CN102164986B - 用具有提高聚乳酸酯及其共聚物生产能力的微生物突变体制备聚乳酸酯及其共聚物的方法 - Google Patents

用具有提高聚乳酸酯及其共聚物生产能力的微生物突变体制备聚乳酸酯及其共聚物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用微生物突变体制备聚乳酸酯及其共聚物的方法，该微生物突变体中通过基因操纵参与辅酶A供体和乳酸酯的生成途径的基因来提高辅酶A供体和乳酸酯的产率。根据本发明，微生物的代谢途径中辅酶A和乳酸酯的量同时增加，从而有效促进聚乳酸酯和具有高含量乳酸酯的羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物的生物合成，这样使本发明的制备方法具有工业实用性。

Description

用具有提高聚乳酸酯及其共聚物生产能力的微生物突变体制备聚乳酸酯及其共聚物的方法
技术领域
本发明涉及一种用具有提高聚乳酸酯及其共聚物的生产能力的微生物突变体制备聚乳酸酯及其共聚物的方法。 
背景技术
聚乳酸酯(PLA)为源自乳酸酯的典型的生物可降解聚合物，其在通用或者医用聚合物中具有广泛应用。近些年，PLA已经通过聚合由微生物发酵产生的乳酸酯来合成，但是这种乳酸酯的直接聚合只能制备低分子量(1000-5000道尔顿)的PLA。为了合成100,000或更多道尔顿的PLA，可以使用链偶联剂将由乳酸酯直接聚合获得的低分子量PLA聚合成更高分子量的PLA。然而，该制备更高分子量PLA的方法具有如下问题：由于溶剂或者链偶联剂的加入使其工艺复杂，也不容易除去该溶剂或者链偶联剂。近些年广泛使用的生产高分子量PLA的方法，包括将乳酸酯转化成丙交酯，并使丙交酯环发生开环缩合反应来合成PLA。 
同时，聚羟基链烷酸酯(PHA)是一种在当碳源过量而其它营养元素如磷、氮、镁和氧缺乏时，积累在微生物当中作为能量或碳源储备材料的聚酯。由于PHA与衍生自石油的常规合成聚合物具有相似的性质，并且表现出优异的生物降解性能，所以其被认为是常规合成塑料的替代品。 
为了从微生物中制备PHA，必需要有将微生物代谢产物转化成PHA单体的酶，和利用PHA单体合成PHA聚合物的PHA合酶。 
PHA合酶用羟酰基-CoA作为底物合成PHA。然而，因为羟基链烷酸酯，例如在2-位碳原子羟基化的乳酸酯，不适合作为PHA合酶的特异性底物(substrate specificity)，因此不存在天然产生或从重组细胞或植物中制备PLA及其共聚物的实例。为了提供乳酰基-CoA(lactyl-CoA)，发明人用丙酸梭菌(Clostridium propionicum)来源的丙酰基-CoA(propionyl-CoA)转移酶和以乳酰基-CoA作为底物的假单胞菌(Pseudomonas)sp.6-19的聚羟基链烷酸酯合酶，成功地合成了PLA和PLA共聚物(韩国专利NO.10-2005-0043798)。 
然而，常规已开发的微生物生产PLA和PLA共聚物的能力仍然较低，因此需要开发具有更高生产PLA和PLA共聚物能力的微生物。 
发明内容
【技术问题】 
因此，本发明的一个目的是提供一种使用有效生产聚乳酸酯(PLA)及其共聚物的微生物突变体来有效制备聚乳酸酯(PLA)或其共聚物的方法。 
【技术解决方案】 
本发明的一方面是提供一种使用微生物突变体制备聚乳酸酯(PLA)及其共聚物的方法，其中对至少一种参与辅酶A(CoA)供体和乳酸酯(lactate)生产途径的基因进行基因操纵从而提高辅酶A供体和乳酸酯的产率。 
【有益效果】 
根据本发明，在微生物的代谢途径中辅酶A供体和乳酸酯的量同时增加，能够有效地生物合成工业上有用的聚乳酸酯(PLA)和具有高乳酸酯含量的羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物(hydroxyalkanoate-lactate copolymer)。 
附图说明
参照附图，在以下详细说明书中更详细地描述本发明优选实施例中的这些和其它特征、方面和有益效果。在附图中： 
图1表示微生物突变体的内源性代谢途径，在这些微生物突变体中使ackA、adhE、acs、ppc或ldhA基因失活或放大以提高聚乳酸酯(PLA)及其共聚物的产率。 
具体实施方式
【最佳实施方式】 
乳酰CoA即聚乳酸酯(PLA)单体应增加至有效合成PLA或其共聚物。为了该目的，应改变微生物体内的代谢流从而增加乳酰CoA的生物合成所需的乳酰CoA供体的量以及增加主要前体底物即乳酸酯的量。CoA供体或乳酸酯的数量增加甚至没有大幅提高乳酰CoA的生物合成效率。因此，本发明意 于在微生物代谢途径中同时增加CoA供体和乳酸酯的量，从而提高PLA或其共聚物的生物合成效率，并增加聚合物中乳酸酯的含量。 
对于乳酸酯的供应，提供了一种从细胞外供应乳酸酯，通过乳酸酯运输器将乳酸酯引入细胞的方法，和一种在厌氧的条件下使用由葡萄糖生成细胞内乳酸酯的方法。当从细胞外供应乳酸酯时，乳酸酯的吸收可能受到限制。从细胞外供应的乳酸酯转移进细胞时，同时也被存在于大肠杆菌细胞膜中的D-乳酸脱氢酶(D-lactate dehydrogenase)和L-乳酸脱氢酶(L-lactatedehydrogenase)转变成丙酮酸酯(pyruvate)。这与本发明提高乳酰CoA产率的目标相矛盾。因此，本发明意于选择一种利用葡萄糖生成乳酸酯并由乳酸酯合成乳酰基-CoA的途径，然后应用基因操纵微生物代谢途径以提高乳酰CoA的产量。 
为了该目的，本发明的目的在于提供一种制备PLA或羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物的方法。此处，该方法包括制备微生物突变体，其中对参与CoA供体和乳酸酯生产途径的至少一种基因进行基因操纵从而提高CoA供体和乳酸酯的产量；在包含葡萄糖或葡萄糖和羟基链烷酸酯的培养基中培养微生物突变体；以及从微生物突变体中回收PLA或羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物。 
根据本发明的一个实施方式，CoA供体可以是乙酰CoA。对于CoA供体，乙酰CoA非常可能成为微生物代谢途径中的辅酶供体，该途径中葡萄糖用于合成乳酸酯。 
