JP2006517796A - 代謝経路の生成または改変を可能とする進化した微生物の生産方法 - Google Patents
代謝経路の生成または改変を可能とする進化した微生物の生産方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2006517796A JP2006517796A JP2006502150A JP2006502150A JP2006517796A JP 2006517796 A JP2006517796 A JP 2006517796A JP 2006502150 A JP2006502150 A JP 2006502150A JP 2006502150 A JP2006502150 A JP 2006502150A JP 2006517796 A JP2006517796 A JP 2006517796A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- evolved
- synthase
- gene
- strain
- activity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1058—Directional evolution of libraries, e.g. evolution of libraries is achieved by mutagenesis and screening or selection of mixed population of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/12—Methionine; Cysteine; Cystine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P33/00—Preparation of steroids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
- C12P7/20—Glycerol
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/52—Propionic acid; Butyric acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Ecology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本発明は、代謝経路の改変を可能とする進化した微生物を調製するための新規方法に関し、該方法は以下の工程を含むことを特徴とする:a)代謝物の産生または消費を阻害するなどの目的で、最初の微生物細胞を遺伝学的に改変することによって改変微生物を製造する工程であって、このとき微生物の成長能力に関しても影響を及ぼす規定培地内で微生物が培養される工程、b)該細胞において進化を誘導するために該規定培地中で上記のように得られた改変微生物を培養する工程であって、このとき該進化を可能とするために該規定培地に補基質を添加する必要があってもよい工程、c)任意に補基質と共に規定培地中で生育することが可能な改変微生物の細胞を選択する工程。本発明はまた、このようにして得られた進化微生物の株、該方法によって得られうる進化タンパク質をコードする進化遺伝子、および生体変換法における該進化微生物、遺伝子、またはタンパク質の使用にも関する。
Description
本発明は、代謝経路の生成または改変を可能とする進化した微生物を調製するための新規な方法、それによって得られる進化した微生物の株、本発明の方法によって得られる進化したタンパク質をコードする進化した遺伝子、ならびに生物変換工程における前記進化した微生物、遺伝子、またはタンパク質の使用に関する。
改変された特性を有する微生物を調製することは、幅広くおこなわれている工程である。その目的は、淘汰圧に抵抗可能な微生物を選択するために、淘汰圧として機能する要素を有する生育培地上で微生物を生育することで微生物を進化させること、あるいは一種または複数種の異種遺伝子を幅広く用いられている遺伝子工学の手法で導入し、一種または複数種の異種遺伝子の発現に伴い微生物に新規表現型特性を付与するためのいずれかである。この進化は、当業者によく知られている突然変異誘発因子の使用により容易におこなわれる。
培養培地中成分の形質転換に必要な遺伝子を除去し淘汰圧下で生育させることにより進化させる方法、ならびに突然変異誘発因子を使用して進化させる方法は、フランス国特許第2823219号および国際公開第03/004656号に詳細に記載されている。
本発明の簡単な説明
本発明は、
a)微生物が規定された培地上で生育する際に、代謝産物の生産または消費が阻害されて微生物の生育能力に負の影響が与えられるように、当初の微生物の細胞を改変するステップであって、細胞が改変されない場合には、該微生物は、同一の規定された培地上で生育する際に、この代謝産物を生産または消費することができ、正常な生育を示すステップと、
b)前記規定された培地上で得られた改変された微生物を進化するように生育させるステップであって、前記規定された培地には進化を可能にする補基質を含むことができるステップと、
c)適宜補基質を含む前記規定された培地上で生育が可能な改変された微生物を選択するステップを、
含むことを特徴とする、代謝経路の生成または改変を可能にする進化した微生物の新規調製方法に関する。
本発明は、
a)微生物が規定された培地上で生育する際に、代謝産物の生産または消費が阻害されて微生物の生育能力に負の影響が与えられるように、当初の微生物の細胞を改変するステップであって、細胞が改変されない場合には、該微生物は、同一の規定された培地上で生育する際に、この代謝産物を生産または消費することができ、正常な生育を示すステップと、
b)前記規定された培地上で得られた改変された微生物を進化するように生育させるステップであって、前記規定された培地には進化を可能にする補基質を含むことができるステップと、
c)適宜補基質を含む前記規定された培地上で生育が可能な改変された微生物を選択するステップを、
含むことを特徴とする、代謝経路の生成または改変を可能にする進化した微生物の新規調製方法に関する。
進化した微生物は、進化したタンパク質をコードする進化した遺伝子を好ましくは少なくとも一つ含み、遺伝子の進化により、阻害された代謝経路を新規代謝経路に置き換えることが可能になる。
本発明は、改変された微生物が生育するステップb)に先立ち、異種タンパク質をコードする異種遺伝子を少なくとも一つ導入する追加ステップa1)を含み、異種遺伝子は新規代謝経路への進化を目的とするものである、方法にも関する。
本発明は、前記進化したタンパク質をコードする進化した遺伝子を単離するステップd)を含む方法にも関する。
本発明は、本発明により事前に得られた進化した遺伝子を、好適な形態で、進化したタンパク質の生産を目的とする生産微生物に導入する方法にも関する。
本発明は、上記および下記で規定するような、本発明による方法で得られる進化した微生物にも関する。
本発明は、本発明による進化した微生物が進化したタンパク質の生産に好適な培養培地中で生育し、進化したタンパク質を適宜精製することを特徴とする、進化したタンパク質の調製方法にも関する。
本発明は、上記および下記で規定するような、本発明による方法で得られる進化したタンパク質をコードする進化した遺伝子にも関する。
本発明は、上記および下記で規定するような、本発明による方法で得られる進化したタンパク質にも関する。
本発明は、生物変換プロセスにおける、上記および下記で規定するような、進化した微生物または進化したタンパク質の使用にも関する。
定義
本発明において、「進化した微生物」は、改変された微生物を選択することにより得られる微生物として規定される。この進化した微生物は、改変された微生物からの違いを少なくとも一つ示す。この違いは、例えば、酵素特性の改善、あるいは新規代謝経路の生成であっても良い。
本発明において、「進化した微生物」は、改変された微生物を選択することにより得られる微生物として規定される。この進化した微生物は、改変された微生物からの違いを少なくとも一つ示す。この違いは、例えば、酵素特性の改善、あるいは新規代謝経路の生成であっても良い。
本発明において、「代謝経路」は、その連続により出発分子(基質)とは異なる分子(産物)が形成される一つまたは複数の酵素的反応のことである。
本発明において、「改変」とは、酵素をコードする遺伝子および/またはそのプロモーター配列の少なくとも一つが変化すること、特に欠失することである。
本発明において、「代謝産物」とは、微生物によって合成および/または転換された分子のことである。
本発明において、「規定された培地」とは、微生物の生育に適した既知の分子組成を有する培地のことである。この規定された培地では実質的に一種または複数種の代謝産物が形成されず、代謝産物の生産は改変の実施により阻害されている。
本発明において、「補基質」とは、反応に関与してその一個または複数個の原子を基質に供与し産物を形成する、基質とは異なる有機分子または無機分子のことである。この補基質が突然変異特性を有することは知られていない。
本発明において、「選択」とは、改変が生育に影響しなくなるまで進化した微生物の選択に使用する培養方法のことである。連続培養法の使用が好ましく、希釈率を下げた場合に比べ同等または高い生育速度を有する微生物のみが培地中に保存されるように希釈率を上げて実施される。
本発明において、「進化した遺伝子」とは、選択後の常態およびプロセシングにおいて、当初の配列からは少なくとも核酸一個が異なる、停止コドン(TAA、TAG、TGA)が結合した(A、T、G、またはCを含む)核酸配列のことであり、進化した遺伝子によりコードされるタンパク質は当初の遺伝子によりコードされるタンパク質とは少なくともアミノ酸一個が異なる。
本発明において、「異種遺伝子」とは、出発コドン(ATGまたはGTG)と停止コドン(TAA、TAG、TGA)が常態で結合した核酸配列であって、コード配列と呼ばれ、進化および/または生産に使用する生物とは異なる生物に由来するものである。
本発明において、「進化したタンパク質」とは、選択後に当初のタンパク質配列とはアミノ酸が少なくとも一個異なるアミノ酸の配列(タンパク質配列)のことである。
本発明において、「異種タンパク質」とは、異種遺伝子の翻訳により生じたタンパク質のことである。
遺伝子およびタンパク質は、その一次配列から同定できるが、タンパク質群を規定する配列または配列相同性からも同定できる。
PFAM(タンパク質系列の配列および隠れマルコフモデルのデータベース;http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)はタンパク質配列の巨大なコレクションである。PFAMにより、多数の配列の可視化、タンパク質ドメインの可視化、生物内における分布の評価、他のデータベースへのアクセス、既知のタンパク質構造の可視化が可能になっている。
COGs(タンパク質のオーソロガス群のクラスター;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)は、30種の主要な系統発生系列を表わす43種の完全なゲノム配列でタンパク質配列を比較することによって得られる。各COGは、少なくとも3系列から規定され、以前に保存されたドメインの同定を可能にする。
相同的配列および相同性パーセントを同定する手段は、当業者によく知られており、これには特にBLASTプログラムが含まれ、このプログラムはウェブサイトに表示されるデフォルト・パラメーターとともにウェブサイト(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)から使用することができる。得られた配列はウェブサイトに表示されるデフォルト・パラメーターとともに、例えば、CLUSTALWプログラム(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)またはMULTALINプログラム(http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl)を使用して(例えば、配列させる等に)利用できる。
当業者は、既知遺伝子のGenBankを参照して、他の生物、菌株、酵母菌、真菌、哺乳類、植物等における相当する遺伝子を決定することができる。このルーチン的作業は、他の微生物由来遺伝子の配列位置決めをおこなって決定できる共通配列を用い、別の生物における相当する遺伝子をクローニングするための縮重プローブを設計すると容易である。分子生物学におけるこれらのルーチン的な方法は、当業者によく知られており、例えば、Sambrook他の文献(1989年分子クローニング:実験室マニュアル、第2版、Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York)に記載されている。
本発明による進化した株のために欠失または過剰発現される遺伝子は、主にE. coli遺伝子の名称を用いて定義される。このようにE. coli遺伝子の名称を用いても、本発明においてはより一般的な意味を有し、他の微生物の相当する遺伝子をもカバーする。当業者なら、GenBankを使ってE. coli遺伝子を参照し、E. coli以外の細菌株における等価な遺伝子を決定することができる。
本発明において、「新規代謝経路」とは、一種または複数種の酵素反応のセットのことであり、酵素反応の連続により、進化した微生物の選択ステップの後で、その酵素活性が相当する非進化微生物における相当する経路での酵素活性とは異なる化学的構成要素が生産されるものである。酵素活性の違いは、触媒する反応の種類、あるいは速度論的特性(Km、Vmax、Ki等)によって異なる。新規な酵素的経路により、当初の基質とは異なるあるいは同一の基質から、当初の産物とは異なるあるいは同一の化学的構成要素を生産することが可能になる。
本発明において、「好適な形態」とは、出発コドン(ATGまたはGTG)と停止コドン(TAA、TAG、TGA)が常態で結合した核酸配列であって、コード配列と呼ばれ、あるいはコード配列の一部であって、異種遺伝子が発現される微生物におけるその発現に必要な調節遺伝子の制御の下にあるものである。これらの調節遺伝子は、当業者によく知られており、プロモーティング調節要素すなわちプロモーター、特に微生物における強力な構成的プロモーターと呼ばれるプロモーターを含んでいる。構成的プロモーターは好ましくは、構成的にするためにラックオペレータが除去された強力なプロモーターであるpTAC-O、pLAC-O、pTRC-O、pTHLAから選択される。
本発明において、「当初の微生物」とは、改変、突然変異、あるいは進化を全く受けてない微生物のことである。
本発明において、「生産微生物」とは、進化した微生物からの新規代謝経路が導入された進化した微生物または至適化された微生物のことである。
本発明において、「改変された微生物」とは、制御された改変、すなわち進化過程の結果ではない改変の実施により得られる微生物のことである。このような改変の例には、指定(directed)突然変異、あるいは遺伝子の除去、指定プロモーター改変がある。
本発明において、「進化したタンパク質の生産に適した培養培地」とは、規定の成分を有する培地、または複合培地、あるいは部分的に規定された培地のことである。複合培地は植物、微生物、または動物の加水分解産物から得られ、その組成は分析により決定されるが、この種の培地の網羅的分析はほとんど不可能である。部分的に規定された培地は、規定された培地に複合培地が加えられたものである。
本発明において、「生物変換プロセス」とは、一種または複数種の微生物内に含まれるまたは含まれない、一種または複数種の酵素によって、分子Aが分子Bに転換されるプロセスのことである。生物変換には3種類、すなわち生物転換、発酵、生体触媒がある。生物転換においては、好適な培地上で生育した一種または複数種の微生物内で一種または複数種の酵素が生産され、物質Aと必要な場合には一種または複数種の補基質が供給されて物質Bに転換される。発酵においては、好適な培地上で生育した一種または複数種の微生物内で生産された一種または複数種の酵素により、一種または複数種の微生物が物質Aを合成することが可能になり、好適な培地に補基質が含まれることが可能である。生体触媒の場合、一種または複数種の酵素は細胞内に無く好適な培地内にあって、好適な培地に物質Aおよび生物変換に必要な補基質が供給される。
遺伝子の単離方法は、当業者によく知られており、Sambrook他の文献(1989年分子クローニング:実験室マニュアル、第2版、Cold Spring Harbor Lab.、Cold Spring Harbor、New York)、Ausubel他の文献(1987年、分子生物学における現在のプロトコル、John Wiley and Sons、New York)、Maniatis他の文献(1982年分子クローニング:実験室マニュアル、Cold Spring Harbor Lab.、Cold Spring Harbor、New York)に詳細に記載されている。これらの方法によって、遺伝子を新規生物に導入するために、遺伝子を配置、複製、または抽出することが可能である。この遺伝子を微生物に導入する最後のステップの前に、遺伝子をポリヌクレオチドに組み込ませるステップをおこなうことができる。
タンパク質を精製する方法は、当業者によく知られており、Coligan他の文献(1997年、タンパク質科学における現在のプロトコル、John Wiley and Sons, Inc.)に詳細に記載されている。これらの方法によって、分別または非分別タンパク質抽出物中の対象タンパク質の同定が可能になる。次にタンパク質は精製することができ、タンパク質が酵素である場合は特異活性が増大する。最後にこれらの方法によって、必要な場合には、支持体(例えば、樹脂)上にタンパク質を固定することが可能である。
本発明において、「除去」とは、「除去された」遺伝子の活性を抑圧することである。抑圧は、適当な手段による、当該遺伝子の発現による産物の不活性化、または当該遺伝子の発現の阻害、またはその発現が損なわれるように当該遺伝子の一部の除去(例えば、発現に必要なプロモーター領域の一部または全部の除去)、または発現による産物の機能喪失(例えば、当該遺伝子のコード部の除去)によりおこなわれる。遺伝子の除去は、好ましくは、当該遺伝子のほとんどの除去、同定を容易にするための選択マーカー遺伝子による適宜な置換、本発明による進化した株の単離と精製からなる。
本発明において、「基質」とは、必要な場合には補基質の存在の下で、酵素の活性によって変換される代謝産物のことである。
本発明の詳細な説明
A.改変された微生物
本発明により改変された微生物株は原核生物でも真核生物でもよい。
A.改変された微生物
本発明により改変された微生物株は原核生物でも真核生物でもよい。
本発明によれば、微生物株は同一種に属する微生物の集団であって、その種の微生物を少なくとも一つ含むものである。したがって、株について記述された特性は、その株の微生物それぞれに当てはまる。同様に、株の微生物一つについて記述された特性は、株を構成する微生物すべてに当てはまる。
本発明における至適な細菌は、細菌、酵母菌、および真菌から選択され、特に以下の種、Aspergillus sp.、Bacillus sp.、Brevibacterium sp.、Clostridium sp.、Corynebacterium sp.、Escherichia sp.、Gluconobacter sp.、Pseudomonas sp.、Rhodococcus sp.、Saccharomyces sp.、Streptomyces sp.、Xanthomonas sp.、Candida sp.から選択される。
好ましい実施形態において、細菌株はEscherichiaの株であり、特にE. coliである。他の実施形態においては、細菌株はCorynebacteriumの株であり、特にC.glutamicumである。
もう一つの実施形態において、酵母菌株はSaccharomycesの株であり、特にS.cerevisiaeである。
このような改変された微生物を調製するためには、微生物の進化を助けるため、改変される代謝経路に結び付いたあるいは無関係な他の遺伝子を弱める、特に除去することが有利であろう。
このような改変された微生物を調製するためには、微生物の進化を助けるため、改変される代謝経路に結び付いたあるいは無関係な他の異種遺伝子または非異種遺伝子を働かせ、特に過剰発現させることも有利であろう。
遺伝子の過剰発現は、その遺伝子のプロモーターをin situで強いプロモーターまたは誘導プロモーターで置き換えることにより達成できる。別法としては、過剰発現する遺伝子が適当なプロモーターにより制御される単コピーまたは多コピー複製プラスミドが細胞に導入される。
このような改変は、改変される代謝経路の選択に基づき、ケース・バイ・ケースで決定される。特に、以下で概略する特定の代謝経路について、改変をケース・バイ・ケースで述べる。
微生物の遺伝子的特性の改変をおこなう手順は、当業者に知られている。
遺伝子の不活性化は、好ましくは相同的組換え(Datsenko K.A.;Wanner B.L(2000年)、PCR産物を用いるEscherichia coliK-12における染色体遺伝子のワンステップ不活性化、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640〜6645頁)によっておこなわれる。主な手順は簡単には以下の通りである。in vitroで得られる直鎖状フラグメントを細胞に導入する。このフラグメントは遺伝子の二つのフランキング領域およびこれら二つの領域の間の選択される遺伝子(通常、抗生物質に対し抵抗性の遺伝子)を少なくとも一つ含み、したがってフラグメントは不活性化遺伝子を呈する。組換え済みでフラグメントを組み込んだ細胞は、次に選択培地上に拡散することにより選別される。次に、本来の遺伝子が非活性化遺伝子によって置き換えられた二重組換え済みの細胞が選別される。この手順は、二重組換えの検知率を高める正または負の選別システムを用いることにより改善される。
S.cerevisiaeの遺伝子の不活性化は好ましくは相同的組換え(Baudin他、Nucl.Acids Res.21、3329〜3330頁、1993年;Wach他、Yeast 10、1793〜1808頁、1994年;Brachmann他、Yeast 14、115〜132頁、1998年)によっておこなわれる。
B. 生産微生物
生産微生物も上記の細菌、酵母菌、および真菌から選択される。これらは、本発明の進化手順により得られた進化した微生物、または所望の代謝産物の生産に至適化された微生物であって、微生物内には本発明による進化した遺伝子が少なくとも一つ導入されている。
生産微生物も上記の細菌、酵母菌、および真菌から選択される。これらは、本発明の進化手順により得られた進化した微生物、または所望の代謝産物の生産に至適化された微生物であって、微生物内には本発明による進化した遺伝子が少なくとも一つ導入されている。
C.微生物の培養
本発明において、「培養」および「発酵」という用語は、単純な炭素源を含む好適な培養培地上での微生物の生育を示すのに区別せずに使用される。
本発明において、「培養」および「発酵」という用語は、単純な炭素源を含む好適な培養培地上での微生物の生育を示すのに区別せずに使用される。
本発明において、単純な炭素源とは、当業者が微生物、特に細菌を正常に成育させるのに使用できる炭素源のことである。具体的には、単純な炭素源は、グルコース、ガラクトース、ショ糖、乳糖または糖蜜等の同化可能な糖、あるいはこれらの糖の副産物でありうる。特に好ましい単純な炭素源の例はグルコースである。もう一つの好ましい単純な炭素源はショ糖である。
当業者は、本発明による微生物の培養条件を決定することができる。具体的には、細菌は、20℃から55℃までの温度、好ましくは25℃から40℃までの温度、より好ましくはC.glutamicumについて約30℃、E. coliについて約37℃の温度で発酵される。
発酵は一般に、単純な炭素源を少なくとも一種および必要な場合には代謝産物の生産に必要な補基質を含み、使用される細菌に適合した既知の規定組成を有する無機培養培地を備えた発酵槽内でおこなわれる。
具体的には、E. coli用無機培養培地は、M9培地(Anderson、1946年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 32:120〜128頁)、M63培地(Miller、1992年、細菌遺伝子学短期コース:E. coliおよび関係細菌用実験室マニュアルおよびハンドブック、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York)、あるいはSchaefer他が規定した培地(1999年、Anal.Biochem.270:88〜96頁)等と同一または類似の組成を有することができる。
同様に、C.glutamicum用無機培養培地は、BMCG培地(Liebl他、1989年、Appl.Microbiol.Biotechnol.32:205〜210頁)あるいはRiedel他が記述した培地(2001年、J.Mol.Microbiol.Biotechnol.3:573〜583頁)等の培地と同一または類似の組成を有することができる。
D. 代謝経路
進化せしめる代謝経路は、一般に、アミノ酸合成経路、核酸合成経路、脂質合成経路、あるいは糖代謝経路から選択される。
進化せしめる代謝経路は、一般に、アミノ酸合成経路、核酸合成経路、脂質合成経路、あるいは糖代謝経路から選択される。
本発明の好ましい第一の実施形態において、進化した代謝経路はアミノ酸の生合成経路、詳細にはメチオニン、システイン、トレオニン、リシン、またはイソロイシンから選択されるアミノ酸の生合成経路である。
本発明の好ましい第二の実施形態において、改変される代謝経路は、NADPHからNADPが再生される経路である。具体的には、システイン、ヒドロキシプロピオナート、キシリトールの生合成経路である。
D.I. メチオニンの生合成経路
本発明は、例えば、メチオニンの生合成経路(図1)、ならびに単純な炭素源および単純な硫黄源、特にメチルメルカプタン(CH3SH)、硫化水素(H2S)、またはこれらの生理学的に許容される塩の代謝によって2-アミノ-4-(アルキルメルカプト)酪酸、特にL-メチオニンすなわち2-アミノ-4-(メチルメルカプト)酪酸を生成する微生物株、特にE. coliおよびコリネバクテリウムに適用することができる。硫黄源の硫化水素は硫酸塩として培養培地に導入することもできる。本発明は、微生物株、改善された酵素、およびそのコード配列にも関する。本発明は最終的に前記微生物株を培養してメチオニンを調製させるプロセスに関する。D,L-メチオニンは工業的には化学合成によって製造される。メチルメルカプタンはアクロレインと反応してβ-チオプロピオンアルデヒドを生成し、β-チオプロピオンアルデヒドはシアン化水素と反応しα-ヒドロキシ-γ-チオブチロニトリルを生成する。アンモニアで処理し加水分解した後、メチオニンが得られる。
本発明は、例えば、メチオニンの生合成経路(図1)、ならびに単純な炭素源および単純な硫黄源、特にメチルメルカプタン(CH3SH)、硫化水素(H2S)、またはこれらの生理学的に許容される塩の代謝によって2-アミノ-4-(アルキルメルカプト)酪酸、特にL-メチオニンすなわち2-アミノ-4-(メチルメルカプト)酪酸を生成する微生物株、特にE. coliおよびコリネバクテリウムに適用することができる。硫黄源の硫化水素は硫酸塩として培養培地に導入することもできる。本発明は、微生物株、改善された酵素、およびそのコード配列にも関する。本発明は最終的に前記微生物株を培養してメチオニンを調製させるプロセスに関する。D,L-メチオニンは工業的には化学合成によって製造される。メチルメルカプタンはアクロレインと反応してβ-チオプロピオンアルデヒドを生成し、β-チオプロピオンアルデヒドはシアン化水素と反応しα-ヒドロキシ-γ-チオブチロニトリルを生成する。アンモニアで処理し加水分解した後、メチオニンが得られる。
D,L-メチオニン工業製品はすべて同じ原料、すなわちアクロレイン、メタンチオール(メチルメルカプタン)、シアン化水素、およびアンモニアまたは炭酸アンモニアを使用している。このラセミ体メチオニンの合成は、バッチプロセスまたは連続プロセスでおこなうことができる。
D,L-メチオニンから純粋なL-メチオニンを得るため、Aspergillus oryzasにより生成される酵素アミノアシラーゼを使用し、化学合成に生体触媒を含む工業的プロセスもある。
米国特許第6,379,934号および欧州特許第1055730号には、accBC遺伝子が増幅されるコリン型細菌株を使用するアミノ酸の製造が記載されている。メチオニンも挙げられてはいるが、例として具体的に示されているのはL-リシンの調製だけである。
しかし、硫黄含有アミノ酸の微生物培養による合成には、特にその生合成経路が複雑で制御機構が多いために、工業生産が可能になるのに適したスケールでの実施が困難である問題がある。
メチオニンの代謝はいくつかのレベルにおいて厳重に制御されている(Weissbach他、1991年、Mol.Microbiol.、5、1593〜1597頁)。
・3-ホスフォグリセラートからのL-セリンの合成、およびアスパラタートおよびアセチル-CoAからのL-ホモセリンの合成のための炭素代謝
・培養培地中のアセチル-CoAおよび硫酸塩の存在下でのL-セリンからL-システインの合成のための硫黄代謝
・L-ホモセリン、システイン、およびアセチル-CoAまたはサクシニル-CoAからのメチオニン合成(図1)
・3-ホスフォグリセラートからのL-セリンの合成、およびアスパラタートおよびアセチル-CoAからのL-ホモセリンの合成のための炭素代謝
・培養培地中のアセチル-CoAおよび硫酸塩の存在下でのL-セリンからL-システインの合成のための硫黄代謝
・L-ホモセリン、システイン、およびアセチル-CoAまたはサクシニル-CoAからのメチオニン合成(図1)
国際公開第93/17112号には、様々な生物におけるL-アスパラギン酸からのメチオニンの生合成に関与する異なる酵素が記載されている。この特許出願には、メチルメルカプタンまたは硫化水素を硫黄源として用いメチオニンを合成するために順次働くいくつかの外因性遺伝子の微生物への導入も記載されている。
本発明は、
一般式(II)の化合物からなる単純な炭素源および硫黄源の代謝により、
R'-SH(II)
(式中、R'は水素原子または以下で定義されるR基、およびその生理学的に許容される塩である)、
一般式(I)の2-アミノ-4-(アルキルメルカプト)酪酸を生成する、
R-S-(CH2)2-CHNH2-COOH(I)
(式中、Rは、一個または複数個のヒドロキシ置換基を含むことのできる、直鎖状または分岐した1から18個までの炭素原子を含むアルキル基、あるいは一個または複数個の窒素原子または硫黄原子をヘテロ芳香環に含み、フェニル基、ピリジル基、ピロリル基、ピラゾリル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基、チアゾリル基、またはチエニル基であってよい、アリール基またはヘテロアリール基である)
微生物の株、特に細菌株、特にE. coliおよびコリネバクテリウムであって、改変された「メチオニン・シンターゼ」活性を有する酵素をコードする遺伝子を少なくとも一つ含む株に関する。
一般式(II)の化合物からなる単純な炭素源および硫黄源の代謝により、
R'-SH(II)
