BRPI0712876B1

BRPI0712876B1 - Produção de ácido glicólico por fermentação a partir de fontes renováveis

Info

Publication number: BRPI0712876B1
Application number: BRPI0712876-2A
Authority: BR
Inventors: Soucaille Philippe
Original assignee: Metabolic Explorer
Priority date: 2006-06-09
Filing date: 2007-06-07
Publication date: 2018-01-23
Also published as: CA2654182A1; US20090155867A1; CN101466841A; AU2007255339A1; AR061304A1; ES2691206T3; WO2007141316A2; JP2014014364A; WO2007141316A3; WO2007140816A1; JP5431149B2; ZA200809973B; BRPI0712876A2; US9034615B2; KR101519670B1; MX2008015737A; JP2009539361A; IL195380A0; CN101466841B; RU2008152832A

Abstract

resumo da patente de invenção para : "produção de ácido glicólico por fermentação a partir de fontes renováveis". a presente invenção proporciona um método para a produção biológica de ácido glicólico a partir de uma fonte de carbono fermentável em um microrganismo. em um aspecto da presente invenção, um processo para a conversão de glicose em ácido glicólico é alcançado pelo uso de um organismo recombinante compreendendo em e. coli hospedeiro transformado i) para atenuar as vias de consumo de glioxilato para outros compostos diferentes de glicolato ii) para usar uma nadph glioxilato redutase para converter glixilato em glicolato, iii) para atenuar o nível de todas as enzimas metabolizadoras de glicolato e iv) aumentar o fluxo a via do glioxilato. em outro aspecto da presente invenção, o processo para a produção de ácido glicólico a partir de uma fonte de carbono fermentável usando uma e.coli recombinante é melhorando pelo aumento da disponibilidade de nadph nas células. opacionalmente, o ácido glicólico produzido pode ser purificado através de uma etapa de polimerização até pelo menos dímeros do áscido glicólico e recuperado pela despolimerização dos dímeros, oligômeros e/ou polímeros de ácido glicólico.

Description

(54) Título: PRODUÇÃO DE ÁCIDO GLICÓLICO POR FERMENTAÇÃO A PARTIR DE FONTES RENOVÁVEIS (51) Int.CI.: C12P 7/42 (30) Prioridade Unionista: 09/06/2006 EP PCT/EP2006/063046 (73) Titular(es): METABOLIC EXPLORER (72) Inventor(es): PHILIPPE SOUCAILLE

Relatório Descritivo da Patente de Invenção Para: PRODUÇÃO DE ÁCIDO GLICÓLICO POR FERMENTAÇÃO A PARTIR DE FONTES RENOVÁVEIS.

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção compreende um processo para a bioconversão de uma fonte de carbono fermentável em ácido glicólico por um microrganismo crescido de modo anaeróbico.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O ácido glicólico (HOCH₂COOH) é o primeiro membro da família de alfa-hidroxiácidos de ácidos carboxílicos. O ácido glicólico apresenta uma funcionalidade dual tanto com grupos funcionais alcoólicos quanto grupos funcionais de ácidos moderadamente fortes em uma molécula muito pequena. Isso resulta em atributos químicos únicos, assim como em uma química de ácido e álcool típica.

O ácido glicólico usa os grupos tanto hidroxila quanto ácido carboxílico para formar complexos de anéis com cinco membros (quelatos) com metais polivalentes. Essa capacidade de complexar com o íon metálico é útil na dissolução da escala de água dura e prevenção de deposição, especialmente em aplicações de limpeza ácida onde uma boa capacidade de rinsagem é um fator chave. Ácido glicólico sofre reações com alcoóis orgânicos e ácidos para formar ésteres. Esteres alquil glicólicos de baixo peso molecular têm propriedades de solvência incomuns e podem ser usados como um substituto para n- e isopropanol, etilenodiamina, fenol, m-cresol, acetato de 2-etoxietila e lactato de etila e metila. Ésteres alquílicos com pesos moleculares superiores podem ser usados em formulações de produtos de cuidados pessoais. O ácido glicólico pode reagir entre si para formar glicolideo dimérico, oligômeros de poliéster cabeça-cauda, e polímeros de cadeia longa. Copolímeros podem ser feitos com outros alfa-hidroxiácidos como o ácido lático. Os polímeros de poliéster gradualmente se hidrolisam em ambientes aquosos em taxas controláveis. Essa propriedade os torna úteis em aplicações biomédicas, tal como em suturas dissolvíveis e em aplicações onde uma liberação controlada de ácido é necessária para reduzir o pH.

Atualmente, mais de 15.000 toneladas de ácido glicólico são consumidas anualmente nos Estados Unidos.

A produção biológica de ácido glicólico, apresentada na Figura 1, requer a formação de glioxilato como um intermediário, o qual é reduzido a glicolato por uma oxidorredutase dependente de NADPH codificada pelo gene ycdW (Nunez et glioxilato é um intermediário do ciclo do glioxilato (Tricarboxylic acid cycle and glyoxylate bypass, reviewed in Neidhardt, F. C. (Ed. in Chief), R. Curtiss III, J. L.

Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter, e Η. E. Umbarger (eds). 1996. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. American Society for Microbiology). Nesse ciclo, o isocitrato é clivado em succinato e glioxilato, uma reação que é catalisada pela isocitrato liase, codificada pelo gene aceA. 0 succinato entra diretamente no ciclo do ácido citrico e é convertido em oxaloacetato. Glioxilato é convertido em malato pela incorporação de uma molécula de acetil-CoA derivada de acetato, uma reação catalisada pelas duas isoenzimas de malato sintase codificadas por aceB e gclB. A entrada de carbono no desvio de glioxilato é regulada nos níveis transcricional e pós-transcricional. A regulação transcricional é exercida no operon aceBAK pelo repressor IclR. O aceBAK codifica a malato sintase, isocitrato liase e isocitrato quinase/fosfatase, respectivamente. O gene iclR é negativamente auto-regulado e ativado pela proteína FadR. A atividade da isocitrato desidrogenase, codificada pelo gene icd, é regulada pós-tanscricionalmente. A isocitrato desidrogenase e a isocitrato liase competem pelo substrato em comum, o isocitrato. Uma vez que o valor de K_mpara o isocitrato é significativamente superior para a reação da isocitrato liase, a entrada na via do glioxilato depende em parte da regulação da enzima isocitrato desidrogenase. A atividade da isocitrato desidrogenase é modulada pela sua fosforilação ou desfosforilação catalisada por AceK. A fosforilação reduz a atividade da Icd e a desfosforilação reativa a enzima Icd. Se AceK atua como quinase ou fosfatase depende da presença de vários metabólitos. A depleção de isocitrato e de 3-fosfoglicerato estimula a atividade quinase; a presença de piruvato e AMP inibe a função quinase, favorecendo dessa forma a atividade da fosfatase (ver também Neidhard). Glioxilato pode ser convertido em tartronato semi-aldeido por uma glioxilato carboligase codificada por gel e em 2-ceto-4hidroxiglutarato por uma 2-ceto-3-desoxigluconato 6-fosfato aldolase codificada por eda, enquanto que o glicolato pode ser reduzido a glicoaldeido por uma glicoaldeido desidrogenase dependente de NAD⁺ codificada por aldA ou oxidada a glioxilato por uma glicolato oxidase dependente de NAD⁺ codificada por glcDEF.

O problema a ser solucionado pela presente invenção é a produção biológica de ácido glicólico a partir de um substrato de carbono barato, tal como glicose ou outros açúcares. A quantidade de passos bioquímicos e a complexidade das vias metabólicas exigem, para um processo industrial praticável de produção de ácido glicólico, o uso de um catalisador de célula inteira metabolicamente projetado.