为了增加CoA供体之一乙酰CoA的数量，可以使微生物中编码参与醋酸酯生成途径的酶的基因，或使编码参与乙醇生成途径的酶的基因失活，或者使编码将醋酸酯再转变为乙酰CoA的酶的基因放大。通过失活或放大基因中的至少两种，乙酰CoA的量也可以进一步增加。 
为了产生乳酰CoA，除了乙酰CoA外，能提供辅酶A的辅酶A供体包括：β-酮己二酸单酰-CoA、γ-丁酰甜菜碱酰基-CoA(γ-butyrobetainyl-CoA)、(R)-甲基丙二酰基-CoA、(S)-甲基丙二酰基-CoA、2′-(5″-磷酸核糖基)-3′-脱磷-CoA、2′-(5″-三磷酸核糖基)-3′-脱磷-CoA、3，4-二羟基苯乙酰基-CoA、3-羟基己二酰基-CoA、3-羟基丁酰基-CoA、3-羟基苯乙酰基-CoA、3-甲基巴豆酰基-CoA、4-羟基苯乙酰基-CoA、苯乙酰基-CoA的顺式二氢二醇衍生物、Δ2-烯酰基-CoA、2-反式-4-顺式-二烯酰基-CoA、3-羟基酰基-CoA、3-酮脂酰基-CoA、顺式-2-烯酰基-CoA、顺式-3-烯酰基-CoA、反式-2-烯酰基-CoA、反式 -3-烯酰基-CoA、顺式-2，3-脱氢酰基-CoA、D-3-二羟基酰基-CoA、脂酰基CoA、长链酰基-CoA、反式，反式-Δ2-Δ4-二烯酰基-CoA、超长链脂酰基-CoA、CoA衍生物、乙酰乙酰基-CoA、乙酰-CoA、ω-羧基酰基-CoA、酰基-CoA、L-3-羟基酰基-CoA、丁酰基-CoA、辅酶A(CoA)、辅酶-A-基团(CoA)、香豆酰基-CoA、巴豆酸甜菜碱酰基-CoA(crotonbetainyl-CoA)、巴豆酰基-CoA、D-肉碱酰基-CoA(D-carnitinyl-CoA)、脱磷-CoA、甲酰基-CoA、异戊酰基-CoA、L-肉碱酰基-CoA(L-carnitinyl-CoA)、丙二酰基-CoA、O-琥珀酰基苯甲酰基-CoA、乙二酰基-CoA、棕榈酰基-CoA、苯乙酰基-CoA、庚二酰基-CoA、丙酰基-CoA、琥珀酰基-CoA、反式-Δ2，顺式-Δ4-癸二烯酰基-CoA、反式-Δ2-癸烯酰基-CoA、乳酰基-CoA等。当不同于乙酰CoA的CoA用作CoA供体时，可以改变失活或放大的基因来增加这些辅酶A供体的数量。 
为了增加微生物代谢流中乳酸酯的量，可以使微生物中编码参与磷酸烯醇丙酮酸酯消耗反应的酶的基因失活，或可以使编码参与丙酮酸酯转变成乳酸酯的酶的基因放大。乳酸酯的量也可以通过至少两种基因的失活或放大而进一步增加。为了使用细胞内的通常在厌氧条件下产生由葡萄糖生成的乳酸酯，首先在有氧条件下充分培养细胞从而使其生长，接着将有氧条件应该转化为厌氧条件或微厌氧条件来产生乳酸酯。然而，当操纵基因来增加上述乳酸酯的量时，可以构造一个有效的生产体系，这其中细胞生长和使用细胞内乳酸酯进行聚合物的生产都可以通过一步培养(one-step culture)实现。 
在本发明中，可以使用任何能够合成PLA或其共聚物的微生物。这种微生物可以包括细菌、酵母菌、霉菌等。例如，细菌可以包括产碱杆菌属(Alcaligenes)、假单胞菌属(Pseudomonas)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)等，但本发明对此没有特别限制。根据本发明的一个实施方式，细菌可以是大肠杆菌(E.coli)。根据本发明的一个实施方式，公开了通过基因操纵E.coliXL 1-Blue制备的突变体E.coli，但本发明对此没有特别限制。 
根据本发明的一个实施方式，参与醋酸酯生成途径的酶可以是如乙酸激酶，编码该酶的基因可以是ackA。 
根据本发明的一个实施方式，参与主要乙醇生成途径的酶可以是如乙醛脱氢酶，编码该酶的基因可以是adhE。 
根据本发明的一个实施方式，将醋酸酯转变成乙酰基CoA的酶可以是如乙酰CoA合酶，编码该酶的基因可以是acs。 
根据本发明的一个实施方式，参与磷酸烯醇丙酮酸酯(phosphoenolpyruvate)消耗反应的酶可以是如磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase)，编码该酶的基因可以是ppc。 
根据本发明的一个实施方式，参与将丙酮酸酯转变成乳酸酯的酶可以是如乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase)，编码该酶的基因可以是ldhA。 
根据本发明的另一个实施方式，在微生物突变体中，可以使编码参与醋酸酯生成途径的酶的基因和编码参与磷酸烯醇丙酮酸酯消耗反应的酶的基因失活，并且可以使编码参与将丙酮酸酯转变成乳酸酯的酶的基因放大。 
还根据本发明的另一个实施方式，在微生物突变体中，可以使编码参与醋酸酯生成途径的酶的基因失活并且可以使编码参与将醋酸酯转变成乙酰CoA的酶的基因放大，同时可以使编码参与磷酸烯醇丙酮酸酯消耗反应的酶的基因失活，并且可以使编码参与将丙酮酸酯转变成乳酸酯的酶的基因放大。 
在本发明中，术语“失活”(inactivate或者inactivating)指的是由于突变而阻止基因的转录或阻止转录的mRNA翻译成完整蛋白质。为了使基因“失活”，可以通过删除某些基因或修改基因的核苷序列而使基因突变。 
在本发明中，术语“放大”(amplify或者amplifying)指的是基因的表达水平高于基因内源性的表达水平的过程。当微生物突变前有未放大的基因存在于微生物中时，可以在微生物中引入并放大至少一种基因。当微生物突变前有至少一种将被放大的基因存在于微生物中时，可以以同样方式在微生物中进一步引入至少一种基因，或者通过基因操纵预先存在的基因来提高基因的表达水平。例如，当表达放大的基因存在于要突变的微生物中时，基因表达可以通过强启动子取代用于诱导基因表达的自身启动子来使基因表达放大。因此，根据本发明的一个实施方式，基因的放大可以通过用强启动子取代本体启动子进行诱导。这种强启动子的实例包括trc启动子，tac启动子、T7启动子、lac启动子等。 