(式中、R'は水素原子または以下で定義されるR基、およびその生理学的に許容される塩である)、
一般式(I)の2-アミノ-4-(アルキルメルカプト)酪酸を生成する、
R-S-(CH2)2-CHNH2-COOH(I)
(式中、Rは、一個または複数個のヒドロキシ置換基を含むことのできる、直鎖状または分岐した1から18個までの炭素原子を含むアルキル基、あるいは一個または複数個の窒素原子または硫黄原子をヘテロ芳香環に含み、フェニル基、ピリジル基、ピロリル基、ピラゾリル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基、チアゾリル基、またはチエニル基であってよい、アリール基またはヘテロアリール基である)
微生物の株、特に細菌株、特にE. coliおよびコリネバクテリウムであって、改変された「メチオニン・シンターゼ」活性を有する酵素をコードする遺伝子を少なくとも一つ含む株に関する。
本発明による改変された「メチオニン・シンターゼ」活性を有する酵素は、一般式(III)の基質の生物変換によって、
R"-O-(CH2)2-CHNH2-COOH(III)
(式中、R"は、アシル基、好ましくはサクシニル基またはアセチル基のいずれかである)、
あるいは基質の一般式(I)の酸への直接生物変換によって、
あるいは基質の一般式(IV)のホモシステインへの生物変換によって、
HS-(CH2)2-CHNH2-COOH(IV)
(これは次に適当な酵素によって一般式(I)の酸へ変換される)、
一般式(I)の2-アミノ-4-(アルキルメルカプト)酪酸の生合成に関与する酵素ならいずれであってもよい。
R"-O-(CH2)2-CHNH2-COOH(III)
(式中、R"は、アシル基、好ましくはサクシニル基またはアセチル基のいずれかである)、
あるいは基質の一般式(I)の酸への直接生物変換によって、
あるいは基質の一般式(IV)のホモシステインへの生物変換によって、
HS-(CH2)2-CHNH2-COOH(IV)
(これは次に適当な酵素によって一般式(I)の酸へ変換される)、
一般式(I)の2-アミノ-4-(アルキルメルカプト)酪酸の生合成に関与する酵素ならいずれであってもよい。
改変された「メチオニン・シンターゼ」活性を有する酵素とは、野生種酵素に触媒される反応に代わって、好ましくは一般式(III)の基質を一般式(I)の酸または一般式(IV)のホモシステインに直接生物変換するように、野生種酵素に比べて改変された酵素のことである。突然変異とも呼ばれるこの改変により、改変された酵素の一般式(II)の硫黄含有化合物に対する親和性はその天然補基質に比べ実質的に増大する。
本発明における単純な炭素源は、当業者が微生物、特に細菌を正常に生育させるために使用できる炭素源ならいかなるものであってもよい。単純な炭素源には特に、グルコース、ガラクトース、ショ糖、または糖蜜等の同化可能な糖、あるいはこれらの糖の副産物のいずれもが含まれる。特に好ましい単純な炭素源の一つはグルコースである。もう一つの好ましい単純な炭素源はショ糖である。
本発明における生理学的に許容される塩は、本発明における微生物の代謝または生育能力に影響しない一般式(I)の化合物の塩ならいかなるものであってもよく、特にナトリウム塩等のアルカリ金属塩である。
本発明の好ましい実施形態において、Rは、直鎖状または分岐した1から4個までの炭素原子を含むアルキル基、具体的にはメチル基、エチル基、n-プロピル基、i-プロピル基、n-ブチル基、i-ブチル基、またはt-ブチル基であって、好ましくはメチル基である。
得られる一般式(I)の2-アミノ-4-(アルキルメルカプト)酪酸は好ましくはL-メチオニンである。生物変換による一般式(I)の酸生成に単純な炭素源および一般式(II)の硫黄化合物を使用することにより、いくつか有利な点が生じる。特に:
・O-アシル-L-ホモセリンからの酸(I)またはメチオニンの合成が一段または二段反応で、システインの合成とは独立し、またテトラヒドロ葉酸サイクルから独立すること、
・一般的には毒性の石油化学製品である、メチルメルカプタン等の一般式(II)の含硫黄化合物が有用なアミノ酸生合成の原料という良好な目的で使われ、付加価値が増すこと、である。
・O-アシル-L-ホモセリンからの酸(I)またはメチオニンの合成が一段または二段反応で、システインの合成とは独立し、またテトラヒドロ葉酸サイクルから独立すること、
・一般的には毒性の石油化学製品である、メチルメルカプタン等の一般式(II)の含硫黄化合物が有用なアミノ酸生合成の原料という良好な目的で使われ、付加価値が増すこと、である。
本発明は、メチルメルカプタン存在下でシスタチオニン-γ-シンターゼ(EC 4.2.99.9;GenBank AAN83320、またはAAA24167)の「メチオニン・シンターゼ」活性を指定改変することに基づいている。メチオニン生合成経路中のシスタチオニン-γ-シンターゼは、E. coli(図2)およびC.glutamicum中のmetB遺伝子にコードされ、広範囲な基質に対する活性を示す(Flavin, M.; Slaughter, C.(1967年)、O-サクシニル-ホモセリンからのホモセリンまたはメチオニンの直接酵素的合成、Biochim.Biophys.Acta 132:400〜405頁)。
本発明は、メチルメルカプタン存在下でO-アセチル-L-ホモセリン・スルフヒドリラーゼ(すなわちO-アセチル-L-ホモセリン・スルフヒドリラーゼ、C 4.2.99.10)の「メチオニン・シンターゼ」活性を指定改変することにも基づいている。メチオニン生合成経路中のO-アセチル-L-ホモセリン・スルフヒドリラーゼは、C.glutamicum中のmetY遺伝子(GenBank AF220150)にコードされ、広範囲な基質に対する活性を示す(Smith, IK.; Thompson JF.、(1969年)、アカパンカビのメチオニンなしでの突然変異におけるS-メチルシステインおよびメチルメルカプタンの使用ならびにそのメチオニンへの変換経路、II、酵素の研究、Biochim.Biophys.Acta 184(1):130〜138頁)。
したがって、本発明は、本発明により株を生成する方法およびその一般式(I)の2-アミノ-4-(アルキルメルカプト)酪酸、好ましくはL-メチオニンを調製する方法への使用にも関する。
本発明による株を生成する方法は、細菌株中の「メチオニン・シンターゼ」活性を有する酵素をコードする遺伝子を進化させ、「メチオニン・シンターゼ」活性を有する酵素をコードする遺伝子が当初の細菌株の遺伝子に比べて改変されるように、当初の細菌株が上記式(II)の化合物の存在下で淘汰圧にさらされるステップを含むプロセスにより、「メチオニン・シンターゼ」活性を有する酵素をコードする遺伝子に少なくとも一つの改変を示す遺伝子的に改変された細菌株を当初の細菌株から得ることからなる。
同一培養条件において(好適量の式(II)の含硫黄化合物を含む培地中で)株(A)におけるメチオニン生成量が当初の株(I)より大きい場合、株(A)における「メチオニン・シンターゼ」活性は当初の株(I)に比べ改善されたといえる。改善は、好ましくは、生成されたメチオニンの量を測定することにより確認される。いくつかのケースでは、改善は、メチオニンを含まない最少培地中での細菌(A)の生育速度が細菌(I)の生育速度に比べ増大することから確認できる。
本発明は、本発明の選択プロセスによって得ることができ、上記および下記で規定するような改変された「メチオニン・シンターゼ」活性を有する酵素をコードする遺伝子を少なくとも一つ含む、改善された「メチオニン・シンターゼ」活性を有するこれらの株にも関する。
本発明の第一の実施形態において、改変された「メチオニン・シンターゼ」活性を有する酵素により、一般式(III)の基質を一般式(I)の酸に直接変換することが可能になる。この場合、硫黄源は、R'が上記定義のRである一般式(II)の化合物である。
改変された「メチオニン・シンターゼ」活性を有する酵素は、シスタチオニン-γ-シンターゼおよびアシルホモセリン・スルフヒドリラーゼから選択される。
本発明の第二の実施形態において、改変された「メチオニン・シンターゼ」活性を有する酵素により、一般式(III)の基質を一般式(IV)のホモシステインに変換することが可能になり、
HS-(CH2)2-CHNH2-COOH(IV)
ホモシステインは次に適当な酵素によって一般式(I)の酸へ変換される。この場合、硫黄含有源は、R'が水素原子である一般式(II)の化合物、好ましくは硫化水素である。硫黄源の硫化水素は、培養培地に導入する、または、例えば硫酸塩のような単純な硫黄源から細菌により生成することができる。
HS-(CH2)2-CHNH2-COOH(IV)
ホモシステインは次に適当な酵素によって一般式(I)の酸へ変換される。この場合、硫黄含有源は、R'が水素原子である一般式(II)の化合物、好ましくは硫化水素である。硫黄源の硫化水素は、培養培地に導入する、または、例えば硫酸塩のような単純な硫黄源から細菌により生成することができる。
改変された「メチオニン・シンターゼ」活性を有する酵素は、シスタチオニン-γ-シンターゼおよびアシルホモセリン・スルフヒドリラーゼから選択するのが有利である。
当業者は、上記定義の改変された酵素の「メチオニン・シンターゼ反応」を実施するための、改変された「メチオニン・シンターゼ」活性を有する他の酵素をその進化能力により選択する方法がわかるであろう。その具体例には、特に細菌のcysK遺伝子およびcysM遺伝子によってコードされる、システイン・シンターゼAおよびBが含まれる。
上記および下記で規定する改変されたシスタチオニン-γ-シンターゼに対し、基質は、O-アセチル-L-ホモセリンまたはO-サクシニル-L-ホモセリンが有利であり、好ましくはO-サクシニル-L-ホモセリンである。
上記および下記で規定する改変されたアシルホモセリン・スルフヒドリラーゼに対し、基質は、O-サクシニル-L-ホモセリンまたはO-アセチル-L-ホモセリンが有利であり、好ましくはO-アセチル-L-ホモセリンである。
これら二つの酵素に対し、改変は本質的に、一般式(III)の基質の変換がL-システインよりも一般式(II)の化合物に優先的に起こるような突然変異からなる。
酵素の突然変異は、一般式(II)の化合物の存在下で淘汰圧下で培養することによる、本発明による改善された「メチオニン・シンターゼ」活性を有する株を調製するための方法を実施することにより実現可能である。
この場合、シスタチオニン-γ-シンターゼまたはアシルホモセリン・スルフヒドリラーゼをコードする配列を有する遺伝子は、
・発現すると相当する酵素の翻訳を可能にする、当初株(I)のゲノム内の野生型遺伝子、または
・導入された当初株(I)内で発現および翻訳を可能にする調節要素の制御下で、シスタチオニン-γ-シンターゼまたはアシルホモセリン・スルフヒドリラーゼをコードする配列を含む異種遺伝子、または
・当初株(I)内に自然に存在する野生型遺伝子上に直接指定突然変異誘発、特に相同的組換えによりもたらされたもの、または
・シスタチオニン-γ-シンターゼまたはアシルホモセリン・スルフヒドリラーゼをコードする配列上に一般的な指定突然変異誘発技術を用い、続いて、導入された当初株(I)内で発現および翻訳を可能にする調節要素の制御下で、当初株(I)内に導入されたもの、でありうる。
・発現すると相当する酵素の翻訳を可能にする、当初株(I)のゲノム内の野生型遺伝子、または
・導入された当初株(I)内で発現および翻訳を可能にする調節要素の制御下で、シスタチオニン-γ-シンターゼまたはアシルホモセリン・スルフヒドリラーゼをコードする配列を含む異種遺伝子、または
・当初株(I)内に自然に存在する野生型遺伝子上に直接指定突然変異誘発、特に相同的組換えによりもたらされたもの、または
・シスタチオニン-γ-シンターゼまたはアシルホモセリン・スルフヒドリラーゼをコードする配列上に一般的な指定突然変異誘発技術を用い、続いて、導入された当初株(I)内で発現および翻訳を可能にする調節要素の制御下で、当初株(I)内に導入されたもの、でありうる。
このような調節要素は、当業者によく知られており、プロモーター調節配列またはプロモーター、特に微生物内の強力な構成的プロモーターを含む。強力な構成的プロモーターは好ましくはpTAC-O(SEQ ID No. 1)またはpLAC-O(SEQ ID No. 2)またはpTRC-O(SEQ ID No. 3)またはpTHLA(SEQ ID No. 4)であり、すべてがそれ自体を構成的にするためにlacオペレーターが除去されている強力なプロモーターである。
「当初の」すなわち非改変「メチオニン・シンターゼ」活性を有するシスタチオニン-γ-シンターゼは、参照番号PF01053のPFAMおよび参照番号CPG0626のCOGにおけるシスタチオニン-γ-シンターゼ相当物から選択することが有利である。
シスタチオニン-γ-シンターゼは、好ましくは、SEQ ID No. 6で示されるE. coli K12からのシスタチオニン-γ-シンターゼである。この配列の相同的配列は、シスタチオニン-γ-シンターゼ活性を有し、SEQ ID No. 6のアミノ酸配列に対して、少なくとも80%の相同性、好ましくは90%の相同性、より好ましくは95%の相同性を有する。
相同的配列および相同性パーセントを同定する手段は、当業者によく知られており、これには特にBLASTプログラム、さらに具体的にはBLASTPプログラムが含まれ、ウェブサイトに表示されるデフォルト・パラメーターとともにウェブサイト(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)から使用することができる。
本発明の好ましい実施形態において、改変前の当初のシスタチオニン-γ-シンターゼは、そのC末端(保存領域1)に下記のアミノ酸配列を有する。
式中、
X1は、A、G、S、好ましくはAを示し、
X2は、E、V、P、T、好ましくはEを示し、
X3は、S、T、N、好ましくはSを示し、
X4は、G、D、A、H、T、好ましくはGを示し、
X5は、V、A、T、H、N、好ましくはVを示し、
X6は、E、R、K、F、好ましくはEを示し、
X7は、S、T、好ましくはSを示し、
X8は、L、I、V、A、好ましくはLを示し、
X9は、I、V、A、T、好ましくはIを示す。
式中、
X1は、A、G、S、好ましくはAを示し、
X2は、E、V、P、T、好ましくはEを示し、
X3は、S、T、N、好ましくはSを示し、
X4は、G、D、A、H、T、好ましくはGを示し、
X5は、V、A、T、H、N、好ましくはVを示し、
X6は、E、R、K、F、好ましくはEを示し、
X7は、S、T、好ましくはSを示し、
X8は、L、I、V、A、好ましくはLを示し、
X9は、I、V、A、T、好ましくはIを示す。
改変前の当初のシスタチオニン-γ-シンターゼは、そのN末端(保存領域2)に下記のアミノ酸配列の少なくとも一つを含むことが有利である。
式中、
X10は、A、H、Y、F、L、K、好ましくはAを示し、
X11は、Y、E、D、K、R、V、I、好ましくはYを示し、
X12は、S、A、T、P、G、好ましくはSを示し、
X13は、I、S、T、R、E、F、W、D、好ましくはSを示し、
X14は、S、G、A、I、E、N、K、P、好ましくはGを示し、
X15は、N、H、Q、S、好ましくはNを示し、
X16は、P、D、L、好ましくはPを示し、
X17は、T、M、N、G、S、好ましくはTを示し、
X18は、R、L、V、S、W、E、好ましくはRを示す。
アミノ酸X1〜X9は、SEQ ID No. 6で示されるE.coliK12のシスタチオニン-γ-シンターゼ配列の残基324から334に相当する。
式中、
X10は、A、H、Y、F、L、K、好ましくはAを示し、
X11は、Y、E、D、K、R、V、I、好ましくはYを示し、
X12は、S、A、T、P、G、好ましくはSを示し、
X13は、I、S、T、R、E、F、W、D、好ましくはSを示し、
X14は、S、G、A、I、E、N、K、P、好ましくはGを示し、
X15は、N、H、Q、S、好ましくはNを示し、
X16は、P、D、L、好ましくはPを示し、
X17は、T、M、N、G、S、好ましくはTを示し、
X18は、R、L、V、S、W、E、好ましくはRを示す。
アミノ酸X1〜X9は、SEQ ID No. 6で示されるE.coliK12のシスタチオニン-γ-シンターゼ配列の残基324から334に相当する。
アミノ酸X10〜X18は、SEQ ID No. 6で示されるE.coliK12のシスタチオニン-γ-シンターゼ配列の残基44から54に相当する。
上記および下記で用いるアミノ酸の位置は、E.coliK12のシスタチオニン-γ-シンターゼの配列を基準として設定した相対的位置である。当業者は当然ながら、通常の配列アラインメントツールを用いて、シスタチオニン-γ-シンターゼの他の配列上の相当するアミノ酸を見出す方法を知っている。これらのツールには特にBLASTプログラムが含まれ、このプログラムはウェブサイトに表示されるデフォルト・パラメーターとともにウェブサイト(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)から使用することができる。配列のアラインメントは、タンパク質(SEQ ID No. 6)および例えばSEQ ID No. 5で示されるコード配列等のコード配列の両方のレベルで実施することができる。
BlastPの進歩した検索機能は、(PHI-BLAST)モチーフを用いる検索の改良に使用するのにも有利である。この場合、モチーフ
を第一の保存領域、モチーフ
を第二の保存領域と見なすことができ、太字は配列のその位置でしばしばみられるアミノ酸を表わし、xはなんらかのアミノ酸を表わし、()内の数字2は、未決定のアミノ酸が二つあることを示す。
を第一の保存領域、モチーフ
を第二の保存領域と見なすことができ、太字は配列のその位置でしばしばみられるアミノ酸を表わし、xはなんらかのアミノ酸を表わし、()内の数字2は、未決定のアミノ酸が二つあることを示す。
配列のアラインメントには、CLUSTALWプログラム(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)またはMULTALINプログラム(http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl)がそれらのサイトに表示されるデフォルト・パラメーターとともに使用できる。
異なるシスタチオニン-γ-シンターゼを選択するための配列のアラインメントを図7に示す。
それらは下記のシスタチオニン-γ-シンターゼ(CGS)から好ましく選択されたものである。
Q9ZMW7 O-サクシニルホモセリン(チオール)-リアーゼ、Helicobacter pylori
P46807 O-サクシニルホモセリン(チオール)-リアーゼ、Mycobacterium leprae
AAO29646 Xylella fastidiosa Temeculal
NP_638204 Xanthomonas campestris pv. campestris str. ATCC 33913
NP_358970 Streptococcus pneumoniae R6
NP_126586 O-サクシニルホモセリン(チオール)-リアーゼ、Pyrococcus abyssi
NP_373671 Staphylococcus aureus subsp. aureus N315
NP_418374 Escherichia coli K12
NP_601979 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
NP_343729 O-サクシニルホモセリン(チオール)-リアーゼ、Sulfolobus solfataricus
NP_786043 O-サクシニルホモセリン(チオール)-リアーゼ、Lactobacillus plantarum WCFS1
NP_719586 Shewanella oneidensis MR-1
CAD30944 Streptomyces coelicolor A3(2)
NP_696324 Bifidobacterium longum NCC2705
NP_457953 Salmonella enterica subsp. enterica serovar typhi
NP_539021 Brucella melitensis
EAA30199 O-サクシニルホモセリン(チオール)-リアーゼ、Neurospora crassa
BAC61028 Vibrio parahaemolyticus
Q9ZMW7 O-サクシニルホモセリン(チオール)-リアーゼ、Helicobacter pylori
P46807 O-サクシニルホモセリン(チオール)-リアーゼ、Mycobacterium leprae
AAO29646 Xylella fastidiosa Temeculal
NP_638204 Xanthomonas campestris pv. campestris str. ATCC 33913
NP_358970 Streptococcus pneumoniae R6
NP_126586 O-サクシニルホモセリン(チオール)-リアーゼ、Pyrococcus abyssi
NP_373671 Staphylococcus aureus subsp. aureus N315
NP_418374 Escherichia coli K12
NP_601979 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
NP_343729 O-サクシニルホモセリン(チオール)-リアーゼ、Sulfolobus solfataricus
NP_786043 O-サクシニルホモセリン(チオール)-リアーゼ、Lactobacillus plantarum WCFS1
NP_719586 Shewanella oneidensis MR-1
CAD30944 Streptomyces coelicolor A3(2)
NP_696324 Bifidobacterium longum NCC2705
NP_457953 Salmonella enterica subsp. enterica serovar typhi
NP_539021 Brucella melitensis
EAA30199 O-サクシニルホモセリン(チオール)-リアーゼ、Neurospora crassa
BAC61028 Vibrio parahaemolyticus
上記規定のように改変されたシスタチオニン-γ-シンターゼは、好ましくは、そのC末端部に突然変異を少なくとも一つ呈し、および(または)そのN末端部に突然変異を少なくとも一つ呈する。
本発明における突然変異は、野生型配列におけるアミノ酸の異なるアミノ酸による置換である。
好ましくは、突然変異が、非改変酵素のシステイン補基質と相互作用する酸性アミノ酸の無極性アミノ酸による置換からなる。この無極性アミノ酸は、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、またはメチオニン残基である。
これらのアミノ酸は、Clausen他(EMBOJ、Vol.17、No.23、6827〜6838頁、1998年)が記載しているように、E. coliのシスタチオニン-γ-シンターゼの結晶構造を基準にして同定することができる。
C末端部における突然変異は、上記の「保存領域1」内の酸性アミノ酸、特に残基X2のレベルに導入することが有利である。
本発明による改変された「メチオニン・シンターゼ」活性を有するシスタチオニン-γ-シンターゼは、そのC末端部に下記のアミノ酸配列を有することが有利である。
式中、
X1、X3、X4、X5、X6、X7、X8、およびX9は上記定義の通りであり、
X2は、G、A、L、I、V、F、またはM、好ましくはAを示す。
式中、
X1、X3、X4、X5、X6、X7、X8、およびX9は上記定義の通りであり、
X2は、G、A、L、I、V、F、またはM、好ましくはAを示す。
N末端部における突然変異は、上記の「保存領域2」内のアミノ酸、特に残基X11および(または)Rおよび(または)X13のレベルに導入することが有利である。
本発明による改変された「メチオニン・シンターゼ」活性を有するシスタチオニン-γ-シンターゼは、そのN末端部に下記のアミノ酸配列を含むことが有利である。
式中、
X7、X9、X12、X14、X15、X16、X17、およびX18は上記定義の通りであり、
X11は、上記定義の通りあるいは非極性アミノ酸であり、
X13は、上記定義の通りあるいは非極性アミノ酸であり、
X19は上記定義の通りあるいは非極性アミノ酸であり、
X11、X13、およびX19のアミノ酸の少なくとも一つが上記定義の通りの非極性アミノ酸である。
式中、
X7、X9、X12、X14、X15、X16、X17、およびX18は上記定義の通りであり、
X11は、上記定義の通りあるいは非極性アミノ酸であり、
X13は、上記定義の通りあるいは非極性アミノ酸であり、
X19は上記定義の通りあるいは非極性アミノ酸であり、
X11、X13、およびX19のアミノ酸の少なくとも一つが上記定義の通りの非極性アミノ酸である。
本発明の好ましい実施形態において、本発明による改変された「メチオニン・シンターゼ」活性を有するシスタチオニン-γ-シンターゼは、上記定義の通り改変され、メチルメルカプタンを硫黄源(Rがメチル基である一般式(II)の化合物)として使用しO-サクシニル-L-ホモセリンをL-メチオニンに直接変換することが可能なシスタチオニン-γ-シンターゼである。
本発明の好ましい実施形態において、改変された「メチオニン・シンターゼ」活性を有するシスタチオニン-γ-シンターゼは、SEQ ID No. 8で示されるアミノ酸配列を含む。この改変された酵素をコードするDNA配列はSEQ ID No. 7で示される。
本発明は、上記定義の通り改変されたシスタチオニン-γ-シンターゼ、およびこれらの改変されたシスタチオニン-γ-シンターゼをコードする核酸配列、特に単離された配列、特にDNA配列、および特にSEQ ID No. 7で示される配列、宿主生物内において調節要素制御下で改変されたシスタチオニン-γ-シンターゼを発現および転写するのに必要なこれらの核酸配列を含むクローニングベクターおよび(または)発現ベクター、ならびにこれらのベクターにより形質転換された宿主生物に関する。
「当初の」すなわち非改変「メチオニン・シンターゼ」活性を有するアシルホモセリン・スルフヒドリラーゼは、参照番号PF01053のPFAMおよび参照番号CPG2873のCOGにおけるアシルホモセリン・スルフヒドリラーゼ相当物から選択することが有利である。
これらは、以下のアシルホモセリン・スルフヒドリラーゼから選択されるのが好ましい。
NP_785969 O-アセチルホモセリン(チオール)-リアーゼ、Lactobacillus plantarum WCFS1
AAN68137 O-アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ、Pseudomonas putida KT2440
NP_599886 O-アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ、Corynebacterium glutamicum ATCC13032
NP_712243 アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ、Leptospira interrogans serovar lai str.56601
BAC46370 O-サクシニルホモセリン・スルフヒドリラーゼ、Bradyrhizobium japonicum USDA110
AAO57279 O-サクシニルホモセリン・スルフヒドリラーゼ、Pseudomonas syringae pv. tomato str.DC3000
NP_284520 O-サクシニルホモセリン・スルフヒドリラーゼ、Neisseria meningitidis Z2491
AAA83435 O-サクシニルホモセリン・スルフヒドリラーゼ、P. aeruginosa
NP_785969 O-アセチルホモセリン(チオール)-リアーゼ、Lactobacillus plantarum WCFS1
AAN68137 O-アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ、Pseudomonas putida KT2440
NP_599886 O-アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ、Corynebacterium glutamicum ATCC13032
NP_712243 アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ、Leptospira interrogans serovar lai str.56601
BAC46370 O-サクシニルホモセリン・スルフヒドリラーゼ、Bradyrhizobium japonicum USDA110
AAO57279 O-サクシニルホモセリン・スルフヒドリラーゼ、Pseudomonas syringae pv. tomato str.DC3000
NP_284520 O-サクシニルホモセリン・スルフヒドリラーゼ、Neisseria meningitidis Z2491
AAA83435 O-サクシニルホモセリン・スルフヒドリラーゼ、P. aeruginosa
本発明の好ましい実施形態において、メチオニンの生合成経路を改変するには、まず細菌を遺伝子的に改変することが必要である。細菌の改変には、必然的に少なくとも一つの遺伝子を弱めること、そしておそらく少なくとも一つの異種遺伝子のクローニングが含まれる。遺伝子の弱化により、細菌は生育を可能にする等価な代謝経路の再生に依存する。遺伝子的に改変された細菌は培養され、その株すなわち細菌株は、外因性補基質の存在下または非存在下で生育速度の改善されたものが選択される。
本発明による株構築のプロセスは、まず当初の株を得ること、「メチオニン・シンターゼ」活性を有する酵素をコードする遺伝子(例えば、E. coli metE)または「ホモシステイン・シンターゼ」活性を有する酵素をコードする遺伝子(例えば、E. coli metC)における少なくとも一つの改変を含む遺伝子的に改変された細菌株を得ることからなる。このプロセスには、細菌株内の少なくとも一つの遺伝子(例えば、E. coli内のmetB)を進化させ、進化した株内にメチオニン・シンターゼ活性またはホモシステイン・シンターゼ活性をもたらされた改変が復帰突然変異につながらないように再生させるために、上記定義の硫黄源の存在下で当初の細菌株を淘汰圧にさらすことからなるステップが含まれる。
本発明は、従来のメチオニン生合成経路に関与する少なくとも一つの外因性遺伝子の不活性化を含む改善された「メチオニン・シンターゼ」活性を有する株にも関する。
好ましい実施形態において、細菌株は不活性化された外因性遺伝子を少なくとも一つ含む。この外因性遺伝子は、metB、metJ、metC、metE、またはmetHから選択される。
