BRPI0712876A2

BRPI0712876A2 - produção de ácido glicólico por fermentação a partir de fontes renováveis

Info

Publication number: BRPI0712876A2
Application number: BRPI0712876-2A
Authority: BR
Inventors: Philippe Soucaille
Original assignee: Metabolic Explorer Sa
Priority date: 2006-06-09
Filing date: 2007-06-07
Publication date: 2012-09-04
Also published as: CA2654182A1; US20090155867A1; CN101466841A; AU2007255339A1; AR061304A1; ES2691206T3; WO2007141316A2; JP2014014364A; WO2007141316A3; WO2007140816A1; JP5431149B2; ZA200809973B; US9034615B2; KR101519670B1; MX2008015737A; JP2009539361A; IL195380A0; CN101466841B; RU2008152832A; BRPI0712876B1

Abstract

Resumo da Patente de Invenção para : "PRODUçãO DE áCIDO GLICóLICO POR FERMENTAçãO A PARTIR DE FONTES RENOVáVEIS". A presente invenção proporciona um método para a produção biológica de ácido glicólico a partir de uma fonte de carbono fermentável em um microrganismo. Em um aspecto da presente invenção, um processo para a conversão de glicose em ácido glicólico é alcançado pelo uso de um organismo recombinante compreendendo em E. Coli hospedeiro transformado i) para atenuar as vias de consumo de glioxilato para outros compostos diferentes de glicolato ii) para usar uma NADPH glioxilato redutase para converter glixilato em glicolato, iii) para atenuar o nível de todas as enzimas metabolizadoras de glicolato e iv) aumentar o fluxo a via do glioxilato. Em outro aspecto da presente invenção, o processo para a produção de ácido glicólico a partir de uma fonte de carbono fermentável usando uma E.Coli recombinante é melhorando pelo aumento da disponibilidade de NADPH nas células. Opacionalmente, o ácido glicólico produzido pode ser purificado através de uma etapa de polimerização até pelo menos dímeros do áscido glicólico e recuperado pela despolimerização dos dímeros, oligómeros e/ou polímeros de ácido glicólico.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção Para: "PRODUÇÃO DE ÁCIDO GLICÓLICO POR FERMENTAÇÃO A PARTIR DE FONTES RENOVÁVEIS".

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção compreende um processo para a bioconversão de uma fonte de carbono fermentável em ácido glicólico por um microrganismo crescido de modo anaeróbico.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O ácido glicólico (HOCH2COOH) é o primeiro membro da família de alfa-hidroxiácidos de ácidos carboxilicos. O ácido glicólico apresenta uma funcionalidade dual tanto com grupos funcionais alcoólicos quanto grupos funcionais de ácidos moderadamente fortes em uma molécula muito pequena. Isso resulta em atributos químicos únicos, assim como em uma química de ácido e álcool típica.

O ácido glicólico usa os grupos tanto hidroxila quanto ácido carboxílico para formar complexos de anéis com cinco membros (quelatos) com metais polivalentes. Essa capacidade de complexar com o íon metálico é útil na dissolução da escala de água dura e prevenção de deposição, especialmente em aplicações de limpeza ácida onde uma boa capacidade de rinsagem é um fator chave. Ácido glicólico sofre reações com alcoóis orgânicos e ácidos para formar ésteres. Esteres alquil glicólicos de baixo peso molecular têm propriedades de solvência incomuns e podem ser usados como um substituto para n- e isopropanol, etilenodiamina, fenol, m-cresol, acetato de 2-etoxietila e lactato de etila e metila. Esteres alquilicos com pesos moleculares superiores podem ser usados em formulações de produtos de cuidados pessoais. 0 ácido glicólico pode reagir entre si para formar glicolideo dimérico, oligômeros de poliéster cabeça-cauda, e polímeros de cadeia longa. Copolimeros podem ser feitos com outros alfa-hidroxiácidos como o ácido lático. Os polímeros de poliéster gradualmente se hidrolisam em ambientes aquosos em taxas controláveis. Essa propriedade os torna úteis em aplicações biomédicas, tal como em suturas dissolvíveis e em aplicações onde uma liberação controlada de ácido é necessária para reduzir o pH. Atualmente, mais de 15.000 toneladas de ácido glicólico são consumidas anualmente nos Estados Unidos.

A produção biológica de ácido glicólico, apresentada na Figura 1, requer a formação de glioxilato como um intermediário, o qual é reduzido a glicolato por uma oxidorredutase dependente de NADPH codificada pelo gene ycdW (Nunez et al, (2001) Biochemistry, 354, 707-715) . O glioxilato é um intermediário do ciclo do glioxilato (Tricarboxylic acid cycle and glyoxylate bypass, reviewed ín Neidhardtf F. C. (Ed. in Chief), R. Curtiss III, J. L. Ingraham, Ε. C. C. Lin, Κ. Β. Low, Β. Magasanik, W. S. Reznikoff, Μ. Riley, Μ. Schaechter, e Η. Ε. Umbarger (eds). 1996. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. American Society for Microbiology).

Nesse ciclo, o isocitrato é clivado em succinato e glioxilato, uma reação que é catalisada pela isocitrato liase, codificada pelo gene aceA. O succinato entra diretamente no ciclo do ácido citrico e é convertido em oxaloacetato. Glioxilato é convertido em malato pela incorporação de uma molécula de acetil-CoA derivada de acetato, uma reação catalisada pelas duas isoenzimas de malato sintase codificadas por aceB e gclB. A entrada de carbono no desvio de glioxilato é regulada nos níveis transcricional e pós-transcricional. A regulação transcricional é exercida no operon aceBAK pelo repressor IclR. O aceBAK codifica a malato sintase, isocitrato liase e isocitrato quinase/fosfatase, respectivamente. O gene iclR é negativamente auto-regulado e ativado pela proteína FadR. A atividade da isocitrato desidrogenase, codificada pelo gene icd, é regulada pós-tanscricionalmente. A isocitrato desidrogenase e a isocitrato liase competem pelo substrato em comum, o isocitrato. Uma vez que o valor de Km para o isocitrato é significativamente superior para a reação da isocitrato liase, a entrada na via do glioxilato depende em parte da regulação da enzima isocitrato desidrogenase. A atividade da isocitrato desidrogenase é modulada pela sua fosforilação ou desfosforilação catalisada por AceK. A fosforilação reduz a atividade da Icd e a desfosforilação reativa a enzima Icd. Se AceK atua como quinase ou fosfatase depende da presença de vários metabólitos. A depleção de isocitrato e de 3-fosfoglicerato estimula a atividade quinase; a presença de piruvato e AMP inibe a função quinase, favorecendo dessa forma a atividade da fosfatase (ver também Neidhard). Glioxilato pode ser convertido em tartronato semi-aldeido por uma glioxilato carboligase codificada por gel e em 2-ceto-4- hidroxiglutarato por uma 2-ceto-3-desoxigluconato 6-fosfato aldolase codificada por ecía, enquanto que o glicolato pode ser reduzido a glicoaldeido por uma glicoaldeido desidrogenase dependente de NAD+ codificada por aldA ou oxidada a glioxilato por uma glicolato oxidase dependente de NAD+ codificada por glcOEF.

