール(1mM)、及び桂皮アルデヒド(0.1mM)を包含していた。メチルグリオキサール(0.1mM)もLY180(pLOI4900)においてルシフェラーゼ活性を増大することが見出された。LY180ΔyqhCにおいて、これらの化合物はどれもルシフェラーゼ活性を増大しなかった。
0.5g/Lのフルフラール添加直前及び15分後にLY180株及びLY180ΔyqhC株から全RNAを調製した。yqhC−yqhD−dkgA領域並びに隣接遺伝子yghB(保存内膜タンパク質)及びyqhG(機能未知)に対する発現結果を図20Bに示す。L180において、yqhC、yqhD、及びdkgA転写産物の発現は、予測通り、フルフラールの添加によって上方調節された。LY180ΔyqhCにおいては、このフルフラール応答は存在しなかった。隣接遺伝子は低レベルで発現して、作用は少なかった。LY180ΔyqhCにおけるyqhCの低レベルの明白な発現は、LY180におけるldhA、adhE、及びfrdBCのような他の遺伝子欠失について観察されたものと類似していて、大腸菌K12チップで得られたハイブリダイゼーションのバックグラウンドレベルを反映していた。これらのデータは、yqhDプロモーターからの転写の陽性調節遺伝子としてのYqhC作用と一致している。
大腸菌以外の細菌におけるyqhCオルソログ及びyqhD及びdkgA遺伝子の相対物の存在を、EcoCyc(Keseler et al. 2009 Nucleic Acids Res 37: D464-D470)で入手できる検索用ゲノムによって調査した。大腸菌yqhCのオルソログを含有する46の属のうち40がグラム陰性細菌であった。yqhD及びdkgAに類似している遺伝子とyqhCオルソログとの近接さを EcoCyc マルチゲノムブラウザーを用いて試験した(図23)。全てのグラム陽性菌を包含して、殆どの属(46属のうち34属)はyqhCオルソログの近くに確認しうるyqhD又はdkgAオルソログを含有していなかった(例えば、アシネトバクター sp.及びキサントモナス・カンペストリス(Xanthomonas campestris))。しかしながら、34属のうち24属は、ゲノムの他の場所にyqhD又はdkAオルソログの一方を含有していた。46属のうち5属はyqhCに加えて隣接yqhDオルソログを含有していたが、dkgAオルソログは含有しておらず(例えば、アエロモナス・ヒドロフィラ(Aeromonas hydrophila)及びビブリオ・パラヘモリチカス(Vibrio parahaemolyticus))、そして1属(サーマトガ・マリティマ(Thermotoga maritima)、示していない)が隣接yqhDオルソログを含有せずに隣接dkgAオルソログを含有していた。5つの属が大腸菌と類似した配列で3つの遺伝子全てを含有していた。このグループは腸内細菌科に限定されて、エシェリキア属、シゲラ属(Shigella)、サルモネラ属、クレブシエラ属、ペクトバクテリウム属(Pectobacterium)、及びエルシニア属(Yersinia)を包含している。P.アトロセプチカム(P.atrosepticum)における遺伝子の配列は、yqhCオルソログ(ECA0352)とyqhDオルソログ(ECA0350)の間に推定ニトロ還元酵素遺伝子、ECA0351が存在するという点で独特であった。
フルフラール耐性突然変異体、EMFR9に存在している突然変異も5−HMFに対する耐性を増大した(図24)。1.0g/Lの5−HMFにおいて、EMFR9による生育及びエタノール生産は5−HMFが存在していないLY180(親株)のそれと同等であった(図24A、24B)。発酵の最初の24時間の間に、細胞生産及びエタノール生産に有害な影響を及ぼさずに、EMFR9によって5−HMFが急速に代謝された。5−HMFのレベルが培養中にゆっくり減少したのにもかかわらず、1.0g/Lの5−HMFによってLY180の生育が完全に阻害された(図24A、24B、及び24C)。植菌なしで、減少は観察されなかった(データは示していない)ので、これは代謝活性の結果であるということが確認された。
EMFR9におけるフルフラール耐性は、2つのNADPH依存性酸化還元酵素、YqhD及びDkgAのサイレンシングに起因していることが先に明らかにされた(Miller et al. 2009b Appl Environ Microbiol 75: 4315-4323)。これらの活性体をコードする遺伝子をpCR2.1 TOPO内にクローン化し、EMFR9内に転写して、0.1mMのIPTGを用いて誘発した。細胞を採取し、破壊して、5−HMF還元酵素活性について試験した(図25A)。プラスミドからのyqhD及びdkgAの個々の発現は、NADPHの5−HMF依存性酸化の速度を5倍に増大して、YqhD及びDkgAが5−HMFを基質として用いることが確認された。
プロトン転座型トランスハイドロゲナーゼpntAB(Keseler et al. 2009 Nucleic Acids Res 37: D464-70)をLY180内で過剰発現して(図26)NADPHの利用可能性を増大した。阻害因子の非存在下で(図26A)、ベクターを有するLY180(対照)及びLY180(pTrc99apntAB)の両方を同じ速度で生育した。IPTG(0.01mM)を用いるLY180(pTrc99a−pntAB)の誘導を5−HMFの非存在下で有害であった。しかしながら、非誘導LY180(pTrc99a pntAB)は、5−HMFの存在下(0.9g/L及び1.8g/L)でベクター対照より早く生育した。pntABの同様な効用がフルフラールを用いて先に観察されている(Miller et al. 2009b)。従って、両方のフランによる生育阻害は、フラン還元に起因して、生合成に必要なNADPHのプールを消耗すると思われる。更に、pntABの過剰発現は、フルフラールの非存在下でも、72時間後の総生育の増大をもたらし、生合成をこれらの条件下でNADPHによって制限できることを示した。
