CN102203267A - 2-羟基异丁酸(2-hiba)的酶法产生 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物制备2-羟基异丁酸(2-HIBA)的新方法,包括用经修饰偏好从可再生资源产生2-HIBA的微生物进行的发酵方法。本发明还涉及用于上述发酵方法的经修饰的微生物。
Description
本发明涉及用于生物制备2-羟基异丁酸(2-HIBA)的新方法,包括用经修饰以利于从可再生资源产生2-HIBA的微生物进行的发酵方法。本发明还涉及用于上述发酵方法中的经修饰的微生物。
背景
2-羟基异丁酸(2-hydroxyisobutyric acid)(2-HIBA)也称为2-羟基异丁酸(2-hydroxyisobutyrate)、2-羟基-2-甲基丙酸(2-Hydroxy-2-methylpropionicacid);和2-甲基乳酸(2-methyllactic acid)。CAS登录号为594-61-6。
2-羟基异丁酸是下述三种化合物的前体:2,3-二羟基甲基丙酸、2-丙醇和甲基丙烯酸。
甲基丙烯酸(methacrylate),也称为甲基丙烯酸(methacrylic acid),是广泛用于树脂、塑料、橡胶和假牙(denture)材料中的大量产生的化学化合物(在2005年产生了三百二十万吨)。其目前是从高毒性化合物如氰化氢、甲醛或异丁烯醛产生的。因此,开发环境友好的并划算的产生甲基丙烯酸的方法是重要的。
现有技术
迄今为止,2-HIBA的酶法产生如下所示实施:
对于参考文献,参见(Lopes Ferreira N,Labbe D,Monot F,Fayolle-Guichard F,Greer CW.Microbiology(2006)152:1361-74)。
来自Rohwerter等题为“The Alkyl tert-Butyl Ether Intermediate2-Hydroxyisobutyrate is degraded via a novel cobalamin-dependant mutasepathway”的文献描述了甲基叔丁基醚和乙基叔丁基醚的降解途径。作者专注于该途径中间产物2-HIBA的降解。结果显示2-HIBA是由异丁酰CoA变位酶的小亚基降解的。
来自Rohwerter等的WO 2007/110394描述了用表达变位酶酶活性的微生物将3-羟基丁酸酶法转化为2-羟基异丁酸的方法。该酶法转化是用由所述微生物(实施例2)获得的酶提取物或通过将微生物在包含3-羟基丁酸作为酶法转化的底物的培养基上培养(实施例1)来进行的。WO 2007/110394并未公开其中所述2-羟基异丁酸是通过在微生物中转化简单碳源如葡萄糖而获得的发酵方法。在WO 2007/110394中公开的方法中,起始材料是3-羟基丁酸,其可为来自任何来源,且特别是通过常规化学合成获得的。
US 7,262,037教导了通过重组大肠杆菌(Escherichia coli)的发酵产生D-(3)-羟基丁酸的方法:图4显示了用于通过代谢物乙酰CoA和3-羟基丁酰CoA而从葡萄糖产生D-(3)-羟基丁酸的代谢途径。将来自真养雷尔氏菌(Ralstonia eutropha)的基因phaA和phaB引入重组大肠杆菌,而所编码的酶实施了乙酰CoA修饰的第一步骤。US 7,262,037并未公开如何从碳源如葡萄糖获得2-HIBA。
结合WO 2007/110394和US 7,262,037的教导将导致需要两种不同微生物的复杂方法:第一微生物用于将葡萄糖转化为3-羟基丁酸而第二微生物用于将3-羟基丁酸酶法转化为2-HIBA。
本发明的方法,即通过将微生物在丰富而廉价的可再生材料上培养来发酵制备2-HIBA,提供了针对化学工艺存在的问题以及本领域中公开的酶法转化的复杂性的解决方案。
发明概述
本发明涉及用于制备2-羟基异丁酸(2-HIBA)的方法,包括使得乙酰CoA能够转化为2-羟基异丁酸的连续步骤,所述连续步骤由下述步骤组成:
a)将乙酰CoA转化为3-羟基丁酰CoA,
b)将之前在步骤a)中获得的3-羟基丁酰CoA转化为2-羟基异丁酰CoA,和
c)将2-羟基异丁酰CoA转化为2-羟基异丁酸,
其中步骤a、b和c中的转化是酶法转化。
在一个优选实施方案中,所述酶法转化在单一微生物中实施,其中所述微生物经修饰而表达连续步骤a)、b)和c)所需的酶活性。
更优选地,本发明的方法是通过将简单碳源转化为2-羟基异丁酸(2-HIBA)而发酵产生2-HIBA的方法,包括下述步骤:
-将经修饰而表达连续步骤a)、b)和c)所需的酶活性的微生物在包含简单碳源的适当的培养基中培养,和
-从所述培养基回收2-HIBA。
步骤a)有利地用两种酶的组合实施,第一酶a1)具有乙酰乙酰CoA硫解酶或乙酰CoA乙酰转移酶活性,而第二酶a2)具有3-羟基丁酰CoA脱氢酶活性。
步骤b)有利地用具有羟基异丁酰CoA变位酶活性的酶系统实施。
有利地,步骤c)是通过用具有CoA转移酶活性或酰基CoA硫酯酶活性的酶,或用两种酶的组合将CoA转移至底物上来实施的,所述两种酶的组合中第一酶c1)具有磷酸转酰基酶(phosphotransacylase)活性而第二酶c2)具有酸激酶(acid kinase)活性。
有利地,连续步骤a)、b)和c)所需的酶活性是由外源基因编码的。
经修饰的微生物也是本发明的一部分。
发明详述
本发明涉及用于制备2-羟基异丁酸(2-HIBA)的方法,包括使得乙酰CoA能够转化为2-羟基异丁酸的连续步骤,所述连续步骤由下述步骤组成:
a)将乙酰CoA转化为3-羟基丁酰CoA,
b)将3-羟基丁酰CoA转化为2-羟基异丁酰CoA,和
c)将2-羟基异丁酰CoA转化为2-羟基异丁酸。
主要底物乙酰CoA是代谢中的重要分子。乙酰CoA是糖代谢的产物。其主要用途是将乙酰基团内的碳原子传递至柠檬酸循环从而氧化用于能量产生。乙酰CoA是在有氧细胞呼吸的第二步过程中产生的。
步骤a)、b)和c)是指明的化合物的酶法转化。术语“酶活性(enzymeactivity)”和“酶的活性(enzymatic activity)”可互换使用,并指酶或酶组合催化特定化学反应的能力。
根据本发明,2-HIBA的制备可在外源添加底物乙酰CoA的液体反应培养基中实施,或可在一种或多种用作“微工厂(mini-factory)”的微生物中实施,优选在一种微生物中实施,所述微生物能够从任何碳源合成乙酰CoA。
在本发明的说明书中,酶活性还通过提及编码具有上述活性的酶的基因来指明。基因和蛋白质通常使用来自大肠杆菌、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、真养雷尔氏菌、Aquincola tertiaricarbonis和Methylibiumpetroleiphilum的基因命名来鉴定。然而,根据本发明使用这些命名具有更加一般的含意,且涵盖了所有其它生物(更具体而言是微生物)中的相应基因和蛋白质、所述基因和蛋白质的功能性同源物、功能性变体和功能性片段。
引用IUBMB Enzyme Nomenclature用于已知的酶活性,本领域技术人员能够确定其它生物、细菌菌株、酵母、真菌等中的相同酶活性。该常规工作有利地使用通过与来源于其它微生物的蛋白质进行序列比对可确定的共有序列来进行。
用于在两个蛋白序列之间确定同源性百分比的方法对于本领域技术人员是已知的。例如,其可在使用从网站http://www.ebi.ac.uk/clustalw/可获得的软件CLUSTALW用网站上指示的缺省参数进行的序列比对之后进行。根据该比对,同一性百分比的计算可容易地通过记录相同位置的相同残基数比残基总数来进行。或者,可使用例如网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上可获得的BLAST程序用网站上指示的缺省参数来进行自动计算。
PFAM(比对和隐藏Markov模型的蛋白质家族数据库(protein familiesdatabase of alignments and hidden Markov models);http://www.sanger.ac.uk/ Software/Pfam/)代表蛋白序列比对的大集合。每个PFAM使得能够显现多重比对、发现蛋白质域、评价生物间的分布、访问其它数据库并显现已知的蛋白结构。
COG(蛋白质直向同源组的簇(clusters of orthologous groups of proteins);http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)是通过将来自代表30个主要系统发生系的66个完全测序的基因组相比较而获得的。每个COG由至少三个系来限定,其使得能够鉴定之前保守的域。