本発明の好ましい実施形態において、改善された「メチオニン・シンターゼ」活性を有する株内、特にE. coliにみられる当初株の改変は、(E. coli内の遺伝子metEにコードされる)野生型メチオニン・シンターゼ活性を不活性化すること、次いで得られた改変された微生物を、メチオニン、S-アデノシルメチオニン、ホモシステイン、およびシスタチオニンは含まないがメチルメルカプタン(外因性補基質)またはその塩の一つを含む、規定の培地上で培養すること、微生物が当初は不活性化されていた活性に差し替えるようにメチルメルカプタンの存在下で、強力に改善されたシスタチオニン-γ-シンターゼのメチオニン・シンターゼ活性を有する進化した微生物を選別することからなる。本発明のこの実施形態において、進化した微生物の選別に使用される培地は、当初の微生物(改変されていない微生物)が生育する培地と同じであって補基質(例えばアルキルメルカプタン)が一つ加えられるだけであることに注意することは重要である。本発明の具体的実施形態において、本発明の進化した微生物を含め選択される細菌株は、E. coli株、より具体的にはE. coli K183株であって、この株は登録番号I-3005で2003年4月2日にブダペスト条約に基づいた国立培養物および微生物コレクション(CNCM)(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, フランス)に登録済みである。この株は、改変されたシスタチオニン-γ-シンターゼを発現する遺伝子を有し、改変されたシスタチオニン-γ-シンターゼはE325Aの突然変異および不活性化されたmetEを含む。
本発明の特定の用途において、対応する改善された「メチオニン・シンターゼ」を有する株を得るために付加的にmetCおよび/またはmetHおよび/またはmetJを除去した株を使用することも可能である。
本発明の第二の同様に好ましい実施形態において、当初株、とりわけE. coliの改変は、(E. coli内の遺伝子metCにコードされる)シスタチオニン-β-リアーゼを不活性化すること、次にメチオニン、S-アデノシルメチオニン、ホモシステイン、およびシスタチオニンを含まない規定の培地上で得られる改変された微生物を培養すること、微生物が当初は不活性化されていた活性に差し替えるようにH2Sの存在下で、強力に改善されたシスタチオニン-γ-シンターゼのホモシステイン・シンターゼ活性を有する進化した微生物を選別することからなる。この実施形態において、進化した微生物の選別に使用される培地は、当初の微生物(改変されていない微生物)が生育する培地と同じであることに注意することは重要である。本出願の特定の実施形態において、培地にNaSHを加えることも可能である。別の特定の用途において、付加的に少なくともmetHおよび/またはmetJにおける突然変異を有する株を使用することが可能である。
本発明の第三の同様に好ましい実施形態において、当初株、とりわけE. coliの改変は、(metB遺伝子にコードされる)野生型サクシニルホモセリン・スルフヒドリラーゼおよび(E. coli内のmetE遺伝子にコードされる)メチオニン・シンターゼを不活性化することからなる。次に、(C. glutamicum内のmetY遺伝子にコードされる)アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼが導入され、得られた改変された微生物が、メチオニン、S-アデノシルメチオニン、ホモシステイン、およびシスタチオニンは含まないが、アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ(MetY)によって保持されるメチオニン・シンターゼ活性が強力に改善された進化した微生物の選別のためにメチルメルカプタン・ナトリウム塩を追加した規定の培地上で、当初は不活性化されていたメチオニン・シンターゼ活性を差し替えるようにメチルメルカプチドナトリウムの存在下で、培養される。本発明のこの実施形態において、進化した微生物の選別に使用される培地は、当初の微生物(改変されていない微生物)が生育する培地と同じであって補基質(例えばメチルメルカプタン)が一つ加えられるだけであることに注意することは重要である。本発明の特定の用途において、付加的に少なくともmetHおよび/またはmetJおよび/またはmetCを除去した株を使用することが可能である。
メチオニンを多量に生産させるための遺伝子metJの突然変異が特開2000-157267号で提案されている(GenBank E35587も参照されたい)。この遺伝子は、遺伝子metB、E、L、J、およびR(Salmonella typhimurium内の)を抑制するタンパク質をコードする。この遺伝子の不活性化または改変によって、メチオニンがおこなっている負のフィードバック制御が軽減される。
遺伝子metC(GenBank M12858)はシスタチアニン-β-リアーゼ(EC4.4.1.8)をコードし、遺伝子metE(GenBank AE000458)およびmetH(GenBank J04975)はメチオニン・シンターゼ(EC2.1.1.13)をコードする。メチオニンは細胞の生命に必須なアミノ酸である。これらの遺伝子の一つまたはそれ以上が不活性化されると、通常のメチオニン生合成経路が抑圧される効果を生じる。
よく知られている、GenBankから得られるこれらの遺伝子を基準に用い、当業者は、E. coli以外の細菌株内の相当する遺伝子を決定することができる。この日常的な作業は、他の微生物のこれらの遺伝子を合成することによって決定できる共通配列を用い、他の生物内の相当する遺伝子をクローニングする縮重プローブを設計して実行すると有利である。分子生物学におけるこれらの日常的な技術は、当業者によく知られており、例えば、Sambrook他の文献(1989年分子クローニング:実験室マニュアル、第2版、Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York)に記載されている。
上記定義の改変された「メチオニン・シンターゼ」活性を有する酵素を含む本発明の改変された「メチオニン・シンターゼ」活性を有する株は、遺伝子metEおよび(または)遺伝子metHおよび(または)遺伝子metCおよび(または)遺伝子metBの少なくとも一つが不活性を呈することが好ましい。
上記定義の改変された「メチオニン・シンターゼ」活性を有する酵素により、一般式(III)の基質の一般式(I)の酸への直接生物変換が可能な場合、本発明の株は、遺伝子metEおよび(または)遺伝子metHおよび(または)遺伝子metBの少なくとも一つ、好ましくは遺伝子metEの少なくとも一つが不活性を呈することが有利である。
上記定義の改変された「メチオニン・シンターゼ」活性を有する酵素により、一般式(III)の基質の式(IV)のホモシステインへの直接生物変換が可能な場合、
HS-(CH2)2-CHNH2-COOH(IV)
遺伝子metCおよび(または)遺伝子metBの少なくとも一つが不活性を呈する本発明の株の好適な酵素によって、ホモシステインは次に一般式(I)の酸へ変換される。遺伝子metEおよび(または)遺伝子metHが不活性を呈することもできる。この場合、同じ活性を有する酵素をコードする遺伝子の導入により、遺伝子metEおよび(または)遺伝子metHと結びついているメチラーゼ活性が再生される。この酵素は、一般式(I)のアミノ酸の合成収率改善のために選択されたおよび(または)改変された酵素の一つであることができる。
HS-(CH2)2-CHNH2-COOH(IV)
遺伝子metCおよび(または)遺伝子metBの少なくとも一つが不活性を呈する本発明の株の好適な酵素によって、ホモシステインは次に一般式(I)の酸へ変換される。遺伝子metEおよび(または)遺伝子metHが不活性を呈することもできる。この場合、同じ活性を有する酵素をコードする遺伝子の導入により、遺伝子metEおよび(または)遺伝子metHと結びついているメチラーゼ活性が再生される。この酵素は、一般式(I)のアミノ酸の合成収率改善のために選択されたおよび(または)改変された酵素の一つであることができる。
一つの実施形態において、遺伝子metAによりホモセリンO-サクシニルトランスフェラーゼ活性(EC2.3.1.46)またはホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼ活性(EC2.3.1.11)のいずれかが付与される等制御されるホモセリンO-アシルトランスフェラーゼ活性の改変をも細菌株は呈することができる。
特定の実施形態において、ホモセリンO-アシルトランスフェラーゼ活性を得るために、ホモセリンO-サクシニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素(GenBank AAN83396)をコードするE. coliの遺伝子metAを置換するまたは改変することが可能である。当業者は、この活性がC. glutamicum(GenBank AF052652)の遺伝子metAによってコードされることを知っている。E. coliの遺伝子metAをC. glutamicumの遺伝子metAで置換する、またはホモセリンO-サクシニルトランスフェラーゼ活性の代わりにホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼ活性を得るためにE. coliのmetAの配列を改変する手順は当業者が知っている。
同様に、ホモセリンO-サクシニルトランスフェラーゼ活性を得るために、ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼ活性をコードするC. glutamicumの遺伝子metAを置換するまたは改変することが可能である。
上記の改変はすべて、本発明の方法を実行する際に、株を淘汰圧にさらすことによって実行可能である。別法として、本発明のスクリーニングを限られた数の改変しか呈しない株に対し実施し、式(II)の化合物、特にメチルメルカプタンの存在下で「メチオニン・シンターゼ」活性を呈する株を得て、正常なメチオニン合成経路の副路増強のために記載した他の改変を実施することが好ましい。
当業者は、微生物の遺伝子的特性の改変に使用される手順を知っている。遺伝子の過剰発現は、この遺伝子のプロモーターを強いあるいは誘導可能なプロモーターにin situで変えることにより達成可能である。別法としては、過剰発現すべき遺伝子が好適なプロモーターの制御下にある細胞内に複製プラスミド(単コピーまたは多コピー)を導入することができる。
遺伝子の不活性化は、好ましくは、相同的組換えによって実施される。その手順は簡単には以下の通りである。直鎖状のフラグメントを細胞に導入する。このフラグメントはin vitroで得られ、遺伝子の二つのフランキング領域およびこれら二つの領域の間の選択される遺伝子(通常、抗生物質に対し抵抗性の遺伝子)を少なくとも一つ含む。したがって、この直鎖状フラグメントは不活性遺伝子を呈する。組換え済みでフラグメントを組み込んだ細胞は、選択培地上に塗りつけることにより選別される。次に、本来の遺伝子が非活性化遺伝子によって置き換えられた二重組換え済みの細胞が選別される。この手順は、二重組換えの検知を加速する正または負の選別システムを用いることにより改善される。
好ましい実施形態において、細菌株はE. coliの株である。
他の実施形態において、細菌株はCorynebacteriumの株、特にC. glutamicumである。
本発明の好ましい実施形態において、細菌株は、登録番号I-3005で2003年4月2日にCNCM(フランスのIDA)に登録されたE. coli K183の株である。この株は、改変されたシスタチオニン-γ-シンターゼを発現する遺伝子を有し、改変されたシスタチオニン-γ-シンターゼは上記の様にE325Aの突然変異および不活性化されたmetEを含む。
本発明の微生物株は、シスタチオニン-γ-シンターゼ酵素および(または)アシルホモセリン・スルフヒドリラーゼ酵素を有する。これらは好ましくは、本発明の目的の一つでもある、スクリーニングし進化させる方法によって選別され改善される。本発明の株を遺伝子的に改変することもできる(すなわち、株は不活性、突然変異および(または)内因性遺伝子の少なくとも一つの過剰活性化を呈することができる)。この改変は、スクリーニング実施の前または後におこなうことができる。
式(II)の化合物、特にメチルメルカプタンの存在下でメチオニン生産のため株の選別および進化を加速するために、下記の操作を実行することができる。このプロセスはメチルメルカプタン用に記述されているが、当業者は、式(II)の他のいかなる化合物、特にH2Sにも適合させる方法を知っている。
a.目的物質の生産が微生物の生育に必要になるような微生物の生育を伴う目的物質の生合成の連鎖
一つの選択肢は、ホモシステインからメチオニンを生産するメチオニン・シンターゼをコードするmetE遺伝子を破壊することである。それにより、株はメチオニンに対し栄養要求性突然変異的になる。
一つの選択肢は、ホモシステインからメチオニンを生産するメチオニン・シンターゼをコードするmetE遺伝子を破壊することである。それにより、株はメチオニンに対し栄養要求性突然変異的になる。
単純な炭素源およびメチルメルカプタンまたはメチルメルカプタン・ナトリウム塩を含む最小培地内で生き残るため、微生物は、O-アシル-L-ホモセリンおよびメチルメルカプタンまたはメチルメルカプチドナトリウムからのL-メチオニンの合成経路を至適化しなければならない。コンピュータモデリングにより、このような条件において理論的メチオニン収率の2倍が可能であることが示された(表1)。
ただし、L-メチオニン以外の2-アミノ-4-(アルキルメルカプト)酪酸を所望する場合は、微生物を生育させるために培地にメチオニンを追加しなければならない。
b.主要な生合成経路を強化するための特に酵素レベルまたは遺伝子レベルでの負のフィードバックにおける抑圧制御
レプレッサー遺伝子をコードする遺伝子metJをこのように抑圧することができる。さらに、遺伝子metAによってコードされるホモシステイン・トランスサクシニラーゼは、メチオニンおよびS-アデノシルメチオニンによりダウン・レギュレーションされることが示されている(Taylor他、1966年、J.Biol.Chem.、241:3641〜3642頁)。したがって、ホモシステイン・トランスサクシニラーゼは負のフィードバックの影響を受けない酵素に置き換えることが望ましい(Chater他、1970年、J.Gen.Microbiol.、63:121〜131頁)。
レプレッサー遺伝子をコードする遺伝子metJをこのように抑圧することができる。さらに、遺伝子metAによってコードされるホモシステイン・トランスサクシニラーゼは、メチオニンおよびS-アデノシルメチオニンによりダウン・レギュレーションされることが示されている(Taylor他、1966年、J.Biol.Chem.、241:3641〜3642頁)。したがって、ホモシステイン・トランスサクシニラーゼは負のフィードバックの影響を受けない酵素に置き換えることが望ましい(Chater他、1970年、J.Gen.Microbiol.、63:121〜131頁)。
本発明の別の目的は、アルキルメルカプタンまたはH2S、特にメチルメルカプタンを代謝することにより、2-アミノ-4-(アルキルメルカプト)酪酸、特にL-メチオニンを生産する微生物を得ることを可能にする、スクリーニングおよび同定試験である。
このように本発明は、そのゲノム内に突然変異を保持し、それによって式(II)の化合物を同化することが可能になり式(I)のアミノ酸を生産する株を同定することを可能にする。これらの改変により、株の「メチオニン・シンターゼ」活性の増大が誘導される。したがって、単純な炭素源および式(II)の化合物から自律的にメチオニンを生産する株の生産を加速することが可能である。
本発明の別の目的は、遺伝子的に改変され得る細菌株であって、シスタチオニン-γ-シンターゼ酵素またはアシルホモセリン・スルフヒドリラーゼ酵素をコードする遺伝子を保持する当初の細菌株をスクリーニングする方法である。この当初の細菌株から、式(I)のアミノ酸、特にL-メチオニンを生産し、式(II)の含硫黄化合物存在下での「メチオニン・シンターゼ」活性の改変を誘導する酵素の遺伝子の改変を呈し、それによってシスタチオニン-γ-シンターゼ酵素またはアシルホモセリン・スルフヒドリラーゼ酵素をコードする遺伝子が進化するように、式(II)の化合物存在下で細菌株を淘汰圧にさらし、進化は一般式(III)の基質が一般式(I)のアミノ酸または式(IV)のホモシステインに優先的かつ直接変換されることを可能にする突然変異からなる、遺伝子的に改変された細菌株が得られる。
当初の細菌株は、少なくとも一つの内因性遺伝子の、特に強力な構成的プロモーターの挿入により、不活性化および(または)過剰活性化を呈することができる。
本発明は、式(II)の化合物、特にメチルメルカプタン存在下での酵素の「メチオニン・シンターゼ」活性の増大を含め、シスタチオニン-γ-シンターゼ酵素またはアシルホモセリン・スルフヒドリラーゼ酵素の遺伝子に対する改変を呈する細菌株にも関する。このような株は、上記のように、他の遺伝子的改変(内因性遺伝子の不活性化、突然変異、または過剰発現)の少なくとも一つを呈することもできる。
本発明の株は、本発明の方法によって得ることができ、特に本発明の方法によって得ることが好ましい。
本発明は、それによって上記定義の改変された「メチオニン・シンターゼ」活性を有する微生物が、一般式(II)の含硫黄化合物存在下で、上記定義の単純な炭素源を含む好適な培地内で生育する、上記定義の式(I)の2-アミノ-4-(アルキルメルカプト)酪酸を調製する方法にも関する。式(I)のアミノ酸は、好ましくはメチオニン、より好ましくはL-メチオニンであって、一般式(II)の含硫黄化合物はメチルメルカプタンまたはH2Sである。
本発明において、「培養」および「発酵」という用語は、単純な炭素源を含む好適な培養培地上での微生物の生育を示すのに区別せずに使用される。
本発明の微生物の培養(発酵)条件は、当業者が設定できる。具体的には、細菌は、20℃から55℃までの温度、好ましくは25℃から40℃までの温度、より好ましくはC.glutamicumについて約30℃、E. coliについて約37℃の温度で生育される。
発酵は、式(II)の含硫黄化合物とともに単純な炭素源を少なくとも一種含み、使用される細菌に適合した既知の規定組成を有する無機培養培地を備えた発酵槽内でおこなわれる。
具体的には、E. coli用無機培養培地は、M9培地(Anderson、1946年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 32:120〜128頁)、M63培地(Miller、1992年、細菌遺伝子学短期コース:E. coliおよび関係細菌用実験室マニュアルおよびハンドブック、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York)、あるいはSchaefer他が規定した培地(1999年、Anal.Biochem.270:88〜96頁)等と同一または類似の組成を有することができる。
同様に、C.glutamicum用無機培養培地は、BMCG培地(Liebl他、1989年、Appl.Microbiol.Biotechnol.32:205〜210頁)あるいはRiedel他が記述した培地(2001年、J.Mol.Microbiol.Biotechnol.3:573〜583頁)等の培地と同一または類似の組成を有することができる。
培地は、いかなる栄養要求性突然変異も補償できるように不足を補うことができる。培地は、培養および生産モードに適合したある濃度の単純な炭素源と、株の進化と選択された生産モードに適合した濃度の式(II)の含硫黄化合物を含む。
発酵後、式(I)のアミノ酸は通常の方法で回収され、必要な場合には精製される。
培養培地内の式(I)のアミノ酸を回収し精製する方法は、当業者がよく知っている。
本発明は、それにより一般式(III)の基質が、
R"-O-(CH2)2-CHNH2-COOH(III)
(式中、R"は、アシル基、好ましくはサクシニル基またはアセチル基のいずれかである)、
上記定義の式(II)の含硫黄化合物を含む好適な反応培地内で上記の改変された「メチオニン・シンターゼ」活性を有する酵素と反応する、式(I)の2-アミノ-4-(アルキルメルカプト)酪酸を調製する方法にも関する。
R"-O-(CH2)2-CHNH2-COOH(III)
(式中、R"は、アシル基、好ましくはサクシニル基またはアセチル基のいずれかである)、
上記定義の式(II)の含硫黄化合物を含む好適な反応培地内で上記の改変された「メチオニン・シンターゼ」活性を有する酵素と反応する、式(I)の2-アミノ-4-(アルキルメルカプト)酪酸を調製する方法にも関する。
好適な反応培地は、当業者によく知られている通常の酵素反応培地、特に基質および酵素が溶解または懸濁している水性培地である。反応の実施条件は当業者がよく知っており、特に酵素の実質的変性の防止が求められる。
本発明の特定の実施形態において、改変された「メチオニン・シンターゼ」活性を有する酵素は非活性化された細菌内または細胞抽出物内に存在する。
本発明の他の特定の実施形態において、改変された「メチオニン・シンターゼ」活性を有する酵素は精製された酵素である。
D.II.システインの生合成経路
本発明は、生物変換の分野および微生物の発酵によるアミノ酸生産にも関する。本発明は、改変された「システイン・シンターゼ」活性を有する酵素、特に改変されたO-アシル-ホモセリン・スルフヒドリラーゼを含み、遺伝子的に改変された株の同定を可能にする、スクリーニング方法および進化を促す方法にも関する。前記微生物株の培養により、相当する株は、L-システインまたはアミノ酸誘導体を生産する。
本発明は、生物変換の分野および微生物の発酵によるアミノ酸生産にも関する。本発明は、改変された「システイン・シンターゼ」活性を有する酵素、特に改変されたO-アシル-ホモセリン・スルフヒドリラーゼを含み、遺伝子的に改変された株の同定を可能にする、スクリーニング方法および進化を促す方法にも関する。前記微生物株の培養により、相当する株は、L-システインまたはアミノ酸誘導体を生産する。
システインは、様々な手段および異なる原料を用いて製造することができる。Sun-Orient Chemical Co., Ltd.は、HClの存在下で加水分解した髪の毛からL-システインを抽出している。次に、L-システインは電解反応を用いてシステインモノ塩化水素に変換される。
ストレッカー合成(アンモニア、HCN、およびメルカプトアルデヒド存在下でのL-システインの合成)によってDL-システインモノ塩化水素を製造することができる。
クロロアセトアルデヒド、HCN、重炭酸アンモニウム、硫化ナトリウムを混合する、ブッヘラー・ベルグ反応によってもL-システインの製造が可能である。L-システインは、塩酸溶液中でモノ塩化水素塩として結晶化される。
β位が置換されたアラニンと硫化物との間の反応をトリプトファン・シンターゼが触媒する、システインの酵素的製造法すなわち生物変換が英国特許第2174390号および欧州特許第0272365号に記載されている。同様に、微生物発酵によるシステインの製造が欧州特許第0885962号および国際公開第01/27307号および国際公開第97/15673号に記載されており、国際公開第01/27307号および国際公開第97/15673号にはそれぞれ、微生物により合成されたシステインの排出最適化、システインによるフィードバック阻害に不応答性のH2Sおよびセリン・アセチルトランスフェラーゼの生産を最適化するための遺伝子cysBの過剰発現が記載されている。
本発明を、例えば、単純な炭素源と上記定義の一般式(II)の化合物からなる硫黄源の代謝によって、
R'-SH(II)
一般式(V)の2-アミノ-4-(アルキルメルカプト)プロピオン酸を生産し、
R-S-CH2-CHNH2-COOH(V)
(式中、Rは上記の一般式(I)の部分と同様に定義される)
「進化したシステイン・シンターゼ」活性を有する突然変異した酵素をコードする遺伝子を少なくとも一つ呈する、進化した微生物、特に細菌、例えばE. coliおよびCorynenebacteriaの株を提供するシステインの生合成経路(図4)に応用することができる。
R'-SH(II)
一般式(V)の2-アミノ-4-(アルキルメルカプト)プロピオン酸を生産し、
R-S-CH2-CHNH2-COOH(V)
(式中、Rは上記の一般式(I)の部分と同様に定義される)
「進化したシステイン・シンターゼ」活性を有する突然変異した酵素をコードする遺伝子を少なくとも一つ呈する、進化した微生物、特に細菌、例えばE. coliおよびCorynenebacteriaの株を提供するシステインの生合成経路(図4)に応用することができる。
本発明において、一般式(I)の化合物の「生理学的に許容される塩」とは、本発明の微生物株の代謝または生育能力に影響を与えない塩、特にナトリウム等のアルカリ金属の塩である。
本発明の好ましい実施形態において、Rは、直鎖状または分岐した1から4個までの炭素原子を含むアルキル基、具体的にはメチル基、エチル基、n-プロピル基、i-プロピル基、n-ブチル基、i-ブチル基、またはt-ブチル基である。Rは優先的にメチル基である。
得られる一般式(V)の2-アミノ-4-(アルキルメルカプト)プロピオン酸はL-システインであることが好ましい。
本発明において、進化した「システイン・シンターゼ」活性を有する酵素は、一般式(V)のアミノ酸、特にL-システインの生合成に関与する突然変異した酵素であって、その必須な活性は、一般式(II)の硫黄化合物の存在下でアセチルセリン、好ましくはO-アセチル-L-セリンを一般式(V)のアミノ酸に直接変換することであるのに対し、当初の非突然変異酵素の必須な活性は、「システイン・シンターゼ」活性ではなかった。それぞれ遺伝子cysKまたはcysMによってコードされるシステイン・シンターゼAおよびB等の、硫化水素(H2S)の存在下でO-アセチル-L-セリン(アセチルセリン)をL-システインに直接変換するシステインの生合成に本来関与してきた酵素は、このため、この定義から除外されている。
「当初の」非突然変異酵素は、優先的には、H2Sの存在下でスルフヒドリル化反応を触媒する酵素であって、好ましくはO-アシル-L-ホモセリン・スルフヒドリラーゼ活性を有する酵素である。
O-アシル-L-ホモセリン・スルフヒドリラーゼ活性を有する「当初の」酵素は、参照番号PF01053のPFAMおよび参照番号CPG2873のCOGにおけるO-アシル-L-ホモセリン・スルフヒドリラーゼ相当物から選択するのが有利である。
これらは以下のアシルホモセリンから優先的に選択される。
NP_785969 O-アセチルホモセリン(チオール)-リアーゼ、Lactobacillus platarum WCFS1
AAN68137 O-アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ、Pseudomonas putida KT2440
NP_599886 O-アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ、Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
NP_712243 アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ、Leptospira interrogans serovar lai str. 56601
BAC46370 O-サクシニルホモセリン・スルフヒドリラーゼ、Bradyrhizobium japonicum USDA110
AAO57279 O-サクシニルホモセリン・スルフヒドリラーゼ、Pseudomonas syringae pv. tomato str. DC3000
NP_284520 O-サクシニルホモセリン・スルフヒドリラーゼ、Neisseria meningitidis Z2491
AAA83435 O-サクシニルホモセリン・スルフヒドリラーゼ、P.aeruginosa
NP_785969 O-アセチルホモセリン(チオール)-リアーゼ、Lactobacillus platarum WCFS1
AAN68137 O-アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ、Pseudomonas putida KT2440
NP_599886 O-アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ、Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
NP_712243 アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ、Leptospira interrogans serovar lai str. 56601
BAC46370 O-サクシニルホモセリン・スルフヒドリラーゼ、Bradyrhizobium japonicum USDA110
AAO57279 O-サクシニルホモセリン・スルフヒドリラーゼ、Pseudomonas syringae pv. tomato str. DC3000
NP_284520 O-サクシニルホモセリン・スルフヒドリラーゼ、Neisseria meningitidis Z2491
AAA83435 O-サクシニルホモセリン・スルフヒドリラーゼ、P.aeruginosa
高い優先度でO-アシル-L-ホモセリン・スルフヒドリラーゼがCorynebacteriumの遺伝子metY、特にC.glutamicum(GenBank AF220150)の遺伝子metYによってコードされるO-アシル-L-ホモセリン・スルフヒドリラーゼおよび同一のO-アシル-L-ホモセリン・スルフヒドリラーゼを示す相同性酵素の中から選択され、C.glutamicum(GenBank AF220150)の遺伝子metYによってコードされるO-アシル-L-ホモセリン・スルフヒドリラーゼに対する配列相同性は少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%である。
本発明は特に、酵素アシルホモセリン・スルフヒドリラーゼの基質特異性をアセチルセリンを優先的に使用するように制御しながら改変することが可能であるという事実に基づいている。したがって、本発明は、アシルホモセリン・スルフヒドリラーゼ活性からシステイン・シンターゼ活性に進化させるために、非改変酵素の基質特異性を制御しながら改変することが可能であるという事実に基づいている。
本発明の好ましい実施形態において、非改変微生物の株は、自然にはO-アシル-L-ホモセリン・スルフヒドリラーゼ活性またはO-アシル-L-ホモセリン・スルフヒドリラーゼをコードする遺伝子metYと相同な遺伝子を保持しない。
本発明によって改変される株は、新しい代謝経路の発生を可能にするため、内因性遺伝子の少なくとも一つの不活性化、突然変異および/または過剰活性化によって遺伝子的に改変される。具体的には、本発明の微生物株は、それぞれシステイン・シンターゼA酵素活性、システイン・シンターゼB酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子cysKおよび/または遺伝子cysMを抑圧するように遺伝子的に改変される。遺伝子cysKおよび遺伝子cysMは優先的に抑圧される。
遺伝子cysK(図4)はシステイン・シンターゼA(GenBank NP_416909)をコードし、遺伝子cysMはシステイン・シンターゼB(GenBank NP_416916)をコードする。これらの遺伝子が不活性化されると、システイン生合成経路は閉鎖され、株はシステインに対し栄養要求性突然変異的になる。
次に、主活性がシステイン・シンターゼ(O-アセチルセリン・スルフヒドリラーゼとも呼ばれる)活性である酵素以外で、上記定義のように、H2Sの存在下でスルフヒドリレーション反応を触媒する酵素をコードする遺伝子、特にCorynebacteriumの遺伝子metY等のO-アシル-L-ホモセリン・スルフヒドリラーゼをコードする遺伝子、および特にC.glutamicum(GenBank AF220150)の遺伝子metYが改変された細菌に導入される。
