ES2619176T3 - Biocatalizador para producir ácido D-láctico - Google Patents
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Abstract
Un microorganismo recombinante en el que la actividad de D-lactato deshidrogenasa dependiente de FAD (did) inherente en el microorganismo recombinante esta inactivada o reducida, la actividad de piruvato formiato-liasa (pfl) esta inactivada o reducida y la actividad de D-lactato deshidrogenasa dependiente de NADH derivada de Escherichia coli (ldhA) esta potenciada.
Description
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Cantidad de ácido D-láctico acumulada
Cantidad recuperada de solución de cultivo
Peso de masa microbiana seca Pureza óptica del ácido Dláctico
Cantidad de ácido D-láctico acumulada después de 50 h del inicio del cultivo
[Ejemplo 3] Producción de ácido láctico por bacterias productoras de ácido láctico de cepa MT-10934/pGlyldhA
La cepa MT-10934/pGlyldhA, que es la bacteria productora de ácido láctico obtenida en el Ejemplo 2, se inoculó en 25 ml de caldo de cultivo LB, solución de cultivo de Miller (Difco244620) contenida en un matraz cónico, y se llevó a cabo cultivo como precultivo de la misma manera que se ha descrito en el Ejemplo 1. Después de completar el cultivo, se realizaron ensayo de los ácidos lácticos y medición de la pureza óptica de los mismos con HPLC de acuerdo con un método establecido. Los resultados se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3
94 g/kg de solución de cultivo 570 g
2,0 g 99,9 %ee o más
65,2 g/kg
En los resultados, se considera que la razón por la que la cantidad total de ácido láctico es mayor que la cantidad de glucosa añadida al inicio del cultivo es que la fuente de carbono en el agua de macerado de maíz se ha usado. Sin embargo, usando todo el azúcar reductor, ácidos orgánicos y aminoácidos en agua de macerado de maíz, se consiguió la tasa de conversión del 90 % o más.
[Ejemplo 4] Clonación de una región adyacente al gen de pfl de Escherichia coli
La secuencia de bases completa del ADN genómico de Escherichia coli se conoce (número de referencia de GenBank: U00096), y la secuencia de bases de un gen que codifica piruvato formiato-liasa de Escherichia coli (en lo sucesivo en el presente documento, puede denominarse pfl) también se ha indicado (número de referencia de GenBank: AE000192). Para clonar la región adyacente a la secuencia de bases de un gen que codifica pfl (2.283 pb), se sintetizaron cuatro tipos de cebadores oligonucleotídicos mostrados en las Secuencias N.º 5, 6, 7 y 8. Los cebadores de las Secuencias N.º 6 y 7 tienen sitio de reconocimiento SphI en el extremo 5' terminal.
El ADN del genoma de la cepa de Escherichia coli MG1655 se preparó por el método descrito en Current Protocols in Molecular Biology (JohnWiley & Sons). Usando combinaciones de 1 µg del ADN del genoma obtenido con el cebador que tiene la secuencia de bases de Secuencia N.º 5 y el cebador que tiene la secuencia de bases de Secuencia N.º 6, y con el cebador que tiene la secuencia de bases de Secuencia N.º 7 y el cebador que tiene la secuencia de bases de Secuencia N.º 8, se realizó PCR en condiciones habituales usando 100 pmol de cada uno de los ADN de cebadores anteriormente mencionados para amplificar fragmentos de ADN de aproximadamente 1,8 kpb (en lo sucesivo en el presente documento, puede denominarse un fragmento pflB-L) y aproximadamente 1,3 kpb (en lo sucesivo en el presente documento, puede denominarse un fragmento pflB-R). Estos fragmentos de ADN se aislaron por electroforesis en agarosa, se recuperaron y el fragmento de pflB-L se digirió con HindIII y SphI, y el fragmento de pflB-R se digirió con SphI y PstI, respectivamente. Estos dos tipos de fragmentos digeridos y un producto de digestión de plásmido sensible a temperatura pTH18cs1 (N.º de referencia de GenBank: AB019610) (Hashimoto-Gotoh, T., et al., Gene, Vol. 241 (1), pp185-191 (2000)) con HindIII y PstI se hicieron reaccionar con ADN ligasa T4, y después el producto se transformó en una célula competente de Escherichia coli DH5α (TAKARA BIO INC.), para proporcionar un plásmido que contiene dos fragmentos, es decir, un fragmento adyacente cadena arriba 5' y un fragmento adyacente cadena abajo 3' de un gen que codifica pflB, que se designó pTH∆pfl.