与引用的蛋白质分享同源性的蛋白质可从其它微生物获得,或可为天然蛋白的变体或功能性片段。
术语“功能性变体或功能性片段”意指所述多肽的氨基酸序列可能并不严格地限于自然界中观察到的序列,但可含有其它的氨基酸。术语“功能性片段”意指所述多肽的序列可包含比初始序列更少的氨基酸但仍旧含有足够的氨基酸来给予初始参照序列的酶活性。在本领域公知多肽可通过取代、插入、缺失和/或添加一个或多个氨基酸进行修饰同时保留其酶活性。例如,在给定位置用化学等同的氨基酸取代一个氨基酸而并不影响蛋白质的功能特性是常见的。就本发明而言,将取代限定为下述组之一之内的交换:
■小的脂族、非极性或微极性的残基:Ala、Ser、Thr、Pro、Gly
■极性、荷负电残基及其酰胺:Asp、Asn、Glu、Gln
■极性、荷正电残基:His、Arg、Lys
■大的脂族、非极性残基:Met、Leu、Ile、Val、Cys
■大的芳族残基:Phe、Tyr、Trp。
可预计导致一个荷负电残基取代另一个(如谷氨酸取代天冬氨酸)或一个荷正电残基取代另一个(如赖氨酸取代精氨酸)的变化产生功能上等同的产物。
氨基酸修饰的位置和受修饰的氨基酸在氨基酸序列中的数量并无特别限定。本领域技术人员能够识别可不影响蛋白质活性而引入的修饰。例如,在某些情况下,可预计在蛋白质N端或C端的修饰并不改变蛋白质的活性。
术语“变体”指经受如上述限定的修饰而仍旧保留初始酶活性的多肽。
术语“编码(encoding,coding)”指多核苷酸通过转录和翻译机理产生氨基酸序列的过程。该过程基于遗传密码,其为DNA中碱基序列和蛋白质中氨基酸序列之间的关系。遗传密码的一个主要特征是简并性,意指一个氨基酸可由多于一个碱基三联子(一个“密码子”)所编码。其直接后果是相同的氨基酸序列可由不同的多核苷酸编码。对于本领域技术人员公知可根据生物变化使用的密码子。在编码相同氨基酸的密码子之中,一些可优选用于给定微生物。因此设计适应于具体微生物密码子选择的多核苷酸以优化相应蛋白质在该生物中的表达是令人关注的。
具体而言,如果宿主微生物是大肠杆菌,来自其它微生物如真养雷尔氏菌的基因序列可用优选的密码子重新编码并可制备合成基因以在大肠杆菌中正确地表达(参见实施例)。
步骤a
乙酰CoA至3-羟基丁酰CoA的转化有利地用两种酶的组合获得:
-第一酶a1),其具有乙酰乙酰CoA硫解酶活性或乙酰CoA乙酰转移酶活性(EC 2.3.1.),和
-第二酶a2),其具有3-羟基丁酰CoA脱氢酶活性(EC1.1.1.157)。
在本发明的优选实施方案中,第一酶a1)是由选自下组的基因编码的基因产物:
-大肠杆菌的atoB,
-丙酮丁醇梭菌的thlA,和
-真养雷尔氏菌的phaA。
由大肠杆菌的atoB、丙酮丁醇梭菌的thlA和真养雷尔氏菌的phaA编码的三个蛋白质均显示相同的酶活性,在其序列中显示至少61%的同一性百分比。
因此,根据本发明,“具有乙酰乙酰CoA硫解酶活性或乙酰CoA乙酰转移酶活性的多肽”指所有与来自大肠杆菌的atoB的序列具有至少60%同源性,优选至少70%的同源性且更优选至少80%同源性的多肽,。
在本发明的另一个优选实施方案中,第二酶a2)是由选自下组的基因编码的基因产物:
-丙酮丁醇梭菌的hbd,和
-真养雷尔氏菌的phaB。
步骤b
3-羟基丁酰CoA至2-羟基异丁酰CoA的转化优选用具有羟基异丁酸CoA变位酶的酶系统获得。
该活性需要必需添加于培养基的钴胺素(cobalamide)辅酶源如维生素B12。
优选的编码羟基异丁酰CoA变位酶的基因是来自A.tertiaricarbonis、M.petroleiphilum或来自链霉属菌种(Streptomyces spp.)的icmA和icmB。
这些羟基异丁酰CoA变位酶在其氨基酸序列中显示至少40%的同源性。因此,“羟基异丁酰CoA变位酶活性”指所有具有该活性并其氨基酸序列与来自链霉属菌种的IcmA和IcmB蛋白分享至少40%同一性的多肽。
本发明人显示了该钴胺素依赖性变位酶的活性可通过过表达fldA-fpr激活系统来增加。上述系统公开于关于SAM-基团酶(WO 2007/047680)的领域,且本领域技术人员知道如何过表达上述系统。
本发明人还阐明了在测定中该变位酶的活性在氧气不存在时提高。在本发明的一个实施方案中,步骤b)是在厌氧或微氧(micro-aerobic)条件下实施的。
步骤c
在本发明的一个具体实施方案中,2-羟基异丁酰CoA至2-羟基异丁酸的转化是通过用具有CoA转移酶活性(EC 2.8.3)的酶将CoA转移至底物上来获得的。
优选地,所述底物为乙酸和2-羟基异丁酰CoA而所述酶具有乙酰CoA转移酶活性(EC 2.3.1.)。
在本发明的另一个实施方案中,2-羟基异丁酰CoA至2-羟基异丁酸的转化是通过用具有酰基CoA硫酯酶活性(EC 3.1.2)的酶将CoA转移至底物上来获得的。
优选地,所述底物是2-羟基异丁酰CoA而所述酶具有2-羟基异丁酰CoA硫酯酶活性,且为由选自下组的基因编码的基因产物:
-大肠杆菌的tesB,和
-流感嗜血杆菌(H.influenzae)的ybgC。
在本发明的另一个实施方案中,从2-羟基异丁酰CoA至2-羟基异丁酸的转化是用两种酶的组合来获得的:
-第一酶c1),其具有磷酸转酰基酶活性,和
-第二酶c2),其具有酸激酶(acid-kinase)活性。
在本发明的一个具体方面,酶c1)具有磷酸羟基异丁酰转移酶活性,且具体而言是由丙酮丁醇梭菌的ptb基因编码的基因产物。
在本发明的一个具体方面,酶c2)是羟基异丁酸激酶,且具体而言是由丙酮丁醇梭菌的buk基因编码的基因产物。
微生物
在本发明的一个优选方面,主要底物乙酰CoA是在微生物中通过任何碳源的生物转化来获得的。该生物转化发生于碳底物转化为能量的有氧细胞呼吸的第二步过程中。
根据本发明,术语“碳源(carbon source)”或“碳底物”或“碳源(source ofcarbon)”指任何本领域技术人员可利用以支持微生物的正常生长的碳源,包括己糖(如葡萄糖、半乳糖或乳糖)、戊糖、单糖、二糖、寡糖(如蔗糖、纤维二糖或麦芽糖)、糖蜜、淀粉或其衍生物、半纤维素、甘油及其组合。特别优选的简单碳源是葡萄糖。另一个优选的简单碳源是蔗糖。
在本发明的一个优选实施方案中,步骤a)、b)和c)是通过表达具有所述步骤a)、b)和c)的转化所需的酶活性的酶的编码基因的微生物来实施的。
优选地,步骤a)、b)和c)是通过表达所有实现酶反应所需的基因产物(如之前所述)的同一微生物来实施的。
更优选地,其为在执行所述酶反应a)、b)和c)之前提供葡萄糖至乙酰CoA的生物转化的同一微生物。因此,葡萄糖至2-HIBA的转化在单一微生物中实施。
本发明还涉及用于制备2-羟基异丁酸的微生物,其中所述微生物表达编码具有如前限定的所述步骤a)、b)和c)的转化所需的酶活性的酶的基因。
本发明因此提供了经修饰的微生物以供改进2-HIBA的产生,其中所述微生物经修饰而表达编码使得乙酰CoA能够通过由下述组成连续步骤a)、b)和c)转化为2-羟基异丁酸的酶的基因:
a)将乙酰CoA转化为3-羟基丁酰CoA,
b)将之前获得的3-羟基丁酰CoA转化为2-羟基异丁酰CoA,和
c)将2-羟基异丁酰CoA转化为2-羟基异丁酸。
具有上述酶活性的酶和编码上述酶活性的基因如上述和下述所公开。
本发明的微生物是“经修饰以改进2-HIBA产生的微生物”,其中修饰了通过转化简单碳源而改进了有利于2-HIBA产生的途径。所述经修饰以供上述改进产生的微生物比天然未经修饰的微生物产生更多的所需生物化学物。
根据本发明,术语“微生物”指细菌、酵母或真菌。优选地,微生物选自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)和棒杆菌科(Corynebacteriaceae)。更优选地所述微生物是埃希氏菌属(Escherichia)、梭菌属(Clostridium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pantoea)、沙门氏菌属(Salmonella)或棒杆菌属(Corynebacterium)的菌种。甚至更优选所述微生物是菌种大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)或丙酮丁醇梭菌或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
如果将外源基因与所有允许其在宿主微生物中表达的元件引入微生物,所述微生物可表达这些基因。用外源DNA转化微生物是本领域技术人员的常规任务。
可将外源基因整合入宿主基因组,或通过质粒或载体在染色体外表达。不同类型的质粒对于本领域技术人员而言是已知的,其根据其复制起点和细胞中的拷贝数有所不同。
根据本发明且除非另行提及,“过表达”基因或“过表达”意指:
-当一种或多种基因表达产生的酶活性不存在于未转化的微生物中时,将所述至少一个或多个外源基因引入该微生物,或
-增加一种或多种具有所述酶活性、存在于微生物中的基因的表达。
本领域技术人员知道如何在微生物中过表达基因,特别是将所述基因的一个或多个拷贝引入微生物或通过修饰基因在经修饰的启动子的调控下的表达水平来进行。
用于调控基因表达的重要元件是启动子。在本发明的一个优选实施方案中,基因可使用具有不同强度,可为诱导型的启动子来表达。这些启动子可为同源的或异源的。本领域技术人员知道如何选择最方便的启动子,例如启动子Ptrc、Ptac、Plac或lambda启动子cI是广泛使用的。
所有用于转化微生物的技术,以及用于增强本发明蛋白质产生的调节元件在本领域是公知的,且可从文献中得到,所述文献包括申请人自己关于在多种微生物中生物合成途径的修饰的专利申请,包括WO2008/052973、WO2008/052595、WO2008/040387、WO2007/144346、WO2007/141316、WO2007/077041、WO2007/017710、WO2006/082254、WO2006/082252、WO2005/111202、WO2005/073364、WO2005/047498、WO2004/076659,其内容以提述的方式并入本文。
在一个更优选的实施方案中,本发明的微生物是表达下述基因的经修饰的微生物:
-phaA(真养雷尔氏菌),phaB(真养雷尔氏菌),icmA(A.tertiaricarbonis,M.petroleiphilum),icmB(A.tertiaricarbonis,M.petroleiphilum),tesB(大肠杆菌);或
-phaA(真养雷尔氏菌),phaB(真养雷尔氏菌),icmA(A.tertiaricarbonis,M.petroleiphilum),icmB(A.tertiaricarbonis,M.petroleiphilum),ybgC(流感嗜血杆菌);或
-phaA(真养雷尔氏菌),phaB(真养雷尔氏菌),icmA(A.tertiaricarbonis,M.petroleiphilum),icmB(A.tertiaricarbonis,M.petroleiphilum),ptb(丙酮丁醇梭菌),buk(丙酮丁醇梭菌);或
-thlA(丙酮丁醇梭菌),hbd(丙酮丁醇梭菌),icmA(A.tertiaricarbonis,M.petroleiphilum),icmB(A.tertiaricarbonis,M.petroleiphilum),tesB(大肠杆菌);或
-thlA(丙酮丁醇梭菌),hbd(丙酮丁醇梭菌),icmA(A.tertiaricarbonis,M.petroleiphilum),icmB(A.tertiaricarbonis,M.petroleiphilum),ybgC(流感嗜血杆菌);或
-thlA(丙酮丁醇梭菌),hbd(丙酮丁醇梭菌),icmA(A.tertiaricarbonis,M.petroleiphilum),icmB(A.tertiaricarbonis,M.petroleiphilum),ptb(丙酮丁醇梭菌),buk(丙酮丁醇梭菌);或
-atoB(大肠杆菌),hbd(丙酮丁醇梭菌)或phaB(真养雷尔氏菌),icmA(A.tertiaricarbonis,M.petroleiphilum),icmB(A.tertiaricarbonis,M.petroleiphilum),tesB(大肠杆菌);或
-atoB(大肠杆菌),hbd(丙酮丁醇梭菌)或phaB(真养雷尔氏菌),icmA(A.tertiaricarbonis,M.petroleiphilum),icmB(A.tertiaricarbonis,M.petroleiphilum),ybgC(流感嗜血杆菌);或
-atoB(大肠杆菌),hbd(丙酮丁醇梭菌)或phaB(真养雷尔氏菌),icmA(A.tertiaricarbonis,M.petroleiphilum),icmB(A.tertiaricarbonis,M.petroleiphilum),ptb(丙酮丁醇梭菌),buk(丙酮丁醇梭菌)
在一个具体实施方案中,上述和下述限定本发明的微生物还经修饰而产生更高水平的乙酰CoA。
可通过不同手段增加向乙酰CoA的通量(flux),具体而言:
i)通过减弱基因ldhA减少酶乳酸脱氢酶的活性,
ii)通过减弱基因,减少至少一种下述酶的活性:
·磷酸转乙酰酶,由pta基因编码,
·乙酸激酶,由ackA基因编码,
·丙酮酸氧化酶,由poxB基因编码,
iii)减少由aceA基因编码的酶异柠檬酸裂合酶的活性。
本发明的一个实施方案还通过增加NADPH的可利用度提供了2-HIBA产生的较佳产量。在微生物中该增加的可利用度可通过减弱至少一个选自下组的基因来获得:编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的pgi或编码可溶性转氢酶的udhA。具有上述遗传修饰,葡萄糖-6-磷酸必需通过磷酸戊糖途径进入糖酵解,且每个代谢的葡萄糖-6-磷酸最多产生2个NADPH。
具有增加的NADPH利用度的经修饰而改进2-HIBA产生的微生物也是本发明的一部分。
从葡萄糖至2-HIBA的生物合成途径包括示于图1的步骤a)、b)和c)。
发酵生产
本发明还公开了通过将简单碳源转化为2-羟基异丁酸(2-HIBA)而发酵产生2-HIBA的方法,包括下述步骤:
-在包含简单碳源的适当培养基中培养如上述和下述限定的本发明的微生物,和
-从所述培养基回收2-羟基异丁酸(2-HIBA)。
更具体而言,本发明提供了通过将简单碳源转化为2-羟基异丁酸(2-HIBA)来发酵产生2-HIBA的方法,包括下述步骤:
-在包含简单碳源的适当培养基中培养经修饰而改进2-HIBA产生的微生物,和
-从所述培养基回收2-羟基异丁酸(2-HIBA),
其中所述微生物经修饰而表达编码通过由下述组成的连续步骤a)、b)和c)使得乙酰CoA能够转化为2-羟基异丁酸的酶的基因:
a)将乙酰CoA转化为3-羟基丁酰CoA,
b)将之前获得的3-羟基丁酰CoA转化为2-羟基异丁酰CoA,和
c)将2-羟基异丁酰CoA转化为2-羟基异丁酸。
在优选实施方案中,微生物还经修饰而产生更高水平的乙酰CoA。还可对其修饰而增加NADPH利用度。
所有对微生物的修饰如上述和下述公开。
发酵通常在发酵罐中用适于所用的微生物、包含至少一种简单碳源和(若需要)共底物的适当的培养基进行。
发酵可在有氧、微氧或厌氧条件下进行。在一些实施方案中,发现在微氧条件下的培养可提供增加的产量。
在本发明的产生方法中,在适当的培养基上培养微生物。
“适当的培养基”意指具有已知适用于微生物生长的分子组成的培养基。具体而言,所述培养包含至少磷源和氮源。所述适当的培养基例如为具有适用于所用细菌的已知设定、含有至少一种碳源的矿物质培养基。所述适当的培养基还可指任何包含氮源和/或磷源的液体,所述液体添加至和/或混合至蔗糖源中。具体而言,用于肠杆菌科的矿物质生长培养基可因此与M9培养基(Anderson,1946)、M63培养基(Miller,1992)或如Schaefer等(1999)限定的培养基具有相同或相似的组成。
作为用于大肠杆菌的已知培养基的实例,所述培养基可与M9培养基(Anderson,1946,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 32:120-128)、M63培养基(Miller,1992;A Short Course in Bacterial Genetics:A Laboratory Manual and Handbookfor Escherichia coli and Related Bacteria,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)或如Schaefer等(1999,Anal.Biochem.270:88-96)限定的培养基具有相同或相似的组成。
作为用于谷氨酸棒杆菌的培养基的另一个实例,所述培养基可与BMCG培养基(Liebl等,1989,Appl.Microbiol.Biotechnol.32:205-210)或如Riedel等(2001,J.Mol.Microbiol.Biotechnol.3:573-583)所述的培养基具有相同或相似的组成。
本领域技术人员能够限定用于本发明的微生物的培养条件。具体而言,细菌是在20℃至55℃,优选25℃至40℃,且更具体而言对于谷氨酸棒杆菌约30℃,而对于大肠杆菌为约37℃的温度发酵。
在该培养基中碳源“葡萄糖”可由任何其它碳源替代,具体而言由蔗糖或任何其它含有蔗糖的碳源如甘蔗汁或糖甜菜汁替代。
“碳源”或“碳底物”意指任何能够由微生物代谢的碳源,其中所述底物含有至少一个碳原子。
优选地,所述碳源选自下组:葡萄糖、蔗糖、单糖或寡糖、淀粉或其衍生物或甘油及其混合物。
事实上,用于本发明方法中的微生物还可经修饰而能够在特定碳源上生长,而未经修饰的微生物无法在相同的碳源上生长,或以较低速率生长。当所述碳源是生物质降解的副产物如甘蔗副产物(包括:来自原汁和不同种类的糖蜜澄清所得的滤饼)时,这些修饰可为必需的。
从培养基回收2-羟基异丁酸对于本领域技术人员而言是常规任务。
在本发明的一个方面,进一步纯化回收的2-羟基异丁酸(2-HIBA)。
实施例
1.实施例1:构建产生2-羟基异丁酸的菌株:MG1655pME101-icmAmp-icmBmp-TT07-Plac-phaAre-phaBre-TT02
为了构建产生2-羟基异丁酸的大肠杆菌MG1655菌株,将编码变位酶活性的Methylibium petroleiphilum的icmA和icmB基因与分别编码乙酰CoA乙酰转移酶和3-羟基丁酰CoA脱氢酶活性的来自真养雷尔氏菌的phaA和phaB基因组合在质粒上过表达。每个单独的和组合的构建如下详述:
1.1构建用于过表达M.petroleiphilum的羟基异丁酰CoA变位酶icmA和icmB的质粒:pME101-icmAmp-icmBmp-TT07质粒
为此,由Geneart公司制备了M.petroletphilum icmA和icmB羟基异丁酰CoA变位酶基因的合成基因。所述基因的密码子选择和GC含量根据供应商的基质(matrix)适应于大肠杆菌。所述合成基因的表达,组织于操纵子中,由组成型Ptrc启动子驱动。将构建体克隆入供应商的pM载体中,并通过测序验证。因此若需要,可在转化大肠杆菌菌株之前将构建体克隆于pME101载体中(该质粒来源于质粒pCL1920(Lerner&Inouye,1990,NAR 18,15p 4631))。
Ptrc01-icmAmp-icmBmp-TT07由下述组成:
SEQ ID NO:2:Ptrc01启动子:gagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaataaggaggtatatc
SEQ ID NO:3:针对大肠杆菌优化的icmAmp基因序列(YP_001023546.)
SEQ ID NO:4:基因间序列:gaataaggaggtatatt
SEQ ID NO:5:针对大肠杆菌优化的icmBmp基因序列(YP_001023543.)
SEQ ID NO:6:终止子序列T7Te(参考Harrington K.J.,Laughlin R.B.和Liang S.Proc Natl Acad Sci USA.2001Apr 24;98(9):5019-24.):ctggctcaccttcgggtgggcctttctg
对于从低拷贝载体表达,可如下所述构建质粒pME101。将质粒pCL1290通过PCR使用寡核苷酸PME101F和PME101R扩增,并将来自载体pTRC99A、携带lacI基因和Ptrc启动子的BstZ17I-XmnI片段插入扩增的载体。所得的载体和携带icmAmp和icmBmp基因的载体可由NcoI和BamHI限制性酶切,并将含有icmAmp和icmBmp的片段克隆入载体pME101。所得的质粒命名为pME101-icmAmp-icmBmp-TT07
PME101F(SEQ ID NO 8):ccgacagtaa gacgggtaag cctg
PME101R(SEQ ID NO 9):agcttagtaa agccctcgct ag
1.2构建用于过表达真养雷尔氏菌乙酰CoA乙酰转移酶phaA和3-羟基丁酰CoA脱氢酶phaB的质粒:pME101-phaAre-phaBre-TT02质粒
如前所述,为此由Geneart公司制备真养雷尔氏菌phaA乙酰CoA乙酰转移酶和phaB 3-羟基丁酰CoA脱氢酶基因的合成基因。所述合成基因的表达,组织于操纵子中,由组成型Plac启动子驱动。将转录终止子添加于基因下游。将构建体克隆入供应商的pM载体,并通过测序验证。因此若需要,可在转化大肠杆菌菌株之前将所述构建体至pME101载体。
Plac-phaAre-phaBre-TT02由下述组成:
SEQ ID NO:11:Plac promoter: aagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggactaca
SEQ ID NO:12:针对大肠杆菌优化的phaAre基因序列(YP_725941.)
SEQ ID NO:13:基因间序列:
ggaaggggttttccggggccgcgcgcggttggcgcggacccggcgacgataacgaagccaatcaaggagtggac
SEQ ID NO:14:针对大肠杆菌优化的phaBre基因序列(YP_725842.)
SEQ ID NO:15:终止子序列rrnB t1(参照Harrington K.J.,Laughlin R.B.和Liang S.Proc Natl Acad Sci USA.2001Apr 24;98(9):5019-24.):catcaaataaaac gaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgtt
pME101载体和携带phaAre和phaBre基因的载体可通过BsrBI和BamHI限制性酶切,而含有phaAre和phaBre的片段可克隆入载体pME101,所得的质粒命名为pME 101-phaAre-phaBre-TT02。
1.3构建用于过表达M.petroleiphilum的羟基异丁酰CoA变位酶icmA和icmB以及真养雷尔氏菌的乙酰CoA乙酰转移酶phaA和3-羟基丁酰CoA脱氢酶phaB的质粒:pME101-icmAmp-icmBmp-TT07-Plac-phaAre-phaBre-TT02质粒
为了在大肠杆菌菌株中共表达icmA、icmB、phaA和phaB基因,将pME101-icmAmp-icmBmp-TT07载体和携带pME101-phaAre-phaBre-TT02基因的载体用SmaI和EcoRI限制性酶切,并将含有phaAre和phaBre的片段克隆入载体pME101-icmAmp-icmBmp-TT07,所得的质粒命名为pME101-icmAmp-icmBmp-TT07-Plac-phaAre-phaBre-TT02。
1.4构建菌株MG1655 pME101-phaAre-phaBre-TT02和MG1655pME101-icmAmp-icmBmp-TT07-Plac-phaAre-phaBre-TT02
将如上所述的pME101-phaAre-phaBre-TT02和pME101-icmAmp-icmBmp-TT07-Plac-phaAre-phaBre-TT02质粒引入菌株MG1655。获得的第一菌株MG1655 pME101-phaAre-phaBre-TT02命名为HI0008,获得的第二菌株MG1655 pME101-icmAmp-icmBmp-TT07-Plac-phaAre-phaBre-TT02命名为HI0012。
2.实施例2:构建产生2-羟基异丁酸的菌株:MG1655pUC18-Ptrc01-icmAmp-icmBmp-TT07-Plac-phaAre-phaBre-TT02
为了获得Methylibium petroleiphilum的编码变位酶活性的icmA和icmB基因和分别编码乙酰CoA乙酰转移酶和3-羟基丁酰CoA脱氢酶活性的来自真养雷尔氏菌的phaA和phaB更高表达,我们将这些基因引入高拷贝数的pUC18质粒。
2.1构建用于过表达Methylibium petroleiphilum的羟基异丁酰CoA变位酶icmA和icmB的质粒:pUC18-Ptrc01-icmAmp-icmBmp-TT07质粒
将携带icmAmp和icmBmp基因(pM-Ptrc01-icmAmp-icmBmp-TT07Geneart的pM载体)的载体用SmaI和HindIII限制性酶切,并将含有icmAmp和icmBmp的片段克隆入用相同限制性酶酶切的载体pUC18,所得的质粒命名为pUC18-Ptrc01-icmAmp-icmBmp-TT07。
2.2构建用于过表达Methylibium petroleiphilum羟基异丁酰CoA变位酶icmA和icrnB以及过表达真养雷尔氏菌的乙酰CoA乙酰转移酶phaA和3-羟基丁酰CoA脱氢酶phaB的质粒:pUC18-Ptrc01-icmAmp-icmBmp-TT07-Plac-phaAre-phaBre-TT02质粒
将携带phaAre和phaBre(pM-Plac-phaAre-phaBre-TT02Geneart的pM载体)的载体用SmaI和EcoRI限制性酶切,并将含有phaAre和phaBre的片段克隆入用相同的限制性酶酶切的载体pUC18-Ptrc01-icmAmp-icmBmp-TT07。所得的质粒命名为pUC18-Ptrc01-icmAmp-icmBmp-TT07-Plac-phaAre-phaBre-TT02。
2.3构建菌株MG1655 pUC18-Ptrc01-icmAmp-icmBmp-TT07-Plae-phaAre-phaBre-TT02
将如上所述的pUC18-Ptrc01-icmAmp-icmBmp-TT07-Plac-phaAre-phaBre-TT02质粒引入菌株MG1665。获得的菌株MG1655 pUC18-Ptrc01-icmAmp-icmBmp-TT07-Plac-phaAre-phaBre-TT02命名为HI0060。
3.实施例3:构建具有增加的NADPH利用度的菌株:MG1655ΔpgiΔudhA pUC18-Ptrc01-icmAmp-icmBmp-TT07-Plac-phaAre-phaBre-TT02
为了增加NADPH利用度以优化2-羟基异丁酸产生,我们将如上所述的质粒引入其中pgi(编码葡萄糖-6-磷酸异构酶)和udhA(编码可溶性转氢酶)基因已经缺失的大肠杆菌菌株MG1655。
构建菌株MG1655Δpgi::Cm
为了缺失pgi基因,使用了Datsenko&Wanner(2000)所述的同源重组策略。该策略允许插入氯霉素或卡那霉素抗性盒,而缺失大部分所述基因。为此,使用了下述寡核苷酸:
DpgiF(SEQ ID NO:17): ccaacgcagaccgctgcctggcaggcactacagaaacacttcgatgaaatgaaagacgttacgatcgccgatctttttgcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
具有
-与基因pgi(参照序列见于网站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)序列(4231352-4231431)同源的区(小写字母),
-用于扩增氯霉素抗性盒(参照序列见于Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645)的区(大写字母),
DpgiR(SEQ ID NO:18): gcgccacgctttatagcggttaatcagaccattggtcgagctatcgtggctgctgatttctttatcatctttcagctctgCATATGAATATCCTCCTTAG
具有
-与基因pgi(参照序列见于网站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)序列(4232980-4232901)同源的区(小写字母),
-用于扩增氯霉素抗性盒(参照序列见于Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645)的区(大写字母)。
使用寡核苷酸DpgiF和DpgiR从质粒pKD3扩增氯霉素抗性盒。然后将获得的PCR产物通过电穿孔引入菌株MG1655(pKD46)。然后选择氯霉素抗性转化体,并通过用下述定义的寡核苷酸pgiF和pgiR的PCR分析验证所述抗性盒的插入。所得的菌株命名为MG1655Δpgi::Cm
pgiF(SEQ ID NO:19):gcggggcggttgtcaacgatggggtcatgc(与4231138至4231167的序列同源)。
pgiR(SEQ ID NO 20):cggtatgatttccgttaaattacagacaag(与4233220至4233191的序列同源)。
3.2构建菌株MG1655ΔpgiΔudhA
通过转导在MG1655Δpgi::Cm中缺失udhA基因。
首先使用如前所述的方法用下述寡核苷酸构建MG1655ΔudhA::Km菌株:
DudhAF(SEQ ID NO:21):CCCAGAATCTCTTTTGTTTCCCGATGGAACAAAATTTTCAGCGTGCCCACGTTCATGCCGACGATTTGTGCGCGTGCCAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
具有
-与基因udhA(参照序列见于网站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)序列(4157588-4157667)同源的区(粗体字母),
-用于扩增卡那霉素抗性盒(参照序列见于Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645)的区(下划线字母),
DudhAR(SEQ ID NO:22):GGTGCGCGCGTCGCAGTTATCGAGCGTTATCAAAATGTTGGCGGCGGTTGCACCCACTGGGGCACCATCCCGTCGAAAGCCATATGAATATCCTCCTTAG
具有
-与基因udhA(参照序列见于网站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)序列(4158729-4158650)同源的区(粗体字母),
-用于扩增卡那霉素抗性盒(参照序列见于Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645)的区(下划线字母)。
使用寡核苷酸DudhAF和DudhAR从质粒pKD4扩增卡那霉素抗性盒。然后将获得的PCR产物通过电穿孔引入菌株MG1655(pKD46)。然后选择卡那霉素抗性转化体,并通过用下述定义的寡核苷酸udhAF和udhAR的PCR分析验证所述抗性盒的插入。所得的菌株命名为MG1655ΔudhA::Km
udhAF(SEQ ID NO:23):(与4157088至4157108的序列同源)GATGCTGGAAGATGGTCACT。
udhAR(SEQ ID NO 24):(与4159070至4159052的序列同源)gtgaatgaacggtaacgc。
为了转移缺失ΔudhA::Km,使用噬菌体P1转导的方法。下述实验方案以两步实施,即制备菌株MG1655ΔudhA::Km的噬菌体裂解液并然后转导入菌株MG1655Δpgi::Cm。该菌株的构建如上所述。
制备噬菌体裂解液P1:
-用10ml LB+Km 50μg/ml+葡萄糖0.2%+CaCl25mM接种100μl菌株MG1655ΔudhA::Km的过夜培养物。
-在37℃振荡温育30分钟。
-将100μl制备的噬菌体P1裂解液添加至菌株MG1655(约1.109个噬菌体/ml)。
-在37℃振荡3小时直至所有细胞裂解。
-添加200ul氯仿并涡旋。
-以4500g离心10分钟以消除细胞碎片。
-将上清转移至灭菌试管并添加200μl氯仿。
-将裂解液储藏于4℃。
转导
-将5ml菌株MG1655Δpgi::Cm在LB培养基中的过夜培养物以1500g离心10分钟。
-将细胞沉淀悬浮于2.5ml的10mM MgSO4和5mM CaCl2。
-对照试管:100μl细胞
100μl针对菌株MG1655ΔudhA::Km的噬菌体P1
-测试试管:100μl细胞+100μl针对菌株MG1655ΔudhA::Km的噬菌体P1。
-在30℃温育30分钟而不振荡。
-在每个试管中添加100μl的1M柠檬酸钠并涡旋。
-添加1ml LB。
-在37℃振荡温育1小时。
-在以7000rpm将试管离心3分钟之后在LB+Km 50μg/ml皿上涂布。
-在37℃温育过夜。
验证菌株
然后选择卡那霉素抗性转化体,并通过用前述寡核苷酸udhAF和udhAR的PCR分析验证基因ΔudhA::Km的缺失。获得的菌株命名为MG1655Δpgi::Cm ΔudhA::Km。
然后可消除卡那霉素和氯霉素抗性盒。然后将作用于卡那霉素和氯霉素抗性盒的FRT位点的携带FLP重组酶的质粒pCP20通过电穿孔引入重组位点。在42℃一系列培养之后,用与先前使用的相同的寡核苷酸(pgiF/pgiR和udhAF/udhAR)通过PCR分析验证卡那霉素和氯霉素抗性盒的丧失。获得的菌株命名为MG1655ΔpgiΔudhA。
3.3构建菌株MG1655ΔpgiΔudhApUC18-Ptrc01-icmAmp-icmBmp-TT07-Plac-phaAre-phaBre-TT02
将上述pUC18-Ptrc01-icmAmp-icmBmp-TT07-Plac-phaAre-phaBre-TT02质粒引入菌株MG1655ΔpgiΔudhA。获得的菌株MG1655ΔpgiΔudhApUC18-Ptrc01-icmAmp-icmBmp-TT07-Plac-phaAre-phaBre-TT02命名为HI0062。
4.实施例4:构建具有增加的羟基异丁酰CoA变位酶活性的菌株:MG1655(pME101-icmAmp-icmBmp-TT07-Plac-phaAre-phaBre-TT02)(pJB137-fldA-TT07-fpr)
为了增加羟基异丁酰CoA变位酶活性,我们过表达了编码黄素氧还蛋白和黄素氧还蛋白还原酶的基因。
4.1构建用于过表达黄素氧还蛋白fldA和过表达黄素氧还蛋白还原酶fpr的质粒:pJB137-fldA-TT07-fpr
质粒pJB137-fldA-TT07-fpr来源于质粒pJB137(Blatny等,1997;ApplEnviron Microbiol.1997Feb;63(2):370-9.)。
为了构建质粒pJB137-fldA-TT07-fpr,首先,从MG1655基因组DNA通过PCR使用下述寡核苷酸BamHI-NcoI-fldA-F-1和fldA-fpr-R-2(参照序列见于网站http://ecogen.org/)扩增fldA-TT07区。然后从MG1655基因组DNA通过PCR使用下述寡核苷酸fldA-fpr-F-3和fpr-BamHI-R-4(参照序列见于网站http://ecogen.org/)扩增TT07-fpr区。在第三步中,通过混合fldA-TT07和TT07-fpr PCR产物并使用BamHI-NcoI-fldA-F-1和fpr-BamHI-R-4寡核苷酸来PCR扩增fldA-TT07-fpr区。fldA-fpr-R-2和fldA-fpr-F-3寡核苷酸均设计为在其全部序列上重叠,并使得两个片段能够通过融合PCR连接。将所得的PCR产物克隆入pSCB载体(Stratagene),通过测序验证,且该载体命名为pSCB-fldA-TT07-fpr。
BamHI-NcoI-fldA-F-1(SEQ ID NO:25)
GGATCCatgcCCATGGTGTGCAGTCCTGCTCGTTTGC
具有
-携带BamHI位点的区(大写下划线),
-具有额外碱基的区(小写),
-携带NcoI位点的区(大写斜体),
-与fldA区(710804至710784)同源的区(大写粗体)。
fldA-fpr-R-2(SEQ ID NO:26)ggactggaaggctcaatcgatCCCGGGGCAGAAAGGCCCACCCGAAGGTGAGCCAGTGTGATGATCATCAGGCATTGAGAATTTCGTCG
具有
-与fldA区(710179至710156)同源的区(大写粗体)。
-T7te转录终止子序列的区(大写下划线)(Harrington K.J.,Laughlin R.B.和Liang S.Proc Natl Acad Sci USA.2001Apr 24;98(9):5019-24.),
-携带SmaI位点的区(大写斜体),
-与fpr区(4112583至4112563)同源的区(小写)。
fldA-fpr-F-3(SEQ ID NO:27)CGACGAAATTCTCAATGCCTGATGATCATCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCCCCGGGatcgattgagccttccagtcc
具有
-与fldA区(710179至710156)同源的区(大写粗体)。
-T7te转录终止子序列的区(大写下划线)(Harrington K.J.,Laughlin R.B.和Liang S.Proc Natl Acad Sci USA.2001Apr 24;98(9):5019-24.),
-携带SmaI位点的区(大写斜体),
-与fpr区(4112583至4112563)同源的区(小写)。
fpr-BamHI-R-4(SEQ ID NO:28)GGATCCttaccagtaatgctccgctgtc
具有
-与fpr区(4111770至4111749)同源的区(小写)。
-携带BamHI位点的区(大写斜体),
为了将基因fldA和fpr转移至低拷贝载体,用限制性酶NcoI和BamHI切割载体pSCB-fldA-TT07-fpr,并将fldA-TT07-fpr片段克隆入pJB137载体的NcoI/BamHI位点,得到载体pJB137-fldA-TT07-fpr。
4.2构建菌株MG1655(pME101-icmAmp-icmBmp-TT07-Plac-phaAre-phaBre-TT02)(pJB137-fldA-TT07-fpr)
将上述pME101-icmAmp-icmBmp-TT07-Plac-phaAre-phaBre-TT02和pJB137-fldA-TT07-fpr质粒引入菌株MG1655。获得的菌株MG1655(pME101-icmAmp-icmBmp-TT07-Plac-phaAre-phaBre-TT02)(pJB137-fldA-TT07-fpr)命名为HI0048。
5.实施例5:纯化编码羟基异丁酰CoA变位酶的icmA和icmB基因产物,并阐明该基因产物催化反应3-羟基丁酰CoA<->2-羟基异丁酰CoA
为了阐明羟基异丁酰CoA变位酶活性催化3-羟基丁酰CoA至2-羟基异丁酰CoA的转化,我们分别纯化了两个亚基icmA和icmB,并在体外重构了活性的多聚蛋白质。
5.1构建针对icmAmp和icmBmp的过表达质粒
构建质粒pPAL7VB01-icmAmp
为了扩增来自Methylibium petroleiphilum的基因icmA,使用供应商的来自GeneArt公司的pM载体(参见实施例1)作为模板和命名为pPAL7-icmAmp F和pPAL7-icmAmp R的引物进行PCR。
pPAL7-icmAmp F(SEQ ID NO:29)
CCCAAGCTTTGACTTCTATGACCTGGCTGGAACCGCAG
pPAL7-icmAmp R(SEQ ID NO:30)
GGAATTCTTAAAACACCGGGGTTTCACGATAGG
用HindIII和EcoRI消化PCR产物,并克隆入经相同限制性酶切割的载体pPAL7(Profinity eXact pPAL7 Vector Biorad)。所得的质粒命名为pPAL7VB01-icmAmp。过表达的蛋白质携带两个添加的氨基酸(Thr-Ser),其对应于使用的标记和蛋白之间的间隔物以确保成功的纯化。
将质粒pPAL7VB01-icmAmp引入大肠杆菌BL21star(DE3)化学感受态细胞,得到菌株BL21star(DE3)(pPAL7VB01-icmAmp)。
构建质粒pPAL7VB01-icmBmp
为了扩增来自Methylibium petroleiphilum的基因icmB,使用供应商的来自GeneArt公司的pM载体(参见实施例1)作为模板和命名为pPAL7-icmBmp F和pPAL7-icmBAmp R的引物进行PCR。
pPAL7-icmBmp F(SEQ ID NO:31)
CCCAAGCTTTGACTTCTATGGATCAGATTCCGATTCGTG
pPAL7-icmBmp R(SEQ ID NO:32)
GGAATTCTTAACGCGCACCACGCGCCGCAACC
用HindIII和EcoRI消化PCR产物,并克隆入经相同限制性酶切割的载体pPAL7(Profinity eXact pPAL7 Vector Biorad)。所得的质粒命名为pPAL7VB01-icmBmp。过表达的蛋白质携带两个添加的氨基酸(Thr-Ser),其对应于使用的标记和蛋白之间的间隔物以确保成功的纯化。
将质粒pPAL7VB01-icmBmp引入大肠杆菌BL21star(DE3)化学感受态细胞,得到菌株BL21star(DE3)(pPAL7VB01-icmBmp)。
5.2过产生羟基异丁酰CoA变位酶的两个亚基IcmAmp和IcmBmp
