IT201800007846A1 - Procedimento per la biosintesi cellulare di acido poli d-lattico e di acido poli l-lattico - Google Patents

Description

“PROCEDIMENTO PER LA BIOSINTESI CELLULARE DI ACIDO POLI D-LATTICO E DI ACIDO POLI L-LATTICO”

La presente invenzione si riferisce ad un procedimento di produzione per via fermentativa di acido poli D-lattico (PDLA) e/o di acido poli L-lattico (PLLA) da zuccheri mediante cellule ingegnerizzate. L’invenzione si riferisce altresì a cellule aventi un flusso metabolico ridirezionato per la sintesi di polimeri enantiomericamente puri quali il PDLA o il PLLA a partire da una fonte di carbonio, che derivi preferibilmente da biomasse residuali di filiere produttive.

STATO DELL’ARTE

L’acido polilattico (PLA) è un biopolimero biodegradabile derivante dall’acido lattico. In particolare, per le sue proprietà chimico-fisiche, è un poliestere alifatico non ramificato, appartenente alla classe dei polimeri termoplastici. Considerando le sue caratteristiche, il PLA è molto simile al polietilene tereftalato (PET), una comune plastica utilizzata principalmente per il packaging alimentare. Il PET ha una derivazione petrolchimica, mentre il PLA viene ottenuto dalla polimerizzazione dell’acido lattico, ottenuto a sua volta per fermentazione (Jamshidian et al., 2010; Tsuji et al., 2011). La necessità di abbandonare processi basati sull’utilizzo del petrolio, risorsa fossile in esaurimento a causa del veloce consumo da parte dell’uomo, in favore di sistemi bio-based, sta portando diverse aziende all’utilizzo delle bioplastiche.

Le applicazioni del PLA sono molteplici, e interessano ad esempio: il settore alimentare (imballaggi, piatti, posate, bicchieri, bottiglie), la stampa 3D, dove può sostituire l’acrilonitrile butadiene stirene (ABS), e l’ambito medicale (es. fili di sutura biocompatibili, capsule per il drug delivery) (Garlotta, 2001; Rasal et al., 2010; Xiao et al., 2012). La versatilità del PLA permette la stampa di prodotti finiti sia a estrusione che a iniezione, ed è possibile utilizzare i macchinari e le infrastutture sviluppate per il PET (Jamshidian et al., 2010).

Il PLA è colorabile tramite masterbatch e miscelabile con altre plastiche (biodegradabili o meno, di derivazione petrolchimica o meno), in modo da ottenere compound dalle proprietà innovative. Oltre a ciò, è possibile trovare il PLA in forma co-polimerica, in cui monomeri di acido lattico si alternano ad altri idrossiacidi come ad esempio il 3-idrossibutirrato (3HB) (Xiao et al., 2012) o il glicolato (Tsuji et al., 2010).

Il PLA, a differenza delle plastiche tradizionali come il PET, risulta essere biodegradabile nell’ambiente e biocompostabile, ovvero smaltibile tra i rifiuti organici. Pertanto, il prodotto finito, una volta terminato il proprio ciclo vitale, viene riassorbito dal terreno, favorendo la formazione di nuova biomassa che può essere ulteriormente utilizzata per la produzione di PLA (Tsuji et al., 2011; Chen e Patel, 2012). Di conseguenza, il PLA presenta una filiera circolare grazie sia alla sua origine da biomasse rinnovabili che alla sua intrinseca biodegradabilità.

Il mercato globale del PLA (circa 210mila tonnellate/anno nel 2017) è in crescita costante e si prevede un incremento del 50% della produzione entro il 2022 rispetto a quella registrata nel 2017 (www.european-bioplastics.org/market/). Esistono tre tipologie di PLA in dipendenza delle forme enantiomeriche dei monomeri costituenti: il PLLA costuito da solo monomeri di acido L-lattico, il PDLA costituito da solo monomeri di acido D-lattico, e il PDLLA costituito da una miscela di entrambi i monomeri (Jamshidian et al., 2010; Tsuji et al., 2011). Il PDLA e il PLLA sono in forma semicristallina, mentre il PDLLA in forma amorfa (Tsuji et al., 2011). La chiralità dei monomeri che costituiscono il PLA viene trasferita al polimero stesso (quindi PDLA o PLLA), che acquista esso stesso precisa chiralità. Questo si traduce, nel solido, in una diversa interazione tra catene prime vicine e in una possibile struttura lamellare o cristallina peculiari dei due singoli enantiomeri, che possono conservare, almeno parzialmente, la chiralità. In particolare, anche in forma di film sottile il PDLA o PLLA può presentare morfologia e almeno parziale chiralità delle superfici, peculiari del particolare enantiomero (Maillard e Prud’homme, 2010), mostrando fenomeni di dicroismo circolare.

Dal punto di vista chimico-fisico però questi polimeri sono tra loro molto simili, per esempio risultano solubili negli stessi solventi organici (es. benzene, cloroformio, acetonitrile, etc.). Inoltre, non si osservano significative differenze in termini di parametri come la temperatura di melting (Tm ~180 °C), la temperatura di decomposizione (~200 °C), e rottura all’allungamento (20-30%) (Xiao et al., 2012), che dipendono principalmente dal peso molecolare del polimero. Dal punto di vista commerciale, il mercato è dominato dal PLLA, che viene utilizzato principalmente per la produzione di oggetti usa-e-getta. Il PDLA ha invece un mercato più di nicchia e applicazioni nell’ambito medicale/oncologico, soprattutto grazie alla capacità di assorbire acido lattico libero (Goldberg, 2014).

Tradizionalmente, il PLA (nelle sue forme enantiomericamente pure e non) viene prodotto mediante una reazione chimica, a partire dall’acido lattico ottenuto per via fermentativa. Al contrario di altre bioplastiche, come i poliidrossialcanoati (PHA), nessun organismo naturale a oggi noto è in grado di sintetizzare direttamente PLA in forma polimerica (Chen e Patel, 2012). La produzione industriale di PLA avviene principalmente tramite una ring-opening polymerization, che passa da un intermedio ciclico, chiamato lattide, in grado di facilitare la reazione. Tale processo presenta però aspetti che riducono la sostenibilità ambientale di questa bioplastica: i) per completare la polimerizzazione è necessario l’uso dell’ottanoato stannico come catalizzatore ii) per permettere la polimerizzazione chimica è necessario che l’acido lattico sia nella sua forma protonata, e non sotto forma di lattato (Garlotta, 2001; Jamshidian et al., 2010; Rasal et al., 2010; Tsuji et al., 2011). Tuttavia, dal momento che le principali filiere di produzione di PLA prevedono l’uso di batteri lattici è necessario trattare con elevate quantità di acido il prodotto finale di fermentazione. Infatti, per permettere la crescita di tali organismi è necessario mantenere il pH del brodo di coltura costante intorno ad un valore di 5 (Okano et al., 2010). In queste condizioni, il prodotto finale è il lattato, dal momento che la pKa dell’acido lattico è 3.86. Si rende quindi necessaria, come precedentemente detto, l’acidificazione a fine fermentazione. Inoltre, le necessità nutrizionali dei lattobacilli risultano nella maggior parte dei casi essere più complesse: questo determina la necessità di formulazioni ricche ma non necessariamente compatibili con l’uso di biomasse residuali come substrato di crescita, ed inoltre determina spesso una maggiore complessità in fase di downstream per la purificazione del monomero desiderato (Okano et al., 2010). Infine, i lattobacilli, a differenza dei lieviti sono soggetti ad attacco da parte di batteriofagi durante il processo di fermentazione (Marcó et al., 2012).

L’uso di lieviti costituisce una valida alternativa, in quanto molte specie appartenenti a questo gruppo, per esempio il lievito della birra e del pane Saccharomyces cerevisiae, sono in grado di crescere in terreni caratterizzati da bassi valori di pH, anche inferiori ad un valore di 3. I lieviti sono microrganismi unicellulari ampiamente utilizzati dalla bioindustria. In particolare, S. cerevisiae è il microrganismo eucariote meglio conosciuto a livello molecolare, genetico e biochimico e vanta lo status di microrganismo GRAS (Generally Recognised As Safe) (Porro et al., 2011; Li e Borodina, 2015). Inoltre, se comparati a batteri come i lattobacilli, i lieviti presentano esigenze nutrizionali meno complesse che permettono la loro crescita su biomasse residuali come riportato a titolo esemplificativo da Soares et al., (2017), Jansen et al., (2017) e Choi et al., (2002).

Nonostante la fermentazione lattica rappresenti già per sé una rivoluzione sostenibile per la produzione di bioplastiche rispetto alla produzione dal petrolio, per ridurre ulteriormente l’impatto del processo convenzionale basato sulla polimerizzazione chimica la sintesi microbiologica diretta rappresenta una possibile soluzione. Come precedentemente detto, in natura nessun organismo noto è in grado di accumulare acido polilattico. A differenza degli eucarioti, molti procarioti sono però in grado di produrre poliesteri alifatici come polimeri di riserva. L’utilizzo quindi di cellule eucariotiche per la produzione di acido polilattico necessita una profonda e nuova ingegnerizzazione.

