JP4173777B2 - 微生物株、プラスミド、微生物株の製造方法及びホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸の製造方法 - Google Patents
微生物株、プラスミド、微生物株の製造方法及びホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸の製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4173777B2 JP4173777B2 JP2003199397A JP2003199397A JP4173777B2 JP 4173777 B2 JP4173777 B2 JP 4173777B2 JP 2003199397 A JP2003199397 A JP 2003199397A JP 2003199397 A JP2003199397 A JP 2003199397A JP 4173777 B2 JP4173777 B2 JP 4173777B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fermentation
- promoter
- serine
- acetyl
- cysteine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/12—Methionine; Cysteine; Cystine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
Description
【発明の属する技術分野】
本発明はホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸及びアミノ酸誘導体、例えばO−アセチル−L−セリン、N−アセチル−L−セリン、L−システイン、LL−シスチン及びL−システイン誘導体を発酵によって製造するための方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
20種の天然のタンパク質形成性のアミノ酸の製造は今日では微生物の発酵によって十分に実施される。その際に、微生物が天然アミノ酸の合成のための相応の生合成経路を有することを利用する。
【0003】
しかしながらかかる生合成経路は野生型の株において、アミノ酸を細胞の必要量までだけを製造することを保証する厳密な制御下にある。効率的な製造過程のための重要な前提条件は従って、野生型の生物に対して劇的に増大された所望のアミノ酸の製造のための生産能力を有する適当な微生物を提供することである。
【0004】
かかるアミノ酸過剰生産性の微生物は古典的な突然変異法/選択法及び/又は近代の特定の組み換え技術(“代謝工学”)によって作成できる。後者の場合にはまず遺伝子又はアレルを同定し、これを改変、活性化又は不活性化によって過剰生産をもたらす。これらの遺伝子/アレルを次いで分子生物学的技術によって微生物株に最適な過剰生産が達成されるように導入するか又は不活性化させる。しかしながら、しばしば最初に複数の異なる措置の組合せが有用な効率的な生産をもたらす。
【0005】
アミノ酸のホスホグリセレート−ファミリーは、その生合成が3−ホスホグリセリン酸から誘導されるアミノ酸であると定義される。代謝の天然の経路はまず中間段階を介して3−ホスホヒドロキシピルベート及び3−ホスホ−L−セリンをL−セリンに導く。L−セリンは更にグリシンに変換され、もしくはO−アセチル−L−セリンを介してL−システインに変換されうる。
【0006】
ホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸、特にL−セリン及びL−システインの発酵的製造のために、既に幾つかの遺伝子/アレルが従来の技術において公知であり、その使用がアミノ酸過剰生産を引き起こす:
− EP0620853号B1又はEP0931833号A2に記載されるようなserA−アレル
これらのserA−アレルは、L−セリンによる低減されたフィードバック阻害の影響下にある3−ホスホグリセレート−デヒドロゲナーゼをコードする。それによって3−ヒドロキシピルベートの形成は十分に細胞のセリン濃度によって解除される。
【0007】
− WO97/15673号(参照することにより内容が記載されたものとする)又はNakamori S. et al., 1998, Appl. Env. Microbiol. 64: 1607-1611(参照することにより内容が記載されたものとする)又はTakagi H. et al., 1999, FEBS Lett. 452: 323-327に記載されるような、微生物に導入されるcysE−アレル
これらのcysE−アレルはL−システインによる低減されたフィードバック阻害の影響下にあるセリン−O−アセチル−トランスフェラーゼをコードする。それによってO−アセチル−L−セリンもしくはL−システインの形成は十分に細胞のシステイン濃度によって解除される。
【0008】
− EP0885962号A1に記載されるような排出遺伝子
記載されるorf−遺伝子は、抗生物質及び別の毒性物質の排出のために適当であり、かつL−システイン、L−シスチン、N−アセチル−セリン及び/又はチアゾリジン誘導体の過剰生産に作用する排出系をおそらくコードしている。
【0009】
− DE19949579号C1に記載されるようなcysB−遺伝子
cysB−遺伝子は硫黄代謝の中心的遺伝子レギュレーターをコードし、かつ従ってシステイン生合成のためのスルフィドの調製において種々の役割を果たす。
【0010】
従来の技術から同様に、挙げられる方法はまたシステイン誘導体に導きうることも公知である。LL−シスチンがL−システインの酸化生成物としてか、又は2−メチル−チアゾリジン−2,4−ジカルボン酸がL−システイン及びピルベートの縮合生成物として発酵の間に生じうる。L−システインは細胞の中心的な硫黄供与体であるので、前記の方法は非常に多様な硫黄含有の代謝物(例えばL−メチオニン、(+)−ビオチン、チアミンなど)の製造のための出発点としても利用でき、これらは本願の範囲においてL−システイン誘導体として解釈される。
【0011】
更に、適当な手順においてはアミノ酸のN−アセチル−L−セリン(EP−A1−0885962号)もしくはO−アセチル−L−セリン(DE−A−10107002号)を主要発酵生成物として形成できることが記載された。L−セリンはまたDE−A−10219851号によれば比較的容易にN−アセチル−L−セリン含有発酵ブロスから得ることができる。
【0012】
【特許文献1】
EP0620853号B1
【特許文献2】
EP0931833号A2
【特許文献3】
WO97/15673号
【特許文献4】
EP0885962号A1
【特許文献5】
DE19949579号C1
【特許文献6】
EP−A1−0885962号
【特許文献7】
DE−A−10107002号
【特許文献8】
DE−A−10219851号
【非特許文献1】
