KR100469592B1

KR100469592B1 - 비단백질성 ｌ-아미노산의 제조방법

Info

Publication number: KR100469592B1
Application number: KR10-2002-0017373A
Authority: KR
Inventors: 마이에르토마스; 가에베르트카르스텐
Original assignee: 콘소티움 퓌르 에렉트로헤미쉐 인두스트리 게엠베하
Priority date: 2001-04-04
Filing date: 2002-03-29
Publication date: 2005-02-02
Also published as: EP1247869B1; HU0201152D0; MXPA02003402A; JP2002315595A; RU2002108336A; AU773173B2; KR20020079402A; CN1200110C; SK4332002A3; DE50208306D1; US20020177196A1; HUP0201152A3; US6579705B2; EP1247869A1; JP2006325607A; AU3140702A; CA2379701A1; JP4240900B2; PL353085A1; HUP0201152A2

Abstract

O-아세틸-L-세린과 친핵화합물(nucleophilic compound)을 반응시킴과 동시에 촉매로서 O-아세틸-L-세린 SH효소(sulfhydrylase)를 사용하여 비단백질성 L-아미노산을 얻는 효소에 의한 바이오형질전환(biotransformation)에 따르는 비단백질성 L-아미노산의 제조방법으로 pH 5.0~7.4의 범위내에서 그 방법을 실시한다.

Description

비단백질성 Ｌ-아미노산의 제조방법{process for preparing non-proteinogenic Ｌ-amino acids}

본 발명은 효소에 의한 바이오형질전환에 따르는 비단백질성 L-아미노산의 제조방법에 관한 것이다.

비단백질성 아미노산은 단백질 생합성의 구성블록으로 그자체 사용되지 아니하여 20종의 단백질성 아미노산과 명백하게 분리(demarcation)되도록 하는 아미노산이다.

본 발명의 기술적인 의미에서, 여러가지의 단백질에서 발생하는 대단히 희소한 아미노산 L-셀레노시스테인은 비단백질성 아미노산으로 분류된다.

비단백질성 아미노산은 예로서 약학 및 농업분야의 활성화합물을 제조하는 관심있는 화합물이다.

이들의 비단백질성 아미노산은 활성화합물로서 또는 활성화합물의 일부로서 분자의태(molecular mimicry)의 타입으로 자연아미노산(natural amino acids)의 구조체를 모방할 수 있어 예로서 수용체 상호작용(receptor interactions)의 경우 자연반응(natural veaction)을 변조(modulation)할 수 있다.

또, 키랄화합물로서 이들의 화합물은 일반적으로 "키랄풀(chiral pool)"의 범위내에서 합성구축블록(synthetic building blocks)으로 사용할 수 있다.

거울상 이성질체 순도형태(enantiomerically pure form)의 비단백질성 아미노산의 제조방법은 대부분 합성을 기준으로 하며, 이들의 합성은 동화작용을 하고, 또 통상적으로 하나의 소정의 화합물에 접근하도록 할 뿐이다.

다만 수종의 방법에 의해 서로 다른 화합물을 출발화합물의 간단한 치환에 의해 제조하도록 한다.

대부분의 경우, 합성은 화학적인 합성으로, 이 합성은 키랄구축블록에서 통상부분적으로 처리하였다.

또 다른 방법에서는 라세미체(racemates)의 화학적 합성과 효소에 의해 자주 실시하는 라세미체분할(racemate resolution)을 조합하는 방법이 있다.

또, 프로키랄화합물(prochiral compounds)을 사용하며 비단백질성 아미노산이 입체선택성 합성을 하도록 하는 효소에 의한 방법은 이미 설명한 바 있다.

따라서, 아미노도너(amino donor)로서 L-글루타민산을 사용하여 α-케토산에서 여러가지의 비단백질성 아미노산을 제조하는 아미노기 전이효소(transaminases)를 사용할 수 있다(참고문헌: Taylor 등; 1998, TIBTECH 16: 412-418).

또 다른 예로는 류신탈수소효소(leucine dehydrogenase)를 사용하는 L-t-류신의 합성이 있다(참고문헌: Drauz 1997,Chimia 51: 310-314).

특허문헌으로 DE 10046934 명세서(본원 출원인과 동일한 출원인에 의해2000.09.21자로 특허등록을 받았음)에서는 미생물의 직접 발효에 의한 비단백질성 아미노산의 간단한 제조방법에 대하여 기재되어있다.

이 제조방법에서는 미생물을 사용하여, 미생물의 시스테인 대사의 조절을 해제시켜 레벨이 높은 O-아세틸-L-세린을 공급하였다.

시스테인 대사에서 이화합물은 L-시스테인의 생합성 전구물질로 사용하였다.

후자, 즉 L-시스테인의 생합성 전구물질은 티올래디컬로 β위치에 있는 아세테이트기를 치환시켜 생성하였다.

이 반응은 β치환으로, O-아세틸-L-세린 SH효소(sulfhydrylase)분류[EC 4.2.99.8]의 효소에 의해 촉진시켰다.

소정의 화합물분류(티올, 아졸 및/또는 이소옥사졸디논)에 속하는 친핵물질을 발효중에 공급할 경우, 이들의 화합물이 β치환반응에 도입됨으로 비단백질성 L-아미노산이 제조된다.

이와같이, 제조한 아미노산의 각각의 래디컬의 구조는 공급하는 친핵화합물에 의해 좌우된다.

이 방법은 친핵화합물 그 자체 또는 그 얻어진 아미노산이 미생물의 대사에 대하여 독성효과를 유도해 낼 수 있기 때문에, 공급하는 친핵화합물을 너무 많은 양으로 계량하여 혼합할 필요가 없다는 기술적인 문제점이 있다.

특히, 이 방법은 레독스(redox)활성물질로서 이들의 물질이 고농도에서 독성을 갖고 있기때문에 여러가지의 티올화합물에 처리하였다.

또, 발효방법에서 티올화합물의 사용에는 기술적으로 문제점이 극히 많다.

그 이유는 발효조를 집중적으로 통기시켰을때 티올화합물은 산화경향이 있고 기계적 구성이 없을 경우 불쾌한 냄새를 다량으로 발생하기 때문이다.

아지드 또는 시아나이드 화합물은 독성이 높기 때문에 공급이 불가능하며, 이들의 화합물은 O-아세틸-L-세린 SH효소를 사용할 경우 β치환의 도입은 공지되어있다(참고문헌: Flint등, 1996, J. Biol. Chem. 271: 16053-16067).

본 발명의 목적은 친핵화합물, 특히 높은 량으로 혼합하는 독성화합물을 사용할 수 있도록 하는 비단백질성 아미노산의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 목적은 O-아세틸-L-세린를 친핵화합물과 반응시킴과 동시에 촉매로서 O-아세틸-L-세린 SH효소를 사용하여 비단백질성 L-아미노산을 얻은 효소에 의한 바이오 형질전환방법(biotransformation method)에서 처리를 pH 5.0 ~ 7.4에서 실시함을 특징으로 하는 방법에 의해 달성한다.

이 발명에 의해 다량의 비단백질성의 거울상이성질체순도를 가진 L-아미노산 (일부를 새로운 화합물임)을 공업적으로 합성할 수 있다.

O-아세틸-L-세린 SH효소는 공지되어있다.

이들의 SH효소는 대단히 넓은 범위의 각종의 식물체 및 미생물에서 분리하였다.

최대범위로 연구조사한 이들의 SH효소에는 살모넬라 타이피무륨(Salmonella typhimurium)으로 부터 분리시킨 그 대응하는 세균효소(bacterial enzymes)가 있다.

그 유기체중에서, 2종의 O-아세틸-L-세린 SH효소가 존재하여, 각각 OASS-A 와 OASS-B로 지정하였다.

그 관련유전자는 동일하게 공지되어있으며, 각각 CysK와 CysM으로 칭하였다.

두효소가 대단히 유사한 반응메카니즘을 가지나, 이들의 아미노산서열을 기준으로 하여 볼때 45%의 동일성을 나타낼 뿐이다.

OASS-B(CysM)은 CASS-A(CysK)와 비교하여 O-아세틸-L-세린과 티오설페이트의 반응을 촉진시켜 S-설포시스테인을 얻을수 있다는 연구보고가 있다.

이 반응은 티오설페이트가 유일한 황원(sulfur source)으로 될 경우 그 세균성장에 중요한 역할을 한다.