O problema a ser solucionado pela presente invenção é a produção biológica de ácido glicólico a partir de um substrato de carbono barato, tal como glicose ou outros açúcares. A quantidade de passos bioquímicos e a complexidade das vias metabólicas exigem, para um processo industrial praticável de produção de ácido glicólico, o uso de um catalisador de célula inteira metabolicamente projetado.

RESUMO DA INVENÇÃO

Os requerentes solucionaram o problema estabelecido e a presente invenção proporciona um método para a bioconversão de uma fonte de carbono fermentável diretamente em ácido glicólico. Glicose é usada como um substrato modelo e E. coli recombinante é usada como o hospedeiro modelo. Em um aspecto dessa invenção, E. coli recombinantes incapazes de metabolizar glioxilato em outros compostos diferentes de glicolato são construídos pela inativação dos genes que codificam as malato sintases (aceB e glcB), a glioxilato carboligase (gel) e a 2-ceto-3- desoxigluconato 6-fosfato aldolase (eda). Em outro aspecto dessa invenção, a atividade da glioxilato redutase dependente de NADPH é usada para reduzir o glioxilato tóxico em glicolato pelo uso de genes codificantes endógenos, como yccM ou yiaE. Em um outro aspecto dessa invenção, o gene codificando as enzimas metabolizadoras de glicolato, glicolato oxidase (glcDEF) e glicoaldeído desidrogenase {aldA) são anuladas. Além disso, o fluxo na via do glioxilato é aumentado pelo: i) aumento do nível de aceA pela inativação do gene iclR ou pelo aumento direto da expressão de aceA, ii) redução do nível de expressão ou inativação do gene que codifica a isocitrato desidrogenase (icd) e iii) inativação dos genes que codificam a piruvato oxidase (poxB) e a via do acetato (ack, pta). Em um aspecto final dessa invenção, um melhor rendimento da produção de glicolato é obtido pelo aumento da disponibilidade de NADPH pela inativação dos genes que codificam a glicose-6-fosfato isomerase (pgi), da 6-fosfogluconato desidratase (edd) e a transidrogenase solúvel (udhA). A presente invenção pode ser aplicada de um modo geral para incluir qualquer substrato de carbono que seja prontamente convertido em acetil-CoA.

Consequentemente é um objeto da presente invenção proporcionar um organismo recombinante, útil para a produção de ácido glicólico compreendendo: (a) pelo menos a inativação de todos os genes que codificam malato sintases, glioxilato carboligases e 2-ceto-3-desoxigluconato 6- fosfato aldolase; (b) pelo menos um gene codificando um polipeptideo possuindo atividade da glioxilato redutase dependente de NADPH e (c) pelo menos a inativação dos genes codificando a oxidação do glicolato dependente de NAD+ em glioxilato. Opcionalmente, o organismo recombinante pode compreender: i) a inativação de mutações em genes endógenos selecionados do grupo consistindo de: (a) um gene codificando um repressor da via glioxilato, (b) um gene codificando um polipeptideo possuindo atividade da glicose- 6-fosfato isomerase; (c) um gene codificando um polipeptideo possuindo atividade da transidrogenase solúvel; (d) um gene codificando um polipeptideo possuindo atividade da β-fosfogluconato desidratase, (e) genes codificando polipeptideos possuindo atividades de fosfo- transacetilase e acetato quinase, (f) um gene codificando a atividade da piruvato oxidase, (g) um gene codificando a atividade da glicoaldeido desidrogenase: ii) aumento do nivel de um gene codificando a isocitrato liase e iii) a redução do nivel ou inativação de um gene codificando polipeptideo possuindo atividade da isocitrato desidrogenase.

Em outra modalidade, a invenção proporciona um processo para a produção de ácido glicólico a partir de um organismo recombinante compreendendo: (a) o contato do organismo recombinante da presente invenção com pelo menos uma fonte de carbono selecionada do grupo consistindo de monossacarideos, oligossacarideos, polissacarideos e substratos com um único carbono, por meio do que o glicolato é produzido; opcionalmente (b) a recuperação do ácido glicólico produzido em (a) através de uma etapa de polimerização até pelo menos dimeros de ácido glicólico, e (c) recuperação do ácido glicólico por despolimerização a partir de dimeros de ácido glicólico, oligômeros e/ou polímeros.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Os desenhos associados, os quais são incorporados e constituem parte dessa especificação, exemplificam a invenção e juntamente com a descrição, servem para explicar os princípios dessa invenção.

Figura 1 demonstra a engenharia genética da glicólise, o ciclo TCA e a via do glioxilato no desenvolvimento do sistema de produção de ácido glicólico a partir de carboidratos.

Figura 2 é um diagrama apresentando a construção do vetor pME101-ycdW.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Conforme aqui utilizados os termos seguintes podem ser usados para a interpretação das reivindicações e especificações.

O termo "cepa mutante" se refere a uma cepa do tipo não-selvagem.

O termo "microrganismo" se refere a todos os tipos de organismos unicelulares, incluindo organismos procarióticos como bactérias, e organismos eucarióticos como leveduras. Bactérias incluem, particularmente: Enterobacteriaceae, Baeillaeeae, Streptomycetaceae e Corynebaeteriaeeae. Enterobacteriaceae compreende particularmente, porém não exclusivamente, os gêneros Escherichia, Klebsiella, Salmonella e Pantoea.

0 termo "transformação" ou "transfecção" se refere à aquisição de novos genes em uma célula após a incorporação de ácido nucléico exógeno. 0 termo "transformante" se refere ao produto de uma transfomação. 0 termo "geneticamente alterado" se refere ao processo de alteração de material hereditário por transformação ou mutação.

O termo "atenuação" se refere à expressão diminuída de um gene ou à atividade diminuída da proteína, produto do gene. O homem versado na técnica conhece várias formas de obter esse resultado, como por exemplo:

Introdução de uma mutação no gene, diminuindo o nível de expressão desse gene ou o nível de atividade da proteína codificada.

- Substituição do promotor natural do gene por um promotor de baixa força, resultando em uma expressão mais baixa.

- Uso de elementos desestabilizando o RNA mensageiro correspondente ou a proteína.

Anulação do gene se nenhuma expressão for necessária. O termo "expressão" se refere à transcrição e tradução de um gene para a proteína, produto do gene.

O termo "plasmídeo" ou "vetor", conforme aqui utilizado, se refere a um elemento extracromossomal geralmente carregando genes os quais não são parte do metabolismo central da célula, e geralmente na forma de moléculas de DNA de fita dupla circular.

O termo "substrato de carbono" ou "fonte de carbono" significa qualquer fonte de carbono capaz de ser metabolizada por um microrganismo, em que o substrato contém pelo menos um átomo de carbono. Os autores se referem particularmente a fontes de carbono renováveis, baratas e fermentáveis, tais como monossacarideos, oligossacarídeos, polissacarídeos, substratos de um único carbono e polióis, tais como glicerol. Substratos de carbono individual são definidos como moléculas de carbono que contêm somente um átomo de carbono, tal como metanol. Monossacarideos de fórmula (CH20)n, são também chamados como oses ou "açúcares simples"; monossacarideos incluem sacarose, frutose, glicose, galactose e manose. Outras fontes de carbono compreendendo mais de um monossacarídeo são chamadas de dissacarídeos, trissacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos. Dissacarídeos incluem sacarose (açúcar de cana), lactose e maltose. Amido e hemicelulose são polissacarideos, também conhecidos como "açúcares complexos". Conseqüentemente, o termo "fonte de carbono" significa qualquer produto conforme citado acima, e suas misturas.