RESUMO DA INVENÇÃO

Os requerentes solucionaram o problema estabelecido e a presente invenção proporciona um método para a bioconversão de uma fonte de carbono fermentável diretamente em ácido glicólico. Glicose é usada como um substrato modelo e E. coli recombinante é usada como o hospedeiro modelo. Em um aspecto dessa invenção, E. coli recombinantes incapazes de metabolizar glioxilato em outros compostos diferentes de glicolato são construídos pela inativação dos genes que codificam as malato sintases (aceB e glcB), a glioxilato carboligase (gel) e a 2-ceto-3desoxigluconato 6-fosfato aldolase (eda). Em outro aspecto dessa invenção, a atividade da glioxilato redutase dependente de NADPH é usada para reduzir o glioxilato tóxico em glicolato pelo uso de genes codificantes endógenos, como ycdW ou yiaE. Em um outro aspecto dessa invenção, o gene codificando as enzimas metabolizadoras de glicolato, glicolato oxidase (glcDEF) e glicoaldeído desidrogenase (aldA) são anuladas. Além disso, o fluxo na via do glioxilato é aumentado pelo: i) aumento do nível de aceA pela inativação do gene iclR ou pelo aumento direto da expressão de aceA, ii) redução do nível de expressão ou inativação do gene que codifica a isocitrato desidrogenase (icd) e iii) inativação dos genes que codificam a piruvato oxidase (poxB) e a via do acetato (ack, pta). Em um aspecto final dessa invenção, um melhor rendimento da produção de glicolato é obtido pelo aumento da disponibilidade de NADPH pela inativação dos genes que codificam a glicose-6-fosfato isomerase (pgri) , da 6-fosfogluconato desidratase (edd) e a transidrogenase solúvel (udhA). A presente invenção pode ser aplicada de um substrato de carbono modo geral para incluir qualquer que seja prontamente convertido em acetil-CoA.

Consequentemente é um objeto da presente invenção proporcionar um organismo recombinante, útil para a produção de ácido glicólico compreendendo: (a) pelo menos a inativação de todos os genes que codificam malato sintases, glioxilato carboligases e 2-ceto-3-desoxigluconato 6fosfato aldolase; (b) pelo menos um gene codificando um polipeptídeo possuindo atividade da glioxilato redutase dependente de NADPH e (c) pelo menos a inativação dos genes codificando a oxidação do glicolato dependente de NAD⁺ em glioxilato. Opcionalmente, o organismo recombinante pode compreender: i) a inativação de mutações em genes endógenos selecionados do grupo consistindo de: (a) um gene codificando um repressor da via glioxilato, (b) um gene codificando um polipeptideo possuindo atividade da glicose6-fosfato isomerase; (c) um gene codificando um polipeptideo possuindo atividade da transidrogenase solúvel; (d) um gene codificando um polipeptideo possuindo atividade da 6-fosfogluconato desidratase, (e) genes codificando polipeptídeos possuindo atividades de fosfotransacetilase e acetato quinase, (f) um gene codificando a atividade da piruvato oxidase, (g) um gene codificando a atividade da glicoaldeído desidrogenase: ii) aumento do nível de um gene codificando a isocitrato liase e iii) a redução do nível ou inativação de um gene codificando polipeptideo possuindo atividade da isocitrato desidrogenase.

Em outra modalidade, a invenção proporciona um processo para a produção de ácido glicólico a partir de um organismo recombinante compreendendo: (a) o contato do organismo recombinante da presente invenção com pelo menos uma fonte de carbono selecionada do grupo consistindo de monossacarideos, oligossacarídeos, polissacarídeos e substratos com um único carbono, por meio do que o glicolato é produzido; opcionalmente (b) a recuperação do ácido glicólico produzido em (a) através de uma etapa de polimerização até pelo menos dímeros de ácido glicólico, e (c) recuperação do ácido glicólico por despolimerização a partir de dimeros de ácido glicólico, oligômeros e/ou polímeros.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Os desenhos associados, os quais são incorporados e constituem parte dessa especificação, exemplificam a invenção e juntamente com a descrição, servem para explicar os princípios dessa invenção.

Figura 1 demonstra a engenharia genética da glicólise, o ciclo TCA e a via do glioxilato no desenvolvimento do sistema de produção de ácido glicólico a partir de carboidratos.

Figura 2 é um diagrama apresentando a construção do vetor pMElOl-ycdW.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Conforme aqui utilizados os termos seguintes podem ser usados para a interpretação das reivindicações e especificações.

O termo cepa mutante se refere a uma cepa do tipo não-selvagem.

O termo microrganismo se refere a todos os tipos de organismos unicelulares, incluindo organismos procarióticos como bactérias, e organismos eucarióticos como leveduras. Bactérias incluem, particularmente: Enterobacteriaceae,

Bacillaceae, Streptomycetaceae e Corynebacteriaceae.

Enterobacteriaceae compreende particularmente, porém não exclusivamente, os gêneros Escherichia, Klebsiella, Salmonella e Pantoea.

O termo transformação ou transfecção se refere à aquisição de novos genes em uma célula após a incorporação de ácido nucléico exógeno. O termo transformante se refere ao produto de uma transfomação. O termo geneticamente alterado se refere ao processo de alteração de material hereditário por transformação ou mutação.

O termo atenuação se refere à expressão diminuída de um gene ou à atividade diminuída da proteína, produto do gene. O homem versado na técnica conhece várias formas de obter esse resultado, como por exemplo:

Introdução de uma mutação no gene, diminuindo o nível de expressão desse gene ou o nível de atividade da proteína codificada.

Substituição do promotor natural do gene por um promotor de baixa força, resultando em uma expressão mais baixa.

- Uso de elementos desestabilizando o RNA mensageiro correspondente ou a proteína.

Anulação do gene se nenhuma expressão for necessária.

O termo expressão se refere à transcrição e tradução de um gene para a proteína, produto do gene.

O termo plasmideo ou vetor, conforme aqui utilizado, se refere um elemento extracromossomal geralmente carregando genes os quais não são parte do metabolismo central da célula, e geralmente na forma de moléculas de DNA de fita dupla circular.

O termo substrato de carbono ou fonte de carbono significa qualquer fonte de carbono capaz de ser metabolizada por um microrganismo, em que o substrato contém pelo menos um átomo de carbono. Os autores se referem particularmente a fontes de carbono renováveis, baratas e fermentáveis, tais como monossacarideos, oligossacarideos, polissacarideos, substratos de um único carbono e polióis, tais como glicerol. Substratos de carbono individual são definidos como moléculas de carbono que contêm somente um átomo de carbono, tal como metanol.

Monossacarideos de fórmula (CH₂O)_n, são também chamados como oses ou açúcares simples; monossacarideos incluem sacarose, frutose, glicose, galactose e manose. Outras fontes de carbono compreendendo mais de um monossacarideo são chamadas de dissacarídeos, trissacarideos, oligossacarideos sacarose (açúcar polissacarideos. Dissacarídeos incluem de cana), lactose e maltose. Amido e hemicelulose são polissacarídeos, também conhecidos como açúcares complexos. Consequentemente, o termo fonte de carbono significa qualquer produto conforme citado acima, e suas misturas.

O termo ATCC, irá ser estabelecido para American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852, EUA.

Os termos glioxilato e ácido glioxilico são usados intercambiavelmente.

Os termos glicolato e ácido glicólico são usados intercambiavelmente.

Na descrição da presente invenção, enzimas são identificadas por suas atividades específicas. Essa definição, desta forma, inclui todos os polipeptídeos que têm a atividade específica definida também presente em outros organismos, mais particularmente em outros microrganismos. Geralmente enzimas com atividades similares podem ser identificadas pelo seu agrupamento a certas famílias definidas como PFAM ou COG.

