CN102341502B

CN102341502B - 用于制备二醇的方法

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Publication number: CN102341502B
Application number: CN200980157747.5A
Authority: CN
Inventors: P.苏凯尔; C.伯伊萨特
Original assignee: Metabolic Explorer SA
Current assignee: Metabolic Explorer SA
Priority date: 2008-12-31
Filing date: 2009-12-29
Publication date: 2015-07-01
Anticipated expiration: 2029-12-29
Also published as: EP2379730A1; US9121041B2; MX2011007039A; CN102341502A; ES2549003T3; BRPI0923748A2; KR101827230B1; JP5774493B2; US20110294178A1; PT2379730E; KR20110117131A; EP2379730B1; KR20170049612A; BRPI0923748B1; JP2012513760A; WO2010076324A1

Abstract

本发明涉及用于生物制备二醇的新颖方法，包括培养经遗传修饰以供生物产生脂族二醇的微生物，其中所述微生物包含用具有2-酮酸脱羧酶活性的酶对羟基-2-酮基脂族酸代谢物脱羧的代谢途径，从所述脱羧步骤获得的产物进一步还原为相应的脂族二醇，且其中所述微生物经遗传修饰以供改善所述羟基-2-酮基脂族酸代谢物的产生。本发明还涉及用于产生脂族二醇的经修饰的微生物。

Description

用于制备二醇的方法

本发明涉及用于生物制备二醇的新方法，包括培养经遗传修饰以供生物产生脂族二醇的微生物，其中所述微生物包含用两种酶对羟基-2-酮基脂族酸代谢物脱羧的代谢途径：具有2-酮酸脱羧酶活性的酶和具有羟基醛还原酶活性的酶。本发明还涉及经修饰以供产生脂族二醇的微生物。

背景技术

通过培养产生二醇的微生物而发酵产生此类二醇在本领域是已知的，包括用经遗传修饰以供改善二醇产生的微生物进行的发酵产生。此类二醇的产生描述于下述文献：WO1996/035796、WO2001/012833、WO2004/033646、US7267972及其他。具体而言，已描述了1，3-丙二醇的产生，其涉及维生素B12依存性酶，从而使得生产工艺非常昂贵。

当下对经修饰以从可再生碳源产生二醇和/或对二醇的产生有潜在的促进，特别是具有维生素B12非依存性途径的微生物的备选方案有需求。这些技术改进可在于基于此种产生所必需的能量所产生的产物的总体产率，和最终地，在于为了分离所述产物以及产物的销售和其他用途而有待特别控制的杂质和副产物的水平。

发明内容

本发明涉及经遗传修饰以供生物产生脂族二醇的微生物，其中所述微生物包含供用具有2-酮酸脱羧酶活性的酶对羟基-2-酮基-脂族酸进行脱羧的代谢途径，用具有羟基醛还原酶活性的酶将从所述脱羧步骤获得的产物进一步还原为相应的脂族二醇，且其中所述微生物经遗传修饰以供改善所述羟基-2-酮基脂族酸代谢物的产生。

本发明的微生物一般选自下组：细菌、酵母和真菌。优选地，所述微生物选自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)和棒杆菌科(Corynebacteriaceae)。

依照第一个实施方案所述微生物包含编码2-酮酸脱羧酶活性的内源基因。其优选选自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Pdc1，Pdc5，Pdc6，Aro10，Thi3)；乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(Kivd)；丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)(Pdc)；拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Pdc2，Pdc3)；树干毕赤酵母(Pichia stipitis)(Pdc1，Pdc2，Aro10)；运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)(Pdc)；结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。该具有内源2-酮酸脱羧酶活性的微生物可进一步修饰以增强编码2-酮酸脱羧酶的内源基因的表达。

根据本发明的另一个实施方案，所述微生物并不包含编码2-酮酸脱羧酶的内源基因。此种缺乏内源2-酮酸脱羧酶的微生物优选选自大肠杆菌(Escherichia coli)或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。对于此类微生物，本发明的微生物包含编码2-酮酸脱羧酶的异源基因。

根据另一个实施方案，所述微生物包含编码羟基醛还原酶活性的内源基因。其优选选自大肠杆菌(yqhD，fucO，dkgA，dkgB)；酿酒酵母(ADH1，ADH2，...)；和所有具有至少一种具有醛还原酶活性或醇脱氢酶活性的酶的生物。该具有内源羟基醛还原酶活性的微生物可进一步经修饰以增强编码羟基醛还原酶的内源基因的表达。

用本发明的微生物产生的脂族二醇是具有包含2至6个碳原子，优选2、3或4个碳原子的直链或支化的烷基链的脂族二醇。

在一个优选实施方案中，所述脂族二醇是乙二醇，而所述羟基-2-酮基脂族酸代谢物是羟基丙酮酸。

在另一个优选实施方案中，所述脂族二醇是1，3-丙二醇，而所述羟基-2-酮基脂族酸代谢物是4-羟基-2-酮基丁酸。

在另一个优选实施方案中，所述脂族二醇是1，4-丁二醇，而所述羟基-2-酮基脂族酸代谢物是5-羟基-2-酮基戊酸。

本发明还涉及用于生物产生脂族二醇的方法，包括下述步骤：

-在包含碳源的适当培养基上培养如上和如下所述的本发明的微生物，和

-从培养基回收所述脂族二醇。

根据本发明的优选实施方案，所述二醇经进一步纯化。

发明详述

微生物

本发明的微生物是经遗传修饰或遗传工程改造的微生物。这表明，根据这些术语的通常含意，本发明的微生物并不见于自然界，而是通过导入或通过缺失新遗传元件(genetic element)来修饰。其亦可通过在特定选择压力下组合定点诱变和进化迫使新代谢途径的发展和进化而受转化(参见，例如WO2004/076659)。

根据本发明，术语“微生物”指细菌、酵母或真菌。优选地，所述微生物选自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)和棒杆菌科(Corynebacteriaceae)。更优选地，所述微生物是埃希氏菌属(Escherichia)、梭菌属(Clostridium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pantoea)、沙门氏菌属(Salmonella)或棒杆菌属(Corynebacterium)的菌种。甚至更优选地，所述微生物是菌种大肠杆菌(Escherichia coli)或谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)或丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)或枯草芽孢杆菌。

如果外源基因与所有允许其在宿主微生物中表达的元件一同导入微生物，所述微生物可表达这些外源基因。用外源DNA转化微生物对于本领域技术人员是常规工作。

外源基因可整合入宿主基因组，或通过质粒或载体在染色体外表达。不同类型的质粒对于本领域技术人员是已知的，其在复制起点及其细胞内拷贝数方面有所不同。

用于控制基因表达的重要元件为启动子。在本发明一个优选实施方案中，可使用不同强度的启动子表达基因，所述启动子可为诱导型的。这些启动子可为同源的或异源的。本领域技术人员知道如何选择最为便利的启动子，例如启动子Ptrc、Ptac、Plac或lambda启动子cI被广泛使用。

在具体实施方案中，内源基因亦可经修饰以调制(modulate)其表达和/或活性，其通过在编码序列中导入突变以修饰基因产物或通过导入异源序列附加至内源调节元件或取代内源调节元件来进行。内源基因的调制可有两种方式：一方面，上调和/或增强基因产物的活性；或者另一方面，下调和/或降低内源基因产物的活性。

根据本发明术语“基因的减弱”表示对基因表达的部分或完全阻遏(suppression)，从而所述基因称为“被减弱的”。该对表达的阻遏可为基因表达的抑制，基因表达所需的启动子区的全部或部分的缺失，基因编码区中的缺失，或用较弱的天然或合成启动子替代野生型的启动子。优选地，基因的减弱基本上为该基因的完全缺失，其可由促进本发明的菌株的鉴定、分离和纯化的选择性标记基因所取代。优选通过同源重组技术使基因失活(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.(2000)“One-step inactivation of chromosomal genes inEscherichia coli K-12using PCR products”.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：6640-6645)。

在本发明的其他实施方案中，亦可将内源序列敲除(knocked out)或缺失，以偏向所述新代谢途径。

所有用于转化微生物的技术，以及用于增强本发明蛋白质产生所用的调节元件在本领域中是公知的，并可从文献中获得，所述文献包括申请人自己关于在多种微生物中修饰生物合成途径的专利申请，包括WO 2008/052973、WO 2008/052595、WO 2008/040387、WO 2007/144346、WO 2007/141316、WO 2007/077041、WO 2007/017710、WO 2006/082254、WO 2006/082252、WO 2005/111202、WO 2005/073364、WO 2005/047498、WO 2004/076659，其内容通过提述并入本文。

基因和酶活性

在本发明的描述中，酶活性亦通过引用编码具有此种活性的酶的基因来命名。除非另行提及，基因和蛋白质一般使用来自大肠杆菌的基因的命名法来鉴定。然而，根据本发明，这些命名法的使用具有更加一般性的含意，并涵盖其他生物，更特别是微生物中，所有相应的基因和蛋白质，所述基因和蛋白质的功能性同源物、功能性变体和功能性片段。

在本申请中鉴定的基因及其登录号列于图4。

使用用于已知酶活性的IUBMB酶命名作为参考，本领域技术人员能够确定其他生物、细菌菌种、酵母、真菌等中的相同酶活性。该常规工作有利地使用共有序列完成，所述共有序列可通过与来源于其他微生物的蛋白质实施序列比对来确定。

用于确定两个蛋白质序列之间同源性百分比的方法对于本领域技术人员是已知的。举例而言，其可在使用可从网站http://www.ebi.ac.uk/clustalw/获得的CLUSTALW软件用该网站上指示的缺省参数进行序列比对之后完成。根据该比对，通过记录与总残基数比较的在相同位置处相同残基的数目，可容易地进行对同一性百分比的计算。或者，可使用例如可从网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/获得的BLAST程序用该网站上指示的缺省参数来进行自动计算。

PFAM(隐蔽马尔科夫模型和比对的蛋白家族数据库http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)代表蛋白序列比对的大集合。每个PFAM使得显现多重比对，观察蛋白质结构域，衡量生物之间的分布，访问其他数据库和显现已知蛋白的结构成为可能。

COG(蛋白质的直向同源组的簇；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)是通过比较来自代表30个主要系统发生谱系的66个经完整测序的基因组的蛋白序列而获得的。每个COG由至少三个谱系限定，其允许鉴定古老的保守域。

与所引用蛋白质分享同源性的蛋白质可从其他微生物获得或为天然蛋白质的变体或功能性片段。

术语“功能性变体或功能性片段”意指所述多肽的氨基酸序列可能并不严格地限于自然界中观察到的序列，而是可以含有其他氨基酸。术语“功能性片段”意指所述多肽的序列可包括少于原始序列的氨基酸，但仍旧包括足以赋予参照的原始序列的酶活性的氨基酸。在本领域公知多肽可通过取代、插入、缺失和/或添加一个或多个氨基酸来修饰同时保留其酶活性。举例而言，在给定位置将一个氨基酸用化学上等同而不影响蛋白质功能性质的氨基酸取代是常见的。就本发明而言，取代定义为下述组之一内部的交换：

■小脂族、非极性或略带极性的残基：Ala、Ser、Thr、Pro、Gly

■极性、荷负电残基及其酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln

■极性、荷正电残基：His、Arg、Lys

■大脂族、非极性残基：Met、Leu、Ile、Val、Cys

■大芳族残基：Phe、Tyr、Trp。

可预期导致一种荷负电残基取代另一种(如谷氨酸取代天冬氨酸)或一种荷正电残基取代另一种(如赖氨酸取代精氨酸)的变化产生功能性等同产物。

氨基酸序列中氨基酸修饰的位置和受修饰氨基酸的数量并无具体限制。本领域技术人员能够知道可导入而不影响蛋白质活性的修饰。举例而言，可预期在蛋白质N端或C端部分中的修饰在某些情况下并不改变蛋白质的活性。

术语“变体”指受到例如上文所定义的修饰而仍旧保留原始酶活性的多肽。

术语“编码(encoding或coding)”指多核苷酸通过转录和翻译机制产生氨基酸序列的过程。该过程基于遗传密码，遗传密码为DNA中碱基序列和蛋白质中氨基酸序列之间的关系。遗传密码的一个主要特征是其简并性，意指一个氨基酸可由多于一个碱基三联体(一个“密码子”)所编码。其直接后果是相同的氨基酸序列可由不同的多核苷酸所编码。本领域技术人员公知密码子的使用可根据生物而变化。在编码相同氨基酸的密码子中，给定微生物可优选地使用其中一些。因此，设计适应于特定微生物的密码子选择以优化相应的蛋白质在该生物中的表达可能是有利的。

在一些情况下，基因或酶可由其活性的名称所命名。在一些其他情况下，根据“活性”的命名可意指两种或多种组合时具有所需活性的酶的组合。在此种情况下，该组合中的每个酶可由在不同调节元件的控制下的不同基因，或由在相同操纵子控制下的基因组合所编码。

编码2-酮酸脱羧酶活性的基因在本领域是公知的，包括来自不同物种的Pdc基因，且更具体而言为来自酿酒酵母的Pdc1、Pdc5、Pdc6、Aro10和Thi3基因，来自乳酸乳球菌的kivD基因；来自丙酮丁醇梭菌的pdc基因；来自拟南芥的Pdc2和Pdc3基因；来自树干毕赤酵母的Pdc1、Pdc2和Aro10基因；来自运动发酵单胞菌的pdc基因。由来自大肠杆菌的基因sucA编码的2-酮戊二酸脱羧酶复合物的第一个亚基亦具有2-酮酸脱羧酶活性，由大肠杆菌的基因dxs编码的酶亦如此。本定义涵盖所述基因和蛋白质的功能性同源物、功能性变体和功能性片段。

编码羟基醛还原酶活性的基因在本领域亦为公知的，包括来自大肠杆菌的yqhD、fucO、dkgA、dkgB基因和来自酿酒酵母的ADH1和ADH2基因。本定义涵盖所述基因和蛋白质的功能性同源物、功能性变体和功能性片段。

发酵产生

本发明还涉及脂族二醇的发酵产生，包括下述步骤：

-在包含碳源的适当培养基上培养微生物，和

-从培养基回收所述脂族二醇。

所述发酵一般在发酵罐中用适应于所用微生物、含有至少一种简单碳源以及若需要还含有共底物的适当培养基进行。

“适当培养基”表示包含对细胞生长和/或维持必需或有益的营养的培养基(例如无菌的液体培养基)，所述营养如碳源或碳底物，氮源例如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵和磷酸铵；磷源例如磷酸单钾(monopotassium phosphate)或磷酸二钾(dipotassiumphosphate)；微量元素(例如金属盐)，例如镁盐、钴盐和/或锰盐；以及生长因子如氨基酸、维生素、生长促进剂(growth promoter)等。