可以进一步操作微生物突变体以增加丙酮酸酯的量。丙酮酸酯是乳酸酯和CoA供体之一的乙酰CoA的共同前体。当丙酮酸酯的量增加时，乙酰辅酶A和乳酸酯的量也会增加。因此，根据本发明的另一个实施方式，微生物突变体可以是这样一种微生物，其中使下列至少一种基因进一步弱化或失活 以增加丙酮酸酯的量，所述基因为：aceE、aceF、lpdA、pfkA、pfkB、tpiA、sdhA、sdhB、sdhC、sdhD、fumA、fumB、fumC、eptB、gpmA、gpmB、ptsG、mdh、ppc、pgi、glgC、sucA、sucB、ribA、folE、pflB等。例如当编码将丙酮酸酯转变成乙酰CoA的丙酮酸脱氢合酶的基因aceE、aceF、lpdA，或编码将丙酮酸酯转变成甲酸酯的丙酮酸甲酸裂解酶(pyruvate formate lyase)的基因pflB弱化或失活时，乙酰CoA和乳酸酯的量随着丙酮酸酯增加而增加。从苹果酸酯到丙酮酸酯的代谢流也可以通过使编码将苹果酸酯(malate)转变成草酰乙酸酯(oxaloacetate)的苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase)的基因mdh弱化或失活而得到增强。可选地，到丙酮酸酯的代谢通流可以通过使编码磷酸转移酶家族中的一员(该酶有助于在消耗丙酮酸酯的前体——磷酸烯醇丙酮酸酯时吸收葡萄糖)的基因ptsG，或在将葡萄糖转变成丙酮酸酯的糖酵解途径中，编码将甘油醛-3-磷酸转变成磷酸二羟丙酮的磷酸丙糖异构酶的基因tpiA弱化或失活而得到增强。 
当在含有葡萄糖的培养基中培养微生物突变体时，PLA可以从该微生物中获得。而且当在含有葡萄糖和羟基链烷酸酯的培养基中培养微生物突变体时，羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物也可以从该微生物中获得。羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物的种类可以根据培养基中含有的羟基链烷酸酯的种类而变化。 
根据本发明的一个实施方式，羟基链烷酸酯可以包括至少一种选自由3-羟基丁酸酯、3-羟基戊酸酯、4-羟基丁酸酯、具有6-14个碳原子的中等链长的(D)-3-羟基羧酸、2-羟基丙酸、3-羟基丙酸、3-羟基己酸、3-羟基庚酸、3-羟基辛酸、3-羟基壬酸、3-羟基癸酸、3-羟基十一烷酸、3-羟基十二烷酸、3-羟基十四烷酸、3-羟基十六烷酸、4-羟基戊酸酯、4-羟基己酸、4-羟基庚酸、4-羟基辛酸、4-羟基癸酸、5-羟基戊酸、5-羟基己酸、6-羟基十二烷酸、3-羟基-4-戊烯酸、3-羟基-4-反式-己烯酸、3-羟基-4-顺式-己烯酸、3-羟基-5-己烯酸、3-羟基-6-反式-辛烯酸、3-羟基-6-顺式-辛烯酸、3-羟基-7-辛烯酸、3-羟基-8-壬烯酸、3-羟基-9-癸烯酸、3-羟基-5-顺式-十二烯酸、3-羟基-6-顺式-十二烯酸、3-羟基-5-顺式-十四烯酸、3-羟基-7-顺式-十四烯酸、3-羟基-5，8-顺式-顺式-十四烯酸、3-羟基-4-甲基戊酸、3-羟基-4-甲基己酸、3-羟基-5-甲基己酸、3-羟基-6-甲基庚酸、3-羟基-4-甲基辛酸、3-羟基-5-甲基辛酸、3-羟基-6-甲基辛酸、3-羟基-7-甲基辛酸、3-羟基-6-甲基壬酸、3-羟基-7-甲基壬酸、3-羟基-8-甲基壬酸、3-羟基-7-甲基癸酸、3-羟基-9-甲基癸酸、3-羟基-7-甲基-6-辛烯 酸、苹果酸、3-羟基琥珀酸-甲酯、3-羟基己二酸-甲酯、3-羟基辛二酸-甲酯、3-羟基壬二酸-甲酯、3-羟基癸二酸-甲酯、3-羟基辛二酸-乙酯、3-羟基癸二酸-乙酯、3-羟基庚二酸-丙酯、3-羟基癸二酸-苯偶酰酯(3-hydroxysebacicacid-benzil ester)、3-羟基-8-乙酰氧基辛酸、3-羟基-9-乙酰氧基壬酸、苯氧基-3-羟基丁酸酯、苯氧基-3-羟基戊酸酯、苯氧基-3-羟基庚酸、苯氧基-3-羟基辛酸、对氰基苯氧基-3-羟基丁酸酯、对氰基苯氧基-3-羟基戊酸酯、对氰基苯氧基-3-羟基己酸、对硝基苯氧基-3-羟基己酸、3-羟基-5-苯基戊酸、3-羟基-5-环己基丁酸、3，12-二羟基十二烷酸、3，8-二羟基-5-顺式-十四烯酸、3-羟基-4，5-环氧基癸酸、3-羟基-6，7-环氧基十二烷酸、3-羟基-8，9-环氧基-5，6-顺式-十四烷酸、7-氰基-3-羟基庚酸、9-氰基-3-羟基壬酸、3-羟基-7-氟庚酸、3-羟基-9-氟壬酸、3-羟基-6-氯己酸、3-羟基-8-氯辛酸、3-羟基-6-溴己酸、3-羟基-8-溴辛酸、3-羟基-11-溴十一烷酸、3-羟基-2-丁烯酸、6-羟基-3-十二烯酸、3-羟基-2-甲基丁酸、3-羟基-2-甲基戊酸和3-羟基-2，6-二甲基-5-庚烯酸组成的组中。 
【发明方式】 
本发明的一个实施方式公开了通过基因操纵E.coli XL 1-Blue从而有效生产聚(D-乳酸酯)和具有高含量乳酸酯的聚(3-羟基丁酸酯-共-D-乳酸酯)的方法。根据本发明的该方法，可以制备各种聚(羟基链烷酸酯-乳酸酯)。 
此处，本发明的优点和特征及获得该优点和特征的方法在以下实施例中将有更详细描述。然而，此处列出的说明仅是用于举例说明目的的优选实施例，不是意于限制本发明的范围，因此应当理解为在不偏离本发明实质和范围的情况下可以进行其它等同方式替换和修改。因此，本发明提供的实施例完成本了发明的公开，并使本领域普通技术人员完全明了有关本发明的范围，这样本发明仅由所提出权利要求的范围进行限定。 
实施例1：有效生产PLA和3-羟基丁酸酯-乳酸酯共聚物的微生物突变体的制备 
在此实施例1中由E.coli XL1-Blue制备有效生产PLA或其共聚物的E.coli突变体，通过将编码参与醋酸酯生成途径的酶的基因ackA，或编码参与乙醇生成途径的酶的基因adhE失活，或使编码将醋酸酯再转变为乙酰辅酶A(CoA)的酶的基因acs放大，并且同时将编码参与磷酸烯醇丙酮酸酯消耗反应的激活酶的基因ppc失活，或使编码参与丙酮酸酯转变为乳酸酯的酶的 基因ldhA放大，以及用包含PHA合酶基因和丙酰基-CoA-转移酶基因的重组载体转化E.coli突变体。图1表示微生物突变体的内源性代谢途径，其中使基因ackA、adhE、acs、ppc或ldhA失活或放大从而提高PLA及其共聚物产率。 
实施例1-1：具有增加的乙酰-CoA和乳酸酯的量的微生物突变体的制备 
1-1-1：基因ackA、adhE或ppc的删除 
用以下引物通过一步失活法(one-step inactivation method)(Warner等，PNAS，6；97(12)：6640-6645，2000)从E.coli XL 1-Blue(stratagene)中删除基因ackA、adhE或ppc。 