0 termo "ATCC", irá ser estabelecido para American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 208 52, EUA.

Os termos "glioxilato" e "ácido glioxílico" são usados intercambiavelmente.

Os termos "glicolato" e "ácido glicólico" são usados intercambiavelmente.

Na descrição da presente invenção, enzimas são identificadas por suas atividades especificas. Essa definição, desta forma, inclui todos os polipeptideos que têm a atividade especifica definida também presente em outros organismos, mais particularmente em outros microrganismos. Geralmente enzimas com atividades similares podem ser identificadas pelo seu agrupamento a certas famílias definidas como PFAM ou COG.

PFAM (banco de dados de famílias de proteínas de alinhamentos e modelos escondidos de Markov; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/) representa uma grande coleção de alinhamentos de seqüências de proteínas. Cada PFAM torna possível visualizar alinhamentos múltiplos, ver domínios de proteína, avaliar a distribuição entre os organismos, ganhar acesso a outros bancos de dados e visualizar estruturas de proteínas conhecidas.

COGs (culturas de grupos ortólogos de proteínas; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/) são obtidas pela comparação de seqüências de proteínas de 43 genomas totalmente seqüenciados representando as 30 maiores linhagens filogênicas. Cada COG é definida a partir de pelo menos três linhagens, o que permite a identificação de domínios anteriormente conservados.

As formas de identificar seqüências homólogas e suas homologias percentuais são bem conhecidas pelas pessoas versadas na técnica, e incluem particularmente os programas BLAST, os quais podem ser usados a partir do website http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ com os parâmetros predefinidos indicados naquele website. As seqüências obtidas podem ser então exploradas (por exemplo, alinhadas) usando, por exemplo, os programas CLUSTALW (http://www.ebi. ac.uk/clustalw/) ou MULTALIN (http://prodes.toulouse.inra .fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl), com os parâmetros predefinidos indicados naqueles websites.

Usando as referências dadas no GenBank para os genes conhecidos, as pessoas versadas na técnica são capazes de determinar os genes equivalentes em outros organismos, cepas bacterianas, leveduras, fungos, mamíferos, plantas, etc. Esse trabalho rotineiro é vantajosamente feito usando seqüências de consenso que podem ser determinadas pela execução de alinhamentos de seqüências com genes derivados de outros microrganismos, e projetando sondas degeneradas para clonar o gene correspondente em outro organismo. Esses métodos de rotina de biologia molecular são bem conhecidos pelas pessoas versadas na técnica e estão descritos, por exemplo, em Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2a ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, Nova Iorque.).

A presente invenção proporciona um método para a produção fermentativa de ácido glicólico, seus derivados ou precursores, pelo cultivo de um microrganismo em um meio de cultura apropriado compreendendo uma fonte de carbono e a recuperação do ácido glicólico a partir do meio de cultura.

Outra modalidade da invenção proporciona um método em que o microrganismo é modificado para ter uma baixa capacidade de conversão de glioxilato, exceto para produzir glicolato, devido à atenuação dos genes que codificam enzimas que consumem glioxilato, um precursor chave do glicolato: genes aceB e gclB que codificam as malato sintases, gel codificando a glioxilato carboligase e eda contendo 2-ceto-3-desoxigluconato 6-fosfato aldolase. Em outra modalidade da invenção, o microrganismo contém pelo menos um gene codificando um polipeptideo que catalisa a conversão de glioxilato em glicolato.

Particularmente, um gene codificando uma enzima glioxilato redutase dependente de NADPH está presente para converter, sob condições aeróbicas, o intermediário glioxilato tóxico no produto final glicolato de baixa toxicidade. 0 gene pode ser exógeno ou endógeno e pode ser expresso cromossomicamente ou extracromossomicamente. Um gene codificando a glioxilato redutase dependente de NADPH pode ser tomado dentre os genes ycdW ou yiaE a partir do genoma de E.coli MG1655. Em uma modalidade preferida, a expressão de pelo menos um dos referidos genes é aumentada. Caso necessário, um alto nivel de atividade glioxilato redutase dependente de NADPH pode ser obtido a partir de genes cromossomicamente localizados pelo uso de uma ou várias cópias no genoma que podem ser introduzidas pelos métodos de recombinação conhecidos pelo especialista na área. Para genes extracromossomais, diferentes tipos de plasmideos que diferem em relação às suas origens de replicação e, deste modo, suas quantidades de cópias na célula podem ser usados. Eles podem estar presentes como 1 a 5 cópias, ca 20 ou até 500 cópias correspondendo a plasmideos com baixo número de cópias com replicação restrita (pSC101, RK2), plasmídeos com baixo número de cópias (pACYC, pRSFlOlO) ou plasmídeos com grande número de cópias (pSK bluescript II). Os genes ycdW ou yiaE podem ser expressos usando promotores com diferentes forças que precisam ou não ser induzidos por moléculas indutoras. São exemplos os promotores Ptrc, Ptac, Plac, o promotor lambda cI ou outros promotores conhecidos pelo especialista na área. A expressão dos genes também pode ser impulsionada por elementos estabilizantes do RNA mensageiro correspondente (Carrier e Keasling (1998) Biotechnol. Prog. 15, 58-64) ou pela proteína (e.g. etiquetas GST, Amersham Biosciences).

Em uma outra modalidade da invenção, o microrganismo é modificado de tal forma que ele é incapaz de metabolizar substancialmente o glicolato. Esse resultado pode ser alcançado pela atenuação de pelo menos um dos genes que codificam enzimas que consomem glicolato (glcDEF codificando glicolato oxidase e aldA codificando glicoaldeído desidrogenase). A atenuação dos genes pode ser feita pela substituição do promotor natural por um promotor de baixa força ou pelo elemento desestabilizador do RNA mensageiro correspondente ou da proteína. Caso necessário, a atenuação completa do gene pode ser conseguida por uma anulação da seqüência de DNA correspondente. Em outra modalidade, o microrganismo usado no método da invenção é transformado para aumentar o fluxo da via do glioxilato.

0 fluxo na via do glioxilato pode ser aumentado por diferentes formas, e em particular:

i) reduzindo a atividade da enzima isocitrato desidrogenase (Icd),

ii) reduzindo a atividade de pelo menos uma das seguintes enzimas:

• fosfo-transacetilase, codificada pelo gene pta;

• acetato quinase, codificada pelo gene ack;

• piruvato oxidase, codificada pelo gene poxB;

pela atenuação dos genes,

iii) aumentando a atividade da enzima isocitrato liase, codificada pelo gene aceA.

A redução do nivel da isocitrato desidrogenase pode ser efetuada pela introdução de promotores artificiais que impulsionam a expressão do gene icd, codificando a isocitrato desidrogenase, ou pela introdução de mutações no gene icd que reduz a atividade enzimática da proteína.

Uma vez que a atividade da proteína Icd é reduzida por fosforilação, ela também pode ser controlada pela introdução de genes aceK mutantes que têm atividade quinase aumentada ou atividade fosfatase reduzida em comparação com a enzima AceK do tipo selvagem.

0 aumento da atividade da isocitrato liase pode ser conseguido ou pela atenuação do nivel dos genes iclR ou fadR, pela codificação dos repressores da via glioxilato, ou pelo estimulo da expressão do gene ace A, por exemplo, pela introdução de promotores artificiais que impulsionam a expressão do gene, ou pela introdução de mutações no gene aceA que aumentam a atividade da proteína codificada.