作为用于大肠杆菌的已知培养基的实例，所述培养基可与M9培养基(Anderson，1946，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 32：120-128)、M63培养基(Miller，1992；A Short Course in Bacterial Genetics：A Laboratory Manual and Handbookfor Escherichia coli and Related Bacteria，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)或与如由Schaefer等所定义的培养基(1999，Anal.Biochem.270：88-96)具有相同或类似组成。

作为用于谷氨酸棒杆菌的培养基的另一个实例，所述培养基可为与BMCG培养基(Liebl等，1989，AppI.Microbiol.Biotechnol.32：205-210)或如Riedel等所述的培养基(2001，J.Mol.Microbiol.Biotechnol.3：573-583)具有相同或类似组成。

根据本发明，术语“碳源(carbon source或source of carbon)”或“碳底物”指任何可由本领域技术人员用于支持微生物正常生长的碳源，包括己糖(如葡萄糖、半乳糖或乳糖)，戊糖，单糖，二糖，寡糖(如蔗糖、纤维二糖或麦芽糖)，糖蜜，淀粉或其衍生物，半纤维素，甘油，及其组合。特别优选的简单碳源是葡萄糖。另一个优选的简单碳源是蔗糖。

在本发明的一些实施方案中，所述培养基包含碳源，所述碳源是另一个使用生物质作为起始材料的过程的副产物，或是最终机械和/或化学和/或酶以及在这些情况下体外或体内的生物质降解如纤维素降解的产物。

有利地选取和/或修饰本发明的微生物以使用所述碳源作为生长于培养基上的唯一碳源。

选用于在特定碳源上生长的微生物在本领域是已知的，在微生物中为了使其在所述特定碳源上生长而待导入的修饰也是已知的。

本领域技术人员能够限定用于本发明的微生物的培养条件。具体而言细菌在20℃至55℃的温度发酵，优选25℃至40℃，且更具体而言对于谷氨酸棒杆菌为约30℃而对于大肠杆菌为约37℃。

从培养基回收脂族二醇对于本领域技术人员是常规工作。

在本发明的一个方面，进一步纯化回收的脂族二醇。

用于从培养基回收二醇及其纯化的方法在本领域是已知的，并公开于下述文献：提交于2008年10月3日的PCT/EP2008/063287和提交于2007年11月30日的PCT/EP2007/063068，以及其他。

具体实施方式

本发明的其他实施方案将如下所述。修饰微生物以偏好羟基-2-酮基-脂族酸代谢物的产生，并将从同一羟基-2-酮基-脂族酸代谢物的脱羧步骤获得的产物转化为相应的脂族二醇。

下述描述针对大肠杆菌，该微生物缺乏内源2-酮酸脱羧酶活性。因此，将编码该活性的异源基因导入该微生物。

将该微生物修饰以优化用于产生羟基-2-酮基脂族酸代谢物的途径并将从同一羟基-2-酮基脂族酸代谢物的脱羧步骤获得的产物转化为脂族二醇亦基于大肠杆菌已知的代谢途径和内源基因完成。然而，本领域技术人员可使用类似策略在其他具有已知基因和途径的微生物中导入或缺失相应基因。

I.乙二醇的制备

本发明的乙二醇产生的生物合成途径包含三个酶反应，始于3-磷酸羟基丙酮酸前体(丝氨酸的前体)的转化。首先，磷酸酶活性使磷酸羟基丙酮酸可以转化为羟基丙酮酸。然后羟基丙酮酸由2-酮酸脱羧酶活性转化为羟乙醛。最终羟基醛还原酶活性使羟乙醛可以转化为乙二醇。另一种用于产生乙二醇的途径以L-丝氨酸作为前体而起始。首先转氨酶或氨基酸氧化酶活性使得丝氨酸可以转化为羟基丙酮酸。接下来两个步骤类似于上述第一途径。

全局的生物合成途径表示于图1。

本发明提供了一种用于发酵产生乙二醇、其衍生物或前体的方法，包括：在包含碳源的适当培养基中培养微生物特别是细菌，并从所述培养基回收乙二醇。

在一个优选实施方案中，所述方法用含有至少一种编码具有2-酮酸脱羧酶活性的多肽的基因和一种编码具有羟基醛还原酶活性的多肽的基因的微生物特别是细菌进行。这些基因可为外源的或内源的，且可在染色体上或在染色体外表达。

在本发明另一个实施方案中，所述方法用其中中间产物3-磷酸甘油酸的利用度增加的微生物特别是细菌进行。优选地，该增加是通过减弱编码磷酸甘油酸变位酶的基因特别是基因gpmA和pgmI之一或二者的表达水平来取得的。这可通过用较弱启动子取代这些基因的野生型启动子，或通过使用使相应的信使RNA或蛋白质不稳定的元件来完成。若需要，亦可通过缺失相应的DNA序列来达成基因的完全减弱。本发明亦涉及用于本发明该具体实施方案的微生物，即呈现3-磷酸甘油酸利用度增加的微生物特别是细菌，具体而言为其中编码磷酸甘油酸变位酶的基因的表达，优选为基因gpmA和pgmI之一或二者的表达减弱的微生物，优选细菌。

在另一个实施方案中，所述方法是用其中流向丝氨酸生物合成途径受刺激的微生物特别是细菌进行的。这可通过增加分别由serA和serC基因编码的3-磷酸甘油酸脱氢酶和/或磷酸丝氨酸氨基转移酶的表达水平来达成。3-磷酸甘油酸脱氢酶和/或磷酸丝氨酸氨基转移酶表达水平的增加可通过导入驱动所述serA和/或serC基因表达的人工启动子，通过增加细胞中的拷贝数或通过将增加相应蛋白质活性的突变导入所述serA和/或serC基因来达成。serA基因的表达亦可通过用lrp突变的等位基因(如对应于lrp蛋白质中GLU114ASP取代的lrp-1等位基因)替代野生型lrp基因(编码亮氨酸应答性调节蛋白)从而导致serA基因转录的组成型激活来增加。本发明亦涉及用于本发明该具体实施方案中的微生物，特别是细菌。

在本发明的具体实施方案中，可将减少SerA蛋白对反馈抑制剂丝氨酸的敏感度从而允许在丝氨酸存在下的活性增加的突变(反馈脱敏等位基因)导入所述serA基因。脱敏等位基因，即反馈不敏感等位基因的实例已描述于EP 0931833(Ajinomoto)或EP 0620853(Wacker)。

在另一个实施方案中，所述方法用其中流向羟基丙酮酸生物合成途径受刺激的微生物特别是细菌进行。该结果可通过增加丝氨酸转氨酶或丝氨酸氧化酶(对于以丝氨酸作为前体起始的途径)表达水平，或通过增加3-磷酸羟基丙酮酸磷酸酶的表达来达成。增加丝氨酸氧化酶的表达水平可通过导入并过表达来自混浊红球菌(R.opacus)的编码L-氨基酸氧化酶的基因，或通过将增加相应蛋白质活性的突变导入所述基因来达成。丝氨酸转氨酶表达的增加可通过导入驱动大肠杆菌的serC基因的表达的人工启动子，通过增加细胞中的拷贝数或通过将增加相应蛋白质活性的突变导入所述serC基因来达成。3-磷酸羟基丙酮酸磷酸酶表达的增加可通过导入驱动大肠杆菌的yeaB基因或serB基因的表达的人工启动子，通过增加细胞中的拷贝数或通过将增加相应蛋白质活性的突变导入所述yeaB基因或serB基因来达成。3-磷酸羟基丙酮酸磷酸酶表达的增加亦可通过导入并过表达来自酿酒酵母的基因GPP2或通过将增加相应蛋白质活性的突变导入GPP2基因来达成。本发明亦涉及用于本发明该具体实施方案中的微生物，特别是细菌。

在本发明的另一个实施方案中，修饰所述微生物特别是细菌以呈现丝氨酸向除了乙二醇之外的其他化合物的转化水平的减弱。该结果可通过减弱消耗丝氨酸的酶像丝氨酸脱氨酶(由sdaA和sdaB和tdcG编码)、丝氨酸转乙酰酶(由cysE编码)、色氨酸合酶(由trpAB编码)或丝氨酸羟甲基转移酶(由glyA编码)的水平来达成。这些基因可通过用使相应的信使RNA或蛋白质不稳定化的元件或用较低强度的启动子取代天然启动子来减弱。若需要，基因的完全减弱亦可通过缺失相应的DNA序列来达成。本发明亦涉及用于本发明该具体实施方案的微生物特别是细菌。

在本发明的另一个实施方案中，修饰所述微生物特别是细菌以呈现羟基丙酮酸向除了羟乙醛以外的其他化合物转化水平的减弱。该结果可通过减弱消耗羟基丙酮酸的酶像羟基丙酮酸还原酶(由ghrA编码)或羟基丙酮酸异构酶(由hyi编码)的水平来达成。这些基因可通过用较低强度的启动子或使相应的信使RNA或蛋白质不稳定化的元件替代天然启动子来减弱。若需要，所述基因的完全减弱亦可通过缺失相应的DNA序列来达成。本发明亦涉及用于本发明该具体实施方案的微生物，特别是细菌。

在本发明的另一个实施方案中，修饰所述微生物特别是细菌以呈现羟乙醛向除了乙二醇以外的其他化合物转化水平的减弱。该结果可通过减弱消耗羟乙醛的酶像羟基苏氨酸醛缩酶(由ltaE编码)或羟乙醛脱氢酶(由aldA、aldB编码)的水平来达成。这些基因可通过用较低强度的启动子或使相应的信使RNA或蛋白质不稳定化的元件替代天然启动子来减弱。若需要，所述基因的完全减弱亦可通过缺失相应的DNA序列来达成。本发明亦涉及用于本发明该具体实施方案的微生物，特别是细菌。

在本发明的一个方面，通过使用不依赖于磷酸烯醇丙酮酸(PEP)作为磷供体的糖输入系统，像已知转运葡萄糖的galP，或通过向糖-磷酸转移酶系统提供更多的磷酸烯醇丙酮酸(PEP)增加了糖输入的效率。存在多种可用于在微生物中增加PEP利用度的手段。具体而言，这可通过减弱反应PEP→丙酮酸来达成。优选地，在所述菌株中减弱至少一种选自pykA和pykF的编码丙酮酸激酶的基因以获得该结果。另一种增加PEP利用度的方式是偏好反应丙酮酸→PEP。这可通过增加催化上述反应的磷酸烯醇丙酮酸合酶的活性来达成。该酶由ppsA基因编码。因此，在微生物中，优选增加ppsA基因的表达。两种修饰均可同时存在于微生物中。

II.1，3-丙二醇的制备

本发明的产生1，3-丙二醇的生物合成途径包含三个酶反应，始于L-高丝氨酸前体(从L-天冬氨酸获得)的转化。首先，高丝氨酸转氨酶或高丝氨酸氧化酶活性使L-高丝氨酸可以转化为4-羟基-2-酮基丁酸(4-hydroxy-2-ketobutyrate)。其次2-酮酸脱羧酶活性使得4-羟基-2-酮基丁酸可以转化为3-羟基丙醛。然后用羟基醛还原酶活性使3-羟基丙醛转化为1，3-丙二醇。

全局的生物合成途径表示于图2。

本发明提供了一种用于发酵产生1，3-丙二醇、其衍生物或前体的方法，包括：在包含碳源的适当培养基中培养微生物特别是细菌，并从所述培养基回收1，3-丙二醇。

在另一个实施方案中，所述方法是用其中流向草酰乙酸生物合成途径受刺激的微生物特别是细菌进行的；该结果可通过增加由ppc基因编码的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的表达水平来达成。磷酸烯醇丙酮酸羧化酶表达的增加可通过导入驱动所述ppc基因表达的人工启动子，通过增加细胞中的拷贝数或通过将增加相应蛋白质活性的突变导入所述ppc基因来达成。中间产物草酰乙酸的利用度亦可通过减弱分别由pckA和/或maeA和/或maeB基因编码的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和/或苹果酸酶的基因的表达水平来增加。这可通过用较弱启动子替代这些基因的野生型启动子，或通过使用使相应的信使RNA或蛋白质不稳定化的元件来完成。若需要，基因的完全减弱亦可通过缺失相应的DNA序列来达成。本发明亦涉及用于本发明该具体实施方案中的微生物特别是细菌，即呈现草酰乙酸利用度增加的微生物特别是细菌。

在另一个实施方案中，所述方法用其中流向高丝氨酸生物合成途径受刺激的微生物特别是细菌进行。这可通过增加分别由thrA和asd基因编码的天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶和/或天冬氨酸半醛脱氢酶的表达来达成。增加天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶和/或天冬氨酸半醛脱氢酶的表达可通过导入驱动所述thrA和/或asd基因的表达的人工启动子，通过增加细胞中的拷贝数或通过将增加相应蛋白质活性的突变导入所述thrA和/或asd基因来达成。本发明亦涉及用于本发明该具体实施方案中的微生物特别是细菌。

在本发明的一个具体实施方案中，可将降低thrA基因对反馈抑制剂苏氨酸的敏感性的突变(反馈脱敏等位基因)导入所述thrA基因，并因此在苏氨酸存在下允许活性增加。

在另一个实施方案中，所述方法用其中流向4-羟基-2-酮基丁酸生物合成途径受刺激的微生物特别是细菌进行。该结果可通过增加高丝氨酸转氨酶或高丝氨酸氧化酶的表达来达成。增加高丝氨酸氧化酶的表达可通过导入并过表达来自混浊红球菌(R.opacus)的编码L-氨基酸氧化酶的基因，或通过将增加相应蛋白质活性的突变导入所述基因来达成。增加高丝氨酸转氨酶表达水平可通过导入驱动大肠杆菌的serC基因的表达的人工启动子，通过增加细胞中的拷贝数或通过将增加相应蛋白质活性的突变导入所述serC基因来达成。本发明亦涉及用于本发明该具体实施方案中的微生物特别是细菌。

在本发明的另一个实施方案中，修饰所述微生物特别是细菌以呈现高丝氨酸向除了1，3-丙二醇之外的其他化合物的转化水平的减弱。该结果可通过减弱消耗高丝氨酸的酶像高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶(由thrB和thrC编码)、高丝氨酸O-转琥珀酰酶(由metA编码)、或二氢吡啶二羧酸合酶(由dapA编码)的水平来达成。这些基因可通过用使相应的信使RNA或蛋白质不稳定化的元件或用较弱的启动子取代天然启动子来减弱。若需要，基因的完全减弱亦可通过缺失相应的DNA序列来达成。本发明亦涉及用于本发明该具体实施方案的微生物特别是细菌。