Nakamori S. et al., 1998, Appl. Env. Microbiol. 64: 1607-1611
【非特許文献2】
Takagi H. et al., 1999, FEBS Lett. 452: 323-327
【0013】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸又はアミノ酸誘導体の過剰生産を可能にする組み換え微生物株を提供することである。他の課題は、ホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸又はアミノ酸誘導体を組み換え微生物株を用いて製造するための発酵的方法を提供することである。
【0014】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、ホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸の発酵的製造のために適当であり、出発株から製造できる微生物株において、該微生物が出発株に対して高められたyfiK遺伝子産物の活性又はyfiKホモログの遺伝子産物の活性を有することを特徴とする微生物株によって解決される。
【0015】
yfiK遺伝子産物の活性の向上は本発明の範囲においては、細胞中の遺伝子産物量の増大によって細胞中の高められた全活性を達成し、かつ従って遺伝子産物の比活性が不変に保持されるが、yfiK遺伝子産物の活性は細胞あたり高められている場合に与えられる。
【0016】
エシェリキア コリのyfiK遺伝子はゲノム配列決定(Blattner et al. 1997, Science 277: 1453-1462)の範囲においてオープンリーディングフレームとして同定され、かつ195個のアミノ酸を有するタンパク質をコードしていた。今まではyfiK遺伝子に生理学的機能は割り当てられていなかった。また配列ホモロジーを有するタンパク質によるデータベース調査(GCG Isconsin packageのFASTA-algorithmus、Genetics Computer Group (GLG) Madison, Wisconsin)も僅かな情報を提供するにすぎない。それというのも単にその機能が同様に未知であるタンパク質との類似性が示されているにすぎないからである。yfiK遺伝子産物の可能な活性のための唯一の根拠はAleshin他(Trends in Biol. Sci., 1999, 24: 133-135)によって見出された。そこにはアミノ酸−排出−タンパク質のタンパク質ファミリーに特徴的であるべき構造モチーフが仮定される。この少ないコンセンサスモチーフはYfiKタンパク質中にも存在するので、YfiKタンパク質はアミノ酸についての排出系でありうる。しかしながら当業者には、そこからYfiKタンパク質の具体的なアミノ酸基質の推論を引き出すことは不可能である。YfiK遺伝子産物がホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸の生産において有益に寄与するという発見は従って特に意想外である。それというのもYdeD遺伝子産物によって既にエシェリキア コリにおいてホスホグリセレートファミリーのアミノ酸に関する排出タンパク質が特徴付けされており(Dassler et al. Mol. Microbiol., 2000, 36: 1101-1112)かつ第2の系の存在は完全に期待されていなかったからである。興味深いことに、yfiK遺伝子産物とydeD遺伝子産物の間に構造の類似性は存在しない。
【0017】
yfiK遺伝子及びYfiK遺伝子産物(YfiKタンパク質)は配列番号1もしくは配列番号2の配列によって特徴付けられている。本発明の範囲においてyfiK−ホモログとして、分析時にアルゴリズムBESTFIT(GCG Wisconsin Package, Genetics Computer Group (GLG) Madison, Wisconsin)によって30%を上回る配列同一性を有する遺伝子を表す。特に有利には配列同一性は70%を上回る。
【0018】
同様に30%を上回る配列同一性(アルゴリズムBESTFIT(GCG Wisconsin Package, Genetics Computer Group (GLG) Madison, Wisconsin))を有するタンパク質はYfiK−ホモログとして解釈される。特に有利には70%を上回る配列同一性である。
【0019】
従ってyfiK−ホモログとしてはyfiK−遺伝子のアレル変異体、特に配列番号1に示される配列からヌクレオチドの欠失、挿入又は置換によって誘導されるが、その際、それぞれの遺伝子産物の酵素活性は保持される機能的変異体が表される。
【0020】
出発株に対して高められたyfiK−遺伝子産物の活性を有する本発明による微生物は分子生物学の標準的な技術によって作成できる。
【0021】
出発株としては、原則的にホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸のための生合成経路を有し、組み換え法が利用可能であり、かつ発酵によって培養可能な全ての生物が適当である。かかる微生物は菌類、酵母又は細菌であってよい。有利には真正細菌の系統群の細菌、有利には腸内細菌科の微生物及び、特にエシェリキア コリの種である。
【0022】
本発明による微生物におけるyfiK−遺伝子産物の活性の増大は、例えばyfiK−遺伝子の増強された発現によって達成される。この場合、微生物中のyfiK遺伝子のコピー数が高められていてよく、かつ/又はyfiK遺伝子の発現が適当なプロモーターによって高められていてよい。増強された発現とは、この場合有利にはyfiK遺伝子が少なくとも出発株よりも2倍強く発現されることを意味する。
【0023】
微生物中のyfiK遺伝子のコピー数の増大は当業者に公知の方法によって実施できる。従って、例えばyfiK遺伝子を細胞あたりに複数のコピー数を有するプラスミドベクター(例えばエシェリキア コリについてはpUC19、pBR322、pA−CYC184)中にクローニングし、かつ微生物中に導入してよい。選択的にyfiK遺伝子は微生物中の染色体中に複数組み込まれてよい。組み込み法としては、溶原性細菌ファージ、組み込みプラスミド又は相同組み換えによる組み込みによる公知の系を用いてよい(例えばHamilton et al., 1989,
J. bacteriol. 171: 4617-4622)。
【0024】
yfiK遺伝子をプロモーターのコントロール下にプラスミドベクターにクローニングすることによってコピー数を増大させることが有利である。yfiK遺伝子をpACYC−誘導体、例えばpACYC184−LH(ブタペスト条約によりドイツ細胞バンク(Deutschen Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen)(ブラウンシュヴァイク)に1995年8月18日にDSM10172の番号で寄託された)にクローニングすることによってエシェリキア コリのコピー数を増大させることが特に有利である。
【0025】
