JP6249456B2 - 藍藻においてプラスチック原料を生産する方法 - Google Patents

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Description

本発明は、時計タンパク質遺伝子を過剰発現させた藍藻、およびこれを用いて有機酸、特にプラスチック原料となる有機酸を生産する方法に関する。
ポリヒドロキシブタン酸（ＰＨＢ）は、微生物が生産するバイオポリマーの一種であり、微生物により分解可能な熱可塑性樹脂として、医薬類、農薬類、医療材料、工業材料等の多方面での応用が期待される材料である。ＰＨＢは、ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）の一種でアセチルＣｏＡから三段階の反応で合成されるポリエステルである。ＰＨＡを微生物により生産させる方法は、これまでに種々開示されている。例えば、特許文献１にはＰＨＢの製造方法について開示されている。しかしながら、これらの何れの方法の場合も資化性炭素源として有機炭素源を必要とするという欠点があった。
そこで、有機炭素源の還元物質を必要とすることなく微生物から効率的にＰＨＡを生産させる方法が種々模索された。これまでに藍藻ＰＨＡに関する研究報告は数多くなされているが、局所的な酵素活性の増大は、ＰＨＡ量の増加につながらないことが明らかとなっている（非特許文献１）。ＰＨＡ量をより増加させるためには、炭素代謝を大きく改変し、ＰＨＡへの代謝フローを促進させる必要があるが、個々の代謝酵素改変では代謝全体の改変にはつながらないことも明らかとなっている。また、Ａｎａｂａｅｎａ属の藍藻において時計タンパク質遺伝子が糖異化を制御することが報告されているが、当該藍藻はＰＨＡ産生能がなく、ＰＨＡの生産に利用することは報告されていない（非特許文献２）。
有機酸の中でも特にコハク酸や乳酸はプラスチックの原料として知られ、環境および経済の観点から生物による生産系の確立が求められている。コハク酸は主に石油から合成されているが、近年、バイオベースで生産するベンチャー企業が国外に設立され、安価で環境に優しいコハク酸生産技術は、社会実装に直結する。従来法では、植物由来の糖質を用いて、従属栄養細菌の発酵によってコハク酸を生産している。一方で、植物由来の糖質は、食糧との競合や天候不順、価格高騰など、安定供給に問題がある。
特開平１−２２２７８８号公報
International Journal of Biological Macromolecules, 30, 2002, 97-104 The Journal of Biological Chemistry, vol. 286, 44, 2011, 38109-38114
本発明は、光合成微生物である藍藻を用いて、二酸化炭素を利用することにより、有機酸を効率的に生産する系を構築し、有機酸の生産量を増加させることを目的とする。
本発明者らは、藍藻において、時計タンパク質であるｋａｉＡＢＣ遺伝子を過剰発現させることにより、有機酸の生産量を増加させることに成功した。
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）時計タンパク質遺伝子が過剰発現している藍藻。
（２）時計タンパク質遺伝子がｋａｉＢ遺伝子またはｋａｉＣ遺伝子である、（１）記載の藍藻。
（３）藍藻が、ポリヒドロキシアルカン酸生産能を有する、（１）または（２）記載の藍藻。
（４）藍藻が、ｐｈａＡＢ遺伝子とｐｈａＥＣ遺伝子を有する、（１）〜（３）のいずれかに記載の藍藻。
（５）藍藻が、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属に属する、（１）〜（４）のいずれかに記載の藍藻。
（６）有機酸の生産方法であって、時計タンパク質遺伝子が過剰発現している藍藻を培養すること、および有機酸を採取することを含む、前記方法。
（７）有機酸がポリヒドロキシアルカン酸であり、藍藻がポリヒドロキシアルカン酸生産能を有し、時計タンパク質遺伝子がｋａｉＢ遺伝子またはｋａｉＣ遺伝子である、（６）記載の方法。
（８）藍藻が、ｐｈａＡＢ遺伝子とｐｈａＥＣ遺伝子を有する、（７）記載の方法。
（９）ポリヒドロキシアルカン酸が、ポリヒドロキシブタン酸である、（７）または（８）記載の方法。
（１０）有機酸がコハク酸または乳酸であり、時計タンパク質遺伝子がｋａｉＢ遺伝子またはｋａｉＣ遺伝子である、（６）記載の方法。
（１１）藍藻が、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属に属する、（６）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）培養を窒素欠乏条件で行う、（６）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）藍藻において有機酸生産能を増強する方法であって、藍藻において時計タンパク質遺伝子を過剰発現させることを含む、前記方法。
（１４）有機酸がポリヒドロキシアルカン酸であり、時計タンパク質遺伝子がｋａｉＢ遺伝子またはｋａｉＣ遺伝子であり、藍藻がｐｈａＡＢ遺伝子とｐｈａＥＣ遺伝子を有する、（１３）記載の方法。
（１５）ポリヒドロキシアルカン酸が、ポリヒドロキシブタン酸である、（１４）記載の方法。
（１６）有機酸がポリヒドロキシアルカン酸であり、時計タンパク質遺伝子がｋａｉＢ遺伝子またはｋａｉＣ遺伝子である、（１３）記載の方法。
（１７）藍藻が、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属に属する、（１３）〜（１６）のいずれかに記載の方法。
（１８）培養を窒素欠乏条件で行う、（１３）〜（１７）のいずれかに記載の方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2014-015560号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
本発明により、光合成微生物である藍藻を用いて、二酸化炭素を利用することにより、ポリヒドロキシアルカン酸、コハク酸および乳酸を含む有機酸を効率的に生産することが可能になる。
本発明は、藍藻において時計タンパク質遺伝子を過剰発現させることを特徴とする。
本発明で時計タンパク質とは、約２４時間周期で変動する生理現象である概日リズムを生み出すタンパク質をいう。また、時計タンパク質遺伝子とは、時計タンパク質をコードする遺伝子をいい、藍藻の場合、狭義にはｋａｉＡ、ｋａｉＢ、ｋａｉＣの３つの遺伝子およびその相同遺伝子を指す。ｋａｉＡ遺伝子は、ＫａｉＣのリン酸化に関与する。ｋａｉＢ遺伝子は、ＫａｉＣの脱リン酸化を促進する。ｋａｉＣ遺伝子は、自己リン酸化および脱リン酸化する活性があり、リン酸化反応が２４時間周期を刻むことが知られている。
ｐｈａＡ遺伝子は、アセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成するβ−ケトチオラーゼをコードする遺伝子をいう。ｐｈａＢ遺伝子は、アセトアセチルＣｏＡから３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを合成するアセトアセチルＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子をいう。ｐｈａＣ遺伝子は、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからＰＨＢを合成するＰＨＡ合成酵素のサブユニットをコードする遺伝子をいう。ｐｈａＥ遺伝子は、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからＰＨＢを合成するＰＨＡ合成酵素のサブユニットをコードする遺伝子をいう。
