JPH02222692A - Ｌ―含硫アミノ酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、微生物を利用してＬ−含硫アミノ酸とくにＬ
−システィンおよび／またはし一シスチンを製造する方
法に関する。

Ｌ−システィン、Ｌ−シスチンなどのＬ−含硫アミノ酸
は化粧品、医薬品、食品添加物として有用である。

従来の技術 従来のし一システィンおよび／またはＬ−シスチンの酵
素的合成法としては、ブレビバクテリウム属、コリネバ
クテリウム属、ミクロバクテリウム属またはアースロバ
フタ−属に属し、Ｓ−メチルシスティンスルフオキシド
、２−チアゾールアラニンまたはエチオニンに対する耐
性を有する微生物を用いる方法（特公昭５３−１４６３
７号公報）、サルモネラ・チフィムリウムの粗抽出液中
のＯ−アセチルセリンスルフヒドラーゼ活性の作用によ
って、０−アセチル−Ｌ−セリンと水硫化ナトリウムか
ら合成する方法〔バイオテクノロジー・アンド・バイオ
エンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄ
　８ｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）　３０　、８７５　
（１９８７）　］　、β−置β−置換ソラニ属硫化物か
らシスティン・デスルフヒドラーゼを用いて合成する方
法（特公昭５７−２１３１１号公報）、Ｌ−セリンと金
属硫化物などからトリプトファン・シンターゼを用いて
合成する方法（特開昭６２−１４３６９０号公報）など
が知られている。

発明が解決しようとする課題 り一含硫アミノ酸とくにＬ−システィンおよび／または
Ｌ−シスチンは近年ますます需要が増大しており、Ｌ−
念硫アミノ酸をより効率よく製造するためにその製造法
の改良は常に求められている。

課Ｈを解決するための手段 ］リネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
する微生物について検討の結果、０−アセチルセリンス
ルフヒドラーゼ活性を有する微生物が見出され、該微生
物の菌体を利用すれば効率よくＬ−システィンが製造で
きることが見出された。

本発明によれば、コリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属に属し、０−アセチルセリンスルフヒドラ
ーゼ活性を有する微生物の菌体、培養物またはその処理
物の存在下、０−アセチル−Ｌ−セリンと金属硫化物、
金属水硫化物または硫化水素とを反応させ、反応物中に
Ｌ−含硫アミノ酸を生成蓄積させ、該反応物からＬ−含
硫アミノ酸を採取することによりＬ−含硫アミノ酸を製
造することができる。

以下に本発明の詳細な説明する。

本発明に用いられる微生物としては、コリネバクテリウ
ム属またはブレビバクテリウム属に属し、Ｏ−アセチル
セリンスルフヒドラーゼ活性を有する微生物ならばいか
なる微生物でも使用できる。

また、０−アセチルセリンスルフヒドラーゼ活性を有す
る限り、紫外線照射、Ｘ線照射あるいは変異物質による
変異処理によって変異させた菌株も用いることができる
。具体的に好適な例としては、コリネバクテリウム・グ
ルタミクムＡＴＣ［１３０３２、＾ＴＣＣ１３０３２よ
り変異処理によって得られたトリプトファン・シンター
ゼ欠損株ＴＡ１０８（ＦＥｌｌ＆ｌ　ＢＰ−１８４６）
あるいはブレビバクテリウム・フラブムＡＴＣＣ１３８
２６などがあげられる。

コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
する微生物の培養は、細菌の培養に通常用いられる合成
ないし天然培地を用いておこなうことができる。培地中
の炭素源としてはグルコース、フラクトース、シューク
ロース、マルトース、マンノース、澱粉、澱粉加水分解
物あるいは糖蜜などの炭水化物、ピルビン酸、フマール
酸、乳酸あるいは酢酸などの各種有機酸が使用できる。

さらに菌の資化性によってアルコール類なども用いられ
る。

窒素源としては、アンモニアあるいは塩化アンモニウム
、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニ
ウムなどの各種無機および有機アンモニウム塩類、尿素
、ペプトン、ＮＺ−アミン、肉エキス、酵母エキス、コ
ーン・スチーブ・リカ、カゼイン加水分解物、フィツシ
ュミールあるいはその消化物、脱脂大豆粕あるいはその
消化物、蝿加水分解物などの窒素含有有機物などが使用
可能である。

無機物としては、リン酸第−水素カリウム、リン酸第二
水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、
硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸
マンガンあるいは炭酸カルシウムなどが使用できる。

微生物の生育に必要なビタミン、アミノ酸源などは、前
記した他の培地成分によって培地に供給されればとくに
加えなくてもよい。

培養は振盪培養あるいは通気攪拌培養などの好気的条件
下でおこなう。培養温度は一般に２０〜４０℃が好適で
ある。培養中の培地のｐＨは中性付近に維持するのが望
ましい。培養期間は通常１〜５日間である。

このようにして得られた培養物あるいは培養物から遠心
分離などによって採取された生菌体、その乾燥菌体、生
菌体を磨砕、自己消化あるいは音波処理などを施すこと
により得られる菌体処理物、これらの菌体の抽出物より
得られる酵素含有物あるいは菌体もしくは酵素含有物を
固定化した菌体処理物などを、０−アセチルセリンスル
フヒドラーゼの酵素源として用いることができる。