또, 여러가지의 유기체에서 O-아세틸-L-세린유전자의 대비에서는 2종의 계통군(phylogenetic groups)이 존재하는 것으로 나타내었다(키타바타케등, 2000, J. Bacteriol. 192: 143-145).

살모넬라타이피무륨 CysK와 에쉐리키아콜리(Escherichia coli) CysK는 O-아세틸-L-세린 SH효소를 함께 가진 대군(large groups)을 다른 진정세균 (Eubacteria), 메탄발생아캐아(methanogenic Archaea) 및 식물(plants)에서 형성한다.

대비할때, 살모넬라타이무륨 CysM과 에쉐리키아콜리 CysM은친온열아캐아(hyperthermophilic Archaea)[즉, 피로콕코커스(Pyrococcus), 설폴로버스(Sulfolobus) 및 서모플라즈마(thermoplasma)]의 O-아세틸-L-세린 SH효소와 함께 범위가 극히 협소한 계통군내에 존재한다.

본 발명의 범위내에서 O-아세틸-L-세린 SH효소는 O-아세틸-L-세린과 설파이드로부터 L-시스테인의 합성을 촉진시킬 수 있도록 하는데 그 특징이 있다.

따라서, CysM-관련 및 CysK-관련효소는 본 발명의 범위내에서 O-아세틸-L-세린 SH효소이다.

수종의 참고문헌에서는 CysK 그룹(group)에서 O-아세틸-L-세린 SH효소가 비교적 폭넓은 기재 스펙트럼(substrate spectrum)이 기재되어 있으나(이케가미 및 무라코시, 1994, Phytochemistry 35:1089-1104; Flint 등, 1996. J. Biol. Chem. 271:16053-16067), 비단백질성 아미노산의 제조용으로 O-아세틸-L-세린 SH효소의 공업적인 사용 가능성에 대하여 종래에는 깊이있게 고려된바 없다.

비단백질성 아미노산의 효소에 의한 제조를 공업적으로 실시하기 위한 O-아세틸-L-세린 SH효소의 사용방법에서 종래에 기술적인 문제가 되는 중요한 이유는 O-아세틸-L-세린 SH효소의 활성범위에 대응하는 pH 범위내에서 O-아세틸-L-세린이 불안정하다는데 있다.

O-아세틸-L-세린은 pH에 따라 N-아세틸-L-세린으로 이성화한다.

반응은 비가역적이며, 예로서 pH 7.6에서 가장 신속하게 속도 1%×min^-1를 가진다.

반응속도는 pH가 낮아짐에 따라 저하되어 O-아세틸-L-세린 화합물은 예로서 pH 4.0에서 안정성이 있다.

반응메카니즘은 아실래디컬의 카르보닐탄소상에서 탈프로톤아미노기(deprotonated amino group)의 분자간의 친핵공격(intra molecular, nucleophilic attack)을 기준으로 한다(참고문헌:Tai등, 1995, Biochemistry 34:12311-12322). 대비할때, O-아세틸-L-세린 SH효소의 최적 pH는 pH 8.0의 영역으로(Ikegami & Murakoshi, 1994, Phytochemistry 35:12311-12322), O-아세틸-L-세린의 이성화반응에서 가장 바람직하지 않은 영역이다.

이와같은 이유에서, 이케가미(Ikegami)와 무라코시(Murakoshi)는 O-아세틸-L-세린, 친핵 화합물, 피리독살 포스페이트(pyridoxal phosphate)및 금속이온(Ga²⁺가 바람직함)을 사용하여 비단백질성 아미노산의 생의태합성방법 (biomimetic synthesis)을 제안하였다.

이 반응은 pH 범위 3.5~4.5에서 실시할수 있다.

반응결과, O-아세틸-L-세린의 안정성을 명백하게 보장받을수 있었다.

그러나, 최대수율<45%로서, 이 방법의 효율은 가장 높지 않다.

효소에 의한 합성방법과 비교할때 중요한 결점은 거울상이성질선택성 (enantioselectivity)의 결여(lackness)에 있다.

따라서, 본 발명에 의한 방법에 따라 달성되는 또 다른 목적은 거울상이성질체 순도를 가진 효소에 의한 비단백질성 아미노산의 제조방법을 제공한다.

이 방법에서는 O-아세틸-L-세린 안정성과 최적의 효소활성에 대한 불화합성(불(不和合性:incompatibility)에도 불구하고 레벨이 낮은 이성화반응과 관련하여 유효한 효소수율(>>45%)을 명백하게 보장받을수 있다.

본 발명의 방법에서는 반응을 O-아세틸-L-세린 SH효소의 최적 pH 이하로 실시하며 그 효소를 상당히 많은 용량으로 사용하는데 특징이 있기 때문에 본 발명의 방법에 의해 그 목적을 달성할 수 있다.

본 발명의 범위내에서 비단백질성 아미노산의 제조에서의 pH 범위는 pH 5.0~7.4이다.

그 pH 범위는 pH 6.0~7.1이 바람직하다.

그 pH 범위는 pH 6.0~6.99가 특히 바람직하다.

그 pH는 아세트산의 생성을 방지하기 위하여 pH의 활성을 조절함으로써 일정하게 유지하는것이 바람직하다.

pH의 활성조절은 측정 제어장치에 의해 바람직하게 얻어지며, 이 측정제어장치는 pH가 소정의 값에서 편차가 있을때 알칼리성 도는 산성으로 측정하여 pH를 재설정한다.

본 발명에 의해 사용되는 방법과 달리, 앞서 인용한 참고문헌에서 기재되어 있는 비단백질성 아미노산을 합성하는데 있어서 O-아세틸-L-세린 SH효소를 사용하는 반응은 O-아세틸-L-세린 SH효소의 최석 pH 영역에서 pH의 활성조절없이 분석화학적으로 실시하였다.

또, 이들의 반응은 Cysk 효소에 속하는 계통군의 효소를 사용하였다.

따라서, 본 발명은 O-아세틸-L-세린과 친핵화합물을 반응시킴과 동시에 촉매로서 O-아세틸-L-세린 SH효소를 사용하여 비단백질성 L-아미노산을 얻는 비단백질성 L-아미노산의 제조방법에 있어서 O-아세틸-L-세린 SH효소로서 CysM 를 사용함을 특징으로 하는 제조방법에 관한 것이다.

그 효소의 적합한 높은 용량에 의해, 효소반응의 최적 pH 밖에서도 만족스러운 수율을 얻을수 있다.

O-아세틸-L-세린 SH효소의 용량 활성 Acys 가 혼합액중에서 최소 2 단위/㎖일때 본 발명의 방법으로 이와같은 효소농도를 얻는 것이 바람직하다.

그 활성은 2~200 단위/㎖가 특히 바람직하다.

그 활성은 실시예 3의 테스트를 사용하여 측정한다.

본 발명의 처리공정을 밟을때, CysM 효소에 속하는 계통군의 O-아세틸-L-세린 SH효소가 비단백질성 아미노산의 제조에 사용하는 가장 우수한 효소라는 것을 관찰할 수 있다.

기재로서 사용에 적합한 친핵화합물의 스펙트럼(spectrum)은 CysK 효소보다 더 넓다.

본 발명의 특히 바람직한 구성에서, 효소반응은 연속 프로세스로 실시한다.

이 경우, O-아세틸-L-세린 , O-아세틸-L-세린 SH효소 및 친핵화합물을 일정하게 계량하게 혼합함과 동시에 그 얻어진 혼합액중에서 비단백질성 L-아미노산 함유용액(생성물 용액)을 제거한다.

반응 혼합액의 용량이 동일하게 있도록 함으로써 후자(생성물 용액)가 바람직하게 얻어진다.

특히, 이 처리공정의 잇점은 반응혼합액중에서 O-아세틸-L-세린의 저농도가 일정하게 유지되도록 정상상태를 설정하여 이성화반응(isomerization)을 감소시키는데 있다.

반응혼합액중에서 O-아세틸-L-세린의 농도는 <1.0g/ℓ로 조절한다.

이 농도값은 반응혼합액중에서 생성물용액의 평균 체재시간(mean dwell time)을 변화시켜 조정할 수 있다.

O-아세틸-L-세린의 연속반응용 탱크(reservoir)는 충분한 안정성을 확실하게 얻기 위하여, 산성 pH, 바람직하게는 pH 4-5에서 유지시키는 것이 바람직하다.