对于ackA基因的删除，用pMlocX载体(Lee，K.H.，Park，J.H.，Kim，T.Y.，Kim，H.U.&Lee，S.Y.Systems metabolic engineering of Escherichia coli forL-threonine production.Molecular systems biology 3，149(2007))作为模板，用引物对SEQ ID NOS：1和3引发首轮PCR。接着，用所得DNA片段作为模板，用引物对SEQ ID NOS：2和4引发第二轮引物延伸的PCR。第二轮PCR中所得DNA片段通过电穿孔转入λ-红重组酶(λ-red recombinase)表达的XL1-Blue和XL1-Blue来源的突变菌株的感受态细胞(电穿孔-感受态细胞)，，来制备基因ackA删除的突变菌株。为了确认ackA基因的删除，用引物对SEQID NOS：5和6来引发菌落PCR。 
对于ppc基因的删除，引物对SEQ ID NOS：7和9以及引物对SEQ IDNOS：8和10，以同样的方式依次使用。使用引物对SEQ ID NOS：11和12来确认ppc基因的删除。 
对于adhE基因的删除，引物对SEQ ID NOS：13和15以及引物对SEQID NOS：14和16，也以同样的方式依次使用。使用引物对SEQ ID NOS：17和18来确认adhE基因的删除。 
1-1-2：基因acs或ldhA的增强 
用与实施例1-1-1描述的相同方式，采用一步失活法，通过用强启动子之一的trc启动子分别取代E.coli染色体DNA上的acs和ldhA基因的自身启动子来使基因acs或ldhA放大(Warner等，PNAS，6；97(12)：6640-6645，2000)。 
为了用trc启动子取代acs基因的自身启动子，将pMloxC载体作为模板用引物对SEQ ID NOS：19和22来引发首轮PCR。接着，所得DNA片段作为模板用引物对SEQ ID NOS：20和23来引发第二轮PCR。在第二轮PCR中所得DNA片段作为模板用引物对SEQ ID NOS：21和24来引发第三轮PCR，从而获得最终DNA片段。然后，将最终的DNA片段通过电穿孔转入λ-红重组酶表达的XL1-Blue和XL1-Blue来源的的突变菌株的感受态细胞(电穿孔感受态细胞)，，来制备其中用trc启动子基因取代自身启动子acs基因的突变菌株。为了确认acs基因启动子的取代，用引物对SEQ ID NOS：25和26引发菌落PCR。 
为了用trc启动子取代自身启动子ldhA基因，引物对SEQ ID NOS：27和30、SEQ ID NOS：28和31以及SEQ ID NOS：29和32也依次使用，引物对SEQ ID NOS：33和34用于确认该取代。 
1-1-3：基因ackA、adhE、acs、ppc或ldhA失活或放大的微生物突变体的制备 
以实施例1-1-1或1-1-2相同的方法制备了微生物突变体JLX1-9，将其中基因ackA、adhE、acs、ppc和ldhA的各种组合失活或放大。 
以该方法制备的E.coli XL1-Blue来源的突变菌株和它们的染色体DNA特征列于下表1。 
表1
  突变菌株   染色体DNA特征
  JLX1   XBΔackA
  JLX2   XB ptrc-ldhA
  JLX3   XBΔppc
  JLX4   XBΔackA ptrc-ldhA
  JLX5   XB ptrc-ldhAΔppc
  JLX6   XBΔackAΔppc
  JLX7   XBΔackA ptrc-ldhAΔppc
  JLX8   XBΔackA ptrc-ldhAΔppc ptrc-acs
  JLX9   XBΔackA ptrc-ldhAΔppc ptrc-acsΔadhE
实施例1-2：含有PHA合酶和丙酰基-CoA-转移酶基因的重组载体的构建 
1-2-1.pPs619C1300-CPPCT重组载体的构建 
为了分离来源于假单胞菌sp.6-19(KCTC 11027BP)的PHA合酶(phaC1ps6-19)基因，提取假单胞菌sp.6-19的总DNA，在phaC1Ps6-19基因序列(AeJin，SONG，Master’s Thesis，Department of Chemical and BiomolecularEngineering，KAIST，2004)的基础上构建具有SEQ ID NOS：35和36的碱基序列的引物对，并进行PCR以获得phaC1Ps6-19基因。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳来确认1.7kbp大小的基因片段的存在，这与phaC1Ps6-19基因相符。 
将其中单体供应酶和合酶一起表达的组成型表达系统的操纵子引入从而诱导phaC1Ps6-19合酶的表达。 
含有来源于富养罗尔斯通氏菌(Ralsronia eutropha)H16的生产PtB的操纵子的DNA片段，用BamHI/EcoRI从pSYL105载体中消化(Lee等，Biotech.Bioeng.，1994，44：1337-1347)，并被插入pBluescript II(Stratagene)的BamHI/EcoRI识别位点以构建pReCAB重组载体。 
众所周知pReCAB载体通过PHB操纵子启动子来组成型表达PHA合酶(phaCRE)和单体供应酶(phaARE和phaBRE)，并在E.coli中(Lee等，Biotech.Bioeng.，1994，44：1337-1347)中运行良好。pReCAB载体用BstBI/SbfI消化以除去R.eutropha H16的PHA合酶(phaCRE)。接着，将以上得到的pPaC1Ps6-19基因插入到BstBI/SbfI识别位点来制备pPs619C1-ReAB重组载体。 
为了制备两端分别对应于BstBI/SbfI识别点的pPaC1Ps6-19合酶基因片段，在不改变氨基酸的情况下，用定点诱变方法(SDM)首先除去内源性BstBI位点，并用具有SEQ ID NOS：37和38、SEQ ID NOS：39和40以及SEQ ID NOS：41和SEQ ID NOS：42的碱基序列的引物来引发重叠PCR从而加入BstBI/SbfI识别位点。 