PFAM (banco de dados de famílias de proteínas de alinhamentos e modelos escondidos de Markov; http://www,sanger.ac.uk/Software/Pfam/) representa uma grande coleção de alinhamentos de sequências de proteínas. Cada PFAM torna possível visualizar alinhamentos múltiplos, ver domínios de proteína, avaliar a distribuição entre os organismos , ganhar acesso a outros bancos de dados e visualizar estruturas de proteínas conhecidas.

COGs (culturas de grupos ortólogos de proteínas; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/) são obtidas pela comparação de sequências de proteínas de 43 genomas totalmente seqüenciados representando as 30 maiores linhagens filogênicas. Cada COG é definida a partir de pelo menos três linhagens, o que permite a identificação de domínios anteriormente conservados.

As formas de identificar sequências homólogas e suas homologias percentuais são bem conhecidas pelas pessoas versadas na técnica, e incluem particularmente os programas

BLAST, os quais podem ser usados a partir do website http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ com os predefinidos indicados naquele website. As parâmetros sequências obtidas podem ser então exploradas por exemplo, alinhadas) usando, por exemplo, os programas CLUSTALW (http://www.ebi.

ac.uk/clustaiw/) ou MULTALIN (http://prodes.toulouse.inra .fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl), com os parâmetros predefinidos indicados naqueles websites.

Usando as referências dadas no GenBank para os genes conhecidos, as pessoas versadas na técnica são capazes de determinar os genes equivalentes em outros organismos, cepas bacterianas, leveduras, fungos, mamíferos, plantas, etc. Esse trabalho rotineiro é vantajosamente feito usando següências de consenso que podem ser determinadas pela execução de alinhamentos de sequências com genes derivados de outros microrganismos, e projetando sondas degeneradas para clonar o gene correspondente em outro organismo. Esses métodos de rotina de biologia molecular são bem conhecidos pelas pessoas versadas na técnica e estão descritos, por exemplo, em Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2^a ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, Nova Iorque.).

A presente invenção proporciona um método para a produção fermentativa de ácido glicólico, seus derivados ou precursores, pelo cultivo de um microrganismo em um meio de cultura apropriado compreendendo uma fonte de carbono e a recuperação do ácido glicólico a partir do meio de cultura.

Outra modalidade da invenção proporciona um método em que o microrganismo é modificado para ter uma baixa capacidade de conversão de glioxilato, exceto para produzir glicolato, devido à atenuação dos genes que codificam enzimas que consumem glioxilato, um precursor chave do glicolato: genes aceB e gclB gue codificam as malato sintases, gel codificando a glioxilato carboligase e eda contendo 2-ceto-3-desoxigluconato 6-fosfato aldolase.

Em outra modalidade da invenção, o microrganismo contém pelo menos um gene codificando um polipeptídeo que catalisa a conversão de glioxilato em glicolato.

Particularmente, um gene codificando uma enzima glioxilato redutase dependente de NADPH está presente para converter, sob condições aeróbicas, o intermediário glioxilato tóxico no produto final glicolato de baixa toxicidade. O gene pode ser exógeno ou endógeno e pode ser expresso cromossomicamente ou extracromossomicamente. Um gene codificando a glioxilato redutase dependente de NADPH pode ser tomado dentre os genes ycdW ou yiaE a partir do genoma de E.coli MG1655. Em uma modalidade preferida, a expressão de pelo menos um dos referidos genes é aumentada. Caso necessário, um alto nível de atividade glioxilato redutase dependente de NADPH pode ser obtido a partir de genes cromossomicamente localizados pelo uso de uma ou várias cópias no genoma que podem ser introduzidas pelos métodos de recombinação conhecidos pelo especialista na área. Para genes extracromossomais, diferentes tipos de plasmídeos que diferem em relação às suas origens de replicação e, deste modo, suas quantidades de cópias na célula podem ser usados. Eles podem estar presentes como 1 a 5 cópias, ca 20 ou até 500 cópias correspondendo a plasmídeos com baixo número de cópias com replicação restrita (pSClOl, RK2), plasmideos com baixo número de cópias (pACYC, pRSFlOlO) ou plasmideos com grande número de cópias (pSK bluescript II). Os genes ycdW ou yiaE podem ser expressos usando promotores com diferentes forças que precisam ou não ser induzidos por moléculas indutoras. São exemplos os promotores Ptrc, Ptac, Plac, o promotor lambda cl ou outros promotores conhecidos pelo especialista na área. A expressão dos genes também pode ser impulsionada por elementos estabilizantes do RNA mensageiro correspondente (Carrier e Keasling (1998) Biotechnol. Prog. 15, 58-64) ou pela proteina (e.g. etiquetas GST, Amersham Biosciences).

Em uma outra modalidade da invenção, o microrganismo é modificado de tal forma gue ele é incapaz de metabolizar substancialmente o glicolato. Esse resultado pode ser alcançado pela atenuação de pelo menos um dos genes que codificam enzimas que consomem glicolato (grlcDEF codificando glicolato oxidase e aldA codificando glicoaldeido desidrogenase). A atenuação dos genes pode ser feita pela substituição do promotor natural por um promotor de baixa força ou pelo elemento desestabilizador do RNA mensageiro correspondente ou da proteina. Caso necessário, a atenuação completa do gene pode ser conseguida por uma anulação da seqüência de DNA correspondente.

Em outra modalidade, o microrganismo usado no método da invenção é transformado para aumentar o fluxo da via do glioxilato.

O fluxo na via do glioxilato pode ser aumentado por diferentes formas, e em particular:

i) reduzindo a atividade da enzima isocitrato desidrogenase (Icd), ii) reduzindo a atividade de pelo menos uma das seguintes enzimas:

• fosfo-transacetilase, codificada pelo gene pta;

• acetato quinase, codificada pelo gene ack;

• piruvato oxidase, codificada pelo gene poxB;

pela atenuação dos genes, iii) aumentando a atividade da enzima isocitrato liase, codificada pelo gene aceA.

A redução do nivel da isocitrato desidrogenase pode ser efetuada pela introdução de promotores artificiais que impulsionam a expressão do gene icd, codificando a isocitrato desidrogenase, ou pela introdução de mutações no gene icd que reduz a atividade enzimática da proteína.

Uma vez que a atividade da proteína Icd é reduzida por fosforilação, ela também pode ser controlada pela introdução de genes aceK mutantes que têm atividade quinase aumentada ou atividade fosfatase reduzida em comparação com a enzima AceK do tipo selvagem.

O aumento da atividade da isocitrato liase pode ser conseguido ou pela atenuação do nivel dos genes iclR ou fadR, pela codificação dos repressores da via glioxilato, ou pelo estímulo da expressão do gene aceA, por exemplo, pela introdução de promotores artificiais que impulsionam a expressão do gene, ou pela introdução de mutações no gene aceA que aumentam a atividade da proteína codificada.

Uma modalidade da invenção proporciona um melhor rendimento da produção de glicolato pelo aumento da disponibilidade de NADPH para a glioxilato redutase dependente de NADPH. Essa modificação das características do microrganismo pode ser obtida através da atenuação de pelo menos um dos genes selecionados dentre os seguintes: pgi codificando a glicose-6-fosfato isomerase, udhA codificando a transidrogenase solúvel e edd codificando a atividade da 6-fosfogluconato desidratase. Com tais modificações genéticas, toda a glicose-6-fosfato terá que entrar na glicólise através da via da pentose fosfato e 2 NADPH serão produzidos por glicose-6-fosfato metabolizada.