H2Sの存在下でスルフヒドリレーション反応を触媒する酵素をコードする遺伝子を、当業者に可能な通常の方法、直接組み込みまたは複製プラスミドによる搬送で改変される細胞に導入することができる。
このようにして改変された株は、好ましくは、本発明の目的の一つである、スクリーニングし進化させる方法によって選別され改善されるが、システインの生産を再生させるため、この方法によって、アシルホモセリン・スルフヒドリラーゼ活性をシステイン・シンターゼ活性に進化させることも可能である。
アシルホモセリン・スルフヒドリラーゼ活性の「進化したシステイン・シンターゼ」活性への変換は、当初の改変された株(M)と少なくとも同じ生育速度を有する遺伝子的に改変され進化した細菌株(E)が単純な炭素源としてのグルコースの存在下で最小培地内で生育する際に達成されると考えられる。特定の実施形態において、アシルホモセリン・スルフヒドリラーゼ活性の「進化したシステイン・シンターゼ」活性への変換は、改変されたO-アシル-L-ホモセリン・スルフヒドリラーゼタンパク質が保持するシステイン・シンターゼ活性がその当初活性に比べ10%改善された時に達成されると考えられる。いくつかの場合において、この改善は、細菌Mの生育速度に比べて細菌Eの生育速度が大きいことから確認できる。結局、アシルホモセリン・スルフヒドリラーゼ活性の「進化したシステイン・シンターゼ」活性へのこの変換は、当初システインが全く存在しない、同等な培養条件下で、株Eが株Mと少なくとも同じ量のシステインを生産する際に達成されると考えられる。
本発明の株を、内因性遺伝子の少なくとも一つの不活性化、突然変異および/または過剰活性化によって遺伝子的に改変することができ、このような改変は、改変される株が進化するステップの前または後に実施される。特に本発明によって、システイン・シンターゼA、システイン・シンターゼB、およびシスタチオニン-γ-シンターゼの酵素活性を抑圧するため、微生物株が遺伝子的に改変される。遺伝子cysKおよび遺伝子cysMが優先的に抑圧される。遺伝子cysKはシステイン・シンターゼA(GenBank NP_416909)をコードし、遺伝子cysMはシステイン・シンターゼB(GenBank NP_416916)をコードする。これらの遺伝子が不活性化されると、システイン生合成経路は抑制され、株はシステインに対し栄養要求性突然変異的になる。これにより、システインの生産再生のために、アシルホモセリン・スルフヒドリラーゼ活性をシステイン・シンターゼ活性に改変した株の選別が可能となる。
必要な場合、シスタチオニンγ-リアーゼ活性をコードする遺伝子を除去することができる。
一つの実施形態において、システインのフィードバック阻害に対し不応答性にするため、細菌株の遺伝子cysE(図4)が保持するセリンO-アシルトランスフェラーゼ活性を改変することもできる。
他の実施形態において、H2S硫黄同化経路を脱制御するために、細菌株の遺伝子cysBを過剰発現させることもできる。
式(V)のアミノ酸、好ましくはL-システインの生産には、前記定義(図4)の「改善されたシステイン・シンターゼ活性」を有する酵素をコードする遺伝子と同時に、遺伝子acs(EC 6.2.1.1)アクセス番号AE000480等のアセチル-CoAシンターゼをコードする遺伝子を過剰発現させることも有利である。
アセテート・キナーゼおよび/またはホスホトランスアセチラーゼをコードする遺伝子、特にアクセス番号がそれぞれAE000318およびAE000319で、それぞれアセテート・キナーゼ(EC 2.7.2.1)およびホスホトランスアセチラーゼ(EC 2.3.1.8)をコードする遺伝子ackおよび遺伝子ptaを弱化させるまたは除去することさえも有利である。この弱化/除去は、アセチル-CoAシンターゼをコードする遺伝子の過剰発現と組み合わせることが好ましい。
上記の改変すべては、改変される株に対し遺伝子metY進化プロセスの前または進化した株、すなわち遺伝子metYの進化後に実施できるが、cysKおよび/またはcysMの除去の場合は、改変される株の生育プロセスおよび進化プロセスの前に実施しなければならない。
本発明はさらに、上記定義の「進化したシステイン・シンターゼ活性」を有する細菌株を生成する方法に関し、この方法は、スルフヒドリレーション反応を触媒する酵素を保持しその必須の活性が上記定義の「システイン・シンターゼ」活性ではない細菌株を、その細菌株内の酵素をコードする遺伝子を「進化したシステイン・シンターゼ」活性をコードする遺伝子に進化させるために、H2S存在下で単純な炭素源を含む好適な培養培地内で生育させることからなるステップを含む。
H2S存在下でスルフヒドリレーション反応を触媒する酵素をコードする遺伝子の選別および進化を加速するため、以下のステップを実行することができる。
a. システインの生産が微生物の良好な生育に必要になるような、システイン生合成と微生物の生育との連鎖
このため、遺伝子cysK、cysM、および場合によってはmetBおよび場合によってはシスタチアニン-γ-リアーゼをコードする遺伝子(例えば、B.subtilis内の遺伝子yrhB)を、天然のシステイン合成経路をすべて抑圧するために、除去することができる。こうして、株はシステインに対し栄養要求性突然変異的になる。
このため、遺伝子cysK、cysM、および場合によってはmetBおよび場合によってはシスタチアニン-γ-リアーゼをコードする遺伝子(例えば、B.subtilis内の遺伝子yrhB)を、天然のシステイン合成経路をすべて抑圧するために、除去することができる。こうして、株はシステインに対し栄養要求性突然変異的になる。
単純な炭素源を含む最小培地内で生き残るため、微生物は、O-アシル-ホモセリン・スルフヒドリラーゼのシステイン・シンターゼ活性を至適化し、アセチルセリンおよびH2Sからのシステイン合成経路を再構築できるようにしなければならない。metBが除去されている場合、培地にメチオニンを付加することが必要である。
b.主要な生合成経路を強化するための制御、特に酵素レベルまたは遺伝子レベルのフィードバック阻害の抑圧
硫黄同化経路のアクチベータータンパク質をコードする遺伝子cysBは過剰発現させることができ(国際公開第01/27307号)、H2S生産の最適化が可能になる。さらに、cysE遺伝子にコードされるセリン・アセチルトランスフェラーゼはセリンによってフィードバック阻害されることが示されている。したがって、セリン・アセチルトランスフェラーゼをフィードバック阻害に不応答性の酵素に置き換える(国際公開第97/15673号;国際公開第02/061106号)またはセリン・アセチルトランスフェラーゼを過剰発現させる(国際公開第02/29029号)ことが望ましい。
硫黄同化経路のアクチベータータンパク質をコードする遺伝子cysBは過剰発現させることができ(国際公開第01/27307号)、H2S生産の最適化が可能になる。さらに、cysE遺伝子にコードされるセリン・アセチルトランスフェラーゼはセリンによってフィードバック阻害されることが示されている。したがって、セリン・アセチルトランスフェラーゼをフィードバック阻害に不応答性の酵素に置き換える(国際公開第97/15673号;国際公開第02/061106号)またはセリン・アセチルトランスフェラーゼを過剰発現させる(国際公開第02/29029号)ことが望ましい。
本発明はさらに、前記定義の「進化したシステイン・シンターゼ」活性を有する微生物を前記定義の単純な炭素源を含む好適な培養培地内で生育させる、システインの調製方法に関する。
発酵条件の決定は当業者に帰す。発酵は、単純な炭素源を少なくとも一種含み、使用される細菌に適合した既知の規定組成を有する無機培養培地を備えた発酵槽内でおこなわれる。
培地は、遺伝子cysKおよび/または遺伝子cysMの除去によるもの以外の栄養要求性突然変異を補償するために付加することができ、生育モードおよび生産に適合した濃度の単純な炭素源、ならびに株の進化および所望の生産モードに適合した濃度の式(II)の硫黄化合物を含む。
発酵後に、システインは通常の方法で回収され、必要な場合精製される。
培養培地内のシステインを回収し精製する方法は、当業者がよく知っている。
本発明はさらに、上記定義の一般式(II)の硫黄化合物を含む好適な反応培地内で、アセチルセリンを上記定義の「進化したシステイン・シンターゼ」活性を有する酵素と反応させることを特徴とする、上記定義の一般式(V)のアミノ酸を調製する方法に関する。
好適な反応培地は、当業者によく知られている通常の酵素反応培地であって、特に基質および酵素が溶解または懸濁している水性培地である。反応の操作条件は、当業者がよく知っており、特に酵素の変性を実質的に防止するのに必要な条件である。
本発明の特定の実施形態において、「進化したシステイン・シンターゼ」活性を有する酵素は、不活性化された細菌または細胞抽出物内に存在する。
D.III. NADPH依存性経路の進化
本発明の他の好ましい実施形態において、NADPH依存性経路を進化させることができる。進化させるために、NADPHの生産速度が、この方法実施のために選択された規定培地上の細菌の生育を阻害することになる、NADP+(NADPとも呼ばれる)への酸化速度を上回るように、当初の細菌株を改変しなければならない。
本発明の他の好ましい実施形態において、NADPH依存性経路を進化させることができる。進化させるために、NADPHの生産速度が、この方法実施のために選択された規定培地上の細菌の生育を阻害することになる、NADP+(NADPとも呼ばれる)への酸化速度を上回るように、当初の細菌株を改変しなければならない。
本発明は、NADPHを消費する代謝経路の進化を可能にするように改変された微生物の株に関する。本発明による株は、NADPHを消費する生物変換プロセスに使用することができる。
本発明はさらに、本発明により化学的構成要素を調製するのに必要な遺伝子的特性をも保持する株の、好適な培地内での生育が関与する生物変換により、化学的構成要素を調製する方法に関する。
生物変換プロセスは、低コストで大量の化学的構成要素の生産が可能になるまで発展しており、同時に工業副産物または農業副産物に良好な用途を提供している。
in vivo生物変換により目的の化学的構成要素を生産するには、大きく二つの取組み方がある。
・一つ目は、単純な炭素源からの化学的構成要素の生産を可能にする、発酵である(例えば、国際公開第01/02547号で、グルコース存在下でのC.glutamicumの発酵によるリシン生産が記載されている)。
・二つ目は、目的の化学的構成要素を生産するための、必要なバイオマスの生産だけに使用される単純な炭素源とは異なる与えられた基質の微生物による生物変換である(例えば、R-ピペリジン誘導体の生産が記載されている国際公開第00/12745号、およびタガトースの生産を記載している国際公開第00/68397号)。
・一つ目は、単純な炭素源からの化学的構成要素の生産を可能にする、発酵である(例えば、国際公開第01/02547号で、グルコース存在下でのC.glutamicumの発酵によるリシン生産が記載されている)。
・二つ目は、目的の化学的構成要素を生産するための、必要なバイオマスの生産だけに使用される単純な炭素源とは異なる与えられた基質の微生物による生物変換である(例えば、R-ピペリジン誘導体の生産が記載されている国際公開第00/12745号、およびタガトースの生産を記載している国際公開第00/68397号)。
生物変換プロセスの改良には、温度、酸化、培地組成、回収プロセス等の様々な要素が関係する。目的の化学的構成要素の生産および/または排出が増大するように微生物を改変することも可能である。
発酵については、例えば、遺伝子の制御を改変することにより、あるいは酵素特性を改変する遺伝子を改変することにより、あるいは補基質の再生を至適化することにより、例えば、生合成経路を至適化するよう努めることが可能である。
生物変換については、酵素の速度論的性質を改善すること、副産物の形成を軽減すること、および生物変換の一つまたは複数のステップに関与する補基質の再生を至適化するよう努めることが可能である。
生物変換に関与する補基質の内で、特にアミノ酸(例えば、アルギニン、プロリン、イソロイシン、メチオニン、またはリシン)、ビタミン(例えば、パントテン酸塩、フィロキノン、またはトコフェロール)、芳香族化合物(例えば、国際公開第94/01564号)、または付加価値が高い他の化学製品の生産にとって、NADPHが重要である。
本発明は、酵素またはNADPHを消費する代謝経路を進化させるように改変された微生物株に関する。
このような微生物を生成するため、本発明者らは、NADPHの生産速度を増大しかつそのNADP+への酸化速度を低減する改変を選択した。改変された微生物は次に、酵素またはNADPHを消費する代謝経路を進化させるのに使用された。これらの細菌は、NADPH依存性合成経路由来の化学的構成要素生産のための生物変換プロセスにも慎重に使用することができる。
NADPHの至適化については、以下でE. coliに関し記載する。同じ原則が同様に有気性条件で生育する微生物すべてに適用される。
本発明により改変された株は、遺伝子udhAおよび/または遺伝子qorを除去している。本発明の好ましい実施形態において、遺伝子udhAおよび遺伝子qorは両方とも除去される。
本発明の特定の実施形態において、本発明により改変された株は、pgiまたはpfkAおよび(または)pfkBから選択される遺伝子が除去されている。
上記の遺伝子は、当業者によく知られており、特にE. coliのものが科学的文献に記載されている。
E. coliの遺伝子および対照標準
udhA:X66026可溶性ピリジン・トランスヒドロゲナーゼ;
qor:L02312キノリン・オキシドリダクターゼ;
pgi:X15196ホスホグルコースイソメラーゼ(EC 5.3.1.9);
pfkA:X02519ホスホフラクトキナーゼ-1;
pfkB:K02500ホスホフラクトキナーゼ-2
E. coliの遺伝子および対照標準
udhA:X66026可溶性ピリジン・トランスヒドロゲナーゼ;
qor:L02312キノリン・オキシドリダクターゼ;
pgi:X15196ホスホグルコースイソメラーゼ(EC 5.3.1.9);
pfkA:X02519ホスホフラクトキナーゼ-1;
pfkB:K02500ホスホフラクトキナーゼ-2
本発明の他の目的は、上記および下記のように、NADPHの生産のために改変された進化した微生物であって、この微生物は、一つまたはそれ以上の選択マーカー遺伝子とともに、目的の化学的構成要素の生物変換に関与するNADPH依存性酵素をコードする一つまたはそれ以上の遺伝子を保持し、この酵素が進化するようになる。
これらの遺伝子は、本発明の改変された株に本来存在しても良く、あるいは好適なベクターで形質転換する、すなわち微生物のゲノム内への組み込みまたは複製ベクターで本発明の至適化された株に導入しても良く、このベクターは、前記目的の化学的構成要素の生物転換に関与する酵素あるいは前記選択マーカーをコードする一つまたはそれ以上の遺伝子を保持する。
これらの遺伝子は、目的の化学的構成要素の生物転換に関与する酵素および/または選択マーカーをコードする核酸配列を含み、このコード配列は、生物転換のために選択された原核生物細胞および/または真核生物細胞内の有効なプロモーター配列に結合されている。ベクター(またはプラスミド)は、E. coliと他の微生物間のシャトルベクターであってよい。
本発明はさらに、遺伝子udhAおよび/または遺伝子qor、必要な場合には遺伝子pgiまたはpfkAおよび/またはpfkBが除去された、上記および下記定義の、本発明の改変された株を調製する方法に関する。
本発明の特定の実施形態において、株を調製する方法には、目的の化学的構成要素の生物転換に関与しNADPHを消費する一つまたはそれ以上の酵素および一つまたはそれ以上の選択マーカーをコードする一つまたはそれ以上の遺伝子を含む好適なベクターの少なくとも一つを含む改変された株の形質転換も含まれる。ベクターにより、遺伝子の複製あるいは改変される細菌の染色体への組込みが可能となる。上記定義のベクターによる株の形質転換は、本発明により、改変された株上または株の改変前に実施することができる。
NADPH生産のために改変された株は、分子生物学的方法によって得られる。
本発明の他の態様は、NADPH依存性酵素を進化させて、その速度論的特性を改善するため、その基質特異性を拡大するまたは縮小するため、および最終的には新規代謝経路を生成するおよび/または生物変換収率を改善するための、本発明のこれらの改変された株の使用に関する。本発明の他の態様は、その生物変換収率が未変換株および/または未進化株に比べて高い、NADPHを消費する生物変換反応を実施するための、改変された株または進化した株の使用に関する。
本発明はさらに、以下のステップを含むことを特徴とし、NADPHを消費するプロセスにより合成される、目的の化学的構成要素の生産方法に関する:
a)発酵または生物変換反応による生物変換を実施するのに必要なNADPH以外の基質を含み微生物の生育を助ける好適な培養培地内での、本発明の進化した微生物の培養、
b)培地からの目的の化学的構成要素の抽出、および必要な場合の精製。
a)発酵または生物変換反応による生物変換を実施するのに必要なNADPH以外の基質を含み微生物の生育を助ける好適な培養培地内での、本発明の進化した微生物の培養、
b)培地からの目的の化学的構成要素の抽出、および必要な場合の精製。
目的の化学的構成要素は、好ましくは、システイン、メチオニン、3-ヒドロキシプロピオン酸塩、ヒドロコルチソン、キシリトール、およびグリセロールから選択される。
生物変換反応のために、この方法では、変換される基質の好適な培養培地に追加がおこなわれる。
上記定義の本発明の方法のステップb)の培養培地は、グルコース、ガラクトース、ショ糖、乳糖または糖蜜等の異なる同化可能な糖、あるいはこれらの糖の副産物から選択される、同化可能な炭水化物を少なくとも一つ含む。特に好ましい単純な炭素源はグルコースである。もう一つの好ましい単純な炭素源はショ糖である。培養培地は、目的の化学的構成要素の生産を助ける一つまたは複数の基質(例えば、アミノ酸、ビタミン、無機塩等)も含むことができる。
以下の実施例は本発明を説明するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
F. 実施例
F.I. メチオニンの生合成経路
本発明のメチオニン生合成経路の代謝工学に対する第一の応用(例F.I.1.)には、以下のステップが含まれる。
a)E.coliの当初株内の遺伝子metEの除去;したがって、得られる改変された株はメチオニンに対し栄養要求性突然変異的になる。当初の株は、メチオニンを含まずS-アデノシルメチオニン、ホモシステインまたはシスタチオニンを含む最小培地(MM)で生育可能だが、改変された株は生育できない。
b)最初に除去された酵素活性(metE)を補償するために、内因性酵素活性をメチオニン・シンターゼ活性に進化させるようにメチルメルカプタン・ナトリウム塩(補基質)が加えられた同じ最小培地(MM)上での上記改変された株の培養。
c)株の特徴である、メチルメルカプチドナトリウム存在下での新規メチオニン・シンターゼ活性を有する進化した株の選別。
d)タンパク質をコードし、進化した酵素活性、この場合、改善されたメチオニン・シンターゼ活性を有するシスタチオニン-γ-シンターゼを含む進化した遺伝子の単離。
F.I. メチオニンの生合成経路
本発明のメチオニン生合成経路の代謝工学に対する第一の応用(例F.I.1.)には、以下のステップが含まれる。
a)E.coliの当初株内の遺伝子metEの除去;したがって、得られる改変された株はメチオニンに対し栄養要求性突然変異的になる。当初の株は、メチオニンを含まずS-アデノシルメチオニン、ホモシステインまたはシスタチオニンを含む最小培地(MM)で生育可能だが、改変された株は生育できない。
b)最初に除去された酵素活性(metE)を補償するために、内因性酵素活性をメチオニン・シンターゼ活性に進化させるようにメチルメルカプタン・ナトリウム塩(補基質)が加えられた同じ最小培地(MM)上での上記改変された株の培養。
c)株の特徴である、メチルメルカプチドナトリウム存在下での新規メチオニン・シンターゼ活性を有する進化した株の選別。
d)タンパク質をコードし、進化した酵素活性、この場合、改善されたメチオニン・シンターゼ活性を有するシスタチオニン-γ-シンターゼを含む進化した遺伝子の単離。
本発明のメチオニン生合成経路の代謝工学に対する第二の応用(例F.I.2.)には、以下のステップが含まれる。
a)E.coliの当初株内の遺伝子metCの除去;したがって、得られる改変された株はメチオニンに対し栄養要求性突然変異的になる。当初の株は、メチオニンを含まずS-アデノシルメチオニン、ホモシステインまたはシスタチオニンを含む最小培地(MM)で生育可能だが、改変された株は生育できない。
b)最初に除去された酵素活性(metC)を補償するために、内因性酵素活性をホモシステイン・シンターゼ活性に進化させるようにいかなる補基質も含まない同じ最小培地(MM)上での上記改変された株の培養。
a)E.coliの当初株内の遺伝子metCの除去;したがって、得られる改変された株はメチオニンに対し栄養要求性突然変異的になる。当初の株は、メチオニンを含まずS-アデノシルメチオニン、ホモシステインまたはシスタチオニンを含む最小培地(MM)で生育可能だが、改変された株は生育できない。
b)最初に除去された酵素活性(metC)を補償するために、内因性酵素活性をホモシステイン・シンターゼ活性に進化させるようにいかなる補基質も含まない同じ最小培地(MM)上での上記改変された株の培養。
本発明のメチオニン代謝経路の進化に対する第三の適用(例F.I.3.)には、以下のステップが含まれる。
a)E.coliの当初株内の遺伝子metC、metB、metJの除去;したがって、得られる改変された株はメチオニンに対し栄養要求性突然変異的になる。当初の株は、メチオニンを含まずS-アデノシルメチオニン、ホモシステインまたはシスタチオニンを含む最小培地(MM)で生育可能だが、改変された株は生育できない。
a1)C.glutamicumからの異種遺伝子である、遺伝子metYの導入;この遺伝子は、アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ活性をメチオニン・シンターゼ活性に進化させるためのものである。
b)最初に除去された酵素活性(metB、metC)を補償するために、内因性酵素活性をメチオニン・シンターゼ活性に進化させるようにメチルメルカプタン・ナトリウム塩(補基質)が加えられた同じ最小培地(MM)上での上記改変された株E.coli [metY Δ(metC、metB、metJ)]の培養。
c)メチルメルカプタン・ナトリウム塩存在下で新規メチオニン・シンターゼ活性を有する進化した株の選別。
a)E.coliの当初株内の遺伝子metC、metB、metJの除去;したがって、得られる改変された株はメチオニンに対し栄養要求性突然変異的になる。当初の株は、メチオニンを含まずS-アデノシルメチオニン、ホモシステインまたはシスタチオニンを含む最小培地(MM)で生育可能だが、改変された株は生育できない。
a1)C.glutamicumからの異種遺伝子である、遺伝子metYの導入;この遺伝子は、アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ活性をメチオニン・シンターゼ活性に進化させるためのものである。
b)最初に除去された酵素活性(metB、metC)を補償するために、内因性酵素活性をメチオニン・シンターゼ活性に進化させるようにメチルメルカプタン・ナトリウム塩(補基質)が加えられた同じ最小培地(MM)上での上記改変された株E.coli [metY Δ(metC、metB、metJ)]の培養。
c)メチルメルカプタン・ナトリウム塩存在下で新規メチオニン・シンターゼ活性を有する進化した株の選別。
例F.I.1. メチルメルカプタン・ナトリウム塩存在下でメチオニン・シンターゼ活性を有する進化した株の調製
a)改変されたE.coli Δ(metE)株の構築
遺伝子metEの不活性化は、クロラムフェニコール抵抗性遺伝子カセットを挿入すること、同時に当該遺伝子のほとんどを除去することで達成される。この方法は、Datsenko K.A.;Wanner B.L(2000年)、PCR産物を用いるEscherichia coliK-12における染色体遺伝子のワンステップ不活性化、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640〜6645頁に記載されている。
a)改変されたE.coli Δ(metE)株の構築
遺伝子metEの不活性化は、クロラムフェニコール抵抗性遺伝子カセットを挿入すること、同時に当該遺伝子のほとんどを除去することで達成される。この方法は、Datsenko K.A.;Wanner B.L(2000年)、PCR産物を用いるEscherichia coliK-12における染色体遺伝子のワンステップ不活性化、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640〜6645頁に記載されている。
この方法を実施するため、二つのオリゴヌクレオチドを使用した。
・100塩基を有するDmetER(SEQ ID No. 1)
tacccccgacgcaagttctgcgccgcctgcaccatgttcgccagtgccgcgcgggtttctggccagccgcgcgttttcagCATATGAATATCCTCCTTAG
小文字の領域は遺伝子metEの配列(4012903から4012824)(配列4010643から4012904、ウェブサイト上の参照配列はhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/)と相同で、
大文字の領域はプラスミドpKD3のクロラムフェニコール抵抗性カセット増幅用(Datsenko K.A.;Wanner B.L(2000年)、PCR産物を用いるEscherichia coliK-12における染色体遺伝子のワンステップ不活性化、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640〜6645頁)である。
・100塩基を有するDmetEF(SEQ ID No. 2)
tgacaatattgaatcacaccctcggtttccctcgcgttggcctgcgtcgcgagctgaaaaaagcgcaagaaagttattggTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
小文字の領域は遺伝子metEの配列(4010644から4010723)と相同で、
大文字の領域はプラスミドpKD3の保持するクロラムフェニコール抵抗性カセット増幅用である。
・100塩基を有するDmetER(SEQ ID No. 1)
tacccccgacgcaagttctgcgccgcctgcaccatgttcgccagtgccgcgcgggtttctggccagccgcgcgttttcagCATATGAATATCCTCCTTAG
小文字の領域は遺伝子metEの配列(4012903から4012824)(配列4010643から4012904、ウェブサイト上の参照配列はhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/)と相同で、
大文字の領域はプラスミドpKD3のクロラムフェニコール抵抗性カセット増幅用(Datsenko K.A.;Wanner B.L(2000年)、PCR産物を用いるEscherichia coliK-12における染色体遺伝子のワンステップ不活性化、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640〜6645頁)である。
・100塩基を有するDmetEF(SEQ ID No. 2)
tgacaatattgaatcacaccctcggtttccctcgcgttggcctgcgtcgcgagctgaaaaaagcgcaagaaagttattggTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
小文字の領域は遺伝子metEの配列(4010644から4010723)と相同で、
大文字の領域はプラスミドpKD3の保持するクロラムフェニコール抵抗性カセット増幅用である。
オリゴヌクレオチドDmetERおよびDmetEFはプラスミドpKD3からのクロラムフェニコール抵抗性カセットの増幅に使用される。得られたPCR産物は次にエレクトロポレーションによって、酵素Redリコンビナーゼが発現し相同的組換えを可能にしている株MG1655(pKD46)に導入される。クロラムフェニコール抵抗性形質転換細胞は選別されて、抵抗性カセットの挿入がオリゴヌクレオチドmetERおよびmetEFのPCR分析によって確認される。
metER(SEQ ID No. 3)ggtttaagcagtatggtgggaagaagtcgc(4012978から4012949までの配列に相同)
metEF(SEQ ID No. 4)cccggggatgaataaacttgccgccttccc(4010567から4010596までの配列に相同)
metER(SEQ ID No. 3)ggtttaagcagtatggtgggaagaagtcgc(4012978から4012949までの配列に相同)
metEF(SEQ ID No. 4)cccggggatgaataaacttgccgccttccc(4010567から4010596までの配列に相同)
次にクロラムフェニコール抵抗性カセットを除去することができる。クロラムフェニコール抵抗性カセットのFRT位で機能するFLPリコンビナーゼを保持するプラスミドpCP20がエレクトロポレーションによって組換え株に導入される。42℃での一連の培養終了後に、クロラムフェニコール抵抗性カセットが除かれたことが、上記で使用したのと同じオリゴヌクレオチドのPCR分析によって確認される。
b)補基質としてのメチルメルカプタン・ナトリウム塩存在下でのΔ(metE)改変株の培養と進化
E.coliをメチルメルカプタンからのメチオニン生産に至適化するため、フラスコ内で制御された選別を実施する。
E.coliをメチルメルカプタンからのメチオニン生産に至適化するため、フラスコ内で制御された選別を実施する。
(前記のように)metE遺伝子の不活性化によってメチオニンに対し栄養要求性突然変異的となったE.coli株は、メチルメルカプタンからメチオニンを生産することができない限り生育できない。
この方法を実施することにより、メチルメルカプタンの存在下で改変された「メチオニン・シンターゼ」活性を獲得したシスタチオニン-γ-シンターゼ(EC 4.2.99.9)を有するE.coli株の選別が可能となる。
制御された選別は、33mMのグルコースおよび最終濃度25mg/Lのクロラムフェニコール存在下で50mLの無機培地を含む密封されたガラスフラスコ内でおこなわれる(Schaefer他、1999年、Anal. Biochem. 270:88〜96頁)。
培養培地に、E.coli K12ΔmetE株を規定OD600nm値で接種する。細菌のいくつかがメチルメルカプタンの同化を可能にする遺伝子metB内の自発的突然変異を起こしている可能性があるため、接種は十分な量の細菌でおこなう。十分な量の細菌は、メチオニンを追加した無機培地上でメチオニンに対し栄養要求性突然変異的の株を培養して得る。