Uma modalidade da invenção proporciona um melhor rendimento da produção de glicolato pelo aumento da disponibilidade de NADPH para a glioxilato redutase dependente de NADPH. Essa modificação das características do microrganismo pode ser obtida através da atenuação de pelo menos um dos genes selecionados dentre os seguintes: pgi codificando a glicose-6-fosfato isomerase, udhA codificando a transidrogenase solúvel e edd codificando a atividade da β-fosfogluconato desidratase. Com tais modificações genéticas, toda a glicose-6-fosfato terá que entrar na glicólise através da via da pentose fosfato e 2 NADPH serão produzidos por glicose-6-fosfato metabolizada.

Em outra modalidade a invenção proporciona um processo para a produção fermentativa de ácido glicólico a partir de um organismo recombinante, compreendendo: (a) o contato do organismo recombinante da presente invenção com pelo menos uma fonte de carbono selecionada do grupo consistindo de glicose, sacarose, monossacarideos, oligossacarideos, polissacarideos, amido ou seus derivados, glicerol e substratos com um único carbono, por meio do que ácido glioxilico é produzido. Opcionalmente, o processo compreende uma etapa de concentração de glicolato na bactéria ou no meio, e o isolamento de ácido glicólico a partir do caldo fermentativo e/ou da biomassa opcionalmente remanescente em porções na quantidade total (0 a 100%) no produto final. Opcionalmente, o processo compreende uma etapa de recuperação do ácido glicólico produzido na etapa (a) através de uma etapa de polimerização até pelo menos dímeros de ácido glicólico e (b) a recuperação do ácido glicólico pela despolimerização dos dimeros, oligômeros e/ou polímeros de ácido glicólico.

As pessoas versadas na técnica são capazes de definir as condições de cultura para os microrganismos de acordo com a invenção. Em particular, as bactérias são fermentadas em uma temperatura entre 20 °C e 55 °C, pref erivelmente entre 25 °C e 40 °C, e mais especificamente de cerca de 30 °C para C. glutamicum e cerca de 37°C para E. coli.

A fermentação é geralmente efetuada em fermentadores com um meio de cultura inorgânico de composição conhecida definida, adaptados para o uso de bactérias, contendo pelo menos uma fonte de carbono simples, e caso necessário um co-substrato necessário para a produção do metabólito.

A invenção também está relacionada com o microrganismo conforme descrito anteriormente. Preferivelmente, esse microrganismo é selecionado dentre o grupo consistindo de E. coli, C. glutamícum ou S. cerevisiae.

EXEMPLO 1

Construção de cepas incapazes de metabolizar glioxilato, exceto reduzi-lo a glicolato: MG1655 AaceB Agcl AglcB

Para anular o gene aceB, a estratégia de recombinação homóloga descrita por Datsenko & Wanner (2000) é usada. Essa estratégia permite a inserção de um cassete de resistência ao cloranfenicol ou a canamicina, enquanto anula a maioria dos genes envolvidos. Para esse propósito, os seguintes oligonucleotideos são usados:

DaceBF (SEQ ID NO: 1)

ggcaacaacaaccgatgaactggctttcacaaggccgtatggcgagcaggagaagcaaa ttcttactgccgaagcggtagCATATGAATATCCTCCTTAG

com - uma região (letras minúsculas) homóloga à seqüência (4213068-4213147) do gene aceB (seqüência de referência no website http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),

- uma região (letras maiúsculas) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol (seqüência de referência em Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645),

DaceBR (SEQ ID NO: 2) ggcggtagcctggcagggtcaggaaatcaattaactcatcggaagtggtgatctgttcc atcaagcgtgcggcatcgtcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

com

- uma região (letras minúsculas) homóloga à seqüência (4214647-4214569) do gene aceB (seqüência de referência no website http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),

- uma região (letras maiúsculas) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol (seqüência de referência em Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645).

Os oligonucleotideos DaceBF e DaceBR são usados para amplificar o cassete de resistência ao cloranfenicol a partir do plasmideo pKD3. O produto PCR obtido é então introduzido por eletroporação na cepa MG1655 (pKD46), na qual a enzima Red recombinase expressada permite a recombinação homóloga. Os transformantes resistentes ao cloranfenicol são então selecionados e a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos aceBF e aceBR definidos abaixo. A cepa retida é designada MG1655 AaceB::Cm

aceBF (SEQ ID NO: 3): cgttaagcgattcagcaccttacc (homóloga à seqüência de 4212807 a 4212830).

aceBR (SEQ ID NO: 4): ccagtttctgaatagcttcc (homóloga à seqüência de 4215327 a 4215308).

Portanto, o gene gel é anulado na cepa MG1655 AaceB::Cm por transdução. A cepa MG1655 AgcIB::Km é primeiramente construída usando o mesmo método como descrito anteriormente com os seguintes oligonucleotideos:

DgclF (SEQ ID NO 5)

ggcaaaaatgagagccgttgacgcggcaatgtatgtgctggagaaagaaggtatcacta ccgccttcggtgttccgggagcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

com

- uma região (letras minúsculas) homóloga à seqüência (533142-533224) da região do gene gel (seqüência de referência no website http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),

- uma região (letras maiúsculas) para a amplificação do cassete de resistência à canamicina (seqüência de referência em Datsenko, K. A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645). DgipR (SEQ ID NO 6)

gcgttacgttttaacggtacggatccatccagcgtaaaccggcttccgtggtggtttgg ggtttatattcacacccaacccCATATGAATATCCTCCTTAG

com

- uma região (letras minúsculas) homóloga à seqüência (535720-535640) da região do gene gel (seqüência de referência no website http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),

- uma região (letras maiúsculas) para a amplificação do cassete de resistência à canamicina (seqüência de referência em Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645).

Os oligonucleotideos DgclF e DgipR são usados para amplificar o cassete de resistência à canamicina a partir do plasmideo pKD4. 0 produto PCR obtido é, a seguir, introduzido por eletroporação na cepa MG1655 (pKD46). Os transformantes resistentes à canamicina são, a seguir, selecionados e a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos gclF e gipR definidos abaixo. A cepa retida é designada MGl655 Agcl::Km.

gclF (SEQ ID NO: 7): ggatatgcccaccttgctgaagg (homóloga à seqüência de 532795 a 532817).

gipR (SEQ ID NO: 8) : cgcttagtttcaatcggggaaatgg (homóloga à seqüência de 536114 a 536090). Para transferir a anulação Agcl::Km, o método da transdução de fago Pl é usado. 0 protocolo seguido é implementado em 2 etapas com a preparação do lisado de fago da cepa MG1655 Agcl:: Km e, a seguir, a transdução na cepa MG1655 AaceB::Cm. A construção da cepa é descrita acima.

Preparação do lisado de fago PI:

- Inoculação com 100 μl; de uma cultura de um dia para o outro da cepa MG1655 Agcl:: Km de 10 mL de LB + Km 50 μg/mL + glicose 0,2% + CaCl 2 5 mM.

- Incubação por 30 min a 37°C com agitação.

- Adição de 100 μl, de lisado de fato Pl preparado na cepa MG1655 (cerca de 1.109 fago/mL).

- Agitação a 37°C por 3 horas até todas as células serem lisadas.