Em outra modalidade a invenção proporciona um processo para a produção fermentativa de ácido glicólico a partir de um organismo recombinante, compreendendo: (a) o contato do organismo recombinante da presente invenção com pelo menos uma fonte de carbono selecionada do grupo consistindo de glicose, sacarose, monossacarideos, oligossacarídeos, polissacarideos, amido ou seus derivados, glicerol e substratos com um único carbono, por meio do que ácido glioxílico produzido. Opcionalmente, o processo compreende uma etapa de concentração de glicolato na bactéria ou no meio, e o isolamento de ácido glicólico a partir do caldo remanescente em produto final.

fermentativo e/ou da biomassa opcionalmente porções na quantidade total (0 a 100%) no

Opcionalmente, o processo compreende uma etapa de recuperação do ácido glicólico produzido na etapa (a) através de uma etapa de polimerização até pelo menos dímeros de ácido glicólico e (b) a recuperação do ácido glicólico pela despolimerízação dos dímeros, oligômeros e/ou polímeros de ácido glicólico.

As pessoas versadas na técnica são capazes de definir as condições de cultura para os microrganísmos de acordo com a invenção. Em particular, as bactérias são fermentadas em uma temperatura entre 20 °C e 55 °C, preferivelmente entre 25 °C e 40 °C, e mais especificamente de cerca de 30 °C para C. glutamicum e cerca de 37°C para E. coli.

A fermentação é geralmente efetuada em fermentadores com um meio de cultura inorgânico de composição conhecida definida, adaptados para o uso de bactérias, contendo pelo menos uma fonte de carbono simples, e caso necessário um co-substrato necessário para a produção do metabólito.

Ά invenção também está relacionada com o microrganismo conforme descrito anteriormente. Preferivelmente, esse microrganismo é selecionado dentre o grupo consistindo de E. coli, C. glutamicum ou S. cerevisiae.

EXEMPLO 1

Construção de cepas incapazes de metabolizar glioxilato, exceto reduzi-lo a glicolato: MG1655 AaceB Agcl AglcB

Para anular o gene aceB, a estratégia de recombinação homóloga descrita por Datsenko & Wanner (2000) é usada. Essa estratégia permite a inserção de um cassete de resistência ao cloranfenicol ou a canamicina , enguanto anula a maioria dos genes envolvidos. Para esse propósito, os seguintes oligonucleotideos são usados:

DaceBF (SEQ ID NO: 1) ggcaacaacaaccgatgaactggctttcacaaggccgtatggcgagcaggagaagcaaa ttcttactgccgaagcggtagCATATGAATATCCTCCTTAG com

- uma região (letras minúsculas) homóloga à seqüência (4213068-4213147) do gene aceB (seqüência de referência no website http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),

- uma região (letras maiúsculas) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol (seqüência de referência em Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS,

97: 6640-6645),

DaceBR (SEQ ID NO: 2) ggcggtagcctggcagggtcaggaaatcaattaactcatcggaagtggtgatctgttcc atcaagcgtgcggcatcgtcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG com

- uma região (letras minúsculas) homóloga à seqüência (4214647-4214569) do gene aceB (seqüência de referência no website http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),

97: 6640-6645).

Os oligonucleotideos DaceBF e DaceBR são usados para amplificar o cassete de resistência ao cloranfenicol a partir do plasmideo pKD3. 0 produto PCR obtido é então introduzido por eletroporação na cepa MG1655 (pKD46), na qual a enzima Red recombinase expressada permite a recombinação homóloga. Os transformantes resistentes ao cloranfenicol são então selecionados e a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos aceBF e aceBR definidos abaixo. A cepa retida é designada MG1655 AaceB::Cm aceBF (SEQ ID NO: 3) : cgttaagcgattcagcaccttacc (homóloga à seqüência de 4212807 a 4212830).

aceBR (SEQ ID NO: 4): ccagtttctgaatagcttcc (homóloga à seqüência de 4215327 a 4215308).

Portanto, o gene gel é anulado na cepa MG1655

AaceB::Cm por transdução.

A cepa MG1655

AgclB::Km é primeiramente construída usando o mesmo método como descrito anteriormente com os seguintes oligonucleotideos:

DgclF (SEQ ID NO 5) ggcaaaaatgagagccgttgacgcggcaatgtatgtgctggagaaagaaggtatcacta ccgccttcggtgttccgggagcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG com

- uma região (letras minúsculas) homóloga à seqüência (533142-533224) da região do gene gel (seqüência de referência no website http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),

- uma região (letras maiusculas) para a amplificação do cassete de resistência à canamicina (seqüência de referência em Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS,

97: 6640-6645).

DgipR (SEQ ID NO 6) gcgttacgttttaacggtacggatccatccagcgtaaaccggcttccgtggtggtttgg ggtttatattcacacccaacccCATATGAATATCCTCCTTAG com

- uma região (letras minúsculas) homóloga à seqüência (535720-535640) da região do gene gel (següência de referência no website http://genolist.pasteur.fr/Colibri/) ,

- uma região (letras maiúsculas) para a amplificação do cassete de resistência à canamicina (seqüência de referência em Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS,

97: 6640-6645).

Os oligonucleotideos DgclF e DgipR são usados para amplificar o cassete de resistência à canamicina a partir do plasmídeo pKD4. 0 produto PCR obtido é, a seguir, introduzido por eletroporação na cepa MG1655 (pKD46). Os transformantes resistentes à canamicina são, a seguir, selecionados e a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos gclF e gipR definidos abaixo. A cepa retida é designada MG1655 Ágcl::Km.

gclF (SEQ ID NO: 7): ggatatgcccaccttgctgaagg (homóloga à següência de 532795 a 532817).

gipR (SEQ ID NO: 8) : cgcttagtttcaatcggggaaatgg (homóloga à seqüência de 536114 a 536090).

Para transferir a anulação Agcl::Km, o método da transdução de fago PI é usado. O protocolo seguido é implementado em 2 etapas com a preparação do lisado de fago da cepa MG1655 Agcl: :Km e, a seguir, a transdução na cepa MG1655 AaceB::Cm. A construção da cepa é descrita acima.

Preparação do lisado de fago Pl:

- Inoculação com 100 pL de uma cultura de um dia para o outro da cepa MG1655 Agcl:: Km de 10 mL de LB + Km 50 pg/mL + glicose 0,2% + CaC12 5 mM.

- Incubação por 30 min a 37 °C com agitação.

- Adição de 100 pL de lisado de fato Pl preparado na cepa MG1655 (cerca de 1.10⁹ fago/mL).

- Agitação a 37 °C por 3 horas até todas as células serem lisadas.

- Adição de 200 pL de clorofórmio e submissão ao vórtex.

- Centrifugação por 10 min a 4500 g para eliminar os fragmentos celulares.

- Transferência do sobrenadante para um tubo estéril e adição de 200 pL de clorofórmio.

- Armazenagem do listo a 4 °C.

Transdução

- Centrifugar por 10 min a 1500 g de 5 mL de uma cultura de um dia para o outro da cepa MG1655 AaceB::Cm em meio LB.

- Suspensão do pélete celular em 2,5 mL de MgSCh 10 mM, CaCl₂ 5 mM.

- Tubos de controle: 100 μΒ de células

100 μΣ de fagos PI da cepa MG1655 Agcl::Km

- Tubo de teste: 100 μΣ de células + 100 μΣ de fagos PI da cepa MG1655 Agcl::Km.

- Incubação por 30 min a 30 °C sem agitação.

- Adição de 100 μΣ de citrato de sódio 1 M em cada tubo e submissão ao vórtex.

- Adição de 1 mL de LB.

- Incubação por 1 h a 37 °C com agitação.

- Espalhamento em placas LB + Km 50 μg/mL depois da centrifugação dos tubos por 3 min a 7000 rpm.

- Incubação a 37 °C de um dia para o outro.

Verificação da cepa

Os transformantes resistentes à canamicina são, a seguir, selecionados e a anulação do gene Agrei:: Km é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos gclF e gipR anteriormente descritos. A cepa retida é designada MG 1655 AaceB::Cm hgcl::Km.

Os cassetes de resistência à canamicina e cloranfenicol podem ser então eliminados. O plasmideo pCP20 carregando a FLP recombinase agindo nos sítios FRT dos cassetes de resistência à canamicina e ao cloranfenicol é, a seguir, introduzido nos sítios recombinantes por eletroporação. Depois de uma série de culturas a 42 °C, a perda dos cassetes de resistência à canamicina e ao cloranfenicol é verificada por uma análise de PCR com os mesmos oligonucleotídeos usados anteriormente (aceBF / aceBR e gclF / gipR) . A cepa retida é designada MG 1655 AaceB Agcl.

A seguir, o gene glcB é anulado na cepa MG 1655 AaceB Agcl por transdução.

O MG1655 AglcB::Km é primeiramente construído usando o mesmo método anteriormente descrito com os seguintes oligonucleotídeos:

DglcBR (SEQ ID NO 9) cccagagccgtttacgcattgacgccaattttaaacgttttgtggatgaagaagtttta ccgggaacagggctggacgcCATATGAATATCCTCCTTAG com

- uma região (letras minúsculas) homóloga à seqüência (3121805-3121727) da região do gene glcB (seqüência de referência no website http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),

97: 6640-6645).

DglcBF (SEQ ID NO 10) cgcqtaaacqccaggcgtgtaataacggttcggtatagccgtttggctgtttcacgccg aggaagattaaatcgctggcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG com

- uma região (letras minúsculas) homóloga à seqüência (3119667-3119745) da região do gene glcB (seqüência de referência no website http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),

- uma região (letras maiusculas) para a amplificação do cassete de resistência à canamicina (seqüência de referência em Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645).

Os oligonucleotídeos DglcF e DglcBR são usados para amplificar o cassete de resistência á canamicina a partir do plasmídeo pKD4. O produto PCR obtido é, a seguir, introduzido por eletroporação na cepa MG1655 (pKD46). Os transformantes resistentes à canamicina são, a seguir, selecionados e a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos gclBF e glcBR definidos abaixo. A cepa retida é designada MG1655 AglcB::Km.

glcBR (SEQ ID NO: 11): gccagcaaatggcgagtgc (homólogo à sequência de 3122225 a 3122207).

glcBF (SEQ ID NO: 12): cgcagagtatcgttaagatgtcc

(homólogo à seqüência de 3119475 a 3119497).	o	método	da
Para transferir a	anulação	AglcB: : Km,
transdução de fago PI é	usado. A	preparação	do	lisado	de
fago da cepa MG1655 AglcB::Km é usada para a	transdução	na

cepa MG1655 AaceB Agcl.

Os transformantes resistentes à canamicina são, a seguir, selecionados e a anulação do gene Aglc::Km é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos previamente definidos glcBF e glcBR. A cepa retida é designada MG1655 AaceB Agcl AglcB::Km.

O cassete de resistência à canamicina pode então ser eliminado. O plasmideo pCP20 carregando a FLP recombinase agindo nos sítios FRT do cassete de resistência à canamicina é, a seguir, introduzido nos sítios recombinantes por eletroporação. Depois de uma série de culturas a 42 °C, a perda do cassete de resistência à canamicina é verificada por uma análise de PCR com os mesmos oligonucleotídeos usados anteriormente (glcBF e grlcBR) . A cepa retida é designada MG 1655 AaceB Agcl Agl cB.

EXEMPLO 2

Construção de cepas com nivel aumentado de glioxilato redutase dependente de NADPH: MG1655 AaceB Agcl AglcB (pMElOl-ycdW)

Para impulsionar o nivel de glioxilato redutase dependente de NADPH, o gene ycdW é expresso a partir do plasmideo pCL1920 (Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631) usando o promotor Ptrc. Para a expressão a partir de um vetor com poucas cópias, o plasmideo pMElOl é construído como se segue. O plasmideo pCL1920 é amplificado por PCR usando os oligonucleotídeos PME101F e PME101R e o fragmento BstZ17I-XmnI do vetor PTRC99A abrigando o gene lacl e o promotor P_trc θ inserido no vetor amplificado.

PME101F (SEQ ID NO 13): Ccgacagtaagacgggtaagcctg

PME101R (SEQ ID NO 14): Agcttagtaaagccctcgctag

O gene ycdW é amplificado por PCR a partir de DNA genômico usando os seguintes oligonucleotídeos:

BspHI ycdW (SEQ ID NO 15) : agctaqctctcatgagaataaatttc gcacaacgcttttcggg

Smal ycdW (SEQ

ID NO 16):

qcatgcatcccgggtctctc ctgtattcaattcccgcc

O fragmento de PCR é digerido clonado no vetor pMElOl cortado pelas com BspHI e Smal e enzimas de restrição

Ncol e Smal resultando no plasmideo pMElOl-ycdW.

O plasmideo pMElOl-ycdW é, a seguir, introduzido na cepa MG1655 AaceB Ágcl ÁglcB.

EXEMPLO 3

Construção das cepas com consumo diminuído de glicolato: MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA (pMElOl-ycdW)

Os genes glcDEFGB são anulados na cepa MG1655 AaceB

Agcl por transdução.

O MG1655 AglcDEFGB::Km é primeiramente construído usando o mesmo método anteriormente descrito com os seguintes oligonucleotídeos:

DglcDR (SEQ ID NO 17) gcgtcttgatggcgctttacccgatgtcgaccgcacatcggtactgatggcactgcgtg agcatgtccctggacttgagatccCATATGAATATCCTCCTTAG com

- uma região (letras minúsculas) homóloga à seqüência (3126016-3125934) do gene glcD (seqüência de referência no website http://genolist.pasteur.fr/Colibri/) ,

97: 6640-6645).

DglcBF (SEQ ID NO 18) cgcgtaaacgccaggcgtgtaataacggttcggtatagccgtttggctgtttcacgccg aggaagattaaatcgctggcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG com

97: 6640-6645).

Os oligonucleotideos DglcDR e DgrlcBF são usados para amplificar o cassete de resistência à canamicina a partir do plasmídeo pKD4. O produto PCR obtido é, a seguir, introduzido por eletroporação na cepa MG1655 (pKD46), na qual a enzima Red recombinase expressada permite a recombinação homóloga. Os transformantes resistentes ao cloranfenicol são, a seguir, selecionados e a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos glcOR e glcBF definidos abaixo. A cepa retida é designada MG1655 AglcDEFGB::Km.

glcOR (SEQ ID NO: 19): ccaagacaaggtcacagagc (homóloga à sequência de 3126183 a 3126164).

glcQF (SEQ ID NO: 20) : cgcaqaqtatcgttaagatgtcc (homóloqa à sequência de 3119475 a 3119497).

Para transferir a anulação AgclDEFGB::Km, o método da transdução de fago PI é usado. O preparo do lisado de fago da cepa MG1655 AgclDEFGB: : Km é usado para a transdução na cepa MG1655 AaceB Agcl.

Os transformantes resistentes à canamicina são, a seguir, selecionados e a anulação do gene AglcDEFGB:Km é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos anteriormente definidos glcBF e glcOR. A cepa retida é designada MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB::Km.

A seguir, o gene aldA é anulado na cepa MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB::Km por transdução. O MG1655 aldA::Cm é primeiramente construído usando o mesmo método que o anteriormente descrito com os seguintes oligonucleotideos:

AldA D r (SEQ ID NO 21) ttaagactgtaaataaaccacctgggtctgcagatattcatgcaagccatgtttaccat ctgcgccgccaataccggatttCATATGAATATCCTCCTTAG com

- uma região (letras minúsculas) homóloga à seqüência (1487615 a 1487695) do gene aldA (seqüência de referência no website http://genolist.pasteur.fr/Colibri/) ,

97: 6640-6645),

AldA D f (SEQ ID NO 22) atgtcagtacccgttcaacatcctatgtatatcgatggacagtttgttacctggcgtgg agacgcatggattgatgtggtaGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG com

- uma região (letras minúsculas) homóloga à seqüência (1486256 a 1486336) do gene aldA (seqüência de referência no website http: //genolist.pasteur.fr/Colibri/) ,

97: 6640-6645),

Os oligonucleotideos aldAF e aldAR são usados para amplificar o cassete de resistência ao cloranfenicol a partir do plasmideo pKD3. O produto PCR obtido é, a seguir, introduzido por eletroporação na cepa MG1655 (pKD46), na qual a enzima Red recombinase expressada permite a recombinação homóloga. Os transformantes resistentes à canamicina são, a seguir, selecionados e a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos YdcFCf e gapCCR definidos abaixo. A cepa retida é designada MG1655 AaldA::Cm.

YdcFCf (SEQ ID NO: 23):tgcagcggcgcacgatggcgacgttccgccg (homóloga à seqüência de 1485722 a 1485752).

gapCCR (SEQ ID NO 24): cacgatgacgaccattcatgcctatactggc

(homóloga à seqüência	de	1488195 a	1488225) .
Para transferir	a	anulação	AaldA: : Cm,	o	método	da
transdução de fago PI	é	usado. A	preparação	do	lisado	de
fago da cepa MG1655 AaldA::Cm é usada para a	transdução	na

cepa MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB::Km.

Os transformantes resistentes à canamicina são, a seguir, selecionados e a anulação do gene AaldA::Cm é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos YdcFCf e gapCCR anteriormente definidos. A cepa retida é designada MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB:: Km AaldA::Cm.

Os cassetes de resistência à canamicina e ao cloranfenicol podem, a seguir, ser eliminados.

O plasmídeo pCP20 carregando a FLP recombinase agindo nos sítios FRT dos cassetes de resistência à canamicina e ao cloranfenicol é então introduzido nos sítios recombinantes por eletroporação. Depois de uma série de culturas a 42 °C, a perda dos cassetes de resistência à canamicina e ao cloranfenicol é verificada por uma análise de PCR com os mesmos oligonucleotideos usados anteriormente (glcBF / glcDR e YdcFCf / gapCCR). A cepa retida é designada MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA.

O plasmideo ρΜΕΙΟΙ-ycdW é, a seguir, introduzido na cepa MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA.

EXEMPLO 4

Construção de cepas com fluxo aumentado na via do glioxilato: MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR (pMElOl-ycdW)

A anulação do gene iclR é introduzida no MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA usando a mesma estratégia anteriormente descrita com os seguintes oligonucleotideos:

DiclF (SEQ ID NO 25) cgcacccattcccgcgaaacgcggcagaaaacccgccgttgccaccgcaccagcgactg gacaggttcagtctttaacgcgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG com

- uma região (letras minúsculas) homóloga à seqüência (4221202-4221120) do gene iclR (seqüência de referência no website http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),

97: 6640-6645),

DiclR (SEQ ID NO 26) gcgcattccaccgtacgccagcgtcacttccttcgccgctttaatcaccatcgcgccaa actcggtcacgcggtcatcggCATATGZXATATCCTCCTTAG com

- uma região (letras minúsculas) homóloga à seqüência (4220386-4220465) do gene iclR (seqüência de referência no website http://genolist.pasteur,fr/Colibri/),

97: 6640-6645),

Os oligonucleotideos DiclF e DiclR são usados para amplificar o cassete de resistência à canamicina a partir do plasmideo pKD4. O produto PCR obtido é, a seguir, introduzido por eletroporação na cepa MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA (pKD46). Os transformantes resistentes à canamicina são então selecionados e a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos iclF e iclR definidos abaixo. A cepa retida é designada MG1655 AaceB Agcl AgrlcDEFGB AaldA

AiclR::Km.

IcIF (SEQ ID NO 27) : cctttgaggtcgcatggccagtcggc (homóloga à seqüência de 4221558 a 4221533) . iclR (SEQ ID NO 28): gctttttaatagaggcgtcgccagctccttgcc (homóloga à seqüência de 4219917 a 4219949).

O cassete de resistência à canamicina pode então ser eliminado. O plasmídeo pCP20 carregando a FLP recombinase agindo nos sítios FRT do cassete de resistência à canamicina é, a seguir, introduzido nos sítios recombinantes por eletroporação. Depois de uma série de culturas a 42 °C, a perda do cassete de resistência à canamicina é verificada por uma análise de PCR com os mesmos oligonucleotídeos usados anteriormente (iclF e iclR) . A cepa retida é designada MG 1655 AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR.

O plasmídeo pMElOl-ycc/W é, a seguir, introduzido na cepa MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AíclR.

EXEMPLO 5

CONSTRUÇÃO DAS CEPAS COM DISPONIBILIDADE DE NADPH AUMENTADA: MG1655 AaceB Agcl AiclR AglcDEFGB AaldA Aeddeda (pMElOl-ycdW)

Os genes edd-eda são anulados na cepa MG1655 AaceB Agcl AglcDEF AaldA AiclR por transdução.

A cepa MG1655 Aedd-eda::Cm é primeiramente construída usando o mesmo método que o anteriormente descrito com os seguintes oligonucleotídeos:

DeddF (SEQ ID NO 29) cgcgcgagactcgctctgcttatctcgcccggatagaacaagcgaaaacttcgaccgtt catcgttcgcagttggcatgcggTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG com

- uma região ( (letras minúsculas) homóloga à seqüência (1932582-1932500) da região dos genes edd-eda (seqüência de referência no website http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),

- uma região (letras maiusculas) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol (seqüência de referência em Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS,

97: 6640-6645),

DedaR (SEQ ID NO 30) gcttagcgccttctacagcttcacgcgccagcttagtaatgcggtcgtaatcgcccgct tccagcgcatctgccggaaccCATATGAATATCCTCCTTAG com

- uma região (letras minúsculas) homóloga à seqüência (1930144-1930223) da região dos genes edd-eda (seqüência da referência no website http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),

- uma região (letras maiúsculas) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol (seqüência de referência em Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645),

Os oligonucleotideos DeddF e DedaR são usados para amplificar o cassete de resistência ao cloranfenicol a partir do plasmídeo pKD3. O produto PCR obtido é então introduzido por eletroporação na cepa MG1655 (pKD46), Os transformantes resistentes ao cloranfenicol são, a seguir, selecionados e a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos eddF e edaR definidos abaixo. A cepa retida é designada MG1655 Aedd-eda::Cm.

eddF (SEQ ID NO 31): Gggtagactccattactgaggcgtgggcg (homóloga à seqüência de 1932996 a 1932968).

edaR (SEQ ID NO 32): ccacatgataccgggatggtgacg (homóloga à seqüência de 1929754 a 1929777).

Para transferir a anulação Aedd-eda::Cm, o método da transdução de fago PI é usado conforme anteriormente descrito. A preparação do lisado de fago da cepa MG1655 Aedd-eda::Cm foi usada para a transdução na cepa MG1655 AaceB Agcl AgrlcDEFGB AaldA AiclR.

Os transformantes de resistência ao cloranfenicol são, a seguir, selecionados e a anulação do gene Aedd-eda::Cm é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos eddF e edaR. A cepa retida é designada MG1655 AaceB AgclB AglcDEF AaldA AiclR Aedd-eda: :Cm.