フラスコ三つに400mg/Lのメチルメルカプタン・ナトリウム塩溶液100μLを入れるが4番目のフラスコにはメチルメルカプタン・ナトリウム塩を入れない。培養物を37℃で振とうしながら6日間生育させ、その後OD600nmを測定する。結果を下の表2にまとめた。
これらの結果から、(光学濃度が増大した)フラスコ2および3においては、生育に必要なメチオニン生産にメチルメルカプタンを使用できていることがわかる。
フラスコ2および3には、E.coli K12ΔmetEのシスタチオニン-γ-シンターゼをコードする遺伝子の改変による、認められる改善された「メチオニン・シンターゼ」活性を有する株が含まれている。
次に、スクリーニング法を使用しあるいは多段階発酵でまたは上記のフラスコ内プロセスをやり直し改善することで、フラスコ2の細菌集団をメチルメルカプタン存在下での「メチオニン・シンターゼ」活性以上の改善に使用できる。
c)スクリーニングおよび多段階発酵による改善
E.coliをメチルメルカプタンに基づくメチオニン生産に至適化するため、選別を実施する。
E.coliをメチルメルカプタンに基づくメチオニン生産に至適化するため、選別を実施する。
この技術の実施により、メチルメルカプタン存在下で「メチオニン・シンターゼ」活性を改善したシスタチオニン-γ-シンターゼ(EC 4.2.99.9)を有するE.coli株の選別が可能となる。ここでは、例2で得られた株を使用することができる。
目的の選別は、連続的多段階システムで実施される(図3)。
最初の発酵槽で、最大生育速度に近い生育速度を有する細菌が生産される。細菌は、最初の発酵槽から、選択スクリーン(ここではメチルメルカプタン)の希釈率が低いことを特徴とする第二の発酵槽に連続的に送られる。
第二の発酵槽内で細菌に課せられる淘汰圧は、メチルメルカプタンの濃度によるものである。選別の連続サイクルにおいては、メチルメルカプタンの濃度を上昇させることにより、ますます強いスクリーニング条件を細菌に課すことができる。
各濃度に応じて、第二の発酵槽内で選別される細菌はメチルメルカプタン全量を代謝するまで進化する(発酵槽内にメチルメルカプタンは残らない)。
この場合、第二の発酵槽でのメチルメルカプタン濃度を最初の発酵槽より上げることによって、第二の発酵槽を生育発酵槽、最初の発酵槽を選別発酵槽として使用し選別を開始することになる。
急速にメチルメルカプタンを発酵させる株を得るためには、異なる選別サイクルが実施される。この株の分析から、シスタチオニン-γ-シンターゼをコードする遺伝子の突然変化が確認できる。
d) メチルメルカプタン・ナトリウム塩存在下で進化した株の選別
フラスコ2のE.coliΔ(metE)株をフラスコ内で連続的に再接種すると、K1a-F株が得られる。
フラスコ2のE.coliΔ(metE)株をフラスコ内で連続的に再接種すると、K1a-F株が得られる。
得られた新規株K1a-Fを、2.5g/Lの炭素13で均一に標識したグルコース、および炭素13で標識しないメチルメルカプタン・ナトリウム塩(200ppm)を含む最小培地で培養する(Schaefer他、1999年、Anal. Biochem. 270:88〜96頁)。メチルメルカプタン・ナトリウム塩が存在しない場合、この株はメチオニンに対し栄養要求性突然変異的である。
培養後、細胞を回収し、洗浄し、6N HClを用い107℃で24時間加水分解する。2D NMRによる解析を実施する(HSQC)。この解析により、メチオニンの5-炭素が溶液中に存在するグルコースから生産されたL-システイン由来のものである(従来の経路)か、メチルメルカプタン・ナトリウム塩由来のものであって本発明の新規代謝経路が使われているかがわかる。
(グルコースからメチオニンを生産する)野生株E.coli K12についても、メチルメルカプタン・ナトリウム塩不存在下で同様に実験をおこなう。
図6には、二つの異なる獲得物の1Dスペクトルを、わかりやすくするため重ねて示す。これらの1Dスペクトルは、HSQC(水素と炭素13との相関性)型の2D NMRスペクトルから抽出したものである。この2D NMRスペクトルは、細菌の酸加水分解物から得られるものである。
解析されたサンプルは全体が加水分解されたものである。しかし、NMRの感度およびデータ取得時間の関係から、基本的にアミノ酸、糖、塩基、およびグリセロールが検知され、各酸の各炭素原子が(水素原子とカップリングし)NMRシグナルを発生した。
メチオニンの5-炭素(すなわち末端メチル基の炭素)のケミカルシフトは約14.7ppmであった。図6には、二つの株の14.7ppmを中心とするケミカルシフトの分布を示した。
上側のスペクトルで5-炭素のシグナルが強く、5-炭素が炭素13で標識されていることがわかる。したがって、この5-炭素は、培養培地内に基質として導入された、標識されたグルコース由来のものである。
対照的に、下側のスペクトル(株K1a-F)では同じシグナルが非常に弱かった。これは、5-炭素が実質的に標識されていないことを示す。しかし、分子内の他の炭素は強く標識されていた(結果は示さない)。したがって、標識されていない5-炭素は、グルコース由来のものではなく、メチルメルカプタン由来のものである。
したがって、株K1a-Fは、サクシニル-L-ホモセリンとメチルメルカプタン・ナトリウム塩からメチオニンを生産すると結論づけることができる。
株K1a-Fは、フラスコ内でさらに14回連続的に再接種される。こうして、株K144(図9)が得られ、株K144は、唯一の炭素源としてグルコースを含む最小培地プレートに接種される。接種された皿は、メチルメルカプタン・ナトリウム塩水溶液を含む管が差し込まれた有気性ジャー内で有気性条件下に置かれる。次に、このジャーは37℃のインキュベーター内に置かれる。メチルメルカプタンの沸点が5℃であるため、ジャー内の雰囲気はメチルメルカプタン・リッチになる。4日後、皿内にクローンが出現し、これらは、メチルメルカプタンの存在下でメチオニンを生産できる細菌である。クローンK176を含め、10個のクローンを単離した。クローンK176は液体培地内で生育し、グリセロール株が生成されてK183と命名された。
クローンK183および当初株E.coli K12Δ(metE)について、遺伝子metJおよびmetB(SEQ ID No. 5)の配列が決定された。進化したmetBから得られ、metB*(SEQ ID No. 7)と名づけられた配列は、ポジション325にグルタメート((SEQ ID No. 6)の代わりにアラニン(SEQ ID No. 8)が存在する。遺伝子metJには突然変異が認められない。この株は、登録番号I-3005で2003年4月2日にCNCMに登録された。
・クローンK183の定性
クローンK183は、フラスコの中のグルコースおよびメチルメルカプタン・ナトリウム塩を唯一の炭素源として含む最小培地内で生育した。平行して、野生株E.coli K12についても同じ条件で培養がおこなわれた。生物量単位当たりのグルコース消費は、E.coli野生株(MBM01)の2倍であることがわかった。この過剰消費は一部にはアセテート生産のためと思われる。
クローンK183は、フラスコの中のグルコースおよびメチルメルカプタン・ナトリウム塩を唯一の炭素源として含む最小培地内で生育した。平行して、野生株E.coli K12についても同じ条件で培養がおこなわれた。生物量単位当たりのグルコース消費は、E.coli野生株(MBM01)の2倍であることがわかった。この過剰消費は一部にはアセテート生産のためと思われる。
これら二つの培養細胞の細胞内代謝産物および細胞外代謝産物の分析によって特に、
細胞内では、アラニン、ピルビン酸塩、ケトピルビン酸塩、および2-ケトイソカプロエートが増加し、トリプトファン、ノルバリン、ノルロイシン、ロイシン、およびメチオニンの濃度が低下し、
細胞外では、グルタミン酸塩、イソロイシン、トレオニン、バリン、および2-ケトイソカプロエートが蓄積され、ピルビン酸塩、ノルロイシン、およびトリプトファンが減少することがわかった。
細胞内では、アラニン、ピルビン酸塩、ケトピルビン酸塩、および2-ケトイソカプロエートが増加し、トリプトファン、ノルバリン、ノルロイシン、ロイシン、およびメチオニンの濃度が低下し、
細胞外では、グルタミン酸塩、イソロイシン、トレオニン、バリン、および2-ケトイソカプロエートが蓄積され、ピルビン酸塩、ノルロイシン、およびトリプトファンが減少することがわかった。
・メチルメルカプタン存在下での株MBM01およびK183の具体的「メチオニン・シンターゼ」活性の定性
野生株(MBM01)に対して株K183のメチオニン・シンターゼ活性が改善されていることを示すため、メチルメルカプタンの非存在下で富栄養培地(BH1、DIFCOから市販、2.5g/Lのグルコースを含む)上で実施された株K183およびMBM01の培養から得られた細胞と無関係の抽出物を用いて、酵素反応を実施した。タンパク質抽出物はPD10上で脱塩し、氷上で保存した。
野生株(MBM01)に対して株K183のメチオニン・シンターゼ活性が改善されていることを示すため、メチルメルカプタンの非存在下で富栄養培地(BH1、DIFCOから市販、2.5g/Lのグルコースを含む)上で実施された株K183およびMBM01の培養から得られた細胞と無関係の抽出物を用いて、酵素反応を実施した。タンパク質抽出物はPD10上で脱塩し、氷上で保存した。
反応条件とサンプルの処理
・メチルメルカプタン・ナトリウム塩溶液の10倍希釈物(3M溶液100μL+MilliQ水900μL)を氷上に用意する。
・500mM pH6.5のリン酸緩衝液20μL、2.5mMピリドキサルリン酸10μL、25mMのO-サクシニルホモセリン16μL、0.3Mメチルメルカプタン・ナトリウム塩10μL、MilliQ水24μLの混合物を氷上に用意する。
・各チューブを37℃にし(フード下のサーモミキサーで)、タンパク質抽出物(20μL)を加えて反応を開始させる。
・(0〜30分後に)反応を停止させるため、各チューブを氷上に置き、-20℃でアセトン400μLを加える。
・各チューブを-20℃で30分間保つ。
・各チューブをフード下で開けて(氷上で)10分間保ち、メチルメルカプタンおよびアセトンを蒸発させる。
・混合物を10,000gで5分間遠心分離し、上澄み液(〜100μL)をエッペンドルフ・チューブにデカントし、最終容積1mLまで希釈する。
・メチルメルカプタン・ナトリウム塩溶液の10倍希釈物(3M溶液100μL+MilliQ水900μL)を氷上に用意する。
・500mM pH6.5のリン酸緩衝液20μL、2.5mMピリドキサルリン酸10μL、25mMのO-サクシニルホモセリン16μL、0.3Mメチルメルカプタン・ナトリウム塩10μL、MilliQ水24μLの混合物を氷上に用意する。
・各チューブを37℃にし(フード下のサーモミキサーで)、タンパク質抽出物(20μL)を加えて反応を開始させる。
・(0〜30分後に)反応を停止させるため、各チューブを氷上に置き、-20℃でアセトン400μLを加える。
・各チューブを-20℃で30分間保つ。
・各チューブをフード下で開けて(氷上で)10分間保ち、メチルメルカプタンおよびアセトンを蒸発させる。
・混合物を10,000gで5分間遠心分離し、上澄み液(〜100μL)をエッペンドルフ・チューブにデカントし、最終容積1mLまで希釈する。
サクシニルホモセリンから放出されたコハク酸塩の量の検知によるメチオニン・シンターゼ活性の定量
・上記サンプルの10μLアリコートを、2mmのAG-11プリカラム、2mmのAS-11カラム、ASRSウルトラサプレッサー、および10μLの注入ループを備えたDionex DX-500を用いてイオンクロマトグラフィーで分析する。グラジエント法を採用し、0〜7分には0.5mMのKOH水溶液を流し、7分で注入し、7〜9.5分には0.5mMのKOH水溶液、9.5〜13分には0.5〜5mMのKOH水溶液、13〜25分には5〜38.3mMのKOH水溶液を流す。
・上記サンプルの10μLアリコートを、2mmのAG-11プリカラム、2mmのAS-11カラム、ASRSウルトラサプレッサー、および10μLの注入ループを備えたDionex DX-500を用いてイオンクロマトグラフィーで分析する。グラジエント法を採用し、0〜7分には0.5mMのKOH水溶液を流し、7分で注入し、7〜9.5分には0.5mMのKOH水溶液、9.5〜13分には0.5〜5mMのKOH水溶液、13〜25分には5〜38.3mMのKOH水溶液を流す。
メチルメルカプタン存在下で合成されたメチオニンの量の検知によるメチオニン・シンターゼ活性の定量
この分析はGC-MSでおこない、注入前にサンプルをシリル化することが必要である。このため、各サンプルには内部標準(セリン13C)を加え、シリル化の程度を確認できるようにする。その後、サンプルを一晩凍結乾燥する。
この分析はGC-MSでおこない、注入前にサンプルをシリル化することが必要である。このため、各サンプルには内部標準(セリン13C)を加え、シリル化の程度を確認できるようにする。その後、サンプルを一晩凍結乾燥する。
誘導は以下の手順でおこなわれる。
1mLの自動ピペットを使いヒドロキシアミン溶液(0.250g±0.002gをピリジン10mLに溶解)400μLを加え、チューブが密栓されていることを確認する。混合物を10秒づつ2回渦動させ、遠心分離(5000gで最大1分)でチューブの底に集め、30℃で1.5時間反応させる。チューブを開け、1mLの自動ピペットを使ってBSTFA溶液を1000μL加え、(200μLの自動ピペットを使って)ピリジン100μLを上に載せる。チューブを閉じ、10秒間渦動させ、TBDMS誘導体は60℃で60分間、BSTFA誘導体は70℃で30分間インキュベートする。必要な場合、サンプルを0.22μmのPTFEメンブラン使い捨てフィルターで濾過するか、5000gで5分間遠心分離する。サンプルを1.5mLフラスコに移し、栓をしてGCに注入する。
1mLの自動ピペットを使いヒドロキシアミン溶液(0.250g±0.002gをピリジン10mLに溶解)400μLを加え、チューブが密栓されていることを確認する。混合物を10秒づつ2回渦動させ、遠心分離(5000gで最大1分)でチューブの底に集め、30℃で1.5時間反応させる。チューブを開け、1mLの自動ピペットを使ってBSTFA溶液を1000μL加え、(200μLの自動ピペットを使って)ピリジン100μLを上に載せる。チューブを閉じ、10秒間渦動させ、TBDMS誘導体は60℃で60分間、BSTFA誘導体は70℃で30分間インキュベートする。必要な場合、サンプルを0.22μmのPTFEメンブラン使い捨てフィルターで濾過するか、5000gで5分間遠心分離する。サンプルを1.5mLフラスコに移し、栓をしてGCに注入する。
分析は、無極性カラム(HP-5MS、Bios Analytique社製)を備えたAgilent Technologies社製GC6890/MSD5973でおこなう。キャリアーガスはヘリウムで、流速は1mL/分である。1μLの注入は、パージが流速50mL/分で0.85分間のスプリットレスモードである。温度プロファイルは、最初90℃で2分間保ち、次に10℃/分の勾配で320℃まで上げる。320℃で6分間保つ。検知は、範囲m/zが40から550amuで、スキャンモードの電子衝撃イオン化マススペクトロメトリーである。溶剤の通過時間は3.10分に設定される。
これらの条件のもとで、メチルメルカプタンでインキュベートされたサンプルの「メチオニン・シンターゼ」活性のアッセイが、最初はコハク酸塩のイオンクロマトグラフィーでの定量により、二番目はメチオニンのGC-MSでの定量によりおこなわれる。
結果を下の表4に示す。
野生株に比べ進化した株で、メチルメルカプタン存在下でのメチオニン・シンターゼ活性が強化されていることは明らかで、突然変異したシスタチオニン-γ-シンターゼ(E325A)がメチオニン・シンターゼ活性を改変したことが確認される。
e)進化したメチオニン・シンターゼ活性を保持する酵素METB*の進化した遺伝子の単離と速度論的特性
METBおよびMETB*によって影響されるメチオニン・シンターゼ活性とシスタチオニン-γ-シンターゼ活性の速度論的パラメーターを決定するため、以下の手順で、遺伝子metBとmetB*を過剰発現ベクターpTopo(Invitrogene)内でクローン化した。
・オリゴヌクレオチドmetJ/metLRおよび耐熱性ポリメラーゼPwoを用いて、遺伝子metBまたはmetB*を増幅する。
・PCR産物をプラスミドpTopo 4-PCR平滑末端に連結し、こうして形成されたプラスミド、pTopo.metBまたはpTopo.metB*をDH5αに導入し、Aprクローンを選別する。
・抽出後に、プラスミドpTopo.metBまたはpTopo.metB*の立体配置を酵素的消化作用によって確認する。
・確認されたプラスミドpTopo.metBを株MG1655(ΔmetBJ、ΔmetE)に導入する。前記のように、導入されたプラスミドを酵素的消化作用によって確認する。metJ除去のためのオリゴヌクレオチドmetJR/metLRおよびmetE除去のためのオリゴヌクレオチドmetER/metEFを使う株MG1655(ΔmetBJ、ΔmetE)のPCRによって株MINS33を確認する。
METBおよびMETB*によって影響されるメチオニン・シンターゼ活性とシスタチオニン-γ-シンターゼ活性の速度論的パラメーターを決定するため、以下の手順で、遺伝子metBとmetB*を過剰発現ベクターpTopo(Invitrogene)内でクローン化した。
・オリゴヌクレオチドmetJ/metLRおよび耐熱性ポリメラーゼPwoを用いて、遺伝子metBまたはmetB*を増幅する。
・PCR産物をプラスミドpTopo 4-PCR平滑末端に連結し、こうして形成されたプラスミド、pTopo.metBまたはpTopo.metB*をDH5αに導入し、Aprクローンを選別する。
・抽出後に、プラスミドpTopo.metBまたはpTopo.metB*の立体配置を酵素的消化作用によって確認する。
・確認されたプラスミドpTopo.metBを株MG1655(ΔmetBJ、ΔmetE)に導入する。前記のように、導入されたプラスミドを酵素的消化作用によって確認する。metJ除去のためのオリゴヌクレオチドmetJR/metLRおよびmetE除去のためのオリゴヌクレオチドmetER/metEFを使う株MG1655(ΔmetBJ、ΔmetE)のPCRによって株MINS33を確認する。
次に富栄養培地上で培養し、タンパク質抽出物を分離する。それぞれ反応補基質としてメチルメルカプタン・ナトリウム塩およびシステインを用いて、メチオニン・シンターゼの酵素活性とシスタチオニン-γ-シンターゼの酵素活性を決定する。
メチオニン・シンターゼ活性の速度論的特性を表5に示す。シスタチオニン-γ-シンターゼ活性の速度論的特性は表6に示す。
突然変異A325Eの影響で、メチルメルカプタンに対する酵素のKmは1/45に低下しているが、Vmaxは半減しているだけである。
(表6)酵素METBおよびMETB*のシスタチオニン-γ-シンターゼ活性の見掛けの速度論的特性
突然変異A325Eの影響で、シスタチオニン-γ-シンターゼ活性およびシステインに対する酵素のKmは1/13に低下している。
突然変異A325Eの影響で、シスタチオニン-γ-シンターゼ活性およびシステインに対する酵素のKmは1/13に低下している。
例F.I.2.:シスタチオニン-γ-シンターゼ活性からホモシステイン・シンターゼ活性への進化
・株MG1655(ΔmetC::Cm)およびMG1655(ΔmetC)の構築
遺伝子metCを不活性化するため、DatsenkoおよびWanner(2000年)が記述した、相同的組換え法を使用した。この方法により、クロラムフェニコール抵抗性カセットの挿入が可能になるが、当該遺伝子はほとんど除去される。
・株MG1655(ΔmetC::Cm)およびMG1655(ΔmetC)の構築
遺伝子metCを不活性化するため、DatsenkoおよびWanner(2000年)が記述した、相同的組換え法を使用した。この方法により、クロラムフェニコール抵抗性カセットの挿入が可能になるが、当該遺伝子はほとんど除去される。
構築のために二つのオリゴヌクレオチドを使用した。
metC用に:
・100塩基を有するDmetCR(SEQ ID No. 13)
ccggcgtccagatcggcaatcagatcgtcgacatcttccagaccaatatgcaggcgaatcaaggtcccgctaaaatcgatCATATGAATATCCTCCTTAG
小文字の領域は遺伝子metCの配列(3151419から3151359)(配列3150251から3151438、ウェブサイト上の参照配列はhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/)と相同で、
大文字の領域はプラスミドpKD3のクロラムフェニコール抵抗性カセット増幅用(Datsenko K.A.;Wanner B.L(2000年)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640〜6645頁の配列を参照されたい)である。
・100塩基を有するDmetCF(SEQ ID No. 14)
cggacaaaaagcttgatactcaactggtgaatgcaggacgcagcaaaaaatacactctcggcgcggtaaatagcgtgattTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
小文字の領域は遺伝子metCの配列(配列3150255から3150334)と相同で、
大文字の領域はプラスミドpKD3のクロラムフェニコール抵抗性カセット増幅用である。
metC用に:
・100塩基を有するDmetCR(SEQ ID No. 13)
ccggcgtccagatcggcaatcagatcgtcgacatcttccagaccaatatgcaggcgaatcaaggtcccgctaaaatcgatCATATGAATATCCTCCTTAG
小文字の領域は遺伝子metCの配列(3151419から3151359)(配列3150251から3151438、ウェブサイト上の参照配列はhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/)と相同で、
大文字の領域はプラスミドpKD3のクロラムフェニコール抵抗性カセット増幅用(Datsenko K.A.;Wanner B.L(2000年)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640〜6645頁の配列を参照されたい)である。
・100塩基を有するDmetCF(SEQ ID No. 14)
cggacaaaaagcttgatactcaactggtgaatgcaggacgcagcaaaaaatacactctcggcgcggtaaatagcgtgattTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
小文字の領域は遺伝子metCの配列(配列3150255から3150334)と相同で、
大文字の領域はプラスミドpKD3のクロラムフェニコール抵抗性カセット増幅用である。
オリゴヌクレオチドDmetCRおよびDmetCFは、プラスミドpKD3からのクロラムフェニコール抵抗性カセットを増幅するのに使用される。得られたPCR産物は次にエレクトロポレーションによって、酵素Redリコンビナーゼが発現し相同的組換えを可能にしている株MG1655(pKD46)に導入される。クロラムフェニコール抵抗性形質転換細胞は選別されて、抵抗性カセットの挿入が前記定義のオリゴヌクレオチドmetCRおよびmetCFのPCR分析によって確認される。得られた株はMG1655(ΔmetC::Cm)と命名された。
metCR(SEQ ID No. 11)cgtccgggacgccttgatcccggacgcaac(3151522から3151493までの配列に相同)
metCF(SEQ ID No. 12)gcgtttacgcagtaaaaaagtcaccagcacgc(3150118から3150149までの配列に相同)
metCR(SEQ ID No. 11)cgtccgggacgccttgatcccggacgcaac(3151522から3151493までの配列に相同)
metCF(SEQ ID No. 12)gcgtttacgcagtaaaaaagtcaccagcacgc(3150118から3150149までの配列に相同)
次にクロラムフェニコール抵抗性カセットを除去することができる。クロラムフェニコール抵抗性カセットのFRT位で機能するFLPリコンビナーゼを保持するプラスミドpCP20がエレクトロポレーションによって組換え株に導入される。42℃での一連の培養終了後に、クロラムフェニコール抵抗性カセットが除かれたことが、上記で使用したのと同じオリゴヌクレオチドのPCR分析によって確認される。保持された株はMG1655(ΔmetC)と命名された。
株Δ(metC)の構築を例F.I.2.に記載する。本発明の具体的な実施形態において、株E.coliΔ(metC)は、唯一の炭素源としてのグルコースを有する無機培地を含むフラスコ内で培養される(例F.I.1.を参照されたい)。培地には、メチルメルカプタンもH2Sも含まれていない。再接種が実施されて、各再接種について生育速度が決定される。無機培地上で、株Δ(metC)の生育速度に明らかな改善がみられ、内因性H2Sの存在下でのシスタチオニン-γ-シンターゼのホモシステイン・シンターゼ活性が強力に改善されたことを示唆している(図10参照)。
例F.I.3.:アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ活性からメチオニン・シンターゼ活性への進化
株MG1655(ΔmetB-ΔmetJ)の構築
遺伝子metBおよびmetJを除去し、オペロンmetBLのプロモーターを保存するため、クロラムフェニコール抵抗性カセットを挿入すると同時に当該遺伝子の大部分を除去し、metBLのプロモーターを保持した。この目的のために、我々は二つのオリゴヌクレオチドを使用した。
metBJ用:
・30塩基を有するMetJR(SEQ ID No. 9)
ggtacagaaaccagcaggctgaggatcagc
遺伝子metJ(配列4125975から4125581、ウェブサイト上の参照配列はhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/)の下流配列(4125431から4125460)と相同である。
・100塩基を有するDmetJBF(SEQ ID No. 10)
tatgcagctgacgacctttcgcccctgcctgcgcaatcacactcatttttaccccttgtttgcagcccggaagccattttcaggcaccagagtaaacatt
大文字の部分は遺伝子metJとmetB(配列4126252から4127412)の間の配列(4126217から4126197)と相同でオペロンmetBLFのプロモーター領域を含み、
小文字の部分は遺伝子metLの開始部(配列4127415から4129847)および遺伝子metBの終結部に相当する配列(4127460から4127380)に相同である。
株MG1655(ΔmetB-ΔmetJ)の構築
遺伝子metBおよびmetJを除去し、オペロンmetBLのプロモーターを保存するため、クロラムフェニコール抵抗性カセットを挿入すると同時に当該遺伝子の大部分を除去し、metBLのプロモーターを保持した。この目的のために、我々は二つのオリゴヌクレオチドを使用した。
metBJ用:
・30塩基を有するMetJR(SEQ ID No. 9)
ggtacagaaaccagcaggctgaggatcagc
遺伝子metJ(配列4125975から4125581、ウェブサイト上の参照配列はhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/)の下流配列(4125431から4125460)と相同である。
・100塩基を有するDmetJBF(SEQ ID No. 10)
tatgcagctgacgacctttcgcccctgcctgcgcaatcacactcatttttaccccttgtttgcagcccggaagccattttcaggcaccagagtaaacatt
大文字の部分は遺伝子metJとmetB(配列4126252から4127412)の間の配列(4126217から4126197)と相同でオペロンmetBLFのプロモーター領域を含み、
小文字の部分は遺伝子metLの開始部(配列4127415から4129847)および遺伝子metBの終結部に相当する配列(4127460から4127380)に相同である。
これら二つのオリゴヌクレオチドは、MG1655Δ(metJ::Cm)の染色体DNA上の当該領域の増幅に使用された。図11を参照のこと。
得られたPCR産物は次にエレクトロポレーションによって、酵素Redリコンビナーゼが発現し相同的組換えを可能にしている株MG1655(pKD46)に導入される。クロラムフェニコール抵抗性形質転換細胞は選別されて、遺伝子metBの相同的組換えによる除去が前記定義のオリゴヌクレオチドMetJRおよびMetLRのPCR分析によって確認される。
所望の株は、遺伝子metBおよびmetJが除去され、オペロンmetBLFがmetLの前に再配置された株MG1655(ΔmetB-ΔmetJ::Cm)である(図12参照)。
次にクロラムフェニコール抵抗性カセットを除去することができる。クロラムフェニコール抵抗性カセットのFRT位で機能するFLPリコンビナーゼを保持するプラスミドpCP20がエレクトロポレーションによって組換え株に導入される。42℃での一連の培養終了後に、クロラムフェニコール抵抗性カセットが除かれたことが、上記で使用したのと同じオリゴヌクレオチド(MetLRおよびMetJR)のPCR分析によって確認される。
株MG1655Δ(metC::Cm、metJB)およびMG1655Δ(metC、metJB)の構築
株MG1655(ΔmetB-ΔmetJ)の遺伝子metC(配列3150251から3151438、ウェブサイト上の参照配列はhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/)を除去するため、ファージP1形質導入法を使用した。株MG1655Δ(metC::Cm)上のファージ・ライゼート調製と株MG1655Δ(metB-ΔmetJ)への形質導入の二段階からなる以下の手順を実施した。
株Δ(metC::Cm)の構築を例F.I.2.に記載する。
ファージ・ライゼートP1の調製
・株MG1655(ΔmetC::Cm)100μLを、LB10mL+Cm30μg/mL+グルコース0.2%+5mM CaCl2に接種し一晩培養する。
・振とうしながら37℃で30分間インキュベートする。
・野生株MG1655(約1.109ファージ/mL)上で調製したファージ・ライゼートP1を100μL加える。
・37℃で3時間振とうして細胞をすべて溶解させる。
・クロロフォルムを200μL加えて渦流させる。
・4500gで10分間遠心分離して細胞破砕物を除去する。
・上澄みを無菌チューブに移し、クロロフォルムを200μL加える。
・ライゼートを4℃で保存する。
形質導入
・LB培地内で一晩培養した株MG1655(ΔmetB-ΔmetJ)5mLを1500gで10分間遠心分離する。
・細胞沈殿物を10mMのMgSO4 2.5mL、5mMのCaCl2に懸濁させる。
・対照チューブ:細胞100μL
株MG1655(ΔmetC::Cm)のファージP1を100μL
・試験チューブ:細胞100μL+株MG1655(ΔmetC::Cm)のファージP1を100μL