プラスミドによってコードされたyfiK遺伝子の発現のためのコントロール領域としては、遺伝子の天然のプロモーター領域及びオペレーター領域が用いられる。
【0026】
しかしながらyfiK遺伝子の増強された発現は、特に別のプロモーターによっても実施できる。例えばエシェリキア コリでのような相応のプロモーター系、gapA遺伝子の構成的GAPDHプロモーター又は誘導可能なlacプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、λプロモーター、araプロモーター又はtetプロモーターは当業者に公知である(Makrides S. C., 1996, Microbiol. Rev. 60: 512-538)。かかる構築物は当業者に公知のようにプラスミド上で又は染色体に使用できる。
【0027】
更に増強された発現は、翻訳開始シグナル、例えばリボソーム結合部位又は遺伝子の開始コドンがそれぞれの構築物に最適化された配列で存在するか、又は“コドン使用頻度”に従って稀なコドンを頻繁に存在するコドンと交換することによって達成することができる。
【0028】
前記の改変は本発明の有利な実施形である。
【0029】
プラスミドベクターへのyfiK遺伝子のクローニングは、例えば全yfiK遺伝子を包含する特異的プライマーの使用下でのポリメラーゼ連鎖反応による特異的な増幅及び引き続いてのベクター−DNA断片とのライゲーションによって実施される。
【0030】
yfiK遺伝子のクローニングのために有利なベクターとしては、既に増強された発現のためのプロモーター、例えばエシェリキア コリのgapA遺伝子の構成的なGAPDHプロモーターを有するプラスミドが使用される。
【0031】
従って本発明は、yfiK遺伝子とプロモーターとを有するプラスミドにも関する。
【0032】
更に、その使用によりホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸の過剰生産がもたらされる遺伝子/アレル、例えばcysEX−遺伝子(WO97/15673号)を有するベクターが特に有利である。かかるベクターは、高いアミノ酸過剰生産を伴う本発明による微生物株を任意の微生物株から直接的に製造することを可能にする。それというのもかかるプラスミドは微生物においてシステイン代謝のフィードバック阻害の低下をもたらすからである。
【0033】
従って本発明は、システイン代謝の脱調節のための遺伝子エレメント並びにyfiK遺伝子をプロモーターと一緒に有することを特徴とするプラスミドにも関する。
【0034】
通常の形質転換法(例えばエレクトロポレーション)によってyfiKを有するプラスミドを微生物中に導入し、かつ例えば抗生物質耐性を用いてプラスミドを有するクローンに対して選択する。
【0035】
従って本発明は出発株に本発明によるプラスミドを導入することを特徴とする本発明による微生物株の製造方法にも関する。
【0036】
ホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸を本発明による微生物株によって製造することは自体公知の方法により発酵槽中で実施される。
【0037】
従って本発明は、本発明による微生物株を発酵において使用し、かつ生産されたアミノ酸を発酵バッチから分離することを特徴とするホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸の製造方法にも関する。
【0038】
発酵槽における微生物株の培養は、連続培養として、回分培養として又は流加培養としても行われる。特に有利には発酵の間に連続的にC源を供給する。
【0039】
C源としては、有利には糖、糖アルコール又は有機酸が用いられる。特に有利には、本発明による方法においてC源としてはグルコース、ラクトース又はグリセリンが使用される。
【0040】
発酵の間に発酵槽中にC源の含量が0.1〜50g/lの範囲に保持されることを保証する形でC源を供給することが有利である。0.5〜10g/lの範囲が特に有利である。
【0041】
N源としては、本発明による方法において有利にはアンモニア、アンモニウム塩又はタンパク質加水分解物が使用される。pH安定化のための校正剤としてのアンモニアの使用により発酵の間に均一にN源が後供給される。
【0042】
他の培地添加物として、元素のリン、塩素、ナトリウム、マグネシウム、窒素、カリウム、カルシウム、鉄の塩を、かつ微量に(すなわちμMの濃度で)元素のモリブデン、ホウ素、コバルト、マンガン、亜鉛及びニッケルの塩を添加してよい。
【0043】
更に、有機酸(例えば酢酸塩、クエン酸塩)、アミノ酸(例えばイソロイシン)及びビタミン(例えばB1、B6)を培地に添加してよい。
【0044】
天然栄養源としては、例えば酵母エキス、コーンスティープリカー、ダイズ粉又は麦芽エキスを使用してよい。
【0045】
中温微生物のためのインキュベーション温度は、有利には15〜45℃、特に有利には30〜37℃である。
【0046】
発酵は、有利には好気的増殖条件下に実施される。発酵槽への酸素供給は圧縮空気又は純粋酸素によって実施される。
【0047】
発酵培地のpH値は発酵の間は、有利には5.0〜8.5、特に有利には7.0である。本発明によるO−アセチル−L−セリンの製造が望ましいのであれば、特に有利なpH領域は5.5〜6.5である。
【0048】
L−システイン及びL−システイン誘導体の製造のために発酵の間に硫黄源を給餌しなければならない。有利にはこの場合、硫酸塩又はチオ硫酸塩が使用される。
【0049】
前記の方法により発酵を行う微生物は回分法又は流加法で増殖期の後に10〜150時間でホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸を高い効率で培養培地中に分泌する。
【0050】
以下の実施例を本発明の更なる説明に用いる。
【0051】
【配列表】
【0052】
【外1】
【0053】
【外2】
【0054】
【外3】
【0055】
【外4】
【0056】
【実施例】
例1:
エシェリキア コリ株W3110からのyfiK遺伝子をプロテアーゼ連鎖反応を用いて増幅させた。特異的プライマーとしてオリゴヌクレオチド
yfiK−fw:(配列番号3)
【0057】
【外5】
【0058】
及び
yfiK−rev:(配列番号4)
【0059】
【外6】
【0060】
を用いる。
【0061】