为了确认pPaC1Ps6-19合酶的PHB合成，用pPs619C1-ReAB重组载体转化E.coli XL 1-Blue(Stratagene)，并在PHB检测培养基(Luria Bertani(LB)琼脂，20g/L葡萄糖，0.5μg/ml尼罗红)中生长。结果没有观察到PHB的合成。 
通过氨基酸序列分析发现了影响短链(short chain length，SCL)活性的氨基酸的三个区域，采用用引物对SEQ ID NOS：43到48的SDM方法制备的phaC1Ps6-19合酶的变体列于下表2中。 
表2
Figure BPA00001309387600111
用这些重组载体转化E.coli XL1-Blue，并在PHB检测培养基中生长(LB琼脂，20g/L葡萄糖，0.5μg/ml尼罗红)。结果确认在用pPs619C1200-ReAB转化的E.coli XL1-Blue和用pPs619C1300-ReAB转化的E.coli XL1-Blue中都产生了PHB。 
也就是说，通过供应单体酶phaARE和phaBRE从葡萄糖生成3HB-CoA，并用3HB-CoA作为底物用phaC1Ps6-19合酶的SCL变体(phaClPs6-19200和phaC1Ps6-19300)合成PHB。 
为了构建操纵子型组成型表达系统(该系统中丙酰基-CoA转移酶一起表达来提供合成PLA和PLA共聚物所需的单体乳酰基-CoA)，使用丙酸梭菌(clostridium propionicum)来源的丙酰基-CoA转移酶(CP-PCT)。 
用引物SEQ ID NOS：49和50将C.propionicum的染色体DNA进行PCR所得的片段作为cp-pct。在这种情况中，通过SDM方法去除原始存在于野生型CP-PCT中的NdeI位点以便于克隆。由于SbfI/NdeI识别点的添加，具有SEQ ID NOS：51和52的碱基对序列的引物也用于引发重叠PCR。 
用SbfI/NdeI消化含有phaC1Ps6-19合酶的SCL突变体(phaC1Ps6-19300)的pPs619C1300-ReAB载体，以除去来源于R.eutrophus H16的单体供应酶(phaARE和phaBRE)，然后将PCR克隆的CP-PCT基因插入SbfI/NdeI识别点来制备pPs619C 1300-CPPCT重组载体。 
1-2-2.pPs619C1300-CPPCT532重组载体的构建 
众所周知，当CP-PCT在E.coli中过度表达时会引起严重的代谢紊乱，从而造成毒性。所有的重组E.coli在IPTG-诱导的表达系统(该系统使用广泛用于重组蛋白质的表达的tac启动子或T7启动子)中加入诱导物后即死亡。 
因此，需要开发可以有效提供乳酰基-CoA的C.propionium丙酸CoA转移酶的突变体。 
为了该目的，用其中乳酰基-CoA弱表达但是随着微生物生长组成性表达的组成型表达系统来合成乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物。 
为了将随机突变引入cp-pct，用实施例1-2-1制备的pPs619C1300-CPPCT作为模板，引物对SEQ ID NOS：53和54在补充以Mn2+并且在dNTPs浓度有差别的条件下，用于引发错配PCR。 
然后，为了扩增包含随机突变的PCR片段，用引物对SEQ ID NOS：53和54在普通条件下引发PCR。 
用SbfI/NdeI消化含有phaC1Ps6-19300(phaC1Ps6-19合酶的SCL突变体)的pPs619C1300-CPPCT载体，以去除野生型cp-pct，制备其中扩增的PCR变体片段插入到SbfI/NdeI识别点的连接混合物(ligation mixture)，并引入E.coliJM109来制备约10^5规模的CP-PCT库。所得CP-PCT库在聚合物检测培养基(LB琼脂，20g/L葡萄糖，1g/L 3HB，0.5μg/ml尼罗红)中培养三天，接着筛选来确认是否生成聚合物，由此初步选择约80个候选者。将候选者在液体培养基(LB琼脂，20g/L葡萄糖，1g/L 3HB，100mg/L氨苄青霉素，37℃)中于聚合物生成条件下培养4天，用荧光激活细胞分类术(FACS)分析，由此选择两种最终样品。 
对所制得的CP-PCT变体进行基因序列分析来定位突变。结果列于下表3中。 
表3
  重组载体   核苷酸取代
  CP-PCT变体512   A1200G
  CP-PCT变体522   T78C，T669C，A1125G，T1158C
用最终筛选的变体(CP-PCT变体512、CP-PCT变体522)在错配PCR方法中再进行随机突变，从而获得CP-PCT变体531-536，列于下表4中。 
表4
  重组载体   突变   沉默突变
  cp-pct变体531   Gly335Asp   A1200G
  cp-pct变体532   Ala243Thr   A1200G
  cp-pct变体533   Asp65Gly   T669C，A1125G，T1158C
  cp-pct变体534   Asp257Asn   A1200G
  cp-pct变体535   Asp65Asn   T669C，A1125G，T1158C
  cp-pct变体536   Thr199Ile   T669C，A1125G，T1158C
然后，为了扩增含CpPct532突变的PCR片段，引物SEQ ID NOS：53和54用于在普通条件下引发PCR。用SbfI/NdeI消化pPs619C1300-CPPCT载体以除去CPPCT部分，并制备其中扩增的CpPct532PCR片段插入到SbfI/NdeI识别位点的连接混合物，从而制备pPs619C1300-CPPCT532载体。 
1-2-3.pPs619C1400-CPPCT532(p400-532)重组载体的制备 
当采用不能有效使用乳酰基-CoA的PHA合酶合成PLA和PLA共聚物时，它们的合成效率很低。因此，在合成PLA和PLA共聚物中使用能够有效使用乳酰基-CoA的PHA合酶是很重要的。据此，本发明人已发现用乳酰基-CoA作为底物，使用假单胞菌sp.6-19中的聚羟基链烷酸酯合酶变体能高效地制备乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物的系统。 