在本发明的另一种实施方案中，修饰所述微生物特别是细菌以呈现3-羟基丙醛向除了1，3-丙二醇以外的其他化合物转化水平的减弱。该结果可通过减弱消耗3-羟基丙醛的酶像3-羟基丙醛脱氢酶(由aldA、aldB编码)的水平来达成。这些基因可通过用使相应的信使RNA或蛋白质不稳定化的元件或用较低强度的启动子替代天然启动子来减弱。若需要，所述基因的完全减弱亦可通过缺失相应的DNA序列来达成。本发明亦涉及用于本发明该具体实施方案的微生物特别是细菌。

在本发明的一个方面，通过使用不依赖于磷酸烯醇丙酮酸(PEP)作为磷供体的糖输入系统，像已知转运葡萄糖的galP编码的系统，或通过向糖-磷酸转移酶系统提供更多的磷酸烯醇丙酮酸(PEP)增加了糖输入的效率。存在多种可用于在微生物中增加PEP利用度的手段。具体而言，这可通过减弱反应PEP→丙酮酸来达成。优选地，在所述菌株中减弱至少一种选自pykA和pykF的编码丙酮酸激酶的基因以获得该结果。另一种增加PEP利用度的方式是偏好反应丙酮酸→PEP。这可通过增加催化上述反应的磷酸烯醇丙酮酸合酶的活性来达成。该酶由ppsA基因编码。因此，在微生物中，优选增加ppsA基因的表达。两种修饰均可同时存在于微生物中。

III.1，4-丁二醇的制备

本发明的产生1，4-丁二醇的生物合成途径包含五个酶反应，始于2-酮戊二酸前体(三羧酸循环的代谢物)的转化。

首先，4-酮戊二酸单酰CoA合成酶(4-oxoglutaryl-CoA synthetase)活性使2-酮戊二酸可以转化为4-酮戊二酸单酰CoA。然后通过两种活性的组合将该化合物转化为5-羟基-2-酮基戊酸，首先为醛脱氢酶，其次为醇脱氢酶，两者均由丙酮丁醇梭菌的基因adhE2或大肠杆菌的基因adhE编码。然后2-酮酸脱羧酶活性使得5-羟基-2-酮基戊酸可以转化为4-羟基丁醛，其依赖于羟基醛还原酶活性进一步转化为1，4-丁二醇。

全局的生物合成途径表示于图3。

本发明提供了一种用于发酵产生1，4-丁二醇、其衍生物或前体的方法，包括：在包含碳源的适当培养基中培养微生物特别是细菌，并从所述培养基回收1，4-丁二醇。

在另一个实施方案中，所述方法是用其中流向草酰乙酸生物合成途径受刺激(进入三羧酸循环)的微生物特别是细菌进行的。这可通过增加由ppc基因编码的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的表达来达成。增加磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的表达可通过导入驱动所述ppc基因表达的人工启动子，通过增加细胞中的拷贝数或通过将增加相应蛋白质活性的突变导入所述ppc基因来达成。中间产物草酰乙酸的利用度亦可通过减弱分别由pckA和/或maeA和/或maeB基因编码的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和/或苹果酸酶的基因的表达水平来增加。这可通过用较弱启动子替代这些基因的野生型启动子，或通过使用使相应的信使RNA或蛋白质不稳定化的元件来完成。若需要，基因的完全减弱亦可通过缺失相应的DNA序列来达成。本发明亦涉及用于本发明该具体实施方案中的微生物特别是细菌，即呈现2-酮戊二酸利用度增加的微生物特别是细菌。

在另一个实施方案中，所述方法用其中流向2-酮戊二酸生物合成途径受刺激的微生物特别是细菌进行。这可通过增加分别由gltA和icd基因编码的柠檬酸合酶和/或异柠檬酸脱氢酶的表达来达成。增加柠檬酸合酶和/或异柠檬酸脱氢酶的表达可通过导入驱动所述gltA和/或icd基因的表达的人工启动子，通过增加细胞中的拷贝数或通过将增加相应蛋白质活性的突变导入所述gltA和/或icd基因来达成。异柠檬酸脱氢酶的活性通过由AceK催化的磷酸化或脱磷酸化反应来调制。磷酸化减少Icd的活性而脱磷酸化重新激活Icd酶。因此，Icd酶的活性亦通过导入与野生型AceK酶相比具有减少的激酶活性或增加的磷酸酶活性的突变体aceK基因来控制。AceK活性的水平亦可通过减弱所述aceK基因的表达来减少。这可通过用较弱启动子替代该基因的野生型启动子，或通过使用使相应的信使RNA或蛋白质不稳定化的元件来完成。若需要，基因的完全减弱亦可通过缺失相应的DNA序列来达成。中间产物2-酮戊二酸的利用度亦可通过减弱分别由sucAB或sucCD和/或aceA或aceB基因编码的2-酮戊二酸脱羧酶或琥珀酰CoA合成酶和/或异柠檬酸裂合酶或苹果酸合酶的基因的表达来增加。这可通过用较弱启动子替代这些基因的野生型启动子，或通过使用使相应的信使RNA或蛋白质不稳定化的元件来完成。向三羧酸循环的流动亦可通过减弱对阻遏编码三羧酸循环的基因的ArcA的阻遏(由arcA基因编码)来增加。本发明亦涉及用于本发明该具体实施方案中的微生物特别是细菌，即呈现2-酮戊二酸利用度增加的微生物特别是细菌。

在另一个实施方案中，所述方法用其中流向5-羟基-2-酮基戊酸生物合成途径受刺激的微生物特别是细菌进行。这可通过增加4-酮戊二酸单酰CoA合成酶(产生AMP的，如由prpE基因编码的；或产生ADP的，如由sucC和sucD基因编码的)和/或醛还原酶/醇脱氢酶的表达来达成。本发明亦涉及用于本发明该具体实施方案中的微生物特别是细菌。

在本发明的另一个实施方案中，修饰所述微生物特别是细菌以呈现2-酮戊二酸向除了1，4-丁二醇之外的其他化合物的转化水平的减弱；这可通过减弱消耗2-酮戊二酸的酶像谷氨酸脱氢酶或谷氨酸合酶(由gdhA和gltB编码)的水平来达成。这些基因可通过用使相应的信使RNA或蛋白质不稳定化的元件或用较弱的启动子取代天然启动子来减弱。若需要，基因的完全减弱亦可通过缺失相应的DNA序列来达成。本发明亦涉及用于本发明该具体实施方案的微生物特别是细菌。

在本发明的另一种实施方案中，修饰所述微生物特别是细菌以呈现4-羟基丁醛向除了1，4-丁二醇以外的其他化合物转化水平的减弱。这可通过减弱消耗4-羟基丁醛的酶像4-羟基丁醛脱氢酶(由aldA、aldB编码)的水平来达成。这些基因可通过用使相应的信使RNA或蛋白质不稳定化的元件或用较弱的启动子替代天然启动子来减弱。若需要，所述基因的完全减弱亦可通过缺失相应的DNA序列来达成。本发明亦涉及用于本发明该具体实施方案的微生物特别是细菌。

在本发明的另一个实施方案中，修饰所述微生物特别是细菌以在厌氧条件下产生1，4-丁二醇。为了取得此种能力，在所述微生物中，缺失了PTS-糖转运系统以通过渗透酶/激酶转运系统代谢糖。为了产生足量的ATP以供微生物在厌氧条件下生长，必须通过由大肠杆菌中的pckA基因编码的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性从磷酸烯醇丙酮酸产生草酰乙酸。对于每摩尔产生的草酰乙酸，生成一摩尔的ATP。以类似方式，2-酮戊二酸至4-酮戊二酸单酰CoA的转化必须通过4-酮戊二酸单酰CoA合成酶来达成。产生ADP的活性，如由大肠杆菌中sucC和sucD基因编码的，对于每摩尔产生的4-酮戊二酸单酰CoA仅消耗一摩尔ATP。所描述的从D-葡萄糖产生1，4-丁二醇的代谢途径特别适用于厌氧生长条件。此种途径的全局反应平衡为：D-葡萄糖+ADP+Pi→1，4-丁二醇+甲酸+CO2+ATP+H2O。在本发明的另一个实施方案中，修饰所述微生物特别是细菌以呈现乙酰CoA至除1，4-丁二醇之外的其他化合物的转化水平的减弱；该结果可通过减弱消耗乙酰CoA的酶像乙酸激酶和磷酸乙酰转移酶(由ackA和pta编码)的水平来达成。这些基因的减弱可通过用使相应的信使RNA或蛋白质不稳定化的元件或用较弱的启动子替代天然启动子来进行。若需要，所述基因的完全减弱亦可通过缺失相应的DNA序列来达成。本发明亦涉及用于本发明该具体实施方案的微生物特别是细菌。

实施例

实施例1

构建表达2-酮酸脱羧酶编码基因和羟基醛还原酶编码基因的菌株：MG1655(pME101-kivDll-yqhD-TT07)

1.1构建质粒pM-Ptrc01-kivDll-TT07以供过表达编码α-酮基异戊酸脱羧酶的乳酸乳球菌的kivD：

编码α-酮基异戊酸脱羧酶的乳酸乳球菌kivD的合成基因由Geneart(Germany)制备。该基因的密码子选择和GC含量根据供应商的矩阵(suppliermatrix)适应于大肠杆菌。该合成基因的表达是由组成型Ptrc启动子驱动的。将转录终止子添加至该基因下游。将构建体克隆入供应商的pM载体并通过测序验证。若需要，将该合成基因克隆入pME101载体(该载体来源于质粒pCL1920(Lerner&Inouye，1990，NAR 18，15p 4631))，接着用其转化大肠杆菌菌株。

Ptrc01-kivDll-TT07：

限制性位点(BamHI，HindIII，EcoRV)(SEQ ID NO 1)：

ggatccatgcaagcttatgcgatatc

Ptrc01启动子(SEQ ID NO 2)：

gagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaataaggaggtataac

对大肠杆菌优化的kivDll基因序列(CAG34226.)(SEQ ID NO 3)：

atgtataccgtgggtgattatctgctggatcgtctgcatgaactgggcattgaagaaattttcggcgttccgggtg

attataatctgcagtttctggatcagattattagccataaagatatgaaatgggtgggtaatgccaatgaactgaatgcaa

gctatatggcagatggttatgcccgtaccaaaaaagcagcagcatttctgaccacctttggtgttggtgaactgagcgc

agttaatggtctggctggtagctatgcagaaaatctgccggttgttgaaattgttggtagcccgaccagcaaagttcaga

atgaaggcaaatttgtgcatcataccctggccgatggtgattttaaacatttcatgaaaatgcatgaaccggttaccgca

gcacgtaccctgctgaccgcagaaaatgcaaccgttgaaattgatcgtgttctgagcgcactgctgaaagaacgtaaa

ccggtgtatattaatctgccggtggatgttgcagcagcaaaagcagaaaaaccgagcctgccgctgaaaaaagaaaa

tagcaccagcaataccagcgatcaggaaattctgaataaaattcaggaatccctgaaaaacgccaaaaaaccgattgt

gattaccggtcatgaaattattagctttggcctggaaaaaaccgttacccagtttattagcaaaaccaaactgccgattac

caccctgaattttggtaaaagcagcgttgatgaagcactgccgagctttctgggtatttataatggcaccctgagcgaac

cgaatctgaaagaatttgtggaaagcgcagatttcattctgatgctgggtgttaaactgaccgatagctctaccggtgca

tttacccatcatctgaatgaaaacaaaatgattagcctgaatattgatgaaggcaaaatttttaatgaacgcattcagaattt

tgattttgaaagcctgattagcagcctgctggatctgagcgaaatcgaatataaaggcaaatatattgataaaaaacagg

aagattttgttccgagcaatgcactgctgtctcaggatcgtctgtggcaggcagttgaaaatctgacccagagcaatga

aaccattgttgcagaacagggcaccagcttttttggtgcaagcagcatttttctgaaaagcaaaagccattttattggtca

gccgctgtggggtagcattggttatacctttccggcagcactgggtagccagattgcagataaagaaagccgtcatct

gctgtttattggtgatggtagcctgcagctgaccgttcaggaactgggtctggccattcgcgaaaaaattaatccgattt

gctttattatcaataatgatggctataccgtggaacgtgaaattcatggtccgaatcagagctataatgatattccgatgtg

gaattatagcaaactgccggaatcttttggtgcaaccgaagatcgtgttgtgagcaaaattgtgcgcaccgaaaatgaa

tttgtgagcgtgatgaaagaagcacaggcagatccgaatcgtatgtattggattgaactgattctggccaaagaaggtg

caccgaaagttctgaaaaaaatgggcaaactgttcgccgaacagaataaaagctaa

终止子序列T7Te(参照Harington K.J.，LaughlinR.B.和Liang S.ProcNatl Acad Sci U S A.2001Apr 24；98(9)：5019-24.)(SEQ ID NO 4)：attacgtagaAGATCTtcctggctcaccttcgggtgggcctttctg限制性位点(SmaI，BamHI，EcoRI)(SEQ ID NO 5)：ccccgggatgcggatccatgcgaattc

对于从低拷贝载体表达，如下所述构建pME101质粒。将pCL1920质粒使用PME101F和PME101R寡核苷酸进行PCR扩增，并将来自载体pTRC99A携带lacI基因和Ptrc启动子的BstZ17I-XmnI片段插入经扩增的载体。将所得的载体用NcoI和BamHI限制性酶切并将携带kivDll基因的载体用AftIII和BamHI限制性酶切。然后将含有kivDll的片段克隆入载体pME101：将所得的质粒命名为pME101-kivDll-TT07

PME 101F(SEQ ID NO 6)：ccgacagtaa gacgggtaag cctg

PME101R(SEQ ID NO 7)：agcttagtaa agccctcgct ag

1.2构建质粒pME101-kivDll-yqhD-TT07以供过表达编码α-酮基异戊酸脱羧酶的乳酸乳球菌的kivD和编码甲基乙二醛还原酶的大肠杆菌的yqhD

将所述pME101载体和携带kivDll基因的载体用SnaBI和BglII限制性酶切，并将含有yqhD的片段克隆入载体pME101。将所得的质粒命名为pME101-kivDll-yqhD-TT07。

将yqhD基因从大肠杆菌MG1655菌株的基因组DNA用寡核苷酸yqhD F和yqhD R进行PCR扩增：

yqhD F(SEQ ID NO 8)