・振とうなしで30℃で30分間インキュベートする。
・各チューブに1Mクエン酸ナトリウムを100μL加える。
・LB1mLを加える。
・振とうしながら37℃で1時間インキュベートする。
・チューブを7000rpmで3分間遠心分離した後、LB+Cm30μg/mL入りの皿に広げる。
・37℃で一晩インキュベートする。
株MG1655(ΔmetB-ΔmetJ)の遺伝子metC(配列3150251から3151438、ウェブサイト上の参照配列はhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/)を除去するため、ファージP1形質導入法を使用した。株MG1655Δ(metC::Cm)上のファージ・ライゼート調製と株MG1655Δ(metB-ΔmetJ)への形質導入の二段階からなる以下の手順を実施した。
株Δ(metC::Cm)の構築を例F.I.2.に記載する。
ファージ・ライゼートP1の調製
・株MG1655(ΔmetC::Cm)100μLを、LB10mL+Cm30μg/mL+グルコース0.2%+5mM CaCl2に接種し一晩培養する。
・振とうしながら37℃で30分間インキュベートする。
・野生株MG1655(約1.109ファージ/mL)上で調製したファージ・ライゼートP1を100μL加える。
・37℃で3時間振とうして細胞をすべて溶解させる。
・クロロフォルムを200μL加えて渦流させる。
・4500gで10分間遠心分離して細胞破砕物を除去する。
・上澄みを無菌チューブに移し、クロロフォルムを200μL加える。
・ライゼートを4℃で保存する。
形質導入
・LB培地内で一晩培養した株MG1655(ΔmetB-ΔmetJ)5mLを1500gで10分間遠心分離する。
・細胞沈殿物を10mMのMgSO4 2.5mL、5mMのCaCl2に懸濁させる。
・対照チューブ:細胞100μL
株MG1655(ΔmetC::Cm)のファージP1を100μL
・試験チューブ:細胞100μL+株MG1655(ΔmetC::Cm)のファージP1を100μL
・振とうなしで30℃で30分間インキュベートする。
・各チューブに1Mクエン酸ナトリウムを100μL加える。
・LB1mLを加える。
・振とうしながら37℃で1時間インキュベートする。
・チューブを7000rpmで3分間遠心分離した後、LB+Cm30μg/mL入りの皿に広げる。
・37℃で一晩インキュベートする。
株の確認
次に、クロラムフェニコール形質転換細胞は選別されて、(metC::Cm)を含む領域の挿入がオリゴヌクレオチドMetCRおよびMetCFのPCR分析で、遺伝子metBおよびmetJを含む株がオリゴヌクレオチドMetJRおよびMetLRのPCR分析で確認される。得られた株はMG1655Δ(metC::Cm、metJB)と命名された。
MetCR(SEQ ID No. 11):cgtccgggacgccttgatcccggacgcaac(配列3151522から3151493に相同)
MetCF(SEQ ID No. 12):gcgtttacgcagtaaaaaagtcaccagcacgc(配列3150118から3150149に相同)
次に、クロラムフェニコール形質転換細胞は選別されて、(metC::Cm)を含む領域の挿入がオリゴヌクレオチドMetCRおよびMetCFのPCR分析で、遺伝子metBおよびmetJを含む株がオリゴヌクレオチドMetJRおよびMetLRのPCR分析で確認される。得られた株はMG1655Δ(metC::Cm、metJB)と命名された。
MetCR(SEQ ID No. 11):cgtccgggacgccttgatcccggacgcaac(配列3151522から3151493に相同)
MetCF(SEQ ID No. 12):gcgtttacgcagtaaaaaagtcaccagcacgc(配列3150118から3150149に相同)
上記と同様に、次にクロラムフェニコール抵抗性カセットを除去することができる。クロラムフェニコール抵抗性カセットのFRT位で機能するFLPリコンビナーゼを保持するプラスミドpCP20がエレクトロポレーションによって組換え株に導入される。42℃での一連の培養終了後に、クロラムフェニコール抵抗性カセットが除かれたことが、上記で使用したのと同じオリゴヌクレオチド(MetCRおよびMetCF、ならびにMetJRおよびMetLR)のPCR分析によって確認される。保持された株はMG1655Δ(metC、metJB)と命名された。
プラスミドpTrc99A-metYの導入と株の進化
特定の実施形態において、C.glutamicumの遺伝子metYの発現を可能にするプラスミドが構築される。この遺伝子は、C.glutamicumの染色体DNAからPCRで増幅され、プラスミドpTrc99Aに導入される。遺伝子metYおよび必要な場合にはその天然プロモーターもPCRで増幅することが可能である。好ましい実施形態において、遺伝子metYは、E.coliの発現を可能にするプロモーターの制御下でクローン化される。使用されるベクターはpTrc99A(Pharmacia社製)であるが、pUC、pBluescript、pCR-Script、pTopo等から選択されるベクターも使用できる。
特定の実施形態において、C.glutamicumの遺伝子metYの発現を可能にするプラスミドが構築される。この遺伝子は、C.glutamicumの染色体DNAからPCRで増幅され、プラスミドpTrc99Aに導入される。遺伝子metYおよび必要な場合にはその天然プロモーターもPCRで増幅することが可能である。好ましい実施形態において、遺伝子metYは、E.coliの発現を可能にするプロモーターの制御下でクローン化される。使用されるベクターはpTrc99A(Pharmacia社製)であるが、pUC、pBluescript、pCR-Script、pTopo等から選択されるベクターも使用できる。
以前得られたE.coliΔ(metC、metJB)は、C.glutamicumのプラスミドpTrc-metYによって形質転換される。この株の形質転換はエレクトロポレーションによっておこなわれる。
得られた株は次に、唯一の炭素源としてグルコースを有する無機培地をその容積の10%含む円錐形フラスコ(OD600nmは約0.4〜0.5)に接種される。当初から酵素MetYの保持するサクシニルホモセリン・スルフヒドリラーゼ活性が低く、合成されるメチオニンが制限されるために、最小培地(MML8)上の細菌株の生育は制限される(μは時間当たり約0.06)。フラスコ内のOD600nmが約2に達すると、再接種を実施する。したがって、22培養サイクルにわたり選別がおこなわれる。この進化-選別の間に、生育速度の明らかな改善が認められる(図13)。以前の経験から、生育に認められた改善は、O-アセチル-ホモセリン活性がO-サクシニル-ホモセリン活性に変化し、いずれも細菌によって生産される基質であるO-サクシニルホモセリンおよびH2Sからのホモシステイン生産が可能になるように、遺伝子metYが進化していることに対応する可能性があった。
metYの進化過程を至適化するためには、E.coliの他の突然変異体、特に突然変異体Δ(metC、metB)を使用しても同様な取り組みが可能である。
例F.I.4.:メチオニン生産および精製のための流加培養法
事前培養
事前培養は、グルコース2.5g/Lを追加したタイプM9改造型最小培地50mLを含む500mLフラスコ内で一晩行った。細胞は、遠心分離で回収し、タイプM9改造型最小培地5mLに取り込んだ。
事前培養
事前培養は、グルコース2.5g/Lを追加したタイプM9改造型最小培地50mLを含む500mLフラスコ内で一晩行った。細胞は、遠心分離で回収し、タイプM9改造型最小培地5mLに取り込んだ。
発酵槽内での培養
培養は、使用可能容積300mLの流加培養用DASGIP型発酵槽でおこなった。
培養は、使用可能容積300mLの流加培養用DASGIP型発酵槽でおこなった。
発酵槽には、タイプM9改造型最小培地145mLを入れ、事前培養品5mL、すなわちOD600nmが0.5から1.2の接種品を接種した。
培養温度は30〜37℃に保ち、pHは6.5〜8に連続的に調整した。部分的には、メチルメルカプタン・ナトリウム塩溶液を加えることによって制御した。必要な場合には、2N水酸化ナトリウム溶液を使って制御を完全なものにした。バッチ段階では振とうを200〜400rpmに保ち、流加培養プロセスの最後には1000rpmに上げた。気体制御機を使用して、溶存酸素量を飽和量の30〜40%に保った。OD600nmが2.5〜3になるとすぐに、最初の流速0.3〜0.5mL/時間で流加培地を加えて流加培養プロセスを開始し、流速は徐々に2.5〜3.5mL/時間まで上げた。その後、24〜32時間は流速を一定に保った。流加培地は、タイプM9改造型培地を基礎にし、濃度が300〜500g/Lのグルコースを追加して構成されている。同時に、細菌の生育を可能にするとともにpHを制御するため、メチルメルカプタン・ナトリウム塩溶液(1〜5Mの溶液)を培地に加えた。細胞濃度が20〜50g/Lに達するとすぐに流加培地をリン分の少ないタイプM9の最小培地に変えた。メチルメルカプタン溶液は、メチルメルカプタンの気相での発酵槽直接注入に変えた。気体流速は、流加溶液の流速に適合させ、炭素基質のモル比が1から3になるようにした。細胞濃度が50〜80g/Lに達するとすぐに発酵を停止した。液状でなければならない発酵液のpHは、NaOH溶液で7.5〜9に調整し、60〜80℃に加熱した。次に発酵液をUFモジュールで濾過した。発酵液の温度は60〜80℃に保ち、発酵液を濃縮してから(カラムでまたはバッチ毎に)活性炭を通して脱色した。脱色された発酵液を、再度濾過して残存粒子を除去してから、濃塩酸でpH2.28(メチオニンのpK1)未満まで酸性化した。こうして形成されたメチオニン塩酸塩の結晶は、濾過により回収され、塩酸を蒸発させて除き、純粋なL-メチオニンが得られた。
生物学的材料の登録
株K183は登録番号I-3005で2003年4月2日にブダペスト条約に基づいた国立培養物および微生物コレクション(CNCM)(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, フランス)に登録済みである。
株K183は登録番号I-3005で2003年4月2日にブダペスト条約に基づいた国立培養物および微生物コレクション(CNCM)(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, フランス)に登録済みである。
F.II. システインの生合成経路の進化
本発明のシステインの生合成経路代謝工学への一つの応用(例F.II.1.)には、以下のステップが含まれる。
a)当初のE.coli株内の遺伝子cysK、cysMを除去する;したがって、得られる改変された株はシステインに対し栄養要求性突然変異的である。当初の株は、メチオニンを含まず、S-アデノシルメチオニン、ホモシステイン、シスタチオニン、またはシステインを含む最小培地(MM)で生育可能だが、改変された株は生育できない。
a1)C.glutamicumからの外因性遺伝子である、遺伝子metYを導入する。この遺伝子は、アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ活性をシステイン・シンターゼ活性に進化させるためのものである。
b)MetYをシステイン・シンターゼ活性に進化させて最初に除去された酵素活性(CysK、CysM)を補償するために、改変された株E.coli [metYΔ(cysK、cysM)]を補基質を含まない同じ最小培地(MM)上で培養する。
c)内因性H2S存在下で新規システイン・シンターゼ活性を有する進化した株を選別する;新規合成経路を確認する。
本発明のシステインの生合成経路代謝工学への一つの応用(例F.II.1.)には、以下のステップが含まれる。
a)当初のE.coli株内の遺伝子cysK、cysMを除去する;したがって、得られる改変された株はシステインに対し栄養要求性突然変異的である。当初の株は、メチオニンを含まず、S-アデノシルメチオニン、ホモシステイン、シスタチオニン、またはシステインを含む最小培地(MM)で生育可能だが、改変された株は生育できない。
a1)C.glutamicumからの外因性遺伝子である、遺伝子metYを導入する。この遺伝子は、アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ活性をシステイン・シンターゼ活性に進化させるためのものである。
b)MetYをシステイン・シンターゼ活性に進化させて最初に除去された酵素活性(CysK、CysM)を補償するために、改変された株E.coli [metYΔ(cysK、cysM)]を補基質を含まない同じ最小培地(MM)上で培養する。
c)内因性H2S存在下で新規システイン・シンターゼ活性を有する進化した株を選別する;新規合成経路を確認する。
例F.II.1.:アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ活性のシステイン・シンターゼ活性への進化
a)株E.coliΔ(cysK、cysM)の構築
抗生物質(それぞれ、クロラムフェニコールおよびカナマイシン)抵抗性カセットの挿入により、遺伝子cysKおよびcysMの不活性化が実行されると同時に、当該遺伝子のほとんどは除去される。使用する方法は、Datsenko K.A.;Wanner B.L(2000年)、PCR産物を用いるEscherichia coliK-12における染色体遺伝子のワンステップ不活性化、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640〜6645頁に記載されている。各構築のために、一対のオリゴヌクレオチドが合成された。
cysK用:
・100塩基を有するDcysKR(SEQ ID No. 15)
TgttgcaattctttctcagtgaagagatcggcaaacaatgcggtgcttaaataacgctcacccgatgatggtagaataacCATATGAATATCCTCCTTAG
小文字の領域は遺伝子cysK(ウェブサイト上の参照配列はhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/)の配列(2531396から2531317)と相同で、
大文字の領域はクロラムフェニコール抵抗性カセット増幅用(配列は、Datsenko K.A.;Wanner B.L(2000年)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640〜6645頁を参照)である。
・100塩基を有するDcysKF(SEQ ID No. 16)
agtaagatttttgaagataactcgctgactatcggtcacacgccgctggttcgcctgaatcgcatcggtaacggacgcatTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
小文字の領域は遺伝子cysKの配列(2530432から2530511)と相同で、
大文字の領域はクロラムフェニコール抵抗性カセット増幅用である。
cysM用:
・100塩基を有するDcysMR(SEQ ID No. 17)
cccgccccctggctaaaatgctcttccccaaacaccccggtagaaaggtagcgatcgccacgatcgcagatgatcgccacCATATGAATATCCTCCTTAG
小文字の領域は遺伝子cysM(ウェブサイト上の参照配列はhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/)の配列(2536699から2536778)と相同で、
大文字の領域はカナマイシン抵抗性カセット増幅用である。
・100塩基を有するDcysMF(SEQ ID No. 18)
AgtacattagaacaaacaataggcaatacgcctctggtgaagttgcagcgaatggggccggataacggcagtgaagtgtgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
小文字の領域は遺伝子cysMの配列(2537600から2537521)と相同で、
大文字の領域はカナマイシン抵抗性カセット増幅用である。
a)株E.coliΔ(cysK、cysM)の構築
抗生物質(それぞれ、クロラムフェニコールおよびカナマイシン)抵抗性カセットの挿入により、遺伝子cysKおよびcysMの不活性化が実行されると同時に、当該遺伝子のほとんどは除去される。使用する方法は、Datsenko K.A.;Wanner B.L(2000年)、PCR産物を用いるEscherichia coliK-12における染色体遺伝子のワンステップ不活性化、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640〜6645頁に記載されている。各構築のために、一対のオリゴヌクレオチドが合成された。
cysK用:
・100塩基を有するDcysKR(SEQ ID No. 15)
TgttgcaattctttctcagtgaagagatcggcaaacaatgcggtgcttaaataacgctcacccgatgatggtagaataacCATATGAATATCCTCCTTAG
小文字の領域は遺伝子cysK(ウェブサイト上の参照配列はhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/)の配列(2531396から2531317)と相同で、
大文字の領域はクロラムフェニコール抵抗性カセット増幅用(配列は、Datsenko K.A.;Wanner B.L(2000年)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640〜6645頁を参照)である。
・100塩基を有するDcysKF(SEQ ID No. 16)
agtaagatttttgaagataactcgctgactatcggtcacacgccgctggttcgcctgaatcgcatcggtaacggacgcatTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
小文字の領域は遺伝子cysKの配列(2530432から2530511)と相同で、
大文字の領域はクロラムフェニコール抵抗性カセット増幅用である。
cysM用:
・100塩基を有するDcysMR(SEQ ID No. 17)
cccgccccctggctaaaatgctcttccccaaacaccccggtagaaaggtagcgatcgccacgatcgcagatgatcgccacCATATGAATATCCTCCTTAG
小文字の領域は遺伝子cysM(ウェブサイト上の参照配列はhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/)の配列(2536699から2536778)と相同で、
大文字の領域はカナマイシン抵抗性カセット増幅用である。
・100塩基を有するDcysMF(SEQ ID No. 18)
AgtacattagaacaaacaataggcaatacgcctctggtgaagttgcagcgaatggggccggataacggcagtgaagtgtgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
小文字の領域は遺伝子cysMの配列(2537600から2537521)と相同で、
大文字の領域はカナマイシン抵抗性カセット増幅用である。
オリゴヌクレオチドDcysKRおよびDcysKF、ならびにDcysMRおよびDcysMFは、それそれプラスミドpKD3およびpKD4からのクロラムフェニコール抵抗性カセットおよびカナマイシン抵抗性カセットの増幅に使用される。得られたPCR産物は次にエレクトロポレーションによって、酵素Redリコンビナーゼが発現し相同的組換えを可能にしている株MG1655(pKD46)に導入される。各抗生物質に抵抗性の形質転換細胞は選別されて、各抵抗性カセットの挿入がオリゴヌクレオチドcysKRおよびcysKF、ならびcysMRおよびcysMFのPCR分析によって確認される。
cysKR(SEQ ID No. 19):tttttaacagacgcgacgcacgaagagcgc(配列2531698から2531669までに相同)
cysKF(SEQ ID No. 20):ggcgcgacggcgatgtgggtcgattgctat(配列2530188から2530217までに相同)
cysMR(SEQ ID No. 21):ggggtgacggtcaggactcaccaatacttc(配列2536430から2536459までに相同)
cysMF(SEQ ID No. 22):gcgcgcatcgctggccgctgggctacacac(配列2538071から2538042までに相同)
cysKR(SEQ ID No. 19):tttttaacagacgcgacgcacgaagagcgc(配列2531698から2531669までに相同)
cysKF(SEQ ID No. 20):ggcgcgacggcgatgtgggtcgattgctat(配列2530188から2530217までに相同)
cysMR(SEQ ID No. 21):ggggtgacggtcaggactcaccaatacttc(配列2536430から2536459までに相同)
cysMF(SEQ ID No. 22):gcgcgcatcgctggccgctgggctacacac(配列2538071から2538042までに相同)
次にクロラムフェニコールおよびカナマイシン抵抗性カセットを除去することができる。クロラムフェニコールおよびカナマイシン抵抗性カセットのFRT位で機能するFLPリコンビナーゼを保持するプラスミドpCP20がエレクトロポレーションによって組換え株に導入される。42℃での一連の培養終了後に、抗生物質抵抗性カセットが除かれたことが、上記で使用したのと同じオリゴヌクレオチドのPCR分析によって確認される。
a1)従来株への遺伝子metYの導入
プラスミドpTopometYは、ベクターZero Blunt TOPO PCRクローニングキット(PCR4 TOPOベクター、Invitrogen社製)内の遺伝子metYの挿入によって構築される。この目的のために、遺伝子metYは、下記のオリゴヌクレオチドを使用し、株C.glutamicum ATCC13032の染色体DNAからのポリメラーゼPwoを用いるPCRによって増幅される。
MetYR(SEQ ID No. 23)
TRC型のプロモーター(pTRC-O)は太字のローマン体、遺伝子metYのRBSは太字のローマン体で下線付き、遺伝子metYの開始コドンは太字のイタリック体である。
MetYF(SEQ ID No. 24)
gctctgtctagtctagtttgcattctcacg
転写ターミネイターmetYの下流から選択された配列
プラスミドpTopometYは、ベクターZero Blunt TOPO PCRクローニングキット(PCR4 TOPOベクター、Invitrogen社製)内の遺伝子metYの挿入によって構築される。この目的のために、遺伝子metYは、下記のオリゴヌクレオチドを使用し、株C.glutamicum ATCC13032の染色体DNAからのポリメラーゼPwoを用いるPCRによって増幅される。
MetYR(SEQ ID No. 23)
TRC型のプロモーター(pTRC-O)は太字のローマン体、遺伝子metYのRBSは太字のローマン体で下線付き、遺伝子metYの開始コドンは太字のイタリック体である。
MetYF(SEQ ID No. 24)
gctctgtctagtctagtttgcattctcacg
転写ターミネイターmetYの下流から選択された配列
得られたPCR産物は、ベクターTopo内で直接クローン化され、プラスミドpTopometYになる。ベクターTopoは、E.coliの複製起点、すなわちアンピシリン抵抗性遺伝子およびカナマイシン抵抗性遺伝子を保持する。
次に、プラスミドpTopometYは、構造確認のために、株DH5αに導入される。万能オリゴヌクレオチドM13リバースおよびM13フォワードでプラスミドpTopometYの遺伝子metYの配列決定を実施し、構造を確認する。
プラスミドは、エレクトロポレーションによって、株E.coliΔ(cysK、cysM)に導入される。
c)アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ活性をコードする遺伝子metYをシステイン・シンターゼ活性に進化させるための改変された株の培養
遺伝子metYを含む従来型株の制御された選別は、瓶内または円錐形フラスコ内でおこなうことができる。この方法の実施により、酵素アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼが「システイン・シンターゼ」活性に進化したE.coli株の選別が可能になる。制御された選別は、グルコース33mM、クロラムフェニコール最終濃度25mg/L、およびカナマイシン濃度25mg/Lの存在下で、無機培地50mLを含む円錐形フラスコ内で実施される(Schaefer他、1999年、Anal.Biochem. 270:88〜96頁)。
遺伝子metYを含む従来型株の制御された選別は、瓶内または円錐形フラスコ内でおこなうことができる。この方法の実施により、酵素アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼが「システイン・シンターゼ」活性に進化したE.coli株の選別が可能になる。制御された選別は、グルコース33mM、クロラムフェニコール最終濃度25mg/L、およびカナマイシン濃度25mg/Lの存在下で、無機培地50mLを含む円錐形フラスコ内で実施される(Schaefer他、1999年、Anal.Biochem. 270:88〜96頁)。
培養培地には、規定OD600nm値で株E.coli K12[Δ(cysK、cysM)pTopometY]が接種される。いくつかの細菌はO-アセチルセリンの同化を可能にする遺伝子metY内の関係する突然変異を保持している可能性があるため、接種は十分大きな細菌株に対しておこなわれる。この株は、システインに対して栄養要求性突然変異的な株をシステインを付加した最小培地上で生育させることにより得られる。対照培養には、株E.coli K12(ΔcysK、cysM)が接種される。
培養は37℃で振とうしながら6日間おこなわれ、終了時にOD600nmが測定される。対照培養では実質的にODが変化しないのに対し、いくつかの他の培養ではODの大きな進展が示される。したがって、これらの円錐形フラスコに含まれる株内では「進化したシステイン・シンターゼ活性」が出現していると考えられる。遺伝子metYがこれらの株と対照株との違いであるため、遺伝子metY内に一つまたは複数の突然変異が生じていると考えられる。
これらの陽性培養体の細菌集団は、前記のようにフラスコ培養を繰り返すことによって、システイン・シンターゼ活性をさらに改善することができる。
c)クローンの選別
次に、進化した株は、唯一の炭素源としてグルコースを含むゲロセ最小培地上に展開される。接種された皿は、有気性条件の37℃のインキュベーター内に置かれる。36時間後に、クローンが皿上に出現し、これらは唯一の炭素源としてグルコースからシステインを生産できる細菌に該当する。3種類のクローンが単離されている。
次に、進化した株は、唯一の炭素源としてグルコースを含むゲロセ最小培地上に展開される。接種された皿は、有気性条件の37℃のインキュベーター内に置かれる。36時間後に、クローンが皿上に出現し、これらは唯一の炭素源としてグルコースからシステインを生産できる細菌に該当する。3種類のクローンが単離されている。
合成経路の制御
進化したE.coli K12[Δ(cysK、cysM)pTopometY]の株は、炭素13で均一に標識したグルコース2.5g/Lを含む最小培地内で培養される(Schaefer他、1999年、Anal.Biochem. 270:88〜96頁)。培養後、細胞は回収されて、洗浄され、6N HClを用い107℃で24時間加水分解される。次に、2D NMR分析がおこなわれる(HSQC)。この分析により、グルコースの炭素13の末路を決めることができ、それによって、システインの合成がセリンとアセチルセリンを経由しておこなわれることが確認され、遺伝子metYによりコードされる酵素がシステイン・シンターゼに進化していることが示される。
進化したE.coli K12[Δ(cysK、cysM)pTopometY]の株は、炭素13で均一に標識したグルコース2.5g/Lを含む最小培地内で培養される(Schaefer他、1999年、Anal.Biochem. 270:88〜96頁)。培養後、細胞は回収されて、洗浄され、6N HClを用い107℃で24時間加水分解される。次に、2D NMR分析がおこなわれる(HSQC)。この分析により、グルコースの炭素13の末路を決めることができ、それによって、システインの合成がセリンとアセチルセリンを経由しておこなわれることが確認され、遺伝子metYによりコードされる酵素がシステイン・シンターゼに進化していることが示される。
F.III.NADPH依存性酵素の進化
本発明のNADPH依存性生物変換経路の代謝工学に対する一つの応用(例F.III.1.)には、以下のステップが含まれる。
a1)当初のE.coli株内の遺伝子udhAおよびpgiの不活性化。
a2)当初のE.coli株内の遺伝子pfkA、pfkB、およびudhAの不活性化;得られる改変された株は、NADPを還元する能力に至適化されている。当初の株は最小培地(MM)上で生育可能だが、改変された株が最小培地上で生育する能力は大きく損なわれている。
b)Bacillus cereusのベンジル・レダクターゼをコードする遺伝子yueDを保持するプラスミドの導入。
c)代謝されにくい基質に対するベンジル・レダクターゼ活性を進化させるための、p-ニトロベンズアルデヒド(補基質)を加えた最小培地(MM)上での以前改変された株の培養。
d)進化した酵素YueDの定性。
本発明のNADPH依存性生物変換経路の代謝工学に対する一つの応用(例F.III.1.)には、以下のステップが含まれる。
a1)当初のE.coli株内の遺伝子udhAおよびpgiの不活性化。
a2)当初のE.coli株内の遺伝子pfkA、pfkB、およびudhAの不活性化;得られる改変された株は、NADPを還元する能力に至適化されている。当初の株は最小培地(MM)上で生育可能だが、改変された株が最小培地上で生育する能力は大きく損なわれている。
b)Bacillus cereusのベンジル・レダクターゼをコードする遺伝子yueDを保持するプラスミドの導入。
c)代謝されにくい基質に対するベンジル・レダクターゼ活性を進化させるための、p-ニトロベンズアルデヒド(補基質)を加えた最小培地(MM)上での以前改変された株の培養。
d)進化した酵素YueDの定性。
例F.III.1.:株E.coliΔ(udhA、pgi)および株E.coliΔ(pfkA、pfkB、udhA)の構築ならびにBacillus cereusのベンジル・レダクターゼの速度論的性質の改変
a1)株E.coliΔ(udhA、pgi)の構築
遺伝子udhAの不活性化は、カナマイシンに対する抵抗性を与える抗生物質抵抗性カセットの挿入によっておこなわれるが、同時に当該遺伝子のほとんどは除去される。使用する方法は、Datsenko K.A.;Wanner B.L(2000年)、PCR産物を用いるEscherichia coliK-12における染色体遺伝子のワンステップ不活性化、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640〜6645頁に記載されている。