基于实施例1-2-1制备的phaC1Ps6-19合酶变体(phaC1Ps6-19300)，采用使用引物对SEQ ID NOS：55和56的SDM方法，制备在E130D、S325T、S477R和Q481M有氨基酸序列突变的假单胞菌sp.6-19来源的PHA合酶变体(phaC1Ps6-19400)。 
用所得变体获得的重组载体(pPs619C1400-CPPCT532)转化的E.coliJM109，在辅以3HB的聚合物检测培养基中(LB琼脂，20g/L葡萄糖，2g/L3HB，0.5μg/ml尼罗红)培养。结果确认了该聚合物的产生。 
1-2-4.pPs619C1310-CPPCT532(p310-532)重组载体的制备 
当采用不能有效使用乳酰基-CoA的PHA合酶合成PLA和PLA共聚物时，它们的合成效率很低。因此，在合成PLA和PLA共聚物中使用能够有效使用乳酰基-CoA的PHA合酶是很重要的。因此，基于实施例1-2-1制备的phaC1Ps6-19合酶变体(phaC1Ps6-19300)，采用使用引物对SEQ ID NOS：57、 58、59和60的SDM方法，制被在E130D、S477F和Q481K有氨基酸序列突变的假单胞菌sp.6-19来源的PHA合酶变体(phaC1Ps6-19310)。 
用所得变体获得的重组载体(pPs619C1310-CPPCT532)转化的E.coliJM109，在辅以3HB的聚合物检测培养基中(LB琼脂，20g/L葡萄糖，2g/L3HB，0.5μg/ml尼罗红)培养。结果确认了聚合物的产生。 
1-3.有效生产PLA和3-羟基丁酸酯-乳酸酯共聚物的微生物突变体的制备 
将实施例1-2-3和1-2-4制备的pPs619C1400-CPPCT532或pPs619C1310-CPPCT532载体引入实施例1-1制备的微生物突变体，其中乙酰-CoA和乳酸酯的量得到增加，来制备能有效生产PLA和聚(3-羟基丁酸酯-共-乳酸酯)的微生物突变体。 
微生物突变体在辅以10μg/ml四环素、100μg/ml氨苄青霉素和20g/L葡萄糖的LB板培养基中进行筛选。转化菌株在10ml的LB培养基中接种，并在30℃下预培养12小时。接着，1ml预培养溶液与10μg/ml四环素、100μg/ml氨苄青霉素和10μg/ml硫胺素在250ml的烧瓶中接种，该烧瓶包含100ml混合下列物质制备的培养基：每1L蒸馏水中含20g葡萄糖、6.67g的KH2PO4、4g的(NH4)2HPO4、0.8g柠檬酸、0.8g的MgSO4·7H2O和5mL痕量金属溶液(每升蒸馏水包括：10g的FeSO4·7H2O、1.35g的CaCl2、2.25g的ZnSO4·7H2O、0.5g的MnSO4·4H2O、1g的CuSO4·5H2O、0.106g的(NH4)6Mo7O24·4H2O、0.23g的Na2B4O7·10H2O、10ml 35％HCl)，培养基的pH用10N的NaOH调整到7.0。接着，所得混合物以200rpm在30℃培养72-96小时。在这种情况中，在培养初始加入一次或两次2g/L的DL-3-羟基丁酸钠盐(ACROS)来生产聚(3-羟基丁酸酯-共聚-乳酸酯)共聚物。补充以4g/L的琥珀酸酯来培养由于突变菌株中ppc基因的删除而使细胞很难生长的菌株。而且在OD600约为0.5时补充以1mM的IPTG，从而使由trc启动子取代了启动子的ldhA和acs基因表达。 
当培养完成时，离心培养液并回收沉淀物。回收的沉淀物用蒸馏水清洗三次，接着在100℃烤箱中干燥24小时。接着，取出已干燥的部分沉淀物，用气相色谱(GC)分析测量细胞中合成的P(3HB-共-LA)共聚物的含量。分析中使用的标准样品是P(3HB-共-3HV)共聚物(共聚物中3HV的含量是约12wt％)和PLA均聚物。约3-10wt％的PLA均聚物可以通过代谢操作产生，使P(3HB- 共-LA)共聚物的生成表现出出色的改进效果，如聚合物中LA比例增加了1.7-4.3倍，聚合物含量增加了1.4-27.3倍。 
实施例2：根据培养体积条件，比较在能有效生产PLA和3-羟基丁酸酯-乳酸酯共聚物的微生物突变体中聚合物的产率 
为了测量培养条件的效果和微生物细胞生长和P(3HB-共-LA)基因化的乳酸酯生产水平，在不同培养体积中培养微生物。为了该目的，分别在含有50ml、100ml和150ml培养基的250ml烧瓶中培养菌株XB/p400-532。在没有操纵E.coli XL1-BLUE的代谢流的情况下，在XB/p400-532菌株中引入pPs619C1400-CPPCT532载体。 
根据培养体积条件，在XB/p400-532菌株中的聚合物的生产结果列于下表5。 
表5
  培养体积(ml)   产生的聚合物
  50   P(3HB-共-19.86mol％LA)24.46wt％
  100   P(3HB-共-39.43mol％LA)34.43wt％
  150   P(3HB-共-43.85mol％LA)36.93wt％
正如所预期的那样，随着培养基体积的增加，细胞生长随(微)厌氧条件的形成而相对减慢，聚合物的含量增加了约1.5倍。(微)厌氧条件下，聚合物中乳酸酯(LA)比例也随乳酸酯产量的增加而增加了2.2倍。 
为了测定本发明基于上述事实的代谢操作的JLX7/p400-532的效果，以50ml和100ml的培养体积进行烧瓶培养。 
根据培养体积条件，在本发明的XB/p400-532菌株和微生物突变体JLX7/p400-532中聚合物的生产结果列于下表6。 
表6
Figure BPA00001309387600151
与XB/p400-532作为宿主菌株时相比，当在50ml的培养体积中培养JLX7/p400-532的微生物突变体时，P(3HB-共-LA)的含量增长1.24倍，并且聚合物的浓度也增长了1.98倍。此外，聚合物中LA的比例从14.32mol％增长到49.55mol％(约3.46倍)。与XB/p400-532作为宿主菌株时相比，当在100ml培养体积中培养JLX7/p400-532的微生物突变体时，P(3HB-共-LA)的含量增长1.62倍，并且聚合物的浓度也增长2.98倍。此外，聚合物中LA的比例从40.45mol％增加到63.95mol％(1.58倍)。 
LA比例的增加和控制与对聚合物物理性质有重要影响的PLA共聚物中的LA比例一样是改进菌株的关键。 