Tcccagcaaagggagcaagtaatgaacaac

-供添加SnaBI限制性位点的区(斜体粗体大写)

-同源于大肠杆菌MG1655yqhD区3153357至3153385的区(小写)yqhD R(SEQ ID NO 9)

atcTTAGCGGGCGGCTTCGTATATAC

-同源于大肠杆菌MG1655yqhD区3154540至3154518的区(大写)

-供添加BglII限制性位点的区(斜体粗体小写)

用限制性酶SnaBI和BglII切割经PCR扩增的片段，并将其克隆入载体pME101-kivDll-TT07的SnaBI-BglII位点，得到载体pME101-kivDll-yqhD-TT07。

实施例2

构建乙二醇途径流量增加的菌株：MG1655ΔsdaAΔsdaB ΔpykFPtrc 18-gpmA Ptrc 18-gpmB(pME 101-kivDll-yqhD-TT07)

2.1构建MG1655ΔsdaAΔsdaB 菌株

为了缺失sdaA基因，使用由Datsenko&Wanner(2000)所述的同源重组策略。该策略允许氯霉素或卡那霉素抗性盒的插入，而缺失大部分涉及的基因。为此目的，使用了下述寡核苷酸：

ΔsdaAF(SEQ ID NO 10)

gtcaggagtattatcgtgattagtctattcgacatgtttaaggtggggattggtccctcatcttcccataccgtagggccTGTAG GCTGGAGCTGCTTCG具有

-与sdaA基因的序列(1894941-1895020)(参照序列见网站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)同源的区(小写)，

-供扩增卡那霉素抗性盒(参照序列见Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS，97：6640-6645)的区(大写粗体)，

ΔsdaAR(SEQ ID NO 11)

GGGCGAGTAAGAAGTATTAGTCACACTGGACTTTGATTGCCAGACCACCGCGTGAGGTTTCGCGGTATTTGGCGTTCATGTCCCATATGAATATCCTCCTAAG具有

-与sdaA基因的序列(1896336-1896254)(参照序列见网站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)同源的区(大写)，

-供扩增卡那霉素抗性盒(参照序列见Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS，97：6640-6645)的区(大写粗体)。

将寡核苷酸ΔsdaAF和ΔsdaAR用于从pKD4质粒扩增卡那霉素抗性盒。然后将获得的PCR产物通过电穿孔导入株MG 1655(pKD46)。选择卡那霉素抗性转化体，并通过PCR分析用下述定义的寡核苷酸sdaAF和sdaAR验证抗性盒的插入。所得的菌株命名为MG1655ΔsdaA::Km.sdaAF(SEQ ID NO12)：cagcgttcgattcatctgcg(同源于1894341至1894360的序列)。sdaAR(SEQ IDNO 13)：

GACCAATCAGCGGAAGCAAG(同源于1896679至1896660的序列)。

然后选择卡那霉素抗性转化体并通过PCR分析用之前限定的寡核苷酸sdaAF和sdaAR验证ΔsdaA::Km。所得的菌株命名为MG1655ΔsdaA::Km。然后通过转导将DsdaB::Cm导入菌株MG1655ΔsdaA::Km。MG1655ΔsdaB::Cm首先是使用如前所述的相同方法用下述寡核苷酸构建的：

ΔsdaBF(SEQ ID NO 14)

cggcattggcccttccagttctcataccgttggaccaatgaaagcgggtaaacaatttaccgacgatctgattgcccgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG具有

-与sdaB基因的序列(2927627-2927705)(参照序列见网站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)同源的区(小写)，

-供扩增氯霉素抗性盒(参照序列见Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS，97：6640-6645)的区(大写粗体)，

ΔsdaBR(SEQ ID NO 15)

CGCAGGCAACGATCTTCATTGCCAGGCCGCCGCGAGAGGTTTCGCGGTACTTGGCGTTCATATCTTTACCTGTTTCGTACCATATGAATATCCTCCTTAG具有

-与sdaB基因的序列(2928960-2928881)(参照序列见网站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)同源的区(大写)，

-供扩增氯霉素抗性盒(参照序列见Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS，97：6640-6645)的区(大写粗体)。

将寡核苷酸ΔsdaBF和ΔsdaBR用于从质粒pKD3扩增氯霉素抗性盒。然后将所得的PCR产物通过电穿孔导入菌株MG1655(pKD46)。然后选择氯霉素抗性转化体，并通过PCR分析用下述定义的寡核苷酸sdaBF和sdaBR验证抗性盒的插入。所得的菌株命名为MG1655ΔsdaB::Cm.sdaBF(SEQ ID NO16)：Gcgtaagtacagcggtcac(同源于2927450至2927468的序列)。sdaBR(SEQ IDNO 17)：CGATGCCGGAACAGGCTACGGC(同源于2929038至2929017的序列)。为了转移ΔsdaB::Cm，使用噬菌体Pl转导的方法。将菌株MG1655ΔsdaB::Cm的噬菌体裂解液的制备物用于转导入菌株MG1655ΔsdaA::Km。

然后选择氯霉素抗性转化体，并通过PCR分析用前述限定的寡核苷酸sdaBF和sdaBR验证ΔsdaB::Cm。所得的菌株命名为MG1655ΔsdaA::KmΔsdaB::Cm。然后消除卡那霉素和氯霉素抗性盒。然后将携带作用于卡那霉素和氯霉素抗性盒的FRT位点的FLP重组酶的质粒pCP20通过电穿孔导入重组位点。在42℃的系列培养之后，卡那霉素和氯霉素抗性盒的丧失通过PCR分析用如前所用的相同寡核苷酸(sdaAF/sdaAR和sdaBF/sdaBR)进行验证。所得的菌株命名为MG1655DsdaAΔsdaB。

2.2构建菌株MG1655ΔsdaAΔsdaBΔpykF6

为了缺失pykF基因，使用了Datsenko&Wanner(2000)所述的同源重组策略。该策略允许允许氯霉素或卡那霉素抗性盒的插入，而缺失大部分涉及的基因。为此目的，使用了下述寡核苷酸：

ΔpykFF(SEQ ID NO 18)

cccatccttctcaacttaaagactaagactgtcatgaaaaagaccaaaattgtttgcaccatcggaccgaaaaccgaaTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

具有

-与pykF区的序列(1753689-1753766)(参照序列见网站http://www.ecogene.org/)同源的区(小写)，

-供扩增卡那霉素抗性盒(参照序列见Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS，97：6640-6645)的区(大写)，

ΔpykFR(SEQ ID NO 19)

ggacgtgaacagatgcggtgttagtagtgccgctcggtaccagtgcaccagaaaccataactacaacgtcacctttgtgCATATGAATATCCTCCTTAG

具有

-与pykF区的序列(1755129-1755051)(参照序列见网站http://www.ecogene.org/)同源的区(小写)，

-供扩增卡那霉素抗性盒(参照序列见Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS，97：6640-6645)的区(大写)。

将寡核苷酸ΔpykFF和ΔpykFR用于从pKD4质粒扩增卡那霉素抗性盒。然后将获得的PCR产物通过电穿孔导入菌株MG 1655(pKD46)。然后选择卡那霉素抗性转化体，并通过PCR分析用下述定义的寡核苷酸pykFF和pykFR验证抗性盒的插入。所得的菌株命名为MG1655ΔpykF::Km.pykFF(SEQ IDNO 20)：gcgtaaccttttccctggaacg(同源于1753371至1753392的序列)。pykFR(SEQ ID NO 21)：gcgttgctggagcaacctgccagc(同源于1755518至1755495的序列)。

为了转移ΔpykF::Km，使用噬菌体P1转导的方法。将菌株MG1655ΔpykF::Km的噬菌体裂解液的制备物用于转导入菌株ΔsdaA ΔsdaB。

然后选择卡那霉素抗性转化体，并通过PCR分析用前述限定的寡核苷酸pykFF和pykFR验证ΔpykF::Km。所得的菌株命名为MG1655ΔsdaA ΔsdaBΔpykF::Km。

然后消除卡那霉素抗性盒。然后将携带作用于卡那霉素抗性盒FRT位点的FLP重组酶的质粒pCP20通过电穿孔导入重组位点。在42℃的系列培养之后，卡那霉素抗性盒的丧失通过PCR分析用如前所用的相同寡核苷酸(sdaAF/sdaARsdaBF/sdaBR和pykFF/pykFR)进行验证。所得的菌株命名为MG1655ΔsdaA ΔsdaBΔpykF。

2.3构建菌株MG1655ΔsdaAΔsdaB ΔpykF Ptrc18-gpmA Ptrc18-gpmB

为了增加3-磷酸甘油酸的水平，构建了突变体Ptrc18-gpmA和Ptrc18-gpmB。首先，为了减少磷酸甘油酸变位酶gpmA基因的表达，将其启动子用经修饰的具有弱活性的组成型trc启动子替代。通过转导将Ptrc 18-gpmA转化入MG1655ΔsdaAΔsdaB ΔpykF菌株。

首先使用如前所述的相同方法用下述寡核苷酸构建菌株MG1655Ptrc18-gpmA::Km：

Ptrc18-gpmAF(SEQ ID NO 22)

CCACTGACTTTCGCCATGACGAACCAGAACCAGCTTAGTTACAGCCATAATATACCTCCTTATTCCACACAgTATACGAGCCGGATGATTAATcGcCAACAGCTCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG具有

-与gpmA基因的序列(786771-786819)(参照序列见网站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)同源的区(大写)，

-trc启动子序列的区(大写斜体)，其中-35和-10框用下划线标示。

Ptrc18-gpmAR(SEQ ID NO 23)

ggttatgcgtaagcattgctgttgcttcgtcgcggcaatataatgagaattattatcattaaaagatgatttgaggagtaagtatCATATGAATATCCTCCTTAG具有

-与gpmA基因上游区的序列(786903-786819)(参照序列见网站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)同源的区(小写)，

将寡核苷酸Ptrc18-gpmAF和Ptrc18-gpmAR用于从pKD4质粒扩增卡那霉素抗性盒。然后将获得的PCR产物通过电穿孔导入菌株MG 1655(pKD46)，其中表达的Red重组酶允许同源重组的发生。然后选择卡那霉素抗性转化体，并通过PCR分析用下述定义的寡核苷酸gpmAF和gpmAR验证抗性盒的插入。所得的菌株命名为MG1655Ptrc18-gpmA::Km.gpmAF(SEQ ID NO 24)：CCTTCCTCTTTCAGCAGCTTACC(同源于786673至786695的序列)。gpmAR(SEQ ID NO 25)：cgacgatcagcgcaaagtgaaagg(同源于787356至787333的序列)。

为了转移修饰Ptrc18-gpmA::Km，使用噬菌体P1转导。下述实验方案分两步实施，首先制备菌株MG1655Ptrc18-gpmA::Km的噬菌体裂解液，然后转导入菌株MG1655ΔsdaA ΔsdaB ΔpykF。该菌株的构建如上所述。

1-制备P1噬菌体裂解液

-用100μl菌株MG1655Ptrc18-gpmA::Km在10ml的LB+Km 50μg/ml+葡萄糖0.2％+CaCl25mM中的过夜培养物接种。在37℃振荡温育30分钟。

-添加在菌株MG1655上制备的100μl噬菌体裂解物P1(约1x10⁹个噬菌体/ml)。

-在37℃振荡3小时直至所有细胞裂解。添加200μl氯仿并涡旋振荡。

-以4500g离心10分钟以消除细胞碎片。

-将上清转移至无菌试管并添加200μl氯仿。

-在4℃储藏裂解液。

2-转导

-将MG1655ΔsdaA ΔsdaB ΔpykF菌株在LB培养基中的5ml过夜培养物以1500g离心10分钟。

-将细胞沉淀悬于2.5ml的10mM MgS04，5mM CaCl2。对照试管：100μl细胞

-100μl菌株MG1655Ptrc18-gpmA::Km的噬菌体P1-试管：100μl细胞+100μl菌株MG1655Ptrc18-gpmA::Km的噬菌体P1

-在30℃不振荡温育30分钟。将100μl的1M柠檬酸钠添加于每个试管并涡旋振荡。

-添加1ml LB-在37℃振荡温育1小时。

-在将试管以7000rpm离心3分钟之后，铺板于LB+Km 50μg/ml皿。

-在37℃温育过夜。

3-菌株的验证

然后选择卡那霉素抗性转化体并通过PCR分析用之前所述的寡核苷酸gpmAF和gpmAR验证Ptrc18-gpmA::Km启动子的修饰。所得的菌株命名为MG1655ΔsdaA ΔsdaB ΔpykF Ptrc 18-gpmA::Km。然后通过转导将Ptrc18-gpmB转移入菌株MG1655ΔsdaA ΔsdaB ΔpykF Ptrc18-gpmA::Km。MG1655Ptrc18-gpmB::Cm首先是使用如前所述的相同方法用下述寡核苷酸构建的：

Ptrc18-gpmBR(SEQ ID NO 26)

CGGCGTTCCACTGCGTTTCACCGTGGCGGACTAGGTATACCTGTAACATAATATACCTCCTTATTCCACACAgTATACGAGCCGGATGATTAATcGcCAACAGCTCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG具有

-与gpmB基因的序列(4631414-4631366)(参照序列见网站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)同源的区(大写)，

Ptrc18-gpmBF(SEQ ID NO 27)

GcgggattggtggtcgcacagacaacttggtgcaaacagcattactcagaaaattaacgttacagcagtatacggaaaaaaagcCATATGAATATCCTCCTTAG具有

-与gpmB基因上游区的序列(4631280-4631365)(参照序列见网站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)同源的区(小写)，

将寡核苷酸Ptrc18-gpmBF和Ptrc18-gpmBR用于从pKD3质粒扩增氯霉素抗性盒。然后将获得的PCR产物通过电穿孔导入株MG 1655(pKD46)，其中表达的Red重组酶使得同源重组发生。然后选择氯霉素抗性转化体，并通过PCR分析用下述定义的寡核苷酸gpmBF和gpmBR验证抗性盒的插入。所得的菌株命名为MG1655Ptrc18-gpmB::Cm gpmBF(SEQ ID NO 28)：ccttacgaccaatctcatcaataccgg(同源于4630906至4630932的序列)。gpmBR(SEQID NO 29)：GCAATACCATGACTCACCAGC(同源于4631823至4631803的序列)。