菌体、培養物またはその処理物の存在下、〇−アセチル
ーし一セリンと金属硫化物、金属水硫化物または硫化水
素とからＬ−含硫アミノ酸を生成させる反応は、微生物
の菌体、培養物またはそれらの処理物と、０−アセチル
−し−セリンおよび金属硫化物、金属水硫化物または硫
化水素とを含有する液とを混合する方法が好ましい。

反応液中の０−アセチル−Ｌ−セリンおよび硫化物など
の基質濃度はとくに制限はないが、一般には液中濃度と
して０．１〜２０重量％の範囲で使用する。また反応に
際しては、基質の他に補酵素であるピリドキサールリン
酸を添加することが好ましい。ピリドキサールリン酸の
添加量としては０．０１ｍＭ〜１０ｍＭが好適である。

金属硫化物としては、硫化ナトリウム、硫化カリウムな
どがあげられ、金属水硫化物としては水硫化す）　ＩＪ
ウムなどがあげられる。

反応液中に加える菌体、培養物またはその処理物の量は
菌体の処理方法によって異なるがとくに制限はなく、基
質の濃度、酵素の活性、その他の種々な条件によって適
宜変更できる。

菌体を酵素源として用いる場合、界面活性剤または有機
溶剤を反応液中に添加することにより、より収率よく生
成物を得ることができる。

界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・ステアリル
アミン（たとえばナイミーンＳ−２１５、日本油脂社製
）、セチルトリメチルアンモニウムブロマイドなどのカ
チオン性界面活性剤、ナトリウムオレイルアミド硫酸な
どのアニオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビ
タン・モノステアレート　（たとえばノニオンＳＴ２２
１．日本油脂社製）などの非イオン性界面活性剤など、
〇−アセチルーＬ〜セリンと金属硫化物、金属水硫化物
または硫化水素からし一念硫アミノ酸の生成を促進する
ものならばいずれでも使用でき、これらは通常１＝５０
ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜２０　ｍｇ／ｍ＋の濃度で
用いられる。

有機溶剤としては、トルエン、キシレン、アセトン、脂
肪族アルコール、ベンゼンあるいは酢酸エチルなどを用
いることができ、これらは０．１〜５０ｍ／ｍｌ、好ま
しくは１〜２０　、ｍ／ｍｌの濃度で用いられる。

また、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属に属する微生物によるグルタミン酸発酵において、そ
の発酵生産物の収量を向上させるこ上が知られている添
加物、たとえばペニシリンなどを添加して培養し得られ
た菌体を用いる場合には、実施例４に示されるように界
面活性剤または有機溶剤を添加しなくても良好な収量が
得られる。

反応は通常１０〜５０℃、ｐＨ６〜１０の、範囲でおこ
なわれ、１〜７０時間で完了する。

反応液からのＬ−システィンおよび／またはＬ−シスチ
ンの分離精製は通常酵素反応、発酵液からアミノ酸の精
製に用いられる方法を用いておこなうことができる。た
とえば、反応終了後に反応液に通気をおこなえばＬ−シ
スティンは酸化されてＬ−シスチンとなって沈殿するの
で容易に単離できる。このようにして得られたし一シス
チンは電気分解などによる還元により容易にＬ−システ
ィンとなる。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例１ 種培地〔ブイヨン２０ｇ／Ｌ酵母エキス５ｇ／ｌ、グル
コース５ｇ／ｊ！の組成からなり、ｐＨ７，２に調整し
た培地〕　５ｍｌ中でコリネバクテリウム・グルタミク
ムＡＴＣＣ１３０３２を３０℃、２４時間培養した。

得られた培養物２ｍｌを、１１容振盪フラスコに分注し
滅菌した２００ｍ１の３３Ｍ培地〔グルコースＩ　Ｏｇ
／Ｌ　ＮＨ，（１・４ｇ／ｆ！、尿素２ｇ／β、酵母エ
キスｌ　ｇ／　Ｉｌ、　ＫＨ２Ｐ　０４１　ｇ／ｌ、に
２ＨＰＯ４１，ｇ／１．、ＭｇＣＬ・６Ｈ７００，４ｇ
／Ｒ１Ｆｅ５０．”７Ｈ２０１０ｍｇ／ｊ！、Ｍｎ５Ｏ
，・４−’６８２０　０．２ｍｇ／ｌ、Ｚｎ５Ｏ。

−ＩＨ，００，９ｍｇ／Ｒ，Ｃｕ５Ｏ，−５８２００、
４ｍｇ／　１、Ｎａ、Ｂ、Ｏｔ”　１０Ｈｔ０　０．０
９ｍｇ／　Ｉｌ、　　（ＮＨ４）ＩＩＭＯｑＯｘ＜　・
４　ＨｘＯＯ，０４ｍｇ／Ｉｔ、ビオチン３０■／Ｒ１
サイアミン塩酸塩ｌｔａｇ／ｉの組成からなりｐ　Ｈ７
，２に調整した培地］に接種し、３０℃で１５時間振盪
培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集
め、生理食塩水で洗浄後、再度遠心分離し湿菌体を集め
た。