DESCRIZIONE DELL’INVENZIONE

La presente invenzione rende disponibile un metodo per la completa sintesi biologica di PDLA e/o PLLA, e cellule idonee allo scopo. Entrambe le biosintesi comprendono la bioconversione di una fonte di carbonio in PDLA e/o PLLA. Le vie metaboliche in esame prevedono la bioconversione del piruvato a lattato, seguita dalla sua attivazione con acetil-CoA a lactoil-CoA e conseguente polimerizzazione a PDLA e/o a PLLA. In letteratura non sono mai stati descritti esempi di cellule eucariotiche in grado di produrre PDLA e/o PLLA.

A supporto dell’inserimento di una catena metabolica che consente la conversione di glucosio in PDLA e/o PLLA, sono stati effettuati esperimenti su ceppi di lievito ingegnerizzati che mostrano la produzione di questi polimeri (vedere Esempi 8-10). La Figura 5 mostra uno schema dettagliato del cammino metabolico di sintesi di PDLA e/o PLLA a partire da glucosio, inserito in cellule di lievito dagli inventori della presente invenzione.

In letteratura esistono esempi di modificazioni genetiche del batterio Escherichia coli allo scopo di produrre direttamente PDLA puro o nella forma di co-polimero con 3-HB o altri monomeri (Cho et al., 2006; Jung et al., 2010; Yang et al., 2010; Choi et al., 2016). Tuttavia, l’utilizzo di E. coli presenta due principali limiti: i) durante il processo di fermentazione, il suddetto microrganismo può essere soggetto ad attacco da parte di batteriofagi, a differenza delle cellule eucariotiche (Marcó et al., 2012) ii) il metabolismo di E. coli è caratterizzato da una fermentazione acido mista in cui l’acido lattico non è l’unico prodotto di fermentazione con conseguenti effetti sulla resa di produzione del metabolita di interesse (Castaño-Cerezo et al., 2009). Inoltre, questi esempi si riferiscono all’incorporazione dell’acido lattico solo nella forma enantiomerica D, mentre non esistono esempi di sintesi diretta di PLLA, o di incorporazione di monomeri di acido L lattico all’interno dei biopolimeri prodotti. Ciò è legato al fatto che il sistema basato su E. coli sfrutta la naturale capacità del batterio di produrre esclusivamente acido lattico nella forma enantiomerica D. Al contrario, le cell factory sviluppate dal richiedente possono produrre acido D-lattico e/o acido L-lattico, permettendo la sintesi di PDLA e/o di PLLA sia in cellule eucariotiche che procariotiche.

Forma pertanto oggetto della presente invenzione una cellula caratterizzata da un flusso di carbonio indirizzato verso la sintesi di PDLA e/o di PLLA.

La sintesi di PDLA comprende le fasi di:

i) conversione da piruvato a D-lattato;

ii) sintesi di D-lactoil-CoA tramite tioesterificazione del D-lattato con acetil-CoA;

iii) polimerizzazione di molecole di D-lactoil-CoA a PDLA.

La sintesi di PLLA comprende le fasi di:

i) conversione da piruvato a L-lattato;

ii) sintesi di L-lactoil-CoA tramite tioesterificazione del L-lattato con acetil-CoA;

iii) polimerizzazione di molecole di L-lactoil-CoA a PLLA.

Le cellule comprendono geni codificanti per enzimi volti a indirizzare il flusso del carbonio verso la sintesi di PDLA e/o di PLLA.

In una forma preferita di realizzazione detta cellula è una cellula eucariotica, preferibilmente una cellula di lievito, più preferibilmente una cellula di Saccharomyces e ancora più preferibilmente una cellula di Saccharomyces cerevisiae.

I lieviti vengono a titolo esemplificativo descritti in “The Yeasts” di N. J. W. Kreger-van Rij, 1987. In particolare, i generi di lievito possono essere Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Debaromyces, Nadsonia, Lipomyces, Torulopsis, Kloeckera, Pichia, Schizosaccharomyces, Trigonopsis, Brettanomyces, Cryptococcus, Trichosporon, Aureobasidium, Lipomyces, Phaffia, Rhodotorula, Yarrowia, o Schwanniomyces, tra gli altri. Preferibilmente, il lievito viene selezionato dal genere Saccharomyces, ancora preferibilmente di Saccharomyces cerevisiae. Preferibilmente, il ceppo di S. cerevisiae è rappresentato da BY4742 (EuroScarf No. Accesso Y10000), CEN.PK 102-5B (MATa, ura3-52, his3-11, leu2-3/112, TRP1, MAL2-8c, SUC2) e 113-11C (MATa, ura3-52, his3-11, TRP1, MAL2-8c, SUC2 – Dr. P. Kötter, Institute of Microbiology, Johann Wolfgang Goethe-University, Francoforte, Germania) o ancora da ceppi industriali quali AP, BL, SAU (Arome Plus, Blanche, Sauvignone disponibile presso gruppo AEB, Italia) e VIN13 (disponibile presso Anchor, Francia). I ceppi di lievito possono essere aploidi o diploidi.

L’espressione coordinata e opportunamente regolata dei geni codificanti per gli enzimi coinvolti nel nuovo cammino metabolico introdotto dagli inventori della presente invenzione può essere realizzata mediante utilizzo di un promotore endogeno forte e costitutivo o mediante l’introduzione di più copie dei geni esogeni o mediante la conversione della sequenza nucleotidica con una variante nucleotidica ottimizzata nei codoni. Si tratta in tutti i casi di tecniche di routine che rientrano nelle competenze degli esperti del ramo.

In una forma di realizzazione dell’invenzione, la cellula è in grado di produrre PDLA esprimendo geni esogeni in essa introdotti codificanti per gli enzimi coinvolti nella sintesi del polimero. In una forma preferita di realizzazione, gli enzimi coinvolti nella suddetta produzione di PDLA sono: i) l’enzima D-lattato deidrogenasi (EC 1.1.1.28), ii) l’enzima propionil-CoA transferasi (EC 2.8.3.1), iii) l’enzima poliidrossialcanoato sintasi (EC 2.3.1.B2). Qualunque enzima D-lattato deidrogenasi, proprionil-CoA transferasi e poliidrossialcanoato sintasi, sia esso codificato da un gene endogeno o eterologo, può essere utilizzato secondo il metodo dell’invenzione. In una forma preferita di realizzazione, il gene eterologo codificante l’enzima D-lattato deidrogenasi è una forma mutata dell’ldhA di E. coli (Gene ID: 946315 NC_000913.3). Nello specifico tale sequenza presenta le seguenti mutazioni nucleotidiche: T387C, A537G, T636C, A663T, A726G, G777A, A798G, G825A, C828T, C885T (SEQ ID NO:1)

In un’altra forma preferita di realizzazione, l’enzima propionil-CoA transferasi è la versione mutata dell’enzima propionil-CoA transferasi (Pct) di Clostridium propionicum. Tale versione mutata, detta Pct540, presenta una sostituzione amminoacidica in posizione 193 in cui la valina è sostituita da un’alanina (V193A) (Park et al., 2009; Yang et al., 2010). Preferibilmente, il “codon usage” del gene eterologo codificante la Pct di Clostridium propionicum (Gene ID: AJ276553) mutato nella versione Pct540, è ottimizzato per la traduzione in lievito (SEQ ID NO: 2).

In una ulteriore forma preferita di realizzazione, l’enzima poliidrossialcanoato sintasi è la versione mutata dell’enzima poliidrossialcanoato sintasi C1 (PhaC1) di Pseudomonas resinovorans. Tale versione mutata, detta PhaC1437Pre, presenta quattro sostituzioni amminoacidiche, in cui l’acido glutammico in posizione 130 è sostituito da acido aspartico (E130D), la serina in posizione 325 è sostituita da treonina (S325T), la serina in posizione 477 è sostituita da glicina (S477G), la glutammina in posizione 481 è sostituita da lisina (Q481K)(Yang et al., 2011). Preferibilmente, il “codon usage” del gene eterologo codificante la PhaC1 di Pseudomonas resinovorans (Gene Accession no.: AF129396), mutato nella versione PhaC1437Pre, è ottimizzato per la traduzione in lievito (SEQ ID NO: 3).

In un’altra forma di realizzazione dell’invenzione, la cellula è in grado di produrre PLLA esprimendo geni esogeni, clonati in essa, codificanti per gli enzimi coinvolti nella sintesi del polimero. Gli enzimi coinvolti nella suddetta produzione sono: i) l’enzima L-lattato deidrogenasi (EC 1.1.1.27), ii) l’enzima propionil-CoA transferasi (EC 2.8.3.1), iii) l’enzima poliidrossialcanoato sintasi (EC 2.3.1.B2). Qualunque enzima L-lattato deidrogenasi, proprionil-CoA transferasi e poliidrossialcanoato sintasi, sia esso codificato da un gene endogeno o eterologo, può essere utilizzato secondo il metodo dell’invenzione. In una forma preferita di realizzazione, il gene eterologo codificante l’enzima L-lattato deidrogenasi è una versione mutata del gene ldh1 di Lactobacillus plantarum (Gene Accession no.: X70926). Nello specifico tale sequenza presenta le seguenti mutazioni nucleotidiche: T1A, T48C, C160G, G255T, G905C (Branduardi et al., 2006) (SEQ ID NO:4).