[Ejemplo 5] Preparación de cepa con gen de pfl alterado de la cepa de Escherichia coli MG1655
El plásmido pTH∆pfl obtenido en el Ejemplo 4 se transformó en la cepa de Escherichia coli MG1655, se cultivó durante la noche en placa de agar LB que contenía 10 µg/ml de cloranfenicol a 30 ºC, a la que la célula puede mantener un plásmido sensible a temperatura, para proporcionar un transformante. El transformante obtenido se cultivó en un medio LB a 30 °C durante 3 horas hasta una noche, y después se diluyó convenientemente con un medio líquido LB o solución salina, y se aplicó a una placa de agar LB que contenía 10 µg/ml de cloranfenicol. Esta placa de agar LB se cultivó a 42 °C, a la que el plásmido sensible a la temperatura no puede mantenerse, y el transformante cultivado se obtuvo como una cepa en la que la longitud completa del plásmido está integrada en el genoma de Escherichia coli por recombinación homóloga entre exogenoma y genoma.
A partir de esta cepa, se adquirió un ADN genómico, y se realizó PCR usando este como molde. Se confirmó que ya que el gen resistente al cloranfenicol contenido en pTH18cs1 está presente en el genoma y que están presentes
13
microbiana cultivada, la masa microbiana cultivada se aplicó a una placa de agar LB que contenía 10 µg/ml de cloranfenicol para proporcionar colonias que crecían a 42 ºC.
Además, la operación se repitió de nuevo para obtener colonias individuales que crecían a 42 ºC, y se seleccionó un 5 clon, en el que el plásmido completo se integró en el cromosoma por recombinación homóloga. Se confirmó que el presente clon no tenía el plásmido en el citoplasma.
A continuación, el clon anteriormente mencionado se aplicó a una placa de agar LB, y se cultivó durante una noche a 30 ºC, y después se inoculó en un medio líquido LB (3 ml/tubo de ensayo) y se cultivó con agitación a 42 ºC 10 durante 3 a 4 horas. Este se diluyó convenientemente (aproximadamente 102 a 106) para obtener colonias individuales, y la solución diluida se aplicó a una placa de agar LB y se cultivó durante una noche a 42 ºC para proporcionar colonias. A partir de las colonias cultivadas, se seleccionaron aleatoriamente 100 colonias, y cada una de ellas se cultivó en una placa de agar LB y una placa de agar LB que contenía 10 µg/ml de cloranfenicol. Se seleccionaron de ellas clones sensibles a cloranfenicol que crecían solamente en una placa de agar LB. Además, se
15 amplificó un fragmento de aproximadamente 2,0 kpb que contenía dld mediante PCR usando el ADN cromosómico de estos clones deseados, y se seleccionó una cepa en la que una región génica de dld estaba suprimida. El clon que satisfizo la descripción anterior se eligió como la cepa con dld suprimido, y la cepa obtenida se designó cepa MG1655∆dld.
20 [Ejemplo 14] Producción de ácido D-láctico por la cepa MG1655∆dld
La cepa MG1655 o cepa MG1655∆dld se inoculó en 25 ml de caldo de cultivo LB, solución de cultivo de Miller (Difco244620) contenida en un matraz cónico, y se llevó a cabo cultivo con agitación durante una noche con 120 rpm como precultivo. La cantidad completa de cada solución de precultivo se movió por separado a un fermentador de 25 BMJ-01, un aparato de cultivo fabricado por ABLE Corporation, que contenía 475 g del medio de la composición como se muestra en la Tabla 20, y se llevó a cabo cultivo. Se llevó a cabo cultivo en condiciones que incluían presión atmosférica, una tasa de aireación de 0,5 vvm, una velocidad de agitación de 200 rpm, una temperatura de cultivo de 31 ºC, y pH de 6,7 (ajustado con NaOH) durante 96 horas. Después de 48 horas y después de completar el cultivo, se realizó el ensayo de ácido láctico, ácido pirúvico, ácido fórmico y ácido acético con HPLC de acuerdo
30 con un método establecido. Los resultados después de 48 horas se muestran en la Tabla 21, y los resultados después de completar el cultivo se muestran en la Tabla 22, en la que la cepa MG1655 y la cepa MG1655∆dld están representadas por Silvestre y ∆dld, respectivamente.