得られるDNA断片を制限酵素AsnI及びPacIによって消化し、アガロースゲル電気泳動によって純化し、かつ単離した(Qiaquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden, D)。クローニングは、EP0885962号A1に詳細に記載されているNdeI/PacIで切断したベクターpACYC184−cysEX−GAPDHとのライゲーションによって実施した。該ベクターはL−システインによる低減されたフィードバック阻害を有するセリンアセチルトランスフェラーゼをコードし、かつその3′側にgapA遺伝子の構成的なGAPDHプロモーターを有するcysEX遺伝子を有する。前記の挙動によってyfiK遺伝子は、そこから転写が開始できるようにGAPDHプロモーターの後方に配置されている。得られるベクターはpG13という名称を有し、かつ図1に見取り図として示されている。構築物の検証の後に、エシェリキア コリ株W3110を形質転換させ、かつ相応の形質転換体をテトラサイクリンで選択した。細菌株のエシェリキア コリW3110/pG13はDSMZ(Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,D-38142 Braunschweig)でDSM15095の番号でブタペスト条約により寄託され、かつ以下の実施例でホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸の製造のための生産株として用いた。高められたyfiK遺伝子の発現の効果の証明のための比較株として、同様にEP0885962号A1に詳細に記載されているが、pG13に対してGAPDH−プロモーター−yfik−配列を有さないW3110/pACYC184−cysEXを選択した。
【0062】
例2:生産株の前培養
発酵のための前培養として、付加的に15mg/lのテトラサイクリンを含有する20mlのLB培地(10g/lのトリプトン、5g/lの酵母エキス、10g/lのNaCl)にW3110/pG13もしくはW3110/pACYC184−cysEXを接種し、かつ30℃及び150rpmで振盪器中でインキュベートした。6時間後にバッチ全体を、5g/lのグルコース;0.5mg/lのビタミンB1及び15mg/lのテトラサイクリンを補った100mlのSM1培地(12g/lのK2HPO4;3g/lのKH2PO4;5g/lの(NH4)2SO4;0.3g/lのMgSO4×7H2O;0.015g/lのCaCl2×2H2O;0.002g/lのFeSO4×7H2O;1g/lのNa3クエン酸塩×2H2O;0.1g/lのNaCl;0.15g/lのNa2MoO4×2H2O;2.5g/lのNa3BO3;0.7g/lのCoCl2×6H2O;0.25g/lのCuSO4×5H2O;1.6g/lのMnCl2×4H2O;0.3g/lのZnSO4×7H2Oからなる1ml/lの微量元素溶液)に移した。更なるインキュベーションを30℃で150rpmにおいて17時間実施した。
【0063】
例3:O−アセチル−L−セリンの発酵的製造
発酵槽として、2lの最大培養容量を有するブラウンビオテック(Braun Biotech)社(Melsungen, D)のビオスタット(Biostat)M装置を用いた。例2に記載される前培養(600nmでの光学密度は約3)を、15g/lのグルコース、0.1g/lのトリプトン、0.05g/lの酵母エキス、0.5mg/lのビタミンB1及び15mg/lのテトラサイクリンを補った900mlのSM1培地を有する発酵槽に接種した。発酵の間に32℃の温度に調整し、かつpH値を25%のアンモニアの供給によって6.0の値で一定に保持した。該培養を滅菌された圧縮空気によって1.5容量/容量/分でガス処理し、かつ撹拌回転速度200rpmで撹拌した。50%の値への酸素飽和の低減の後に、制御装置を介して回転数を1200rpmの値にまで高めて、50%の酸素飽和が保持した(pO2プローブによって測定し、900rpmで100%の飽和に校正した)発酵槽中のグルコース含量が当初の15g/lから約5〜10g/lに低下したらすぐに、56%のグルコース溶液の供給を実施した。給餌は6〜12ml/時間の流速で実施し、その際、発酵槽中のグルコース濃度は0.5〜10g/lで一定に保持した。グルコース測定をYSI社のグルコース分析器(Yellow Springs, Ohio, USA)を用いて実施した。発酵時間は28時間であった。この時間の後に試料を採取し、かつこれらの細胞を遠心分離によって培養培地から分離した。得られる培養上清をLUNA 5μ C18(2)−カラム(Phenomenex, Aschaffenburg, Deutschland)で流速0.5ml/分で逆相HPLCによって分析した。溶出剤として希釈されたリン酸(0.1mlの濃リン酸/l)を用いた。第1表は培養上清中の主要代謝産物の達成された含量を示している。これらは、中性ないしアルカリ性の条件でO−アセチル−L−セリンから異性体化によって増大して生じるO−アセチル−L−セリン及びN−アセチル−L−セリンである。
【0064】
第1表:
【0065】
【表1】
【0066】
例4:N−アセチル−L−セリンの発酵的製造
N−アセチル−N−セリンの製造のために例2及び3におけるのと同様に行った。発酵槽中のpH値を7.0の値に調整したに過ぎない。それによってO−アセチル−L−セリンのN−アセチル−L−セリンへの異性体化は促進され、かつ主要生成物としてN−アセチル−L−セリンが得られた。発酵時間は48時間であった。
【0067】
第2表:
【0068】
【表2】
【0069】
例5:L−システイン及びL−システイン誘導体の発酵的製造
L−システインの製造のために例2及び3におけるのと同様に行った。発酵槽中のpH値を7.0の値に調整し、チオ硫酸塩の給餌を行ったに過ぎない。更に、2時間後に30%のNaチオ硫酸塩溶液の供給を3ml/時間の速度で行った。発酵時間は48時間であった。L−システインの生産を比色的にガイトンデ(Gaitonde)による試験(Gaitonde, M. K. (1967), Biochem. J. 104, 627-633)によって調査した。この場合に、該試験はL−システイン及びEP0885962号A1に記載されるL−システイン及びピルベートの縮合生成物(2−メチル−チアゾリジン−2,4−ジカルボン酸)の間を区別できないことを顧慮すべきである。L−システインの酸化によって生じるLL−システインは前記試験においてジチオトレイトール(DTT)による還元によりpH8.0の希釈された溶液中で同様にL−システインとして検出される。
【0070】
第3表
【0071】
【表3】
【図面の簡単な説明】
【図1】図1はプラスミドpG13の構造を示している。
Claims (17)
- 出発株から製造可能な、L−システインによる低減されたフィードバック阻害を有するセリン−O−アセチル−トランスフェラーゼをコードするcysE−アレルを有する、O−アセチル−L−セリン、N−アセチル−L−セリン又はL−システインの発酵的製造のために適当な微生物株において、該微生物株が出発株に対して高められたyfiK遺伝子産物の活性を有することを特徴とする微生物株。
- 菌類、酵母又は細菌である、請求項1記載の微生物株。
- 腸内細菌科の細菌である、請求項2記載の微生物株。
- 種エシェリキア コリである、請求項3記載の微生物株。
- 微生物中でyfiK遺伝子のコピー数が高められているか、又はyfiK遺伝子の発現が適当なプロモーター又は翻訳シグナルの使用によって高められた、請求項1から4までのいずれか1項記載の微生物株。
- プロモーターがgapA遺伝子の構成的なGAPDHプロモーター、誘導可能なlacプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、λプロモーター、araプロモーター及びtetプロモーターの群から選択される、請求項5記載の微生物株。