종래에는 O-아세틸-L-세린이 L-세린의 아세틸화반응에 의한 화학적 합성으로부터 제조되어, L-세린의 코스트가 고가이므로 제조비용이 높았다.

특허문헌 DE 10107002(본원 출원인과 동일하며, 2001. 12. 15. 출원하였음)명세서에서는 발효에 의한 O-아세틸-L-세린의 제조방법에 대하여 기재되어 있다.

이 특허문헌(출원명세서)에서는 제조코스트에 유리한 제조시스템을 이용할 수 있으나, O-아세틸-L-세린의 불안정성으로 인하여 생성물을 발효조배지에서 분리하는데 기술적으로 어려움이 있다.

본 발명의 잇점은 예로서 위의 특허문헌 DE 10107002 에 기재되어 있는 바돠같이 실시한 발효처리에서 얻어진 O-아세틸-L-세린함유 발효조배지를 본 발명에 의한 방법에서 O-아세틸-L-세린원(sousce)으로 직접 사용할 수 있다.

이와같은 방법은 특히 경제적이며, 불안정한 화합물에 의한 분리처리를 회피할 수 있다.

비단백질성 아미노산의 합성에 쓰이는 O-아세틸-L-세린 SH효소는 통상의 기술자가 알고 있는 통상의 재조합 DNA기술을 사용하여 제조하는 것이 바람직하다.

여기서, O-아세틸-L-세린 SH효소를 엔코팅한 유전자는 적합한 벡터에 클로닝(cloning)시키며, 그 다음으로 적합한 숙주균주(host strain)를 형질전환하였다.

재조합 DNA기술에 접근할 수 있고 발효에 의한 재조합 단백질의 제조에 적합한 어떤 미생물이라도 숙주균주로서 사용에 적합하다.

에쉐리키아콜리는 O-아세틸-L-세린 SH효소를 제조하는 바람직한 미생물이다.

원칙적으로, 재조합 O-아세틸-L-세린 SH효소 유전자는 크로모솜(염색체)에 결합시킬수 있고(integrate), 그밖에 자기복제(self-replicating)플라스미드벡터에 사용할 수 있다.

클로닝(cloning)에 있어서, O-아세틸-L-세린 SH효소 유전자에 의해 조절할 수 있고 강력하게 유도할 수 있게 발현할 수 있는 유전자요소(gentic elements)[즉 조절할 수 있는 촉진제, 종료암호(terminators)]를 이미 포함한 벡터의 사용이 바람직하다.

에쉐리키아골리 벡터 pUC18, pBR322, pACYC184 및 이들의 유도체등 복제수가 높은 플라스미드 벡터가 특히 바람직하다.

강력하게 유도할 수 있는 적합한 촉진제의 예로는 lac,tac,trc, 람다 P_L,ara 및 tet 촉진제가 있다.

O-아세틸-L-세린 SH효소는 예로서 발효에 의한 재조합 미생물 균주를 배양시켜 생산한다.

이것과 관련하여, 소정의 미생물 균주에 적합하도록 할 필요가 있는 방법상의 파라미터를 가지며 통상의 기술자에 의해 공지되어 있는 증식방법(propagating methods)을 사용한다.

영양배지로서 완전배지(complete media)와 최소배지(mininal media)를 사용할 수 있고, 배치프로세스(batch process)또는 공급-배치 프로세스(fed-batch process)를 사용할 수 있다.

유도할 수 있는 촉진제계(promoter system)를 사용할 경우 O-아세틸-L-세린 SH효소 유전자의 발현(expression)은 적합한 유도제(inducer)를 첨가시켜 적합한 시점에서 전환시킨다.

적합한 생산단계 다음으로, O-아세틸-L-세린 SH효소 함유세포는 공지의 방법(즉, 원심분리)를 사용하여 얻어진다.

이와같이 하여 제조한 O-아세틸-L-세린 SH효소는 통상의 단백질 정제방법을 사용하여 분리시킬수 있다.

이것과 관련하여, 종래의 방법(즉, 침전, 이온교환 크로마토그래피, 수소성 상호작용 크로마토그래피 및 등전집속)과 "친화성태그"(affinity tags)를 사용하는 최근의 친화성 크로마토그래피를 사용할 수 있다.

이들의 친화성태그를 엔코딩한 서열은 유전자를 클로닝할때 코딩영역에융합(fusion)할 수 있어, 그 대응하는 친화성태그를 포함하는 융합단백질을 얻을수 있다.

그다음, 이들의 단백질은 1단계 정제공정으로하여 분리시킨다.

친수성 태그와 친수성 정제의 적합한 조합의 한 예로는 스트렙-태그(strep-Tag)와 스트렙타비딘(strep tavidin)친화성 크로마토그래피가 있으며, 시판제품에서 구입할 수 있다(상품으로는 독일 괴팅겐에 있는 IBA 회사에서 제조한 상품이 있음). 본 발명에 의한 방법에서 정제형태의 O-아세틸-L-세린 SH효소를 사용할 수 있다.

그러나, 용액중에서의 반응이외에 지지체상에서 그 효소를 고정할수도 있다.

적합한 방법은 종래의 기술에 속한다.

비단백질성 아미노산의 제조에 쓰이는 O-아세틸-L-세린 SH효소의 분리가 절대적으로 필요한 것은 아니다.

또, 본 발명에 의한 제조방법에서 O-아세틸-L-세린 SH효소 활성을 가진 미생물 세포를 직접 사용할수 있다.

이와같은 미생물 균주의 예로는 에쉐리키아 콜리균주 DH5α/pFL145 및 BLR21(DE3)/pLE4 가 있다.

이들의 균주는 실시예 1및 2에 기재되어 있으며, 기탁번호 DSM14088 및 14089로 각각 독일 DSMZ 에 기탁되어 있다.

본 발명에 의한 방법의 변형예에서는 휴지세포(resting cell)를 사용하여 O-아세틸-L-세린을 비단백질성 L-아미노산으로 바이오형질전환(biotransformation)을 한다.

이와 관련하여, O-아세틸-L-세린과 친핵화합물의 휴지세포내 침투에 의해 세포에 의한 반응생성물, 즉 비단백질성 L-아미노산의 방출을 즉시 보장받을수 있다.

필요할 경우, 그 세포의 내부와 반응배지사이에서 물질전달은 그 세포를 투과하도록 하는 물질과 세포를 처리함으로써 증가시킬수 있다.

이들의 물질, 예로서 클로로포름 또는 톨루엔과 이들의 사용은 통상의 기술자에 의해 공지되어 있다.

본 발명의 방법의 바람직한 구성에서, 비단백질성 아미노산은 O-아세틸-L-세린과 친핵화합물을 반응시킴과 동시에, 촉매로서 미생물의 세포내에 존재하는 O-아세틸-L-세린 SH효소를 사용함으로써 생성된다.

발효에 의해 얻어진 비정제한 O-아세틸-L-세린과 친핵화합물을 반응시킴과 동시에 촉매로서 미생물의 세포내에 존재한 O-아세틸-L-세린 SH효소를 사용하는 비단백질성 L-아미노산의 제조가 특히 바람직하다.

본 발명에 의한 방법에 사용되고 O-아세틸-L-세린 SH효소에 의해 촉진되는 β치환반응용 친핵화합물은 다음의 그룹에서 선택되는 래디컬을 포함한 화합물이바람직하다.

다음 화합물의 그룹에서 선택되는 친핵화합물을 반응혼합액에 첨가하는 것이 특히 바람직하다.

- 티오 설페이트

- 다음 일반식(1)의 티올

H - S - R¹(1)

위식에서, R¹은 탄소원자 1~15개를 가진 1가의 치환 또는 비치환 알킬, 알콕시, 아릴 또는 헤테르아릴 래디컬이다.

- 셀레나이드

- 다음 일반식(2)의 셀레놀(selenols)

H - Se - R¹(2)

위식에서, R¹은 일반식(1)의 정의를 가진다.

- 아지드(azides)

- 시아나이드(cyanides)

- 다음 일반식(3)또는 (4)의 아졸(azoles)

위식에서, X 및 Y는 같거나 다르며, CR⁴또는 N이며, R⁴는 -H, -COOH, -OH , -NH₂, -NO₂, -SH, -SO₃-, -F, -Cl, -Br, -I, C₁-C₅-알킬카르보닐-및 이들의 에스테르, 아미드 또는 염, 또는 R¹이다.