Tabla 20 35 Composición de medio
Glucosa 100 g/l Na2HPO4·2H2O 6,0 g/l (NH4)2SO4 6,0 g/l KH2PO4 3,0 g/l NaCI 3,0 g/l MgSO4·7aq 0,1 g/l Extracto de levadura 0,5 g/l Casaminoácido 5,0 g/l
Tabla 21 Resultados después de 48 horas
Silvestre ∆dld
- Cantidad de ácido D-láctico acumulada
- 26 g/l 22 g/l
- Cantidad de ácido pirúvico acumulada 4,5 g/l
- 1,1 g/l
- Cantidad de ácido fórmico acumulada 5,0 g/l
- 1,55 g/l
- Cantidad de ácido acético acumulada
- 14 g/l 9,5 g/l
40 Tabla 22 Resultados después de 96 horas
Silvestre ∆dld
- Cantidad de ácido D-láctico acumulada
- 36 g/l 41 g/l
- Cantidad de ácido pirúvico acumulada 5,84 g/l
- 1,26 g/l
- Cantidad de ácido fórmico acumulada 3,4 g/l
- 0 g/l
- 18
5
15
25
35
45
55
65
[Ejemplo 19] Sustitución del promotor de ldhA en el genoma de la cepa de Escherichia coli MG1655∆pfl∆dld con promotor de GAPDH
Se conoce la secuencia de bases completa del ADN genómico de Escherichia coli (número de referencia de GenBank: U00096), y también se ha indicado la secuencia de bases del gen de ldhA de Escherichia coli (número de referencia de GenBank: U36928). Se realizó PCR usando AAGGTACCACCAGAGCGTTCTCAAGC (secuencia N.º 17) y GCTCTAGATTCTCCAGTGATGTTGAATCAC (secuencia N.º 18), que se prepararon basándose en la información génica de la región adyacente 5’ del gen de ldhA derivado de la cepa de Escherichia coli MG1655, usando ADN genómico de Escherichia coli como un molde, para amplificar un fragmento de ADN de aproximadamente 1000 pb.
Además, se realizó PCR usando GGTCTAGAGCAATGATTCACACGATTCG (secuencia N.º 19), que se preparó basándose en la información de secuencia del promotor de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) de la cepa de Escherichia coli MG1655, y AACTGCAGGTTCGTTCTCATACACGTCC (secuencia N.º 20), que se preparó basándose en la información de secuencia del gen de ldhA de la cepa de Escherichia coli MG1655, usando el vector de expresión pGAPldhA preparado en el Ejemplo 18 como un molde, para proporcionar un fragmento de ADN de aproximadamente 850 pb que contiene un promotor de GAPDH y una región adyacente al codón de inicio del gen de ldhA.
El fragmento obtenido anteriormente se digirió con enzimas de restricción KpnI y XbaI, y XbaI y PstI, respectivamente, y este fragmento se mezcló con el fragmento obtenido por digestión del plásmido sensible a temperatura pTH18cs1 con KpnI y PstI, se ligó usando una ligasa y después se transformó en una célula competente DH5α (fabricada por TAKARA BIO INC.) a 30 °C, para proporcionar un transformante que crece en una placa de agar LB que contiene 10 µg/ml de cloranfenicol. La colonia obtenida se cultivó en un medio líquido LB que contenía 10 µg/ml de cloranfenicol a 30 °C durante una noche, el plásmido se recuperó de la masa microbiana obtenida, que se designó pTH-GAPldhA. pTH-GAPldhA se transformó en la cepa MG1655∆pfl∆dld a 30 °C, se cultivó en una placa de agar LB que contenía 10 µg/ml de cloranfenicol a 30 °C durante una noche, para proporcionar un transformante. El transformante obtenido se inoculó en un medio líquido LB que contenía 10 µg/ml de cloranfenicol, y se cultivó durante una noche a 30 °C. A continuación, para obtener masa microbiana cultivada, el transformante cultivado se aplicó a una placa de agar LB que contenía 10 µg/ml de cloranfenicol para proporcionar colonias que crecían a 42 °C. Las colonias obtenidas se cultivaron en un medio líquido LB que no contenía un fármaco a 30 °C durante una noche, y después se aplicaron a una placa de agar LB que no contenía un fármaco para proporcionar colonias que crecían a 42 °C.