また、遺伝子を過剰発現させるとは、野生株に比較してｍＲＮＡ量が増えていることを意味し、好ましくは、野生株に比較して２倍以上、より好ましくは３倍以上、さらに好ましくは５倍以上になっていることをさす。
藍藻は、シアノバクテリア（藍色細菌）とも呼ばれる真正細菌の1群であり、光合成によって酸素を生み出すという特徴を有する。単細胞で浮遊するもの、少数細胞の集団を作るもの、糸状に細胞が並んだ構造を持つものなどがあり、特に制限されないが、単細胞のものが好ましい。
本発明の有機酸とは、生体内に含まれる化合物の中で、特にカルボン酸を含み、または酸性を示す化合物を指し、ポリヒドロキシアルカン酸、コハク酸、乳酸または酢酸が例示できる。
有機酸の生産量を増大させる観点からは、有機酸、好ましくはポリヒドロキシアルカン酸、コハク酸、乳酸または酢酸の生産能を有する藍藻を用いることが好ましい。
ポリヒドロキシアルカン酸の生産量を増大させる観点からは、ポリヒドロキシアルカン酸、好ましくはポリヒドロキシブタン酸の生産能を有する藍藻を用いることが好ましい。したがって、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子、例えばｐｈａＡＢ遺伝子およびｐｈａＥＣ遺伝子を有する藍藻を用いることが好ましい。ポリヒドロキシアルカン酸の生産能を有する藍藻には、遺伝子改変や突然変異誘導等によりポリヒドロキシアルカン酸の生産能が付与された藍藻も包含される。したがって、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子、例えばｐｈａＡＢ遺伝子およびｐｈａＥＣ遺伝子を有する藍藻には、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子が導入された藍藻も包含される。
コハク酸の生産量を増大させる観点からは、コハク酸の生産能を有する藍藻を用いることが好ましい。したがって、コハク酸合成酵素遺伝子、例えば乳酸脱水素酵素遺伝子（ｄｄｈ、ｌｄｈ）を有する藍藻を用いることが好ましい。ｌｄｈおよびｄｄｈは、乳酸とピルビン酸との相互変換を触媒する活性を有する酵素をコードする遺伝子をさす。コハク酸の生産能を有する藍藻には、遺伝子改変や突然変異誘導等によりコハク酸の生産能が付与された藍藻も包含される。したがって、コハク酸合成酵素遺伝子を有する藍藻には、コハク酸合成酵素遺伝子が導入された藍藻も包含される。
乳酸の生産量を増大させる観点からは、乳酸の生産能を有する藍藻を用いることが好ましい。したがって、乳酸合成酵素遺伝子、例えば乳酸脱水素酵素遺伝子（ｄｄｈ、ｌｄｈ）を有する藍藻を用いることが好ましい。乳酸の生産能を有する藍藻には、遺伝子改変や突然変異誘導等により乳酸の生産能が付与された藍藻も包含される。したがって、乳酸合成酵素遺伝子を有する藍藻には、乳酸合成酵素遺伝子が導入された藍藻も包含される。
酢酸の生産量を増大させる観点からは、酢酸の生産能を有する藍藻を用いることが好ましい。したがって、酢酸合成酵素遺伝子、例えばアセチルＣｏＡ合成酵素（ａｃｓ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、アルデヒド脱水素酵素、アシルホスファターゼ遺伝子を有する藍藻を用いることが好ましい。酢酸の生産能を有する藍藻には、遺伝子改変や突然変異誘導等により酢酸の生産能が付与された藍藻も包含される。したがって、酢酸合成酵素遺伝子を有する藍藻には、酢酸合成酵素遺伝子が導入された藍藻も包含される。
藍藻の具体例としては、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属藍藻、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ属藍藻、例えばＭｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ属藍藻、例えばＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ属藍藻、Ａｎａｂａｅｎａ属藍藻、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属藍藻、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属藍藻、例えばＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｓ、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ属藍藻、例えばＧｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｏｌａｃｅｕｓ、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ属藍藻、例えばＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ属藍藻、例えばＮｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ属藍藻、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｎ属藍藻、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ属藍藻などが挙げられる。
このうち、少なくともＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属藍藻、例えばＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ６８０３、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ属藍藻、例えばＭｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ属藍藻、例えばＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属藍藻、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ属藍藻、Ｎｏｓｔｏｃ属藍藻、例えばＮｏｓｔｏｃ ｍｕｓｃｏｒｕｍについては、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子の存在が明らかとなっている。