- Adição de 200 μl de clorofórmio e submissão ao vórtex.

- Centrifugação por 10 min a 4500 g para eliminar os fragmentos celulares.

- Transferência do sobrenadante para um tubo estéril e adição de 200 de clorofórmio.

- Armazenagem do listo a 4°C.

Transdução - Centrifugar por 10 min a 1500 g de 5 mL de uma cultura de um dia para o outro da cepa MG1655 ∆aceB::Cm em meio LB.

- Suspensão do pélete celular em 2,5 mL de MgSO4 10 mM, CaCl2 5 mM.

- Tubos de controle: 100 μL de células

100 μL de fagos Pl da cepa MG1655

∆gcl: : Km

- Tubo de teste: 100 μL de células + 100 μl de fagos

Pl da cepa MG1655 Agcl::Km.

- Incubação por 30 min a 30 °C sem agitação.

- Adição de 100 μL de citrato de sódio 1 M em cada tubo e submissão ao vórtex.

- Adição de 1 mL de LB.

- Incubação por 1 h a 37 °C com agitação.

- Espalhamento em placas LB + Km 50 μg/mL depois da centrifugação dos tubos por 3 min a 7000 rpm.

- Incubação a 37 °C de um dia para o outro.

Verificação da cepa

Os transformantes resistentes à canamicina são, a seguir, selecionados e a anulação do gene ∆gcl:: Km é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos gclF e gipR anteriormente descritos. A cepa retida é designada MG 1655 AaeeB::Cm AgcI::Km.

Os cassetes de resistência à canamicina e cloranfenicol podem ser então eliminados. 0 plasmídeo pCP20 carregando a FLP recombinase agindo nos sítios FRT dos cassetes de resistência à canamicina e ao cloranfenicol é, a seguir, introduzido nos sítios recombinantes por eletroporação. Depois de uma série de culturas a 42°C, a perda dos cassetes de resistência à canamicina e ao cloranfenicol é verificada por uma análise de PCR com os mesmos oligonucleotídeos usados anteriormente (aceBF / aceBR e gclF / gipR). A cepa retida é designada MG 1655 AaceB Agcl.

A seguir, o gene glcB é anulado na cepa MG 1655 AaceB Agcl por transdução.

0 MG1655 AgIcB::Km é primeiramente construído usando o mesmo método anteriormente descrito com os seguintes oligonucleotídeos:

DglcBR (SEQ ID NO 9)

cccagagccgtttacgcattgacgccaattttaaacgttttgtggatgaagaagtttta ccgggaacagggctggacgcCATATGAATATCCTCCTTAG

com - uma região (letras minúsculas) homóloga à seqüência (3121805-3121727) da região do gene glcB (seqüência de referência no website http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),

DglcBF (SEQ ID NO 10) cgcgtaaacgccaggcgtgtaataacggttcggtatagccgtttggctgtttcacgccg aggaagattaaatcgctggcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

com

- uma região (letras minúsculas) homóloga à seqüência (3119667-3119745) da região do gene glcB (seqüência de referência no website http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),

Os oligonucleotideos DgIcF e DglcBR são usados para amplificar o cassete de resistência à canamicina a partir do plasmideo pKD4. 0 produto PCR obtido é, a seguir, introduzido por eletroporação na cepa MG1655 (pKD46). Os transformantes resistentes à canamicina são, a seguir, selecionados e a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos gclBF e glcBR definidos abaixo. A cepa retida é designada MGl655 AglcB: : Km.

glcBR (SEQ ID NO: 11): gccagcaaatggcgagtgc (homólogo à seqüência de 3122225 a 3122207).

glcBF (SEQ ID NO: 12) : cgcagagtatcgttaagatgtcc (homólogo à seqüência de 3119475 a 3119497).

Para transferir a anulação AglcB::Km, o método da transdução de fago Pl é usado. A preparação do lisado de fago da cepa MG1655 AglcB::Km é usada para a transdução na cepa MGl655 AaceB Agcl.

Os transformantes resistentes à canamicina são, a seguir, selecionados e a anulação do gene Aglc::Km é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos previamente definidos glcBF e glcBR. A cepa retida é designada MG1655 AaceB Agcl AglcB::Km.

O cassete de resistência à canamicina pode então ser eliminado. O plasmideo pCP20 carregando a FLP recombinase agindo nos sítios FRT do cassete de resistência à canamicina é, a seguir, introduzido nos sítios recombinantes por eletroporação. Depois de uma série de culturas a 42°C, a perda do cassete de resistência à canamicina é verificada por uma análise de PCR com os mesmos oligonucleotídeos usados anteriormente (glcBF e glcBR). A cepa retida é designada MG 1655 AaceB Agcl Agl cB.

EXEMPLO 2

Construção de cepas com nível aumentado de glioxilato redutase dependente de NADPH: MG1655 ∆aceB ∆gcl ∆glcB (pME101-ycdW)

Para impulsionar o nível de glioxilato redutase dependente de NADPH, o gene ycdW é expresso a partir do plasmídeo pCL1920 (Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 ρ 4631) usando o promotor Ptrc. Para a expressão a partir de um vetor com poucas cópias, o plasmídeo pMElOl é construído como se segue. O plasmídeo pCLl920 é amplificado por PCR usando os oligonucleotídeos PME101F e PME101R e o fragmento BstZ 171-XmnI do vetor PTRC 9 9A abrigando o gene IacI e o promotor Ptrc é inserido no vetor amplificado.

PME101F (SEQ ID NO 13): Ccgacagtaagacgggtaagcctg

PME101R (SEQ ID NO 14): Agcttagtaaagccctcgctag

O gene yccM é amplificado por PCR a partir de DNA genômico usando os seguintes oligonucleotídeos:

BspHI yccM (SEQ ID NO 15) : agctaqctctcatgagaataaatttc gcacaacgcttttcggg SmaI ycdW (SEQ ID NO 16) : gcatgcatcccgggtctctc ctgtattcaattcccgcc

0 fragmento de PCR é digerido com BspHI e SmaI e clonado no vetor pMElOl cortado pelas enzimas de restrição NcoI e Sinal resultando no plasmideo pME101-ycdW.

O plasmideo pMElOl-ycdW é, a seguir, introduzido na cepa MGl655 AaceB Agcl AglcB.

EXEMPLO 3

Construção das cepas com consumo diminuído de glicolato: MGl 655 AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA (pMElOl-ycdW) Os genes glcDEFGB são anulados na cepa MG1655 AaceB Agcl por transdução.

0 MG1655 AglcDEFGB:: Km é primeiramente construído usando o mesmo método anteriormente descrito com os seguintes oligonucleotideos:

DglcDR (SEQ ID NO 17)

gcgtcttgatggcgctttacccgatgtcgaccgcacatcggtactgatggcactgcgtg agcatgtccctggacttgagatccCATATGAATATCCTCCTTAG

com

- uma região (letras minúsculas) homóloga à seqüência (3126016-3125934) do gene glcD (seqüência de referência no website http://genolist.pasteur.fr/Colibri/), - uma região (letras maiúsculas) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol (seqüência de referência em Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645).