R¹은 일반식(1)의 정의를 가진다.

R²및 R³는 같거나 다르며, R⁴이다.

일반식(4)에서 C¹및 C²는 치환체 R²및 R³대신 브리지(bridge)[-CR⁵R⁶-]a (여기서 a는 1,2,3 또는 4 임)에 의해 결합되어 하나의 링(ring)을 형성한다.

R⁵및 R⁶는 같거나 다르며 R⁴이고, 1개이상의 인접하지 않은 기 (non-adjacent groups)[-CR⁵R⁶-]는 산소, 황 또는 이미노래디컬(C₁-C₅-알킬-에 의해 선택치환됨)에 의해 치환시킬수 있고, 2개의 인접기[-CR⁵R⁶-]는 하나의기[-CR⁵=CR⁶-]또는 [-CR⁵=N-]와 치환할 수 있다.

- 다음일반식(5)또는 (6)의 이소옥사졸리논

위식에서, X,R¹,R²및 R³는 위에서 설명한 정의를 가지며, 일반식(6)의 C¹및 C²는 치환체 R²및 R³대신 일반식(4)의 브리지에 의해 연결되어 하나의 링(ring)을 형성할 수 있다.

티오설페이트의 예로는 소듐 티오설페이트, 포타슘 티오설페이트 및 암모늄 티오설페이트가 있다.

티올의 예로는 다음의 그룹에서 선택한 화합물이 있다.

2-메르캅토에타놀, 3-메르캅토 프로파놀,

3-메르캅토 프로피온산, 3-메르캅토-1-프로판 설폰산,

메르캅토에탄설폰산, 2-메르캅토에틸아민,

티오글리콜산, 티오락틴산,

티오아세트산, 메르캅토석신산,

메르캅토피루빈산, 디티오트레이톨,

디티오에리트리톨, 1-티오글리세롤,

티오페놀, 4-플루오로티오페놀, 4-클로로티오페놀,

4-메르캅토페놀, P-티오크레졸, 5-티오-2-니트로벤조산,

2-메르캅토티아졸, 2-메르캅토티아졸린, 2-메르캅토이미타졸,

3-메르캅토-1,2,4-트리아졸, 2-티오페네티올, 2-메르캅토피리딘,

2-메르캅토피리미딘, 2-티오사이토신, 2-메르캅토니코틴산,

2-메르캅토-1-메틸이미다졸, 2-메르캅토벤조티아졸,

2-메르캅토벤조옥사졸 및 6-메르캅토푸린

셀레놀의 예로는 메틸셀레놀, 에틸셀레놀,프로필셀레놀 및 페닐셀레놀의 그룹에서 선택한 화합물이 있다.

아지드의 예로는 소듐아지드, 포타슘아지드 및 암모늄아지드가 있다.

시아나이드의 예로는 포타슘 시아나이드, 소듐시아나이드 및 암모늄시아나이드가 있다.

아졸의 예로는 1,2-피라졸, 3-메틸피라졸, 4-메틸피라졸, 3,5-디메틸피라졸, 3-아미노피라졸, 4-아미노피라졸, 피라졸-4-카르복실산, 피라졸-3,5-디카르복실산, 1,2,3-트리아졸,1,2,4-트리아졸, 3-아미노-1,2,4-트리아졸, 1,2,3,4-테트라졸, 인다졸, 인다졸-3-카르복실산, 인다졸-5-카르복실산, 5-아미노산인다졸, 벤조트리아졸, 벤조트리아졸-5-카르복실산, 5-아미노벤조트리아졸, 아미노피라졸로피리미딘, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌의 그룹에서 선택한 화합물이 있다.

이소옥사졸리논의 예로는 이소옥사졸린-5-온, 3-메틸이소옥사졸린-5-온, 4-메틸이소옥사졸린-5-온, 4,5-디메틸이소옥사졸린-2-온 및 1,2,4-옥사디아졸리딘-3,5-온의 그룹에서 선택한 화합물이 있다.

혼합용액중에서 친핵화합물의 농도는 O-아세틸-L-세린과 등몰의 농도로 존재하도록 선택하는 것이 바람직하다.

반응온도는 5℃~70℃의 범위가 되도록 선택하는 것이 바람직하다.

그 온도범위는 20℃~40℃가 특히 바람직하다.

물은 반응의 용제로서 사용하는 것이 바람직하다.

생성되는 반응생성물은 L구성에서 다음 일반식(7)의 L-아미노산이 바람직하다.

위식에서, Z는 다음식(8)~(19)에서 선택한 1가 래디컬 및 그 에스테르, 에테르 또는 염이다.

위식에서 R¹,R²,R³,R⁴, X 및 Y는 일반식(1)~(6)에서 설명한 정의를 가진다.

본 발명에 의한 처리를 종료시킨후와 공지의 방법을 사용하여 바람직한 수용액을 바이오매스(biomass)와 배양상징액으로 분리시킨후에 배양상징액에서 용해할수 있는 비단백질성-L-아미노산을 분리하는 것이 바람직하다.

이와같은 아미노산의 분리방법은 동일하게 통상의 기술자에 의해 공지되어 있다.

이들의 분리방법에는 예로써 여과, 원심분리, 추출, 흡착, 이온교환크로마토그래피, 침전 및 결정화가 있다.

난용성의 비단백질성아미노산의 경우, 통상의 기술자에 의해 공지되어 있는 바와 같이 등급원심분리(grading centrifugation)를 실시하여 그 바이오매스가 가급적 모두 원심분리상징액에 있도록 하는 것이 바람직하다.

분리시킨 생성물은 표준방법을 사용하여 용해시킨 다음 재침전시키는 것이 바람직하다.

다음 실시예를 들어 본 발명을 명백하게 설명한다.

실시예 1 ; 스트렙태그(StrepTag)서열함유융합유전자로서 에쉐리키아콜리 CysK 및 CysM유전자의 클로닝(Cloning)

에쉐리키아콜리 CysK 및 CysM유전자를 클로닝하기 위하여, 다음의 포스포로티오에이트보호올리고뉴클레오티드 프라이머쌍(phosphorothioate-protected oligon ucleotide primer pairs)과 PwoDNA중합효소를 사용하여 우선 중합효소사슬반응 (Polymerase chain reaction)을 실시하였다.

cysKs1 : 5'-gat cga ctc gaa tga gta aga ttt ttg aag a-3' SEQ.ID.NO. 1

cysKS2 : 5'-gat cgaggt ctcggc gct ctg ttg caa ttc ttt ctc ag-3'SEQ.ID.NO. 2 및

cysMS3 : 5'-gat cgaggt ctcgaa gta cat tag aax aaa c-3 SEQ.ID.NO. 3

cysMS5 : 5'-gat cgaggt ctcggc gct aat ccc cgc ccc ctg gct aa-3' SEQ.ID.NO. 4

이와 관련하여, 제한 엔도뉴클레아제(endonuclease)BasI(밑줄친 뉴클레오티드)의 분리부위를 프라이머(primer)서열에 의해 도입하였다.

에·콜리(E·coli)W3110(ATTC 27325)의 염색체 DNA는 템플레이트(template)로 사용하였다. 그 결과 얻어진 증폭인자는 제한효소 BsaI로 소화시킨 다음, Eco31I-처리벡터 (PASK-IBA3(독일, 피링겐에 있는 연구소로서, Institute for Bioanalysis)에 클로닝하였다.

이 벡터에 의해 스트렙태그 Ⅱ(StrepTag Ⅱ)로 지정되어 있는 친화성 탭티드 (WSHPWFEK SEQ.ID.NO.5)를 엔코딩하는 3'단부의 서열을 가진 유전자융합으로 유전자를 클로닝하도록 하였다.

유전자융합을 발현하는 tet촉진제를 사용하여 C-말단스트렙태그Ⅱ를 가진 단백질을 얻었다. 후자는 스트렙태그Ⅱ가 스트렙타비딘(streptavidin) 컬럼(columns)의 결합을 조절하기 때문에 단백질의 분리에 사용할 수 있다.

실시예 2 : CysK 및 CysM 단백질의 정제

CysM-스트렙태그(StrepTag) 구성(pFL145)을 사용하여, 에·콜리균주DH5α (Clonetech, 독일)에서 가장 우수한 유전자발현을 얻을 수 있었다.