蛋白质IcmAmp和IcmBmp的过产生在2ll锥形瓶中使用补充了2.5g/l葡萄糖和100ppm氨苄青霉素的LB培养液(Bertani,1951,J.Bacterio1.62:293-300)进行。使用过夜预培养物来将500ml培养物接种至OD600nm为约0.1。该预培养是在填充了50ml补充了2.5g/l葡萄糖和100ppm氨苄青霉素的LB培养液的500ml锥形瓶中进行。将培养物首先振荡器上在37℃和200rpm保持直至OD600nm为约0.5,然后将培养物移至第二振荡器以25℃和200rpm振荡约一小时直至OD600nm为约0.6-0.8(约一小时),然后用500μM IPTG诱导。将该培养物保持于25℃和200rpm直至OD600nm为约4,然后将其终止。将细胞以7000rpm在4℃离心5分钟,并储藏于-20℃。
5.3纯化蛋白IcmAmp和IcmBmp
5.3.1步骤1:制备无细胞提取物
将约100mg大肠杆菌生物质重悬于15ml的100mM磷酸钾pH 7.6和蛋白酶抑制剂混合液中。将细胞悬液在冰上在50ml锥形管中在30秒及30秒间隔的8个循环过程中进行声处理(Bandelin sonoplus,70W)。声处理之后,将细胞在室温用5mM MgCl2和1UI/ml DNaseI温育30分钟。通过在4℃以12000g离心30分钟去除细胞碎片。
5.3.2步骤2:亲和纯化
从粗细胞提取物在Profinity柱(BIORAD,Bio-Scale Mini Profinity提取柱(exact cartridge)1ml)上根据生产商推荐的试验方案通过亲和力纯化所述蛋白。将粗提取物加载于用100mM磷酸钾pH 7.6平衡的1ml Profinity提取柱1ml上。用10柱体积的相同缓冲液洗涤柱,并将其用100mM磷酸钾pH 7.6,100mM氟化物在4℃温育过夜。将所述蛋白质用2柱体积的100mM磷酸钾pH 7.6从柱洗脱。标记物仍紧密地结合于树脂,并释放纯化的蛋白质。汇集含有蛋白质的级分并针对100mM Tris-HCl,150mM NaCl和10%甘油pH 8进行透析。
蛋白质浓度使用Bradford蛋白质测定法测量。
5.4羟基异丁酰CoA变位酶测定法
羟基异丁酰CoA测定法是用50mM磷酸钾缓冲液pH 7.4,5mM EDTA,20μM辅酶B12,1mM或10mM 3-羟基丁酰CoA,10%甘油和约17μg以等摩尔浓度在总体积500μl中混合的纯化的IcmAmp和IcmBmp进行的。该反应在30℃在黑暗中温育120分钟,并通过在用250μl的15%(v/v)H2SO4酸化之后添加250μl 2M KOH来终止。该酶测定法在有氧和厌氧条件下实施。形成的酸(2-羟基异丁酸)通过LC-MS来测量。
5.5纯化酶的活性
在体外测量得到的该活性阐明了通过IcmAmp、IcmBmp和辅酶B12的混合物获得的多聚活性蛋白催化3-羟基丁酰CoA至2-羟基异丁酰CoA的转化(在我们的酶测定中通过酸水解转化为2-羟基异丁酸)。我们还阐明了羟基异丁酰CoA变位酶在厌氧条件下具有20倍以上的活性。
6.实施例6:大肠杆菌的编码酰基CoA硫酯酶的tesB基因产物、丙酮丁醇梭菌的编码磷酸转丁酰基酶和丁酸激酶活性的ptbca和bukca基因产物的纯化,并阐明所述基因产物催化2-羟基异丁酰CoA至2-羟基异丁酸的转化
为了阐明酰基CoA硫酯酶活性,或磷酸转丁酰基酶和丁酸激酶活性的组合催化2-羟基异丁酰CoA至2-羟基异丁酸的转化,我们分别纯化了三个tesB、ptbca和bukca基因产物,并进行了酶测定。
6.1构建用于tesB、ptbca和bukca的过表达质粒
6.1.1构建质粒pPAL7-tesB
为了从大肠杆菌扩增基因tesB,使用大肠杆菌基因组DNA作为模板以及命名为pPAL7-tesB F和pPAL7-tesB R的引物进行PCR。
pPAL7-tesB F(SEQ ID NO:33)
CCCAAGCTTTGATGAGTCAGGCGCTAAAAAATTTACTGAC
pPAL7-tesB R(SEQ ID NO:34)
GGAATTCTTAATTGTGATTACGCATCACCCCTTCC
将PCR产物用HindIII和EcoRI消化,并克隆入用相同限制性酶切割的载体pPAL7(Profinity eXact pPAL7 Vector Biorad)。所得的质粒命名为pPAL7-tesB。
将载体pPAL7-tesB引入E.coli BL21 star(DE3)化学感受态细胞,得到菌株BL21star(DE3)(pPAL7-tesB)。
6.1.2构建质粒pPAL7VB01-ptbca
为了从丙酮丁醇梭菌扩增基因ptb,使用丙酮丁醇梭菌基因组DNA作为模板以及命名为pPAL7-ptbca F和pPAL7-ptbca R的引物进行PCR。
pPAL7-ptbca F(SEQ ID NO:35)
CCCAAGCTTTGACTTCTATGATTAAGAGTTTTAATG
pPAL7-ptbca R(SEQ ID NO:36)
GGAATTCTTATTTATTGCCTGCAACTAAAGCTGC
将PCR产物用HindIII和EcoRI消化,并克隆入用相同限制性酶切割的载体pPAL7(Profinity eXact pPAL7Vector Biorad)。所得的质粒命名为pPAL7VB01-ptbca。过表达的蛋白质携带两个添加的氨基酸(Thr-Ser),其对应于使用的标记和蛋白之间的间隔物以确保成功的纯化。
将载体pPAL7VB01-ptbca引入E.coli BL21star(DE3)化学感受态细胞,得到菌株BL21star(DE3)(pPAL7VB01-ptbca)。
6.1.3构建质粒pPAL7VB01-bukca
为了从丙酮丁醇梭菌扩增基因buk,使用丙酮丁醇梭菌基因组DNA作为模板以及命名为pPAL7-bukca F和pPAL7-bukca R的引物进行PCR。
pPAL-bukca F(SEQ ID NO:37)
CCCGCTCTTCAAAGCTTTGACTTCTATGTATAGATTACTAATAATCAATCC
pPAL-bukca R(SEQ ID NO:38)
GGAATTCTTATTTGTATTCCTTAGCTTTTTCTTCTCC
将PCR产物用SapI和EcoRI消化,并克隆入用相同限制性酶切割的载体pPAL7(Profinity eXact pPAL7 Vector Biorad)。所得的质粒命名为pPAL7VB01-bukca。过表达的蛋白质携带两个添加的氨基酸(Thr-Ser),其对应于使用的标记和蛋白之间的间隔物以确保成功的纯化。
将载体pPAL7VB01-bukca引入E.coli BL21star(DE3)化学感受态细胞,得到菌株BL21star(DE3)(pPAL7VB01-bukca)。
6.2过产生acyl-CoA硫酯酶、磷酸酶和激酶,TesB、Ptbca和Bukca
蛋白TesB、Ptbca和Bukca的过产生应用与实施例5.2相同的实验方案进行。
6.3纯化蛋白TesB、Ptbca和Bukca
6.3.1步骤1:制备无细胞提取物
将约100mg(120mg用于TesB)的大肠杆菌生物质重悬于15ml的100mM磷酸钾pH 7.6和蛋白酶抑制剂混合液。将细胞悬液在冰上在50ml锥形管中在30秒及30秒间隔的8个循环过程中进行声处理(Bandelin sonoplus,70W)。在声处理之后,将细胞在室温用5mM MgCl2和1UI/ml DNaseI温育30分钟。通过以在4℃12000g离心30分钟来去除细胞碎片。
6.3.2步骤2:亲和纯化
蛋白TesB、Ptbca和Bukca的纯化应用如上述实施例5.3.2相同的实验方案进行。
6.4酶测定
6.4.1酰基CoA硫酯酶测定
酰基CoA硫酯酶测定是用总体积1ml中的100mM磷酸钾缓冲液,pH 8,0.1mM 5,5’-二硫二-2-硝基苯甲酸(DTNB),200μM 2-羟基异丁酰CoA和约11μg的纯化蛋白进行的。在30℃在分光光度计上测量405nm处吸光度增加的速率。将不含酶的对照测定结果从测定结果中减去。一单位的酰基CoA硫酯酶活性是每分钟水解1μmol底物所需的酶量(Epsilon 405nm=13600M-1cm-1)。
6.4.2酸激酶测定
该反应在过量羟胺存在下用2-羟基异丁酸(或3-羟基丁酸)和ATP作为反应物进行。该测定方法利用了酰基磷酸在中性立即形成氧肟酸并随后在酸性溶液中形成有色的氧肟酸铁络合物的能力。在100mM Tris-HCl pH7.4缓冲液,用KOH中和的400mM羟胺pH 7.4,50mM 2-羟基异丁酸,用KOH中和的10mM ATP pH 7.4,20mM MgCl2、150mM KCl,120mM KOH和约5μg纯化酶,总体积1ml中测定酶。反应用纯化酶在37℃起始,在30分钟之后通过添加500μl含有370mM FeCl3,20%三氯乙酸和720mM HCl的溶液来终止反应。将试管在4℃以10000g离心15分钟,将上清储藏于冰上,并在540nm在分光光度计上测量吸光度。将不含酶的对照测定结果从测定结果中减去。(Epsilon 540nm=169M-1cm-1)。