DglcBF (SEQ ID NO 18)

cgcgtaaacgccaggcgtgtaataacggttcggtatagccgtttggctgtttcacgccg aggaagattaaatcgctggcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG com

Os oligonucleotideos DgIcDR e DglcBF são usados para amplificar o cassete de resistência à canamicina a partir do plasmideo pKD4. 0 produto PCR obtido é, a seguir, introduzido por eletroporação na cepa MG1655 (pKD46), na qual a enzima Red recombinase expressada permite a recombinação homóloga. Os transformantes resistentes ao cloranfenicol são, a seguir, selecionados e a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos glcDR e glcBF definidos abaixo. A cepa retida é designada MG1655 AglcDEFGB::Km.

glcDR (SEQ ID NO: 19): ccaagacaaggtcacagagc (homóloga à seqüência de 3126183 a 3126164).

glcBF (SEQ ID NO: 20): cgcagagtatcgttaagatgtcc (homóloga à seqüência de 3119475 a 3119497).

Para transferir a anulação AgclDEFGB::Km, o método da transdução de fago Pl é usado. 0 preparo do lisado de fago da cepa MG1655 AgclDEFGB::Km é usado para a transdução na cepa MG1655 AaceB Agel.

Os transformantes resistentes à canamicina são, a seguir, selecionados e a anulação do gene AglcDEFGB:Km é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos anteriormente definidos glcBF e glcDR. A cepa retida é designada MG1655 AaeeB Agcl AgleDEFGB::Km.

A seguir, o gene aldA é anulado na cepa MG1655 AaeeB Agcl AgleDEFGB::Km por transdução. 0 MG1655 aldA::Cm é primeiramente construído usando o mesmo método que o anteriormente descrito com os seguintes oligonucleotideos:

AldA D r (SEQ ID NO 21)

ttaagactgtaaataaaccacctgggtctgcagatattcatgcaagccatgtttaccat ctgcgccgccaataccggatttCATATGAATATCCTCCTTAG

com - uma região (letras minúsculas) homóloga à seqüência (1487615 a 1487695) do gene aldA (seqüência de referência no website http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),

- uma região (letras maiúsculas) para a amplificação do cassete de resistência à canamicina (seqüência de referência em Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645),

AldA D f (SEQ ID NO 22)

atgtcagtacccgttcaacatcctatgtatatcgatggacagtttgttacctggcgtgg agacgcatggattgatgtggtaGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

com

- uma região (letras minúsculas) homóloga à seqüência (1486256 a 1486336) do gene aldA (seqüência de referência no website http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),

Os oligonucleotideos aldAF e aldAR são usados para amplificar o cassete de resistência ao cloranfenicol a partir do plasmideo pKD3. 0 produto PCR obtido é, a seguir, introduzido por eletroporação na cepa MG1655 (pKD46), na qual a enzima Red recombinase expressada permite a recombinação homóloga. Os transformantes resistentes à canamicina são, a seguir, selecionados e a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos YdcFCf e gapCCR definidos abaixo. A cepa retida é designada MG1655 AaldA::Cm.

YdcFCf (SEQ ID NO: 23):tgcagcggcgcacgatggcgacgttccgccg (homóloga à seqüência de 1485722 a 1485752).

gapCCR (SEQ ID NO 24): cacgatgacgaccattcatgcctatactggc (homóloga à seqüência de 1488195 a 1488225).

Para transferir a anulação AaldR::Cm, o método da transdução de fago Pl é usado. A preparação do lisado de fago da cepa MG1655 AaldR: : Cm é usada para a transdução na cepa MGl655 AaceB Agcl AglcDEFGB::Km.

Os transformantes resistentes à canamicina são, a seguir, selecionados e a anulação do gene AaIdA::Cm é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos YdcFCf e gapCCR anteriormente definidos. A cepa retida é designada MG1655 AaceB Agcl AgleDEFGB:: Km AaldA::Cm.

Os cassetes de resistência à canamicina e ao cloranfenicol podem, a seguir, ser eliminados.

0 plasmideo pCP20 carregando a FLP recombinase agindo nos sitios FRT dos cassetes de resistência à canamicina e ao cloranfenicol é então introduzido nos sitios recombinantes por eletroporação. Depois de uma série de culturas a 42 °C, a perda dos cassetes de resistência à canamicina e ao cloranfenicol é verificada por uma análise de PCR com os mesmos oligonucleotideos usados anteriormente (glcBF / glcDR e YdcFCf / gapCCR). A cepa retida é designada MG1655 AaceB Agcl AgIcDEFGB AaldA.

0 plasmideo pME101-ycdW é, a seguir, introduzido na cepa MGl655 AaceB Agcl AgIcDEFGB AaldA.

EXEMPLO 4

Construção de cepas com fluxo aumentado na via do glioxilato: MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR (pME101-ycdW)

A anulação do gene IcIR é introduzida no MG1655 AaceB Agel AgIcDEFGB AaldA usando a mesma estratégia anteriormente descrita com os seguintes oligonucleotideos:

DiclF (SEQ ID NO 25)

cgcacccattcccgcgaaacgcggcagaaaacccgccgttgccaccgcaccagcgactg gacaggttcagtctttaacgcgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

com

- uma região (letras minúsculas) homóloga à seqüência (4221202-4221120) do gene iclR (seqüência de referência no website http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),

DiclR (SEQ ID NO 26)

gcgcattccaccgtacgccagcgtcacttccttcgccgctttaatcaccatcgcgccaa actcggtcacgcggtcatcggCATATGAATATCCTCCTTAG

com

- uma região (letras minúsculas) homóloga à seqüência (4220386-4220465) do gene iclR (seqüência de referência no website http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),

Os oligonucleotideos DiclF e DiclR são usados para amplificar o cassete de resistência à canamicina a partir do plasmideo pKD4. 0 produto PCR obtido é, a seguir, introduzido por eletroporação na cepa MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA (pKD46). Os transformantes resistentes à canamicina são então selecionados e a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos iclF e iclR definidos abaixo. A cepa retida é designada MG1655 AaceB Agcl AgIeDEFGB AaldA AiclR::Km. IcIF (SEQ ID NO 27) : cctttgaggtcgcatggccagtcggc (homóloga à seqüência de 4221558 a 4221533). iclR (SEQ ID NO 28): gctttttaatagaggcgtcgccagctccttgcc (homóloga à seqüência de 4219917 a 4219949).

0 cassete de resistência à canamicina pode então ser eliminado. 0 plasmideo pCP20 carregando a FLP recombinase agindo nos sítios FRT do cassete de resistência à canamicina é, a seguir, introduzido nos sítios recombinantes por eletroporação. Depois de uma série de culturas a 42°C, a perda do cassete de resistência à canamicina é verificada por uma análise de PCR com os mesmos oligonucleotídeos usados anteriormente (iclF e iclR). A cepa retida é designada MG 1655 AaceB Agcl AgIcDEFGB AaldA AiclR.

0 plasmideo pME101-ycdW é, a seguir, introduzido na cepa MGl655 AaeeB Agcl AgleDEFGB AaldR AiclR.