증식(propagation)과 발현은 독일연방공화국 괴팅겐에 있는 회사(Institut fuer Bioanalytik)에 의해 작성한 지시서에 따라 실시하였다.

균주 DH5α/pFL145는 기탁번호 DSMZ14088로 DSMZ에 기탁되어 있다. CysK-스트렙태그구성(pLE1)의 경우 대비할때 발현은 대단히 미약(weak)하였다. 그러나, 이 경우(pLE4) XbaI/HindIII 단편으로, 유전자융합을 T7촉진제(pRSET5a)(Stratage ne, 독일)함유 백터에 리클로닝(recloning)하여, 균주 BLR21(DE3)(Novagen, 독일)에서 발현시킴으로써 유전자생성물을 생성하였다.

균주 BLR21(DE3)/pLE4는 기탁번호 DSMZ14089로 DSMZ에 기탁되어 있다.

CysK 및 CysM 단백질은 스트렙타비딘(Streptavidin)컬럼(columns)상에서 친화성 크로마토그래피에 의해 분리하였다.

이 처리공정은 원칙적으로 제조업자의 지시서(독일연방공화국 괴팅겐에 있는 회사(Institut fuer Bioanalytik)에 의해 작성한 지시서임)에 따라 실시하였다.

배양액 250㎖를 사용하였을때 수율은 각각 정제한 CysK 단백질3㎎ 또는 정제한 CysM 단백질 4.5㎎이었다.

피리드옥살포스페이트 보조인자(cofactor)로 인하여, 2종단백질은 진한 황색의 착색을 나타내었으며, 420㎚에서 최대흡수를 가졌다.

실시예 3 ; 효소고유활성도 측정

O-아세틸-L-세린 SH효소의 활성은 "중성"반응생성물 L-시스테인(Cys)을 검출하거나, 또는 CysM의 경우 S-설포-L-시스테인(S-Cys)으로 반응생성물을 검출하여측정하였다. 2종의 단백질은 참고문헌(Gaitonde, 1967, Biochem. J. 104 : 627-633)에 기재되어 있는 테스트를 사용하여 극히 특정하게 그리고 극히 강도높게 검출할 수 있었다.

각각의 표준곡선은 2종의 화합물에 대하여 표준화곡선으로 보정하였다. 그 이유는 설포시스테인의 칼라복합체(color complex)의 강도가 낮기 때문이다.

10mM O-아세틸-세린(pH 5.5의 500mM소듐석시네이트완충액중에서 200mM 원액에 첨가함), 10mM소듐설파이드 또는 소듐티오설페이트, pH 7.0의 100mM 포타슘포스페이트완충액 및 1㎖당 정제효소 5㎍을 포함한 테스트혼합액을 37℃에서 배양하였다.

고유활성도(specific activity)A는 단백질 1mg당 단위로 나타낸다. 즉, 생성물 ㎛o1 ×min^-1×단백질 ㎎^-1으로 나타낸다.

A_cys는 설파이드를 사용하는 시스테인의 생성에 대한 고유활성도를 나타낸다.

A_s-cys는 티오설페이트를 사용하는 S-설포시스테인의 셍성에 대한 고유활성도를 나타낸다.

실시예 2에서 분리한 단백질을 사용하는 고유활성도는 다음과 같다.

CysK : A_cys140 단위/mg

CysM : A_cys199 단위/mg

CysM : A_s-cys145 단위/mg

휴지세포에서 O-아세틸 세린 SH효소의 고유활성도를 측정할때, 세포현탁액의흡광도(optical density)를 우선 20.0으로 조절하였다(600nm에서 측정함). 다음으로 농도 10Vol%의 클로로포름을 첨가시켜 그 휴지세포를 투과하였다.

그리고 그 얻어진 혼합액을 5분간 실온에서 배양하였다.

그 효소테스트에 있어서는 흡광도를 1.0으로 조절시킨 다음, 위에서 설명한 휴지세포를 사용하여 O-아세틸-L-세린과 설파이드 또는 티오셀페이트의 반응을 실시하였다. 따라서 휴지세포의 고유활성도 A는 ㎛o1 ×min^-1×(600nm에서 흡광도 1.0을 가진 세포현탁액 ㎖)로 나타낸다. 즉, 단위/㎖OD로 나타낸다.

실시예 4 : O-아세틸-L-세린 SH효소 CysK 및 CysM에 대한 촉매가능성 조사

O-아세틸-L-세린 SH효소를 사용하여 비단백질성아미노산을 제조하기 위하여, 설파이드 또는 티오설페이트 대신 다른 친핵화합물을 반응에 사용하였다.

이들의 친핵화합물을 검출하기 위하여, 오르토-프탈디알데히드를 사용하여 아미노산에 대한 전치컬럼유도체화반응(precolumn derivatization)을 실시하였다.

이 방법을 사용하여, 적합한 친핵기재에 대하여 광범위한 선별을 실시하였다.

혼합액에는 4mM O-아세틸-L-세린(200mM원액에서, pH 5.5의 500mM 소듐석시네이트완충액중에 첨가함), 20mM 친핵화합물, pH 7.0의 100mM포타슘포스페이트 완충액, 1㎖당 정제한 효소 5㎍을 포함시켰다.

반응을 아세트산(96%v/v)용량의 1/100로 정지시키고 제조업자의 지시서(독일발트브론의 회사(Hewlett Packard)에 의해 작성한 지시서)에 따라 HP 아미노성분컬럼(200mm ×2.1mm)을 사용하여 HPLC에 의해 분석하였다.

생성한 생성물을 특성화하기 위하여 HPLC-MS를 사용하여 분자량을 확정하였다. 루나(Luna)C18컬럼(Phenomenex회사제품, 독일 아스하펜부르그에 있음)을 이 분자량설정에 사용하였으며, 포름산(0.1%v/v)을 가동상(mobile phase)으로 사용하였다.

포지티브엘렉트로스프레이모드(positive electrospray mode)로 이온화반응을 실시하였다.

다음의 표는 여러가지의 친핵화합물에 대한 2종효소, 즉 CysK 및 CysM의 반응성과 HPLC-MS분석으로 측정한 질량(MH+)을 나타낸다.

(주): ＊ +++ 30분후 70%이상의 전환율

++ 30분후 40%이상의 전환율

+ 30분후 10%이상의 전환율

- 30분후 5%미만의 전환율

실시예 5 : 발효에 의한 O-아세틸-L-세린 SH효소 CysM의 제조

발효용 예비배지로, 1ℓ당 앰피실린 100㎎을 추가로 포함한 LB배지(1ℓ당 트립톤 10g, 1ℓ당 이스트엑스 5g, 1ℓ당 NaC1 10g)20㎖에 균주, DH5α/pFL145(위 기재참조)를 접종시킨다음, 30℃에서 150rpm으로 회전하는 교반기중에서 하루밤 배량하였다.

그 다음, 그 혼합액 전부를 SM1배지(100㎖)에 이식하였다.

SM1배지는 아래의 구성성분을 가지며, 1ℓ당 글루코오스 5g, 1ℓ당 비타민 B₂0.5㎎, 1ℓ앰피실린 100㎎을 보충하였다.

SM1배지는 1ℓ당 K₂PO₄12g, 1ℓ당 KH₂PO₄3g, 1ℓ당(NH₄)₂SO₄5g, 1ℓ당 MgSO₄×7H₂O 0.3g, 1ℓ당 CaCl₂×2H₂O 0.015g, 1ℓ당 FeSO₄×7H₂O 0.002g, 1ℓ당 소듐시트레이트×2H₂O 1g, 1ℓ당 NaCl 0.1g, 1ℓ당 미량원소용액 1㎖로이루어지며, 미량원소용액은 1ℓ당 Na₂MoO₄×2H₂O 0.15g, 1ℓ당 Na₃BO₃2.5g, 1ℓ당 CoCl₂×6H₂O 0.7g, 1ℓ당 CuSo₄×5H₂O 0.25g, 1ℓ당 MnCl₂×4H₂O 1.6g, 1ℓ당 ZnSO₄×7H₂O 0.3g 으로 이루어진 용액이다.

그 예비배지를 온도 30℃에서 8시간동안 150rpm으로 하여 더 배양하였다.

사용한 발효조(발효장치)는 바이오스태트 M(Biostat M)장치이다(제조회사,Braun Biotech; 독일 멜순겐에 있음). 이 장치는 최대 배양용량이 2ℓ이다.