O cassete de resistência ao cloranfenicol pode, a seguir, ser eliminado. O plasmideo pCP20 carregando a FLP recombinase agindo nos sítios FRT do cassete de resistência ao cloranfenicol é, a seguir, introduzido nos sítios recombinantes por eletroporação. Depois de uma série de culturas a 42 °C, a perda do cassete de resistência ao cloranfenicol é verificada por uma análise de PCR com os mesmos oligonucleotídeos usados anteriormente (eddF e edaR) . A cepa retida é designada MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd-eda.

O plasmideo ρΜΕΙΟΙ-ycdW é então introduzido na cepa MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd-eda.

EXEMPLO 6

CONSTRUÇÃO DE CEPAS COM DISPONIBILIDADE DE NADPH AUMENTADA: MG1655 AaceB Agcl AiclR AglcDEFGB AaldA Apgi::Cm Aedd-eda (pMElOl-ycdW)

A anulação do gene pgi é introduzida no MG1655 AaceB Agcl AglcB AglcDEF AaldA AiclR Aedd-eda usando a mesma estratégia anteriormente descrita com os seguintes oligonucleotídeos:

DpgiF (SEQ ID NO 33) ccaacgcagaccgctgcctggcaggcactacagaaacacttcgatgaaatgaaagacgt tacgatcgccgatctttttgcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG com

- uma região (letras minúsculas) homóloga à seqüência (4231352-4231432) do gene pgi (seqüência de referência no website http://genolist.pasteur.fr/Colibri/) ,

97: 6640-6645),

DpgiR (SEQ ID NO 34) gcgccacgctttatagcggttaatcagaccattggtcgagctatcgtggctgctgattt ctttatcatctttcagctctgCATATGAATATCCTCCTTAG com

- uma região (letras minúsculas) homóloga à seqüência (4232980-4232901) do gene pgi (seqüência de referência no website http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),

97: 6640-6645),

Os oligonucleotideos DpgiF e DpgiR são usados para amplificar o cassete de resistência ao cloranfenicol a partir do plasmídeo pKD3. O produto PCR obtido é, a seguir,introduzido por eletroporação na cepa MG1655 AaceB Agcl AglcB AglcDEF AaldA AiclR Aedd-eda (pKD46). Os transformantes resistentes ao cloranfenicol são, a seguir, selecionados e a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotídeos pgiF e pgiR definidos abaixo. A cepa retida é designada MG1655 AaceB Agcl AglcB AglcDEF AaldA AiclR Aedd-eda Apgi::Cm pgiF (SEQ ID NO 35) : gcggggcggttgtcaacgatggggtcatgc (homóloga à sequência de 4231138 a 4231167).

pgiR (SEQ ID NO 36) : cggtatgatttccgttaaattacagacaag (homóloga à sequência de 4233220 a 4233191).

O plasmideo ρΜΕΙΟΙ-ycdW é então introduzido na cepa MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd-eda Apgi::Cm.

EXEMPLO 7

CONSTRUÇÃO DAS CEPAS COM DISPONIBILIDADE DE NADPH AUMENTADA: MG1655 AaceB Agcl AiclR AglcDEFGB AaldA Apgi Aedd-eda::Cm AudhA::Km (pMElOl-ycdW)

A anulação do gene udhA é introduzida em MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Apgi::Cm Aedd-eda usando a mesma estratégia como anteriormente descrita com os seguintes oligonucleotídeos:

DudhAF (SEQ ID NO 37)

CCCAGAATCTCTTTTGTTTCCCGATGGAACAAAATTTTCAGCGTGCCCACGTTCATGCC GACGATTTGTGCGCGTGCCAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG com

- uma região (letras em negrito) homóloga à seqüência (4157588-4157667) do gene udhA (seqüência de referência no website http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),

- uma região (letras sublinhadas) para a amplificação do cassete de resistência à canamicina (seqüência de referência em Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS,

97: 6640-6645),

DudhAR (SEQ ID NO 38) ggtgcgcgcgtcgcagttatcgagcgttatcaaaatgttggcggcggttgcacccactg gggcaccatcccgtcgaaagcCATATGAATATCCTCCTTAG com

- uma região (letras em negrito) homóloga à seqüência (4158729-4158650) do gene udhA (seqüência de referência no website http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),

97: 6640-6645).

Os oligonucleotídeos DudhAF e DudhAR são usados para amplificar o cassete de resistência à canamicina a partir do plasmideo pKD4. O produto PCR obtido é, a seguir, introduzido por eletroporação na cepa MG1655 ÁaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Apgi::Cm Aedd-eda (pKD46). Os transformantes resistentes à canamicina são então selecionados e a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos udhAF e udhAR definidos abaixo. A cepa retida é designada MG1655 AaceB Agcl AgrlcDEFGB AaldA AiclR Apgl::Cm Aedd-eda AudhA::Km udhAF (SEQ ID NO 39) : (homóloga à seqüência de

4157088 a 4157108). GATGCTGGAAGATGGTCACT udhAR (SEQ ID NO 40): (homóloga à seqüência de 4159070 a 4159052). gtgaatgaacggtaacgc

O plasmideo ρΜΕΙΟΙ-ycdW é então introduzido na cepa MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Apgi::Cm Aedd-eda AudhA::Km.

EXEMPLO 8

FERMENTAÇÃO DE CEPAS PRODUTORAS DE ÁCIDO GLICÓLICO EM FRASCOS DE ERLENMEYER

Os desempenhos das cepas foram inicialmente avaliados em culturas de frascos de erlenmeyer com septo de 250 mL usando meio M9 modificado (Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 32: 120-128) que foi suplementado com 40 g/L de MOPS e 10 g/L de glicose e ajustado em pH 6,8.

Estreptomicina foi adicionada, caso necessário, em uma concentração de 50 mg/L e 100 μιη de IPTG foi também adicionado para indução do vetor de expressão, caso presente. Uma pré-cultura de um dia para o outro foi usada para inocular uma cultura de 50 mL em uma OD₆oo ™ de cerca de 0,3. As culturas foram mantidas em um agitador a 30 °C e

400 rpm até a glicose no meio de cultura se exaurir. No final da cultura, a glicose e o ácido glicólico foram analisados por HPLC usando uma coluna Biorad HPX 97H para a separação e um refratômetro para a detecção.

A comparação dos desempenhos de cepas diferentes é dada na tabela abaixo (cada valor é a média de n repetições). A cepa descrita no exemplo 1 não apresentou qualquer produção de ácido glicólico.

Cepa do exemplo n°	2	3	4	5	6	7
Genótipo	AaceB	AaceB	AaceB	AaceB	AaceB	AaceB
(E. coli	Agcl	Agcl	Agcl	Agcl	Agcl	Agcl
MG1655)	Agl cB	AglcDE	AglcDE	AglcDE	AglcDE	AglcDE
	(pMEl	FGB	FGB	FGB	FGB	FGB
	01-	AaldA	AaldA	AaldA	AaldA	AaldA
	ycdW)	(pMEl 0 1-	AiclR	AiclR	AiclR	AiclR

		ycdW)	(pMEl 0 1- ycdW)	Aeddeda (pMElO 1- ycdW)	Aeddeda Kpgi (pMElO 1ycdW)	Aeddeda Epgi EudhA (pMElO 1ycdW)
Produção	0,28	0,28	0, 65	1,73	2,75	2,33
de ácido glicólico	(n=3)	(n= 8)	(n= 8)	(n= 8)	(n= 6)	(n= 4)
Rendimento	0, 03	0,03	0,07	0,17	0,29	0,25
(g de ácido glicólico/ g de glicose)	(n=3)	(n= 8)	(n= 8)	(n= 8)	(n= 6)	(n= 4)

As cepas descritas no Exemplo 6 e no Exemplo 7 são as melhores produtoras de ácido glicólico com títulos maiores do gue 2 g/L e rendimentos superiores a 0,2 g/g.