EXEMPLO 5

CONSTRUÇÃO DAS CEPAS COM DISPONIBILIDADE DE NADPH AUMENTADA: MG1655 AaceB Agcl AiclR AglcDEFGB AaldA Aedd- eda (pME101-ycdW)

Os genes edd-eda são anulados na cepa MG1655 AaeeB Agel AgleDEF AaldA AiclR por transdução. A cepa MG1655 Aedd-eda::Cm é primeiramente construída usando o mesmo método que o anteriormente descrito com os seguintes oligonucleotideos:

DeddF (SEQ ID NO 29)

cgcgcgagactcgctctgcttatctcgcccggatagaacaagcgaaaacttcgaccgtt catcgttcgcagttggcatgcggTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

com

- uma região ( (letras minúsculas) homóloga à seqüência (1932582-1932500) da região dos genes edd-eda (seqüência de referência no website http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),

DedaR (SEQ ID NO 30)

gcttagcgccttctacagcttcacgcgccagcttagtaatgcggtcgtaatcgcccgct tccagcgcatctgccggaaccCATATGAATATCCTCCTTAG

com

- uma região (letras minúsculas) homóloga à seqüência (1930144-1930223) da região dos genes edd-eda (seqüência da referência no website http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),

- uma região (letras maiúsculas) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol (seqüência de referência em Datsenko, K. A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645),

Os oligonucleotídeos DeddF e DedaR são usados para amplificar o cassete de resistência ao cloranfenicol a partir do plasmideo pKD3. 0 produto PCR obtido é então introduzido por eletroporação na cepa MG1655 (pKD46), Os transformantes resistentes ao cloranfenicol são, a seguir, selecionados e a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotídeos eddF e edaR definidos abaixo. A cepa retida é designada MGl655 Aedd-eda::Cm.

eddF (SEQ ID NO 31): Gggtagactccattactgaggcgtgggcg (homóloga à seqüência de 1932996 a 1932968).

edaR (SEQ ID NO 32): ccacatgataccgggatggtgacg (homóloga à seqüência de 1929754 a 1929777).

Para transferir a anulação Aedd-eda::Cm, o método da transdução de fago Pl é usado conforme anteriormente descrito. A preparação do lisado de fago da cepa MG1655 Aedd-eda::Cm foi usada para a transdução na cepa MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR.

Os transformantes de resistência ao cloranfenicol são, a seguir, selecionados e a anulação do gene Aedd-eda::Cm é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotídeos eddF e edaR. A cepa retida é designada MG1655 AaceB AgclB AglcDEF AaldA AielR Aedd-eda : : Cm.

O cassete de resistência ao cloranfenicol pode, a seguir, ser eliminado. 0 plasmideo pCP20 carregando a FLP recombinase agindo nos sítios FRT do cassete de resistência ao cloranfenicol é, a seguir, introduzido nos sítios recombinantes por eletroporação. Depois de uma série de culturas a 42°C, a perda do cassete de resistência ao cloranfenicol é verificada por uma análise de PCR com os mesmos oligonucleotídeos usados anteriormente (eddF e edaR). A cepa retida é designada MG1655 AaeeB Agel

AgleDEFGB AaldA AiclR Aedd-eda.

O plasmideo pME101-ycdW é então introduzido na cepa MGl655 AaeeB Agel AgIeDEFGB AaldA AielR Aedd-eda.

EXEMPLO 6

CONSTRUÇÃO DE CEPAS COM DISPONIBILIDADE DE NADPH AUMENTADA: MG1655 AaceB Agcl AiclR AglcDEFGB AaldA Apgi::Cm Aedd-eda (pME101-ycdW)

A anulação do gene pgí é introduzida no MG1655 AaeeB Agcl AgleB AgleDEF AaldA AielR Aedd-eda usando a mesma estratégia anteriormente descrita com os seguintes oligonucleotídeos:

DpgiF (SEQ ID NO 33) ccaacgcagaccgctgcctggcaggcactacagaaacacttcgatgaaatgaaagacgt tacgatcgccgatctttttgcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

com

- uma região (letras minúsculas) homóloga à seqüência (4231352-4231432) do gene pgi (seqüência de referência no website http;//genolist.pasteur.fr/Colibri/),

DpgiR (SEQ ID NO 34)

gcgccacgctttatagcggttaatcagaccattggtcgagctatcgtggctgctgattt ctttatcatctttcagctctgCATATGAATATCCTCCTTAG

com

- uma região (letras minúsculas) homóloga à seqüência (4232980-4232901) do gene pgi (seqüência de referência no website http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),

Os oligonucleotideos DpgiF e DpgiR são usados para amplificar o cassete de resistência ao cloranfenicol a partir do plasmideo pKD3. O produto PCR obtido é, a seguir,introduzido por eletroporação na cepa MG1655 AaeeB Agcl AglcB AglcOEF AaldA AielR Aedd-eda (pKD46). Os transformantes resistentes ao cloranfenicol são, a seguir, selecionados e a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos pgiF e pgiR definidos abaixo. A cepa retida é designada MGl655 AaceB Agel AgleQ AglcDEF Aaldh AielR Aedd-eda Apgi::Cm

pgiF (SEQ ID NO 35) : gcggggcggttgtcaacgatggggtcatgc (homóloga à seqüência de 4231138 a 4231167).

pgiR (SEQ ID NO 36) : cggtatgatttccgttaaattacagacaag (homóloga à seqüência de 4233220 a 4233191).

O plasmideo pME101-ycdW é então introduzido na cepa MGl655 AaceB Agel AgleDEFGB AaldR AielR Aedd-eda Apgi::Cm.

EXEMPLO 7

CONSTRUÇÃO DAS CEPAS COM DISPONIBILIDADE DE NADPH AUMENTADA: MG1655 AaceB Agcl AiclR AglcDEFGB AaldA Apgi ∆edd-eda::Cm ∆udhA::Km (pME101-ycdW)

A anulação do gene udhR é introduzida em MG1655 AaeeB Agel ∆gleDEFGB ∆aldR ∆ielR ∆pgi::Cm ∆edd-eda usando a mesma estratégia como anteriormente descrita com os seguintes oligonucleotideos: DudhAF (SEQ ID NO 37) CCCAGAATCTCTTTTGTTTCCCGATGGAACAAAATTTTCAGCGTGCCCACGTTCATGCC GACGATTTGTGCGCGTGCCAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG com

- uma região (letras em negrito) homóloga à seqüência (4157588-4157667) do gene udhA (seqüência de referência no website http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),

- uma região (letras sublinhadas) para a amplificação do cassete de resistência à canamicina (seqüência de referência em Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645),

DudhAR (SEQ ID NO 38) ggtgcgcgcgtcgcagttatcgagcgttatcaaaatgttggcggcggttgcacccactg qqqcaccatcccgtcqaaagcCATATGAATATCCTCCTTAG

com

- uma região (letras em negrito) homóloga à seqüência (4158729-4158650) do gene udhA (seqüência de referência no website http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),

- uma região (letras sublinhadas) para a amplificação do cassete de resistência à canamicina (seqüência de referência em Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645).

Os oligonucleotideos DudhAF e DudhAR são usados para amplificar o cassete de resistência à canamicina a partir do plasmideo pKD4. O produto PCR obtido é, a seguir, introduzido por eletroporação na cepa MG1655 AaceB Ágcl AglcDEFGB ΔaldA AiclR Apgi::Cm Aedd-eda (pKD46). Os transformantes resistentes à canamicina são então selecionados e a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos udhAF e udhAR definidos abaixo. A cepa retida é designada MGl655 AaceB Agcl AgleDEFGB ΔaldA AiclR Apgi::Cm Aedd-eda AudhA::Km

udhAF (SEQ ID NO 39) : (homóloga à següência de 4157088 a 4157108). GATGCTGGAAGATGGTCACT

udhAR (SEQ ID NO 40): (homóloga à seqüência de 4159070 a 4159052). gtgaatgaacggtaacgc

O plasmideo pME101-ycdW é então introduzido na cepa MGl655 AaeeB Agcl AgleDEFGB ΔaldA AiclR Apgi::Cm Aedd-eda AudhA::Km.