- yfiK遺伝子産物の高められた活性がpACYC誘導体におけるyfiK遺伝子のコピー数の増大に基づくエシェリキア コリ株である、請求項1から6までのいずれか1項記載の微生物株。
- プラスミドにおいて、L−システインによる低減されたフィードバック阻害を有するセリン−O−アセチル−トランスフェラーゼをコードする、システイン代謝の脱調節のための遺伝子エレメントを有し、かつyfiK遺伝子をプロモーターと一緒に有することを特徴とするプラスミド。
- 出発株に請求項8記載のプラスミドを導入する、請求項1から7までのいずれか1項記載の微生物株の製造方法。
- O−アセチル−L−セリン、N−アセチル−L−セリン又はL−システインの製造方法において、請求項1から7までのいずれか1項記載の微生物株を発酵において使用し、かつ製造されたアミノ酸を発酵バッチから分離することを特徴とするO−アセチル−L−セリン、N−アセチル−L−セリン又はL−システインの製造方法。
- 微生物株を発酵槽において連続培養、回分培養又は流加培養として培養する、請求項10記載の方法。
- 発酵の間にC源を連続的に供給する、請求項10又は11記載の方法。
- 発酵のC源として糖、糖アルコール又は有機酸を用いる、請求項10から12までのいずれか1項記載の方法。
- 発酵のC源の供給を、発酵槽中のC源の含量が発酵の間に0.1〜50g/lの範囲内に保持されることを保証する形で実施する、請求項10から13までのいずれか1項記載の方法。
- 発酵のC源の供給を、発酵槽中のC源の含量が発酵の間に0.5〜10g/lの範囲内に保持されることを保証する形で実施する、請求項14記載の方法。
- 発酵のN源としてアンモニア、アンモニウム塩又はタンパク質加水分解物を使用する、請求項10から15までのいずれか1項記載の方法。
- 発酵を好気的増殖条件下に実施する、請求項10から16までのいずれか1項記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE10232930A DE10232930A1 (de) | 2002-07-19 | 2002-07-19 | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren und Aminosäure-Derivaten der Phosphoglycerat-Familie |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004049237A JP2004049237A (ja) | 2004-02-19 |
JP4173777B2 true JP4173777B2 (ja) | 2008-10-29 |
Family
ID=29762075
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2003199397A Expired - Lifetime JP4173777B2 (ja) | 2002-07-19 | 2003-07-18 | 微生物株、プラスミド、微生物株の製造方法及びホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸の製造方法 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20040038352A1 (ja) |
EP (1) | EP1382684B1 (ja) |
JP (1) | JP4173777B2 (ja) |
KR (1) | KR100546733B1 (ja) |
CN (1) | CN1330750C (ja) |
AT (1) | ATE312192T1 (ja) |
CA (1) | CA2433485A1 (ja) |
DE (2) | DE10232930A1 (ja) |
DK (1) | DK1382684T3 (ja) |
ES (1) | ES2252593T3 (ja) |
RU (1) | RU2346038C2 (ja) |
TW (1) | TWI330199B (ja) |
Families Citing this family (40)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE10232930A1 (de) * | 2002-07-19 | 2004-02-05 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren und Aminosäure-Derivaten der Phosphoglycerat-Familie |
DE10331291A1 (de) | 2003-07-10 | 2005-02-17 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Varianten der 3-Phosphoglyceratdehydrogenase mit reduzierter Hemmung durch L-Serin und dafür codierende Gene |
ES2619176T3 (es) * | 2003-09-30 | 2017-06-23 | Mitsui Chemicals, Inc. | Biocatalizador para producir ácido D-láctico |
US8114626B2 (en) * | 2004-02-10 | 2012-02-14 | Trustees Of Dartmouth College | Yeast strain and method for using the same to produce nicotinamide riboside |
US8383372B2 (en) * | 2008-03-06 | 2013-02-26 | Ajinomoto Co., Inc. | L-cysteine producing bacterium and a method for producing L-cysteine |
JP5332237B2 (ja) * | 2008-03-06 | 2013-11-06 | 味の素株式会社 | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 |
JP5521347B2 (ja) * | 2009-02-16 | 2014-06-11 | 味の素株式会社 | L−アミノ酸生産菌及びl−アミノ酸の製造法 |
JP5359409B2 (ja) | 2009-03-12 | 2013-12-04 | 味の素株式会社 | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 |
KR100987062B1 (ko) * | 2009-10-26 | 2010-10-11 | 림버스산업 주식회사 | 배수시트 교체가 용이한 교량 신축이음장치 및 이의 시공방법 |