得られた湿菌体０．１ｇを、０−アセチル−し−セリン
５．３ｍｇ、水硫化ナトリウム２．８ｍｇ、ピリドキサ
ールリン酸０．２７ｍｇ、キシレン１０ｍｇを含む１０
０ｍＭリン酸カリウム緩衝液１ｍ１２（ｐＨ７，０）に
加え、２５℃で２時間反応させた。

反応液中のし一システィンおよび／またはＬ−シスチン
の量をガイトンデの方法〔バイオケミカル・ジャーナル
（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　−Ｊ−、’）”Ｔ’０４　、６２
６　（１９６７）　：１により定量したところ、３．３
ｍｇ（システィン換算）のし−システィンおよび／また
はＬ−シスチン生成がＳ忍められた。

実施例２ コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
より変異処理によって得られたトリブトファンシターゼ
欠損株ＴＡ　１０８　（ＦＢＲＭ　ＢＰ−１８４６）を
、３３Ｍ培地ニドリブ）　７　ｙ　ン１００　ｍｇ／ｌ
加えた培地で培養をおこなう以外は実施例１と同様に培
養した。得られた湿菌体を用いて実施例１と同様な反応
をおこなったところ、３．　Ｏａ＋ｇ（システィン換算
）のし−システィンおよび／またはＬ−シスチンの生成
が認められた。

実施例３ ブレビバクテリウム・フラブムＡ　Ｔ　ＣＣ１３８２６
を実施例１と同様な方法で培養し、得られた湿菌体を用
いて実施例１と同様な反応をおこなった。

その結果、３．２ｍｇ（システィン換算）のＬ−システ
ィンおよび／またはＬ−シスチンの生成が認められた。

実施例４ 種培地〔グルコース４０ｇ／ｌ、ポリペプトン２０ｇ／
Ｉｔ、ＫＨ，Ｐｏ、１．５ｇ／Ｉｔ、に、ＨＰｏ。

０．５ｇ／ｌ、Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏｓ・７　ＨｚＯ０，５ｇ
／β、ビオチン３０ｇｇ／Ｊ！、尿素３ｇ／ｌの組成か
らなりｐ　Ｈ７，２に調整した培地３５ｍｌ中でコリネ
バクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２を３０
℃、２４時間培養した。

得られた培養物４ｍｌを、３００ｍ１容三角フラスコに
分注し滅菌した２０ｍ１の廃糖蜜培地〔廃糖蜜６０ｇ／
ｉ　（グルコース換算）、（ＮＨ，）、ＳＯ。

２ｇ／Ｉｌ、ＫＨ２ＰＯ４１ｇ／Ｉｔ、に２ＨＰＯ４０
，５ｇ／ｆＳＭｇＳＯ＜・７　Ｈ２Ｏ０，５ｇ／　ＲＦ
　ｅ　ＳＯ４・７　Ｈ２Ｏ０，２ｍｇ／ｊ！、Ｃｕ　Ｓ
Ｏａ・５Ｈ＝Ｏｌａｇ／ｌ、Ｍｎ　ＳＯ４・４　Ｈ２Ｏ
１０Ｉｎｇ／ｉ、サイアミン塩酸塩ｌｆｆ１ｇ／ｊ！、
尿素５ｇ／ｌの組成からなり、ｐＨ６，５に調整した培
地〕に接種し、ペニシリンＧを５単位／　ｍ　ｌ添加し
て３０℃で、３０日間振盪培養をおこなった。培養中、
培養液をｐＨ６〜８に保つため、培養開始から１２時間
目と２０時間目に１０％尿素液を１ｍｌずつ添加した。

（このとき培養土浦中には２７．３ｍｇ／ｍｌのグルタ
ミン酸が蓄積した。） 培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集め、生理食
塩水で洗浄後再度遠心分離し、湿菌体（ａ）を得た。

一方、ペニシリンＧを添加しない以外は上記と同様に培
養し調整された湿菌体（ｂ）を用意した。

両温菌体を用い、反応時間を１０分間とした以外は実施
例１と同様な条件でそれぞれ反応をおこなった。キシレ
ン１０ｍｇ添加および無添加の条件で反応をおこなった
ときのし一システィンおよび／またはＬ−シスチンの生
成量（システィン換算）を第１表に示す。

第　　　　１　　　　表 （ａ） ０．５ １．８ ら） ２．９ ３．０ 発明の効果 本発明によれば、収率よくＬ−含硫アミノ酸とくにＬ−
システィンおよび／またはＬ−シスチンを製造すること
ができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
   し、Ｏ−アセチルセリンスルフヒドラーゼ活性を有する
   微生物の菌体、培養物またはその処理物の存在下、Ｏ−
   アセチル−Ｌ−セリンと金属硫化物、金属水硫化物また
   は硫化水素とを反応させ、反応物中にＬ−含硫アミノ酸
   を生成蓄積させ、該反応物からＬ−含硫アミノ酸を採取
   することを特徴とするＬ−含硫アミノ酸の製造法。