A partir de las colonias cultivadas, se seleccionaron aleatoriamente 100 colonias, y cada una de ellas se cultivó en una placa de agar LB que no contenía un fármaco y una placa de agar LB que contenía 10 µg/ml de cloranfenicol, para seleccionar clones sensibles a cloranfenicol. Además, se amplificó un fragmento de aproximadamente 800 pb que contenía un promotor de GAPDH y un gen de ldhA por PCR usando el ADN cromosómico de estos clones deseados, para seleccionar una cepa en la que la región promotora de ldhA se sustituye con el promotor de GAPDH, y el clon que satisface la descripción anterior se designó como cepa con inserción en el genoma MG1655∆pfl∆dld/GAPldhA.
[Ejemplo 20] Producción de ácido D-láctico mediante cepa MG1655∆pfl∆dld, cepa MG1655∆pfl∆dld/pGAPldhA y cepa con inserción en el genoma MG1655∆pfl∆dld/GAPldhA
La cepa MG1655∆pfl∆dld, cepa MG1655∆pfl∆dld/pGAPldhA y cepa con inserción en el genoma MG1655∆pfl∆dld&pflB/GAPldhA se inocularon por separado cada una en 25 ml de caldo de cultivo LB, solución de cultivo de Miller (Difco244620) contenida en un matraz cónico, y se llevó a cabo cultivo con agitación durante una noche a 120 rpm como precultivo. La cantidad completa de cada solución precultivada se movió a un fermentador de 1 l (BMJ-01, aparato de cultivo fabricado por ABLE Corporation), que contenía 475 g de un medio que contenía 120 g/l de glucosa y agua de macerado de maíz 5 % (fabricado por NIHON SHOKUHIN KAKO CO. LTD.) y se llevó a cabo cultivo. Se llevó a cabo cultivo en condiciones que incluían presión atmosférica, una velocidad de aireación de 0,5 vvm, una velocidad de agitación de 200 rpm, una temperatura de cultivo de 35 °C y pH de 7,2 (ajustado con NaOH) hasta que se agotó la glucosa. Después de completar el cultivo, se midió la cantidad de ácido D-láctico acumulado en la solución de cultivo obtenida con HPLC de acuerdo con un método establecido. Los resultados se muestran en la Fig. 1. La acumulación y producción de ácido D-láctico fue de 109,0 g/l para la cepa MG1655∆pfl∆dld 48 horas, 115,6 g/l para la cepa MG1655∆pfl∆dld/pGAPldhA 48 horas y 113,5 g/l para la cepa con inserción en el genoma MG1655∆pfl∆dld/GAPldhA 30 horas, respectivamente.
[Ejemplo 21] Preparación de cepa de Escherichia coli MG1655∆pfl∆dld∆mdh
Se conoce la secuencia de bases completa del ADN genómico de Escherichia coli (número de referencia de GenBank: U00096), y también se ha indicado la secuencia de bases del gen de mdh de Escherichia coli (número de referencia de GenBank: AE000403). Para clonar la región adyacente a la secuencia de bases de un gen que codifica mdh (939 pb), se sintetizaron cuatro tipos de cebadores oligonucleotídicos mostrados en los n.º de secuencia 21, 22, 23 y 24. El cebador que tiene la secuencia de bases de la secuencia N.º 21 tiene un sitio de reconocimiento de KpnI
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