本明細書に記載されている本発明の特定の実施態様の多くの均等物を、当業者は認識し、或いは単に通常の実験程度のものを用いて確認することができるだろう。このような均等物は本発明に包含されることが意図されている。
本明細書において特定されている全ての刊行物、特許出願及び特許はその全てが参照により明確に本明細書に取り込まれている。
Claims (96)
- 当該細菌が参照する細菌と比較してフルフラールに対する耐性を増大している、単離された細菌。
- 当該細菌がエタノール生産性である、請求項1に記載の単離された細菌。
- 当該細菌が、参照する細菌と比較してエタノール生産を増大している、請求項1に記載の単離された細菌。
- 参照する細菌と比較して、yqhD遺伝子の発現が減少している、請求項1に記載の単離された細菌。
- 参照する細菌における発現と比較して、yqhD遺伝子及びdkgA遺伝子の発現が減少している、請求項1に記載の単離された細菌。
- 参照する細菌における発現と比較して、yqhC遺伝子の発現が減少している、請求項1に記載の単離された細菌。
- yghD遺伝子が発現されない、請求項1に記載の単離された細菌。
- yghD遺伝子及びdkgA遺伝子が発現されない、請求項1に記載の単離された細菌。
- yqhC遺伝子が発現されない、請求項1に記載の単離された細菌。
- 参照する細菌と比較して、yqhC遺伝子の発現が減少している、請求項4、5、7又は8の何れか一項に記載の単離された細菌。
- yqhC遺伝子が欠失している、請求項4、5、7又は8の何れか一項に記載の単離された細菌。
- 参照する細菌と比較して、YqhDタンパク質の活性が減少している、請求項1に記載の単離された細菌。
- 参照する細菌と比較して、YqhDタンパク質の活性及びDkgAタンパク質の活性が減少している、請求項1に記載の単離された細菌。
- 参照する細菌と比較して、YqhCタンパク質の活性が減少している、請求項1に記載の単離された細菌。
- 参照する細菌と比較して、yqhD遺伝子の発現の調節が修正されている、請求項1に記載の単離された細菌。
- 参照する細菌の発現と比較して、yqhD遺伝子の発現の調節及びdkgA遺伝子の調節が修正されている、請求項1に記載の単離された細菌。
- 参照する細菌の発現と比較して、yqhC遺伝子の発現の調節が修正されている、請求項1に記載の単離された細菌。
- 参照する細菌と比較して、yqhC遺伝子の発現が減少している、請求項12、13、15又は16の何れか一項に記載の単離された細菌。
- yqhC遺伝子が欠失している、請求項12、13、15又は16の何れか一項に記載の単離された細菌。
- yqhD遺伝子のプロモーター又は調節タンパク質の活性に変化がある、請求項12又は13に記載の単離された細菌。
- dkgA遺伝子のプロモーター又は調節タンパク質の活性に変化がある、請求項13に記載の単離された細菌。
- アンチセンスRNAの付加によってYqhD、DkgA、及び/又はYqhCタンパク質のレベルが減少している、請求項1に記載の単離された細菌。
- siRNAの付加によってYqhD、DkgA、及び/又はYqhCタンパク質のレベルが減少している、請求項1に記載の単離された細菌。
- 当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌が工程:
a)フルフラールの存在下で細菌の候補突然変異株を生育すること;及び
b)フルフラールの存在下でエタノールを生産する突然変異体を選択すること:
を含有してなる処理工程によって調製される、NADPH依存性フルフラール還元酵素活性の発現が減少している単離された細菌。 - 当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌が工程:
a)増大する濃度のフルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること;及び
b)フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること:
を含有してなる処理工程によって調製される、NADPH依存性フルフラール還元酵素活性の発現が減少している単離された細菌。 - NADPH依存性フルフラール還元酵素がYqhD又はDkgAである、請求項24又は25に記載の単離された細菌。
- NADPH依存性フルフラール還元酵素がYqhD及びDkgAである、請求項24又は25に記載の単離された細菌。
- 当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌は工程:
a)フルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること;及び
b)フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること:
を含有してなる処理工程によって調製される、参照する細菌と比較して、yqhD遺伝子の発現が減少している単離された細菌。 - 当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌が工程:
a)増大する濃度のフルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること;及び
b)フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること:
を含有してなる処理工程によって調製される、参照する細菌と比較して、yqhD遺伝子の発現が減少している単離された細菌。 - 当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌が工程:
a)フルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること;及び