当微生物突变体JLX7/p400-532在50ml培养体积中培养时，LA比例从14.32mol％增加到49.55mol％(约3.46倍)，然而，当微生物突变体JLX7/p400-532在100ml培养体积中培养时，LA比例的增加相对低，即，LA比例从40.45mol％增加到63.95mol％(1.58倍)，但是具有最高的绝对值(63.95mol％)。也就是说，在50ml的培养体积中LA比例的增加相对高，但最高值约50mol％没有超出在100ml培养体积中的最高值(63.95mol％)。这表明除了基因水平的代谢工程外，培养条件是生产PLA及其共聚物的应当优化的调节因子。 
实施例3：根据突变基因的组合比较微生物突变体中聚合物的产率 
确认应用于本发明的微生物突变体的基因突变的组合对提高聚合物产率的效果。 
据以上描述，将20g/L葡萄糖作为碳源加入到MR培养基中作为基础培养基，并加入10μg/ml四环素、100μg/ml氨苄青霉素和10μg/ml硫胺素作为标记。并且，在培养初始加入一次(就p310-532载体来说M20)或两次(就p400-532载体来说M18)2g/L的DL-3-羟基丁酸钠盐(ACROS)，以200rpm在30℃条件下培养72小时。 
用XB和JLK1菌株作为宿主菌株时，它们在上述没有其它项目加入的条件下培养，当使用JLX3、JLX5、JLX6、JLX7和JLX8菌株时，在培养初始进一步加入4g/L的琥珀酸酯，以便减轻ppc基因的删除对细胞生长的抑制。当使用JLX2、JLX4、JLX5、JLX7和JLX8菌株时，在OD600约为0.5时加入1mM IPTG，以诱导ptrc-ldhA基因或ptrc-ldhA和ptrc-acs基因的表达。 
微生物突变体中聚合物的产率列于下表7，其中XB野生型菌株以及列于表1中的JLX1、JLX2、JLX3、JLX4、JLX5、JLX6和JLX7菌株用作宿主菌株，并将p400-532载体引入每个菌株。 
表7
  宿主菌株   聚合物生产的结果
  XB野生型   P(3HB-共-40.44mol％LA)34.73wt％
  JLX1   P(3HB-共-37.34mol％LA)15.86wt％
  JLX2   P(3HB-共-45.10mol％LA)48.82wt％
  JLX3   P(3HB-共-46.85mol％LA)52.26wt％
  JLX4   P(3HB-共-44.98mol％LA)28.48wt％
  JLX5   P(3HB-共-50.83mol％LA)56.14wt％
  JLX6   P(3HB-共-36.89mol％LA)45.27wt％
  JLX7   P(3HB-共-63.95mol％LA)55.53wt％
微生物突变体中聚合物的产率也列于下表8，其中XB野生型菌株以及列于表1中的JLX1、JLX2、JLX3、JLX4、JLX5、JLX6、JLX7和JLX8菌株也用作宿主菌株，并将p310-532载体引入每个菌株。 
表8
  宿主菌株   聚合物生产的结果
  XB野生型   P(3HB-共-14.39mol％LA)1.13wt％
  JLX1   P(3HB-共-26.18mol％LA)14.48wt％
  JLX2   P(3HB-共-39.09mol％LA)20.74wt％
  JLX3   P(3HB-共-38.76mol％LA)6.09wt％
  JLX4   P(3HB-共-35.78mol％LA)17.54wt％
  JLX5   P(3HB-共-60.78mol％LA)14.11wt％
  JLX6   P(3HB-共-39.24mol％LA)13.20wt％
  JLX7   P(3HB-共-58.16mol％LA)16.16wt％
  JLX8   P(3HB-共-61.52mol％LA)30.90wt％
聚合物的生产受到所有直接影响宿主菌株代谢流和聚合物生产的酶活性的影响。因此，如表7和8所列，可看出，即使在相同宿主细胞中，所生产的聚合物中LA的比例和聚合物含量也会根据所用酶的活性而改变。虽然如此，显示出在JLX5、JLX7或JLX8菌株中聚合物的产率通常是出色的。 
实施例4：根据3-羟基丁酸酯提供量比较聚合物的产率 
对于PLA均聚物和具有高乳酸酯含量的P(3HB-共-LA)共聚物的生物合成，通过调整3-羟基丁酸酯(3HB)的供应量来测定这些聚合物的产率。 
当XB野生型菌株和JLX7菌株用作宿主菌株，并将p400-532载体引入每个菌株时，根据3HB的供应量(0、0.5、1、2、4和8g/L)的聚合物的产率列于下表9。 
表9
Figure BPA00001309387600181
当XB野生型菌株和JLX7、JLX8和JLX9菌株用作宿主菌株，并将p310-532载体引入每个菌株时，根据3HB的供应量(0、0.5、1、2和4g/L)的聚合物的产率列于下表10。 
表10
Figure DEST_PATH_GSB00000509599200011
当p400-532和p310-532宿主细胞是XB野生型菌株时，它们没有产生PLA均聚物和具有50mol％或更高LA含量的P(3HB-共-LA)共聚物，而JLX7、JLX8和JLX9菌株产生了3-10wt％的PLA均聚物和13-65wt％的具有50-86mol％LA含量的P(3HB-共-LA)共聚物。 
 
Figure IPA00001309387000011
Figure IPA00001309387000021
Figure IPA00001309387000031
Figure IPA00001309387000041
Figure IPA00001309387000051
Figure IPA00001309387000061
Figure IPA00001309387000091
Figure IPA00001309387000101
Figure IPA00001309387000111
Figure IPA00001309387000121
Figure IPA00001309387000141
Figure IPA00001309387000151
Figure IPA00001309387000161
Figure IPA00001309387000171
Figure IPA00001309387000181
Figure IPA00001309387000191