为了转移修饰Ptrc18-gpmB::Cm，使用噬菌体P1转导。将菌株MG1655Ptrc18-gpmB::Cm的噬菌体裂解液用于转导入菌株MG1655ΔsdaAΔsdaBΔpykF Ptrc18-gpmA::Km。然后选择氯霉素抗性转化体并通过PCR分析用之前限定的寡核苷酸gpmBF和gpmBR验证Ptrc18-gpmB::Cm。所得的菌株命名为MG1655ΔsdaAΔsdaB ΔpykF Ptrc18-gpmA::Km Ptrc18-gpmB::Cm。然后可消除卡那霉素和氯霉素抗性盒。然后将携带作用于卡那霉素和氯霉素抗性盒的FRT位点的FLP重组酶的质粒pCP20通过电穿孔导入重组位点。在42℃的系列培养之后，卡那霉素和氯霉素抗性盒的丧失通过PCR分析用如前所用的相同寡核苷酸(gpmAF/gpmAR和gpmBF/gpmBR)进行验证。所得的菌株命名为MG1655ΔsdaAΔsdaB ΔpykF Ptrc18-gpmA Ptrc18-gpmB。

2.4构建菌株MG1655ΔsdaAΔsdaBΔpykF Ptrc1 8-gpmA Ptrc18-gpmB(pME101-kivDll-yqhD-TT07)

然后将pME101-kivDll-yqhD-TT07质粒导入菌株MG1655ΔsdaAΔsdaBΔpykF Ptrc18-gpmA Ptrc18-gpmB。

实施例3

构建1，3-丙二醇途径流量增加的菌株：MG1655ΔmetAΔpykFΔthrLABC::TT07-Ptrc-thrA*1(pME 101-kivDll-yqhD-TT07)(pMA-aaoro)

3.1构建菌株MG1655ΔmetA

为了缺失metA基因，使用由Datsenko&Wanner(2000)所述的同源重组策略。该策略允许氯霉素或卡那霉素抗性盒的插入，而缺失大部分涉及的基因。为此目的，使用了下述寡核苷酸：

ΔmetAF(SEQ ID NO 30)：

ttcgtgtgccggacgagctacccgccgtcaatttcttgcgtgaagaaaacgtctttgtgatgacaacttctcgtgcgtctTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

具有

-与metA基因区的序列(4212310-4212389)(参照序列见网站http://www ecogene org/)同源的区(小写)，

ΔmetAR(SEQ ID NO 31)：

atccagcgttggattcatgtgccgtagatcgtatggcgtgatctggtagacgtaatagttgagccagttggtaaacagtaCATATGAATATCCTCCTTAG

具有

-与metA基因区的序列(4213229-4213150)(参照序列见网站http://www.ecogene.org/)同源的区(大写)，

将寡核苷酸ΔmetAF和ΔmetAR用于从pKD4质粒扩增卡那霉素抗性盒。然后将获得的PCR产物通过电穿孔导入株MG 1655(pKD46)。然后选择卡那霉素抗性转化体，并通过PCR分析用下述定义的寡核苷酸metAF和metAR验证抗性盒的插入。所得的菌株命名为MG1655ΔmetA::Km.metAF(SEQ IDNO 32)：tcaccttcaacatgcaggctcgacattggc(同源于4212203至4212232的序列)。metAR(SEQ ID NO 33)：ataaaaaaggcacccgaaggtgcctgaggt(同源于4213301至4213272的序列)。

然后消除卡那霉素抗性盒。然后将携带作用于卡那霉素抗性盒的FRT位点的FLP重组酶的质粒pCP20通过电穿孔导入重组位点。在42℃的系列培养之后，卡那霉素抗性盒的丧失通过PCR分析用如前所用的相同寡核苷酸(metAF/metAR)进行验证。所得的菌株命名为MG1655ΔmetA。

3.2构建菌株MG1655ΔmetA ΔpykF

为了转移ΔpykF::Km，使用噬菌体P1转导。将菌株MG1655ΔpykF::Km(如上所述)的噬菌体裂解液的制备物用于转导入菌株MG1655ΔmetA。

然后选择卡那霉素抗性转化体，且通过PCR分析用前述限定的寡核苷酸pykFF和pykFR验证ΔpykF::Km。所得的菌株命名为MG1655ΔmetADpykF::Km。

3.3构建菌株MG1655DmetA DpykF DthrLABC::TT07-Ptrc-thrA*1

为了增加天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶thrA*1的反馈抗性等位基因的表达，构建了下述质粒：用于获得thrA*1的pSB1和用于用Ptrc-thrA*1等位基因替代thrLABC操纵子的pSB2。

质粒pSB1来源于质粒pCL1920(Lerner&Inouye，1990，NAR 18，15p4631)并携带从启动子Ptrc表达，具有减少的对苏氨酸的反馈抗性的天冬氨酸激酶/高丝氨酸thrA*等位基因(Lee等2003J.Bacteriol.185，18pp.5442-5451)。对于pSB1的构建，将thrA从基因组DNA使用下述寡核苷酸进行PCR扩增：

BspHIthrA(SEQ ID NO 34)：

TTATCATGAgagtgttgaagttcggcggtacatcagtggc

具有

-与thrA基因的序列(341-371)(参照序列见网站http://www.ecogene.org/)同源的区(小写)，

-供BspHI限制性位点和额外碱基的区(大写)，

SmaIthrA(SEQ ID NO 35)：

TTACCCGGGccgccgccccgagcacatcaaacccgacgc

具有

-与thrA基因的序列(2871-2841)(参照序列见网站http://www.ecogene.org/)同源的区(小写)，

-供SmaI限制性位点和额外碱基的区(大写)，

用限制性酶BspHI和SmaI切割经PCR扩增的片段，并将其克隆入载体pTRC99A(Stratagene)的NcoI/SmaI位点。对于从低拷贝载体表达，如下所述构建pME101质粒。将pCL1920质粒使用PME101F和PME101R寡核苷酸进行PCR扩增，并将来自载体pTRC99A携带lacI基因和Ptrc启动子的BstZ17I-XmnI片段插入经扩增的载体。将所得的载体和携带thrA基因的载体用ApaI和SmaI限制性酶切并将含有thrA的片段克隆入载体pME101。为了解除(relieve)ThrA的反馈抑制，通过定点诱变(Stratagene)使用寡核苷酸ThrA SFfor和ThrA SF rev导入突变thrAS345F，得到载体pSB1。

PME101F(SEQ ID NO 36)

ccgacagtaagacgggtaagcctg

PME101R(SEQ ID NO 37)

agcttagtaaagccctcgctag

ThrA SF FOr(SEQ ID NO 38)

CGTATTTCCGTGGTGCTGATTACGCAATTCTCTTCCGAGTACTCAATCAGTTTCTGC

ThrA SF rev(SEQ ID NO 39)

GCAGAAACTGATTGAGTACTCGGAAGAGAATTGCGTAATCAGCACCACGGAAATACG

为了缺失thrLABC操纵子并将其用Ptrc-thrA*1等位基因替代，使用由Datsenko&Wanner(2000)所述的同源重组策略。该策略允许氯霉素或卡那霉素抗性盒，以及其他DNA的插入，而缺失大部分涉及的基因。为此目的，构建了下述质粒，pSB2。

质粒pSB2来源于质粒pUC18(Norrander等，Gene 26(1983)，101-106)并携带与Ptrc-thrA*1等位基因相关的氯霉素抗性盒，两者均在thrL上游区和thrC下游区之间克隆。

对于pSB2的构建，将thrL的上游区和thrC的下游区从基因组DNA使用下述寡核苷酸进行PCR扩增：

HpaIupthrLF(SEQ ID NO 40)

CGTAGTTAACGAATTCccaactagttgcatcatacaactaataaacgtgg

具有

-与thrL区的序列(4638698-4638731)(参照序列见网站http://www.ecogene.org/)同源的区(小写)，

-供HpaI和EcoRI限制性位点和额外碱基的区(大写)。

BstZ17IupthrLR(SEQ ID NO 41)

CCCGGGGGAGGCGCCCGCGGATCCCGGTATAC aggtaaccagttcagaagctgctatcag具有

-与thrL区的序列(87-60)(参照序列见网站http://www.ecogene.org/)同源的区(小写)，

-T7te转录终止子序列的区(大写粗体)(Harrington K.J.，Laughlin R.B.和Liang S.Proc Natl Acad Sci U S A.2001Apr 24；98(9)：5019-24.)，

-由BstZ17I、BamHI、SfoI和SmaI限制性位点组成的多克隆位点区(大写)。

BamHIdownthrCF(SEQ ID NO 42)

GTATACCGGGATCCGCGGGCGCCTCCCCCGGGaatctattcattatctcaatcaggccggg

具有

-与thrC区的序列(5021-5049)(参照序列见网站http://www.ecogene.org/)同源的区(小写)，

HpaIdownthrCR(SEQ ID NO 43)

CGTAGTTAACGAATTCgagaatgcccgagggaaagatctg

具有

-与thrC区的序列(6054-6031)(参照序列见网站http://www.ecogene.org/)同源的区(小写)，

-供HpaI和EcoRI限制性位点和额外碱基的区(大写)。

首先，将“upthrL”和“downthrC”片段从MG1655基因组DNA分别使用HpaIupthrLF/BstZ17IupthrLR和BamHIdownthrCF/HpaIdownthrCR寡核苷酸进行PCR扩增。其次，从“upthrL”和“downthrC”PCR片段(其具有由T7Te转录终止子和由BstZ17I、BamHI、SfoI和SmaI限制性位点组成的多克隆位点组成的重叠区)使用HpaIupthrLF/HpaIdownthrCR寡核苷酸进行扩增。用限制性酶HpaI切割“upthrL-downthrC”PCR片段，并将其克隆入pUC18载体的EcoRI/SfoI位点，得到pUC18-DthrLABC::TT07-SMC质粒。

然后，将氯霉素抗性盒从pKD3载体使用下述寡核苷酸进行PCR扩增：

BstZ17ICmF(SEQ ID NO 44)

GGGGTATACtgtaggctggagctgcttcg

具有

-供扩增氯霉素抗性盒(参照序列见Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS，97：6640-6645)的区(小写)，

-供BstZ17I限制性位点和额外碱基的区(大写)。

BamHICmR(SEQ ID NO 45)

CGCGGATCCcatatgaatatcctccttag

具有

-供BamHI限制性位点和额外碱基的区(大写)。

用限制性酶BstZ17I和BamHI切割PCR片段，并将其克隆入pUC18-ΔthrLABC::TT07-SMC质粒的BstZ17I/BamHI位点，得到pUC18-ΔthrLABC::TT07-SMC::Cm质粒。

最终，将Ptrc-thrA*1等位基因从pSB1质粒用限制性酶SfoI和SmaI切割，并克隆入pUC18-ΔthrLABC::TT07-SMC::Cm质粒的SfoI/SmaI位点，得到pUC18-ΔthrLABC::TT07-Ptrc-thA*l::Cm质粒或pSB2。

通过用EcoRI限制性酶切割pSB2质粒得到ΔthrLABC::TT07-Ptrc-thrA*1::Cm片段，并将其通过电穿孔导入菌株MG1655(pKD46)，其中表达的Red重组酶使得同源重组发生。然后选择氯霉素抗性转化体，并通过PCR分析用下述定义的寡核苷酸thrA*1F和thrA*1R验证抗性盒的插入。所得的菌株命名为MG1655ΔthrLABC::TT07-Ptrc-thrA*1::Cm.thrA*1F(SEQ ID NO 46)：cgtgttgcgtgttaccaactcg(同源于thrL区的序列(4638276-4638297)(参照序列见网站http://www.ecogene.org/))。thrA*1R (SEQID NO 47)cggaaactgacgcctccgcag(同源于thrC区的序列(6345-6325)(参照序列见网站http://www.ecogene.org/))。

重组质粒通过DNA测序验证。

为了转移ΔthrLABC::TT07-Ptrc-thrA*1::Cm，使用噬菌体P1转导。将菌株MG1655ΔthrLABC::TT07-Ptrc-thrA*1::Cm的噬菌体裂解液的制备物用于转导入菌株MG1655ΔmetA DpykF::Km。

然后选择卡那霉素和氯霉素抗性转化体并通过PCR分析用之前限定的寡核苷酸thrA*1F和thrA*1R验证ΔthrLABC::TT07-Ptrc-thrA*1::Cm。所得的菌株命名为MG1655ΔmetAΔpykF::KmΔthrLABC::TT07-Ptrc-thrA*1::Cm。

然后可消除卡那霉素和氯霉素抗性盒。然后将携带作用于卡那霉素和氯霉素抗性盒的FRT位点的FLP重组酶的质粒pCP20通过电穿孔导入重组位点。在42℃的系列培养之后，卡那霉素和氯霉素抗性盒的丧失通过PCR分析用如前所用的相同寡核苷酸(metAF/metAR、pykF/pykFR和thrA*1F/thrA*1R)进行验证。所得的菌株命名为MG1655ΔmetAΔpykFΔthrLABC::TT07-Ptrc-thrA*1。

3.4构建质粒pMA-aaoro

编码氨基酸氧化酶的混浊红球菌aao基因的合成基因由Geneart(Germany)制备。该基因的密码子选择和GC含量根据供应商的矩阵适应于大肠杆菌。该合成基因的表达是由组成型Pttrc启动子驱动的。将构建体克隆入供应商的pM载体并通过测序验证。

Ptrc01-aaoro：

限制性位点(Kpnl，EcoRI，Smal)(SEQ ID NO 48)：

ggtaccgaattccccggg

Ptrc01启动子和RBS(SEQ ID NO 49)：

gagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaaggatcccccgggtaaggaggttataa

对大肠杆菌优化的aaoro基因序列(AY053450.)(SEQ ID NO 50)：

atggcatttacccgtcgcagctttatgaaaggtctgggtgcaaccggtggtgcaggtctggcatatggtgcaat

gagcaccctgggtctggcaccgtctacagcagcaccggcacgtacctttcagccgctggcagccggtgatctgattg

gtaaagtgaaaggtagccatagcgttgttgttctgggtggtggtccggcaggtctgtgtagcgcatttgaactgcagaa

agccggttataaagttaccgttctggaagcacgtacccgtccgggtggtcgtgtttggaccgcacgtggtggtagcga

agaaaccgatctgagcggtgaaacccagaaatgtacctttagcgaaggccatttttataatgttggtgccacccgtattc

cgcagagccatattaccctggattattgtcgcgaactgggtgttgaaattcagggtttcggcaatcaaaatgccaatacc

tttgtgaattatcagagcgataccagcctgagcggtcagagcgttacctatcgtgcagcaaaagcagatacctttggct

atatgagcgaactgctgaaaaaagcaaccgatcagggtgcactggatcaggttctgagccgtgaagataaagatgca

ctgagcgaatttctgagcgattttggtgatctgtctgatgatggtcgttatctgggtagcagccgtcgtggttatgatagc

gaaccgggtgccggtctgaattttggcaccgaaaaaaaaccgtttgccatgcaggaagttattcgtagcggtattggtc

gcaattttagctttgattttggctatgatcaggccatgatgatgtttacaccggttggtggtatggatcgtatttattatgcctt

tcaggatcgtattggcactgataacatcgtgttcggtgccgaagttaccagcatgaaaaatgttagcgaaggtgtgacc

gttgaatataccgcaggcggtagcaaaaaaagcattaccgcagattatgccatttgtaccattcctccgcatctggttgg

tcgtctgcagaataatctgcctggtgatgttctgaccgcactgaaagcagcaaaaccgagcagcagcggtaaactgg

gtattgaatatagccgtcgttggtgggaaaccgaagatcgcatttatggtggtgcaagcaataccgataaagatattag

ccagattatgtttccgtatgatcattataatagcgatcgtggtgttgttgttgcatattatagctctggtaaacgccaggaag

catttgaaagcctgacccatcgtcagcgtctggcaaaagcaattgcagaaggcagcgaaattcacggcgaaaaatat

acccgtgatattagcagcagctttagcggtagctggcgtcgtaccaaatatagcgaaagcgcatgggcaaattgggc

aggtagcggtggttctcatggtggtgcagccactccggaatatgaaaaactgctggaaccggtggataaaatttatttt

gccggtgatcatctgagcaatgcaatcgcatggcagcatggtgcactgaccagcgcacgtgatgttgttacccatattc

atgaacgtgttgcacaggaagcctaa

限制性位点(BglII，EcoRV，Pacl，Sacl，XbaI，HindIII)(SEQ ID NO 51)：

gatctgatatcttaattaagagctctctagaaagctt

3.5构建菌株MG1655ΔmetAΔpykFΔthrLABC::TT07-Ptrc-thrA*1(pME101-kivDll-yqhD-TT07)(pMA-aaoro)

然后将pME101-kivDll-yqhD-TT07和pMA-aaoro质粒导入菌株MG1655ΔmetAΔpykFΔthrLABC::TT07-Ptrc-thrA*1。

实施例4

构建1，4-丁二醇途径流量增加的菌株：MG1655ΔsucCDΔaceBAKΔarcAΔgdhA(pUC19-Ptrc01/OP01/RBS01-adhE2ca-prpE-TT02)(pME101-kivDll-yqhD-TT07)

4.1构建菌株MG1655ΔaceBAKΔsucCD

为了缺失aceBAK基因，使用由Datsenko&Wanner(2000)所述的同源重组策略。该策略允许氯霉素或卡那霉素抗性盒的插入，而缺失大部分涉及的基因。为此目的，使用了下述寡核苷酸：

ΔaceBAKF(SEQ ID NO 52)：

ctggctttcacaaggccgtatggcgagcaggagaagcaaattcttactgccgaagcggtagaatttctgactgagctggtTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

具有

-与aceB区的序列(4213531-4213610)(参照序列见网站http://www.ecogene.org/)同源的区(小写)，

ΔaceBAKR(SEQ ID NO 53)：

aacatcttccacatgcccttcacgtatgcggttttgtagtgcgcgccagtaatcagcgcggaacaggtcggcgtgcatcCATATGAATATCCTCCTTAG

具有

-与aceK区的序列(4218298-4218220)(参照序列见网站http://www.ecogene.org/)同源的区(小写)，

将寡核苷酸ΔaceBAKF和ΔaceBAKR用于从pKD4质粒扩增卡那霉素抗性盒。然后将获得的PCR产物通过电穿孔导入株MG 1655(pKD46)。然后选择卡那霉素抗性盒，且抗性盒的插入通过PCR分析用下述定义的寡核苷酸aceBAKF和aceBAKR验证。所得的菌株命名为MG1655ΔmetA::Km.aceBAKF(SEQ ID NO 54)：cgttaagcgattcagcaccttacc(同源于4213251至4213274的序列)。aceBAKR(SEQ ID NO 55)：aacgcattacccactctgtttaatacg(同源于4218728至4218702的序列)。

为了缺失sucCD基因，使用由Datsenko&Wanner(2000)所述的同源重组策略。该策略允许氯霉素或卡那霉素抗性盒的插入，而缺失大部分涉及的基因。为此目的，使用了下述寡核苷酸：

ΔsucCDF(SEQ ID NO 56)：

tttttgcccgctatggcttaccagcaccggtgggttatgcctgtactactccgcgcgaagcagaagaagccgcttcaaaaCATATGAATATCCTCCTTAG

具有

-与sucC区的序列(762268-762347)(参照序列见网站http://www.ecogene.org/)同源的区(小写)，

ΔsucCDR(SEQ ID NO 57)：

atatccgccaggctgcgaacggttttcacgcctgcggcttccagagcagcgaatttctcatccgcagtccctttaccggcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

具有

-与sucD区的序列(764241-764168)(参照序列见网站http://www.ecogene.org/)同源的区(大写)，

将寡核苷酸DsucCDF和DsucCDR用于从pKD3质粒扩增氯霉素抗性盒。然后将获得的PCR产物通过电穿孔导入株MG 1655(pKD46)。然后选择氯霉素抗性转化体，并通过PCR分析用下述定义的寡核苷酸sucCDF和sucCDR验证抗性盒的插入。所得的菌株命名为MG1655ΔsucCD::Cm.sucCDF(SEQID NO 58)：tcgcgaatccgtgggcttcctggtaacg(同源于761887至761914的序列)。sucCDR(SEQ ID NO 59：cctctgatgccaaccgaagagatgagccg(同源于764555至764527的序列)。

为了转移ΔaceBAK::Km，使用噬菌体P1转导的方法。将菌株MG1655DaceBAK::Km的噬菌体裂解液的制备物用于转导入菌株MG1655ΔsucCD::Cm。

然后选择卡那霉素和氯霉素抗性转化体，并通过PCR分析用前述限定的寡核苷酸aceBAKF和aceBAKR验证ΔaceBAK::Km。所得的菌株命名为MG1655ΔsucCD::CmΔaceBAK::Km。

然后可消除卡那霉素和氯霉素抗性盒。然后将携带作用于卡那霉素和氯霉素抗性盒的FRT位点的FLP重组酶的质粒pCP20通过电穿孔导入重组位点。在42℃的系列培养之后，卡那霉素和氯霉素抗性盒的丧失通过PCR分析用如前所用的相同寡核苷酸(aceBAKF/aceBAKR，和sucCDF/sucCDR)进行验证。所得的菌株命名为MG1655ΔsucCDΔaceBAK。

4.2构建菌株MG1655ΔsucCDΔaceBAKΔarcAΔgdhA

为了缺失arcA基因，使用由Datsenko&Wanner(2000)所述的同源重组策略。该策略允许氯霉素或卡那霉素抗性盒的插入，而缺失大部分涉及的基因。为此目的，使用了下述寡核苷酸：

ΔarcAF(SEQ ID NO 60)：

cccgcacattcttatcgttgaagacgagttggtaacacgcaacacgttgaaaagtattttcgaagcggaaggctatgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

具有

-与arcA区的序列(4638322-4638245)(参照序列见网站http://www.ecogene.org/)同源的区(小写)，

ΔarcAR(SEQ ID NO 61)：

ccagatcaccgcagaagcgataaccttcaccgtgaatggtggcgatgatttccggcgtatccggcgtagattcgaaatgCATATGAATATCCTCCTTAG

具有

-与arcA 区的序列(4637621-4637699)(参照序列见网站http://www.ecogene.org/)同源的区(大写)，

将寡核苷酸DarcAF和DarcAR用于从pKD4质粒扩增卡那霉素抗性盒。然后将获得的PCR产物通过电穿孔导入株MG 1655(pKD46)。然后选择卡那霉素抗性转化体，并通过PCR分析用下述定义的寡核苷酸arcAF和arcAR验证抗性盒的插入。所得的菌株命名为MG1655ΔarcA::Km.arcAF(SEQ ID NO62)：cgacaattggattcaccacg(同源于4638746至4638727的序列)。arcAR(SEQ IDNO 63)：gcggtattgaaaggttggtgc(同源于4637308至4637328的序列)。

为了转移ΔarcA::Km，使用噬菌体P1转导。将菌株MG1655DarcA::Km的噬菌体裂解液的制备物用于转导入菌株MG1655ΔsucCDΔaceBAK。

然后选择卡那霉素抗性转化体，并通过PCR分析用前述限定的寡核苷酸arcAF和arcAR验证ΔarcA::Km。所得的菌株命名为MG1655ΔsucCDΔaceBAKΔarcA::Km。

为了缺失gdhA基因，使用由Datsenko&Wanner(2000)所述的同源重组策略。使用寡核苷酸ΔgdhAF和ΔgdhAR来从质粒pKD3扩增所述氯霉素抗性盒。

ΔgdhAF(SEQ ID NO 64)：

taaacaacataagcacaatcgtattaatatataagggttttatatctatg 具有

-与gdhA基因上游的序列(1840348至1840397)(http://ecogene.org/blast.php)同源的区(小写)，

ΔgdhAR(SEQ ID NO 65)：

taagcgtagcgccatcaggcatttacaacttaaatcacaccctgcgccag 具有：

-与gdhA基因下游区和末端的序列(1840348至1840397)(http://ecogene.org/blast.php)同源的区(小写)，

-供扩增氯霉素抗性盒(参照序列见Datsenko，K.A.&Wannep，B.L.，2000，PNAS，97：6640-6645)的区(大写粗体)，

然后将获得的PCR产物通过电穿孔导入菌株MG 1655(pKD46)。然后选择氯霉素抗性转化体，并通过PCR分析用寡核苷酸Ptrc-gdhAverF和gdhA R验证抗性盒的插入。

Ptrc-gdhAverF(SEQ ID NO 66)：

CCTTAACGTTATTGTCTCTGC

-与gdhA基因上游区的序列(1840168至1840188)(http://ecogene.org/blast.php)同源的区，

gdhA R(SEQ ID NO 67)：

GGAGGAAGCCCCAGAGCAGG

-与gdhA基因下游区的序列(1842274至1842293)(http://ecogene.org/blast.php)同源的区。

所得的菌株命名为MG1655ΔgdhA::Cm。

为了转移ΔgdhA::Cm，使用噬菌体P1转导。将菌株MG1655ΔgdhA::Cm的噬菌体裂解液用于转导入菌株MG1655ΔsucCDΔaceBAKΔarcA::Km。

然后选择卡那霉素和氯霉素抗性转化体，且通过PCR分析用前述限定的寡核苷酸Ptrc-gdhAverF和gdhA R验证ΔgdhA::Cm。所得的菌株命名为MG1655ΔsucCDΔaceBAKΔarcA::Km ΔgdhA::Cm。

然后消除卡那霉素和氯霉素抗性盒。然后将携带作用于卡那霉素和氯霉素抗性盒的FRT位点的FLP重组酶的质粒pCP20通过电穿孔导入重组位点。在42℃的系列培养之后，卡那霉素和氯霉素抗性盒的丧失通过PCR分析用如前所用的相同寡核苷酸(aceBAKF/aceBAKR、sucCDF/sucCDR、arcAF/arcAR、和gdhAverF/gdhAR)进行验证。所得的菌株命名为MG1655ΔsucCDΔaceBAK ΔarcA ΔgdhA.

4.3构建供过表达丙酮丁醇梭菌的双功能性乙醛CoA/醇脱氢酶adhE2和大肠杆菌的丙酰CoA合成酶prpE基因的质粒：pUC19-Ptrc01/OP01/RBS01-adhE2ca-prpE-TT02

将来自丙酮丁醇梭菌、编码双功能性乙醛CoA/醇脱氢酶的adhE2基因克隆于质粒pUC19。将编码丙酰CoA合成酶的prpE基因克隆于adhE2的上游。

adhE2基因是从丙酮丁醇梭菌菌株ATCC824的巨大质粒(megaplasmid)pSol1(33722至36298位)用寡核苷酸adhE2Ca F和adhE2Ca R用PCR扩增的。

adhE2Ca F(SEQ ID NO 68)：

gagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtgg taaggaggtatatt具有

-供添加KpnI、BamHI、ApaI限制性位点的区(粗体小写)

-供添加启动子Ptrc01的区(下划线小写)

-供添加操纵子序列OP01的区(斜体小写)

-供添加SnaBI限制性位点的区(粗体大写)

-供添加RBS01序列的区(小写)

-与丙酮丁醇梭菌33722至33752的adhE2区同源的区(下划线大写)

adhE2Ca R(SEQ ID NO 69)：

GAGCTCAAGCTT AATGATTTTATATAGATATCCTTAAGTTCAC，具有

-供添加HindIII、SacI限制性位点的区(大写)

-供添加终止子TT02的区(下划线粗体小写)

-供添加PacI、XbaI、NheI、AvrII限制性位点的区(斜体)

-与丙酮丁醇梭菌36264至36298的adhE2区同源的区(下划线大写)。

将该PCR片段用BamHI和HindIII消化，并克隆入用相同限制性酶消化的载体pUC19。所得的质粒命名为pUC19-Ptrc01/OP01/RBS01-adhE2ca-TT02。

为了扩增prpE基因，使用大肠杆菌的染色体DNA作为模板和引物prpEF和prpE R实施PCR。

prep F(SEQ ID NO 70)：

aagttcaacaggagagcattatg

-供添加限制性位点XbaI和BamHI的区(粗体下划线)

-与351910至351932的区同源的区(http://ecogene.org/blast.php)(小写)

prep R_(SEQ ID NO 71)：

ctactcttccatcgcctggc

-供添加限制性位点BamHI、NheI、AvrII、SnaBII的区(粗体下划线)

-与353816至353797的区同源的区(http://ecogene.org/blast.php)(小写)

将该PCR片段用XbaI和NheI消化，并克隆入用相同限制性酶消化的载体pUC19-Ptrc01/OP01/RBS01-adhE2ca-TT02。所得的质粒命名为pUC19-Ptrc01/OP01/RBS01-adhE2ca-prpE-TT02。

4.4构建MG1655ΔsucCD ΔaceBAK ΔarcA ΔgdhA(pUC19-Ptrc01/OP01/RBS01-adhE2ca-prpE-TT02)(pME101-kivDll-yqhD-TT07)菌株

然后将p UC19-Ptrc01/OP01/RBS01-adhE2ca-prpE-TT02和pME101-kivDll-yqhD-TT07质粒导入菌株MG1655ΔsucCD ΔaceBAK ΔarcAΔgdhA。

实施例5

在锥形瓶中发酵乙二醇生产菌株

在500ml带隔板的锥形瓶培养中使用补充10g/l MOPS和10g/l葡萄糖并调整至pH 6.8的改良M9培养基(Anderson，1946，Proc.Natl.Acad.Sci.USA32：120-128)评价菌株的性能。若需要，以50mg/l的浓度添加大观霉素，和/或若需要，以30mg/l的浓度添加氯霉素。使用24h预培养来将50ml培养物接种至约0.3的OD600nm。将培养物在37℃和200rpm在振荡器上维持直至培养基中的葡萄糖耗尽。在培养结束时，通过使用用于分离的Biorad HPX 97H柱和用于检测的折光计的HPLC来分析葡萄糖和主要产物。乙二醇的产生通过气相色谱/质谱(GC/MS)用偶联于Hewlett Packard 5973Series质量选择性检测器(EI)和HP-INNOWax柱(25m长，0.20mm i.d.，0.20微米的薄膜厚度)的Hewlett Packard 6890Series气相色谱仪来确证。将生成的乙二醇的保留时间和质谱与乙二醇可信样品进行比较。

所述生产菌株和参照菌株的性能比较在下表中给出。(对于生产菌株的构建，见下)

nd：未检出

实施例6

构建乙二醇途径流量增加的菌株：MG1655ΔpykF(pME101-kivDll-yqhD-yeaB-TT07)(pCC1BAC-serA)

6.1构建供过表达乳酸乳球菌的羟基酮酸脱羧酶kivD、大肠杆菌的羟基醛还原酶yqhD和磷酸羟基丙酮酸磷酸酶yeaB基因的质粒：pME101-kivDll-yqhD-yeaB-TT07质粒

将含有yeaB的片段用XbaI和BglII限制性酶切并克隆入用相同限制性酶限制性酶切的载体pME101-kivDll-yqhD，所得的质粒命名为pME101-kivDll-yqhD-yeaB-TT07。

将yeaB基因从大肠杆菌MG1655菌株的基因组DNA用寡核苷酸yeaB F和yeaB R进行PCR扩增：

yeaB F(SEQ ID NO 72)

AGCT taaggaggtatattATGGAATACCGTAGCCTGACGC

-供添加BstZ17I、EcoRI和BglII限制性位点的区(斜体粗体大写)

-供添加核糖体结合位点的区(下划线小写)

-与大肠杆菌MG1655的1894195至1894215的yeaB区同源的区(大写)(参照序列见网站http://www.ecogene.org/)，

yeaB R(SEQ ID NO 73)

GCTAGCAGAAAGGCCCACCCGAAGG TGAGCCAGGA

-与大肠杆菌MG1655的1894772至1894745的yeaB区同源的区(粗体大写)(参照序列见网站http://www.ecogene.org/)，

-与终止子序列T7te同源的区(下划线大写)(参见：Harrington K.J.，Laughlin R.B.和Liang S.Proc Natl Acad Sci U S A.2001 Apr24；98(9)：5019-24.)：

-供添加PsiI、PvuII、XbaI、BstZ17I、XmnI、PacI、SacI和AvrII限制性位点的区(斜体大写)

将经PCR扩增的片段用限制性酶XbaI和BglII切割，并克隆入载体pME101-kivDll-yqhD-TT07的XbaI-BglII位点，给出载体pME101-kivDll-yqhD-yeaB-TT07。

6.2构建供过表达大肠杆菌的磷酸甘由酸脱氢酶serA的质粒：pCC1BAC-serA质粒

为了增加serA基因的表达，将该基因从拷贝控制载体(copy control vector)pCC1BAC(Epicentre)使用其合适的启动子表达。

为此目的，将serA基因从大肠杆菌基因组使用寡核苷酸serAF和serAR扩增。使用酶XbaI和SmaI对PCR产物进行限制性酶切，并克隆入用相同限制性酶限制性酶切的载体pUC18(Stratagene)。所得的载体命名为pUC18-serA。

serAF(SEQ ID NO 74)：

ctagTTAGTACAGCAGACGGGCGCG

具有

-与serA基因的序列(3055199-3055220)(参照序列见网站http://www.ecogene.org/)同源区(大写)，

-携带XbaI位点的区(粗体)

serAR(SEQ ID NO 75)：

tccCCGTCAGGGCGTGGTGACCG

具有

-与serA基因的序列(3056880-3056880)(参照序列见网站http://www.ecogene.org/)同源的区(大写)，

-携带SmaI和HindIII位点的区(粗体)

为了将基因serA转移至拷贝控制载体pCC1BAC，将载体pUC18-serA用酶HindIII限制性酶切并克隆入可即时HindIII克隆的pCC1BAC(HindIIIcloning ready pCC 1BAC)(Epicentre)。

验证了所得的构建体，并命名为pCC1BAC-serA。

6.3构建MG1655ΔpykF(pME101-kivDll-yqhD-yeaB-TT07)(pCC1BAC-serA)菌株

之前详述了MG1655ΔpykF菌株的构建(2.2部分)。

然后将pCC1BAC-serA和pME101-kivDll-yqhD-yeaB-TT07质粒导入菌株MG1655ΔpykF。

实施例7

表明由乳酸乳球菌的基因kivD编码的羟基酮酸脱羧酶活性

7.1构建供KivD表征的菌株：BL21(pPAL 7-kivDll)

为了表征KivD蛋白，从表达载体pPAL7(Bio-rad)表达相应的基因。

为此目的，使用寡核苷酸pPAL7-kivDll F和pPAL7-kivDll R从乳酸乳球菌基因组扩增kivD基因。将PCR产物使用酶HindIII和EcoRI限制性酶切，并克隆入用相同限制性酶限制性酶切的载体pPAL7。所得的载体命名为pPAL7-kivDll。

pPAL7-kivDll F(SEQ ID NO 76)：

cccAAGCTTtg

具有

-与乳酸乳球菌kivD基因的合成基因的序列同源的区(斜体)，

-携带生成含有短N端氨基酸延伸以促进纯化的无标记蛋白所需的核苷酸的区(粗体)，

-携带HindIII限制性位点的区(下划线)

pPAL7-kivDll R(SEQ ID NO 77)：

gGAATTC

具有

-与乳酸乳球菌kivD基因的合成基因的序列同源的区(斜体)，

-携带EcoRI限制性位点的区(下划线)。

然后将pPAL7-kivDll质粒导入菌株BL21(DE3)感受态细胞(Invitrogen)。

7.2蛋白KivD的过产生

蛋白KivD的过产生是在2l锥形瓶中使用补充2.5g/l葡萄糖和100mg/l氨苄西林的LB培养液(Bertani，1951，J.Bacteriol.62：293-300)进行的。使用过夜预培养物以将500ml的培养物接种至约0.15的OD_600nm。该预培养是在充满50ml补充2.5g/l葡萄糖和100mg/l氨苄西林的LB培养液的500ml锥形瓶中进行的。将培养物首先在37℃和200rpm在振荡器上维持至OD_600nm为约0.5，然后将培养物移至第二振荡器上在25℃和200rpm直至OD_600nm为0.6-0.8(约一小时)，接着用500μM IPTG诱导。将培养物维持在25℃和200rpm直至OD_600nm为4左右，然后停止。将细胞在4℃以7000rpm离心5分钟，然后在-20℃储藏。

7.3蛋白KivD的纯化

7.3.1步骤1：制备不含细胞的提取物

将约188mg大肠杆菌生物质悬于30ml的100mM磷酸钾pH 7.6和蛋白酶抑制剂混合液中。将细胞悬液(15ml每锥形管)在冰上在50ml锥形管中以8个循环，每循环30秒，循环间间隔30秒进行声处理(Bandelin sonoplus，70W)。在声处理之后，将细胞在室温用5mM MgCl₂和1UI/ml的DNaseI温育30分钟。通过在4℃以12000g离心30分钟去除细胞碎片。

7.3.2步骤2：亲和纯化

依照生产商推荐的实验方案通过在Profinity柱(BIORAD，Bio-Scale MiniProfinity精确柱(exact cartridge)5ml)上的亲和法来从粗细胞提取物纯化蛋白质。将粗提取物加载于5ml用100mM磷酸钾pH 7.6平衡的Profinity精确柱上。用10个柱体积的相同缓冲液洗涤该柱，并将其在4℃用100mM磷酸钾pH 7.6，100mM氟化物温育过夜。用2个柱体积的100mM磷酸钾pH 7.6将蛋白质从柱上洗脱。标记仍旧紧密结合于树脂，而纯化的蛋白质被释放。汇集含有该蛋白质的级分并将其针对100mM磷酸钾，150mM NaCl和10％甘油pH 8进行透析。

蛋白质浓度使用Bradford蛋白质测定法进行测量。

7.4羟基酮酸脱羧酶测定

7.4.15-羟基-2-酮基戊酸的化学合成

5-羟基-2-酮基戊酸的化学合成描述于下述公开文献：

Friedhelm Korte，Karl Heinz Büchel，α-Hydroxyalkyliden-lacton-Umlagerung，X.α-Hydroxyalkyliden-lacton-Umlagerung inChemischeBerichte，Volume 92Issue 4，Pages 877-883(1959)

7.4.24-羟基-2-酮基丁酸的化学合成

4-羟基-2-酮基丁酸的化学合成描述于下述公开文献：

R S Lane；EE Dekker；(1969)2-keto-4-hydroxybutyrate.Synthesis，chemicalproperties，and as a substrate for lactate dehydrogenase of rabbit muscleBiochemistry.，8(7)，2958-2966。

7.4.3羟基酮酸脱羧酶测定法

羟基酮酸的脱羧是在30℃使用偶联的酶测定法来测量的。该羟基酮酸脱羧酶活性测定法是用50mM磷酸钾缓冲液pH 6，0.2mM NADH、1mMMgSO₄、0.5mM硫胺素二磷酸、72单位/ml来自酿酒酵母的醇脱氢酶、10mM中和的羟基酮酸(羟基丙酮酸或4-羟基2-酮基丁酸或5-羟基2-酮基戊酸)和约40μg纯化的蛋白质在1ml的总体积中实施的。在分光光度计上在340nm监视NADH的消耗。将在缺乏底物的对照测定中检测出的活性从在有底物的测定中检测出的活性中减去。一个单位的羟基酮酸脱羧酶活性为在30℃每分钟催化1μmol羟基酮酸脱羧所需的酶量(Epsilon 340nm＝6290M^-1cm^-1)。

7.5纯化的酶的活性

实施例8

表明由大肠杆菌的基因yqhD编码的羟基醛还原酶活性

8.1构建供YqhD表征的菌株：MG1655ΔpykF:Km (pTR(99A-yqhD)

8.1.1构建菌株MG1655ΔyqhD::Km

为了缺失yqhD基因，使用由Datsenko&Wanner(2000)所述的同源重组策略。该策略允许氯霉素或卡那霉素抗性盒的插入，而缺失大部分涉及的基因。为此目的，使用了下述寡核苷酸：

ΔyqhDF(SEQ ID NO 78)

atgaacaactttaatctgcacaccccaacccgcattctgtttggtaaaggcgcaatcgctggtttacgcgaacaaattccg

具有

-与yqhD区的序列(3153377-3153456)(参照序列见网站http://www.ecogene.org/)同源的区(小写)，

ΔyqhDR(SEQ ID NO 79)

ttagcgggcggcttcgtatatacggcggctgacatccaacgtaatgtcatgattttcgcccagttgggtcatgccgtgctc

具有

-与yqhD区的序列(3154540-3154460)(参照序列见网站http://www.ecogene.org/)同源的区(大写)，

将寡核苷酸ΔyqhDF和ΔyqhDR用于从pKD4质粒扩增卡那霉素抗性盒。然后将获得的PCR产物通过电穿孔导入菌株MG 1655(pKD46)。然后选择卡那霉素抗性转化体，并通过PCR分析用下述定义的寡核苷酸yqhDF和yqhDR验证抗性盒的插入。所得的菌株命名为MG1655ΔyqhD::Km.yqhDF(SEQ IDNO 80)：ggcgtctcgccatacaacaaacgcacatcgggc(同源于3153068至3153100的序列)。yqhDR(SEQ ID NO 81)：gggctttgccgacaccttcttcgttcttg(同源于3154825至3154797的序列)。

8.1.2构建质粒pTRC99A-yqhD

为了表征YqhD蛋白，从载体pTRC99A(Amersham)表达相应的基因。

为此目的，使用寡核苷酸yqhD F pTRC99A F和yqhD R pTRC99A R从大肠杆菌基因组扩增yqhD基因。将PCR产物使用酶HindIII和BspHI限制性酶切，并克隆入用NcoI-HindIII限制性酶限制性酶切的载体pTRC99A。所得的载体命名为pTRC99A-yqhD。

yqhD F pTRC99AF(SEQ ID NO 82)：

cgatgcacg acaactttaatctgcacaccccaacccg，

具有：

-与基因yqhD的序列(3153377-3153408)(参照序列见网站http://www.ecogene.org/)同源的区(下划线)，

-BspHI限制性位点(粗体)

yqhD R pTRC99A R(SEQ ID NO 83)：

ggcgtaaa agcgggcggcttcgtatatacggcggctgacatccaacgtaatgtcgtgattttcg

具有：

-与基因tqhD的序列(3154540-3154483)(参照序列见网站http://www.ecogene.org/)同源的区(下划线)，

-HindIII限制性位点(粗体)。

然后将pTRC99A-yqhD质粒导入菌株MG1655ΔyqhD::Km。

8.2蛋白YqhD的过产生

在2l带隔板的锥形瓶中使用500ml补充2.5g/l葡萄糖和50mg/l氨苄西林和50mg/l的卡那霉素的LB培养基在37℃在有氧条件下过产生蛋白YqhD。在定轨振荡器上以200rpm振荡烧瓶。当在550nm测量的吸光度达到0.5单位时，将烧瓶在25℃温育。当在550nm测量的吸光度达到1.2单位时，通过将IPTG添加至终浓度500μM来诱导YqhD蛋白的产生。当培养物达到高于3.5单位的吸光度时，通过离心收获生物质。弃去上清，并将沉淀储藏于-20℃直至使用。

8.3蛋白YqhD的纯化

8.3.1步骤1：制备不含细胞的提取物

将400mg大肠杆菌生物质悬于70ml的50mM Hepes pH 7.5和蛋白酶抑制剂混合液中。将细胞在冰上在Rosett小杯(cell)RZ3中以8个循环，每循环30秒，循环间间隔30秒进行声处理(Bandelin sonoplus，70W)。在声处理之后，将细胞在室温用1mM MgCl₂和1UI/ml的DNaseI温育1小时。通过在4℃以12000g离心30分钟去除细胞碎片。保留上清作为粗提取物。