발효조에는 발효배지 900㎖ 가 있으며, 위에서 설명한 예비배지(600nm에서 흡광도 약 2임)로 접종하였다.

이 발효배지는 1ℓ당 글루코오스 15g, 1ℓ당 트립톤 10g, 1ℓ당 이스트엑스 5g, 1ℓ당 (NH₄)₂SO₄5g, 1ℓ당 KH₂PO₄1.5g, 1ℓ당 NaCl 0.5g, 1ℓ당 MgSO₄×7H₂O 0.3g, 1ℓ당 CaCl₂×2H₂O 0.015g, 1ℓ당 FeSO₄×7H₂O 0.075g, 1ℓ당 소듐시트레이트×2H₂O 1g 및 1ℓ당 미량원소용액 1㎖(미량원소용액 성분은 위에서 설명한것과 같음), 1ℓ당 비타민 B₁5㎖, 1ℓ당 앰피실린 100mg 으로 이루어지며, 25% 암모니아에 의해 pH 7.0으로 조절하였다.

발효할때 온도를 32℃로 고정하였으며, pH는 25%v/v 암모니아로 혼합시켜 pH 7.0으로 일정하게 유지하였다.

그 얻어진 배양액은 1.5Vol/Vol/min 의 살균시킨 압축공기로 처리시키면서 회전교반기속도 200rpm으로 교반하였다.

산소포화가 50%로 되었을때, 50%의 산소포화를 유지하기 위하여 감시장치(monitoring device)에 의해 1200rpm으로 회전속도를 증가시켰다.(산소포화는 900rpm에서 100%포화 눈금을 가진 pO₂프로브(probe)를 사용하여 측정함).

발효조내 글루코오스 농도가 초기농도 15g/ℓ에서 약 5~10g/ℓ로 저하되는 즉시 글루코오스 56% w/v용액을 계량하여 혼합하였다.

발효조내 글루코오스 농도를 0.5~10g/ℓ로 유지시키면서 유량 3~6㎖/h로 공급하였다.

글루코오스는 글루코오스 분석기(Yellow Springs 사제품, 미국 오하이오주)를 사용하여 측정하였다.

흡광도(optical density)30으로 되었을때 1ℓ당 테트라시클린 3mg 을 첨가시켜 효소생성을 유도하였다.

유도시간은 7시간이었다.

이 시간후에 샘플을 채취하여 세포를 원심분리에 의해 배지에 분리하고 세척하였다.

얻어진 세포 현탁액을 실시예 3에서와 같이 분석하였다.

티오 설페이트로 측정한 O-아세틸 세린 SH효소의 활성도, A_s-cys는 12 단위/mlOD이었다.

그 세포는 원심분리에 의해 얻어지며, 액상질소중에서 충격냉동 (shock-frozen)시키고 -20℃ 에서 저장하였다.

실시예 6 : 발효에 의한 O-아세틸-L-세린 SH효소 CysM의 제조

Cysk 효소의 제조공정은 원칙적으로 실시예 5에서의 공정과 같다.

그러나, 이 실시예의 경우 균주 BLR21(DE 3)/PLE4 를 사용하였다.

그러나, 초기에 넣은 1ℓ당 글루코오스 15g 을 모두 소비시킨다음, 글리세롤60%(v/v)용액을 공급하였다.

유량은 9.5㎖/h 이었다.

동시에, 0.4mM 이소프로필-β-티오갈락토사이드(IPTG)를 첨가시켜 효소의 생성을 유도하였다.

유도시간 21시간후에 샘플을 채취하여 그 세포를 원심분리에 의해 배지에서 분리시킨다음 세척하였다.

그 결과 얻어진 세포현탁액을 실시예 3에서와 같이하여 분석하였다.

설파이드로 측정한 O-아세틸 세린 SH효소의 고유활성도, Acys는 2단위/㎖OD 이었다.

그 세포를 원심분리에 의해 얻어, 액상질소중에서 충격냉동시켜 -20℃에서 저장하였다.

실시예 7 : 휴지세포를 사용하는 효소에 의한 S-페닐-L-시스테인의 제조

pH 프로브(probe)와 pH 조절기를 장치한 온도제어 용기내에서 물 100㎖중에 O-아세틸-L-세린 히드로 클로리드(Sigma 사제품, 독일 데이센호펜시에 있음)를 우선 용해시켜 200mM(29.4g/ℓ)O-아세틸-L-세린의 최종농도를 얻었다.

그다음, 200mM 티오페놀을 첨가시키면서 교반하였다.

그 다음으로, 얻어진 혼합액은 5M NaCH 로 적가시켜 신속하게 pH 6.7으로 한 다음, CysM 생성균주 DH5α/pFL145 의 세포현탁액을 즉시 혼합하였다.

그 세포현탁액은 고유활성도 As-cys 가 12 단위/mlOD 이었다.

그 혼합액중에서 세포의 흡광도(600nm 에서 츠정)는 2.0이었으며, O-아세틸 세린의 고유활성도 As-cys 는 24 단위/mlOD 이었다.

그 반응중에, pH는 pH 제어기에 의해 5M NaOH 의 혼합으로 일정하게 유지하였다.

그 반응중에 백색침전물의 생성이 확인되었다.

30분후, 샘플을 채취하여 1%(v/v)아세트산으로 처리하였다.

그 침전물은 원심분리에 의해 분리시켜 동용량의 21%(v/v)인산중에 용해하여 HPLC에 의해 분석하였다.

또, 원심분리 상징액은 크로마토그래피분석 처리를 하였다.

그 분석처리는 루나(LUNA)5μC18(2) 컬럼(Phenomenex 제품, 독일)상에서 액상 HPLC에 의해 실시하였다.

유량 0.5ml/min의 묽은 인산(1ℓ당 진한 인산 0.1㎖)을 용리액(eluent)으로 사용하였다.

S-페닐-L-시스테인의 함량은 상징액중에서 1.6g/ℓ이었으며, 침전물에서 24.8g/ℓ이었다.

이것은 O-아세틸-L-세린을 기준으로 하여 총반응수율 67%에 대응한다.

사용한 O-아세틸 세린 SH효소의 고유활성도를 각각 12 단위/㎖ 와 2 단위/㎖로 감소시켜 제조하였다.

그러나, 이것은 효소반응이 지연되어 O-아세틸-L-세린의 이성화로 인하여 각각 수율 52% 와 15% 로 감소되었다.

실시예 8 : O-아세틸-L-세린 함유 발효배지와 휴지세포를 사용하는 발효에 의한 S-페닐-L-시스테인의 제조

순수물질로서 O-아세틸-L-세린대신, O-아세틸-L-세린함유 발효배지에서 이 실시예의 실험을 실시하였다.

이 발효배지는 특허문헌 DE 10107002 명세서에 기재되어 있는 바와같이 발효에 의해 얻었다.

발효가 완료되었을때, O-아세틸-L-세린을 안정화하기 위하여 pH를 21%(v/v) 인산에 의해 pH 4.0으로 조정하였다.

휴지세포를 원심분리에 의해 분리시키고 발효배지를 증류에 의해 1ℓ당 O-아세틸-L-세린 30g의 농도로 하였다.

그 다음으로, pH 6.7로 될때까지 적정후 200mM티오페놀과 CysM 생성 균주 DH 5α/pFL145 의 세포를 배지 100㎖와 혼가하였다.

고유활성도 As-cys 는 24 단위/ml 이었다.

그 다음, 실시예 7에서와 같이 또 다른 공정으로 처리하였다.

O-아세틸-L-세린을 기준으로 한 수율은 65% 이었다.

고유활성도 Acys 38단위/㎖를 사용할 경우 CysK 생성 균주 BLR21(DE 3)/pLE4 의 세포를 함유한 동일 혼합액은 수율 72% 를 얻었다.

실시예 9 : O-아세틸-L-세린 함유 발효배지와 휴지세포를 사용하는 효소에 의한 S-페닐-L-시스테인의 연속제조

이 반응의 실시목적은 고가의 불안정한 출발화합물 O-아세틸-L-세린을 기재로 하여 가급적 높은 대사회전(turnover)을 얻도록 하는데 있다.

대사회전을 확보하기 위하여 연속처리를 실시하였다.