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Claims (17)

1.一种制备聚乳酸酯(PLA)或羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物的方法，该方法包括以下步骤：
制备微生物突变体，其中，基因操纵参与辅酶A(CoA)供体和乳酸酯的生产途径中的至少一种基因以提高CoA供体和乳酸酯的产率；
在含有葡萄糖或者葡萄糖和羟基链烷酸酯的培养基中培养微生物突变体；和
从微生物突变体中回收PLA或羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物，
其中，使微生物突变体中编码参与醋酸酯生成途径的酶的基因或编码参与乙醇生成途径的酶的基因失活，或使编码将醋酸酯再转变成乙酰CoA的酶的基因放大，从而提高CoA供体的产率。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述CoA供体选自由乙酰-CoA、β-酮己二酸单酰-CoA、γ-丁酰甜菜碱酰基-CoA、(R)-甲基丙二酰基-CoA、(S)-甲基丙二酰基-CoA、2′-(5″-磷酸核糖基)-3′-脱磷-CoA、2′-(5″-三磷酸核糖基)-3′-脱磷-CoA、3,4-二羟基苯乙酰基-CoA、3-羟基己二酰基-CoA、3-羟基丁酰基-CoA、3-羟基苯乙酰基-CoA、3-甲基巴豆酰基-CoA、4-羟基苯乙酰基-CoA、苯乙酰基-CoA的顺式二氢二醇衍生物、Δ2-烯酰基-CoA、2-反式-4-顺式-二烯酰基-CoA、3-羟基酰基-CoA、3-酮脂酰基-CoA、顺式-2-烯酰基-CoA、顺式-3-烯酰基-CoA、反式-2-烯酰基-CoA、反式-3-烯酰基-CoA、顺式-2,3-脱氢酰基-CoA、D-3-二羟基酰基-CoA、反式-Δ2,反式-Δ4-二烯酰基-CoA、乙酰乙酰基-CoA、ω-羧基酰基-CoA、L-3-羟基酰基-CoA、丁酰基-CoA、香豆酰基-CoA、巴豆酸甜菜碱酰基-CoA、巴豆酰基-CoA、D-肉碱酰基-CoA、脱磷-CoA、甲酰基-CoA、异戊酰基-CoA、L-肉碱酰基-CoA、丙二酰基-CoA、O-琥珀酰基苯甲酰基-CoA、乙二酰基-CoA、棕榈酰基-CoA、苯乙酰基-CoA、庚二酰基-CoA、丙酰基-CoA、琥珀酰基-CoA、反式-Δ2,顺式-Δ4-癸二烯酰基-CoA、反式-Δ2-癸烯酰基-CoA和乳酰基-CoA组成的组中。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，使微生物突变体中编码参与磷酸烯醇丙酮酸酯消耗反应的酶的基因失活，或使编码参与将丙酮酸酯转变成乳酸酯的酶的基因放大，从而提高乳酸酯的产率。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述微生物突变体选自由细菌、酵母菌和霉菌组成的组中。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述细菌选自由产碱杆菌属、假单胞菌属、埃希氏杆菌属、罗尔斯通氏菌属、芽孢杆菌属和棒状杆菌属组成的组中。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述细菌是大肠杆菌。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述编码参与醋酸酯生成途径的酶的基因是ackA。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述编码参与乙醇生成途径的酶的基因是adhE。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述编码将醋酸酯再转变成乙酰CoA的酶的基因是acs。
10.根据权利要求3所述的方法，其中，所述编码参与磷酸烯醇丙酮酸酯消耗反应的酶的基因是ppc。
11.根据权利要求3所述的方法，其中，所述编码参与将丙酮酸酯转变成乳酸酯的酶的基因是ldhA。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，在微生物突变体中，使编码参与醋酸酯生成途径的酶的基因失活从而提高CoA供体的产率，使编码参与磷酸烯醇丙酮酸酯消耗反应的酶的基因失活，并使编码参与将丙酮酸酯转变成乳酸酯的酶的基因放大从而提高乳酸酯的产率。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，在微生物突变体中，使编码参与醋酸酯生成途径的酶的基因失活，并使编码将醋酸酯再转变成乙酰CoA的酶的基因放大从而提高CoA供体的产率，使编码参与磷酸烯醇丙酮酸酯消耗反应的酶的基因失活，并使编码参与将丙酮酸酯转变成乳酸酯的酶的基因放大从而提高乳酸酯的产率。
14.根据权利要求1或3所述的方法，其中，所述基因的放大是通过强启动子取代自身启动子而进行的。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述强启动子选自由trc启动子、tac启动子、T7启动子和lac启动子组成的组中。
16.根据权利要求7至11中任一项所述的方法，其中，所述微生物突变体含有至少一种进一步弱化或失活的基因，该基因选自由aceE、aceF、lpdA、pfkA、pfkB、tpiA、sdhA、sdhB、sdhC、sdhD、fumA、fumB、fumC、eptB、gpmA、gpmB、ptsG、mdh、pgi、glgC、sucA、sucB、ribA、folE和pflB组成的组中。
17.根据权利要求1的方法，其中，所述羟基链烷酸酯选自由3-羟基丁酸酯、3-羟基戊酸酯、4-羟基丁酸酯、4-羟基戊酸酯、3-羟基琥珀酸甲酯、3-羟基己二酸甲酯、3-羟基辛二酸甲酯、3-羟基壬二酸甲酯、3-羟基癸二酸甲酯、3-羟基辛二酸乙酯、3-羟基癸二酸乙酯、3-羟基庚二酸丙酯、3-羟基癸二酸苯偶酰酯、苯氧基-3-羟基丁酸酯、苯氧基-3-羟基戊酸酯、对氰基苯氧基-3-羟基丁酸酯和对氰基苯氧基-3-羟基戊酸酯组成的组中。
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