ES2646165T3 (es) | 2009-11-30 | 2017-12-12 | Ajinomoto Co., Inc. | Bacteria que produce L-cisteína y procedimiento para la producción de L-cisteína |
RU2460793C2 (ru) | 2010-01-15 | 2012-09-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий семейства enterobacteriaceae |
CN103119154B (zh) | 2010-09-14 | 2015-11-25 | 味之素株式会社 | 含硫氨基酸生产菌以及含硫氨基酸的制造方法 |
JP2014087259A (ja) | 2011-02-22 | 2014-05-15 | Ajinomoto Co Inc | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 |
BR112013023465B1 (pt) | 2011-04-01 | 2020-10-27 | Ajinomoto Co., Inc | método para produzir l-cisteína |
JP2014131487A (ja) | 2011-04-18 | 2014-07-17 | Ajinomoto Co Inc | L−システインの製造法 |
DE102011075656A1 (de) | 2011-05-11 | 2012-03-29 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Produktion von L-Cystin |
DE102011078481A1 (de) | 2011-06-30 | 2013-01-03 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Produktion von natürlichem L-Cystein |
DE102012208359A1 (de) | 2012-05-18 | 2013-11-21 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Produktion von L-Cystein und Derivaten dieser Aminosäure |
DE102012216527A1 (de) | 2012-09-17 | 2014-03-20 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Produktion von L-Cystein und Derivaten dieser Aminosäure |
CN105247038B (zh) | 2013-03-15 | 2021-08-27 | 小利兰·斯坦福大学托管委员会 | 产生苄基异喹啉生物碱(bia)的微生物及其制备和使用方法 |
CN105008532B (zh) | 2013-05-13 | 2017-07-21 | 味之素株式会社 | L‑氨基酸的制造方法 |
DE102013209274A1 (de) * | 2013-05-17 | 2014-11-20 | Wacker Chemie Ag | Mikroorganismus und Verfahren zur fermentativen Überproduktion von Gamma-Glutamylcystein und Derivaten dieses Dipeptids |
JP2016165225A (ja) | 2013-07-09 | 2016-09-15 | 味の素株式会社 | 有用物質の製造方法 |
WO2015060314A1 (ja) | 2013-10-21 | 2015-04-30 | 味の素株式会社 | L-アミノ酸の製造法 |
JP6519476B2 (ja) | 2013-10-23 | 2019-05-29 | 味の素株式会社 | 目的物質の製造法 |
CA2965469A1 (en) * | 2013-11-04 | 2015-05-07 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Benzylisoquinoline alkaloid (bia) precursor producing microbes, and methods of making and using the same |
CN107614688B (zh) | 2015-05-04 | 2023-02-28 | 小利兰·斯坦福大学托管委员会 | 产生苄基异喹啉生物碱(bia)前体的微生物及其制备和使用方法 |
DK3294865T3 (da) | 2015-05-08 | 2023-05-08 | Univ Leland Stanford Junior | Fremgangsmåder til fremstilling af epimeraser og benzylisoquinolinalkaloider |
KR101825310B1 (ko) * | 2016-12-29 | 2018-03-15 | 씨제이제일제당 (주) | O-포스포세린을 생산하는 에스케리키아 속 미생물 및 이를 이용한 o-포스포세린 또는 l-시스테인을 생산하는 방법 |
JP7066977B2 (ja) | 2017-04-03 | 2022-05-16 | 味の素株式会社 | L-アミノ酸の製造法 |
BR112020002050A2 (pt) | 2017-08-03 | 2020-09-08 | Antheia, Inc. | epimerases engenheiradas alcaloides benzilisoquinolina e métodos de produção de alcaloides benzilisoquinolina |
WO2020071538A1 (en) | 2018-10-05 | 2020-04-09 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing target substance by bacterial fermentation |
JP2022521544A (ja) | 2019-02-22 | 2022-04-08 | 味の素株式会社 | ydiJ遺伝子を過剰発現する腸内細菌科に属する細菌を用いたL-アミノ酸の製造方法 |
BR112021017870A2 (pt) | 2019-04-05 | 2021-12-07 | Ajinomoto Kk | Método para produzir um l-aminoácido |
CN110317766B (zh) * | 2019-05-23 | 2020-08-28 | 浙江工业大学 | 一种高产l-半胱氨酸的基因工程菌、构建方法及应用 |
JP2022550084A (ja) | 2019-09-25 | 2022-11-30 | 味の素株式会社 | 細菌の発酵によるl-アミノ酸の製造方法 |