이 처리에서, 처리공정은 사용한 CysM 고유활성도 As-cys 를 48 단위/㎖로 증가시키는 것을 제외하고 초기에는 실시예 8에서와 같이 하였다.

반응시간 20분후에, O-아세틸-L-세린함유 발효배지 (30g/ℓ), 티오페놀 및 CysM 생성균주 DH5α/pFL145의 세포현탁액(pH 7.0의 포타슘포스페이트 완충액중에서, 600nm 에서의 흡광도 240)을 계량 혼합장치에 의해 첨가하였다.

유량은 각각 150, 2.5 및 3㎖/h 이었다.

동시에, 유량 155.5㎖/h 에서 반응용기에서의 생성물 용액의 연속적인 제거를 개시하였다.

반응기내 반응용액을 일정하게 있도록 하고 반응기내에서 평균체재시간이 30분으로 되도록 그 유량을 선택하였다.

이 처리공정을 사용하여, 일정한 O-아세틸-L-세린농도 1.0g/ℓ의 혼합액중에서 정상상태를 설정하였다.

이와같이 저농도결과, 저농도에서 효소는 KM값이 더 낮아져 극히 우수한 활성을 갖게되어, N-아세틸-L-세린의 이성화를 계속해서 최소화할 수 있었다.

O-아세틸-L-세린을 기준으로 하여 반응의 수율은 85%이었다.

실시예 10 : O-아세틸-L-세린함유 발효배지와 휴지세포를 사용하는 효소에 의한 아지도-L-알라닌의 제조

이 실시예의 다음 처리공정은 CysM함유 세포를 사용하여 실시예 8에서와 같이 처리하였다.

티오페놀대신, 200mM 소듐아지드를 사용하였다.

반응시간 30분후에, 혼합액중에서 활성도 72단위/㎖에 대응하는 세포를 사용하여 전환율은 45%로 측정되었다.

실시예 11 : O-아세틸-L-세린함유 발효배지와 휴지세포를 사용하는 효소에 의한 시아노-L-알라닌의 제조

CysM 함유세포를 사용하여 실시에 8에서와 같이 이 실시예의 처리공정을 실시하였다.

티오페놀대신 200mM 포타슘 시아나이드를 사용하였다.

혼합액의 pH를 6.7로 조정한 다음 포타슘 시아나이드만을 첨가하였다.

반응시간 30분후, 이 혼합액중에서 활성도 72 단위/㎖에 대응하는 세포를 사용하여 전환율은 65%로 측정되었다.

실시예 12 : O-아세틸-L-세린함유 발효배지와 휴지세포를 사용하는 효소에 의한 S-설포-L-시스테인의 제조

이 실시예의 다음 처리공정은 CysM 함유세포를 사용하여 실시예 8의 공정과 동일하게 처리하였다.

티오페놀 대신, 200mM 소듐 티오설페이트를 사용하였다.

반응시간 30분후에, 혼합액중에 활성도 16단위/㎖에 대응하는 세포를 사용하여 그 전환율은 91%로 측정되었다.

실시예 13 : O-아세틸-L-세린함유 발효배지와 휴지세포를 사용하는 효소에 의한 S-티아졸-2-일-L-시스테인의 제조

CysM 함유 세포를 사용하여 실시예 8에서와 같이 이 실시예의 처리공정을 실시하였다.

티오페놀대신 200mM 2-메르캅토티아졸을 사용하였다.

반응시간 30분후에 혼합액중에 활성도 72단위/㎖에 대응하는 세포를 사용하여 전환율은 62%로 측정되었다.

실시예 14 : O-아세틸-L-세린함유 발효배지와 휴지세포를 사용하는 효소에 의한 S-1,2,4-트리아졸-3-일-L-시스테인의 제조

CysM 함유 세포를 사용하여 실시예 8에서와 같이 이 실시예의 공정을 처리하였다.

티오페놀대신, 200mM 3-메르캅토-1,2,4-트리아졸을 사용하였다.

반응시간 30분후에, 혼합액중에 활성도 72단위/㎖에 대응하는 세포를 사용하여 전환율은 74%로 측정되었다.

실시예 15 : O-아세틸-L-세린함유 발효배지와 휴지세포를 사용하는 효소에의한 셀레노-L-시스테인의 제조

CysM 함유세포를 사용하여 실시예 8에서와 같이 이 실시예의 공정을 처리하였다.

티오페놀대신, 200mM 소듐셀레니드를 사용하였다.

소듐 셀레나이트를 소듐 보로히드리드로 환원시켜 소듐 셀레니드를 제조하였다.

반응시간 30분후 혼합액중에 활성도 72 단위/㎖에 대응하는 세포를 사용하여 전환율은 74%로 측정되었다.

실시예 16 : O-아세틸-L-세린함유 발효배지와 휴지세포를 사용하는 효소에 의한 페닐-설레노-L-시스테인의 제조

티오페놀대신 200mM페닐셀레놀을 사용하였다.

반응시간 30분후에, 혼합액중에 활성도 72 단위/㎖에 대응하는 세포를 사용하여 전환율은 62%로 측정되었다.

실시예 17 : O-아세틸-L-세린함유 발효배지와 휴지세포를 사용하는 효소에 의한 1,2,4-트리아졸-1-일-L-알라닌의 제조

이 실시예의 처리공정은 실시예 8에서와 같이 실시하였다.

티오페놀 대신 200mM 1,2,4-트리아졸을 사용하였다.

이 반응에서 세포는 10%(v/v)클로로포름으로 처리하여 투과시켰다.

반응시간 30분후, 혼합액중에 활성도 72 단위/㎖에 대응하는 세포를 사용하여 전환율은 48%로 측정되었다.

실시예 18 : O-아세틸-L-세린함유 발효배지와 휴지세포를 사용하는 효소에 의한 5-카르복시-1,2,3-벤조 트리아졸-2-일-L-알리닌의 제조

이 실시예의 공정을 실시예 8에서와 같이 실시하였다.

티오페놀 대신 200mM 5-카르복시-1,2,3-벤조트리아졸을 사용하였다.

이 반응에서, 세포는 10%클로로포름의 처리에 의해 투과하였다.

반응시간 30분후, 혼합액중에서 활성도 72단위/㎖에 대응하는 세포를 사용하여 전환율은 54%로 측정되었다.

실시예 19 : O-아세틸-L-세린함유 발효배지와 휴지세포를 사용하는 효소에 의한 1,2,4-옥사디아졸리딘-3,5-디오닐-L-알라닌(퀴스쿼르산)의 제조

실시예 8에서와 같이 이 실시예의 공정을 처리하였다.

티오페놀 대신 200mM 1,2,4-옥소디아졸리딘-2,5-디온을 사용하였다.

이 반응에서 세포는 10%클로로포름으로 처리하여 투과하였다.

반응시간 30분후에, 혼합액중에 활성도 72 단위/㎖에 대응하는 세포를 사용하여 전환율은 11%로 측정되었다.

본 발명의 제조방법에 의해, 친핵화합물, 특히 높은 량의 독성화합물을 사용할 수 있고, pH는 pH 5.0 ~ pH 7.4의 범위에 실시할 수 있으며, O-아세틸-L-세린 SH효소는 CysM을 사용하며, 혼합액중에서 최소 2단위/㎖의 고유활성도 Acys 를 갖도록 하며, 지지체상에서 고정화시켜 사용하고, O-아세틸-L-세린 SH효소활성도를 가진 미생물 휴지세포형태로 사용할 수 있다.

서열리스팅(listing)

<110> 콘소튬 퓌르 엘렉트로헤미쉐 인두스트리 게엠베하

<120> 비단백질성 L-아미노산의 제조방법

<130> 합성아미노산 Ⅱ

<140>

<141>

<160> 5

<170> 페이턴트인 버스.(Patent In Vers,)2.0

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 인공서열(Artificial sequencs)

<220>

<223> PCR의 프라이머(primer)

<400> 1

gatcgaggtc tcgaatgagt aagatttttg aaga 34

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213> 인공서열

<220>

<223> PCR의 프라이머

<400> 2

gatcgaggtc tcggcgctct gttgcaattc tttctcag 38

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 인공서열

<220>

<223> PCR의 프라이머

<400> 3

gatcgaggtc tcgaatgagt acattagaac aaac 34

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 인공서열

<220>

<223> PCR의 플이머

<400> 4

gatcgaggtc tcggcgctaa tccccgcccc ctggctaa 38

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 인공서열

<220>

<223> 단백질 정제용 스트렙 태그 Ⅱ 친화성텝티드

<400> 5

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5

Claims

효소의 바이오형질전환 (enzymic biotransformation)에 의한 비단백질성 L-아미노산의 제조방법에 있어서,

촉매로서 O-아세틸-L-세린 SH 효소를 사용하여 O-아세틸-L-세린과 친핵화합물을 반응시켜 비단백질성 L-아미노산을 얻는 단계를 포함하며,

상기 반응을 pH 5.0 내지 pH 7.4의 범위의 pH에서 실시함을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항에 있어서, pH 6.0 내지 pH 7.1의 범위의 pH에서 실시함을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항에 있어서, pH 6.0 내지 pH 6.99의 범위의 pH에서 실시함을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항에 있어서, O-아세틸-L-세린 SH효소는 정제형태로 사용함을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항에 있어서, O-아세틸-L-세린 SH효소는 지지체상에서 고정화시킨후에 사용함을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항에 있어서, O-아세틸-L-세린 SH효소는 O-아세틸-L-세린 SH효소 활성도를 가진 미생물 휴지세포의 형태로 사용함을 특징으로 하는 제조방법
제 1항에 있어서, 친핵 화합물에는의 그룹에서 선택한 하나의 래디컬을 포함함을 특징으로 하는 제조방법.
제 7항에 있어서, 친핵화합물은 티오설페이트, 다음 일반식 (1)의 티올, 셀레니드, 다음 일반식 (2)의 셀레놀, 아지드, 시아나이드, 다음 일반식 (3) 또는 (4)의 아졸, 다음 일반식 (5) 또는 (6)의 이소옥사졸리논의 군에서 선택함을 특징으로 하는 제조방법:

상기 식에서,

R¹은 탄소원자 1~15개를 가진 1가의 치환 또는 비치환 알킬, 알콕시, 아릴 또는 헤테로아릴 래디컬이고; X 및 Y는 같거나 다르며, CR⁴또는 N이고; R⁴는 -H, -COOH, -OH, -NH₂, -NO^- ₂, -SH, -SO^- ₃, -F, -Cl , -Br, -I, C₁-C₅-알킬카르보닐- 및 이들의 에스테르, 아미드 또는 염, 또는 R¹이고;

R²및 R³는 같거나 다르며 R⁴이거나,

일반식(4)에서 C¹및 C²가 치환체 R²및 R³대신 브리지(bridge)[-CR⁵R⁶-]a(a는 1,2,3 또는 4임)에 의해 결합되어 하나의 링(ring)을 형성하는 경우,

R⁵및 R⁶는 같거나 다르며, R⁴이고;

1개 이상의 인접하지 않은 기 [-CR⁵R⁶-]는 산소, 황 또는 C₁-C₅-알킬에 의해 선택적으로 치환되는 이미노래디컬로 대체될 수 있고, 2개의 인접기 [-CR⁵R⁶-]는 기 [-CR⁵=CR⁶-] 또는 기 [-CR⁵=N-]로 대체될 수 있고;

일반식 (6)의 C¹및 C²는 치환체 R²및 R³대신, 일반식 (4)의 정의에서와 같이 브리지에 의해 결합하여 하나의 링을 형성할 수 있다.
제 7항 또는 제 8항에 있어서, 친핵화합물은 2-메르캅토에타놀, 3-메르캅토 프로파놀, 3-메르캅토프로피온산, 3-메르캅토-1-프로판 설폰산, 메르캅토에탄설폰산, 2-메르캅토에틸아민, 티오글리콜산, 티오락트산, 티오아세트산, 메르캅토석신산, 메르캅토피루빈산, 디티오트레이톨, 디티오에리트리톨, 1-티오글리세롤, 티오페놀, 4-플루오로티오페놀, 4-클로로티오페놀, 4-메르캅토페놀, p-티오크레졸, 5-티오-2-니트로벤조산, 2-메르캅토티아졸, 2-메르캅토티아졸린, 2-메르캅토이미다졸, 3-메르캅토-1,2,4-트리아졸, 2-티오펜티올, 2-메르캅토피리딘, 2-메르캅토피리미딘, 2-티오사이토신, 2-메르캅토니코틴산, 2-메르캅토-1-메틸이미다졸, 2-메르캅토벤조티아졸, 2-메르캅토벤조옥사졸, 6-메르캅토푸린, 소듐티오설페이트, 포타슘티오설페이트, 암모늄티오설페이트, 소듐아지드, 포타슘아지드, 암모늄아지드, 포타슘시아나이드 소듐시아나이드, 암모늄시아니드, 메틸셀레놀, 에틸셀레놀, 프로필셀레놀, 페닐셀레놀, 1,2-피라졸, 3-메틸피라졸, 4-메틸피라졸, 3,5-디메틸피라졸, 3-아미노피라졸, 4-아미노피라졸, 피라졸-4-카르복실산, 피라졸-3,5-디카르복실산, 1,2,3-트리아졸, 1,2,4-트리아졸, 3-아미노-1,2,4-트리아졸, 1,2,3,4-테트라졸, 인다졸, 인다졸-3-카르복실산, 인다졸-5-카르복실산, 5-아미노인다졸, 벤조트리아졸, 벤조트리아졸-5-카르복실산, 5-아미노벤조트리아졸,아미노피라졸피리미딘, 8-아자구아닐, 8-아자아데닌, 이소옥사졸린-5-온, 3-메틸이소옥사졸린-5-온, 4-메틸이소옥사졸린-5-온, 4,5-디메틸이소옥사졸린-2-온 및 1,2,4-옥사디아졸리딘-3,5-디온의 군에서 선택함을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항에 있어서, 친핵화합물이 O-아세틸-L-세린과 등몰인 농도로 존재하도록 친핵화합물의 농도를 선택함을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항에 있어서, 5℃~70℃의 온도에서 실시함을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항에 있어서, 비단백질성 L-아미노산은 L 구조에 있어서 다음 일반식(7)의 아미노산, 그 에스테르, 에테르 및 염의 군에서 선택함을 특징으로 하는 제조방법.

위식에서, Z는 다음식(8)~(19)중 하나에 의한 1가 래디컬이다.

위식에서 R¹,R²,R³,R⁴,X 및 Y는 일반식(1)~(6)에서의 정의와 같다.
제 1항에 있어서, 제조처리를 종료한후 비단백질성 L-아미노산를 분리하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 제조방법.
제 13항에 있어서, 분리는 여과, 원심분리,추출,흡수,이온교환 크로마트그래피, 침전 또는 결정화에 의해 실시함을 특징으로 하는 제조방법.
비단백질성 L-아미노산의 제조방법에 있어서,

촉매로서 O-아세틸-L-세린 SH효소를 사용하여 O-아세틸-L-세린과 친핵화합물을 반응시켜 비단백질성 L-아미노산을 얻는 단계를 포함하며,

O-아세틸-L-세린 SH효소로서 CysM을 사용하며,

상기 반응을 pH 5.0 내지 pH 7.4 범위의 pH에서 실시함을 특징으로 하는 제조방법.
제 15항에 있어서, O-아세틸-L-세린 SH효소는 혼합액중에서 최소 2 단위/㎖의 고유활성도 Acys 를 가짐을 특징으로 하는 제조방법.
비단백질성 L-아미노산의 제조방법에 있어서,

촉매로서 O-아세틸-L-세린 SH효소를 사용하여 O-아세틸-L-세린과 친핵화합물을 반응시켜 비단백질성 L-아미노산을 얻는 단계를 포함하며,

O-아세틸-L-세린, O-아세틸-L-세린 SH효소 및 친핵화합물을 일정하게 계량하여 혼합시킴과 동시에 비단백질성 L-아미노산 함유용액을 제거하며,

상기 공정을 pH 5.0 내지 pH 7.4 범위의 pH에서 실시함을 특징으로 하는 제조방법.
비단백질 L-아미노산의 제조방법에 있어서,

촉매로서 O-아세틸-L-세린 SH효소를 사용하여 O-아세틸-L-세린과 친핵화합물을 반응시켜 비단백질 L-아미노산을 얻는 단계를 포함하며,

O-아세틸-L-세린으로서 O-아세틸-L-세린함유 발효배치를 사용하며,

상기 반응을 pH 5.0 내지 pH 7.4 범위의 pH에서 실시함을 특징으로 하는 제조방법.