EXEMPLO 8

FERMENTAÇÃO DE CEPAS PRODUTORAS DE ÁCIDO GLICÓLICO EM FRASCOS DE ERLENMEYER

Os desempenhos das cepas foram inicialmente avaliados em culturas de frascos de erlenmeyer com septo de 250 mL usando meio M9 modificado (Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32: 120-128) que foi suplementado com 40 g/L de MOPS e 10 g/L de glicose e ajustado em pH 6,8. Estreptomicina foi adicionada, caso necessário, em uma concentração de 50 mg/L e 100 μm de IPTG foi também adicionado para indução do vetor de expressão, caso presente. Uma pré-cultura de um dia para o outro foi usada para inocular uma cultura de 50 mL em uma OD600 nm de cerca de 0,3. As culturas foram mantidas em um agitador a 30°C e 400 rpm até a glicose no meio de cultura se exaurir. No final da cultura, a glicose e o ácido glicólico foram analisados por HPLC usando uma coluna Biorad HPX 97H para a separação e um refratômetro para a detecção.

A comparação dos desempenhos de cepas diferentes é dada na tabela abaixo (cada valor é a média de η repetições). A cepa descrita no exemplo 1 não apresentou qualquer produção de ácido glicólico.

<table>table see original document page 45</column></row><table> <table>table see original document page 46</column></row><table>

As cepas descritas no Exemplo 6 e no Exemplo 7 são as melhores produtoras de ácido glicólico com títulos maiores do que 2 g/L e rendimentos superiores a 0,2 g/g.

EXEMPLO 9

FERMENTAÇÃO DE CEPAS PRODUTORAS DE ÁCIDO GLICÓLICO EM UM FERMENTADOR DE ALIMENTAÇÃO EM BATELADA As cepas descritas no Exemplo 6 e no Exemplo 7 foram avaliadas sob as condições de produção em um fermentador de 600 mL usando um protocolo de alimentação em batelada.

Uma primeira pré-cultura em tubos foi efetuada em meio LB suplementado com 2,5 g/L de glicose a 30°C, seguido por uma segunda pré-cultura em um frasco de erlenmeyer de 500 mL preenchido com 50 mL de meio sintético suplementado com 40 g/L de MOPS e 10 g/L de glicose (o mesmo meio usado para culturas de frasco) a 30°C. Essa segunda pré-cultura foi usada para a inoculação do fermentador.

0 fermentador preenchido com 200 mL de meio sintético suplementado com 40 g/L de glicose, 50 mg/L de espectinomicina e 100 μΜ de IPTG foi inoculado em uma densidade ótica inicial de cerca de 2. A cultura foi executada a 30 0C com agitação e aeração ajustada para manter o oxigênio dissolvido acima de saturação de 30%. O pH foi ajustado em 6,8 com adição de base. A cultura foi efetuada em um modo em batelada até a exaustão da glicose. Naquele momento, uma solução de 500 g/L de glicose suplementada com sulfato de magnésio, oligoelementos, espectinomicina e IPTG foi adicionada para restaurar a concentração de 40 g/L de glicose no meio. Outras adições foram feitas em cada vez que a glicose foi novamente exaurida. Rotineiramente, a cepa descrita no Exemplo 7 proporcionou um melhor desempenho de produção do que a cepa descrita no Exemplo 6 nos fermentadores (rendimento de glicose de 0,22 versus 0,15 g/g).

Um curso de tempo representativo da fermentação para a produção de ácido glicólico usando a cepa do exemplo 7 é dado abaixo.

<table>table see original document page 48</column></row><table> O título final obtido foi de 31 g/L de ácido glicólico com um rendimento de glicose de 0,22 g/g.

Claims

1. Método para a produção fermentativa de ácido glicólico, seus derivados ou precursores, pelo cultivo de um microrganismo em um meio de cultura apropriado, caracterizado pelo fato de compreender uma fonte de carbono e a recuperação de ácido glicólico a partir do meio de cultura.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o microrganismo é modificado para atenuar a conversão de glioxilato para outros produtos diferentes de glicolato.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a expressão de pelo menos um gene, selecionado dentre os seguintes, envolvido no metabolismo de glioxilato, é atenuada. • aceB codificando malato sintase, • glcB codificando a segunda malato sintase, • gel codificando a glioxilato carboligase, • eda codificando 2-ceto-3-desoxigluconato 6-fosfato aldolase.

4. Método, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o microrganismo contém pelo menos um gene codificando um polipeptideo catalisando a conversão de glioxilato em glicolato.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o gene codifica uma glioxilato redutase dependente de NADPH.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 5, caracterizado pelo fato de que o gene codificando um polipeptideo com atividade glioxilato redutase dependente de NADPH é endógeno.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que a expressão do referido gene é aumentada.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, caracterizado pelo fato de que o gene codificando um polipeptideo com atividade glioxilato redutase dependente de NADPH é selecionado entre yccM e yiaE.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o microrganismo é modificado de tal forma que ele é incapaz de metabolizar substancialmente o glicolato.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a expressão de pelo menos um gene, selecionado dentre os seguintes envolvido no metabolismo do glicolato, é atenuado: • glcDEF codificando a glicolato oxidase, • aldA codificando a glicoaldeido desidrogenase.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o microrganismo é transformado para aumentar o fluxo da via de glioxilato.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a atividade da enzima isocitrato desidrogenase é atenuada.

13. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a expressão de pelo menos um dos seguintes genes: • pta codificando a fosfo-transacetilase, • ack codificando acetato quinase, • poxB codificando a piruvato oxidase é atenuada.

14. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o fluxo na via glioxilato é aumentado pelo aumento da atividade de aceA.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a expressão de aceA é aumentada pela atenuação da expressão dos genes iclR ou fadR.

16. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a expressão de aceh é aumentada pela introdução de um promotor artificial à montante do gene aceA.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que a disponibilidade de NADPH é aumentada.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a expressão de pelo menos um gene, selecionado dentre os seguintes: • pgí codificando a glicose-6-fosfato isomerase, • udhA codificando a transidrogenase solúvel, • edd codificando a fosfogluconato desidratase é atenuada.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a fonte de carbono é pelo menos uma das seguintes: glicose, sacarose, mono- ou oligossacarideos, amido e seus derivados ou glicerol.

20. Método para a preparação fermentativa de glicolato, conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas: a) Fermentação do microrganismo produtor de glicolato, b) Concentração do glicolato na bactéria ou no meio e c) Isolamento do ácido glicólico do caldo fermentativo e/ou da biomassa opcionalmente remanescente em porções ou na quantidade total (0 a 100%) no produto final.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o glicolato é isolado através de uma etapa de polimerização até pelo menos dimeros de glicolato.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o glicolato é recuperado pela despolimerização a partir de dimeros de glicolato, oligômeros e/ou polímeros.

23. Microrganismo caracterizado pelo fato de ser definido como em qualquer uma das Reivindicações 1 a 22.

24. Microrganismo, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de ser selecionado dentre o grupo consistindo de E. coli, C. glutamicum ou S. cerevisiae.