8.3.2步骤2：硫酸铵沉淀

将粗提取物以50％硫酸铵的浓度进行沉淀：将固体硫酸铵(300g/l)在冰上添加至所述粗提取物。在4℃温育15分钟之后，将混合物在4℃以12000g离心15分钟。弃去上清，并将沉淀溶解于50ml的50mM Hepes pH 7.5，1M硫酸铵。

8.3.3步骤3：疏水层析

使用Akta Purifier(GE Healthcare)，将来自前一步骤的蛋白质提取物加载于用相同缓冲液平衡的5ml HiTrap PhenylHP柱(GE Healthcare)上。用10个柱体积的相同缓冲液洗涤该柱。蛋白质用两步梯度洗脱：一个梯度是10个柱体积从1M至0.5M的硫酸铵，而另一个梯度是20个柱体积从0.5M至0M的硫酸铵。在洗脱之后，用10个柱体积的50mM Hepes pH 7.5洗涤柱。柱流速为2.5ml/分钟，并收集2.5ml级分。汇集含有该蛋白质的级分，在50mM HepespH 7.5中透析，并浓缩至1.14μg/μl的浓度。

8.4羟基醛还原酶测定法

8.4.14-羟基丁醛的化学合成

4-羟基丁醛的化学合成描述于下述公开文献：

N°158Transposition des dihydro-2.5furannes en dihydro-2.3furannes.-Application àla préparation de l’hydroxy-4butanal；par R.PAUL，M.FLUCHAIRE et G. GOLLARDEAU。

Bulletin de la SociétéChimique de France，668-671，1950。

8.4.2羟乙醛和4-羟基丁醛还原酶活性测定法

羟乙醛和4-羟基丁醛还原酶活性是通过用分光光度计在340nm的波长并在30℃的恒定温度测量NADPH氧化的起始速率来测定的。使用羟乙醛或4-羟基丁醛作为底物的反应混合物是在20mM Hepes pH 7.5、0.1mM硫酸锌、0.2mM NADPH、2μg的纯化酶以1ml的终浓度实施的。将反应混合物在30℃温育5分钟，然后通过以终浓度10mM添加底物(羟乙醛或4-羟基丁醛)来起始反应。将缺乏底物的对照测定(空白)平行运行，并将其针对对照测量的值从对于测定测量的值中减去以考虑NADPH的非特异性氧化。(Epsilon 340nm＝6290M^-1cm^-1)。

一个单位的酶活性定义为在测定条件下每分钟消耗1μmol底物的酶量。酶的比活性表示为每mg蛋白质的单位数。

8.4.33-羟基丙醛还原酶活性测定法

YqhD对底物3-羟基丙醛(3-HPA)的活性描述于下述公开文献：

Hongmei Li；Jia Chen；Hao Li；Yinghua Li；Ying Li；(2008).Enhancedactivity of yqhD oxidoreductase in synthesis of 1，3-propanediol by error-pronePCR Prog Nat Sci.，18(12)，1519-1524。

这些作者使用了5mM氯化锌、1mM EDTA和1mMβ-巯基乙醇用于其3-羟基丙醛还原酶测定。

8.5纯化的酶的活性

实施例9

表明由大肠杆菌的基因serC编码的L-丝氨酸转氨酶活性

9.1构建供SerC表征的菌株：BL21(pPAL7-serC)

为了表征SerC蛋白，从表达载体pPAL7(Bio-rad)表达相应的基因。

为此目的，使用寡核苷酸pPAL7-serC F和pPAL7-serC R从大肠杆菌基因组扩增serC基因。将PCR产物使用酶HindIII和EcoRI限制性酶切，并克隆入用相同限制性酶限制性酶切的载体pPAL7。所得的载体命名为pPAL7-serC。

pPAL7-serC F (SEQ ID NO 84)：

cccAAGCTTtg

具有

-与基因serC的序列(956876-956904)(参照序列见网站http://www.ecogene.org/)同源的区(粗体)，

-携带HindIII限制性位点的区(下划线)

pPAL7-serC R(SEQ ID NO 85)：

gGAATTC

具有

-与基因serC区的序列(957964-957937)(参照序列见网站http://www.ecogene.org/)同源的区(粗体)，

-携带EcoRI限制性位点的区(下划线)

然后将pPAL7-serC质粒导入感受态BL21(DE3)细胞(Invitrogen)。

9.2蛋白SerC的过产生

蛋白SerC的过产生是使用与实施例#7.2相同的实验方案完成的。

9.3蛋白SerC的纯化

9.3.1步骤1：制备不含细胞的提取物

将约280mg大肠杆菌生物质悬于45ml的100mM磷酸钾pH 7.6和蛋白酶抑制剂混合液中。将细胞悬液(15ml每锥形管)在冰上在50ml锥形管中以8个循环，每循环30秒，循环间间隔30秒进行声处理(Bandelin sonoplus，70W)。在声处理之后，将细胞在室温用5mM MgCl₂和1UI/ml的DNaseI温育30分钟。通过在4℃以12000g离心30分钟去除细胞碎片。

9.3.2步骤2：亲和纯化

依照生产商推荐的实验方案通过在Profinity柱(BIORAD，Bio-Scale MiniProfinity精确柱(exact cartridge)5ml)上的亲和法来从粗细胞提取物纯化蛋白质。将粗提取物加载于5ml用100mM磷酸钾pH 7.6平衡的Profinity精确柱上。用10个柱体积的相同缓冲液洗涤该柱，并将其在室温用100mM磷酸钾pH 7.6，100mM氟化物温育30分钟。用2个柱体积的100mM磷酸钾pH7.6将蛋白质从柱上洗脱。标记仍旧紧密结合于树脂，而纯化的蛋白质被释放。汇集含有该蛋白质的级分并将其针对100mM Tris HCl，150mM NaCl和10％甘油pH 8进行透析。

蛋白质浓度使用Bradford蛋白质测定法进行测量。

9.4L-丝氨酸转氨酶活性测定法

对于L-丝氨酸转氨酶活性测定，将约30μg纯化的酶添加至在总体积300μl中含有50mM Tris-HCl缓冲液pH 8.2、3mM L-丝氨酸、1mM α-酮戊二酸的缓冲液中。将反应物在30℃温育60分钟。反应产物(羟基丙酮酸)直接通过LC-MS/MS测量。

9.5纯化的酶的活性

实施例10

表明由酿酒酵母的基因GPP2编码的3-磷酸羟基丙酮酸磷酸酶活性

10.1构建供GPP2sc表征的菌株：BL21(pPAL7-gpp2sc)

为了表征GPP蛋白，从表达载体pPAL7(Bio-rad)表达相应的基因。

为此目的，使用寡核苷酸pPAL7-gpp2sc F和pPAL7-gpp2sc R从酿酒酵母基因组扩增gpp基因。将PCR产物使用酶HindIII和BamHI限制性酶切，并克隆入用相同限制性酶限制性酶切的载体pPAL7。所得的载体命名为pPAL7-gpp2sc。

pPAL7-gpp2sc F(SEQ ID NO 86)：

cccAAGCTTTg

具有

-与基因gpp2区的序列(280680-280655)(参照序列见网站http://www.yeastgenome.org/)同源的区(粗体)，

-携带HindIII限制性位点的区(下划线)

pPAL7-kivDll R(SEQ ID NO 87)：

gGGATCC

具有

-与基因gpp2区的序列(279928-279954)(参照序列见网站http://www.yeastgenome.org/)同源的区(粗体)，

-携带BamHI限制性位点的区(下划线)

然后将pPAL7-gpp2sc质粒导入感受态BL21(DE3)细胞(Invitrogen)。

10.2蛋白GPP2sc的过产生

蛋白GPP2sc的过产生是使用与实施例#7.2相同的实验方案完成的。

10.3蛋白GPP2sc的纯化

10.3.1步骤1：制备不含细胞的提取物

将约294mg大肠杆菌生物质悬于45ml的100mM磷酸钾pH 7.6和蛋白酶抑制剂混合液中。将细胞悬液(15ml每锥形管)在冰上在50ml锥形管中以8个循环，每循环30秒，循环间间隔30秒进行声处理(Bandelin sonoplus，70W)。在声处理之后，将细胞在室温用5mM MgCl₂和1UI/ml的DNaseI温育30分钟。通过在4℃以12000g离心30分钟去除细胞碎片。

10.3.2步骤2：亲和纯化

依照生产商推荐的实验方案通过在Profinity柱(BIORAD，Bio-Scale MiniProfinity精确柱(exact cartridge)5ml)上的亲和法来从粗细胞提取物纯化蛋白质。将粗提取物加载于5ml用100mM磷酸钾pH 7.6平衡的Profinity精确柱上。用10个柱体积的相同缓冲液洗涤该柱，并将其在室温用100mM磷酸钾pH 7.6，100mM氟化物温育过夜。用2个柱体积的100mM磷酸钾pH 7.6将蛋白质从柱上洗脱。标记仍旧紧密结合于树脂，而纯化的蛋白质被释放。汇集含有该蛋白质的级分并将其针对100mM磷酸钾，150mM NaCl和10％甘油pH 8进行透析，并浓缩至0.22μg/μl的浓度。

蛋白质浓度使用Bradford蛋白质测定法进行测量。

10.43-磷酸羟基丙酮酸磷酸酶活性测定法

10.4.13-磷酸羟基丙酮酸的化学合成

3-磷酸羟基丙酮酸的化学合成描述于下述公开文献：

CE Ballou；H Hesse；R Hesse；(1956).The Synthesis and Properties ofHydroxypyruvic Acid Phosphate J Am Chem Soc.，78(15)，3718-3720。

10.4.23-磷酸羟基丙酮酸磷酸酶活性测定法

3-磷酸羟基丙酮酸磷酸酶活性测定是用在300μl总体积中的50mMTris-HCl缓冲液pH 8.2、5mM MgCl₂、3.6mM 3-磷酸羟基丙酮酸和约6μg的纯化的酶(Gpp)实施的。将反应物在30℃温育120分钟。反应产物(羟基丙酮酸)直接通过LC-MS/MS测量。

10.5纯化的酶的活性

实施例11

模拟乙二醇、1，3-丙二醇和1，4-丁二醇产生的最大产率

11.1用于模拟的参数

模拟是用我们专有的METEX软件METOPT^TM进行的。使用了简化的大肠杆菌代谢网络(metabolic network)，其包含中央代谢网络，供所有生物质前体的代谢途径和如上所述的特定产生途径。使用针对大肠杆菌的经典的生物质组成。对于每种具体二醇，进行了两次模拟。第一个是为了计算理论最大产率(仅考虑该模型的化学计量，而无生长，无维持能量)。第二个是为了计算实际最大产率，考虑0.1h^-1的生长速率和5mmol_ATP·g_DW ^-1.h^-1的维持能量。所有模拟是用3mmol.g_DW ^-1.h^-1的葡萄糖特定摄入速率进行的。对于乙二醇和1，3-丙二醇，模拟是在有氧条件下进行的。对于1，4-丁二醇，特别在有氧和厌氧两种条件下进行了模拟。对于厌氧条件，无法将生长速率强加至0.1h^-1。其生长速率为根据可获得的ATP所能取得的最大生长速率。

11.2模拟结果

Claims

1.一种经遗传修饰用于生物产生脂族二醇的大肠杆菌菌种的微生物，所述脂族二醇选自由以下组成的组：乙二醇、1,3-丙二醇和1,4-丁二醇，

其中所述微生物经修饰包含用由来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的异源基因kivD编码的具有2-酮酸脱羧酶活性的酶对羟基-2-酮基脂族酸代谢物进行脱羧的代谢途径，用由来自大肠杆菌的基因yqhD编码的具有羟基醛还原酶活性的酶将从所述脱羧步骤获得的产物进一步还原为相应的脂族二醇，

其中所述羟基-2-酮基脂族酸代谢物：

当所述脂族二醇是乙二醇时，是羟基丙酮酸，或

当所述脂族二醇是1,3-丙二醇时，是4-羟基-2-酮基丁酸，或

当所述脂族二醇是1,4-丁二醇时，是5-羟基-2-酮基戊酸，

且其中所述微生物经遗传修饰以供改善所述羟基-2-酮基脂族酸代谢物的产生。

2.一种用于发酵产生脂族二醇的方法，所述脂族二醇选自由以下组成的组：乙二醇、1,3-丙二醇和1,4-丁二醇，所述方法包括下述步骤：

-在包含碳源的适当培养基上培养权利要求1的微生物，和

-从培养基回收相应的脂族二醇。

3.权利要求2的方法，其中所述二醇经进一步纯化。

4.权利要求2或3任一项的方法，其中所述碳源选自单糖、寡糖、糖蜜、淀粉及其组合。

5.权利要求4的方法，其中所述单糖选自己糖、戊糖及其组合。

6.权利要求4的方法，其中所述寡糖是二糖。

7.权利要求4的方法，其中所述碳源选自葡萄糖和蔗糖。

8.权利要求1的微生物，其中所述乙二醇的产生通过下列修饰而改善：

-减弱基因：gpmA、gpmB、sdaA、sdaB和pykF，和

-过表达基因：来自乳酸乳球菌的kivD和来自大肠杆菌的yqhD。

9.权利要求1的微生物，其中所述1,3-丙二醇的产生通过下列修饰而改善：

-减弱下列基因：thrLABC、metA和pykF，和

-过表达下列基因：来自乳酸乳球菌的kivD、来自大肠杆菌的yqhD、来自混浊红球菌(Rhodococcus opacus)的aao和thrA*。

10.权利要求1的微生物，其中所述1,4-丁二醇的产生通过下列修饰而改善：

-减弱下列基因：sucCD、aceBAK、arcA和gdhA，和

-过表达下列基因：来自乳酸乳球菌的kivD、来自大肠杆菌的yqhD和来自丙酮丁醇梭菌的基因adhE2。

11.一种用于发酵产生脂族二醇的方法，所述脂族二醇选自由以下组成的组：乙二醇、1,3-丙二醇和1,4-丁二醇，所述方法包括下列步骤：

-在包含碳源的适当培养基上培养权利要求8-10中任一项的微生物，和

-从培养基回收相应的脂族二醇。

12.权利要求11的方法，其中所述二醇经进一步纯化。

13.权利要求11或12的方法，其中所述碳源选自单糖、寡糖、糖蜜、淀粉及其组合。

14.权利要求13的方法，其中所述单糖选自己糖、戊糖及其组合。

15.权利要求13的方法，其中所述寡糖是二糖。

16.权利要求13的方法，其中所述碳源选自葡萄糖和蔗糖。