In un’altra forma preferita di realizzazione, l’enzima propionil-CoA transferasi è la versione mutata dell’enzima propionil-CoA transferasi (Pct) di Clostridium propionicum. Tale versione mutata, detta Pct540, presenta una sostituzione amminoacidica in posizione 193 in cui la valina è sostituita da un’alanina (V193A) (Park et al., 2009; Yang et al., 2010). Preferibilmente il “codon usage” del gene eterologo codificante la Pct di Clostridium propionicum (Gene ID: AJ276553), mutato nella versione Pct540,è ottimizzato per la traduzione in lievito (SEQ ID NO: 2).

In una ulteriore forma preferita di realizzazione, l’enzima poliidrossialcanoato sintasi è la versione mutata dell’enzima poliidrossi alcanoato sintasi C1 (PhaC1) di Pseudomonas resinovorans. Tale versione mutata, detta PhaC1437Pre, presenta quattro sostituzioni amminoacidiche, in cui l’acido glutammico in posizione 130 è sostituito da acido aspartico (E130D), la serina in posizione 325 è sostituita da treonina (S325T), la serina in posizione 477 è sostituita da glicina (S477G), la glutammina in posizione 481 è sostituita da lisina (Q481K)(Yang et al., 2011). Preferibilmente, il “codon usage” del gene eterologo codificante la PhaC1 di Pseudomonas resinovorans (Gene Accession no.: AF129396), mutato nella versione PhaC1437Pre, è ottimizzato per la traduzione in lievito (SEQ ID NO: 3).

Sorprendentemente le attività enzimatiche propionil-CoA transferasi e poliidrossialcanoato sintasi coinvolte nella produzione di PLLA sono le medesime di quelle necessarie per la sintesi di PDLA.

Essendo l’acido lattico intermedio chiave per la produzione di PDLA e/o PLLA, l’iperproduzione intracellulare di questo acido a partire da glucosio e/o da altri zuccheri, mediante ingegnerizzazione dei livelli di espressione di geni noti, porta all’aumento della produzione di acido lattico e quindi di PDLA e/o PLLA. L’esistenza di noti pathway ingegnerizzati per l’uso efficiente di glucosio e/o zuccheri pentosi (xilosio, arabinosio) rende altresì possibile lo sfruttamento di questa via per la produzione di PDLA e/o PLLA da zuccheri, che derivino da biomasse residuali e quindi non in competizione con la filiera agro-alimentare.

Quindi, secondo una forma ulteriore di realizzazione, la cellula preposta alla produzione di PLLA/PDLA comprende dei livelli intracellulari di zuccheri e/o di intermedi catabolici, da essi derivanti, maggiori rispetto ad una corrispondente cellula wild-type, mediante clonaggio di almeno uno dei geni codificanti per proteine responsabili della internalizzazione e/o del catabolismo di zuccheri. Secondo una forma preferita di realizzazione detti zuccheri sono scelti tra glucosio e carboidrati che derivano dall’idrolisi chimica e/o enzimatica (enzimi appartenenti alle superfamiglie delle laccasi, idrolasi, cellulasi ed emicellulasi, vedere Kumar et al., 2009) di una biomassa residuale. Preferibilmente, detti carboidrati sono esosi e pentosi, tra cui glucosio, mannosio, galattosio, xilosio, arabinosio, e loro miscele. In questo modo i polimeri di interesse possono essere prodotti in un procedimento che prevede l’idrolisi di biomasse residuali per via enzimatica e/o chimico-fisica, ad esempio mediante steam explosion, che porta ad una preparazione arricchita in zuccheri semplici.

In aggiunta o in alternativa, si possono aumentare i livelli di acido lattico intracellulare eliminando pathway competitivi alla sua produzione. A titolo esemplificativo, ma non esaustivo, si possono deletare i geni codificanti per gli enzimi piruvato decarbossilasi (i.e. PDC1 Gene ID: 850733, Sequenza NC_001144.5; PDC5 Gene ID ID: 850825, Sequenza NC_001144.5; PDC6 Gene ID: 852978, Sequenza NC_001139.9) e/o alcol deidrogenasi che conducono alla formazione di etanolo (i.e. ADH1 Gene ID: 854068, Sequenza NC_001147.6).

L’invenzione ha altresì come oggetto un procedimento per la produzione di PDLA e/o PLLA che comprende i seguenti passaggi:

(i) coltura di una cellula come qui descritta in un terreno di coltura comprendente una fonte di carbonio;

(ii) recupero della massa cellulare contenente il polimero;

ed opzionalmente

(iii) estrazione di PDLA e/o PLLA dalle cellule.

La cellula può essere procariotica o eucariotica. In una forma preferita di realizzazione detta cellula è eucariotica, preferibilmente una cellula di lievito, più preferibilmente una cellula di Saccharomyces e ancora più preferibilmente una cellula di Saccharomyces cerevisiae. In un’ulteriore forma preferita di realizzazione del procedimento di produzione di PDLA e/o PLLA secondo l’invenzione detta fonte di carbonio può essere scelta tra glucosio e zuccheri che derivano dall’idrolisi di una biomassa residuale (i.e. esosi, pentosi). Preferibilmente, detti zuccheri sono esosi, preferibilmente glucosio, o pentosi, preferibilmente xilosio e/o arabinosio, e loro miscele.

In un’ulteriore forma preferita di realizzazione del procedimento di produzione di PDLA e/o PLLA secondo l’invenzione, detta fonte di carbonio può essere presente in una quantità compresa tra 10 g/L e 1000 g/L, essendo preferibilmente 20 g/L e 50 g/L.

L’estrazione di PDLA e/o PLLA dalle cellule può essere effettuata mediante l’uso di solventi. In alternativa può essere usata direttamente la massa cellulare contenente il polimero.

FIGURE

la Figura 1 mostra la mappa del vettore ricombinante pTEFLEU2-ldhA recante il gene ldhA derivante da E. coli;

la Figura 2 mostra la mappa del vettore ricombinante pTEFLEU2-ldh1 recante il gene ldh1 derivante da L. plantarum;

la Figura 3 mostra la mappa del vettore ricombinante pYX212-Pct540 recante il gene Pct540 derivante dalla Pct di C. propionicum;

la Figura 4 mostra la mappa del vettore ricombinante pYX022-PhaC1437Pre recante il gene PhaC1437Pre derivante dalla PhaC1 di P. resinovorans;

la Figura 5 mostra la via metabolica per la produzione di PDLA a partire da glucosio via piruvato, D-lattato e D-lactoil CoA (parte superiore della figura), e la via metabolica per la produzione di PLLA a partire da glucosio via piruvato, L-lattato e L-lactoil CoA (parte inferiore della figura);

la Figura 6 mostra un grafico rappresentativo dell’andamento della crescita cellulare nel tempo di un ceppo ingegnerizzato per la produzione di PDLA, di un ceppo ingegnerizzato per la produzione di PLLA e di un ceppo di controllo esprimente solo i geni ldhA e Pct540, fornendo come fonte di carbonio glucosio 20 g/L (pannello superiore); istogrammi relativi alla resa di conversione del glucosio in etanolo e del glucosio in glicerolo (pannello inferiore);

la Figura 7 mostra i dot plot relativi alla fluorescenza emessa da cellule trattate con il colorante Nile red, nel ceppo di controllo esprimente ldhA e Pct540 (pannello superiore), nel ceppo ingegnerizzato per la produzione di PDLA (pannello centrale) e nel ceppo ingegnerizzato per la produzione di PLLA (pannello inferiore). Tali misurazioni sono state effettuate a diversi tempi dall’inoculo (24 ore, 48 ore, 72 ore) tramite citofluorimetria a flusso (FACS); nei grafici, l’intensità della fluorescenza emessa a 620 nm è riportata in scala logaritmica sull’asse delle ascisse mentre il segnale Forward Scatter (FS), relativo alle dimesioni delle cellule, è riportato sull’asse delle ordinate. Il gate, fisso per tutte le analisi, indica la percentuale di cellule positive alla colorazione con il Nile red;

la Figura 8 mostra i dati relativi all’analisi GC-MS di acido lattico puro (commerciale) sottoposto a metanolisi in condizioni acide. Il cromatogramma riportato è relativo ai primi 5 minuti di analisi. Per l’unico picco ottenuto, al tempo di ritenzione di 2.26 minuti, è riportato il relativo spettro di massa con la percentuale di identificazione con il metil lattato.