EP4103729B1 (de) | 2020-04-03 | 2023-10-18 | Wacker Chemie AG | Biokatalysator als kernkomponente eines enzymkatalysierten redoxsystems zur biokatalytischen reduktion von cystin |
WO2021259491A1 (de) | 2020-06-26 | 2021-12-30 | Wacker Chemie Ag | Verbesserte cystein produzierende stämme |
KR20230044012A (ko) | 2021-07-05 | 2023-03-31 | 와커 헤미 아게 | 설핀산의 설폰산으로의 효소적 산화 방법 |
WO2023165684A1 (de) | 2022-03-01 | 2023-09-07 | Wacker Chemie Ag | Verbesserte cystein produzierende stämme |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19726083A1 (de) * | 1997-06-19 | 1998-12-24 | Consortium Elektrochem Ind | Mikroorganismen und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Cystein, L-Cystin, N-Acetyl-Serin oder Thiazolidinderivaten |
RU2175351C2 (ru) * | 1998-12-30 | 2001-10-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | Фрагмент днк из escherichia coli, определяющий повышенную продукцию l-аминокислот (варианты), и способ получения l-аминокислот |
DE10232930A1 (de) * | 2002-07-19 | 2004-02-05 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren und Aminosäure-Derivaten der Phosphoglycerat-Familie |
-
2002
- 2002-07-19 DE DE10232930A patent/DE10232930A1/de not_active Withdrawn
-
2003
- 2003-07-10 ES ES03015546T patent/ES2252593T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-07-10 AT AT03015546T patent/ATE312192T1/de active
- 2003-07-10 DK DK03015546T patent/DK1382684T3/da active
- 2003-07-10 EP EP03015546A patent/EP1382684B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-07-10 DE DE50301836T patent/DE50301836D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-07-16 US US10/620,487 patent/US20040038352A1/en not_active Abandoned
- 2003-07-17 CA CA002433485A patent/CA2433485A1/en not_active Abandoned
- 2003-07-18 JP JP2003199397A patent/JP4173777B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2003-07-18 RU RU2003122076/13A patent/RU2346038C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2003-07-18 KR KR1020030049274A patent/KR100546733B1/ko active IP Right Grant
- 2003-07-18 TW TW092119756A patent/TWI330199B/zh not_active IP Right Cessation
- 2003-07-18 CN CNB031786677A patent/CN1330750C/zh not_active Expired - Lifetime
-
2006
- 2006-02-09 US US11/351,137 patent/US20060148041A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20040010256A (ko) | 2004-01-31 |
CN1487079A (zh) | 2004-04-07 |
TWI330199B (en) | 2010-09-11 |
DK1382684T3 (da) | 2006-03-06 |
DE10232930A1 (de) | 2004-02-05 |
JP2004049237A (ja) | 2004-02-19 |
US20040038352A1 (en) | 2004-02-26 |
RU2346038C2 (ru) | 2009-02-10 |
RU2003122076A (ru) | 2005-02-27 |
US20060148041A1 (en) | 2006-07-06 |
ATE312192T1 (de) | 2005-12-15 |
KR100546733B1 (ko) | 2006-01-26 |
TW200402471A (en) | 2004-02-16 |
EP1382684B1 (de) | 2005-12-07 |
CA2433485A1 (en) | 2004-01-19 |
EP1382684A1 (de) | 2004-01-21 |
ES2252593T3 (es) | 2006-05-16 |
CN1330750C (zh) | 2007-08-08 |
DE50301836D1 (de) | 2006-01-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4173777B2 (ja) | 微生物株、プラスミド、微生物株の製造方法及びホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸の製造方法 | |
CA2386539C (en) | Method for production of l-cysteine or l-cysteine derivatives by fermentation | |