b)フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること:
を含有してなる処理工程によって調製される、参照する細菌と比較して、yqhD遺伝子及びdkgA遺伝子の発現が減少している単離された細菌。 - 当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌が工程:
a)増大する濃度のフルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること;及び
b)フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること:
を含有してなる処理工程によって調製される、参照する細菌と比較して、yqhD遺伝子及びdkgA遺伝子の発現が減少している単離された細菌。 - yqhC遺伝子の発現が減少している、請求項28〜31の何れか一項に記載の単離された細菌。
- yqhC遺伝子が欠失している、請求項28〜31の何れか一項に記載の単離された細菌。
- 当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌が工程:
a)フルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること;及び
b)フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること:
を含有してなる処理工程によって調製される、参照する細菌と比較して、yqhC遺伝子の発現が減少している単離された細菌。 - 当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌が工程:
a)増大する濃度のフルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること;及び
b)フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること:
を含有してなる処理工程によって調製される、参照する細菌と比較して、yqhC遺伝子の発現が減少している単離された細菌。 - 当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌が工程:
a)yqhD遺伝子の発現を減少すること;
b)フルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること;及び
c)フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること:
を含有してなる処理工程によって調製される、NADPH依存性フルフラール還元酵素活性の発現が減少している単離された細菌。 - 当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌が工程:
a)yqhD遺伝子及びdkgA遺伝子の発現を減少すること;
b)フルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること;及び
c)フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること:
を含有してなる処理工程によって調製される、NADPH依存性フルフラール還元酵素活性の発現が減少している単離された細菌。 - yqhC遺伝子の発現が減少している、請求項36又は37に記載の単離された細菌。
- yqhC遺伝子が欠失している、請求項36又は37に記載の単離された細菌。
- 当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌が工程:
a)yqhC遺伝子の発現を減少すること;
b)フルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること;及び
c)フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること:
を含有してなる処理工程によって調製される、NADPH依存性フルフラール還元酵素活性の発現が減少している単離された細菌。 - 当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌が工程:
a)yqhD遺伝子の発現を減少すること;
a)フルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること;及び
b)フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること:
を含有してなる処理工程によって調製される、yqhD遺伝子の発現が減少している単離された細菌。 - 当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌が工程:
a)yqhD遺伝子及びdkgA遺伝子の発現を減少すること;
a)フルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること;及び
b)フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること:
を含有してなる処理工程によって調製される、yqhD遺伝子及びdkgA遺伝子の発現が減少している単離された細菌。 - yqhC遺伝子の発現が減少している、請求項41又は42に記載の単離された細菌。
- yqhC遺伝子が欠失している、請求項41又は42に記載の単離された細菌。
- 当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌が工程:
a)yqhC遺伝子の発現を減少すること;
a)フルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること;及び
b)フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること:
を含有してなる処理工程によって調製される、yqhC遺伝子の発現が減少している単離された細菌。 - 当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌が工程:
a)フルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること;及び
b)フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること:
を含有してなる処理工程によって調製される、参照する細菌と比較して、YqhDタンパク質の活性が減少又は除去されている単離された細菌。 - 当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌が工程:
a)増大する濃度のフルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること;及び
b)フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること:
を含有してなる処理工程によって調製される、参照する細菌と比較して、YqhDタンパク質の活性が減少している単離された細菌。 - 当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌が工程:
a)フルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること;及び
b)フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること:
を含有してなる処理工程によって調製される、参照する細菌と比較して、YqhDタンパク質及びDkgAタンパク質の活性が減少又は除去されている単離された細菌。 - 当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌が工程:
a)増大する濃度のフルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること;及び
b)フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること:
を含有してなる処理工程によって調製される、参照する細菌と比較して、YqhDタンパク質及びDkgAタンパク質の活性が減少している単離された細菌。 - yqhC遺伝子の発現が減少している、請求項46〜49の何れか一項に記載の単離された細菌。
- yqhC遺伝子が欠失している、請求項46〜49の何れか一項に記載の単離された細菌。
- 当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌が工程:
a)フルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること;及び
b)フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること:
を含有してなる処理工程によって調製される、参照する細菌と比較して、YqhCタンパク質の活性が減少又は消去されている単離された細菌。 - 当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌が工程:
a)増大する濃度のフルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること;及び
b)フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること:
を含有してなる処理工程によって調製される、参照する細菌と比較して、YqhCタンパク質の活性が減少している単離された細菌。 - 参照する細菌と比較して、当該細菌が、フルフラールの存在下におけるエタノール生産を増大している、請求項1〜53の何れか一項に記載の単離された細菌。
- 参照する細菌と比較して、当該細菌が、5−ヒドロキシメチルフルフラール(5−HMF)の存在下におけるエタノール生産を増大している、請求項1〜53の何れか一項に記載の単離された細菌。
- 参照する細菌と比較して、当該細菌が、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、及び桂皮アルデヒドよりなる群から選ばれるアルデヒドの存在下におけるエタノール生産を増大している、請求項1〜53の何れか一項に記載の単離された細菌。
- 参照する細菌と比較して、当該細菌が、メチルグリオキサールの存在下におけるエタノール生産を増大している、請求項1〜53の何れか一項に記載の単離された細菌。
- 参照する細菌と比較して、当該細菌が、フルフラールの還元的除去のレベルが減少している場合に、エタノール生産を増大している、請求項1〜53の何れか一項に記載の単離された細菌。
- 参照する細菌と比較して、当該細菌が、フルフラールの代謝を減少している、請求項1〜52の何れか一項に記載の単離された細菌。
- 当該細菌が検出可能なフルフラールの代謝を示さない、請求項1〜53の何れか一項に記載の単離された細菌。
- 参照する細菌と比較して、当該細菌の生育が増大している、請求項1〜53の何れか一項に記載の単離された細菌。
- 参照する細菌と比較して、当該細菌のフルフラールの存在下での生育が増大している、請求項1〜53の何れか一項に記載の単離された細菌。
- 参照する細菌と比較して、当該細菌のフルフラールの存在下での生育が増大し及びエタノール生産が増大している、請求項1〜53の何れか一項に記載の単離された細菌。
- 参照する細菌と比較して、当該細菌の5−HMFの存在下での生育が増大している、請求項1〜53の何れか一項に記載の単離された細菌。
- 参照する細菌と比較して、当該細菌の5−HMFの存在下での生育が増大し及びエタノール生産が増大している、請求項1〜53の何れか一項に記載の単離された細菌。
- 参照する細菌と比較して、当該細菌がフルフラール還元酵素活性を減少する、請求項1〜53の何れか一項に記載の単離された細菌。
- 当該細菌がNADPHの5−HMF依存性酸化の速度を減少する、請求項1〜53の何れか一項に記載の単離された細菌。
- yqhC遺伝子中のIS10の挿入にによってyqhC遺伝子の発現が減少している、請求項1に記載の単離された細菌。
- 参照する細菌と比較して、当該細菌が加水分解物の存在下での生育を増大している、請求項1〜53の何れか一項に記載の単離された細菌。
- 加水分解物が、バイオマス、ヘミセルロース系バイオマス、リグノセルロース系バイオマス又はセルロース系バイオマスに由来している、請求項1〜53の何れか一項に記載の単離された細菌。
- 当該細菌が主発酵産物としてエタノールを生産する、請求項1〜53の何れか一項に記載の単離された細菌。
- エタノールが嫌気的条件下で生産される、請求項71に記載の単離された細菌。
- エタノールが微好気的条件下で生産される、請求項71に記載の単離された細菌。
- 当該細菌が非組み換え型である、請求項1〜53の何れか一項に記載の単離された細菌。
- 当該細菌が組み換え型である、請求項1〜53の何れか一項に記載の単離された細菌。
- 当該細菌がグラム陰性である、請求項1〜53の何れか一項に記載の単離された細菌。
- 当該細菌がグラム陽性である、請求項1〜53の何れか一項に記載の単離された細菌。
- グラム陰性細菌が、アシネトバクター属、グルコノバクター属、ザイモモナス属、エシェリキア属、ジオバクター属、シェワネラ属、サルモネラ属、エンテロバクター属及びクレブシエラ属よりなる群から選ばれる、請求項76に記載の単離された細菌。
- グラム陽性菌が、バチルス属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、オエノコッカス属、ストレプトコッカス属及びユーバクテ
リウム属よりなる群から選ばれる、請求項77に記載の単離された細菌。 - 細菌が大腸菌である、請求項1〜53の何れか一項に記載の単離された細菌。
- 細菌がクレブシエラ・オキシトカである、請求項1〜53の何れか一項に記載の単離された細菌。
- 細菌が、大腸菌EMFR9株である、請求項80に記載の非組み換え型細菌。
- バイオマス、ヘミセルロース系バイオマス、リグノセルロース系バイオマス、セルロース系バイオマス又はオリゴ糖を、請求項1〜53の何れか一項に記載の単離された細菌と接触させて、それによってバイオマス、ヘミセルロース系バイオマス、リグノセルロース系バイオマス、セルロース系バイオマス又はオリゴ糖源からエタノールを生産することを含有してなる、バイオマス、ヘミセルロース系バイオマス、リグノセルロース系バイオマス、セルロース系バイオマス又はオリゴ糖源からエタノールを生産する方法。
- バイオマス、ヘミセルロース系バイオマス、リグノセルロース系バイオマス、セルロース系バイオマス又はオリゴ糖を、請求項1〜53の何れか一項に記載の単離された細菌と接触させて、それによってバイオマス、ヘミセルロース系バイオマス、リグノセルロース系バイオマス、セルロース系バイオマス又はオリゴ糖源からエタノールを生産することを含有してなる、フルフラールの存在下で、バイオマス、ヘミセルロース系バイオマス、リグノセルロース系バイオマス、セルロース系バイオマス又はオリゴ糖源からエタノールを生産する方法。
- 請求項1〜53の何れか一項に記載の単離された細菌を含有してなる、キット。
- Agricultural Research Culture Collection に寄託された、寄託番号NRRL B−50239で表される、大腸菌LY180株。
- 請求項83又は84に記載の方法で生産されたエタノール。
- yqhC遺伝子の非存在下で発現の増大又は減少を示す遺伝子を含有してなる、マイクロアレイ。
- 図28に示される配列及びその断片、並びにそれらの突然変異体を含有してなる、単離されたyqhDプロモーター。
- フルフラール、5−HMF、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、桂皮アルデヒド、及びメチルグリオキサールの内の少なくとも1つの存在下で、参照する細菌と比較して、遺伝子の発現を調節するための、yqhDプロモーターの使用。
- 参照する細菌と比較して、当該細菌がフルフラールに対する耐性を増大して、そして参照する細菌と比較して、NADPH依存性酸化還元酵素の発現及び/又は活性が減少している、単離された細菌。
- 当該NADPH依存性酸化還元酵素が、YqhDのKm及び/又はDkgAのKm未満か又は等しいKmを有している、請求項91に記載の単離された細菌。
- Agricultural Research Culture Collection に寄託された、寄託番号NRRL B−50240で表される、大腸菌EMFR9株。
- Agricultural Research Culture Collection に寄託された、寄託番号NRRL B−50241で表される、大腸菌EMFR17株。
- Agricultural Research Culture Collection に寄託された、寄託番号NRRL B−50242で表される、大腸菌EMFR26株。
- Agricultural Research Culture Collection に寄託された、寄託番号NRRL B−50243で表される、大腸菌EMFR35株。
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