a1)株E.coliΔ(udhA、pgi)の構築
遺伝子udhAの不活性化は、カナマイシンに対する抵抗性を与える抗生物質抵抗性カセットの挿入によっておこなわれるが、同時に当該遺伝子のほとんどは除去される。使用する方法は、Datsenko K.A.;Wanner B.L(2000年)、PCR産物を用いるEscherichia coliK-12における染色体遺伝子のワンステップ不活性化、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640〜6645頁に記載されている。
この目的のために2種類のオリゴヌクレオチドが合成された。
・100塩基を有するDudhAR(SEQ ID No. 25)
cccagaatctcttttgtttcccgatggaacaaaattttcagcgtgcccacgttcatgccgacgatttgtgcgcgtgccagTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
小文字の領域は遺伝子udhA(配列4158303から4156969、ウェブサイト上の参照配列はhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/)の配列(4157144から4157223)と相同で、
大文字の領域はカナマイシン抵抗性カセット増幅用(配列は、Datsenko K.A.;Wanner B.L(2000年)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640〜6645頁を参照)である。
・100塩基を有するDudhAF(SEQ ID No. 26)
ggtgcgcgcgtcgcagttatcgagcgttatcaaaatgttggcggcggttgcacccactggggcaccatcccgtcgaaagcCATATGAATATCCTCCTTAG
小文字の領域は遺伝子udhAの配列(4158285から4158206)と相同で、
大文字の領域はカナマイシン抵抗性カセット増幅用である。
・100塩基を有するDudhAR(SEQ ID No. 25)
cccagaatctcttttgtttcccgatggaacaaaattttcagcgtgcccacgttcatgccgacgatttgtgcgcgtgccagTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
小文字の領域は遺伝子udhA(配列4158303から4156969、ウェブサイト上の参照配列はhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/)の配列(4157144から4157223)と相同で、
大文字の領域はカナマイシン抵抗性カセット増幅用(配列は、Datsenko K.A.;Wanner B.L(2000年)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640〜6645頁を参照)である。
・100塩基を有するDudhAF(SEQ ID No. 26)
ggtgcgcgcgtcgcagttatcgagcgttatcaaaatgttggcggcggttgcacccactggggcaccatcccgtcgaaagcCATATGAATATCCTCCTTAG
小文字の領域は遺伝子udhAの配列(4158285から4158206)と相同で、
大文字の領域はカナマイシン抵抗性カセット増幅用である。
オリゴヌクレオチドDudhARおよびDudhAFは、プラスミドpKD4からのカナマイシン抵抗性カセットを増幅するのに使用される。得られたPCR産物は次にエレクトロポレーションによって、酵素Redリコンビナーゼが発現し相同的組換えを可能にしている株MG1655(pKD46)に導入される。カナマイシン抵抗性形質転換細胞は選別されて、カナマイシン抵抗性カセットの挿入がオリゴヌクレオチドUdhARおよびUdhAFのPCR分析によって確認される。
UdhAR(SEQ ID No. 27)gcgggatcactttactgccagcgctggctg(配列4156772から4156801までに相同)
UdhAF(SEQ ID No. 28)ggccgctcaggatatagccagataaatgac(配列4158475から4158446までに相同)
UdhAR(SEQ ID No. 27)gcgggatcactttactgccagcgctggctg(配列4156772から4156801までに相同)
UdhAF(SEQ ID No. 28)ggccgctcaggatatagccagataaatgac(配列4158475から4158446までに相同)
遺伝子pgiの不活性化は、クロラムフェニコールに対する抵抗性を与える抗生物質抵抗性カセットの挿入によっておこなわれるが、同時に当該遺伝子のほとんどは除去される。使用する方法は、Datsenko K.A.;Wanner B.L(2000年)、PCR産物を用いるEscherichia coliK-12における染色体遺伝子のワンステップ不活性化、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640〜6645頁に記載されている。
この目的のために2種類のオリゴヌクレオチドが合成された。
・100塩基を有するDpgiR(SEQ ID No. 29)
gcgccacgctttatagcggttaatcagaccattggtcgagctatcgtggctgctgatttctttatcatctttcagctctgCATATGAATATCCTCCTTAG
小文字の領域は遺伝子pgi(配列4231337から4232986、ウェブサイト上の参照配列はhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/)の配列(4232980から4232901)と相同で、
大文字の領域はクロラムフェニコール抵抗性カセット増幅用(配列は、Datsenko K.A.;Wanner B.L(2000年)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640〜6645頁を参照)である。
・100塩基を有するDpgiF(SEQ ID No. 30)
ccaacgcagaccgctgcctggcaggcactacagaaacacttcgatgaaatgaaagacgttacgatcgccgatctttttgcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
小文字の領域は遺伝子pgiの配列(4231352から4231432)と相同で、
大文字の領域はクロラムフェニコール抵抗性カセット増幅用である。
・100塩基を有するDpgiR(SEQ ID No. 29)
gcgccacgctttatagcggttaatcagaccattggtcgagctatcgtggctgctgatttctttatcatctttcagctctgCATATGAATATCCTCCTTAG
小文字の領域は遺伝子pgi(配列4231337から4232986、ウェブサイト上の参照配列はhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/)の配列(4232980から4232901)と相同で、
大文字の領域はクロラムフェニコール抵抗性カセット増幅用(配列は、Datsenko K.A.;Wanner B.L(2000年)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640〜6645頁を参照)である。
・100塩基を有するDpgiF(SEQ ID No. 30)
ccaacgcagaccgctgcctggcaggcactacagaaacacttcgatgaaatgaaagacgttacgatcgccgatctttttgcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
小文字の領域は遺伝子pgiの配列(4231352から4231432)と相同で、
大文字の領域はクロラムフェニコール抵抗性カセット増幅用である。
オリゴヌクレオチドDpgiRおよびDpgiFは、プラスミドpKD3からのクロラムフェニコール抵抗性カセットを増幅するのに使用される。得られたPCR産物は次にエレクトロポレーションによって、酵素Redリコンビナーゼが発現し相同的組換えを可能にしている株MG1655ΔudhA(pKD46)に導入される。クロラムフェニコール抵抗性形質転換細胞は選別されて、クロラムフェニコール抵抗性カセットの挿入がオリゴヌクレオチドPgiRおよびPgiFのPCR分析によって確認される。
PgiR(SEQ ID No. 31)cggtatgatttccgttaaattacagacaag(配列4233220から4233191までに相同)
PgiF(SEQ ID No. 32)gcggggcggttgtcaacgatggggtcatgc(配列4231138から4231167までに相同)
PgiR(SEQ ID No. 31)cggtatgatttccgttaaattacagacaag(配列4233220から4233191までに相同)
PgiF(SEQ ID No. 32)gcggggcggttgtcaacgatggggtcatgc(配列4231138から4231167までに相同)
次に2種類の抵抗性カセットを除去することができる。カナマイシンおよびクロラムフェニコール抵抗性カセットのFRT位で機能するFLPリコンビナーゼを保持するプラスミドpCP20がエレクトロポレーションによって組換え株に導入される。42℃での一連の培養終了後に、2種類の抗生物質抵抗性カセットが除かれたことが、上記で使用したのと同じオリゴヌクレオチドのPCR分析によって確認される。
a2)改変された株E.coliΔ(pfkA、pfkB、udhA)の構築
遺伝子pfkAの不活性化は、クロラムフェニコールに対する抵抗性を与える抗生物質抵抗性カセットの挿入によっておこなわれるが、同時に当該遺伝子のほとんどは除去される。使用する方法は、Datsenko K.A.;Wanner B.L(2000年)、PCR産物を用いるEscherichia coliK-12における染色体遺伝子のワンステップ不活性化、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640〜6645頁に記載されている。
遺伝子pfkAの不活性化は、クロラムフェニコールに対する抵抗性を与える抗生物質抵抗性カセットの挿入によっておこなわれるが、同時に当該遺伝子のほとんどは除去される。使用する方法は、Datsenko K.A.;Wanner B.L(2000年)、PCR産物を用いるEscherichia coliK-12における染色体遺伝子のワンステップ不活性化、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640〜6645頁に記載されている。
この目的のために2種類のオリゴヌクレオチドが合成された。
・100塩基を有するDpfkAR(SEQ ID No. 33)
ttcgcgcagtccagccagtcacctttgaacggacgcttcatgttttcgatagcgtcgatgatgtcgtggtgaaccagctgCATATGAATATCCTCCTTAG
小文字の領域は遺伝子pfkA(配列4105132から4106094、ウェブサイト上の参照配列はhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/)の配列(4106081から4106002)と相同で、
大文字の領域はクロラムフェニコール抵抗性カセット増幅用(配列は、Datsenko K.A.;Wanner B.L(2000年)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640〜6645頁を参照)である。
・100塩基を有するDpfkAF(SEQ ID No. 34)
ggtgtgttgacaagcggcggtgatgcgccaggcatgaacgccgcaattcgcggggttgttcgttctgcgctgacagaa ggTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
小文字の領域は遺伝子pfkAの配列(4105147から4105227)と相同で、
大文字の領域はクロラムフェニコール抵抗性カセット増幅用である。
・100塩基を有するDpfkAR(SEQ ID No. 33)
ttcgcgcagtccagccagtcacctttgaacggacgcttcatgttttcgatagcgtcgatgatgtcgtggtgaaccagctgCATATGAATATCCTCCTTAG
小文字の領域は遺伝子pfkA(配列4105132から4106094、ウェブサイト上の参照配列はhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/)の配列(4106081から4106002)と相同で、
大文字の領域はクロラムフェニコール抵抗性カセット増幅用(配列は、Datsenko K.A.;Wanner B.L(2000年)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640〜6645頁を参照)である。
・100塩基を有するDpfkAF(SEQ ID No. 34)
ggtgtgttgacaagcggcggtgatgcgccaggcatgaacgccgcaattcgcggggttgttcgttctgcgctgacagaa ggTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
小文字の領域は遺伝子pfkAの配列(4105147から4105227)と相同で、
大文字の領域はクロラムフェニコール抵抗性カセット増幅用である。
オリゴヌクレオチドDpfkARおよびDpfkAFは、プラスミドpKD3からのクロラムフェニコール抵抗性カセットを増幅するのに使用される。得られたPCR産物は次にエレクトロポレーションによって、酵素Redリコンビナーゼが発現し相同的組換えを可能にしている株MG1655(pKD46)に導入される。クロラムフェニコール抵抗性形質転換細胞は選別されて、クロラムフェニコール抵抗性カセットの挿入がオリゴヌクレオチドPfkARおよびPfkAFのPCR分析によって確認される。
PfkAR(SEQ ID No. 35)ccctacgccccacttgttcatcgcccg(配列4106434から4106408までに相同)
PfkAF(SEQ ID No. 36)cgcacgcggcagtcagggccgacccgc(配列4104751から4104777までに相同)
PfkAR(SEQ ID No. 35)ccctacgccccacttgttcatcgcccg(配列4106434から4106408までに相同)
PfkAF(SEQ ID No. 36)cgcacgcggcagtcagggccgacccgc(配列4104751から4104777までに相同)
udhA遺伝子の不活性化は、例F.III.1.a1)に記載しており、同様に実施できる。
次に2種類の抵抗性カセットを除去することができる。カナマイシンおよびクロラムフェニコール抵抗性カセットのFRT位で機能するFLPリコンビナーゼを保持するプラスミドpCP20がエレクトロポレーションによって組換え株に導入される。42℃での一連の培養終了後に、2種類の抗生物質抵抗性カセットが除かれたことが、上記で使用したのと同じオリゴヌクレオチドのPCR分析によって確認される。
遺伝子pfkBの不活性化は、クロラムフェニコールに対する抵抗性を与える抗生物質抵抗性カセットの挿入によっておこなわれるが、同時に当該遺伝子のほとんどは除去される。使用する方法は、Datsenko K.A.;Wanner B.L(2000年)、PCR産物を用いるEscherichia coliK-12における染色体遺伝子のワンステップ不活性化、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640〜6645頁に記載されている。
この目的のために2種類のオリゴヌクレオチドが合成された。
・100塩基を有するDpfkBR(SEQ ID No. 37)
gcgggaaaggtaagcgtaaattttttgcgtatcgtcatgggagcacagacgtgttccctgattgagtgtggctgcactccCATATGAATATCCTCCTTAG
小文字の領域は遺伝子pfkB(配列1804394から1805323、ウェブサイト上の参照配列はhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/)の配列(1805320から1805241)と相同で、
大文字の領域はクロラムフェニコール抵抗性カセット増幅用(配列は、Datsenko K.A.;Wanner B.L(2000年)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640〜6645頁を参照)である。
・100塩基を有するDpfkBF(SEQ ID No. 38)
gcgccctctctcgatagcgcaacaattaccccgcaaatttatcccgaaggaaaactgcgctgtaccgcaccggtgttcgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
小文字の領域は遺伝子pfkBの配列(1804421から1804499)と相同で、
大文字の領域はクロラムフェニコール抵抗性カセット増幅用である。
・100塩基を有するDpfkBR(SEQ ID No. 37)
gcgggaaaggtaagcgtaaattttttgcgtatcgtcatgggagcacagacgtgttccctgattgagtgtggctgcactccCATATGAATATCCTCCTTAG
小文字の領域は遺伝子pfkB(配列1804394から1805323、ウェブサイト上の参照配列はhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/)の配列(1805320から1805241)と相同で、
大文字の領域はクロラムフェニコール抵抗性カセット増幅用(配列は、Datsenko K.A.;Wanner B.L(2000年)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640〜6645頁を参照)である。
・100塩基を有するDpfkBF(SEQ ID No. 38)
gcgccctctctcgatagcgcaacaattaccccgcaaatttatcccgaaggaaaactgcgctgtaccgcaccggtgttcgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
小文字の領域は遺伝子pfkBの配列(1804421から1804499)と相同で、
大文字の領域はクロラムフェニコール抵抗性カセット増幅用である。
オリゴヌクレオチドDpfkBRおよびDpfkBFは、プラスミドpKD3からのクロラムフェニコール抵抗性カセットを増幅するのに使用される。得られたPCR産物は次にエレクトロポレーションによって、酵素Redリコンビナーゼが発現し相同的組換えを可能にしている株MG1655Δ(pfkA、udhA)(pKD46)に導入される。クロラムフェニコール抵抗性形質転換細胞は選別されて、クロラムフェニコール抵抗性カセットの挿入がオリゴヌクレオチドPfkBRおよびPfkBFのPCR分析によって確認される。
PfkBR(SEQ ID No. 39)gccggttgcactttgggtaagccccg(配列1805657から1805632までに相同)
PfkBF(SEQ ID No. 40)tggcaggatcatccatgacagtaaaaacgg(配列1803996から1804025までに相同)
PfkBR(SEQ ID No. 39)gccggttgcactttgggtaagccccg(配列1805657から1805632までに相同)
PfkBF(SEQ ID No. 40)tggcaggatcatccatgacagtaaaaacgg(配列1803996から1804025までに相同)
次にクロラムフェニコール抵抗性カセットを除去することができる。クロラムフェニコール抵抗性カセットのFRT位で機能するFLPリコンビナーゼを保持するプラスミドpCP20がエレクトロポレーションによって組換え株に導入される。42℃での一連の培養終了後に、抗生物質抵抗性カセットが除かれたことが、上記で使用したのと同じオリゴヌクレオチドのPCR分析によって確認される。保持された株はMG1655Δ(pfkA、pfkB、udhA)と命名された。
a1)Bacillus cereusのベンジル・レダクターゼをコードする遺伝子yueDの株Δ(pgi、udhA)または株Δ(pfkA、pfkB、udhA)への導入
遺伝子yueD はベクターpTrc99A(Amersham-Pharmacia社製)内でクローン化される。Bacillus cereusの染色体DNAからのこの遺伝子の増幅には、オリゴYueDRおよびYueDFが使用される。
・YueDR(SEQ ID No. 41)
CGTGAATTCttattcatcaattctaataa
小文字の領域は遺伝子yueDの配列(731から750)と相同で、
大文字の領域は酵素EcoRIによる開裂を可能とする。
・YueDF(SEQ ID No. 42)
ACGTTCatgAgAtacgttatcataacaggaac
小文字の領域は遺伝子yueDの配列(1から26)と相同で、
大文字の領域(変化し付加された塩基)は酵素BspHIによる開裂を可能とする。
遺伝子yueD はベクターpTrc99A(Amersham-Pharmacia社製)内でクローン化される。Bacillus cereusの染色体DNAからのこの遺伝子の増幅には、オリゴYueDRおよびYueDFが使用される。
・YueDR(SEQ ID No. 41)
CGTGAATTCttattcatcaattctaataa
小文字の領域は遺伝子yueDの配列(731から750)と相同で、
大文字の領域は酵素EcoRIによる開裂を可能とする。
・YueDF(SEQ ID No. 42)
ACGTTCatgAgAtacgttatcataacaggaac
小文字の領域は遺伝子yueDの配列(1から26)と相同で、
大文字の領域(変化し付加された塩基)は酵素BspHIによる開裂を可能とする。
得られたPCR産物は、制限酵素BspHIおよびEcoRIによって消化され、NcoIおよびEcoRIによって消化済みのベクターpTrc99A内にクローン化される。得られたプラスミドpYU1は次に株MG1655株Δ(pgi、udhA)に導入される。遺伝子yueDはNADPH依存性ベンジル・レダクターゼをコードするが、ベンジル・レダクターゼは、1-フェニル-1,2-プロパンジオンを効率的に還元する(kcat=165分-1;km=42μM)が、p-ニトロベンズアルデヒドに対する活性は低い(kcat=1.2分-1;km=261μM)(Maruyama,R. Nishizawa,M. Itoi,Y. Ito,S. Inoue,M.、(2002年)、ベンジル・レダクターゼ活性を有する酵素が細菌から哺乳類まで保存されている、J.Biotechnology 94:157〜169頁)。
b)最小培地上での改変された株の培養と進化
株E.coli [Δ(udhA、pgi)yueD]の最大生育速度が最小培地上で評価された(μmax=0.04)。これらの条件において、非改変株(μmax=0.61)に比べてはるかに小さかった。そのため、1-フェニル-1,2-プロパンジオン(補基質)を最小培地に加えることを決め、その結果、同じ培地上で改変された株が当初の(すなわち非改変)株より若干劣る速度で生育することがわかった。次に、改変された株とともにp-ニトロベンズアルデヒド(補基質)を含む最小培地を入れた恒成分培養槽で接種(OD 5)することにした。この条件において、株の生育速度は補基質を含まない場合と同等であった。恒成分培養槽での生育は1〜5週間おこない、その間希釈率を徐々に上げた。希釈率は段階的に上げてもよく、連続的に上げてもよい。恒成分培養槽内の株にはグリセロールが定期的に蓄積された。
株E.coli [Δ(udhA、pgi)yueD]の最大生育速度が最小培地上で評価された(μmax=0.04)。これらの条件において、非改変株(μmax=0.61)に比べてはるかに小さかった。そのため、1-フェニル-1,2-プロパンジオン(補基質)を最小培地に加えることを決め、その結果、同じ培地上で改変された株が当初の(すなわち非改変)株より若干劣る速度で生育することがわかった。次に、改変された株とともにp-ニトロベンズアルデヒド(補基質)を含む最小培地を入れた恒成分培養槽で接種(OD 5)することにした。この条件において、株の生育速度は補基質を含まない場合と同等であった。恒成分培養槽での生育は1〜5週間おこない、その間希釈率を徐々に上げた。希釈率は段階的に上げてもよく、連続的に上げてもよい。恒成分培養槽内の株にはグリセロールが定期的に蓄積された。
d)進化した酵素YueDの定性
株が課せられた希釈率に適応できなくなった時点で選別が終了したと考えられる。最終的に進化した株から(必要な場合は蓄積されたグリセロールを使って)コロニー一つを取り出し、基質の1-フェニル-1,2-プロパンジオンおよびp-ニトロベンズアルデヒドを使い、当初のベンジル・レダクターゼと比較することによって、進化したベンジル・レダクターゼの速度論的特性を評価した。進化したベンジル・レダクターゼのp-ニトロベンズアルデヒドに対するkcat値は明らかに改善されたが、1-フェニル-1,2-プロパンジオン対するkcat値は大きく低下した。進化したクローンの配列決定により、点突然変異が多発していることがわかり、これによって、これら酵素の基質特異性の変化が説明される。
株が課せられた希釈率に適応できなくなった時点で選別が終了したと考えられる。最終的に進化した株から(必要な場合は蓄積されたグリセロールを使って)コロニー一つを取り出し、基質の1-フェニル-1,2-プロパンジオンおよびp-ニトロベンズアルデヒドを使い、当初のベンジル・レダクターゼと比較することによって、進化したベンジル・レダクターゼの速度論的特性を評価した。進化したベンジル・レダクターゼのp-ニトロベンズアルデヒドに対するkcat値は明らかに改善されたが、1-フェニル-1,2-プロパンジオン対するkcat値は大きく低下した。進化したクローンの配列決定により、点突然変異が多発していることがわかり、これによって、これら酵素の基質特異性の変化が説明される。
参考文献
Anderson, E.H. (1946), Growth requirements of virus-resistant mutants of Escherichia coli strain "B" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128.
A Baudin, O Ozier-Kalogeropoulos, A Denouel, F Lacroute, and C Cullin (1993), A simple and efficient method for direct gene deletion in Saccharomyces cerevisiae, Nucl. Acids Res., 21: 3329-3330, 1993.
Brachmann CB, Davies A, Cost GJ, Caputo E, Li J, Hieter P, Boeke JD. (1998), Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14:115-32.
Datsenko, K.A.; Wanner, B.L. (2000), One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645.
Miller, 1992. A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York.
Schaefer, U., Boos, W., Takors, R., Weuster-Botz, D. (1999), Automated sampling device for monitoring intracellular metabolite dynamics, Anal. Biochem. 270: 88-96.
Wach, A., Brachat, A., Pohlmann, R., and Philippsen, P. (1994) New heterologous modules for classical or PCR-based gene disruptions in Saccharomyces cerevisiae. Yeast, 10, 1793-1808.
Anderson, E.H. (1946), Growth requirements of virus-resistant mutants of Escherichia coli strain "B" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128.
A Baudin, O Ozier-Kalogeropoulos, A Denouel, F Lacroute, and C Cullin (1993), A simple and efficient method for direct gene deletion in Saccharomyces cerevisiae, Nucl. Acids Res., 21: 3329-3330, 1993.
Brachmann CB, Davies A, Cost GJ, Caputo E, Li J, Hieter P, Boeke JD. (1998), Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14:115-32.
Datsenko, K.A.; Wanner, B.L. (2000), One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645.
Miller, 1992. A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York.
Schaefer, U., Boos, W., Takors, R., Weuster-Botz, D. (1999), Automated sampling device for monitoring intracellular metabolite dynamics, Anal. Biochem. 270: 88-96.
Wach, A., Brachat, A., Pohlmann, R., and Philippsen, P. (1994) New heterologous modules for classical or PCR-based gene disruptions in Saccharomyces cerevisiae. Yeast, 10, 1793-1808.