EXEMPLO 9

FERMENTAÇÃO DE CEPAS PRODUTORAS DE ÁCIDO GLICÓLICO EM

UM FERMENTADOR DE ALIMENTAÇÃO EM BATELADA

As cepas descritas no Exemplo 6 e no Exemplo 7 foram avaliadas sob as condições de produção em um fermentador de 600 mL usando um protocolo de alimentação em batelada.

Uma primeira pré-cultura em tubos foi efetuada em meio LB suplementado com 2,5 g/L de glicose a 30 °C, seguido por uma segunda pré-cultura em um frasco de erlenmeyer de 500 mL preenchido com 50 mL de meio sintético suplementado com 40 g/L de MOPS e 10 g/L de glicose (o mesmo meio usado para culturas de frasco) a 30 °C. Essa segunda pré-cultura foi usada para a inoculação do fermentador.

fermentador preenchido com 200 mL de meio sintético suplementado com g/L de glicose, 50 mg/L de espectinomicina

100 μΜ de

IPTG foi inoculado em uma densidade ótica inicial de cerca de 2. A cultura foi executada a 30 °C com agitação e aeração ajustada para manter o oxigênio dissolvido acima de saturação de 30%. O pH foi ajustado em 6,8 com adição de base. A cultura foi efetuada em um modo em batelada até a exaustão da glicose.

Naquele momento, uma solução de 500 g/L de qlicose suplementada com sulfato de magnésio, oligoelementos, espectinomicina e

IPTG foi adicionada para restaurar a concentração de 40 g/L de glicose no meio. Outras adições foram feitas em cada vez que a glicose foi novamente exaurida.

Rotineiramente, a cepa descrita no Exemplo 7 proporcionou um melhor desempenho de produção do que a cepa descrita no Exemplo 6 nos fermentadores (rendimento de glicose de 0,22 versus 0,15 g/g).

Um curso de tempo representativo da fermentação para a produção de ácido glicólico usando a cepa do exemplo 7 é dado abaixo.

Tempo (h)	OD₆₀0 nm (AU)	Glicose (g/L)	Ácido glicólico (g/L)
0	2,0	35,45	0,11
16	3,7	34,70	0,57
20	5,1	33, 25	1,14
25	6,7	31,24	1,81
39	14,8	20,55	4,75
44	20,3	12,24	7,02
49	27,9	2,48	9,44
64	53,9	7,94	18,80
70	62,8	33, 97	21,76
73	67,8	24,54	23,54
87	84,0	36, 60	28,70
93	89,6	25, 61	31,33

titulo final obtido foi de 31 g/L de ácido glicólico com um rendimento de glicose de 0,22 g/g.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para a produção fermentativa de ácido glicólico pelo cultivo de uma cepa de E. coli em ura meio de cultura apropriado compreendendo uma fonte de carbono e recuperação de ácido glicólico a partir do meio de cultura, caracterizado pelo fato de que o referido método compreende as seguintes etapas:

a) fermentação da cepa de E. coli produzindo glicolato; b) concentração do glicolato na referida cepa ou no meio; e c) isolamento de ácido glicólico a partir do caldo de fermentação e / ou da biomassa, em que a expressão dos seguintes genes é atenuada na referida cepa de E. coli, de modo a atenuar a conversão do

glioxilato em outros produtos que não o glicolato:

• aceB codificando malato sintase;

• glcB codificando a segunda malato sintase; e • gel codificando glioxilato carboligase; e

- a expressão do gene yccM que codifica uma glioxilato redutase endógena dependente de NADPH, a qual catalisa a conversão de glioxilato em glicolato é aumentada na referida cepa de E. coli.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a expressão dos seguintes genes envolvidos no metabolismo do glicolato é atenuada, de modo que a cepa de E. coli não seja capaz de metabolizar o glicolato • glcDEF que codifica a glicolato oxidase; e • aldA codificando a glicoaldeido desidrogenase.

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3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a expressão do gene iclR é atenuada.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o edd codificando a fosfogluconato desidratase é atenuado, de modo a aumentar a disponibilidade de NADPH e em que a expressão de eda que

codifica 2-ceto-3-desoxigluconato 6-fosfato aldolase é atenuada, de modo a atenuar a conversão de glioxilato em produtos que não o glicolato. 5. Método, de acordo com a reivindicação

caracterizado pelo fato de que a expressão de pgi que codifica a glicose-6-fosfato isomerase é atenuada, de modo a aumentar a disponibilidade de NADPH.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a expressão de udhA que codifica a transhidrogenase solúvel é atenuada, de modo a aumentar a disponibilidade de NADPH.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a fonte de carbono é pelo menos uma. das seguintes* glicose, sacarose, mono- ou oligossacarideos, amido ou seus derivados ou glicerol.

8. Método, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo faro de que o glicolato é isolado através de uma etapa de polimerizaçào para pelo menos dímeros de glicolato.

9. Método, de acordo com. a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o glicolato é recuperado por despolimerização a partir de dímeros de glicolato, oligômeros e / ou polímeros.

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10. Cepa de E. coli produzindo ácido glicólico por cultivo em um meio de cultura apropriado caracterizada pelo fato de que é cultivada em um meio de cultura contendo uma fonte de carbono, sendo a referida cepa •geneticamente modificada para (i) atenuar a conversão de glioxilato em outros produtos que não glicolato e (ii) catalisar a conversão de glioxilato a glicolato, sendo as referidas modificações genéticas as seguintes:

- (i) atenuação da expressão dos seguintes genes:

• aceB codificando malato sintase;

• glcB codificando a segunda malato sintase; e • gel codificando a glioxilato carboligase; e

- (ii) aumento na expressão do gene ycdW que codifica uma glioxilato redutase endógena dependente de NADPH.

11. Cepa de E. Coli, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a expressão dos seguintes genes envolvidos no metabolismo de glicolato é atenuada na referida cepa, de modo que não seja capaz de metabolizar o glicolato • glcDEF codificando a glicolato oxidase; e • aldA codificando a glicoaldeído desidrogenase

12. Cepa de E. Coli, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a expressão do gene iclR é atenuada na referida cepa.

13. Cepa de E. Coli, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o edd que codifica a fosfogluconato desidratase é atenuado, de modo a aumentar a disponibilidade de NADPH e em que a expressão de eda que codifica 2-ceto-3-desoxigluconato 6-fosfato aldola.se é atenuada, de modo a atenuar a conversão de glioxilato em produtos que não o glicolato.

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14. Cepa de E. coli ,de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a expressão de pgi que codifica a glicose-6-fosfato isomerase é atenuada, de modo a aumentar a disponibilidade de NADPH.

15. Cepa de E. Coli, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a expressão de udhA que codifica a. transhidrogenase solúvel é atenuada, de modo a aumentar a disponibilidade de NADPH.

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BsrBI(6762) \

' — \ \

EcoRV (47)

ZW(5182)

Ρν«Π(6448)

Sfol (6396) \

Ρν«Π(6355)

EcoRV (6205)

Apal (5966)

Bs/BI (830)

Smal (1034)

BawHI(1037)

ÁfoI(1043)

Psd(1059) //úidlll (1067) ξ ψόΙ(1346) \ V/ni(1491) ξ Psil (1650) Psil (2008)

4gel(318) ycdW

J/indin (569)

β.$7Ζ17Ι (5102)

BspHI (5009)

Bgll (4686)
5ψΗΙ(4054)

Bgll (3580) pME101-ycdW

6790 Pb

Sp

Ndel (2902)

FIGURA 2