La Figura 9 mostra i dati relativi all’analisi GC-MS di cellule ingegnerizzate per la produzione di PDLA, liofilizzate e sottoposte a metanolisi in condizioni acide. Il cromatogramma riportato è relativo ai primi 5 minuti di analisi. Per il picco osservabile al tempo di ritenzione di 2.20 minuti è riportato il relativo spettro di massa con la percentuale di identificazione con il metil lattato;

la Figura 10 mostra i dati relativi all’analisi GC-MS di cellule ingegnerizzate per la produzione di PLLA, liofilizzate e sottoposte a metanolisi in condizioni acide. Il cromatogramma riportato è relativo ai primi 5 minuti di analisi. Per il picco osservabile al tempo di ritenzione di 2.22 minuti è riportato il relativo spettro di massa con la percentuale di identificazione con il metil lattato;

la Figura 11 mostra il cromatogramma relativo ai primi 5 minuti di analisi GC di cellule liofilizzate esprimenti ldhA e Pct e sottoposte a metanolisi;

la Figura 12 mostra i dati relativi all’analisi GC-MS di campioni sottoposti a metanolisi in condizioni acide derivanti da estrazione con solvente di cellule liofilizzate ingegnerizzate per la produzione di PDLA. Il cromatogramma riportato è relativo ai primi 5 minuti di analisi. Per il picco osservabile al tempo di ritenzione di 2.24 minuti è riportato il relativo spettro di massa con la percentuale di identificazione con il metil lattato.

DEFINIZIONI

Con il termine biomassa si definisce qualsiasi sostanza di origine organica che possa rigenerarsi in tempi compatibili con il suo consumo, destinata alla produzione di bioenergia e/o biocarburanti e/o biomateriali. Ciò in contrapposizione con le biomasse fossili, le cui tempistiche di rigenerazione eccedono di numerosi ordini di grandezza quelle di consumo.

Per biomasse residuali si intende la frazione biodegradabile di rifiuti e/o residui di origine biologica provenienti dall’agricoltura (comprendente sostanze vegetali e/o animali) e/o dalla silvicoltura e/o dalle industrie connesse, comprese la pesca e/o l’acquacoltura, gli sfalci e le potature provenienti dal verde pubblico e privato, nonché la parte biodegradabile dei rifiuti industriali e/o urbani.

Si definisce resa di produzione il rapporto tra la quantità di prodotto ottenuto e la quantità di substrato consumato.

Il termine vettore indica un costrutto di DNA comprendente una sequenza di DNA legata a una sequenza di controllo capace di portare all’espressione del suddetto DNA in un ospite adatto. Nella presente invenzione il tipico vettore plasmidico usato presenta: a) o un’origine di replicazione che permette l’effettiva replicazione del plasmide così che in ogni cellula dell’ospite scelto vi siano decine di copie del vettore plasmidico, o una sequenza di DNA che permette l’integrazione del vettore plasmidico in un cromosoma di ciascuna cellula dell’ospite scelto; b) un marcatore di selezione tale per cui una cellula correttamente trasformata con il vettore plasmidico possa essere selezionata; c) una sequenza di DNA comprendente siti di taglio per enzimi di restrizione al fine di poter introdurre nel vettore plasmidico DNA esogeno mediante un processo chiamato ligazione.

Come generalmente riportato nello stato dell’arte, per portare all’espressione del gene inserito nella cellula ospite, la sequenza codificante deve essere correttamente e funzionalmente connessa a elementi regolatori della trascrizione, della traduzione e dell’espressione funzionanti nell’ospite di espressione selezionato.

Con il termine trasformazione qui utilizzato si intende che il DNA, una volta introdotto nella cellula, può replicarsi al di fuori di cromosomi o come parte di un intero cromosoma.

ESEMPI ESEMPIO 1: Costruzione del vettore ricombinante pTEFLEU2-ldhA recante il gene ldhA

La sequenza codificante del gene ldhA è stata amplificata per PCR usando come templato il DNA genomico di E. coli e oligonucleotidi specifici (SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6). Il programma usato per l’amplificazione è come segue: dopo 30 secondi di denaturazione a 98 °C, 25 cicli (denaturazione di 10 secondi a 98 °C, appaiamento di 30 secondi a 72 °C e allungamento di 60 secondi a 72 °C), seguiti da un allungamento finale di 2 minuti a 72 °C. Il prodotto di PCR e il vettore di destinazione pTEFLEU2 sono stati digeriti con gli enzimi di restrizione EcoRI e XhoI e la loro ligazione ha portato all’ottenimento del vettore di espressione ricombinante pTEFLEU2-ldhA (Figura 1).

ESEMPIO 2: Costruzione del vettore ricombinante pTEFLEU2-ldh1 recante il gene ldh1

Il gene ldh1 di L. plantarum (SEQ ID NO: 4) è stato exciso dal vettore p022TLP (Branduardi et al., 2006) tramite digestione con l’enzima di restrizione EcoRI. Il frammento di DNA corrispondente al gene ldh1 e recante estremità EcoRI è stato ligato con il vettore di destinazione pTEFLEU2, previa sua digestione con EcoRI, portando all’ottenimento del vettore di espressione ricombinante pTEFLEU2-ldh1 (Figura 2).

ESEMPIO 3: Costruzione del vettore ricombinante pYX212-Pct540 recante il gene Pct540

La sequenza codificante per la versione mutata del gene Pct di C. propionicum, ovvero Pct540 (SEQ ID NO: 3), preceduta dalla sequenza del promotore pTDH3 di S. cerevisiae (SEQ ID NO: 7) sono state sintetizzate de novo e clonate dalla ditta produttrice nel vettore pEX-A2 (Eurofins Genomics), dando origine al vettore pEX-A2-Pct540. In particolare, la sequenza del gene Pct540 ha “codon usage” ottimizzato per cellule di lievito. Il vettore pEX-A2-Pct540 è stato linearizzato con l’enzima di restrizione BglI, e il frammento di DNA pTDH3-Pct540 è stato exciso dal suddetto vettore linearizzato, tramite digestione con gli enzimi di restrizione KpnI e NheI. Il frammento pTDH3-Pct540 con estremità KpnI/NheI è stato clonato nel vettore di destinazione pYX212 (R&D Systems, Inc., Wiesbaden, D), digerito con gli enzimi di restrizione KpnI e NheI e quindi privo del promotore pTPI di S. cerevisiae. La ligazione dei due frammenti di DNA ha portato all’ottenimento del vettore di espressione ricombinante pYX212-Pct540 (Figura 3).

ESEMPIO 4: Costruzione del vettore ricombinante pYX022-PhaC1437Pre recante il gene PhaC1437Pre

La sequenza codificante per la versione mutata del gene PhaC1 di P.

resinovorans, ovvero PhaC1437Pre (SEQ ID NO: 3), preceduta dalla sequenza del promotore pADH1 di S. cerevisiae (SEQ ID NO: 8) sono state sintetizzate de novo e clonate dalla ditta produttrice nel vettore pEX-K4 (Eurofins Genomics). In particolare, la sequenza del gene PhaC1437Pre ha “codon usage” ottimizzato per cellule di lievito. Il frammento di DNA pADH1- PhaC1437Pre è stato exciso dal vettore pEX-K4 tramite digestione con gli enzimi di restrizione AatII e NheI. Il frammento pADH1-PhaC1437Pre con estremità AatII/NheI è stato clonato nel vettore di destinazione pYX022 (R&D Systems, Inc., Wiesbaden, D), digerito con gli enzimi di restrizione AatII e NheI e quindi privo del promotore pTPI di S. cerevisiae. La ligazione dei dei due frammenti di DNA ha portato all’ottenimento del vettore di espressione ricombinante pYX022-PhaC1437Pre (Figura 4).

ESEMPIO 5: Costruzione del ceppo ricombinante di S. cerevisiae per la produzione di PDLA

Il ceppo di laboratorio CEN.PK di S. cerevisiae è stato trasformato con i vettori pTEFLEU2-ldhA, pYX212-Pct540 e pYX022-PhaC1437Pre, descritti rispettivamente negli esempi 1, 3, 4. La rappresentazione grafica della via metabolica per la sintesi di PDLA a partire da glucosio via piruvato, D-lattato e D-lactoil-CoA, nel ceppo ricombinante è riportata in Figura 5A.

ESEMPIO 6: Costruzione del ceppo ricombinante di S. cerevisiae per la produzione di PLLA

Il ceppo di laboratorio CEN.PK di S. cerevisiae è stato trasformato con i vettori pTEFLEU2-ldh1, pYX212-Pct540 e pYX022-PhaC1437Pre, descritti rispettivamente negli esempi 2, 3, 4. La rappresentazione grafica della via metabolica per la sintesi di PLLA a partire da glucosio via piruvato, L-lattato e L-lactoil-CoA, nel ceppo ricombinante è riportata in Figura 5B.