また、少なくともＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属藍藻、例えばＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ６８０３、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ属藍藻、例えばＭｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ属藍藻、例えばＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ属藍藻、Ａｎａｂａｅｎａ属藍藻、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属藍藻、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属藍藻、例えばＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｓ、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ属藍藻、例えばＧｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｏｌａｃｅｕｓ、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ属藍藻、例えばＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ属藍藻、例えばＮｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ属藍藻、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｎ属藍藻、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ属藍藻などについては、コハク酸合成酵素遺伝子の存在が明らかとなっている。
また、少なくともＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属藍藻、例えばＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ６８０３、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ属藍藻、例えばＭｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ属藍藻、例えばＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ属藍藻、Ａｎａｂａｅｎａ属藍藻、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属藍藻、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属藍藻、例えばＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｓ、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ属藍藻、例えばＧｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｏｌａｃｅｕｓ、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ属藍藻、例えばＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ属藍藻、例えばＮｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ属藍藻、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｎ属藍藻、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ属藍藻などについては、乳酸合成酵素遺伝子の存在が明らかとなっている。
また、少なくともＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属藍藻、例えばＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ６８０３、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ属藍藻、例えばＭｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ属藍藻、例えばＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ属藍藻、Ａｎａｂａｅｎａ属藍藻、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属藍藻、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属藍藻、例えばＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｓ、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ属藍藻、例えばＧｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｏｌａｃｅｕｓ、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ属藍藻、例えばＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ属藍藻、例えばＮｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ属藍藻、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｎ属藍藻、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ属藍藻などについては、酢酸合成酵素遺伝子の存在が明らかとなっている。
藍藻では、時計遺伝子クラスターｋａｉＡＢＣが生物時計の遺伝子として知られている。時計遺伝子クラスターｋａｉＡＢＣは２つのオペロンｋａｉＡおよびｋａｉＢＣより構成されている。ｋａｉＢＣオペロンの発現は、時計タンパク質ＫａｉＡにより促進され、もう一つの時計タンパク質ＫａｉＣにより抑制される。これが、藍藻の生物時計におけるフィードバック制御であると考えられている。また、ＫａｉＣはリン酸化されることが知られており、このＫａｉＣのリン酸化はＫａｉＡによって促進されることが判明している。
藍藻由来時計タンパク質遺伝子であるｋａｉＡ遺伝子の具体例として、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ６８０３由来のｋａｉＡ遺伝子の塩基配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に示す。藍藻由来時計タンパク質ｋａｉＢ遺伝子の具体例として、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ６８０３由来のｋａｉＢ１遺伝子の塩基配列を配列番号３に、アミノ酸配列を配列番号４に、ｋａｉＢ２遺伝子の塩基配列を配列番号５に、アミノ酸配列を配列番号６に、ｋａｉＢ３遺伝子の塩基配列を配列番号７に、アミノ酸配列を配列番号８に示す。藍藻由来時計タンパク質ｋａｉＣ遺伝子の具体例として、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ６８０３由来のｋａｉＣ１遺伝子の塩基配列を配列番号９に、アミノ酸配列を配列番号１０に、ｋａｉＣ２遺伝子の塩基配列を配列番号１１に、アミノ酸配列を配列番号１２に、ｋａｉＣ３遺伝子の塩基配列を配列番号１３に、アミノ酸配列を配列番号１４に示す。
上記のｋａｉＡ遺伝子、ｋａｉＢ１遺伝子、ｋａｉＢ２遺伝子、ｋａｉＢ３遺伝子、ｋａｉＣ１遺伝子、ｋａｉＣ２遺伝子およびｋａｉＣ３遺伝子には、それぞれ配列番号１、３、５、７、９、１１および１３の塩基配列からなる遺伝子と機能的に同等の遺伝子も包含される。配列番号１、３、５、７、９、１１または１３の塩基配列からなる遺伝子と機能的に同等の遺伝子としては、それぞれ配列番号１、３、５、７、９、１１または１３の塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性または同一性を有する塩基配列からなり、それぞれ時計タンパク質の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。また、本発明においてｋａｉＡ遺伝子、ｋａｉＢ１遺伝子、ｋａｉＢ２遺伝子、ｋａｉＢ３遺伝子、ｋａｉＣ１遺伝子、ｋａｉＣ２遺伝子およびｋａｉＣ３遺伝子には、そのホモログやオルソログも包含される。
時計タンパク質ＫａｉＡ、ＫａｉＢ１、ＫａｉＢ２、ＫａｉＢ３、ＫａｉＣ１、ＫａｉＣ２およびｋａｉＣ３には、それぞれ配列番号２、４、６、８、１０、１２および１４のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等のタンパク質も包含される。配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等のタンパク質としては、それぞれ配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４のアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列からなり、時計タンパク質の活性を有するタンパク質が挙げられる。また、配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、時計タンパク質の活性を有するタンパク質も包含される。欠失、置換、挿入または付加されるアミノ酸の数は、通常２〜１０個、好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個である。
本明細書においては、ｋａｉＡ遺伝子、ｋａｉＢ１遺伝子、ｋａｉＢ２遺伝子、ｋａｉＢ３遺伝子、ｋａｉＣ１遺伝子、ｋａｉＣ２遺伝子およびｋａｉＣ３遺伝子をまとめてｋａｉＡＢＣ遺伝子と称し、ＫａｉＡ、ＫａｉＢ１、ＫａｉＢ２、ＫａｉＢ３、ＫａｉＣ１、ＫａｉＣ２およびｋａｉＣ３をまとめてＫａｉＡＢＣと称する場合がある。
ｋａｉＡＢＣ遺伝子をはじめ、目的遺伝子の塩基配列は公共のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ）より検索可能であり、例えば上記藍藻に由来するｋａｉＡＢＣ遺伝子のうち、配列が未知の藍藻に由来するｋａｉＡＢＣ遺伝子は、配列が既知の藍藻に由来するｋａｉＡＢＣ遺伝子の情報を利用し、クローニングにより取得することができる。所望の遺伝子をクローニングにより取得する方法は、分子生物学の分野において周知である。例えば、遺伝子配列が既知の場合、制限エンドヌクレアーゼ消化により適したゲノムライブラリを作り、所望の遺伝子配列に相補的なプローブを用いてスクリーニングすることができる。配列が単離されたら、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような標準的増幅法を用いてＤＮＡを増幅し、形質転換（遺伝子導入）に適した量のＤＮＡを得ることができる。遺伝子のクローニングに用いるゲノムライブラリの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断および連結、形質転換等の方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第３版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載されている。
公知のｋａｉＡ遺伝子のＳｅｑｕｅｎｃｅＩＤの例を以下に示す：ｓｌｒ０７５６、ｃｃｅ＿０４２４、ＰＣＣ８８０１＿４２３３、ＭＡＥ３１７３０、ＰＣＣ７４２４＿０６０１、ＳＹＮＰＣＣ７００２＿Ａ０２８９、Ｃｙａｎ７４２５＿０３４６、ＡＭ１＿０９９４、ｔｌｒ０４８１、ＮＩＥＳ３９＿Ｌ０１２３０、Ｓｙｎｐｃｃ７９４２＿１２１８、ｓｙｃ０３３２＿ｄ、ＣＹＢ＿０４９０、ＣＹＡ＿１９０２、ｓｙｎｃ＿２２２２、ＳｙｎＲＣＣ３０７＿１８２６、ＳＹＮＷ０５４８、Ｓｙｎｃｃ９９０２＿０５４７、ＳｙｎＷＨ７８０３＿１９６６。
公知のｋａｉＢ１遺伝子のＳｅｑｕｅｎｃｅＩＤの例を以下に示す：ｓｌｒ０７５７、ＭＡＥ３１７４０、ＰＣＣ７４２４＿０６００、ＰＣＣ８８０１＿４２３２、ｃｃｅ＿０４２３、Ｔｅｒｙ＿３８０４、Ａｖａ＿１０１７、ａｌｒ２８８５、ＮＩＥＳ３９＿Ｌ０１２２０、Ｃｙａｎ７４２５＿０３４７、ｔｌｒ０４８２、Ｎｐｕｎ＿Ｒ２８８７、ＡＭ１＿０９９３、Ｐ９３０３＿０５４３１、ＳｙｎＷＨ７８０３＿１９６５、Ｓｙｎｃｃ９６０５＿２１２５、Ｓｙｎｃｃ９９０２＿０５４８、ＳＹＮＷ０５４９、ＰＭＴ１４１９、ｓｙｎｃ＿２２２１。
公知のｋａｉＢ２遺伝子のＳｅｑｕｅｎｃｅＩＤの例を以下に示す：ｓｌｌ１５９６、ＲＰＡ０００８、ＭＡＥ３１７４０、ｓｌｌ０４８６、ＭＡＥ４２９６０、ＰＣＣ７４２４＿３００５、ｃｃｅ＿０４２３、ＰＣＣ７４２４＿０６００、ＰＣＣ８８０１＿４２３２、Ｐ９５１５＿１５０４１、ＣＹＡ＿１９０１、ＣＹＢ＿０４８９、Ｔｅｒｙ＿３８０４、Ｐ９３０１＿１５２９１、ＰＭＭ１３４３、Ｐ９２１５＿１５７２１、ＮＩＥＳ３９＿Ｌ０１２２０、Ａｖａ＿１０１７、ａｌｒ２８８５、ｓｌｒ０７５７。
公知のｋａｉＢ３遺伝子のＳｅｑｕｅｎｃｅＩＤの例を以下に示す：ｓｌｌ０４８６、ｃｃｅ＿４７１５、ＰＣＣ８８０１＿３９３３、ＰＣＣ７４２４＿３００５、ＭＡＥ４２９６０、ｓｌｌ１５９６、Ｐｒｏ１４２４、ＣＹＡ＿１９０１、ＣＹＢ＿０４８９、ｔｌｒ０４８２、ＭＡＥ３１７４０、Ｐ９５１５＿１５０４１、ＰＭＭ１３４３、ＰＭＴ９３１２＿１４４１、Ｐ９２１１＿１３９７１、ｃｃｅ＿０４２３、ＳｙｎＲＣＣ３０７＿１８２５、ＰＣＣ７４２４＿０６００、ＰＣＣ８８０１＿４２３２、Ｐ９２１５＿１５７２１。
公知のｋａｉＣ１遺伝子のＳｅｑｕｅｎｃｅＩＤの例を以下に示す：ｓｌｒ０７５８、ＰＣＣ８８０１＿４２３１、ＰＣＣ７４２４＿０５９９、ｃｃｅ＿０４２２、ＭＡＥ３１７５０、ＳＹＮＰＣＣ７００２＿Ａ０２８７、Ａｖａ＿１０１６、ａｌｒ２８８６、Ｔｅｒｙ＿３８０５、Ｎｐｕｎ＿Ｒ２８８６、Ｃｙａｎ７４２５＿０３４８、ＡＭ１＿０９９２、ｔｌｒ０４８３、ｓｙｃ０３３４＿ｄ、Ｓｙｎｐｃｃ７９４２＿１２１６、ＮＩＥＳ３９＿Ｌ０１２１０、ＣＹＢ＿０４８８、ＣＹＡ＿１９００、ＳｙｎＲＣＣ３０７＿１８２４、Ｓｙｎｃｃ９９０２＿０５４９。
公知のｋａｉＣ２遺伝子のＳｅｑｕｅｎｃｅＩＤの例を以下に示す：ｓｌｌ１５９５、ＲＰＡ０００９、ＣＹＢ＿０４８８、ＣＹＡ＿１９００、ｔｌｒ０４８３、ＡＭ１＿０９９２、ｓｙｃ０３３４＿ｄ、Ｓｙｎｐｃｃ７９４２＿１２１６、Ｐ９２１１＿１３９６１、Ｓｙｎｃｃ９６０５＿２１２４、ＭＡＥ３１７５０、ＳｙｎＷＨ７８０３＿１９６４、ＳｙｎＲＣＣ３０７＿１８２４、Ｐ９３０３＿０５４４１、ｓｙｎｃ＿２２２０、ＰＭＴ１４１８、ＮＡＴＬ１＿１７６９１、Ｐ９２１５＿１５７１１、ＳＹＮＷ０５５０、Ｐｒｏ１４２３。
公知のｋａｉＣ３遺伝子のＳｅｑｕｅｎｃｅＩＤの例を以下に示す：ｓｌｒ１９４２、ＰＣＣ７４２４＿３００６、ＰＣＣ８８０１＿３９３４、ＭＡＥ３９１３０、ｃｃｅ＿４７１６、Ｔｅｒｙ＿３８０５、Ｃｙａｎ７４２５＿０３４８、ｔｌｒ０４８３、ｓｙｃ０３３４＿ｄ、Ｓｙｎｐｃｃ７９４２＿１２１６、ＡＭ１＿０９９２、ＣＹＡ＿１９００、ＰＣＣ８８０１＿４２３１、ＳＹＮＰＣＣ７００２＿Ａ０２８７、ｓｌｒ０７５８、ａｌｒ２８８６、ＣＹＢ＿０４８８、Ａｖａ＿１０１６、ＭＡＥ３１７５０、ＰＣＣ７４２４＿０５９９。
藍藻において時計タンパク質遺伝子を過剰発現させる方法としては、例えば時計タンパク質遺伝子が過剰発現するような変異を加える方法が挙げられ、当技術分野で公知の方法で実施することができ、特に制限されない。時計タンパク質遺伝子を過剰発現させる方法の具体例としては、時計タンパク質遺伝子を導入する方法、時計タンパク質遺伝子のプロモーターを当該遺伝子を過剰発現させるようなプロモーターと交換する方法、突然変異誘導による方法などが挙げられる。本発明において時計タンパク質遺伝子には、ｋａｉＡ遺伝子、ｋａｉＢ１遺伝子、ｋａｉＢ２遺伝子、ｋａｉＢ３遺伝子、ｋａｉＣ１遺伝子、ｋａｉＣ２遺伝子およびｋａｉＣ３遺伝子、ならびにｋａｉＡＢＣオペロンが包含される。時計タンパク質遺伝子を過剰発現させることには、ｋａｉＡ遺伝子、ｋａｉＢ１遺伝子、ｋａｉＢ２遺伝子、ｋａｉＢ３遺伝子、ｋａｉＣ１遺伝子、ｋａｉＣ２遺伝子およびｋａｉＣ３遺伝子のいずれか１つまたは複数（２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたは７つ）を過剰発現させることが包含される。
遺伝子導入は、時計タンパク質遺伝子またはその一部を適当なベクターに連結し、得られた組換えベクターを時計タンパク質遺伝子が発現し得るように宿主である藍藻中に導入することにより、または相同組換えによってゲノム上の任意の位置に時計タンパク質遺伝子またはその一部を挿入することにより実施できる。「一部」とは、宿主中に導入された場合に時計タンパク質遺伝子がコードするタンパク質を発現することができる時計タンパク質遺伝子の一部分を指す。導入する時計タンパク質遺伝子は、宿主である藍藻とは別の属や種に由来するものでもよいが、宿主である藍藻と同一の属や種に由来する遺伝子が好ましい。プロモーターの交換は、例えば、相同組換えによってゲノム上の時計タンパク質遺伝子プロモーターを目的のプロモーターと交換することにより実施できる。突然変異誘導による方法は、親株を紫外線照射、または変異誘発剤（例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸など）で処理した後、ポリヒドロキシアルカン酸を高生産する株を選抜することにより実施できる。
遺伝子導入のために遺伝子を連結するベクターとしては、宿主細胞で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド、ファージおよびコスミド等が挙げられる。染色体遺伝子との相同組換えによる遺伝子導入では、プラスミドを用いることなく、ＰＣＲ等によって、遺伝子配列の両末端相同組換え部位の遺伝子配列と時計タンパク質遺伝子配列を含む線状の遺伝子配列を合成したものを用いることができる。本線状遺伝子は配列の両末端に宿主ゲノム上の遺伝子と相同配列を有し、本相同配列を介して宿主染色体中へ導入される。
上記ベクターにおいては、挿入した時計タンパク質遺伝子が確実に発現されるようにするため、該遺伝子の上流に適当なプロモーターを連結することができる。使用するプロモーターは、二酸化炭素を炭素源とする培養において窒素欠乏条件で時計タンパク質を発現させるプロモーターであれば制限されず、宿主に応じて当業者が適宜選択すればよい。光合成系ＩＩ反応中心タンパク質をコードする遺伝子のプロモーター、例えばｐｓｂＡＩＩのプロモーター、色素タンパク質フィコシアニンをコードする遺伝子ｃｐｃＡのプロモーター、炭素同化酵素ルビスコサブユニットをコードする遺伝子ｒｂｃＬのプロモーターなどが挙げられる。また、構成的プロモーターを用いてもよい。構成的プロモーターは、宿主細胞内外の刺激と関係なく一定のレベルで構造遺伝子を発現させるプロモーターをいう。構成的プロモーターの例としては、人工合成プロモーターｔｒｃ、などが挙げられるが、これらに限定されない。
ベクターには、プロモーターおよび目的の遺伝子に加えて、所望により選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などが連結されていてもよい。また、導入する遺伝子配列は、選択マーカーを含んでいてもよい。選択マーカーの例としては、カナマイシン、スペクチノマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシンなどの薬剤耐性マーカーが挙げられるがこれに限定されない。
遺伝子を連結させるには、公知のＤＮＡリガーゼを用いる。好ましくは市販のライゲーションキット、例えばＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡）やＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて、規定の条件にてライゲーション反応を行うことにより組換えベクターを得ることができる。また、これらのベクターを、必要であればボイル法、アルカリＳＤＳ法、磁性ビーズ法およびそれらの原理を使用した市販されているキット等により精製し、さらにエタノール沈殿法、ポリエチレングリコール沈殿法などの濃縮手段により濃縮することができる。
遺伝子の導入は、藍藻とベクターまたはＤＮＡ断片とを接触させることにより実施できるが（自然形質転換）、接合法、エレクトロポレーション法等を用いてもよい。
相同組換えによってゲノム上の任意の位置に目的の遺伝子を挿入する方法は、ゲノム上の配列と相同な配列に目的遺伝子をプロモーターとともに挿入し、このＤＮＡ断片を細胞内に導入して相同組換えを起こさせることにより実施できる。ゲノムへの導入の際には目的遺伝子と選択マーカー遺伝子を連結したＤＮＡ断片を用いると容易に相同組換えが起こった株を選抜することができる。また、薬剤耐性遺伝子と特定の条件下で致死的になる遺伝子を連結した遺伝子をゲノム上に上記の方法で相同組換えによって挿入し、その後、薬剤耐性遺伝子と特定の条件下で致死的になる遺伝子を置き換える形で目的遺伝子を相同組換えを利用して導入することもできる。
上記で得られた時計タンパク質遺伝子が過剰発現している藍藻（例えば、形質転換藍藻および藍藻変異体）を、好ましくは窒素欠乏条件で培養することにより、有機酸、好ましくはポリヒドロキシアルカン酸、コハク酸、乳酸または酢酸を生産することができる。藍藻が光エネルギーと二酸化炭素を利用して光合成を行う場合には、二酸化炭素を炭素源として培養することができる。
ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）は、ある種の微生物がその体内に蓄積することが知られているポリエステルであり、以下の化学式：
Figure 0006249456
 [式中、Ｒは同一でも異なっていてもよく、炭素数１〜１４の直鎖または分岐鎖アルキル基であり、ｎは２以上の整数であり、好ましくは１００以上の整数であり、好ましくは１０００００以下の整数である]で表すことができる。
ＰＨＡは自然環境中で分解されることから生分解性プラスチックや生体適合性材料への応用が期待されている。ＰＨＡの具体例として、例えば、以下の化学式で表されるものが挙げられる。
Figure 0006249456
ＰＨＡのうち、ポリヒドロキシブタン酸（ＰＨＢおよびＰ（３ＨＢ）とも表される）は、微生物が生産するバイオポリマーとして知られ、微生物により分解可能な熱可塑性樹脂として、医薬類、農薬類、医療材料、工業材料等の多方面での応用が期待される材料である。ポリヒドロキシブタン酸（ＰＨＢ）は、アセチルＣｏＡから三段階の反応で合成されるポリエステルである。また、コハク酸や乳酸はプラスチックの原料として知られている。
ポリヒドロキシブタン酸生産能を有する藍藻としては、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属藍藻、例えば、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ６８０３、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属藍藻、例えばＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ＭＡ１９、Ｎｏｓｔｏｃ属藍藻、例えばＮｏｓｔｏｃ ｍｕｓｃｏｒｕｍなどが挙げられる。
コハク酸生産能を有する藍藻としては、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属藍藻、例えば、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ６８０３、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ属藍藻、例えばＭｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ属藍藻、例えばＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ属藍藻、Ａｎａｂａｅｎａ属藍藻、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属藍藻、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属藍藻、例えばＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｓ、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ属藍藻、例えばＧｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｏｌａｃｅｕｓ、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ属藍藻、例えばＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ属藍藻、例えばＮｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ属藍藻、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｎ属藍藻、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ属などが挙げられる。
乳酸生産能を有する藍藻としては、少なくともＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属藍藻、例えばＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ６８０３、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ属藍藻、例えばＭｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ属藍藻、例えばＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ属藍藻、Ａｎａｂａｅｎａ属藍藻、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属藍藻、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属藍藻、例えばＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｓ、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ属藍藻、例えばＧｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｏｌａｃｅｕｓ、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ属藍藻、例えばＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ属藍藻、例えばＮｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ属藍藻、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｎ属藍藻、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ属藍藻などが挙げられる。
酢酸生産能を有する藍藻としては、少なくともＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属藍藻、例えばＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ６８０３、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ属藍藻、例えばＭｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ属藍藻、例えばＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ属藍藻、Ａｎａｂａｅｎａ属藍藻、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属藍藻、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属藍藻、例えばＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｓ、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ属藍藻、例えばＧｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｏｌａｃｅｕｓ、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ属藍藻、例えばＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ属藍藻、例えばＮｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ属藍藻、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｎ属藍藻、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ属藍藻などが挙げられる。
本発明の藍藻の培養方法は、特に制限されないが、好ましくは二酸化炭素を炭素源として、窒素欠乏条件で培養する。好気条件下では空気に二酸化炭素を混合することで二酸化炭素濃度を高めることができ、０．０１〜１０％に調整することが好ましい。培養に用いる培地は、当業者であれば適宜好適なものを選択できるが、例えば、ＢＧ−１１培地、ＭＤＭ培地、ＡＯ培地、ＡＴＣＣ培地、ＣＲＢＩＰ培地、ＳＰ培地などを利用できる。一般に培養温度は２０〜６０℃、好ましくは２５〜５５℃であり、培養液のｐＨは６〜１２、好ましくは７〜１０である。培養時間は４〜１６８時間、好ましくは８〜４８時間である。
有機酸としてポリヒドロキシアルカン酸を生産する場合は、好ましくはｋａｉＢ遺伝子またはｋａｉＣ遺伝子が過剰発現している藍藻を培養することが好ましい。ｋａｉＢ遺伝子またはｋａｉＣ遺伝子が過剰発現している藍藻には、ｋａｉＢ遺伝子のみが過剰発現している藍藻、ｋａｉＣ遺伝子のみが過剰発現している藍藻、ｋａｉＢ遺伝子およびｋａｉＣ遺伝子が過剰発現している藍藻が包含される。特に、ｋａｉＢ３遺伝子が過剰発現している藍藻およびｋａｉＣ３遺伝子が過剰発現している藍藻を培養することが好ましい。これら藍藻を、上記ＢＧ−１１培地のような培地で、光照射下、通気条件（明好気条件）で培養する。光強度は２０〜１５０マイクロモルフォトン（１平方メートル、１秒あたり）が好ましい。光照射下で培養を行い、その後光遮断下での培養に切り替え（明暗条件）て培養することも可能である。菌体内のＰＨＡ蓄積率を上げるためには、窒素欠乏条件、例えば分離した藍藻菌体を窒素源を制限した培養液、例えば、ＢＧ−１１培地から硝酸ナトリウムを除いた培地にて培養を行うことが好ましい。このようにして藍藻菌体にＰＨＡを生成蓄積させ、このＰＨＡを培養物から採取する。
有機酸としてコハク酸を生産する場合は、好ましくはｋａｉＢ遺伝子またはｋａｉＣ遺伝子が過剰発現している藍藻を培養することが好ましい。特に、ｋａｉＢ３遺伝子が過剰発現している藍藻およびｋａｉＣ３遺伝子が過剰発現している藍藻を培養することが好ましい。これら藍藻を、上記ＢＧ−１１培地のような培地で、明好気条件で培養した後、光を遮断し、例えば窒素ガスでの空気の置換により酸素が実質的に存在しない条件（暗嫌気条件）にすることで、細胞外にコハク酸を放出させ、このコハク酸を培養物から採取する。コハク酸が細胞外に放出されることから、その精製を低コストで実施できる。酸素が実質的に存在しない条件とは、酸素濃度が、例えば１％以下、好ましくは０．５％以下、より好ましくは０．２％以下の条件をいう。
有機酸として乳酸を生産する場合は、好ましくはｋａｉＢ遺伝子またはｋａｉＣ遺伝子が過剰発現している藍藻を培養することが好ましい。特に、ｋａｉＢ１遺伝子が過剰発現している藍藻、ｋａｉＢ２遺伝子が過剰発現している藍藻、ｋａｉＢ３遺伝子が過剰発現している藍藻、ｋａｉＣ１遺伝子が過剰発現している藍藻、ｋａｉＣ２遺伝子が過剰発現している藍藻、およびｋａｉＣ３遺伝子が過剰発現している藍藻を培養することが好ましい。これら藍藻を、上記ＢＧ−１１培地のような培地で、明好気条件で培養した後、暗嫌気条件にすることで、細胞外に乳酸を放出させ、この乳酸を培養物から採取する。乳酸が細胞外に放出されることから、その精製を低コストで実施できる。
有機酸として酢酸を生産する場合は、好ましくはｋａｉＢ遺伝子またはｋａｉＣ遺伝子が過剰発現している藍藻を培養することが好ましい。特に、ｋａｉＢ２遺伝子が過剰発現している藍藻、ｋａｉＢ３遺伝子が過剰発現している藍藻、ｋａｉＣ１遺伝子が過剰発現している藍藻、ｋａｉＣ２遺伝子が過剰発現している藍藻、およびｋａｉＣ３遺伝子が過剰発現している藍藻を培養することが好ましい。これら藍藻を、上記ＢＧ−１１培地のような培地で、明好気条件で培養した後、暗嫌気条件にすることで、細胞外に乳酸を放出させ、この酢酸を培養物から採取する。酢酸が細胞外に放出されることから、その精製を低コストで実施できる。
「培養物」は、例えば、培養した藍藻を含む培養液の他に、培養液の上清、培養細胞若しくは培養菌体、または、培養細胞若しくは培養菌体の破砕物等を包含する。有機酸が、例えば、菌体内または細胞内に生産される場合、培養後、菌体または細胞を破砕することにより単離できる。また、有機酸が、例えば、菌体外または細胞外に生産される場合、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により培養液から菌体または細胞を除去することで単離できる。その後、当技術分野で通常用いられる方法を、単独で、または、適宜組み合わせることによって、培養物から有機酸を精製することもできる。精製方法としては、特に制限されず、例えば、有機酸が可溶である有機溶剤に有機酸を溶解させて抽出する方法や、有機酸以外の菌体構成成分を可溶化等させて取り除くことにより有機酸を得る方法などが挙げられる。抽出溶媒としては、メタノール、エタノールなどのアルコール類、ヘキサン、アセトン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素などが挙げられる。例えば、有機酸を培養物から採取する方法として、Ｇ．Ｂｒａｕｎｅｇｇらの方法（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，２９−３７（１９７８））や、Ｍ．Ｋａｔｏらの方法（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４５：３６３−３７０（１９９６））を使用することができる。
本発明により得られる藍藻の培養液１ＬあたりのＰＨＡ生産量は、好ましくは時計タンパク質過剰発現株では野生株の１．４〜２．０倍である。本発明により得られる藍藻の培養液１Ｌあたりのコハク酸生産量は、好ましくは時計タンパク質過剰発現株では野生株の１．２〜２．０倍である。本発明により得られる藍藻の培養液１Ｌあたりの乳酸生産量は、好ましくは時計タンパク質過剰発現株では野生株の１．２〜２．０倍である。本発明により得られる藍藻の培養液１Ｌあたりの酢酸生産量は、好ましくは時計タンパク質過剰発現株では野生株の１．２〜２．０倍である。
したがって、本発明により有機酸、特にＰＨＡ、コハク酸、乳酸および酢酸を効率的に生産することが可能になる。
以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）時計タンパク質遺伝子過剰発現株の構築
単細胞性シアノバクテリア（単細胞性藍藻）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ ６８０３（以下Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）細胞を用いて、７つの時計タンパク質遺伝子（ｋａｉＡ、ｋａｉＢ１、ｋａｉＢ２、ｋａｉＢ３、ｋａｉＣ１、ｋａｉＣ２、ｋａｉＣ３）を過剰発現する株を構築した。Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ ６８０３は、パスツール研究所（フランス）から入手可能である（http://www.pasteur.fr/ip/easysite/pasteur/en/research/collections/crbip/general-informations-concerning-the-collections/iv-the-open-collections/iv-iii-pasteur-culture-collection-of-cyanobacteria）。
具体的には、遺伝子のＯＲＦに光合成系ＩＩ反応中心タンパク質をコードするｐｓｂＡＩＩのプロモーターを付加し、ゲノム上の影響の少ない領域へ導入した。ベクターとして、ｐＴＫＰ２０３１Ｖを用いた（Ｏｓａｎａｉ ｅｔ ａｌ．２０１１ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８６；３０９６２−３０９７１）。具体的には、時計タンパク質過剰発現株を、以下のとおり作製した。
時計タンパク質ｋａｉＡ、ｋａｉＢ１、ｋａｉＢ２、ｋａｉＢ３、ｋａｉＣ１、ｋａｉＣ２、ｋａｉＣ３の各ＯＲＦ領域を、ＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓのゲノムＤＮＡを鋳型に、ＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡）とプライマー（下記表１参照）を用いてＰＣＲで増幅した。得られた断片の末端をＮｄｅＩとＨｐａＩ（タカラバイオ）で切断し、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ用のベクターｐＴＫＰ２０３１ＶのＮｄｅＩ−ＨｐａＩ領域に導入した。ライゲーションには、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いた。完成したプラスミドの配列は、シークエンスで確認した。
Figure 0006249456
Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓの形質転換は次の通りに行った。Ａ７３０＝２〜３の濃度のＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓの野生株（ＧＴ株）の培養液２００μｌに、ｐＴＫＰ２０３１Ｖ−ｈｉｋ８を約１００ｎｇ加え、ＢＧ−１１プレート上の混合セルロースメンブレン（メルクミリポア）に塗布した。シアノバクテリア用インキュベータ内で１日培養した後、メンブレンを５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含んだＢＧ−１１プレートに移し、約３週間培養した。得られたコロニーを、同濃度のカナマイシンを含んだＢＧ−１１プレートで３回植継ぎ、それぞれの過剰発現株を確立した。ＢＧ−１１培地組成は以下のとおりである。
Figure 0006249456
以下、ＢＧ−１１液体培地では、１７．６５ｍＭ ＮａＮＯ３を除き、３ｍＭ ＮＨ４Ｃｌを窒素源とした。アンモニア源を使い切らせるか、窒素源を除いた培地にフィルターで回収した細胞を再懸濁することにより、窒素欠乏条件とした。
得られた各時計タンパク質過剰発現株と親株（ＧＴ）について、各時計タンパク質のｍＲＮＡ量をリアルタイムＰＣＲにより測定した。各時計タンパク質過剰発現株では、親株に比べて、各時計タンパク質のｍＲＮＡ量が増加していた。
（実施例２）ポリヒドロキシブタン酸（ＰＨＢ）生産量の測定
実施例１で作製した各時計タンパク質過剰発現株（ｋａｉＡｏｘ、ｋａｉＢ１ｏｘ、ｋａｉＢ２ｏｘ、ｋａｉＢ３ｏｘ、ｋａｉＣ１ｏｘ、ｋａｉＣ２ｏｘ、ｋａｉＣ３ｏｘ）および野生株（ＧＴ）について、ポリヒドロキシブタン酸（ＰＨＢ）の細胞内蓄積量を測定した。
本実施例では、窒素源のない培地（ＢＧ−１１０）に３ｍＭ塩化アンモニウムを初期窒素源として加え、これを使い切らせることにより窒素欠乏状態にした。培養は全て、好気・明条件、３０℃で行った。光強度は５０〜８０マイクロモルフォトン／ｍ２ｓとした。また、好気培養では、１％ＣＯ２を混合した空気を培養液中に導入した。９日間培養した後、細胞を遠心分離により回収した。回収した細胞を、−８０℃で３日間凍結乾燥し、その後クロロホルムに懸濁し、４日間７０℃のインキュベートと約５分間の超音波破砕を計８回行った。この破砕液を濾過し、ヘキサン、クロロホルム、メタノール等を用いて抽出・精製し、得られたサンプルの重量をＰＨＢ量とした。
培養液１ＬあたりのＰＨＢ量は、野生株（ＧＴ）では、約７ｍｇであったのに対し、ｋａｉＢ３およびｋａｉＣ３過剰発現株（ｋａｉＢ３ｏｘおよびｋａｉＣ３ｏｘ）ではそれぞれ約１４ｍｇ、約１０ｍｇに増加することが分かった。
（実施例３）コハク酸、乳酸および酢酸の生産量の測定
実施例１で作製した各時計タンパク質過剰発現株（ｋａｉＡｏｘ、ｋａｉＢ１ｏｘ、ｋａｉＢ２ｏｘ、ｋａｉＢ３ｏｘ、ｋａｉＣ１ｏｘ、ｋａｉＣ２ｏｘ、ｋａｉＣ３ｏｘ）および野生株（ＧＴ）について、コハク酸、乳酸および酢酸の生産量を測定した。
コハク酸、乳酸、酢酸などの有機酸については、嫌気・暗条件での培養液中の量を測定した。まず、各藍藻株を、７０ｍｌの通常培地で好気・明条件、３０℃で培養した。好気培養では、１％ＣＯ２を混合した空気を培養液中に導入した。３日間の培養の後、濁度がＡ７３０＝２０となるように、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）溶液１０ｍｌに細胞を濃縮、懸濁し、ガスクロマトグラフィー用のバイアル瓶に移した。バイアル瓶にブチルゴムで蓋をした後、２本の注射針をゴム栓に刺し、一方から窒素ガスを１時間導入した。その後、注射針を抜くことで、バイアル瓶中を嫌気状態にした。バイアル瓶をアルミホイルで包んで暗条件とし、３０℃で３日間振盪した。培養液を遠心分離にかけることで細胞を分離し、上清を新しいチューブに移して、凍結乾燥によって内容物を固化させた。これを過塩素酸に懸濁し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、分析した。定量は、ブロモチモールブルーを用いたポストラベル法によって行った。
測定１：
野生株のコハク酸、乳酸、酢酸の生産量はそれぞれ培養液１Ｌあたり約２０ｍｇ、２７５ｍｇ、１６ｍｇであった。コハク酸については、ｋａｉＢ３またはｋａｉＣ３の過剰発現によって、培養液１Ｌあたりの生産量が、それぞれ２５ｍｇ、３０ｍｇに増加することが分かった。乳酸については、ｋａｉＢ１、ｋａｉＢ２、またはｋａｉＣ１の過剰発現で、それぞれ５４６ｍｇ、４４７ｍｇ、４０８ｍｇに増加した。また、酢酸は、培養液１Ｌあたりの生産量が、ｋａｉＢ３の過剰発現でそれぞれ、２１ｍｇに増加した。
測定２：
野生株のコハク酸、乳酸、酢酸の生産量はそれぞれ培養液１Ｌあたり約１３ｍｇ、５ｍｇ以下、１６７ｍｇであった。コハク酸については、ｋａｉＢ３またはｋａｉＣ３の過剰発現によって、培養液１Ｌあたりの生産量が、それぞれ１９ｍｇ、２６ｍｇに増加することが分かった。乳酸については、ｋａｉＢ１、ｋａｉＢ２、またはｋａｉＣ１の過剰発現で、それぞれ１６ｍｇ、１０ｍｇ、１２ｍｇに増加した。また、酢酸は、培養液１Ｌあたりの生産量が、ｋａｉＢ３、ｋａｉＣ３の過剰発現でそれぞれ、２６６ｍｇ、２７９ｍｇに増加した。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (9)

  1. ポリヒドロキシブタン酸、コハク酸、乳酸および酢酸からなる群より選択される有機酸の生産方法であって、ｋａｉＢ遺伝子またはｋａｉＣ遺伝子である時計タンパク質遺伝子が過剰発現している藍藻を培養すること、および有機酸を採取することを含む、前記方法。
  2. 藍藻がポリヒドロキシアルカン酸生産能を有する、請求項１記載の方法。
  3. 藍藻が、ｐｈａＡＢ遺伝子とｐｈａＥＣ遺伝子を有する、請求項２記載の方法。
  4. 藍藻が、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属に属する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  5. 培養を窒素欠乏条件で行う、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
  6. 藍藻においてポリヒドロキシブタン酸、コハク酸、乳酸および酢酸からなる群より選択される有機酸生産能を増強する方法であって、藍藻においてｋａｉＢ遺伝子またはｋａｉＣ遺伝子である時計タンパク質遺伝子を過剰発現させることを含む、前記方法。
  7. 藍藻がｐｈａＡＢ遺伝子とｐｈａＥＣ遺伝子を有する、請求項６記載の方法。
  8. 藍藻が、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属に属する、請求項６または７に記載の方法。
  9. 培養を窒素欠乏条件で行う、請求項６〜８のいずれかに記載の方法。
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