6.4.3磷酸转酰基酶测定
磷酸转酰基酶测定是用总体积1ml中的100mM磷酸钾缓冲液pH 7.4,0.08mM 5,5’-二硫二-2-硝基苯甲酸(DTNB),200μM 2-羟基异丁酰CoA和约2μg的纯化蛋白进行的。在30℃在分光光度计上测量405nm处吸光度增加的速率。将不含酶的对照测定结果从测定结果中减去。一单位的磷酸转酰基酶活性是每分钟水解1μmol底物所需的酶量(Epsilon 405nm=13600M-1cm-1)。
6.5纯化酶的活性
在体外对纯化酶测量得到的这些活性阐明了酰基CoA硫酯酶活性,以及磷酸转酰基酶与酸激酶活性的组合均催化2-羟基异丁酰CoA至2-羟基异丁酸的转化。
6.6参照菌株大肠杆菌MG1655粗提取物的活性
我们阐明了由于tesB的染色体形式,在我们的参照菌株MG1655中测量的酰基CoA硫酯酶比活性足以将2-羟基异丁酰CoA转化为2-羟基异丁酸。
7.实施例7:在锥形瓶中发酵2-羟基异丁酸产生菌株
7.1在带挡板的锥形瓶中发酵2-HIBA产生菌株(有氧条件)
起初在500ml带挡板的锥形瓶培养物中使用补充10g/l MOPS,10g/l葡萄糖,10mg/l B12维生素和100μM IPTG并调整至pH 6.8的修饰的M9培养基(Anderson,1946,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 32:120-128)评价菌株的性能。如果需要,分别以50mg/l和100mg/l的浓度添加大观霉素(spectinomycin)和羧苄西林(carbenicillin)。使用24小时预培养物来将50ml培养物接种至OD600nm为约0.3至0.6。(减少预培养时间增强菌株HI0048c01的2-HIBA产生)。将培养物在37℃和200rpm保持在振荡器上直至培养基中的葡萄糖耗尽。通过HPLC使用Biorad HPX 97H柱分离并用折光计检测来跟踪葡萄糖消耗。通过LC-MS/MS(液相色谱-质谱偶联)来跟踪2-HIBA产生。
不同菌株的性能的比较在下表给出。
nd:未检测出
7.2在不带挡板的锥形瓶中发酵2-HIBA产生菌株(微氧条件)
因为已显示IcmAmp/IcmBmp酶复合物在缺乏氧气时更加有效(用体外酶测定获得的结果,参见实施例5.5),修饰了初始实验方案以应用微氧的培养步骤。然后在500ml不带挡板的锥形瓶中使用补充20g/l MOPS,10g/l葡萄糖和100μM IPTG并调整至pH 6.8的修饰的M9培养基评价菌株的性能。如果需要,分别以50mg/l和100mg/l的浓度添加大观霉素和羧苄西林。使用24小时预培养物来将50ml培养物接种至OD600nm为约0.3至0.6。将培养物在37℃和200rpm保持在振荡器上直至OD600nm高于4。然后将10mg/l B12维生素添加至培养基中,并将振荡器搅拌速度减少至100rpm直至培养基中的葡萄糖耗尽。通过HPLC使用Biorad HPX 97H柱分离并用折光计检测来跟踪葡萄糖消耗。通过LC-MS/MS(液相色谱-质谱偶联)来跟踪2-HIBA产生。
不同菌株的性能的比较在下表给出。
nd:未检测出
7.3B12维生素对带挡板的锥形瓶中菌株HI0048的2-HIBA产生的影响(有氧条件)
因为已知IcmAmp/IcmBmp酶复合物具有B12维生素依赖性,用或不用B12维生素供应在实施例7.1中所述的培养条件中实施了菌株HI0048c01的两个培养,其中用7小时的预培养代替24小时的预培养。通过HPLC使用BioradHPX 97H柱分离并用折光计检测来跟踪葡萄糖消耗。通过LC-MS/MS(液相色谱-质谱偶联)来跟踪2-HIBA产生。在图1中给出了2-HIBA的产生。
性能在下表中给出。
nd:未检测出
Claims (26)
1.一种用于制备2-羟基异丁酸(2-HIBA)的方法,包括使得乙酰CoA能够转化为2-羟基异丁酸的连续步骤,所述连续步骤由下述组成:
a)将乙酰CoA转化为3-羟基丁酰CoA,
b)将之前获得的3-羟基丁酰CoA转化为2-羟基异丁酰CoA,和
c)将2-羟基异丁酰CoA转化为2-羟基异丁酸,
其中步骤a)、b)和c)是酶法转化。
2.权利要求1的方法,其中步骤a)中的酶活性是通过两种酶的组合获得的,
-第一酶a1),具有乙酰乙酰CoA硫解酶或乙酰CoA乙酰转移酶活性,和
-第二酶a2),具有3-羟基丁酰CoA脱氢酶活性。
3.权利要求2的方法,其中酶a1)是由选自下组的基因编码的基因产物:大肠杆菌(E.coli)的atoB,丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)的thlA和真养雷尔氏菌(R.eutropha)的phaA。
4.权利要求2或3的方法,其中酶a2)是由选自下组的基因编码的基因产物:丙酮丁醇梭菌的hbd和真养雷尔氏菌的phaB。
5.权利要求1-4任一项所述的方法,其中步骤b)是用具有羟基异丁酰CoA变位酶活性的酶系统获得的。
6.权利要求5的方法,其中所述羟基异丁酰CoA变位酶活性是通过由如下基因编码的基因产物得到的酶来实施的:来自A.tertiaricarbonis、M.petroleiphilum或链霉菌属菌种的icmA和icmB。
7.权利要求6的方法,其中羟基异丁酰CoA变位酶的活性通过过表达fldA-fpr激活系统来增加。
8.权利要求1-7任一项所述的方法,其中步骤c)是通过用具有CoA转移酶活性的酶将CoA转移至底物上来获得的。
9.权利要求8的方法,其中所述酶具有乙酰CoA转移酶活性,而所述底物为乙酸和2-羟基异丁酰CoA。
10.权利要求1-7任一项所述的方法,其中步骤c)是通过用具有酰基CoA硫酯酶活性的酶将CoA转移至底物上来获得的。
11.权利要求10的方法,其中所述酰基CoA硫酯酶活性是通过由选自下组的基因编码的基因产物得到的酶实施的:大肠杆菌的tesB和流感嗜血杆菌(H.influenzae)的ybgC。
12.权利要求1-7任一项所述的方法,其中步骤c)是通过两种酶的组合获得的:
-第一酶c1),具有磷酸转酰基酶活性,和
-第二酶c2),具有酸激酶活性。
13.权利要求12的方法,其中酶c1)具有磷酸羟基异丁酰转移酶活性,特别是由丙酮丁醇梭菌的基因ptb编码的基因产物。
14.权利要求12或13任一项的方法,其中酶c2)是羟基异丁酸激酶,特别是由丙酮丁醇梭菌的基因buk编码的基因产物。
15.权利要求1-14任一项所述的方法,其中乙酰CoA是通过在微生物中生物转化碳源来获得的。
16.权利要求1-15任一项所述的方法,其中步骤a)、b)和c)由表达具有所述步骤a)、b)和c)的转化所需的酶活性的酶的编码基因的微生物来实施。
17.权利要求1-16任一项所述的方法,其中步骤a)、b)和c)由同一微生物来实施。
18.权利要求17的方法,其中所述同一微生物提供葡萄糖至乙酰CoA的生物转化。
19.一种微生物,其经修饰用于改进2-羟基异丁酸的产生,其中所述微生物表达具有权利要求2-15中限定的所述步骤a)、b)和c)的转化所需的酶活性的酶的编码基因。
20.权利要求17的微生物,其中其经修饰而产生更高水平的乙酰CoA。
21.权利要求18的微生物,其中减弱了至少一种下述基因的表达:
·pta,其编码磷酸转乙酰酶
·ackA,其编码乙酸激酶
·poxB,其编码丙酮酸氧化酶
·ldhA,其编码乳酸脱氢酶
·aceA,其编码异柠檬酸裂合酶。
22.权利要求19-20任一项所述的微生物,其中增加了NADPH的利用度。
23.权利要求22的微生物,其中减弱了至少一种下述基因的表达:
·pgi,其编码葡萄糖-6-磷酸异构酶
·udhA,其编码可溶性转氢酶。
24.权利要求19-23任一项所述的微生物,其中其为细菌,优选选自下组:肠杆菌科、梭菌科、芽孢杆菌科、链霉菌科和棒杆菌科。
25.一种通过将简单碳源转化为2-羟基异丁酸(2-HIBA)的发酵产生2-HIBA的方法,包括下述步骤:
-将权利要求19-24任一项所述的微生物在包含简单碳源的适当培养基中培养,和
-从所述培养基回收2-羟基异丁酸(2-HIBA)。
26.权利要求25的方法,其中进一步纯化2-羟基异丁酸(2-HIBA)。
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