ESEMPIO 7: Costruzione del ceppo ricombinante di S. cerevisiae come controllo negativo della sintesi di PLA

Il ceppo di laboratorio CEN.PK di S. cerevisiae è stato trasformato con i vettori pTEFLEU2-ldhA e pYX212-Pct540. Il suddetto ceppo ricombinante è privo dell’attività poliidrossialcanoato sintasi pertanto è usato nei prossimi esempi come controllo negativo della produzione di PDLA e PLLA. Infatti, indipendentemente dalla stereochimica del lattato, l’assenza dell’attività poliidrossialcanoato sintasi non consente la polimerizzazione dei monomeri di lactoil-CoA.

ESEMPIO 8: Andamento della crescita cellulare e produzione dei principali metaboliti extracellulari nel tempo nel ceppo ingegnerizzato per la produzione di PDLA, nel ceppo ingegnerizzato per la produzione di PLLA e nel ceppo di controllo Le cellule del ceppo CEN.PK pTEFLEU2-ldhA, pYX212-Pct540, pYX022-PhaC1437Pre ingegnerizzato per la produzione di PDLA, del ceppo CEN.PK pTEFLEU2-ldh1, pYX212-Pct540, pYX022-PhaC1437Pre ingegnerizzato per la produzione di PLLA e del ceppo CEN.PK pTEFLEU2-ldhA, pYX212-Pct540 (usato come controllo) sono state cresciute in presenza di glucosio 20 g/L e Yeast Nitrogen Base (YNB) 6,7 g/L. Le cellule sono state inoculate ad una densità ottica di 0,05 (DO 660 nm) in 20 mL di terreno in beute da 100 mL poste a 30 °C su agitatore orbitale a 160 rpm. La crescita cellulare è stata monitorata misurando la DO a 660 nm a intervalli di tempo regolari. La concentrazione extracellulare di glucosio, acetato, etanolo e glicerolo è stata determinata tramite HPLC utilizzando H2SO4 5 mN come fase mobile e una colonna Rezex ROA H<+ >(8%) 300 x 7.8 mm con matrice di stirene sulfonato- divinilbenzene (Phenomenex).

Come mostrato in Figura 6A il ceppo CEN.PK ingegnerizzato per la produzione di PDLA e il ceppo ingegnerizzato per la produzione di PLLA hanno un andamento della crescita cellulare simile nel tempo. Sorprendentemente, tali ceppi sono caratterizzati da un rallentamento della crescita cellulare e da una minor massa cellulare raggiunta a fine fermentazione, se paragonati al ceppo CEN.PK pTEFLEU2-ldhA, pYX212-Pct540, usato come controllo. I risultati ottenuti risultano in accordo con l’analisi dei principali metaboliti extracellulari; alla minor resa di conversione di glucosio in massa cellulare dei ceppi ingegnerizzati per la produzione dei due polimeri corrispondono infatti maggiori rese di conversione di glucosio in etanolo e glicerolo rispetto al ceppo di controllo CEN.PK pTEFLEU2-ldhA, pYX212-Pct540.

Con questi esperimenti si dimostra quindi un reindirizzamento del flusso del carbonio all’interno di cellule trasformate con i geni codificanti le attività enzimatiche necessarie alla produzione di PDLA e PLLA.

ESEMPIO 9: Valutazione della produzione di PDLA o alternativamente di PLLA mediante trattamento con il colorante Nile red

Le cellule del ceppo CEN.PK ingegnerizzato per la produzione di PDLA, del ceppo ingegnerizzato per la produzione di PLLA e del ceppo di controllo esprimente solo i geni ldha e Pct540 sono state cresciute come descritto nell’esempio 8. La produzione di PDLA o alternativamente di PLLA è stata valutata mediante trattamento con il colorante Nile red. Tale colorante è usato per valutare in cellule vive l’accumulo di biopolimeri alifatici, quali PHA o co-polimeri di acido D-lattico e altri idrossiacidi, come riportato in letteratura, a titolo esemplificativo, da Spiekermann et al., 1999; Glorenflo et al., 1999; Yang et al., 2010. Nello specifico, dopo 24, 48 e 72 ore dall’inoculo sono state prelevate 0.3 DO di cellule dei ceppi in esame e dopo centrifugazione sono state lavate in 1 mL di tampone fosfato (PBS; NaH2PO4 53 mM, Na2HPO4 613 mM, NaCl 75 mM). Dopo centrifugazione, sono state risospese in 1 mL di etanolo al 35% (v/v) freddo e incubate in ghiaccio per 20 minuti al fine di permeabilizzare le cellule al colorante. Le cellule sono state nuovamente lavate con 1 mL di PBS, e, dopo aver aggiunto il colorante Nile red alla concentrazione finale 31.4 μM, sono state incubate per 5 minuti al buio in ghiaccio. Successivamente i campioni sono stati analizzati tramite citofluorimetria a flusso (FACS), utilizzando un citometro a flusso Beckman Coulter FC-500 (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) equipaggiato con un laser a ioni argon (lunghezza d’onda di eccitazione 488 nm, potenza del laser 20 mW). L’emissione di fluorescenza del Nile red viene acquisita attraverso un filtro a 670 nm (canale FL3), in scala logaritmica. I parametri operativi sono stati settati in modo da analizzare 20 mila cellule per ogni campione escludendo debris cellulari. I dati sono stati analizzati successivamente mediante il programma Flowing software (www.flowingsoftware.com). In Figura 7 sono mostrati i dot plot relativi alla fluorescenza emessa, a diversi tempi dall’inoculo (24, 48, 72 ore), da cellule trattate con il Nile red. Nello specifico ogni punto rappresenta una cellula; la sua posizione nel grafico è dipendente dalla sua emissione di fluorescenza (riportata sull’asse delle ascisse) e dalle sue dimensioni (riportata sull’asse delle ordinate).

I dot plot mostrano che la quasi totalità di cellule ingegnerizzate per la produzione di PDLA (pannello B) e per la produzione di PLLA (pannello C) risulta essere positiva alla colorazione con il Nile red. In particolare, la percentuale massima di cellule positive alla colorazione è del 84% nel ceppo ingegnerizzato per la produzione di PDLA e del 97% nel ceppo ingegnerizzato per la produzione di PLLA. Al contrario, come osservabile nel pannello A, nelle cellule di controllo esprimenti solo i geni ldhA e Pct540 la percentuale di cellule positive alla colorazione è trasurabile e ascrivibile all’interazione del Nile red con componenti strutturali della cellula, come ad esempio le membrane cellulari (Mukherjee et al., 2007).

Data la correlazione diretta tra l’emissione di fluorescenza del Nile red e la presenza di polimeri alifatici, i dati riportati dimostrano quindi che le ingegnerizzazioni metaboliche volte alla produzione di PDLA e/o di PLLA (Figura 5), oggetto della presente invenzione, determinano l’accumulo di questi polimeri in cellule eucariotiche.

Viene quindi qui descritta per la prima volta la sintesi diretta di PDLA in cellule eucariotiche. Inoltre, viene descritta per la prima volta la sintesi diretta di PLLA mediante cellule. Non sono riportati in letteratura esempi di cellule wild-type o ingegnerizzate in grado di polimerizzare idrossiacidi, e tra questi l’acido lattico, con un centro chirale in configurazione L. In particolare, è stato qui descritto per la prima volta che l’enzima poliidrossialcanoato sintasi è in grado di polimerizzare monomeri idrossiacidi con centro chirale in configurazione L.

ESEMPIO 10: Analisi di PDLA o alternativamente di PLLA mediante analisi GC-MS

Al fine di valutare la composizione del polimero accumulato nelle cellule (esempio 9) è stata effettuata un’analisi gas cromatografica accoppiata ad una spettrometria di massa (GC-MS).

Le cellule del ceppo ingegnerizzato per la produzione di PDLA, del ceppo ingegnerizzato per la produzione di PLLA e del ceppo di controllo esprimente solo i geni ldha e Pct540 sono state pre-inoculate in presenza di glucosio 50 g/L e YNB 6.7 g/L . Il preinoculo è stato effettuato in 100 mL di terreno in beute da 500 mL poste a 30 °C su agitatore orbitale a 160 rpm. Dopo 24 ore di crescita, le cellule sono state inoculate in un bioreattore da 2L ad un DO660 iniziale di 0.2. Il volume operativo di terreno utilizzato nel bioreattore è di 1.5 L e la sua composizione risulta essere: glucosio 50 g/L e YNB 13.4 g/L.

I parametri di crescita sono: temperatura costante di 30 °C; quantità di ossigeno disciolto superiore al 25% con un flusso di aria di 1 vvm (volume di aria per volume di terreno di coltura); pH mantenuto a 5 con aggiunte, se necessario, di NaOH 4M e H3PO4 al 25% (v/v). L’agitazione risulta essere dipendente dalla percentuale di ossigeno disciolto nel terreno.

Dopo 48 ore dall’inoculo, le cellule sono state recuperate mediante centrifugazione e sottoposte a liofilizzazione e successivamente a metanolisi acida al fine di rompere le cellule stesse e depolimerizzare il polimero di acido lattico in unità monomeriche di metil lattato. La metanolisi è stata effettuata secondo il seguente protocollo adattato da Braunegg et al. (1978): le cellule sono state disciolte in una soluzione di metanolo acidificato con acido solforico (3% v/v) e cloroformio in rapporto 1:1; la preparazione è stata scaldata in microonde ad una potenza di 300 W, per 200 minuti a 120 °C. La soluzione derivante dalla metanolisi delle cellule è stata sottoposta ad analisi GC-MS. Tale strumento è costituito da un gas cromatografo Clarus 500 (PerkinElmer) e da uno spettrometro di massa Clarus 560 (PerkinElmer). Il GC è equipaggiato con una colonna capillare Elite-5MS (PerkinElmer). Le condizioni di temperatura in cui è stata effettuata l’analisi gas cromatografica sono le seguenti: 70 °C per 5 minuti, incremento di 10 °C/minuto fino a raggiungere 150 °C, incremento di 20 °C/minuto fino a raggiungere 300 °C, mantenuti per 14.5 minuti. Il campione è stato iniettato ad una temperatura iniziale di 250 °C, mantenuta per 10 minuti.

In Figura 8 sono mostrati il cromatogramma e lo spettro di massa relativi ad un campione di lattato puro (commerciale) esterificato a metil lattato (secondo il protocollo di metanolisi), utilizzato come riferimento per le successive analisi condotte sulle cellule ingegnerizzate per produrre PDLA o alternativamente PLLA. Nel cromatogramma è presente un unico picco, con un tempo di ritenzione di 2.26 minuti e, dal confronto con la NIST Mass Spectral Library, esso mostra una percentuale di identificazione con il metil-lattato pari al 97%.

In Figura 9 sono riportati i dati GC-MS relativi al ceppo ingegnerizzato per la produzione di PDLA. Il picco con un tempo di ritenzione di 2.20 minuti è corrispondente al metil lattato, con una percentuale del 90.5% di identificazione con tale molecola. Tale risultato dimostra che l’acido lattico è monomero costituente del biopolimero accumulato dalle cellule. Gli ulteriori picchi presenti nel cromatogramma sono riconducibili a molecole liberate a seguito della lisi delle componenti cellulari.

In Figura 10 sono riportati i dati GC-MS relativi al ceppo ingegnerizzato per la produzione di PLLA. Il picco con un tempo di ritenzione di 2.22 minuti è corrispondente al metil lattato, con una percentuale del 85.6% di identificazione con tale molecola. Tale risultato dimostra che l’acido lattico è monomero costituente del biopolimero accumulato dalle cellule. Gli ulteriori picchi presenti nel cromatogramma sono anche in questo caso riconducibili a molecole liberate a seguito della lisi delle componenti cellulari.

La Figura 11 mostra i dati relativi al ceppo di controllo, esprimente solo i geni ldhA e Pct540. Il cromatogramma presenta picchi riconducibili a molecole liberate dalla lisi cellulare ma non quello relativo al metil lattato caratterizzato da un tempo di ritenzione di circa 2.2 minuti. Tale dato dimostra pertanto che il picco relativo al metil lattato, identificato nelle Figure 9 e 10, deriva effettivamente dalla depolimerizzazione di PDLA o alternativamente di PLLA accumulati nelle cellule appositamente ingegnerizzate, e non da acido lattico libero nella cellula.

La Figura 12 mostra i dati relativi all’analisi GC-MS di campioni sottoposti a metanolisi in condizioni acide derivanti da estrazione con solvente di cellule liofilizzate ingegnerizzate per la produzione di PDLA. L'estrazione è stata effettuata prima del procedimento sopra descritto di metanolisi in condizioni acide, mediante l’utilizzo di cloroformio e dell’apparato (o estrattore) di Soxhlet, come descritto a titolo esemplificativo, ma non esclusivo, da Yang et al. (2010), con minime modifiche. Il picco con un tempo di ritenzione di 2.24 minuti è corrispondente al metil lattato, con una percentuale del 95.4% di identificazione con tale molecola. Tale risultato dimostra che anche a seguito di estrazione tramite apparato di Soxhlet è possibile identificare l’acido lattico come monomero costituente del biopolimero accumulato dalle cellule.

RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI

Branduardi P, Sauer M, De Gioia L, Zampella G, Valli M, Mattanovich D, Porro D. Lactate production yield from engineered yeasts is dependent from the host background, the lactate dehydrogenase source and the lactate export. Microbial cell factories, 2006; 5(1):4.

Braunegg G, Sonnleitner BY, Lafferty RM A rapid gas chromatographic method for the determination of poly-β-hydroxybutyric acid in microbial biomass. European journal of applied microbiology and biotechnology, 1978; 6(1):29-37.

Castaño-Cerezo S, Pastor JM, Renilla S, Bernal V, Iborra JL, Cánovas M. An insight into the role of phosphotransacetylase (pta) and the acetate/acetyl-CoA node in Escherichia coli. Microbial Cell Factories, 2009; 8:54.

Chen CQ and Patel MK. Plastics derived from biological sources: present and future: a technical and environmental review. Chemical reviews, 2011; 112(4): 2082-2099.

Cho JH, Park SJ, Lee SY, Jung YK. Cells or plants having a producing ability of polylactate or its copolymers and method for preparing polylactate or its copolymers using the same. WO Brevetto 2006, 126796

Choi MH, Ji GE, Koh KH, Ryu YW, Park YH. Use of waste Chinese cabbage as a substrate for yeast biomass production. Bioresource technology, 2002; 83(3), 251-253.

Choi SY, Park SJ, Kim WJ, Yang JE, Lee H, Shin J, Lee SY. One-step fermentative production of poly (lactate-co-glycolate) from carbohydrates in Escherichia coli. Nature biotechnology, 2016; 34(4):435.

Garlotta D. A literature review of poly (lactic acid). Journal of Polymers and the Environment, 2001; 9(2):63-84.

Goldberg JS. PDLA a potential new potent topical analgesic: a case report. Local and regional anesthesia , 2014; 7,59.

Gorenflo V, Steinbüchel A, Marose S, Rieseberg M, Scheper T. Quantification of bacterial polyhydroxyalkanoic acids by Nile red staining. Applied microbiology and biotechnology, 1999; 51(6), 765-772.

Jamshidian M, Tehrany EA, Imran M, Jacquot M, Desobry S. Poly‐Lactic Acid: production, applications, nanocomposites, and release studies. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2010; 9(5): 552-571.

Jansen ML, Bracher JM, Papapetridis I, Verhoeven MD, de Bruijn H, de Waal PP, van Maris AJA, Klaassen P, Pronk JT. Saccharomyces cerevisiae strains for second-generation ethanol production: from academic exploration to industrial implementation. FEMS yeast research, 2017; 17(5).

Jung YK, Kim TY, Park SJ, Lee SY. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of polylactic acid and its copolymers. Biotechnology and bioengineering, 2010; 105(1):161-171.

Kumar P, Barrett DM, Delwiche MJ, Stroeve P. Methods for Pretreatment of Lignocellulosic Biomass for Efficient Hydrolysis and Biofuel Production. Industrial & Engineering Chemistry Research, 2009; 48(8):3713-3729.

Li M e Borodina I. Application of synthetic biology for production of chemicals in yeast Saccharomyces cerevisiae. FEMS yeast research, 2015; 15(1), 1-12.

Maillard D, Prud’homme RE. Differences between crystals obtained in PLLA-rich or PDLA-rich stereocomplex mixtures. Macromolecules, 2010; 43(9), 4006-4010.

Marcó MB, Moineau S, Quiberoni A. Bacteriophages and dairy fermentations. Bacteriophage, 2012; 2(3):149-158.

Mukherjee S, Raghuraman H, Chattopadhyay A. Membrane localization and dynamics of Nile Red: effect of cholesterol. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, 2007; 1768(1), 59-66.

Okano K, Tanaka T, Ogino C, Fukuda H, Kondo A. Biotechnological production of enantiomeric pure lactic acid from renewable resources: recent achievements, perspectives, and limits. Appl Microbiol Biotechnol., 2010; 85:413– 423.

Park SJ, Yang TH, Kang HO, Lee SH, Lee EJ, Kim TW. Mutant of propionyl-coa transferase from Clostridium propionicum and preparing method for PLA or PLA copolymer using the same. WO Brevetto 2009, 022797 A1.

Porro D, Gasser B, Fossati T, Maurer M, Branduardi P, Sauer M, Mattanovich D. Production of recombinant proteins and metabolites in yeasts. Applied microbiology and biotechnology, 2011; 89(4):939-948.

Rasal RM, Janorkar AV, Hirt DE. Poly (lactic acid) modifications. Progress in polymer science, 2010; 35(3):338-356.

Soares J, Demeke MM, Van de Velde M, Foulquie-Moreno MR, Kerstens D, Sels BF, Verplaetse A, Ribeiro Fernandes AA, Thevelein JM, Fernandes PMB. Fedbatch production of green coconut hydrolysates for high-gravity second-generation bioethanol fermentation with cellulosic yeast. Bioresource technology, 2017; 244: 234-242.

Spiekermann P, Rehm BH, Kalscheuer R, Baumeister D, Steinbüchel A. A sensitive, viable-colony staining method using Nile red for direct screening of bacteria that accumulate polyhydroxyalkanoic acids and other lipid storage compoundfiguis. Archives of microbiology, 1999; 171(2), 73-80.

Tsuji H, Auras R, Lim L-T, Selke SEM. Poly (lactic acid): synthesis, structures, properties, processing, and applications. Wiley, 2011.

Xiao L, Wang B, Yang G, Gauthier M. Poly (lactic acid)-based biomaterials: synthesis, modification and applications. In Biomedical science, engineering and technology. InTech, 2012.

Yang TH, Jung YK, Kang HO, Kim TW, Park SJ, Lee SY. Tailor-made type II Pseudomonas PHA synthases and their use for the biosynthesis of polylactic acid and its copolymer in recombinant Escherichia coli. Applied microbiology and biotechnology, 2011; 90(2):603-614.

Yang TH, Kim TW, Kang HO, Lee SH, Lee EJ, Lim SC, Oh SO, Song AJ, Park SJ, Lee SY. Biosynthesis of polylactic acid and its copolymers using evolved propionate CoA transferase and PHA synthase. Biotechnology and bioengineering, 2010; 105(1):150-160.

RIFERIMENTI SITOGRAFICI

www.european-bioplastics.org/market/

LISTA DELLE SEQUENZE

<110> Università degli Studi Milano-Bicocca

Galatea Biotech

<120> Procedimento per la biosintesi cellulare di acido poli D-lattico e di acido poli L-lattico

<130> 11309M

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 990

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 1

atgaaactcg ccgtttatag cacaaaacag tacgacaaga agtacctgca acaggtgaac 60

gagtcctttg gctttgagct ggaatttttt gactttctgc tgacggaaaa aaccgctaaa 120

actgccaatg gctgcgaagc ggtatgtatt ttcgtaaacg atgacggcag ccgcccggtg 180

ctggaagagc tgaaaaagca cggcgttaaa tatatcgccc tgcgctgtgc cggtttcaat 240

aacgtcgacc ttgacgcggc aaaagaactg gggctgaaag tagtccgtgt tccagcctat 300

gatccagagg ccgttgctga acacgccatc ggtatgatga tgacgctgaa ccgccgtatt 360 caccgcgcgt atcagcgtac ccgtgacgct aacttctctc tggaaggtct gaccggcttt 420

actatgtatg gcaaaacggc aggcgttatc ggtaccggta aaatcggtgt ggcgatgctg 480

cgcattctga aaggttttgg tatgcgtctg ctggcgttcg atccgtatcc aagtgcggcg 540

gcgctggaac tcggtgtgga gtatgtcgat ctgccaaccc tgttctctga atcagacgtt 600

atctctctgc actgcccgct gacaccggaa aactaccatc tgttgaacga agccgccttc 660

gatcagatga aaaatggcgt gatgatcgtc aataccagtc gcggtgcatt gattgattct 720

caggcggcaa ttgaagcgct gaaaaatcag aaaattggtt cgttgggtat ggacgtatat 780

gagaacgaac gcgatctgtt ctttgaagat aaatccaacg acgtaattca ggatgacgta 840

ttccgtcgcc tgtctgcctg ccacaacgtg ctgtttaccg ggcatcaggc attcctgaca 900

gcagaagctc tgaccagtat ttctcagact acgctgcaaa acttaagcaa tctggaaaaa 960

ggcgaaacct gcccgaacga actggtttaa 990

<210> 2

<211> 1575

<212> DNA

<213> Clostridium propionicum

<400> 2

atgagaaaag ttccgataat tactgctgac gaagctgcaa agttgatcaa agatggtgat 60 acagtaacca cttcgggttt tgtcggtaat gctattcctg aggcgttaga cagagccgtt 120 gaaaagagat tcttggaaac tggcgaacct aagaatatca cctatgtcta ttgtggtagc 180 caagggaaca gagatggaag gggtgcagaa cattttgccc atgaaggact actgaaaagg 240 tatattgcag gacattgggc tacagttcca gcgttgggga aaatggctat ggaaaacaaa 300 atggaagcgt ataatgtctc tcaaggcgcc ttatgtcact tgtttaggga tatagcgagt 360 cacaaacctg gcgtctttac taaagtgggt attggcactt tcatagaccc tagaaatggc 420 ggtggaaaag tgaacgatat tacgaaagaa gatattgttg agcttgttga aatcaaaggg 480 caagaatact tgttctatcc tgcctttccc atacatgttg ccttgataag aggtacatat 540 gctgatgaat cagggaacat aactttcgag aaagaagccg ctccgttgga aggaacatct 600 gtatgtcaag ctgtaaagaa tagtggaggt attgtagttg tccaggtaga aagagtggta 660 aaggcaggga cattggatcc acgtcacgtt aaggttccag gaatttacgt tgattacgtt 720 gttgtggcag atcctgagga tcaccaacag tcattagatt gcgagtatga tcccgcactt 780 tctggtgaac atcgtagacc agaagttgtt ggtgagccat tacctctttc cgccaagaaa 840 gtgataggca gaagaggtgc tattgagctt gagaaggacg tggctgtaaa cttaggtgta 900 ggtgctccgg aatatgtcgc atcagtcgct gacgaagaag gcattgtgga ttttatgacc 960 ttaactgcag aatctggcgc tattggaggc gttccagctg gtggagttag atttggtgca 1020 tcctataatg ccgatgcact aatcgatcaa ggataccagt ttgactacta tgatggtggt 1080

ggtttagact tatgctactt gggactggcc gagtgtgacg agaaaggtaa cattaatgtt 1140

tcgcgttttg gtcccaggat tgcaggatgt ggaggtttca ttaatataac tcagaatacg 1200

ccaaaagtgt tcttttgtgg cacattcact gcaggcggtt tgaaggtcaa aatcgaggac 1260

ggtaaagtca tcatcgtaca agaagggaag caaaagaaat ttcttaaggc tgtggaacag 1320

ataacattca atggcgacgt tgctttagcc aacaagcaac aagtaaccta cattacggaa 1380

agatgcgttt tcttactgaa ggaagatggt ctacatctat ccgaaattgc accaggtatt 1440

gacttgcaaa cccaaatact agatgtcatg gactttgctc caatcatcga tagagatgcg 1500

aatggtcaga tcaaactgat ggatgccgct ttgtttgcag aagggttaat gggtttgaaa 1560

gagatgaaaa gctaa 1575

<210> 3

<211> 1680

<212> DNA

<213> Pseudomonas resinovorans

<400> 3

atgtcaaaca agaacaacga agatttgcaa agacaagcaa gcgataacac cctgaatttg 60

aacccagtta ttggtataag aggcaaagac ctactgtcaa gcgctagaat ggtgctattg 120 caagctataa agcaaccctt tcattctgcc aaacatgttg cgcactttgg attggagtta 180 aagaatgtct tgttggggca atcgggactt caaccagaag cagatgatag aagatttaac 240 gatccagctt ggtcacaaaa tcccttgtat aagcgttatc tacagacata cttggcttgg 300 agaaaggaat tacattcttg gatagatgaa tctaacttgt cctcacaaga cgcatctaga 360 ggtcacttcg ttataaactt gatgaccgat gctatggcac ctaccaattc catggctaac 420 cctgcagccg tcaagagatt ctttgagact ggtgggaaat ccttactaga tggattaagt 480 catctggcca aagacatggt aaataatggt ggtatgcctt ctcaggtcaa tatggatgca 540 tttgaagttg gtcagaattt agcaactacc gagggagctg tagtgttcag aaacgatgtt 600 ttagagttga ttcaatacaa acccattacc gaatcagtgt atgaacgtcc gttacttgtt 660 gttccgcccc agattaacaa attttacgtg ttcgacttgt cacctgaaaa gtctttagcc 720 agattttgct tgaggagtaa tctgcaaaca ttcatcgtaa gttggagaaa tcctactaag 780 gctcagagag aatggggttt aagcacgtat attgaggcac taaaggaagc aattgacgtg 840 atattgaaaa tcacgggtgc aaaagatctg aatatcctag gtgcttgttc tggcggtatt 900 acgaccgtag cgttacttgg tcactatcag gctattggtg agacaaaagt caatgccttt 960 acacagatgg tcactgtctt agattttaac ttggatagtc aagtggccct atttgctgat 1020 gaacaaacgt tagaagctgc caaaaggaga tcataccaag ctggagtttt ggaagggaag 1080

gatatggcta aagttttcgc ttggatgagg cctaacgatc tgatttggaa ttattgggtt 1140

aacaattact tacttggcaa tgaaccacca gcatttgaca tcttgtattg gaataatgac 1200

actactaggt taccagcagc ctttcatggt gagttagttg agatgttcaa gactaacgct 1260

cttactagac caaatgctct tgaagtatgt ggcactccta tagacttgaa gcaagtaaca 1320

tcggatttct tttgtcttgc cggtacaaca gaccacatta ctccttggga agcctgttat 1380

cgtagcgcat tgctacttgg aggtaaatgc gagtttgtct tgtccaatgg aggccacatc 1440

aaatcgatct tgaatccacc agggaatcca aaagcaagat tctccacagg atccgaaatg 1500

cctaaagacc caaaagcgtg gttagaaaac gctaccaaac atgcggattc ttggtggctg 1560

cattggcaac aatggattgg cgaaagaagt ggtaaaacta agaaagcgag tttcacatta 1620

ggcaataagg cctttccagc gggtgaagct tctccgggta catacgttca tgaaaggtaa 1680

<210> 4

<211> 963

<212> DNA

<213> Lactobacillus plantarum

<400> 4

atgtcaagca tgccaaatca tcaaaaagtt gtgttagtcg gcgacggcgc tgttggttct 60 agttacgctt ttgccatggc acaacaagga attgctgaag aatttgtaat tgtcgatgtt 120 gttaaagatc ggacaaaggg tgacgccctt gatcttgaag acgcccaagc attcaccgct 180 cccaagaaga tttactcagg cgaatattca gattgtaagg acgctgactt agttgttatt 240 acagccggtg cgcctcaaaa gcctggtgaa tcacgtttag acttagttaa caagaattta 300 aatatcctat catccattgt caaaccagtt gttgactccg gctttgacgg catcttctta 360 gttgctgcta accctgttga catcttaact tacgctactt ggaaattctc aggtttccca 420 aaggatcgtg tcattggttc agggacttcc ttagactctt cacgtttacg cgttgcgtta 480 ggcaaacaat tcaatgttga tcctcgttcc gttgatgctt acatcatggg tgaacacggt 540 gattctgaat ttgctgctta ctcaactgca accatcggga cacgtccagt tcgcgatgtc 600 gctaaggaac aaggcgtttc tgacgaagat ttagccaagt tagaagatgg tgttcgtaac 660 aaagcttacg acatcatcaa cttgaagggt gccacgttct acggtatcgg gactgcttta 720 atgcggattt ccaaagccat tttacgtgat gaaaatgccg ttttaccagt aggtgcctac 780 atggacggcc aatacggctt aaacgacatt tatatcggga ctccggctgt gattggtgga 840 actggtttga aacaaatcat cgaatcacca ctttcagctg acgaactcaa gaagatgcaa 900 gattccgccg caactttgaa aaaagtgctt aacgacggtt tagctgaatt agaaaataaa 960 taa 963

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer FW ldha

<400> 5

cttagaattc atgaaactcg ccgtttatag cacaaaacag t 41

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer REV ldha

<400> 6

tgtactcgag ttaaaccagt tcgttcgggc aggtttc 37

<210> 7

<211> 667

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

tcattatcaa tactgccatt tcaaagaata cgtaaataat taatagtagt gattttccta 60

actttattta gtcaaaaaat tagcctttta attctgctgt aacccgtaca tgcccaaaat 120

agggggcggg ttacacagaa tatataacat cgtaggtgtc tgggtgaaca gtttattcct 180

ggcatccact aaatataatg gagcccgctt tttaagctgg catccagaaa aaaaaagaat 240

cccagcacca aaatattgtt ttcttcacca accatcagtt cataggtcca ttctcttagc 300

gcaactacag agaacagggg cacaaacagg caaaaaacgg gcacaacctc aatggagtga 360

tgcaacctgc ctggagtaaa tgatgacaca aggcaattga cccacgcatg tatctatctc 420

attttcttac accttctatt accttctgct ctctctgatt tggaaaaagc tgaaaaaaaa 480

ggttgaaacc agttccctga aattattccc ctacttgact aataagtata taaagacggt 540

aggtattgat tgtaattctg taaatctatt tcttaaactt cttaaattct acttttatag 600

ttagtctttt ttttagtttt aaaacaccaa gaacttagtt tcgaataaac acacataaac 660

aaacaaa 667

<210> 8

<211> 705

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

atccttttgt tgtttccggg tgtacaatat ggacttcctc ttttctggca accaaaccca 60 tacatcggga ttcctataat accttcgttg gtctccctaa catgtaggtg gcggagggga 120 gatatacaat agaacagata ccagacaaga cataatgggc taaacaagac tacaccaatt 180 acactgcctc attgatggtg gtacataacg aactaatact gtagccctag acttgatagc 240 catcatcata tcgaagtttc actacccttt ttccatttgc catctattga agtaataata 300 ggcgcatgca acttcttttc tttttttttc ttttctctct cccccgttgt tgtctcacca 360 tatccgcaat gacaaaaaaa tgatggaaga cactaaagga aaaaattaac gacaaagaca 420 gcaccaacag atgtcgttgt tccagagctg atgaggggta tctcgaagca cacgaaactt 480 tttccttcct tcattcacgc acactactct ctaatgagca acggtatacg gccttccttc 540 cagttacttg aatttgaaat aaaaaaaagt ttgctgtctt gctatcaagt ataaatagac 600 ctgcaattat taatcttttg tttcctcgtc attgttctcg ttccctttct tccttgtttc 660 tttttctgca caatatttca agctatacca agcatacaat caact 705

Claims (15)

1. RIVENDICAZIONI 1. Cellula in grado di produrre acido poli D-lattico (PDLA) e/o acido poli L-lattico (PLLA) attraverso i seguenti passaggi metabolici: (i) conversione di piruvato a D- e/o L-lattato ad opera dell’enzima D- e/o L-lattato deidrogenasi; (ii) sintesi di D- e/o L-lactoil-CoA tramite tioesterificazione del D- e/o L-lattato ad opera dell’enzima acil-CoA transferasi; (iii) polimerizzazione di molecole di D- e/o L-lactoil-CoA rispettivamente a PDLA e/o PLLA ad opera dell’enzima poliidrossialcanoato sintasi.
2. 2. Cellula secondo la rivendicazione 1, in cui l’enzima D- o L-lattato deidrogenasi è codificato da un gene eterologo.
3. 3. Cellula secondo la rivendicazione 2, in cui detto gene eterologo è scelto tra: (i) gene codificante l’enzima D-lattato deidrogenasi ldhA di E. coli, avente la sequenza nucleotidica SEQ ID NO:1; (ii) gene codificante l’enzima L-lattato deidrogenasi ldh1 di Lactobacillus plantarum, avente la sequenza nucleotidica SEQ ID NO:4.
4. 4. Cellula secondo la rivendicazione 1, in cui detta acil-CoA trasferasi è un enzima propionil-CoA transferasi codificato da un gene eterologo.
5. 5. Cellula secondo la rivendicazione 4, in cui detto gene eterologo codifica una forma mutata della propionil-CoA transferasi di Clostridium propionicum ed ha la sequenza nucleotidica SEQ ID NO:2.
6. 6. Cellula secondo la rivendicazione 1, in cui l’enzima poliidrossialcanoato sintasi è codificato da un gene eterologo.
7. 7. Cellula secondo la rivendicazione 6, in cui detto gene eterologo codifica una forma mutata dell’enzima poliidrossialcanoato sintasi C1 (PhaC1) di Pseudomonas resinovorans ed ha la sequenza nucleotidica SEQ ID NO:3.
8. 8. Cellula secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 7, che è una cellula eucariotica.
9. 9. Cellula secondo la rivendicazione 8, che è una cellula di fungo o di lievito.
10. 10. Cellula secondo la rivendicazione 9, in cui il lievito è Saccharomyces cerevisiae.
11. 11. Cellula secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 10, contenente inoltre uno o più geni responsabili della internalizzazione e/o del catabolismo degli zuccheri.
12. 12. Cellula secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 11 in cui sono parzialmente o completamente disattivati o eliminati i geni codificanti per l’enzima piruvato decarbossilasi e/o alcol deidrogenasi che conducono alla formazione di etanolo.
13. 13. Metodo per produrre acido poli D-lattico (PDLA) e/o acido poli L-lattico (PLLA) che comprende i seguenti passaggi: (i) coltura di una cellula secondo le rivendicazioni da 1 a 12 in un terreno di coltura comprendente una fonte di carbonio; (ii) recupero della massa cellulare contenente il polimero; ed opzionalmente (iii) estrazione di PDLA e/o PLLA dalle cellule.
14. 14. Metodo secondo la rivendicazione 13, in cui detta fonte di carbonio è scelta tra zuccheri monomerici esosi e/o pentosi, preferibilmente glucosio, fruttosio, galattosio, mannosio, xilosio, arabinosio, e disaccaridi, preferibilmente, il lattosio e il saccarosio.
15. 15. Uso di una cellula secondo le rivendicazioni da 1 a 12 per la preparazione di acido poli D-lattico (PDLA) e/o acido poli L-lattico (PLLA).