Claims (37)
- 代謝経路の改変を可能にする進化した微生物の調製方法であって、
a)微生物が規定された培地上で生育する際に、代謝産物の生産または消費が阻害されて微生物の生育能力が低下するように、当初の微生物の細胞を遺伝子的に改変することにより改変された微生物を調製するステップと、
b)改変された微生物を進化するように前記規定された培地上で培養するステップであって、培地には進化を可能にする補基質を含むことができるステップと、
a)必要な場合補基質を含む、前記規定された培地上で生育が可能な改変された微生物を選択するステップを、
含むことを特徴とする方法。 - 代謝経路が、アミノ酸の生合成経路、核酸の合成経路、脂質の合成経路、または糖の代謝経路から選択されることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 改変された代謝経路がアミノ酸の生合成経路であることを特徴とする、請求項2記載の方法。
- 改変された代謝経路が、メチオニン、システイン、トレオニン、リシン、またはイソロイシンから選択されるアミノ酸の生合成経路であることを特徴とする、請求項3記載の方法。
- 改変された代謝経路でNADPHが消費されることを特徴とする、請求項2記載の方法。
- ステップa)における改変が、おそらくNADPHのNADPへの酸化を制限することにより、NADPのNADPHへの還元を有利にすることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 進化した微生物が進化したタンパク質をコードする進化した遺伝子を少なくとも一つ保持し、その進化が、阻害された代謝経路を新規代謝経路に置き換えることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 改変された微生物が培養されるステップb)への準備段階として、追加ステップa1)、異種タンパク質をコードする異種遺伝子を少なくとも一つ導入するステップであって、異種遺伝子により新規代謝経路への進化が可能となるステップを含むことを特徴とする、請求項1または請求項2のいずれか一項記載の方法。
- ステップd)として、進化したタンパク質をコードする進化した遺伝子を単離するステップを含むことを特徴とする、請求項7または請求項8のいずれか一項記載の方法。
- 進化した遺伝子が、好適な形態で、進化したタンパク質の生産を目的とする生産微生物に導入されることを特徴とする、請求項9記載の方法。
- 請求項1〜10のいずれか一項記載の方法により入手可能な進化した微生物。
- 微生物が、改変された「メチオニン・シンターゼ」活性を有するE.coliK183株であって、2003年4月2日に登録番号I-3005としてCNCMに登録されたことを特徴とする、請求項11記載の進化した微生物。
- 請求項11記載の進化した微生物を、進化したタンパク質の生産に適した培養培地で培養する、進化したタンパク質の調製方法。
- 生産された進化したタンパク質が精製されることを特徴とする、請求項13記載の方法。
- 請求項9記載の方法で入手可能な、進化したタンパク質をコードする進化した遺伝子。
- 請求項13または請求項14のいずれか一項記載の方法で入手可能な、進化したタンパク質。
- 酵素が、改変された「メチオニン・シンターゼ」活性を有し、改変された「メチオニン・シンターゼ」活性を有するシスタチオニン-γ-シンターゼおよびアシルホモセリン・スルフヒドリラーゼから選択されることを特徴とする、請求項16記載の進化したタンパク質。
- 進化前には非改変「メチオニン・シンターゼ」活性を有するシスタチオニン-γ-シンターゼが、参照番号PF01053のPFAMおよび参照番号CPG0626のCOGにおけるシスタチオニン-γ-シンターゼ相当物から選択されることを特徴とする、請求項17記載の進化したタンパク質。
- 進化前には非改変「メチオニン・シンターゼ」活性を有するシスタチオニン-γ-シンターゼが、そのC末端(保存領域1)に下記のアミノ酸配列を有し、
式中、
X1は、A、G、S、好ましくはAを示し、
X2は、E、V、P、T、好ましくはEを示し、
X3は、S、T、N、好ましくはSを示し、
X4は、G、D、A、H、T、好ましくはGを示し、
X5は、V、A、T、H、N、好ましくはVを示し、
X6は、E、R、K、F、好ましくはEを示し、
X7は、S、T、好ましくはSを示し、
X8は、L、I、V、A、好ましくはLを示し、
X9は、I、V、A、T、好ましくはIを示し、
上記アミノ酸配列は、SEQ ID No. 6で示されるE.coliK12のシスタチオニン-γ-シンターゼ配列の残基324から334に相当する、請求項18記載の進化したタンパク質。 - 進化前には非改変「メチオニン・シンターゼ」活性を有するシスタチオニン-γ-シンターゼが、そのN末端(保存領域2)に下記のアミノ酸配列を有し、
式中、
X10は、A、H、Y、F、L、K、好ましくはAを示し、
X11は、Y、E、D、K、R、V、I、好ましくはYを示し、
X12は、S、A、T、P、G、好ましくはSを示し、
X13は、I、S、T、R、E、F、W、D、好ましくはSを示し、
X14は、S、G、A、I、E、N、K、P、好ましくはGを示し、
X15は、N、H、Q、S、好ましくはNを示し、
X16は、P、D、L、好ましくはPを示し、
X17は、T、M、N、G、S、好ましくはTを示し、
X18は、R、L、V、S、W、E、好ましくはRを示し、
上記アミノ酸配列は、SEQ ID No. 6で示されるE.coliK12のシスタチオニン-γ-シンターゼ配列の残基44から54に相当することを特徴とする、請求項18または請求項19記載の進化したタンパク質。 - C末端部に突然変異を少なくとも一つおよび/またはN末端部に突然変異を少なくとも一つ含むことを特徴とする、請求項18〜20のいずれか一項記載の進化したタンパク質。
- 突然変異が、非改変酵素中の補基質システインと相互作用する酸性アミノ酸を、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニンまたはメチオニン残基から選択される非極性アミノ酸で置換することからなることを特徴とする、請求項21記載の進化したタンパク質。
- シスタチオニン-γ-シンターゼのC末端部における突然変異が、請求項14で定義した「保存領域1」の酸性アミノ酸中に、特に残基X2に導入されることを特徴とする、請求項22記載の進化したタンパク質。
- 改変された「メチオニン・シンターゼ」活性を有するシスタチオニン-γ-シンターゼが、SEQ ID No. 8で示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項25記載の進化したタンパク質。
- シスタチオニン-γ-シンターゼのN末端部における突然変異が、上記定義の「保存領域2」の酸性アミノ酸中に、特に残基X11および/またはRおよび/またはX13に導入されることを特徴とする、請求項18〜26のいずれか一項記載の進化したタンパク質。
- 改変された「メチオニン・シンターゼ」活性を有するシスタチオニン-γ-シンターゼがそのN末端部に下記のアミノ酸配列を有し、
式中、
X7、X9、X12、X14、X15、X16、X17、およびX18は上記定義の通りであり、
X11は、請求項15の定義の通りあるいは非極性アミノ酸を示し、
X13は、請求項15の定義の通りあるいは非極性アミノ酸を示し、
X19はRあるいは非極性アミノ酸を示し、
X11、X13、およびX19の少なくとも一つが非極性アミノ酸を示し、
非極性アミノ酸は互いに独立にグリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニンまたはメチオニン残基から選択されることを特徴とする、請求項27記載の進化したタンパク質。 - 突然変異を含まない当初の酵素が、進化する前に、H2Sの存在下でスルフヒドリル化を触媒することを特徴とする、請求項16記載の進化したタンパク質。
- 突然変異を含まない当初の酵素が、進化する前に、O-アシル-L-ホモセリン・スルフヒドリラーゼ活性を有することを特徴とする、請求項29記載の進化したタンパク質。
- O-アシル-L-ホモセリン・スルフヒドリラーゼ活性を有する当初の酵素が、参照番号PF01053のPFAMおよび参照番号COG2873のCOGにおけるO-アシル-L-ホモセリン・スルフヒドリラーゼ相当物から選択されることを特徴とする、請求項30記載の進化したタンパク質。
- 当初の酵素が下記のアシルホモセリン・スルフヒドリラーゼ:
NP_785969 O-アセチルホモセリン(チオール)-リアーゼ、Lactobacillus plantarum WCFS1
AAN68137 O-アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ、Pseudomonas putida KT2440
NP_599886 O-アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ、Corynebacterium glutamicum ATCC13032
NP_712243 アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ、Leptospira interrogans serovar lai str. 56601
BAC46370 O-サクシニルホモセリン・スルフヒドリラーゼ、Bradyrhizobium japonicum USDA110
AAO57279 O-サクシニルホモセリン・スルフヒドリラーゼ、Pseudomonas syringae pv. tomato str. DC3000
NP_284520 O-サクシニルホモセリン・スルフヒドリラーゼ、Neisseria meningitidis Z2491
AAA83435 O-サクシニルホモセリン・スルフヒドリラーゼ、P. aeruginosa
から選択されることを特徴とする、請求項31記載の進化したタンパク質。 - 進化前の当初の酵素がコリネバクテリウムのmetY遺伝子でコードされるO-アシル-L-ホモセリン・スルフヒドリラーゼであることを特徴とする、請求項31記載の進化したタンパク質。
- O-アシル-L-ホモセリン・スルフヒドリラーゼがコリネバクテリウム・グルタミカム(Genbank AF220150)のmetY遺伝子でコードされることを特徴とする、請求項33記載の進化したタンパク質。
- 生物変換法における、請求項11記載の進化した微生物または請求項15記載の進化したタンパク質の使用。
- 生物変換がNADPH依存性酵素に依存する、請求項35記載の生物変換法。
- NADPH依存性酵素が進化した基質特異性を有する、請求項36記載の方法。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR0301924A FR2851256A1 (fr) | 2003-02-18 | 2003-02-18 | Procede de criblage et d'evolution dirigee de souches produisant de la methionine par nouvelle voie metabolique |
FR0305768A FR2851255B1 (fr) | 2003-02-18 | 2003-05-14 | Microorganisme a activite methionine synthase modifiee et procede de preparation de la methionine |
FR0305769A FR2854902B1 (fr) | 2003-05-14 | 2003-05-14 | Microorganisme a activite cysteine synthase modifiee et procede de preparation de la cysteine |
FR0313054A FR2862067A1 (fr) | 2003-11-06 | 2003-11-06 | Procede de preparation de microorganismes evolues permettant la creation ou la modification de voies metaboliques |
PCT/FR2004/000354 WO2004076659A2 (fr) | 2003-02-18 | 2004-02-17 | Procede de preparation de microorganismes evolues permettant la creation ou la modification de voies metaboliques |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2006517796A true JP2006517796A (ja) | 2006-08-03 |
Family
ID=32931448
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2006502150A Pending JP2006517796A (ja) | 2003-02-18 | 2004-02-17 | 代謝経路の生成または改変を可能とする進化した微生物の生産方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20060270013A1 (ja) |
EP (2) | EP1597364B1 (ja) |
JP (1) | JP2006517796A (ja) |
BR (1) | BRPI0407600A (ja) |
MX (1) | MXPA05008857A (ja) |
WO (1) | WO2004076659A2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2019528498A (ja) * | 2016-07-06 | 2019-10-10 | ヨーロピアン モレキュラー バイオロジー ラボラトリーEuropean Molecular Biology Laboratory | 適応実験室進化のための方法 |
Families Citing this family (64)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1597364B1 (fr) * | 2003-02-18 | 2013-07-24 | Metabolic Explorer | Procede de preparation de microorganismes evolues permettant la creation ou la modification de voies metaboliques |
JP4479283B2 (ja) * | 2004-03-04 | 2010-06-09 | 味の素株式会社 | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 |
JP2008529485A (ja) * | 2005-02-07 | 2008-08-07 | メタボリック エクスプローラー | 低いγ脱離活性を有する発現酵素を含む微生物 |
BRPI0612900A8 (pt) * | 2005-07-18 | 2022-07-19 | Basf Ag | Métodos para produzir metionina, para aperfeiçoar o uso de dmds para produção de metionina, e, para identificar um alelo mutante, composição, produto contendo metionina, microorganismo, gene isolado, o-acetil-homosserina sulfidrilase mutante ou enzimas de o-succinil-homosserina sulfidrilase, e organismo |
ES2459617T3 (es) | 2006-01-04 | 2014-05-12 | Metabolic Explorer | Procedimiento para la preparación de metionina y sus precursores homoserina o succinilhomoserina que utiliza un microorganismo |
KR100905381B1 (ko) * | 2006-07-28 | 2009-06-30 | 씨제이제일제당 (주) | L-메치오닌 전구체 생산 균주 및 상기 l-메치오닌전구체로부터의 l-메치오닌 및 유기산의 생산방법 |
WO2008016693A1 (en) * | 2006-08-02 | 2008-02-07 | The Regents Of The University Of California | Method for determining the genetic basis for physiological changes in organisms |
BRPI0806695A2 (pt) * | 2007-01-12 | 2014-06-03 | Univ Colorado | Composições e métodos para aumentar a tolerância à produção de produtos químicos produzidos por microorganismos |
KR20100015815A (ko) * | 2007-03-23 | 2010-02-12 | 메타볼릭 익스플로러 | 1,2-프로판디올 및 아세톨의 제조를 위한 미생물 및 방법 |
TW200904984A (en) * | 2007-03-23 | 2009-02-01 | Metabolic Explorer Sa | New micro-organisms for the production of 1,2-propanediol obtained by a combination of evolution and rational design |
PL2520645T3 (pl) | 2007-04-11 | 2015-05-29 | Cj Cheiljedang Corp | Kompozycje i sposoby wytwarzania metioniny |
WO2009043372A1 (en) * | 2007-10-02 | 2009-04-09 | Metabolic Explorer | Increasing methionine yield |
US20090181901A1 (en) * | 2007-11-14 | 2009-07-16 | Thomas Eidenberger | Compositions and methods to increase bioavailability of carotenoids |
US8048624B1 (en) | 2007-12-04 | 2011-11-01 | Opx Biotechnologies, Inc. | Compositions and methods for 3-hydroxypropionate bio-production from biomass |
US7815801B2 (en) * | 2007-12-17 | 2010-10-19 | APT Water, Inc. | Removal of selenium in contaminated wastewater streams |
US7851180B2 (en) | 2008-04-04 | 2010-12-14 | Cj Cheiljedang Corporation | Microorganism producing L-methionine precursor and the method of producing L-methionine precursor using the microorganism |
US9005952B2 (en) | 2008-04-04 | 2015-04-14 | Cj Cheiljedang Corporation | Microorganism producing L-methionine precursor and the method of producing L-methionine precursor using the microorganism |
MX2011000793A (es) * | 2008-07-23 | 2011-09-06 | Opx Biotechnologies Inc | Metodos, sistemas y composiciones para incrementada tolerancia de microorganismos a y produccion de acido 3-hidroxipropionico (3-hp). |
WO2010022763A1 (en) * | 2008-08-25 | 2010-03-04 | Metabolic Explorer | Method for the preparation of 2-hydroxy-isobutyrate |
MX2011007039A (es) | 2008-12-31 | 2011-07-20 | Metabolic Explorer Sa | Metodo para la preparacion de dioles. |
EP2267126A1 (en) | 2009-06-26 | 2010-12-29 | Metabolic Explorer | Process for the stable gene interruption in clostridia |
WO2011038364A1 (en) | 2009-09-27 | 2011-03-31 | Opx Biotechnologies, Inc. | Method for producing 3-hydroxypropionic acid and other products |
US8809027B1 (en) | 2009-09-27 | 2014-08-19 | Opx Biotechnologies, Inc. | Genetically modified organisms for increased microbial production of 3-hydroxypropionic acid involving an oxaloacetate alpha-decarboxylase |
WO2011063363A2 (en) * | 2009-11-20 | 2011-05-26 | Opx Biotechnologies, Inc. | Production of an organic acid and/or related chemicals |
WO2011073738A1 (en) | 2009-12-14 | 2011-06-23 | Metabolic Explorer | Use of inducible promoters in the production of methionine |
PL2519643T3 (pl) | 2009-12-30 | 2018-03-30 | Evonik Degussa Gmbh | Zwiększenie wytwarzania metioniny przez nadekspresję dehydrogenazy bursztynianowej |
CN102782137B (zh) | 2009-12-30 | 2016-01-06 | 代谢探索者公司 | 用于甲硫氨酸生产的菌株和方法 |
US8911978B2 (en) | 2010-07-02 | 2014-12-16 | Metabolic Explorer | Method for the preparation of hydroxy acids |
TWI500768B (zh) | 2010-07-05 | 2015-09-21 | Metabolic Explorer Sa | 由蔗糖製備1,3-丙二醇之方法 |
CN103797027B (zh) | 2010-12-21 | 2017-05-17 | Cj 第一制糖株式会社 | 具有高丝氨酸乙酰转移酶活性的修饰多肽和表达其的微生物 |
US9260732B2 (en) * | 2010-12-29 | 2016-02-16 | Cj Cheiljedang Corp | Methods for production of L-methionine and related products |
EP2540834A1 (en) | 2011-06-29 | 2013-01-02 | Metabolic Explorer | Method for the preparation of 1,3-propanediol |
AR086790A1 (es) | 2011-06-29 | 2014-01-22 | Metabolic Explorer Sa | Un microorganismo para la produccion de metionina con importacion de glucosa mejorada |
EP2578559A1 (en) | 2011-10-07 | 2013-04-10 | Metabolic Explorer | Process for producing isobutene from isobutylamine |
US9410164B2 (en) | 2011-10-11 | 2016-08-09 | Metabolic Explorer | Biosynthesis pathway for prenol in a recombinant microorganism |
US20140342419A1 (en) | 2011-11-21 | 2014-11-20 | Metabolic Explorer | Microorganism strains for the production of 2,3-butanediol |
WO2013128230A1 (en) | 2012-03-02 | 2013-09-06 | Metabolic Explorer | A process for butanol production |
EP2647718A3 (en) | 2012-04-06 | 2014-12-24 | Metabolic Explorer | Process for producing 5-aminopentanoate empolying a recombinant microorganism |
AU2012383221A1 (en) | 2012-06-18 | 2015-01-15 | Evonik Degussa Gmbh | Recombinant microorganism for the fermentative production of methionine |
IN2015DN01858A (ja) | 2012-08-10 | 2015-05-29 | Opx Biotechnologies Inc | |
WO2014049382A2 (en) | 2012-09-26 | 2014-04-03 | Metabolic Explorer | Ethylenediamine fermentative production by a recombinant microorganism |
US20150057465A1 (en) | 2013-03-15 | 2015-02-26 | Opx Biotechnologies, Inc. | Control of growth-induction-production phases |
US9512057B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-12-06 | Cargill, Incorporated | 3-hydroxypropionic acid compositions |
JP6603658B2 (ja) | 2013-07-19 | 2019-11-06 | カーギル インコーポレイテッド | 脂肪酸及び脂肪酸誘導体の製造のための微生物及び方法 |
US11408013B2 (en) | 2013-07-19 | 2022-08-09 | Cargill, Incorporated | Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products |
JP2016529899A (ja) | 2013-08-30 | 2016-09-29 | メタボリック エクスプローラー | メチオニンシンターゼ活性及びメチオニン流出が改善された、メチオニン生産のための微生物 |
CN107109359B (zh) | 2014-09-01 | 2021-06-29 | 赢创运营有限公司 | 用于通过具有改进的甲硫氨酸排出的发酵生产甲硫氨酸的方法和微生物 |
EP2993228B1 (en) | 2014-09-02 | 2019-10-09 | Cargill, Incorporated | Production of fatty acid esters |
KR20160111285A (ko) | 2015-03-16 | 2016-09-26 | 씨제이제일제당 (주) | 사료 첨가제용 조성물 및 이를 포함하는 동물 사료 조성물 |
WO2016193161A1 (en) | 2015-05-29 | 2016-12-08 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Multivalent immunogenic composition for inducing an immune response against yersinia species |
WO2017211883A1 (en) * | 2016-06-07 | 2017-12-14 | Danmarks Tekniske Universitet | Bacterial cells with improved tolerance to polyols |
KR20190026851A (ko) | 2016-07-08 | 2019-03-13 | 에보니크 데구사 게엠베하 | 당 포스포트랜스퍼라제 시스템 (pts)을 코딩하는 유전자를 포함하는 미생물에 의한 메티오닌 또는 그의 히드록시 유사체 형태의 발효적 생산을 위한 방법 |
US11479758B2 (en) | 2016-08-24 | 2022-10-25 | Danmarks Tekniske Universitet | Method of improving methyltransferase activity |
EP3296404A1 (en) | 2016-09-15 | 2018-03-21 | Evonik Degussa GmbH | Modified microorganism for production of methionine |
EP3354742A1 (en) | 2017-01-26 | 2018-08-01 | Metabolic Explorer | Methods and microorganisms for the production of glycolic acid and/or glyoxylic acid |
CN110494566A (zh) | 2017-02-02 | 2019-11-22 | 嘉吉公司 | 产生c6-c10脂肪酸衍生物的经遗传修饰的细胞 |
EP3652321B9 (en) | 2017-07-11 | 2023-10-04 | Adisseo France S.A.S. | Enhanced metabolite-producing saccharomyces cerevisiae |
CN110914434A (zh) | 2017-07-11 | 2020-03-24 | 安迪苏法国联合股份有限公司 | 苏氨酸生产酵母 |
EP3652319B1 (en) | 2017-07-11 | 2023-10-25 | Adisseo France S.A.S. | Methionine-producing yeast |
CN110869488B (zh) | 2017-07-11 | 2024-04-05 | 安迪苏法国联合股份有限公司 | 增强型代谢物生产酵母 |
EP3428282A1 (en) | 2017-07-11 | 2019-01-16 | Alderys | Ectoine-producing yeast |
KR101866884B1 (ko) | 2018-01-29 | 2018-06-14 | 씨제이제일제당(주) | 사료 첨가제용 조성물 및 이를 포함하는 동물 사료 조성물 |
CN110684811B (zh) * | 2019-11-13 | 2021-06-29 | 浙江工业大学 | 一种提高甲硫氨酸产量的方法 |
CN113388630B (zh) * | 2020-03-11 | 2022-07-26 | 华东理工大学 | 合成l-半胱氨酸的重组大肠杆菌的构建方法及其应用 |
Family Cites Families (33)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3071518A (en) * | 1960-02-09 | 1963-01-01 | Cons Lab Inc | Method of increasing metabolic product yield of organisms |
JPS51151391A (en) | 1975-06-19 | 1976-12-25 | Ajinomoto Co Inc | Process for preparing l-sulfur- containing amino acids |
JPS56144092A (en) * | 1980-04-14 | 1981-11-10 | Ajinomoto Co Inc | Preparation of l-methionine by fermentation |
JPS61242589A (ja) | 1985-04-22 | 1986-10-28 | Mitsui Toatsu Chem Inc | L−含硫アミノ酸の製造方法 |
CA1299128C (en) | 1986-11-19 | 1992-04-21 | Tooru Miyahara | Method of producing l-cystine |
JPH02222692A (ja) | 1989-02-23 | 1990-09-05 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | L―含硫アミノ酸の製造法 |
EP0519113A1 (en) * | 1991-06-21 | 1992-12-23 | Ajinomoto Co., Inc. | Bacterial strains having high productivity of an amino acid and method of constructing these strains |
FR2678601B1 (fr) | 1991-07-01 | 1993-10-22 | Commissariat Energie Atomique | Procede de preparation de sulfures et d'acides amines marques au soufre 35. |
WO1993017112A1 (en) * | 1992-02-20 | 1993-09-02 | Genencor International, Inc. | Biosynthesis of methionine using a reduced source of sulfur |
FR2693207B1 (fr) | 1992-07-03 | 1994-09-30 | Orsan | Souche de levure permettant la co-expression d'une activité mono-oxygénase de cytochrome P450 hétérologue et d'une NADPH-cytochrome P450-réductase endogène ou hétérologue et son utilisation à des fins de bioconversion. |
JP3514507B2 (ja) | 1994-05-13 | 2004-03-31 | サントリー株式会社 | 硫化水素生成が低減された酵母とこの酵母を用いたビール製造法 |
DE19539952A1 (de) | 1995-10-26 | 1997-04-30 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur Herstellung von O-Acetylserin, L-Cystein und L-Cystein-verwandten Produkten |
DE19726083A1 (de) | 1997-06-19 | 1998-12-24 | Consortium Elektrochem Ind | Mikroorganismen und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Cystein, L-Cystin, N-Acetyl-Serin oder Thiazolidinderivaten |
EP1108053A1 (de) | 1998-08-26 | 2001-06-20 | Lonza A.G. | Verfahren zur herstellung von (2r)-piperidinderivaten |
US6368793B1 (en) | 1998-10-14 | 2002-04-09 | Microgenomics, Inc. | Metabolic selection methods |
JP2000157267A (ja) | 1998-11-24 | 2000-06-13 | Ajinomoto Co Inc | 変異型metJ遺伝子及びL−メチオニンの製造法 |
DE19856136C2 (de) | 1998-12-04 | 2002-10-24 | Pasteur Institut | Verfahren und Vorrichtung zur Selektion beschleunigter Proliferation lebender Zellen in Suspension |
KR100309327B1 (ko) | 1999-05-06 | 2001-09-29 | 담철근 | 아라비노스 이성화효소를 포함한 재조합 대장균주와 이를 이용한타가토스의 생산방법 |
DE19924364A1 (de) | 1999-05-27 | 2000-11-30 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien |
JP2003169674A (ja) | 1999-07-02 | 2003-06-17 | Ajinomoto Co Inc | L−リジンの製造法 |
DE19949579C1 (de) | 1999-10-14 | 2000-11-16 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Cystein oder L-Cystein-Derivaten |
JP4380029B2 (ja) * | 2000-07-05 | 2009-12-09 | 味の素株式会社 | 微生物を利用した物質の製造法 |
DE10109690A1 (de) * | 2000-09-02 | 2002-03-14 | Degussa | Neue für das metY-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
DE10136986A1 (de) | 2000-09-03 | 2002-03-21 | Degussa | Für Gene cysD, cysN, cysK, cysE und cysH kodierende Nukleotidsequenzen |
US20050124010A1 (en) * | 2000-09-30 | 2005-06-09 | Short Jay M. | Whole cell engineering by mutagenizing a substantial portion of a starting genome combining mutations and optionally repeating |
WO2002046451A2 (en) | 2000-10-26 | 2002-06-13 | Paradigm Genetics, Inc. | Methods for the identification of inhibitors of cysteine syhthase in plants |
EP1345714A1 (en) * | 2000-12-22 | 2003-09-24 | Basf Aktiengesellschaft | Genes of corynebacterium |
DE10104722A1 (de) | 2001-02-02 | 2002-08-14 | Ipk Inst Fuer Pflanzengenetik | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Cystein, Cystin und Glutathion |
US6579705B2 (en) | 2001-04-04 | 2003-06-17 | Consortium Fur Elektrochemische Industrie Gmbh | Process for preparing non-proteinogenic L-amino acids |
FR2823219B1 (fr) | 2001-04-10 | 2003-07-04 | Pasteur Institut | Mutants de la desoxycytidine kinase possedant une activite enzymatique elargie |
EP1404846B1 (en) | 2001-07-06 | 2013-09-11 | Institut Pasteur | Method for obtaining cells with new properties |
DE10222858A1 (de) * | 2002-05-23 | 2003-12-04 | Basf Ag | Verfahren zur fermentativen Herstellung schwefelhaltiger Feinchemikalien |
EP1597364B1 (fr) * | 2003-02-18 | 2013-07-24 | Metabolic Explorer | Procede de preparation de microorganismes evolues permettant la creation ou la modification de voies metaboliques |
-
2004
- 2004-02-17 EP EP04711626.4A patent/EP1597364B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 2004-02-17 BR BRPI0407600-1A patent/BRPI0407600A/pt not_active IP Right Cessation
- 2004-02-17 EP EP10183261A patent/EP2348107A3/fr not_active Withdrawn
- 2004-02-17 WO PCT/FR2004/000354 patent/WO2004076659A2/fr active Application Filing
- 2004-02-17 JP JP2006502150A patent/JP2006517796A/ja active Pending
- 2004-02-17 MX MXPA05008857A patent/MXPA05008857A/es unknown
- 2004-02-17 US US10/546,139 patent/US20060270013A1/en not_active Abandoned
- 2004-02-18 US US10/781,499 patent/US7745195B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2019528498A (ja) * | 2016-07-06 | 2019-10-10 | ヨーロピアン モレキュラー バイオロジー ラボラトリーEuropean Molecular Biology Laboratory | 適応実験室進化のための方法 |
JP7181797B2 (ja) | 2016-07-06 | 2022-12-01 | ヨーロピアン モレキュラー バイオロジー ラボラトリー | 適応実験室進化のための方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1597364A2 (fr) | 2005-11-23 |
WO2004076659A3 (fr) | 2004-12-16 |
WO2004076659A2 (fr) | 2004-09-10 |
US7745195B2 (en) | 2010-06-29 |
EP1597364B1 (fr) | 2013-07-24 |
MXPA05008857A (es) | 2006-03-09 |
EP2348107A2 (fr) | 2011-07-27 |
EP2348107A3 (fr) | 2012-07-11 |
BRPI0407600A (pt) | 2006-02-14 |
US20050054060A1 (en) | 2005-03-10 |
US20060270013A1 (en) | 2006-11-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2006517796A (ja) | 代謝経路の生成または改変を可能とする進化した微生物の生産方法 | |
CN104862352B (zh) | 生产o-磷酸丝氨酸的微生物和使用该微生物由o-磷酸丝氨酸生产l-半胱氨酸或其衍生物的方法 | |
US9493801B2 (en) | Compositions and methods of producing methionine | |
KR101827230B1 (ko) | 디올의 제조 방법 | |
DK2290051T3 (en) | A microorganism producing O-acetylhomoserine, and the method of producing O-acetylhomoserine, using the microorganism | |
JP2017169576A (ja) | メチオニン生産のためのnadphの供給増加 | |
CN109055289B (zh) | 一种高产l-甲硫氨酸的重组大肠杆菌及其应用 | |
JP2008529485A (ja) | 低いγ脱離活性を有する発現酵素を含む微生物 | |
JP2007517517A (ja) | 1,2−プロパンジオールの産生のための発展型微生物 | |
WO2019011948A1 (en) | IMPROVED METABOLITE PRODUCTION YEAST | |
EP3652321B1 (en) | Enhanced metabolite-producing saccharomyces cerevisiae | |
KR101770150B1 (ko) | 메티오닌 히드록시 유사체 (mha)의 발효 생산 | |
JP7511698B2 (ja) | メチオニン生産酵母 | |
WO2020264061A1 (en) | Engineered biosynthetic pathways for production of cystathionine by fermentation | |
WO2019011946A1 (en) | YEAST PRODUCING THREONINE | |
FR2862067A1 (fr) | Procede de preparation de microorganismes evolues permettant la creation ou la modification de voies metaboliques | |
Takors et al. | Platform Engineering of Corynebacterium | |
MXPA06007929A (en) | Advanced microorganism for producing 1,2-propanediol |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090413 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090707 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090714 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20091222 |