CA2235419C (en) | Microorganisms and processes for the fermentative preparation of l-cysteine, l-cystine, n-acetylserine or thiazolidine derivatives | |
DK2314710T3 (en) | A process for the production of methionine by culturing a microorganism modified to enhance the production of cysteine | |
JP2008504048A (ja) | L−メチオニン生産菌株及び前記菌株を用いたl−メチオニンの生産方法 | |
JP2013543723A (ja) | O−ホスホセリンを生産する微生物およびそれを用いてo−ホスホセリンからl−システインまたはその誘導体を生産する方法 | |
US7582460B2 (en) | 3-phosphoglycerate dehydrogenase variants whose inhibition by L-serine is reduced, and genes encoding them | |
ES2268504T3 (es) | Procedimiento para la preparacion por fermentacion de l-metionina. | |
JP6828038B2 (ja) | 低分子量物質およびタンパク質の抗生物質を含まない発酵製造のための微生物株および方法 | |
US20200216867A1 (en) | Method for producing l-tryptophan using improved strains of the enterobacteriaceae family | |
JP2014512841A (ja) | 調整された酸素飽和条件下における、発酵によるl−シスチンの製造方法 | |
US20140342399A1 (en) | Microorganism and method for overproduction of gamma-glutamylcysteine and derivatives of this dipeptide by fermentation | |
US7195897B2 (en) | Feedback-resistant homoserine transsuccinylases having a modified c-terminus | |
RU2723714C2 (ru) | Способ и микроорганизм для ферментативного продуцирования метионина с улучшенным выходом метионина | |
JP2019149972A (ja) | エルゴチオネイン合成微生物、及びエルゴチオネインの製造方法 | |
JP3721136B2 (ja) | O−アセチル−l−セリンを発酵法で製造する方法 | |
US20100047861A1 (en) | Process for producing useful substance | |
JP2010022215A (ja) | L−システインの製造方法 | |
WO2021254927A1 (en) | Methods for producing biotin in genetically modified microorganisms | |
Bubnov et al. | Glutamyl-and Glutaminyl-tRNA synthetases are a promising target for the design of an L-Threonine–producing strain | |
JP6258329B2 (ja) | L−システインおよび該アミノ酸の誘導体の発酵生産方法 | |
RU2458982C2 (ru) | Способ получения l-цистеина, l-цистина, s-сульфоцистеина или тиазолидинового производного l-цистеина, или их смеси с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae | |
JPWO2008126785A1 (ja) | 有用物質の製造法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060524 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20060821 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20060824 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20061121 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070216 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20070327 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20070330 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20070516 |
|
RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20070525 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070810 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20080716 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20080814 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Ref document number: 4173777 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110822 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120822 Year of fee payment: 4 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130822 Year of fee payment: 5 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |