JP2022530467A - 再生可能資源からの化学物質の生成 - Google Patents

再生可能資源からの化学物質の生成 Download PDF

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Abstract

とりわけ、本開示は、１，５－ペンタンジオール、アジピン酸、１，６－ヘキサンジオール、６－ヒドロキシヘキサン酸及び２－ケトカルボン酸のような各種化合物を調製するための生合成ポリペプチド、方法及び天然に存在しない微生物を提供する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１９年４月２５日に出願した米国特許仮出願第６２／８３８，７９３号、及び２０１９年６月２８日に出願した同第６２／８６８，８２４号に基づく優先権を主張するものであり、そのそれぞれは、参照により、全体が本明細書に援用される。
本開示は概ね、産業上有用な化学物質の組成物及び調製方法に関するものである。
アジピン酸（ＡＡ）は、広く用いられている化学物質であり、２０１２年の需要量は、推定で２３０万メートルトンであった（ＩＨＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｒｅｐｏｒｔ：Ｂｉｏ－Ｂａｓｅｄ Ａｄｉｐｉｃ Ａｃｉｄ（２０１２年１２月））。ＡＡは、ヘキサメチレンジアミン（ＨＭＤＡ）とともに、ナイロン６，６、ポリエステル樹脂、可塑剤、食品及びその他の物質の生成の際に使用される。したがって、再生可能資源を用いて、アジピン酸を高収量で調製する方法は、非常に望ましい。
１，５－ペンタンジオールは、ポリウレタン及びポリエステルの主成分である（ＰＤＬ）。１，６－ヘキサンジオール（ＨＤＯ）は、末端ヒドロキシル基を有する直鎖ジオールである。ＨＤＯは、工業塗料用途のポリエステル、自動車用途の２液型ポリウレタン塗料で使用される。ＨＤＯは、マクロジオール、例えばアジピン酸エステル、エラストマーで用いられるポリカーボネートジオール、ならびにパーケットフローリング及び皮革用塗料用のポリウレタン分散体の生成にも使用される。
６－ヒドロキシヘキサン酸（６ＨＨ）は、環化させてε－カプロラクトンを生成でき、そして、そのε－カプロラクトンをアミノ化してε－カプロラクタムを生成できる。ε－カプロラクタムは、ナイロン６の生成に使用され、このナイロン６は、多くの異なる産業で広く用いられているポリマーである。ε－カプロラクトンを重合させて、特殊ポリウレタンを生成する用途を持つ生分解性ポリエステルであるポリカプロラクトン（ＰＣＬ）を生成する。
２－ケトカルボン酸は、数多くの産業関連の化学物質及び医薬を調製する際の有用な中間体である。２－ケトカルボン酸は、アミノ酸、及び産業上有用なα－ヒドロキシカルボン酸を生成する際の前駆体である。
とりわけ本開示には、ある特定の生合成ペプチド、例えば各種酵素を用いて、多くの実施形態では、その酵素の天然の基質及び／または特徴付けられた基質とは構造的に異なる基質から、各種化合物を効率的に調製することができるという認識が含まれる。いくつかの実施形態では、本開示は、上記のような酵素を１つ以上用いて、各種化合物を調製する技術（例えば、酵素、核酸、生物、培養液など）を提供する。
例えば、いくつかの実施形態では、本開示は、様々なヒドラターゼ－アルドラーゼのようなアルドール脱水生成物生合成ポリペプチドを効果的に用いて、それらの典型的な基質である芳香族アルデヒドとは異なる脂肪族アルデヒドから、数多くの化合物を調製できることを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、
ピルベート及び脂肪族アルデヒドをアルドール脱水生成物生合成ポリペプチドと接触させて、アルドール脱水生成物を生成させるようにすることを含む方法であって、
その脂肪族アルデヒドのカルボニル基が、アルケニル基、アルキニル基または芳香族基に共役しておらず、
そのアルドール脱水生成物が、アルデヒド基またはケトン基と、そのアルデヒド基またはケトン基と共役した二重結合を含む化合物である、
方法を提供する。
いくつかの実施形態では、アルデヒド、例えば、脂肪族アルデヒドは、下記の式Ａ－１の構造
Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－Ｃ（Ｏ）Ｈ
Ａ－１
またはその塩を有し、式中、
Ｒａは、Ｒ”または－ＯＲ”であり、
Ｌ１及びＬ２のそれぞれは独立して、共有結合であるか、または２価の任意に置換された直鎖もしくは分岐鎖のＣ１－２０脂肪族基もしくはＣ１－２０ヘテロ脂肪族基であり、そのメチレン単位の１つ以上は任意にかつ独立して、－Ｃ≡Ｃ－、－Ｃ（Ｒ”）２－、－Ｃｙ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｎ（Ｒ”）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（ＮＲ”）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）－、－Ｎ（Ｒ”）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）－、－Ｎ（Ｒ”）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ”）－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－によって置き換えられており、
－Ｃｙ－は、２価の任意に置換された３～２０員の単環、二環または多環であり、その各単環は独立して、ヘテロ原子を０～５個有する任意に置換されているか、飽和であるか、部分飽和であるか、または芳香族である３～２０員環であり、
各Ｒ”は独立して、－Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＣＯ２Ｒ’または－ＳＯ２Ｒ’であり、
Ｒ’は、水素であるか、またはＣ１－１０脂肪族基、ヘテロ原子を１～５個有するＣ１－１０ヘテロ脂肪族基、６～１０員のアリール環、ヘテロ原子を１～５個有する５～１０員のヘテロアリール環、及びヘテロ原子を１～５個有する３～１０員のヘテロ環から選択した任意に置換された基であるか、あるいは
２つ以上のＲ’基が、介在する原子と一体となって、ヘテロ原子を、その介在する原子に加えて０～５個有する任意に置換された３～２０員の単環、二環または多環を形成し、その各単環は独立して、ヘテロ原子を０～５個有する任意に置換されているか、飽和であるか、部分飽和であるか、または芳香族である３～２０員環である。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、任意に置換された－ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、任意に一置換された－ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、－ＣＨ２－である。
いくつかの実施形態では、アルドール脱水生成物は、下記の式Ｐ－２の構造
Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ＝ＣＨ－Ｃ（Ｏ）－Ｃ（Ｏ）ＯＨ
Ｐ－２
またはその塩を有し、式中、各可変基は独立して、本明細書に記載されているとおりである。
本明細書に記載されているように、アルドール脱水生成物、例えば、式Ｐ－２の化合物またはその塩は、いくつかの実施形態では、１つ以上の生合成プロセスを通じて、さらに処理して、１，５－ペンタンジオール、ＨＤＯ、６ＨＨ、アジピン酸（例えば、図２～５を参照されたい）などのような様々な生成物、及びそれらから作られる様々な生成物（それらから作られる様々なポリマー生成物を含む）をもたらすことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に示されているように、アルドール脱水生成物、例えば、式Ｐ－２の化合物またはその塩は、アルドール生成物、例えば、下記の式Ｐ－１の化合物
Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－Ｃ（Ｏ）ＯＨ
Ｐ－１
またはその塩から調製してもよく、式中、各可変基は独立して、本明細書に記載されているとおりである。
いくつかの実施形態では、アルドール脱水生成物は、アルドール生成物を脱水生成物生合成ポリペプチドと接触させることによって製造する。
いくつかの実施形態では、アルドール生成物は、適切な基質をアルドール生成物生合成ポリペプチドと接触させることによって製造する。
いくつかの実施形態では、本開示は、様々なアルケン還元生成物生合成ポリペプチドを用いて、その天然または非天然の基質から、各種化合物を製造できることを示す。いくつかの実施形態では、本開示は、
アルケンをアルケン還元生成物生合成ポリペプチドと接触させて、アルケン還元生成物を生成させるようにすることを含む方法であって、
そのアルケンが、カルボニル基に共役した二重結合を含み、
そのアルケンにおける、カルボニル基に共役した二重結合を還元して単結合にして、アルケン還元生成物をもたらす、
方法を提供する。
いくつかの実施形態では、アルケンは、アルドール脱水生成物、例えば、式Ｐ－２またはその塩のうちの１つである。いくつかの実施形態では、アルケン還元生成物は、下記の式Ｐ－３の構造
Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－Ｃ（Ｏ）ＯＨ
Ｐ－３
またはその塩を有し、式中、各可変基は独立して、本明細書に記載されているとおりである。
とりわけ、本発明で開示するのは、再生可能資源を用いて、２－ケトカルボン酸、１，５－ペンタンジオール、アジピン酸、１，６－ヘキサンジオール及び６－ヒドロキシヘキサン酸を調製するための酵素、方法及び組み換え微生物である。
一態様では、本発明で提供するのは、下記の式の２－ケトカルボン酸の生成方法であって、
Figure 2022530467000002
式中、Ｒが、Ｈ、ＣＨ３またはＣＨ２ＯＨであり、
その方法が、天然に存在しない１つ以上の微生物を含む培養液または生物において、ピルベート及び
Figure 2022530467000003
 をヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼと接触させて、２－ケトカルボン酸を生成させることを含むかまたはそのことから本質的になり、そのヒドラターゼ－アルドラーゼ及びそのキノンオキシドレダクターゼが、天然に存在しない１つ以上の微生物によって発現される、方法である。
別の態様では、本発明で提供するのは、下記の式の２－ケトカルボン酸の生成方法であって、
Figure 2022530467000004
式中、Ｒが、Ｈ、ＣＨ３またはＣＨ２ＯＨであり、
その方法が、天然に存在しない２つ以上の微生物を含む培養液または生物において、ピルベート及び
Figure 2022530467000005
 をヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼと接触させて、２－ケトカルボン酸を生成させることを含むかまたはそのことから本質的になり、そのヒドラターゼ－アルドラーゼ及びそのキノンオキシドレダクターゼが、天然に存在しない２つ以上の微生物によって発現される、方法である。
別の態様では、本発明で提供するのは、１，５－ペンタンジオールの生成方法であって、
ピルベート及び３－ヒドロキシプロパナールをヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼと接触させて、下記の式の２－ケトカルボン酸を生成させることと、
Figure 2022530467000006
（式中、Ｒが、ＣＨ２ＯＨである）
その２－ケトカルボン酸を２－ケト酸デカルボキシラーゼと接触させて、５－ヒドロキシペンタナールを生成させることと、
その５－ヒドロキシペンタナールを１級アルコールデヒドロゲナーゼと接触させて、１，５－ペンタンジオールを生成させることと、
を含むかまたはそのことから本質的になり、
天然に存在しない１つ以上の微生物を含む培養液において行う方法である。
別の態様では、本発明で提供するのは、１，５－ペンタンジオールの生成方法であって、
ピルベート及び３－ヒドロキシプロパナールをヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼと接触させて、下記の式の２－ケトカルボン酸を生成させることと、
Figure 2022530467000007
（式中、Ｒが、ＣＨ２ＯＨである）
その２－ケトカルボン酸を２－ケト酸デカルボキシラーゼと接触させて、５－ヒドロキシペンタナールを生成させることと、
その５－ヒドロキシペンタナールを１級アルコールデヒドロゲナーゼと接触させて、１，５－ペンタンジオールを生成させることと、
を含むかまたはそのことから本質的になり、
天然に存在しない２つ以上の微生物を含む培養液において行う方法である。
別の態様では、本発明で提供するのは、１，６－ヘキサンジオールの生成方法であって、
ピルベート及び３－ヒドロキシプロパナールをヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼと接触させて、下記の式の２－ケトカルボン酸を生成させることと、
Figure 2022530467000008
（式中、Ｒが、ＣＨ２ＯＨである）、
その２－ケトカルボン酸を６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼと接触させて、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを生成させることと、
その２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼと接触させて、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
その２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼと接触させて、６－ヒドロキシ－２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
その６－ヒドロキシ－２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡを２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
その６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサノエートを生成させることと、
その６－ヒドロキシヘキサノエートを６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサナールを生成させることと、
その６－ヒドロキシヘキサナールを６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼと接触させて、１，６－ヘキサンジオールを生成させることと、
を含み、
天然に存在しない１つ以上の微生物を含む培養液において行う、方法である。
別の態様では、本発明で提供するのは、１，６－ヘキサンジオールの生成方法であって、
ピルベート及び３－ヒドロキシプロパナールをヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼと接触させて、下記の式の２－ケトカルボン酸を生成させることと
Figure 2022530467000009
（式中、Ｒが、ＣＨ２ＯＨである）
その２－ケトカルボン酸を６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼと接触させて、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを生成させることと、
その２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼと接触させて、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
その２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼと接触させて、６－ヒドロキシ－２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
その６－ヒドロキシ－２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡを２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
その６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサノエートを生成させることと、
その６－ヒドロキシヘキサノエートを６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサナールを生成させることと、
その６－ヒドロキシヘキサナールを６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼと接触させて、１，６－ヘキサンジオールを生成させることと、
を含み、
天然に存在しない２つ以上の微生物を含む培養液において行う方法である。
別の態様では、本発明で提供するのは、６－ヒドロキシヘキサノエートの生成方法であって、
ピルベート及び３－ヒドロキシプロパナールをヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼと接触させて、下記の式の２－ケトカルボン酸を生成させることと、
Figure 2022530467000010
（式中、Ｒが、ＣＨ２ＯＨである）
その２－ケトカルボン酸を６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼと接触させて、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを生成させることと、
その２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼと接触させて、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
その２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼと接触させて、６－ヒドロキシ－２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
その６－ヒドロキシ－２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡを２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
その６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサノエートを生成させることと、
を含み、
天然に存在しない１つ以上の微生物を含む培養液において行う方法である。
別の態様では、本発明で提供するのは、６－ヒドロキシヘキサノエートの生成方法であって、
ピルベート及び３－ヒドロキシプロパナールをヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼと接触させて、下記の式の２－ケトカルボン酸を生成させることと、
Figure 2022530467000011
（式中、Ｒが、ＣＨ２ＯＨである）、
その２－ケトカルボン酸を６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼと接触させて、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを生成させることと、
その２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼと接触させて、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
その２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼと接触させて、６－ヒドロキシ－２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
その６－ヒドロキシ－２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡを２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
その６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサノエートを生成させることと、
を含み、
天然に存在しない２つ以上の微生物を含む培養液において行う方法である。
別の態様では、本発明で提供するのは、アジピン酸の生成方法であって、
ピルベート及び３－ヒドロキシプロパナールをヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼと接触させて、下記の式の２－ケトカルボン酸を生成させることと、
Figure 2022530467000012
（式中、Ｒが、ＣＨ２ＯＨである）、
その２－ケトカルボン酸を６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼと接触させて、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを生成させることと、
その２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼと接触させて、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
その２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼと接触させて、６－ヒドロキシ－２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
その６－ヒドロキシ－２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡを２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
その６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサノエートを生成させることと、
その６－ヒドロキシヘキサノエートを６－ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼと接触させて、６－オキソヘキサノエートを生成させることと、
その６－オキソヘキサノエートを６－オキソヘキサノエートオキシダーゼと接触させて、アジピン酸を生成させることと、
を含み、
天然に存在しない１つ以上の微生物を含む培養液において行う方法である。
別の態様では、本発明で提供するのは、アジピン酸の生成方法であって、
ピルベート及び３－ヒドロキシプロパナールをヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼと接触させて、下記の式の２－ケトカルボン酸を生成させることと、
Figure 2022530467000013
（式中、Ｒが、ＣＨ２ＯＨである）
その２－ケトカルボン酸を６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼと接触させて、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを生成させることと、
その２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼと接触させて、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
その２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼと接触させて、６－ヒドロキシ－２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
その６－ヒドロキシ－２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡを２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
その６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサノエートを生成させることと、
その６－ヒドロキシヘキサノエートを６－ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼと接触させて、６－オキソヘキサノエートを生成させることと、
その６－オキソヘキサノエートを６－オキソヘキサノエートオキシダーゼと接触させて、アジピン酸を生成させることと、
を含み、
天然に存在しない２つ以上の微生物を含む培養液において行う方法である。
いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、ＥＣ番号４．１．２．４５、ＥＣ番号４．１．２．３４またはＥＣ番号４．１．１．４である酵素である。いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、ＧｅｎＢａｎｋ、ＲｅｆＳｅｑまたはＵｎｉｐｒｏｔのＩＤ番号Ｄ７Ｃ０Ｅ５、Ｐ０Ａ１４４、Ｑ７９ＥＭ８、Ａ０Ａ０Ｎ０ＡＨＩ８、Ａ０Ａ０Ｎ１ＦＲＹ３、Ｍ３ＤＹＲ１、Ｗ７ＳＵ４８、Ａ０Ａ２８６ＰＨ１８、Ｑ９Ｘ９Ｑ６、Ｑ９ＷＸＨ７、Ａ４ＸＤＳ１、Ｆ２Ｊ６Ｎ９、Ａ０Ａ０６３ＢＦＬ５、Ｑ９ＺＨＨ６、Ａ０Ａ０Ｃ１Ｋ８５３、ＷＰ＿０３４３９８４８２、ＰＹＫ１２１９１、ＷＰ＿１１５４７８０３３、ＷＰ＿０２８２２２２５３、ＷＰ＿０１３６５４８０７、ＷＰ＿０５９４０３０６０、ＷＰ＿０９２５０８５３０、ＷＰ＿１１６６４２６２７、ＷＰ＿００９７７０６５９、ＷＰ＿１０７８１８１９１、ＷＰ＿００３２９２０６１、ＰＹＮ４８８５５、ＷＰ＿１２２２１２９６５、ＷＰ＿０２８２１７２９７、ＷＰ＿０３４５０７０４９、ＫＭＫ６４０８１．１、ＷＰ＿０７００２８０４１．１またはＫＺＬ９２４４９．１で識別される酵素の群から選択した酵素である。
いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、ＥＣ番号４．１．２．４５、ＥＣ番号４．１．２．３４またはＥＣ番号４．１．１．４である酵素である。いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、ＧｅｎＢａｎｋ、ＲｅｆＳｅｑまたはＵｎｉｐｒｏｔのＩＤ番号Ｄ７Ｃ０Ｅ５、Ｐ０Ａ１４４、Ｑ７９ＥＭ８、Ａ０Ａ０Ｎ０ＡＨＩ８、Ａ０Ａ０Ｎ１ＦＲＹ３、Ｍ３ＤＹＲ１、Ｗ７ＳＵ４８、Ａ０Ａ２８６ＰＨ１８、Ｑ９Ｘ９Ｑ６、Ｑ９ＷＸＨ７、Ａ４ＸＤＳ１、Ｆ２Ｊ６Ｎ９、Ａ０Ａ０６３ＢＦＬ５、Ｑ９ＺＨＨ６、Ａ０Ａ０Ｃ１Ｋ８５３、ＷＰ＿０３４３９８４８２、ＰＹＫ１２１９１、Ａ０Ａ３７０Ｘ７Ｄ８、ＷＰ＿０２８２２２２５３、Ｆ２Ｊ６Ｌ６、Ａ０Ａ０Ｎ０Ｌ９Ｆ６、Ａ０Ａ１Ｇ９ＹＷＧ７、Ａ０Ａ２Ｕ１ＢＴ０９、Ａ０Ａ２４４ＤＨＥ８、ＷＰ＿１０７８１８１９１、Ａ０Ａ０２３ＷＺＦ９、ＰＹＮ４８８５５、Ａ０Ａ４２１ＰＡＱ６、ＷＰ＿０２８２１７２９７、ＷＰ＿０３４５０７０４９、ＫＭＫ６４０８１．１、ＷＰ＿０７００２８０４１．１またはＫＺＬ９２４４９．１で識別される酵素の群から選択した酵素である。いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号８４、配列番号８５または配列番号８６の配列を含む酵素である。
いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、ＧｅｎＢａｎｋ、ＲｅｆＳｅｑまたはＵｎｉｐｒｏｔのＩＤ番号Ｄ７Ｃ０Ｅ５、Ｐ０Ａ１４４、Ｑ７９ＥＭ８、Ａ０Ａ０Ｎ０ＡＨＩ８、Ａ０Ａ０Ｎ１ＦＲＹ３、Ｍ３ＤＹＲ１、Ｗ７ＳＵ４８、Ａ０Ａ２８６ＰＨ１８、Ｑ９Ｘ９Ｑ６、Ｑ９ＷＸＨ７、Ａ４ＸＤＳ１、Ｆ２Ｊ６Ｎ９、Ａ０Ａ０６３ＢＦＬ５、Ｑ９ＺＨＨ６、Ａ０Ａ０Ｃ１Ｋ８５３、ＷＰ＿０３４３９８４８２、ＰＹＫ１２１９１、Ａ０Ａ３７０Ｘ７Ｄ８、ＷＰ＿０２８２２２２５３、Ｆ２Ｊ６Ｌ６、Ａ０Ａ０Ｎ０Ｌ９Ｆ６、Ａ０Ａ１Ｇ９ＹＷＧ７、Ａ０Ａ２Ｕ１ＢＴ０９、Ａ０Ａ２４４ＤＨＥ８、ＷＰ＿１０７８１８１９１、Ａ０Ａ０２３ＷＺＦ９、ＰＹＮ４８８５５、Ａ０Ａ４２１ＰＡＱ６、ＷＰ＿０２８２１７２９７、ＷＰ＿０３４５０７０４９、ＫＭＫ６４０８１．１、ＷＰ＿０７００２８０４１．１もしくはＫＺＬ９２４４９．１で識別される酵素の群から選択した酵素、またはその一部分のうち、アルドール脱水生成物の形成を促す部分（例えば、ドメイン、一連のアミノ酸残基（連続的であることも離れていることもできる）など）との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上である。いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号８４、配列番号８５または配列番号８６の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上である。
いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、表１及び５～８から選択した酵素である。いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、表１及び５～８から選択した酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上である。
いくつかの実施形態では、キノンオキシドレダクターゼは、ＥＣ番号１．６．５である酵素である。いくつかの実施形態では、キノンオキシドレダクターゼは、ＥＣ番号１．６．５．５である酵素である。いくつかの実施形態では、キノンオキシドレダクターゼは、ＧｅｎＢａｎｋ、ＲｅｆＳｅｑまたはＵｎｉｐｒｏｔのＩＤ番号Ｐ２８３０４、Ｐ４０７８３、Ｑ０Ｋ２Ｉ０、Ａ０Ａ１Ｚ１ＳＲＹ９、Ｐ４３９０３、Ｉ７Ｇ８Ｇ０、またはＱ１４２Ｌ２、ＡＬＫ１９３２４．１、Ａ０Ａ１Ｇ９Ｒ４０８、Ｇ４Ｑ８Ｒ５、ＡＮＡ９８７２３．１、Ｋ０ＥＵＱ３、Ａ０Ａ０６１ＣＲＳ８、Ｑ９Ａ２１２、Ａ０Ａ１Ｉ６ＲＷＷ２、ＷＰ＿０２６１９７２７７．１、Ｑ５ＮＫＺ３、ＷＰ＿０１２３３３０３４．１またはＷＰ＿１３６８９８０００．１で識別される酵素の群から選択した酵素である。いくつかの実施形態では、キノンオキシドレダクターゼは、ＧｅｎＢａｎｋ、ＲｅｆＳｅｑまたはＵｎｉｐｒｏｔのＩＤ番号Ｐ２８３０４、Ｐ４０７８３、Ｑ０Ｋ２Ｉ０、Ａ０Ａ１Ｚ１ＳＲＹ９、Ｐ４３９０３、Ｉ７Ｇ８Ｇ０、またはＱ１４２Ｌ２、ＡＬＫ１９３２４．１、Ａ０Ａ１Ｇ９Ｒ４０８、Ｇ４Ｑ８Ｒ５、ＡＮＡ９８７２３．１、Ｋ０ＥＵＱ３、Ａ０Ａ０６１ＣＲＳ８、Ｑ９Ａ２１２、Ａ０Ａ１Ｉ６ＲＷＷ２、ＷＰ＿０２６１９７２７７．１、Ｑ５ＮＫＺ３、ＷＰ＿０１２３３３０３４．１またはＷＰ＿１３６８９８０００．１で識別される酵素の群から選択した酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上である。いくつかの実施形態では、キノンオキシドレダクターゼは、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７の配列を含む酵素である。いくつかの実施形態では、キノンオキシドレダクターゼは、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上である。
いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼは、天然に存在しない１つ以上の微生物によって発現される。いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼ酵素のうちの少なくとも１つは、天然に存在しない１つ以上の微生物によって発現される１つ以上の外因性遺伝子によって発現される。いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現される。いくつかの実施形態では、キノンオキシドレダクターゼは、天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現される。いくつかの実施形態では、キノンオキシドレダクターゼは、天然に存在しない１つ以上の微生物によって過剰発現される。いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現され、キノンオキシドレダクターゼは、天然に存在しない１つ以上の微生物によって過剰発現される。
いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼは、天然に存在しない２つ以上の微生物によって発現される。いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼ酵素のうちの少なくとも１つは、天然に存在しない２つ以上の微生物によって発現される１つ以上の外因性遺伝子によって発現される。いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、天然に存在しない２つ以上の微生物によって外因性に発現される。いくつかの実施形態では、キノンオキシドレダクターゼは、天然に存在しない２つ以上の微生物によって外因性に発現される。いくつかの実施形態では、キノンオキシドレダクターゼは、天然に存在しない１つ以上の微生物によって過剰発現される。いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、天然に存在しない２つ以上の微生物によって外因性に発現され、キノンオキシドレダクターゼは、天然に存在しない２つ以上の微生物によって過剰発現される。
いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼの１つ以上はさらに、タンパク質タグを１つ以上含む。いくつかの実施形態では、そのタンパク質タグは、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ（グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグ）、ＨＡタグ（ヘマグルチニンタグ）、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、マルトース結合タンパク質タグ、キチン結合タンパク質タグ及び蛍光タグから選択されている。
いくつかの実施形態では、２－ケトカルボン酸の生成方法はさらに、２－ケトカルボン酸を、天然に存在しない１つ以上の微生物、または天然に存在しない１つ以上の微生物を含む培養液から分離することを含むか、またはそのことから本質的になる。いくつかの実施形態では、その方法はさらに、２－ケトカルボン酸を、天然に存在しない２つ以上の微生物、または天然に存在しない２つ以上の微生物を含む培養液から分離することを含むか、またはそのことから本質的になる。
いくつかの実施形態では、２－ケト酸デカルボキシラーゼは、ＥＣ番号４．１．１．１、ＥＣ番号４．１．１．２、ＥＣ番号４．１．１．３、ＥＣ番号４．１．１．４、ＥＣ番号４．１．１．５、ＥＣ番号４．１．１．６、ＥＣ番号４．１．１．７、ＥＣ番号４．１．１．１１、ＥＣ番号４．１．１．１２、ＥＣ番号４．１．１．１５、ＥＣ番号４．１．１．１６、ＥＣ番号４．１．１．１７、ＥＣ番号４．１．１．１８、ＥＣ番号４．１．１．１９、ＥＣ番号４．１．１．２０、ＥＣ番号４．１．１．３４、ＥＣ番号４．１．１．３５、ＥＣ番号４．１．１．４０、ＥＣ番号４．１．１．５４、ＥＣ番号４．１．１．５６、ＥＣ番号４．１．１．７１、ＥＣ番号４．１．１．７２、ＥＣ番号４．１．１．７３、ＥＣ番号４．１．１．７４、ＥＣ番号４．１．１．７５またはＥＣ番号４．１．１．７７で識別される酵素の群から選択した酵素である。いくつかの実施形態では、２－ケト酸デカルボキシラーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ６ＱＢＳ４、Ａ７Ｍ７Ｄ６またはＰ２０９０６で識別される酵素の群から選択した酵素である。いくつかの実施形態では、２－ケト酸デカルボキシラーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ６ＱＢＳ４、Ａ７Ｍ７Ｄ６またはＰ２０９０６で識別される酵素の群から選択した酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上である。
いくつかの実施形態では、１級アルコールデヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．１．１．６１である酵素である。いくつかの実施形態では、１級アルコールデヒドロゲナーゼは、ＵｎｉｐｒｏｔまたはＧｅｎＢａｎｋのＩＤ番号ＮＰ＿４１７２７９．１、ＮＰ＿３４９８９２．１、ＮＰ＿３４９８９１．１、ＢＡＢ１２２７３．１、Ｌ２１９０２．１、Ｑ９４Ｂ０７、ＡＡＢ０３０１５．１、ＮＰ＿０１４０３２．１、ＮＰ＿０１３８９２．１、ＮＰ＿０１５０１９．１、ＮＰ＿０１０９９６．２、ＡＢＸ３９１９２．１、ＸＰ＿００１２１０６２５．１、ＡＢＯ６７１１８、ＡＢＯ６８２２３、ＢＡＥ７７０６８．１またはＣＡＡ４７７４３．１で識別される酵素の群から選択した酵素である。いくつかの実施形態では、１級アルコールデヒドロゲナーゼは、ＵｎｉｐｒｏｔまたはＧｅｎＢａｎｋのＩＤ番号ＮＰ＿４１７２７９．１、ＮＰ＿３４９８９２．１、ＮＰ＿３４９８９１．１、ＢＡＢ１２２７３．１、Ｌ２１９０２．１、Ｑ９４Ｂ０７、ＡＡＢ０３０１５．１、ＮＰ＿０１４０３２．１、ＮＰ＿０１３８９２．１、ＮＰ＿０１５０１９．１、ＮＰ＿０１０９９６．２、ＡＢＸ３９１９２．１、ＸＰ＿００１２１０６２５．１、ＡＢＯ６７１１８、ＡＢＯ６８２２３、ＢＡＥ７７０６８．１またはＣＡＡ４７７４３．１で識別される酵素の群から選択した酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上である。いくつかの実施形態では、１級アルコールデヒドロゲナーゼは、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３または配列番号７４の配列を含む酵素である。いくつかの実施形態では、１級アルコールデヒドロゲナーゼは、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３または配列番号７４の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上である。
いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ａ０Ａ２８６ＰＨ１８で識別される酵素であり、キノンオキシドレダクターゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｐ２８３０４で識別される酵素であり、２－ケト酸デカルボキシラーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ６ＱＢＳ４で識別される酵素であり、１級アルコールデヒドロゲナーゼは、ＵｎｉｐｒｏｔまたはＧｅｎＢａｎｋのＩＤ番号Ｄ６Ｚ８６０、ＹＰ＿００１７０５４３６．１、ＡＮＯ０６４０７．１、ＡＡＲ９１６８１．１、ＡＨＨ９８１２１．１、ＡＮＢ００６１２．１、ＡＮＯ０４６５５．１、Ａ０Ｒ４８４、ＡＦＰ４２０２６．１、ＧＡＪ８６５１０．１、ＹＰ＿００１７０４０９７．１、ＡＮＡ９９３１５．１、ＧＡＪ８３０２７．１、ＡＮＡ９８９２５．１、ＡＮＡ９８９２４．１、ＡＮＯ０４６５６．１、ＹＰ＿００１７０３６９４で識別される酵素である。いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、配列番号８の配列を含む酵素であり、キノンオキシドレダクターゼは、配列番号４５の配列を含む酵素であり、２－ケト酸デカルボキシラーゼは、配列番号８３の配列を含む酵素であり、１級アルコールデヒドロゲナーゼは、配列番号７０の配列を含む酵素である。
いくつかの実施形態では、２－ケト酸デカルボキシラーゼ及び１級アルコールデヒドロゲナーゼは、天然に存在しない１つ以上の微生物によって発現される。いくつかの実施形態では、２－ケト酸デカルボキシラーゼ及び１級アルコールデヒドロゲナーゼは、天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現される。
いくつかの実施形態では、２－ケト酸デカルボキシラーゼ及び１級アルコールデヒドロゲナーゼは、天然に存在しない２つ以上の微生物によって発現される。いくつかの実施形態では、２－ケト酸デカルボキシラーゼ及び１級アルコールデヒドロゲナーゼは、天然に存在しない２つ以上の微生物によって外因性に発現される。
いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼ、キノンオキシドレダクターゼ、２－ケト酸デカルボキシラーゼ及び１級アルコールデヒドロゲナーゼのうちの１つ以上はさらに、タンパク質タグを１つ以上含む。いくつかの実施形態では、そのタンパク質タグは、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ（グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグ）、ＨＡタグ（ヘマグルチニンタグ）、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、マルトース結合タンパク質タグ、キチン結合タンパク質タグ及び蛍光タグから選択されている。
いくつかの実施形態では、１，５－ペンタンジオールの生成方法はさらに、１，５－ペンタンジオールを、天然に存在しない１つ以上の微生物、または天然に存在しない１つ以上の微生物を含む培養液から分離することを含むか、またはそのことから本質的になる。いくつかの実施形態では、その方法はさらに、１，５－ペンタンジオールを、天然に存在しない２つ以上の微生物、または天然に存在しない２つ以上の微生物を含む培養液から分離することを含むか、またはそのことから本質的になる。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼ、６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼ及び６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼは、天然に存在しない１つ以上の微生物によって発現される。いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼ、６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼ及び６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼは、天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現される。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼ、６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼ及び６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼは、天然に存在しない２つ以上の微生物によって発現される。いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼ、６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼ及び６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼは、天然に存在しない２つ以上の微生物によって外因性に発現される。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼは、ＥＣ番号１．１．９９．６、ＥＣ番号１．１．１．１６９、ＥＣ番号１．１．１．２１５、ＥＣ番号１．１．１．２８またはＥＣ番号１．１．１．１１０で識別される酵素の群から選択した酵素であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼは、ＥＣ番号２．８．３、ＥＣ番号２．８．３．１またはＥＣ番号２．８．３．１２で識別される酵素の群から選択した酵素であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼは、ＥＣ番号４．２．１．１６７である酵素であり、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼは、ＥＣ番号１．３．１．４４である酵素であり、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼは、ＥＣ番号２．８．３、ＥＣ番号２．８．３．１またはＥＣ番号２．８．３．１２である酵素であり、６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼは、ＥＣ番号１．２．９９．６である酵素であり、６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼは、ＥＣ番号１．１．１である酵素である。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼは、ＵｎｉｐｒｏｔまたはＧｅｎＢａｎｋのＩＤ番号ＷＰ＿００３４３１４０７．１、ＢＡＬ５１２９２．１、Ｑ５ＦＴＵ６、ＡＫＣ６４０９４．１、ＷＰ＿００２８７６８６２．１、ＡＧＰ６９０１７．１、ＷＰ＿００３６４０７４１．１、ＡＫＣ６４０９５．１及びＡＫＣ６４０９４．１で識別される酵素の群から選択した酵素であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｔ４ＶＷ９３で識別される酵素の群から選択した酵素であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ５Ｕ９２４、Ｑ５Ｕ９２５及びＱ５Ｕ９２３で識別される酵素の群から選択した酵素であり、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ７３Ｑ４７で識別される酵素であり、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｔ４ＶＷ９３で識別される酵素であり、６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼは、ＵｎｉｐｒｏｔまたはＧｅｎＢａｎｋのＩＤ番号Ｄ６Ｚ８６０、ＹＰ＿００１７０５４３６．１、ＡＮＯ０６４０７．１、ＡＡＲ９１６８１．１、ＡＨＨ９８１２１．１、ＡＮＢ００６１２．１、ＡＮＯ０４６５５．１、Ａ０Ｒ４８４、ＡＦＰ４２０２６．１、ＧＡＪ８６５１０．１、ＹＰ＿００１７０４０９７．１、ＡＮＡ９９３１５．１、ＧＡＪ８３０２７．１、ＡＮＡ９８９２５．１、ＡＮＡ９８９２４．１、ＡＮＯ０４６５６．１、ＹＰ＿００１７０３６９４．１、ＷＰ＿０３６３３８３０１．１、ＷＰ＿００７４７２１０６．１またはＡ０ＱＷＩ７で識別される酵素であり、６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼは、ＵｎｉｐｒｏｔまたはＧｅｎＢａｎｋのＩＤ番号Ｄ６Ｚ８６０、ＹＰ＿００１７０５４３６．１、ＡＮＯ０６４０７．１、ＡＡＲ９１６８１．１、ＡＨＨ９８１２１．１、ＡＮＢ００６１２．１、ＡＮＯ０４６５５．１、Ａ０Ｒ４８４、ＡＦＰ４２０２６．１、ＧＡＪ８６５１０．１、ＹＰ＿００１７０４０９７．１、ＡＮＡ９９３１５．１、ＧＡＪ８３０２７．１、ＡＮＡ９８９２５．１、ＡＮＡ９８９２４．１、ＡＮＯ０４６５６．１、ＹＰ＿００１７０３６９４で識別される酵素である。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼは、配列番号５３、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４または配列番号１０５の配列を含む酵素であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼは、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼは、配列番号５９、配列番号６１及び配列番号６３、または配列番号６０、配列番号６２及び配列番号６４の配列を含む酵素であり、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼは、配列番号６５の配列を含む酵素であり、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼは、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素であり、６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼは、配列番号６６、配列番号６７または配列番号６８の配列を含む酵素であり、６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼは、配列番号７０の配列を含む酵素である。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼは、配列番号５３、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４または配列番号１０５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼは、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼは、配列番号５９、配列番号６１及び配列番号６３、または配列番号６０、配列番号６２及び配列番号６４の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼは、配列番号６５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼは、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼは、配列番号６６、配列番号６７または配列番号６８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼは、配列番号７０の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上である。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼは、ＵｎｉｐｒｏｔまたはＧｅｎＢａｎｋのＩＤ番号ＷＰ＿００３４３１４０７．１、ＢＡＬ５１２９２．１、Ｑ５ＦＴＵ６、ＡＫＣ６４０９４．１、ＷＰ＿００２８７６８６２．１、ＡＧＰ６９０１７．１、ＷＰ＿００３６４０７４１．１、ＡＫＣ６４０９５．１及びＡＫＣ６４０９４．１で識別される酵素であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｔ４ＶＷ９３、Ａ０Ａ０Ｃ７ＧＤ１６、Ａ０Ａ１７５Ｌ１Ｗ４またはＡ０Ａ２Ｘ３ＢＴＱ９で識別される酵素であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ５Ｕ９２４、Ｑ５Ｕ９２５及びＱ５Ｕ９２３、またはＡ０Ａ２Ｘ３ＢＫ０９、Ａ０Ａ２Ｘ３ＢＵ１９及びＡ０Ａ１Ｖ９ＩＸＡ９で識別される酵素であり、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ７３Ｑ４７で識別される酵素であり、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｔ４ＶＷ９３、Ａ０Ａ０Ｃ７ＧＤ１６、Ａ０Ａ１７５Ｌ１Ｗ４またはＡ０Ａ２Ｘ３ＢＴＱ９で識別される酵素であり、６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼは、ＵｎｉｐｒｏｔまたはＧｅｎＢａｎｋのＩＤ番号Ｄ６Ｚ８６０、ＹＰ＿００１７０５４３６．１、ＡＮＯ０６４０７．１、ＡＡＲ９１６８１．１、ＡＨＨ９８１２１．１、ＡＮＢ００６１２．１、ＡＮＯ０４６５５．１、Ａ０Ｒ４８４、ＡＦＰ４２０２６．１、ＧＡＪ８６５１０．１、ＹＰ＿００１７０４０９７．１、ＡＮＡ９９３１５．１、ＧＡＪ８３０２７．１、ＡＮＡ９８９２５．１、ＡＮＡ９８９２４．１、ＡＮＯ０４６５６．１、ＹＰ＿００１７０３６９４．１、ＷＰ＿０３６３３８３０１．１、ＷＰ＿００７４７２１０６．１またはＡ０ＱＷＩ７で識別される酵素であり、６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼは、ＵｎｉｐｒｏｔまたはＧｅｎＢａｎｋのＩＤ番号Ｄ６Ｚ８６０、ＹＰ＿００１７０５４３６．１、ＡＮＯ０６４０７．１、ＡＡＲ９１６８１．１、ＡＨＨ９８１２１．１、ＡＮＢ００６１２．１、ＡＮＯ０４６５５．１、Ａ０Ｒ４８４、ＡＦＰ４２０２６．１、ＧＡＪ８６５１０．１、ＹＰ＿００１７０４０９７．１、ＡＮＡ９９３１５．１、ＧＡＪ８３０２７．１、ＡＮＡ９８９２５．１、ＡＮＡ９８９２４．１、ＡＮＯ０４６５６．１、ＹＰ＿００１７０３６９４で識別される酵素である。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼは、ＵｎｉｐｒｏｔまたはＧｅｎＢａｎｋのＩＤ番号ＷＰ＿００３４３１４０７．１、ＢＡＬ５１２９２．１、Ｑ５ＦＴＵ６、ＡＫＣ６４０９４．１、ＷＰ＿００２８７６８６２．１、ＡＧＰ６９０１７．１、ＷＰ＿００３６４０７４１．１、ＡＫＣ６４０９５．１及びＡＫＣ６４０９４．１で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｔ４ＶＷ９３、Ａ０Ａ０Ｃ７ＧＤ１６、Ａ０Ａ１７５Ｌ１Ｗ４またはＡ０Ａ２Ｘ３ＢＴＱ９で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ５Ｕ９２４、Ｑ５Ｕ９２５及びＱ５Ｕ９２３、またはＡ０Ａ２Ｘ３ＢＫ０９、Ａ０Ａ２Ｘ３ＢＵ１９及びＡ０Ａ１Ｖ９ＩＸＡ９で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ７３Ｑ４７で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｔ４ＶＷ９３、Ａ０Ａ０Ｃ７ＧＤ１６、Ａ０Ａ１７５Ｌ１Ｗ４またはＡ０Ａ２Ｘ３ＢＴＱ９で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼは、ＵｎｉｐｒｏｔまたはＧｅｎＢａｎｋのＩＤ番号Ｄ６Ｚ８６０、ＹＰ＿００１７０５４３６．１、ＡＮＯ０６４０７．１、ＡＡＲ９１６８１．１、ＡＨＨ９８１２１．１、ＡＮＢ００６１２．１、ＡＮＯ０４６５５．１、Ａ０Ｒ４８４、ＡＦＰ４２０２６．１、ＧＡＪ８６５１０．１、ＹＰ＿００１７０４０９７．１、ＡＮＡ９９３１５．１、ＧＡＪ８３０２７．１、ＡＮＡ９８９２５．１、ＡＮＡ９８９２４．１、ＡＮＯ０４６５６．１、ＹＰ＿００１７０３６９４．１、ＷＰ＿０３６３３８３０１．１、ＷＰ＿００７４７２１０６．１またはＡ０ＱＷＩ７で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼは、ＵｎｉｐｒｏｔまたはＧｅｎＢａｎｋのＩＤ番号Ｄ６Ｚ８６０、ＹＰ＿００１７０５４３６．１、ＡＮＯ０６４０７．１、ＡＡＲ９１６８１．１、ＡＨＨ９８１２１．１、ＡＮＢ００６１２．１、ＡＮＯ０４６５５．１、Ａ０Ｒ４８４、ＡＦＰ４２０２６．１、ＧＡＪ８６５１０．１、ＹＰ＿００１７０４０９７．１、ＡＮＡ９９３１５．１、ＧＡＪ８３０２７．１、ＡＮＡ９８９２５．１、ＡＮＡ９８９２４．１、ＡＮＯ０４６５６．１、ＹＰ＿００１７０３６９４で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上である。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼ、６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼ及び６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼのうちの１つ以上はさらに、タンパク質タグを１つ以上含む。いくつかの実施形態では、そのタンパク質タグは、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ（グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグ）、ＨＡタグ（ヘマグルチニンタグ）、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、マルトース結合タンパク質タグ、キチン結合タンパク質タグ及び蛍光タグから選択されている。
いくつかの実施形態では、１，６－ヘキサンジオールの生成方法はさらに、１，６－ヘキサンジオールを、天然に存在しない１つ以上の微生物、または天然に存在しない１つ以上の微生物を含む培養液から分離することを含むか、またはそのことから本質的になる。いくつかの実施形態では、その方法はさらに、１，６－ヘキサンジオールを、天然に存在しない２つ以上の微生物、または天然に存在しない２つ以上の微生物を含む培養液から分離することを含むか、またはそのことから本質的になる。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ及び６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼは、天然に存在しない１つ以上の微生物によって発現される。いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ及び６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼは、天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現される。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ及び６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼは、天然に存在しない２つ以上の微生物によって発現される。いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ及び６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼは、天然に存在しない２つ以上の微生物によって外因性に発現される。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼは、ＥＣ番号１．１．９９．６、ＥＣ番号１．１．１．１６９、ＥＣ番号１．１．１．２１５、ＥＣ番号１．１．１．２８またはＥＣ番号１．１．１．１１０で識別される酵素の群から選択されており、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼは、ＥＣ番号２．８．３、ＥＣ番号２．８．３．１またはＥＣ番号２．８．３．１２である酵素であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼは、ＥＣ番号４．２．１．１６７である酵素であり、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼは、ＥＣ番号１．３．１．４４である酵素であり、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼは、ＥＣ番号２．８．３、ＥＣ番号２．８．３．１またはＥＣ番号２．８．３．１２である酵素である。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼは、ＵｎｉｐｒｏｔまたはＧｅｎＢａｎｋのＩＤ番号ＷＰ＿００３４３１４０７．１、ＢＡＬ５１２９２．１、Ｑ５ＦＴＵ６、ＡＫＣ６４０９４．１、ＷＰ＿００２８７６８６２．１、ＡＧＰ６９０１７．１、ＷＰ＿００３６４０７４１．１、ＡＫＣ６４０９５．１及びＡＫＣ６４０９４．１で識別される酵素の群から選択した酵素であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｔ４ＶＷ９３、Ａ０Ａ２Ｘ３ＢＴＱ９、Ａ０Ａ０Ｃ７ＧＤ１６またはＡ０Ａ１７５Ｌ１Ｗ４で識別される酵素であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ５Ｕ９２４、Ｑ５Ｕ９２５及びＱ５Ｕ９２３、またはＡ０Ａ２Ｘ３ＢＫ０９、Ａ０Ａ２Ｘ３ＢＵ１９及びＡ０Ａ１Ｖ９ＩＸＡ９で識別される酵素であり、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ７３Ｑ４７で識別される酵素であり、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｔ４ＶＷ９３、Ａ０Ａ２Ｘ３ＢＴＱ９、Ａ０Ａ０Ｃ７ＧＤ１６またはＡ０Ａ１７５Ｌ１Ｗ４で識別される酵素である。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼは、ＵｎｉｐｒｏｔまたはＧｅｎＢａｎｋのＩＤ番号ＷＰ＿００３４３１４０７．１、ＢＡＬ５１２９２．１、Ｑ５ＦＴＵ６、ＡＫＣ６４０９４．１、ＷＰ＿００２８７６８６２．１、ＡＧＰ６９０１７．１、ＷＰ＿００３６４０７４１．１、ＡＫＣ６４０９５．１及びＡＫＣ６４０９４．１で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｔ４ＶＷ９３、Ａ０Ａ２Ｘ３ＢＴＱ９、Ａ０Ａ０Ｃ７ＧＤ１６またはＡ０Ａ１７５Ｌ１Ｗ４で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ５Ｕ９２４、Ｑ５Ｕ９２５及びＱ５Ｕ９２３、またはＡ０Ａ２Ｘ３ＢＫ０９、Ａ０Ａ２Ｘ３ＢＵ１９及びＡ０Ａ１Ｖ９ＩＸＡ９で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ７３Ｑ４７で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｔ４ＶＷ９３、Ａ０Ａ２Ｘ３ＢＴＱ９、Ａ０Ａ０Ｃ７ＧＤ１６またはＡ０Ａ１７５Ｌ１Ｗ４で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上である。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼは、配列番号５３、配列番号５４、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４または配列番号１０５の配列を含む酵素であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼは、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼは、配列番号５９、配列番号６１及び配列番号６３、または配列番号６０、配列番号６２及び配列番号６４の配列を含む酵素であり、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼは、配列番号６５の配列を含む酵素であり、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼは、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素である。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼは、配列番号５、配列番号５４、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４または配列番号１０５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼは、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼは、配列番号５９、配列番号６１及び配列番号６３、または配列番号６０、配列番号６２及び配列番号６４の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼは、配列番号６５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼは、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上である。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ及び６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼのうちの１つ以上はさらに、タンパク質タグを１つ以上含む。いくつかの実施形態では、そのタンパク質タグは、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ（グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグ）、ＨＡタグ（ヘマグルチニンタグ）、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、マルトース結合タンパク質タグ、キチン結合タンパク質タグ及び蛍光タグから選択されている。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシヘキサノエートの生成方法はさらに、６－ヒドロキシヘキサノエートを、天然に存在しない１つ以上の微生物、または天然に存在しない１つ以上の微生物を含む培養液から分離することを含むか、またはそのことから本質的になる。いくつかの実施形態では、その方法はさらに、６－ヒドロキシヘキサノエートを、天然に存在しない２つ以上の微生物、または天然に存在しない２つ以上の微生物を含む培養液から分離することを含むか、またはそのことから本質的になる。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼ、６－ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼ及び６－オキソヘキサノエートオキシダーゼは、天然に存在しない１つ以上の微生物によって発現される。いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼ、６－ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼ及び６－オキソヘキサノエートオキシダーゼは、天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現される。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼ、６－ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼ及び６－オキソヘキサノエートオキシダーゼは、天然に存在しない２つ以上の微生物によって発現される。いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼ、６－ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼ及び６－オキソヘキサノエートオキシダーゼは、天然に存在しない２つ以上の微生物によって外因性に発現される。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼは、ＥＣ番号１．１．９９．６、ＥＣ番号１．１．１．１６９、ＥＣ番号１．１．１．２１５、ＥＣ番号１．１．１．２８またはＥＣ番号１．１．１．１１０で識別される酵素の群から選択されており、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼは、ＥＣ番号２．８．３、ＥＣ番号２．８．３．１またはＥＣ番号２．８．３．１２である酵素であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼは、ＥＣ番号４．２．１．１６７である酵素であり、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼは、ＥＣ番号１．３．１．４４である酵素であり、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼは、ＥＣ番号２．８．３、ＥＣ番号２．８．３．１またはＥＣ番号２．８．３．１２である酵素であり、６－ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．１．１．２５８である酵素であり、６－オキソヘキサノエートオキシダーゼは、ＥＣ番号１．２．１．６３である酵素である。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼは、ＵｎｉｐｒｏｔまたはＧｅｎＢａｎｋのＩＤ番号ＷＰ＿００３４３１４０７．１、ＢＡＬ５１２９２．１、Ｑ５ＦＴＵ６、ＡＫＣ６４０９４．１、ＷＰ＿００２８７６８６２．１、ＡＧＰ６９０１７．１、ＷＰ＿００３６４０７４１．１、ＡＫＣ６４０９で識別される酵素の群から選択した酵素であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｔ４ＶＷ９３またはＡ０Ａ２Ｘ３ＢＴＱ９で識別される酵素であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ５Ｕ９２４、Ｑ５Ｕ９２５及びＱ５Ｕ９２３、またはＡ０Ａ２Ｘ３ＢＫ０９、Ａ０Ａ２Ｘ３ＢＵ１９及びＡ０Ａ１Ｖ９ＩＸＡ９で識別される酵素であり、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ７３Ｑ４７で識別される酵素であり、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｔ４ＶＷ９３またはＡ０Ａ２Ｘ３ＢＴＱ９で識別される酵素であり、６－ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ７ＷＶＤ０またはＱ８４Ｈ７８で識別される酵素であり、６－オキソヘキサノエートオキシダーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ９Ｒ２Ｆ４で識別される酵素である。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼは、ＵｎｉｐｒｏｔまたはＧｅｎＢａｎｋのＩＤ番号ＷＰ＿００３４３１４０７．１、ＢＡＬ５１２９２．１、Ｑ５ＦＴＵ６、ＡＫＣ６４０９４．１、ＷＰ＿００２８７６８６２．１、ＡＧＰ６９０１７．１、ＷＰ＿００３６４０７４１．１、ＡＫＣ６４０９５．１及びＡＫＣ６４０９４．１で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｔ４ＶＷ９３またはＡ０Ａ２Ｘ３ＢＴＱ９で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ５Ｕ９２４、Ｑ５Ｕ９２５及びＱ５Ｕ９２３、またはＡ０Ａ２Ｘ３ＢＫ０９、Ａ０Ａ２Ｘ３ＢＵ１９及びＡ０Ａ１Ｖ９ＩＸＡ９で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ７３Ｑ４７で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｔ４ＶＷ９３またはＡ０Ａ２Ｘ３ＢＴＱ９で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、６－ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ７ＷＶＤ０またはＱ８４Ｈ７８で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、６－オキソヘキサノエートオキシダーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ９Ｒ２Ｆ４で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上である。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼは、配列番号５３、配列番号５４、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４または配列番号１０５の配列を含む酵素であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼは、配列番号５５または配列番号５８の配列を含む酵素であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼは、配列番号５９、配列番号６１及び配列番号６３、または配列番号６０、配列番号６２及び配列番号６４の配列を含む酵素であり、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼは、配列番号６５の配列を含む酵素であり、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼは、配列番号５５または配列番号５８の配列を含む酵素であり、６－ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼは、配列番号７１または配列番号７２の配列を含む酵素であり、６－オキソヘキサノエートオキシダーゼは、配列番号７５の配列を含む酵素である。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼは、配列番号５３、配列番号５４、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４または配列番号１０５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼは、配列番号５５または配列番号５８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼは、配列番号５９、配列番号６１及び配列番号６３、または配列番号６０、配列番号６２及び配列番号６４の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼは、配列番号６５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼは、配列番号５５または配列番号５８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、６－ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼは、配列番号７１及び配列番号７２の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、６－オキソヘキサノエートオキシダーゼは、配列番号７５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上である。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼ、６－ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼ及び６－オキソヘキサノエートオキシダーゼのうちの１つ以上はさらに、タンパク質タグを１つ以上含む。いくつかの実施形態では、そのタンパク質タグは、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ（グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグ）、ＨＡタグ（ヘマグルチニンタグ）、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、マルトース結合タンパク質タグ、キチン結合タンパク質タグ及び蛍光タグから選択されている。
いくつかの実施形態では、アジピン酸の生成方法はさらに、アジピン酸を、天然に存在しない１つ以上の微生物、または天然に存在しない１つ以上の微生物を含む培養液から分離することを含むか、またはそのことから本質的になる。いくつかの実施形態では、その方法はさらに、アジピン酸を、天然に存在しない２つ以上の微生物、または天然に存在しない２つ以上の微生物を含む培養液から分離することを含むか、またはそのことから本質的になる。
いくつかの実施形態では、ピルベートは、グリセロール、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、スクロース及びデンプンまたはこれらを組み合わせたものから選択した炭素源から生成させる。いくつかの実施形態では、
Figure 2022530467000014
 は、３－ヒドロキシプロパナールである。いくつかの実施形態では、３－ヒドロキシプロパナールは、天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現されるグリセロールデヒドラターゼ酵素による、グリセロールの脱水によって生成される。
別の態様では、本発明で提供するのは、アルドラーゼヒドラターゼ酵素をコードする第１の外因性核酸を含む組み換え微生物であって、さらに、キノンオキシドレダクターゼを、野生型または改変されていない同じ微生物よりも多い量で発現するように改変されており、任意に、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、クロストリジウム種またはＥ．ｃｏｌｉである組み換え微生物である。いくつかの実施形態では、その生物は、キノンオキシドレダクターゼをコードする第２の外因性核酸を含む。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の外因性核酸はさらに、第２の外因性核酸の発現を駆動する調節エレメントを含む。あるいは、第１及び第２の核酸は、同じプロモーター調節エレメントの制御下にある。いくつかの実施形態では、その調節エレメントは、プロモーターまたはエンハンサーから選択されている。いくつかの実施形態では、アルドラーゼヒドラターゼ酵素は、ＥＣ番号４．１．２．４５またはＥＣ番号４．１．２．３４またはＥＣ番号４．１．１．４である。いくつかの実施形態では、アルドラーゼヒドラターゼ酵素は、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｄ７Ｃ０Ｅ５、Ｐ０Ａ１４４、Ｑ７９ＥＭ８、Ａ０Ａ０Ｎ０ＡＨＩ８、Ａ０Ａ０Ｎ１ＦＲＹ３、Ｍ３ＤＹＲ１、Ｗ７ＳＵ４８、Ａ０Ａ２８６ＰＨ１８、Ｑ９Ｘ９Ｑ６、Ｑ９ＷＸＨ７、Ａ４ＸＤＳ１、Ｆ２Ｊ６Ｎ９、Ａ０Ａ０６３ＢＦＬ５、Ｑ９ＺＨＨ６、Ａ０Ａ０Ｃ１Ｋ８５３、ＷＰ＿０３４３９８４８２、ＰＹＫ１２１９１、ＷＰ＿１１５４７８０３３、ＷＰ＿０２８２２２２５３、ＷＰ＿０１３６５４８０７、ＷＰ＿０５９４０３０６０、ＷＰ＿０９２５０８５３０、ＷＰ＿１１６６４２６２７、ＷＰ＿００９７７０６５９、ＷＰ＿１０７８１８１９１、ＷＰ＿００３２９２０６１、ＰＹＮ４８８５５、ＷＰ＿１２２２１２９６５、ＷＰ＿０２８２１７２９７、ＷＰ＿０３４５０７０４９、ＫＭＫ６４０８１．１、ＷＰ＿０７００２８０４１．１またはＫＺＬ９２４４９．１で識別される酵素の群から選択した酵素である。いくつかの実施形態では、アルドラーゼヒドラターゼ酵素は、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｄ７Ｃ０Ｅ５、Ｐ０Ａ１４４、Ｑ７９ＥＭ８、Ａ０Ａ０Ｎ０ＡＨＩ８、Ａ０Ａ０Ｎ１ＦＲＹ３、Ｍ３ＤＹＲ１、Ｗ７ＳＵ４８、Ａ０Ａ２８６ＰＨ１８、Ｑ９Ｘ９Ｑ６、Ｑ９ＷＸＨ７、Ａ４ＸＤＳ１、Ｆ２Ｊ６Ｎ９、Ａ０Ａ０６３ＢＦＬ５、Ｑ９ＺＨＨ６、Ａ０Ａ０Ｃ１Ｋ８５３、ＷＰ＿０３４３９８４８２、ＰＹＫ１２１９１、Ａ０Ａ３７０Ｘ７Ｄ８、ＷＰ＿０２８２２２２５３、Ｆ２Ｊ６Ｌ６、Ａ０Ａ０Ｎ０Ｌ９Ｆ６、Ａ０Ａ１Ｇ９ＹＷＧ７、Ａ０Ａ２Ｕ１ＢＴ０９、Ａ０Ａ２４４ＤＨＥ８、ＷＰ＿１０７８１８１９１、Ａ０Ａ０２３ＷＺＦ９、ＰＹＮ４８８５５、Ａ０Ａ４２１ＰＡＱ６、ＷＰ＿０２８２１７２９７、ＷＰ＿０３４５０７０４９、ＫＭＫ６４０８１．１、ＷＰ＿０７００２８０４１．１またはＫＺＬ９２４４９．１で識別される酵素の群から選択した酵素である。いくつかの実施形態では、アルドラーゼヒドラターゼ酵素は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号８４、配列番号８５または配列番号８６の配列を含む酵素である。
いくつかの実施形態では、第１の外因性核酸及び第２の外因性核酸はそれぞれ、ベクター、例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクターに含まれている。いくつかの実施形態では、第１の外因性核酸及び第２の外因性核酸はそれぞれ、同じベクターに含まれている。いくつかの実施形態では、第１の外因性核酸及び第２の外因性核酸はそれぞれ、特有の別々のベクターに含まれている。いくつかの実施形態では、そのベクターは、プラスミドである。いくつかの実施形態では、キノンオキシドレダクターゼは、ＥＣ番号１．６．５である酵素である。いくつかの実施形態では、キノンオキシドレダクターゼは、ＥＣ番号１．６．５．５である酵素である。いくつかの実施形態では、キノンオキシドレダクターゼは、ＧｅｎＢａｎｋ、ＲｅｆＳｅｑまたはＵｎｉｐｒｏｔのＩＤ番号Ｐ２８３０４、Ｐ４０７８３、Ｑ０Ｋ２Ｉ０、Ａ０Ａ１Ｚ１ＳＲＹ９、Ｐ４３９０３、Ｉ７Ｇ８Ｇ０、またはＱ１４２Ｌ２、ＡＬＫ１９３２４．１、Ａ０Ａ１Ｇ９Ｒ４０８、Ｇ４Ｑ８Ｒ５、ＡＮＡ９８７２３．１、Ｋ０ＥＵＱ３、Ａ０Ａ０６１ＣＲＳ８、Ｑ９Ａ２１２、Ａ０Ａ１Ｉ６ＲＷＷ２、ＷＰ＿０２６１９７２７７．１、Ｑ５ＮＫＺ３、ＷＰ＿０１２３３３０３４．１またはＷＰ＿１３６８９８０００．１で識別される酵素の群から選択した酵素である。いくつかの実施形態では、キノンオキシドレダクターゼは、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７の配列を含む酵素である。いくつかの実施形態では、本発明の組み換え微生物は、下記の式の２－ケトカルボン酸を産生でき、
Figure 2022530467000015
式中、Ｒは、Ｈ、ＣＨ３またはＣＨ２ＯＨである。いくつかの実施形態では、本発明の組み換え微生物は、１，５－ペンタンジオール、１，６－ヘキサンジオール、アジピン酸または６－ヒドロキシヘキサノエートを産生できる。いくつかの実施形態では、本発明の組み換え微生物は、炭素源からのピルベートの生成を向上させるように、遺伝子が改変されている。いくつかの実施形態では、その炭素源は、グリセロール、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、スクロース及びデンプンまたはこれらを組み合わせたものから選択されている。
別の態様では、本発明で提供するのは、本明細書に開示されている組み換え微生物を含む培養液である。
別の態様では、本発明で提供するのは、本明細書に開示されているような組み換え微生物の集団である。いくつかの実施形態では、その集団は、実質的に均質である。
別の態様では、本発明で提供するのは、本明細書に開示されている集団を含む培養液である。
別の態様では、本発明で提供するのは、１，５－ペンタンジオール、１，６－ヘキサンジオール、アジピン酸または６－ヒドロキシヘキサノエートの生成方法であって、本明細書に開示されているような外因性核酸の発現を促進する適切な条件下で、本明細書に開示されているような集団または組み換え微生物を培養することを含む方法である。一態様では、その外因性核酸は、野生型または改変されていない同等の微生物と比べて、過剰発現する。いくつかの実施形態では、その方法はさらに、１，５－ペンタンジオール、１，６－ヘキサンジオール、アジピン酸または６－ヒドロキシヘキサノエートを、その培養液または微生物から単離することを含む。
実施例として、２－ケトカルボン酸をピルベート及びアルデヒドから生成するための、二酵素型の生合成経路を示している。アルドール脱水生成物（例えば、本明細書に記載されているアルドール縮合生成物）は、理論によって制限されることを意図しないが、図示されているような工程１及び２を通じて、単一の酵素（例えば、ヒドラターゼ－アルドラーゼ（いくつかの実施形態では、Ａｄｓ－Ｈｙｄと称する）のようなアルドール脱水生成物生合成ポリペプチド）によって触媒されるプロセスから生成できる。当業者には明らかであるように、例示されているアルドール縮合生成物の二重結合は、Ｅ型としても、またはＺ型としても存在してよい。多くの実施形態では、図示されているような工程３は、オキシドレダクターゼ、例えば、キノンの還元のためにＮＡＤＨ及び／またはＮＡＤＰＨを用いるＥＣ１．６．５（例えばＥＣ１．６．５．５）に属するオキシドレダクターゼによって触媒できる。本明細書に記載されているように、様々なアルデヒドを用いてよい。例えば、いくつかの実施形態において例示されているアルデヒドでは、Ｒは、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＯＨ、ＣＨ２ＯＨまたはＣＨ２ＣＨ２ＯＨである。 中間体６－ヒドロキシ－２－ケトヘキサノエート（６Ｈ２ＫＨ）を介して、１，５－ペンタンジオールを生成するための生合成経路を示している。本明細書で使用する場合、３ＨＰＡは３－ヒドロキシプロパナールを指し、６Ｈ４Ｈ２ＫＨは４，６－ジヒドロキシ－２－ケトヘキサノエートを指し、６Ｈ３（Ｅ）２ＫＨは６－ヒドロキシ－３，４－デヒドロ－２－ケトヘキセノエートを指し、５ＨＰｅＡは、５－ヒドロキシペンタナールを指す。図示されている目的においては、ＮＡＤＨは、この経路の還元工程の多くにおける補因子として示されている。ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨのいずれかが、補因子であることができる。 中間体６－ヒドロキシ－２－ケトヘキサノエート（６Ｈ２ＫＨ）を介して、１，６－ヘキサンジオールを生成するための生合成経路を示している。本明細書で使用する場合、３ＨＰＡは３－ヒドロキシプロパナールを指し、６Ｈ４Ｈ２ＫＨは４，６－ジヒドロキシ－２－ケトヘキサノエートを指し、６Ｈ３（Ｅ）２ＫＨは６－ヒドロキシ－３，４－デヒドロ－２－ケトヘキセノエートを指し、６Ｈ２ＨＨは２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを指し、６ＨＨ－ＣｏＡは６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを指し、６ＨＨは６－ヒドロキシヘキサノエートを指し、６Ｈ２ＨＨ－ＣｏＡは２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを指し、６ＨＨＡは６－ヒドロキシヘキサナールを指す。ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨのいずれかが、補因子であることができる。工程５及び８は、単一のＣｏＡトランスフェラーゼ酵素によって触媒される。図示されている目的においては、６ＨＨ－ＣｏＡは、工程５の反応の供与体として、６Ｈ２ＨＨは受容体として示されている。ｉｎ ｖｉｖｏにおいては、他のＣｏＡエステルまたはカルボン酸も、この酵素の供与体及び受容体として機能することができる。 中間体６－ヒドロキシ－２－ケトヘキサノエート（６Ｈ２ＫＨ）を介して、６－ヒドロキシヘキサノエートを生成するための生合成経路を示している。本明細書で使用する場合、３ＨＰＡは３－ヒドロキシプロパナールを指し、６Ｈ４Ｈ２ＫＨは４，６－ジヒドロキシ－２－ケトヘキサノエートを指し、６Ｈ３（Ｅ）２ＫＨは６－ヒドロキシ－３，４－デヒドロ－２－ケトヘキセノエートを指し、６Ｈ２ＨＨは２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを指し、６ＨＨ－ＣｏＡは６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを指し、６ＨＨは６－ヒドロキシヘキサノエートを指し、６Ｈ２ＨＨ－ＣｏＡは２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを指す。ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨのいずれかが、補因子であることができる。工程５及び８は、単一のＣｏＡトランスフェラーゼ酵素によって触媒される。例示されている目的においては、６ＨＨ－ＣｏＡは、工程５の反応の供与体として、６Ｈ２ＨＨは受容体として示されている。ｉｎ ｖｉｖｏにおいては、他のＣｏＡエステルまたはカルボン酸も、この酵素の供与体及び受容体として機能することができる。 中間体６－ヒドロキシ－２－ケトヘキサノエート（６Ｈ２ＫＨ）を介して、アジピン酸を生成するための生合成経路を示している。本明細書で使用する場合、３ＨＰＡは３－ヒドロキシプロパナールを指し、６Ｈ４Ｈ２ＫＨは４，６－ジヒドロキシ－２－ケトヘキサノエートを指し、６Ｈ３（Ｅ）２ＫＨは６－ヒドロキシ－３，４－デヒドロ－２－ケトヘキセノエートを指し、６Ｈ２ＨＨは２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを指し、６ＨＨ－ＣｏＡは６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを指し、６ＨＨは６－ヒドロキシヘキサノエートを指し、６Ｈ２ＨＨ－ＣｏＡは２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを指し、６ＫＨＡは６－オキソヘキサノエートを指す。ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨのいずれかが、補因子であることができる。工程５及び８は、単一のＣｏＡトランスフェラーゼ酵素によって触媒される。例示されている目的においては、６ＨＨ－ＣｏＡは、工程５の反応の供与体として、６Ｈ２ＨＨは受容体として示されている。ｉｎ ｖｉｖｏにおいては、他のＣｏＡエステルまたはカルボン酸も、この酵素の供与体及び受容体として機能することができる。 補因子ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨを用いて、６－ヒドロキシ－３，４－デヒドロ－２－ケトヘキセノエートを還元して、６－ヒドロキシ－２－ケトヘキセノエートにした際のキノンオキシドレダクターゼ－１（Ｑｏｒ－１）の活性を示している。
定義
本明細書で使用する場合、特定の用語は、下記の定義された意味である場合がある。本明細書で使用する場合、文脈上明らかに別段に示されている場合を除き、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という単数形には、単数の言及物及び複数の言及物が含まれる。
本明細書で使用する場合、「含む」という用語は、その組成物及び方法に、列挙された要素が含まれるが、他の要素が除外されないことを意味するように意図されている。「～から本質的になる」は、組成物及び方法を定義する目的で使用する際には、その組成物または方法において、何らかの本質的な意義のある他の要素が除外されることを意味するものとする。「～からなる」とは、特許請求されている組成物のための微量要素を超える他の成分、及び実質的な方法ステップを超えるものを除外することを意味するものとする。これらの移行句用語のそれぞれによって定義される態様は、本開示の範囲内である。すなわち、その方法及び組成物は、追加の工程及び構成要素を含むことができる（含む）か、あるいは、有意義ではない工程及び組成物を含むことができる（～から本質的になる）か、あるいは、示されている方法ステップまたは組成物のみを意図する（～からなる）ことが意図されている。
本明細書で使用する場合、「アルドール脱水生成物生合成ポリペプチド」という用語は、本明細書に記載されているようなアルドール脱水生成物の合成に関与するポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、アルドール脱水生成物生合成ポリペプチドは、本明細書に記載されているようなアルドラーゼポリペプチド、ヒドラターゼ、ヒドラターゼ－アルドラーゼポリペプチド（例えばヒドラターゼ－アルドラーゼ）であってもよいし、またはこれらを含んでもよい。いくつかの実施形態では、アルドール脱水生成物生合成ポリペプチドは、本明細書に記載されているようなヒドラターゼ－アルドラーゼポリペプチド（例えばヒドラターゼ－アルドラーゼ）であってもよいし、またはそれを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本発明のアルドール脱水生成物生合成ポリペプチドは、天然において、例えば微生物において（例えば、天然において見られる参照アルドール脱水生合成ポリペプチドにおいて）見られるアミノ酸配列を有する。上記の代わりにまたは上記に加えて、いくつかの実施形態では、アルドール脱水生合成ポリペプチドは、適切な参照アルドール脱水生合成ポリペプチド（例えば、天然において見られるようなもの、及び／または本明細書（例えば、関連する表（例えば表１及び５～８）のうちの１つ以上）に示されているようなもの）、あるいはその一部分（例えば、関連する反応を促進する部分（例えば、ドメイン（例えば、関連する触媒ドメイン）及び／または一連のアミノ酸残基（連続する残基であることも、または離れた残基であることもできる）））と、特徴的な配列エレメント及び／または全体の同一性パーセントを共有する。
本明細書で使用する場合、「アルドール脱水生成物」とは、アルデヒド基またはケトン基と、そのアルデヒド基またはケトン基と共役した二重結合を含む化合物を指す。いくつかの実施形態では、アルドール脱水生成物は、式Ｐ－２の化合物またはその塩である。
本明細書で使用する場合、「アルドール生成物」という用語は、アルデヒド基またはケトン基と、アルデヒド基またはケトンカルボニル基のβ－炭素に結合したヒドロキシル基を含む化合物を指す。いくつかの実施形態では、アルドール生成物は、アルドール反応の生成物である。いくつかの実施形態では、アルドール生成物は、式Ｐ－１またはその塩の構造を有する。
本明細書で使用する場合、「アルドール生成物生合成ポリペプチド」という用語は、本明細書に記載されているようなアルドール生成物の合成に関与するポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、アルドール生成物生合成ポリペプチドは、本明細書に記載されているようなアルドラーゼポリペプチド、ヒドラターゼ－アルドラーゼポリペプチド（例えばヒドラターゼ－アルドラーゼ）であってもよいし、またはこれらを含んでもよい。いくつかの実施形態では、アルドール生成物生合成ポリペプチドは、本明細書に記載されているようなアルドラーゼポリペプチドであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、アルドール生成物生合成ポリペプチドは、天然において、例えば、微生物において（例えば、天然において見られる参照アルドール生合成ポリペプチドにおいて）見られるアミノ酸配列を有する。上記の代わりにまたは上記に加えて、いくつかの実施形態では、アルドール生合成ポリペプチドは、適切な参照アルドール生合成ポリペプチド（例えば、天然において見られるようなもの、及び／または本明細書（例えば、関連する表のうちの１つ以上）に示されているようなもの）、あるいはその一部分（例えば、関連する反応を促進する部分（例えば、ドメイン（例えば、関連する触媒ドメイン）及び／または一連のアミノ酸残基（連続する残基であることも、または離れた残基であることもできる）））と、特徴的な配列エレメント及び／または全体の同一性パーセントを共有する。
本明細書で使用する場合、「アルケン還元生成物生合成ポリペプチド」という用語は、本明細書に記載されているような、二重結合の単結合への変換（及びアルケン還元生成物の形成）に関与するポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、アルケン還元生成物生合成ポリペプチドは、本明細書に記載されているようなキノンオキシドレダクターゼであってもよいし、またはそれを含んでもよい。いくつかの実施形態では、アルケン還元生成物生合成ポリペプチドは、天然において、例えば、微生物において（例えば、天然において見られる参照アルケン還元生合成ポリペプチドにおいて）見られるアミノ酸配列を有する。上記の代わりにまたは上記に加えて、いくつかの実施形態では、アルドール生合成ポリペプチドは、適切な参照アルドール生合成ポリペプチド（例えば、天然において見られるようなもの、及び／または本明細書（例えば、関連する表のうちの１つ以上）に示されているようなもの）、あるいはその一部分（例えば、関連する反応を促進する部分（例えば、ドメイン（例えば、関連する触媒ドメイン）及び／または一連のアミノ酸残基（連続する残基であることも、または離れた残基であることもできる）））と、特徴的な配列エレメント及び／または全体の同一性パーセントを共有する。
本明細書で使用する場合、「脂肪族」という用語は、完全飽和であるか、もしくは不飽和単位を１つ以上含む直鎖（すなわち非分岐鎖）もしくは分岐鎖の置換もしくは非置換の炭化水素鎖、または完全飽和であるか、もしくは不飽和単位を１つ以上含む置換もしくは非置換の単環、二環もしくは多環の炭化水素環（ただし、芳香族ではないもの）、あるいはこれらを組み合わせたものを意味する。いくつかの実施形態では、脂肪族基は、１～５０個の脂肪族炭素原子を含む。いくつかの実施形態では、脂肪族基は、１～２０個の脂肪族炭素原子を含む。別の実施形態では、脂肪族基は、１～１０個の脂肪族炭素原子を含む。別の実施形態では、脂肪族基は、１～９個の脂肪族炭素原子を含む。別の実施形態では、脂肪族基は、１～８個の脂肪族炭素原子を含む。別の実施形態では、脂肪族基は、１～７個の脂肪族炭素原子を含む。別の実施形態では、脂肪族基は、１～６個の脂肪族炭素原子を含む。さらに別の実施形態では、脂肪族基は、１～５個の脂肪族炭素原子を含み、さらに別の実施形態では、脂肪族基は、１個、２個、３個または４個の脂肪族炭素原子を含む。適切な脂肪族基としては、直鎖または分岐鎖の置換または非置換のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びこれらのハイブリッド（（シクロアルキル）アルキル、（シクロアルケニル）アルキルまたは（シクロアルキル）アルケニルなど）が挙げられるが、これらに限らない。
本明細書で使用する場合、「アルキル」という用語には、当該技術分野におけるその通常の意味が付与され、アルキルとしては、直鎖アルキル基、分岐鎖アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル基及びシクロアルキル置換アルキル基を含む飽和脂肪族基を挙げてよい。いくつかの実施形態では、アルキルは、１～１００個の炭素原子を含む。特定の実施形態では、直鎖または分岐鎖アルキルは、その主鎖に、炭素原子を約１～２０個有し（例えば、直鎖では、Ｃ１－Ｃ２０、分岐鎖ではＣ２－Ｃ２０）、あるいは約１～１０個有する。いくつかの実施形態では、シクロアルキル環は、その環構造（その環は、単環、二環または多環である）に、炭素原子を約３～１０個有し、あるいは、環構造に、炭素を約５個、６個または７個有する。いくつかの実施形態では、アルキル基は、低級アルキル基であってよく、その低級アルキル基は、炭素原子を１～４個含む（例えば、直鎖低級アルキルでは、Ｃ１－Ｃ４）。
本明細書で使用する場合、単独で用いられるか、または「アラルキル」、「アラルコキシ」もしくは「アリールオキシアルキル」におけるように、より大きい部分の一部として用いられる「アリール」という用語は、環員を合わせて５～３０個有する単環系、二環系または多環系であって、その系の少なくとも１つの環が、芳香族である環系を指す。いくつかの実施形態では、アリール基は、環員を合わせて５～１４個有する単環系、二環系または多環系であって、その系の少なくとも１つの環が、芳香族であり、その系の各環が、環員を３～７個含む環系である。いくつかの実施形態では、アリール基は、ビアリール基である。「アリール」という用語は、「アリール環」という用語と同義的に用いてよい。本開示の特定の実施形態では、「アリール」とは、芳香族環系（フェニル、ビフェニル、ナフチル、ビナフチル、アントラシルなどが挙げられるが、これらに限らない）を指し、この環系は、置換基を１つ以上有してもよい。「アリール」という用語の範囲内には、本明細書で使用されているように、インダニル、フタルイミジル、ナフトイミジル、フェナントリジニルまたはテトラヒドロナフチルなど、芳香族環が１つ以上の非芳香族環に縮合している基も含まれる。
本明細書で使用する場合、「脂環式」、「炭素環」、「カルボシクリル」、「炭素環式ラジカル」及び「炭素環式環」という用語は、同義的に用いられており、別段の定めのない限り、環員を３～３０個有する、本明細書に記載されているような飽和または部分不飽和の非芳香族の環状脂肪族単環系、二環系または多環系を指す。脂環式基としては、以下に限らないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、シクロヘプテニル、シクロオクチル、シクロオクテニル、ノルボルニル、アダマンチル及びシクロオクタジエニルが挙げられる。いくつかの実施形態では、脂環式基は、炭素を３～６個有する。いくつかの実施形態では、脂環式基は、飽和であり、シクロアルキルである。「脂環式」という用語には、デカヒドロナフチルまたはテトラヒドロナフチルのように、１つ以上の芳香族環または非芳香族環に縮合している脂肪族環も含めてよい。いくつかの実施形態では、脂環式基は、二環である。いくつかの実施形態では、脂環式基は、三環である。いくつかの実施形態では、脂環式基は、多環である。いくつかの実施形態では、「脂環式」とは、完全飽和であるか、または不飽和単位を１つ以上含むＣ３－Ｃ６単環炭化水素、またはＣ８－Ｃ１０二環もしくは多環炭化水素であって、芳香族ではなく、分子の残部への結合位置を１つ有する炭化水素、あるいは、完全飽和であるか、または不飽和単位を１つ以上含むＣ９－Ｃ１６多環炭化水素であって、芳香族ではなく、分子の残部への結合位置を１つ有する多環炭化水素を指す。
本明細書で使用する場合、「ヘテロ脂肪族」という用語には、当該技術分野におけるその通常の意味が付与され、本明細書に記載されているような脂肪族基のうち、１つ以上の炭素原子が独立して、１つ以上のヘテロ原子（例えば、酸素、窒素、硫黄、ケイ素、リンなど）に置き換えられている脂肪族基を指す。いくつかの実施形態では、Ｃ、ＣＨ、ＣＨ２及びＣＨ３から選択した１つ以上の単位が独立して、１つ以上のヘテロ原子（その酸化形態及び／または置換形態を含む）によって置き換えられている。いくつかの実施形態では、ヘテロ脂肪族基は、ヘテロアルキルである。いくつかの実施形態では、ヘテロ脂肪族基は、ヘテロアルケニルである。
本明細書で使用する場合、「ヘテロアルキル」という用語には、当該技術分野におけるその通常の意味が付与され、本明細書に記載されているようなアルキル基のうち、１つ以上の炭素原子が独立して、１つ以上のヘテロ原子（例えば、酸素、窒素、硫黄、ケイ素、リンなど）に置き換えられているアルキル基を指す。ヘテロアルキル基の例としては、アルコキシ、ポリ（エチレングリコール）－、アルキル置換アミノ、テトラヒドロフラニル、ピペリジニル、モルホリニルなどが挙げられるが、これらに限らない。
本明細書で使用する場合、単独で用いられるか、またはより大きい部分、例えば、「ヘテロアラルキル」または「ヘテロアラルコキシ」の一部として用いられる「ヘテロアリール」及び「ヘテロアル－」という用語は、環員を合わせて５～３０個有する単環系、二環系または多環系であって、その系の少なくとも１つの環が、芳香族であり、少なくとも１つの芳香族環原子が、ヘテロ原子である環系を指す。いくつかの実施形態では、ヘテロアリール基は、環原子を５～１０個有する基（すなわち、単環、二環または多環）であり、いくつかの実施形態では、環原子を５個、６個、９個または１０個有する基である。いくつかの実施形態では、ヘテロアリール基は、環状の配列で共有されたπ電子を６個、１０個または１４個有し、炭素原子に加えて、ヘテロ原子を１～５個有する。ヘテロアリール基としては、以下に限らないが、チエニル、フラニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニル及びプテリジニルが挙げられる。いくつかの実施形態では、ヘテロアリールは、ビピリジルなどのようなヘテロビアリール基である。本明細書で使用する場合、「ヘテロアリール」及び「ヘテロアル－」という用語には、ヘテロ芳香族環が、１つ以上のアリール、脂環式環またはヘテロシクリル環に縮合している基であって、そのラジカルまたは結合位置が、そのヘテロ芳香族環上にある基も含まれる。非限定的な例としては、インドリル、イソインドリル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、ジベンゾフラニル、インダゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、４Ｈ－キノリジニル、カルバゾリル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル及びピリド［２，３－ｂ］－１，４－オキサジン－３（４Ｈ）－オンが挙げられる。ヘテロアリール基は、単環、二環または多環であってよい。「ヘテロアリール」という用語は、「ヘテロアリール環」、「ヘテロアリール基」または「ヘテロ芳香族」という用語と同義的に用いてよく、これらのいずれの用語も、任意に置換されている環を含む。「ヘテロアラルキル」という用語は、ヘテロアリール基によって置換されたアルキル基を指し、そのアルキル部分及びヘテロアリール部分は独立して、任意に置換されている。
本明細書で使用する場合、「ヘテロ原子」という用語は、炭素でも水素でもない原子を指す。いくつかの実施形態では、ヘテロ原子は、ホウ素、酸素、硫黄、窒素、リンまたはケイ素（酸化形態の窒素、硫黄、リンまたはケイ素、荷電形態の窒素（例えば、４級化形態、イミニウム基におけるような形態などを含む）、リン、硫黄、酸素など）である。いくつかの実施形態では、ヘテロ原子は、酸素、硫黄または窒素である。
本明細書で使用する場合、「複素環」、「ヘテロシクリル」、「複素環式ラジカル」及び「ヘテロ環」という用語は、本明細書で使用する場合、同義的に用いられており、飽和または部分不飽和であるとともに、ヘテロ原子環原子を１つ以上有する単環部分、二環部分または多環部分（例えば、３～３０員）を指す。いくつかの実施形態では、ヘテロシクリル基は、飽和または部分不飽和のいずれかであるとともに、炭素原子に加えて、上で定義したようなヘテロ原子を１つ以上、好ましくは１～４個有する安定な５～７員の単環または７～１０員の二環の複素環式部分である。複素環の環原子に関して用いられている場合には、「窒素」という用語には、置換された窒素が含まれる。例として、酸素、硫黄及び窒素から選択したヘテロ原子を０～３個有する飽和または部分不飽和の環では、その窒素は、Ｎ（３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ピロリルにおけるようなもの）、ＮＨ（ピロリジニルにおけるようなもの）、または＋ＮＲ（Ｎ置換ピロリジニルにおけるようなもの）であってよい。ヘテロ環は、そのペンダント基に、安定構造をもたらすいずれかのヘテロ原子または炭素原子で結合でき、その環原子のいずれも、任意に置換されていることができる。このような飽和または部分不飽和の複素環式ラジカルの例としては、以下に限らないが、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピロリニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オキサゾリジニル、ピペラジニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、ジアゼピニル、オキサゼピニル、チアゼピニル、モルホリニル及びキヌクリジニルが挙げられる。「複素環」、「ヘテロシクリル」、「ヘテロシクリル環」、「複素環式基」、「複素環式部分」及び「複素環式ラジカル」という用語は、本明細書では同義的に用いられており、これらの用語には、ヘテロシクリル環が、１つ以上のアリール、ヘテロアリールまたは脂環式環に縮合している基（インドリニル、３Ｈ－インドリル、クロマニル、フェナントリジニルまたはテトラヒドロキノリニルなど）も含まれる。ヘテロシクリル基は、単環、二環または多環であってよい。「ヘテロシクリルアルキル」という用語は、ヘテロシクリルによって置換されたアルキル基を指し、そのアルキル部分及びヘテロシクリル部分は独立して、任意に置換されている。
任意に置換された：本明細書に記載されているように、化学物質、例えば、本開示の各種化合物は、任意に置換された部分及び／または置換された部分を含んでよい。概して、「置換された」という用語は、示されている部分の水素の１つ以上が、適切な置換基に置き換えられていることを意味する。別段に示されていない限り、「任意に置換された」基は、その基の置換可能なそれぞれの位置に、適切な置換基を有してよく、いずれかの所定の構造における２つ以上の位置を、所定の基から選択した２つ以上の置換基で置換し得る場合には、その置換基は、すべての位置において、同じであっても異なってもよい。いくつかの実施形態では、任意に置換された基は、置換されている。いくつかの実施形態では、任意に置換された基は、非置換である。本開示によって想定される置換基の組み合わせは好ましくは、安定な化合物または化学的に実現可能な化合物を形成させるものである。「安定な」という用語は、本明細書で使用する場合、その化合物の生成、検出、ならびに特定の実施形態では、その化合物の回収、精製、及び本明細書に開示されている目的のうちの１つ以上のための使用を可能にする条件に供したときに、実質的に変化しない化合物を指す。特定の置換基は、下に説明されている。
置換可能な原子、例えば適切な炭素原子上の適切な１価の置換基は独立して、ハロゲン、－（ＣＨ２）０－４Ｒ°、－（ＣＨ２）０－４ＯＲ°、－Ｏ（ＣＨ２）０－４Ｒｏ、－Ｏ－（ＣＨ２）０－４Ｃ（Ｏ）ＯＲ°、－（ＣＨ２）０－４ＣＨ（ＯＲ°）２、－（ＣＨ２）０－４Ｐｈ（Ｒ°で置換されていてもよい）、－（ＣＨ２）０－４Ｏ（ＣＨ２）０－１Ｐｈ（Ｒ°で置換されていてもよい）、－ＣＨ＝ＣＨＰｈ（Ｒ°で置換されていてもよい）、－（ＣＨ２）０－４Ｏ（ＣＨ２）０－１－ピリジル（Ｒ°で置換されていてもよい）、－ＮＯ２、－ＣＮ、－Ｎ３、－（ＣＨ２）０－４Ｎ（Ｒ°）２、－（ＣＨ２）０－４Ｎ（Ｒ°）Ｃ（Ｏ）Ｒ°、－Ｎ（Ｒ°）Ｃ（Ｓ）Ｒ°、－（ＣＨ２）０－４Ｎ（Ｒ°）Ｃ（Ｏ）ＮＲ°２、－Ｎ（Ｒ°）Ｃ（Ｓ）ＮＲ°２、－（ＣＨ２）０－４Ｎ（Ｒ°）Ｃ（Ｏ）ＯＲ°、－Ｎ（Ｒ°）Ｎ（Ｒ°）Ｃ（Ｏ）Ｒ°、－Ｎ（Ｒ°）Ｎ（Ｒ°）Ｃ（Ｏ）ＮＲ°２、－Ｎ（Ｒ°）Ｎ（Ｒ°）Ｃ（Ｏ）ＯＲ°、－（ＣＨ２）０－４Ｃ（Ｏ）Ｒ°、－Ｃ（Ｓ）Ｒ°、－（ＣＨ２）０－４Ｃ（Ｏ）ＯＲ°、－（ＣＨ２）０－４Ｃ（Ｏ）ＳＲ°、－（ＣＨ２）０－４Ｃ（Ｏ）ＯＳｉＲ°３、－（ＣＨ２）０－４ＯＣ（Ｏ）Ｒ°、－ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ２）０－４ＳＲ°、－ＳＣ（Ｓ）ＳＲ°、－（ＣＨ２）０－４ＳＣ（Ｏ）Ｒ°、－（ＣＨ２）０－４Ｃ（Ｏ）ＮＲ°２、－Ｃ（Ｓ）ＮＲ°２、－Ｃ（Ｓ）ＳＲ°、－（ＣＨ２）０－４ＯＣ（Ｏ）ＮＲ°２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＯＲ°）Ｒ°、－Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ°、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ°、－Ｃ（ＮＯＲ°）Ｒ°、－（ＣＨ２）０－４ＳＳＲ°、－（ＣＨ２）０－４Ｓ（Ｏ）２Ｒ°、－（ＣＨ２）０－４Ｓ（Ｏ）２ＯＲ°、－（ＣＨ２）０－４ＯＳ（Ｏ）２Ｒ°、－Ｓ（Ｏ）２ＮＲ°２、－（ＣＨ２）０－４Ｓ（Ｏ）Ｒ°、－Ｎ（Ｒ°）Ｓ（Ｏ）２ＮＲ°２、－Ｎ（Ｒ°）Ｓ（Ｏ）２Ｒ°、－Ｎ（ＯＲ°）Ｒ°、－Ｃ（ＮＨ）ＮＲ°２、－Ｓｉ（Ｒ°）３、－ＯＳｉ（Ｒ°）３、－Ｂ（Ｒ°）２、－ＯＢ（Ｒ°）２、－ＯＢ（ＯＲ°）２、－Ｐ（Ｒ°）２、－Ｐ（ＯＲ°）２、－Ｐ（Ｒ°）（ＯＲ°）、－ＯＰ（Ｒ°）２、－ＯＰ（ＯＲ°）２、－ＯＰ（Ｒ°）（ＯＲ°）、－Ｐ（Ｏ）（Ｒ°）２、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ°）２、－ＯＰ（Ｏ）（Ｒ°）２、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ°）２、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ°）（ＳＲ°）、－ＳＰ（Ｏ）（Ｒ°）２、－ＳＰ（Ｏ）（ＯＲ°）２、－Ｎ（Ｒ°）Ｐ（Ｏ）（Ｒ°）２、－Ｎ（Ｒ°）Ｐ（Ｏ）（ＯＲ°）２、－Ｐ（Ｒ°）２［Ｂ（Ｒ°）３］、－Ｐ（ＯＲ°）２［Ｂ（Ｒ°）３］、－ＯＰ（Ｒ°）２［Ｂ（Ｒ°）３］、－ＯＰ（ＯＲ°）２［Ｂ（Ｒ°）３］、－（Ｃ１－４直鎖もしくは分岐鎖のアルキレン）Ｏ－Ｎ（Ｒ°）２、または－（Ｃ１－４直鎖もしくは分岐鎖のアルキレン）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｎ（Ｒ°）２であり、式中、各Ｒ°は、本明細書で定義されているように置換されていてよく、独立して、水素、Ｃ１－２０脂肪族、独立して窒素、酸素、硫黄、ケイ素及びリンから選択したヘテロ原子を１～５個有するＣ１－２０ヘテロ脂肪族基、－ＣＨ２－（Ｃ６－１４アリール）、－Ｏ（ＣＨ２）０－１（Ｃ６－１４アリール）、－ＣＨ２－（５～１４員のヘテロアリール環）、独立して窒素、酸素、硫黄、ケイ素及びリンから選択したヘテロ原子を０～５個有する、５～２０員の単環、二環もしくは多環の飽和、部分不飽和またはアリールの環であり、あるいは、上記の定義にかかわらず、独立して存在する２つのＲ°は、それらの介在する原子（複数可）と一体となって、独立して窒素、酸素、硫黄、ケイ素及びリンから選択したヘテロ原子を０～５個有する５～２０員の単環、二環または多環の飽和、部分不飽和またはアリールの環を形成し、この環は、下に定義されているように置換されていてよい。
Ｒ°（または独立して存在する２つのＲ°が、それらの介在する原子と一体となることによって形成される環）上の適切な１価の置換基は独立して、ハロゲン、－（ＣＨ２）０－２Ｒ●、－（ハロＲ●）、－（ＣＨ２）０－２ＯＨ、－（ＣＨ２）０－２ＯＲ●、－（ＣＨ２）０－２ＣＨ（ＯＲ●）２、－Ｏ（ハロＲ●）、－ＣＮ、－Ｎ３、－（ＣＨ２）０－２Ｃ（Ｏ）Ｒ●、－（ＣＨ２）０－２Ｃ（Ｏ）ＯＨ、－（ＣＨ２）０－２Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、－（ＣＨ２）０－２ＳＲ●、－（ＣＨ２）０－２ＳＨ、－（ＣＨ２）０－２ＮＨ２、－（ＣＨ２）０－２ＮＨＲ●、－（ＣＨ２）０－２ＮＲ● ２、－ＮＯ２、－ＳｉＲ● ３、－ＯＳｉＲ● ３、－Ｃ（Ｏ）ＳＲ●、－（Ｃ１－４直鎖もしくは分岐鎖のアルキレン）Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、または－ＳＳＲ●であり、式中、各Ｒ●は、非置換であるか、または「ハロ」が前にある場合には、１つ以上のハロゲンのみで置換されており、独立して、Ｃ１－４脂肪族基、－ＣＨ２Ｐｈ、－Ｏ（ＣＨ２）０－１Ｐｈ、ならびに独立して窒素、酸素及び硫黄から選択したヘテロ原子を０～４個有する５～６員の飽和、部分不飽和またはアリールの環から選択されている。Ｒ°の飽和炭素原子上の適切な２価の置換基としては、＝Ｏ及び＝Ｓが挙げられる。
例えば、適切な炭素原子上の適切な２価の置換基は独立して、＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＮＲ＊ ２、＝ＮＮＨＣ（Ｏ）Ｒ＊、＝ＮＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ＊、＝ＮＮＨＳ（Ｏ）２Ｒ＊、＝ＮＲ＊、＝ＮＯＲ＊、－Ｏ（Ｃ（Ｒ＊ ２））２－３Ｏ－または－Ｓ（Ｃ（Ｒ＊ ２））２－３Ｓ－であり、式中、それぞれの独立して存在するＲ＊は、水素、Ｃ１－６脂肪族基（下に定義されているように置換されていてよい）、ならびに独立して窒素、酸素及び硫黄から選択したヘテロ原子を０～４個有する非置換の５～６員の飽和、部分不飽和またはアリールの環から選択されている。「任意に置換された」基の置換可能な隣接する炭素に結合する適切な２価の置換基としては、－Ｏ（ＣＲ＊ ２）２－３Ｏ－が挙げられ、式中、それぞれの独立して存在するＲ＊は、水素、Ｃ１－６脂肪族基（下に定義されているように置換されていてよい）、ならびに独立して窒素、酸素及び硫黄から選択したヘテロ原子を０～４個有する非置換の５～６員の飽和、部分不飽和及びアリールの環から選択されている。
Ｒ＊の脂肪族基上の適切な置換基は独立して、ハロゲン、－Ｒ●、－（ハロＲ●）、－ＯＨ、－ＯＲ●、－Ｏ（ハロＲ●）、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、－ＮＨ２、－ＮＨＲ●、－ＮＲ● ２または－ＮＯ２であり、式中、各Ｒ●は、非置換であるか、または「ハロ」が前にある場合には、１つ以上のハロゲンでのみ置換されており、独立して、Ｃ１－４脂肪族基、－ＣＨ２Ｐｈ、－Ｏ（ＣＨ２）０－１Ｐｈ、または独立して窒素、酸素及び硫黄から選択したヘテロ原子を０～４個有する５～６員の飽和、部分不飽和もしくはアリールの環である。
いくつかの実施形態では、置換可能な窒素上の適切な置換基は独立して、－Ｒ†、－ＮＲ† ２、－Ｃ（Ｏ）Ｒ†、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ†、－Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ†、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ†、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ†、－Ｓ（Ｏ）２ＮＲ† ２、－Ｃ（Ｓ）ＮＲ† ２、－Ｃ（ＮＨ）ＮＲ† ２または－Ｎ（Ｒ†）Ｓ（Ｏ）２Ｒ†であり、式中、各Ｒ†は独立して、水素、Ｃ１－６脂肪族基（下に定義されているように置換されていてよい）、非置換の－ＯＰｈ、または独立して窒素、酸素及び硫黄から選択したヘテロ原子を０～４個有する非置換の５－６員の飽和、部分不飽和もしくはアリールの環であり、あるいは上記の定義にかかわらず、独立して存在する２つのＲ†は、それらの介在する原子（複数可）と一体となって、独立して窒素、酸素及び硫黄から選択したヘテロ原子を０～４個有する非置換の３～１２員の飽和、部分不飽和またはアリールの単環または二環を形成する。
Ｒ†の脂肪族基上の適切な置換基は独立して、ハロゲン、－Ｒ●、－（ハロＲ●）、－ＯＨ、－ＯＲ●、－Ｏ（ハロＲ●）、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、－ＮＨ２、－ＮＨＲ●、－ＮＲ● ２または－ＮＯ２であり、式中、各Ｒ●は、非置換であるか、または「ハロ」が前にある場合には、１つ以上のハロゲンでのみ置換されており、独立して、Ｃ１－４脂肪族基、－ＣＨ２Ｐｈ、－Ｏ（ＣＨ２）０－１Ｐｈ、または独立して窒素、酸素及び硫黄から選択したヘテロ原子を０～４個有する５～６員の飽和、部分不飽和またはアリールの環である。
本明細書で使用する場合、「部分不飽和」という用語は、二重結合または三重結合を少なくとも１つ含む環部分を指す。「部分不飽和」という用語には、不飽和の部位を複数有する環を含めるように意図されているが、本明細書で定義されているようなアリール部分またはヘテロアリール部分を含めるようには意図されていない。
「野生型」は、天然において存在するとおりの細胞、組成物、組織またはその他の生体物質を定義するものである。
いくつかの実施形態では、３－ヒドロキシプロパナール及びピルベートは、グリセロール、Ｃ５糖、Ｃ６糖、ホスホグリセレート、その他の炭素源、解糖経路の中間体、及びこれらを組み合わせたもののうちの１つ以上から調製させる。いくつかの実施形態では、Ｃ５糖は、キシロース、キシルロース、リブロース、アラビノース、リキソース及びリボースのうちの１つ以上を含むか、あるいは、これらのうちの１つ以上から本質的になるか、またはさらには、これらのうちの１つ以上からなり、Ｃ６糖は、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、タロース、フルクトース、プシコース、ソルボース及びタガトースを含むか、あるいは、これらから本質的になるか、またはさらには、これらからなる。いくつかの実施形態では、上記のその他の炭素源は、微生物の炭素源として適切な原材料であり、その原材料は、アミノ酸、脂質、コーンストーバー、ミスカンサス、都市ゴミ、エネルギー原料用サトウキビ、砂糖用サトウキビ、バガス、デンプン流、デキストロース流、フォーメート、メタノール及びこれらを組み合わせたもののうちの１つ以上を含むか、あるいは、これらのうちの１つ以上から本質的になるか、またはさらには、これらのうちの１つ以上からなる。
本明細書で使用する場合、「Ｃ５糖」という用語は、炭素を５個含む糖分子を指す。
本明細書で使用する場合、「Ｃ６糖」という用語は、炭素を６個含む糖分子を指す。
いくつかの実施形態では、「アルドール付加」という用語は、ピルベート分子が、ＣＮアルデヒドのアルデヒド官能基と反応する対応するエノールイオンもしくはエノラートイオン、またはシッフ塩基もしくはエナミンを形成して、中間体ＣＮ＋３４－ヒドロキシ－２－ケトカルボン酸を生成させる化学反応を指す。いくつかの実施形態では、ＣＮアルデヒドは、３－ヒドロキシプロパナールであり、中間体ＣＮ＋３４－ヒドロキシ－２－ケトカルボン酸は、４，６－ジヒドロキシ－２－ケトヘキサン酸である。
いくつかの実施形態では、「アルドール縮合」という用語は、ピルベート分子が、ＣＮアルデヒドのアルデヒド官能基と反応する対応するエノールイオンもしくはエノラートイオン、またはシッフ塩基もしくはエナミンを形成して、ＣＮ＋３３，４－デヒドロ－２－ケトカルボン酸を生成させる化学反応を指す。いくつかの実施形態では、ＣＮアルデヒドは、３－ヒドロキシプロパナールであり、ＣＮ＋３３，４－デヒドロ－２－ケトカルボン酸は、６－ヒドロキシ－３，４－デヒドロ－２－ケトヘキサン酸である。
本明細書で使用する場合、「溶液」という用語は、本明細書に記載されている方法で用いる出発物質のように、溶媒及び溶質を含む液体組成物を指す。いくつかの実施形態では、溶媒は水である。いくつかの実施形態では、溶媒は有機溶媒である。
本明細書で使用する場合、「酵素的工程」または「酵素反応」という用語は、所望の酵素反応を促進するように選択したものである酵素によって触媒される分子反応を指す。酵素は、巨大な生体分子であり、高度に選択的な触媒である。大半の酵素はタンパク質であるが、触媒ＲＮＡ分子がいくつか特定されている。
本願全体を通じて、酵素的工程は、「工程１」、「工程２」などと示されている場合があり、これらの工程を特異的に触媒する酵素は、それぞれ「１」、「２」などと示されている。このような酵素は、「反応特異的酵素」とも称する。
本明細書で使用する場合、「ＣｏＡ」または「コエンザイムＡ」という用語は、有機補因子または補欠分子族（酵素の非タンパク質部分）を意味するように意図されており、その存在は、多くの酵素の活性のために、活性酵素系を形成させるのに必要となる。
本明細書で使用する場合、「実質的に嫌気性の」という用語は、培養条件または成長条件に関して使用する場合、酸素量が、液体培地中の溶存酸素の飽和率で約１０％未満であることを意味するように意図されている。この用語には、液体培地または固体培地の入った密封チャンバーを、酸素が約１％未満である雰囲気で保持することも含めるように意図されている。
本明細書で使用する場合、「天然に存在しない」または「非天然の」という用語は、本開示の微生物（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｏｒｇａｎｉｓｍ）または微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）に関して使用する場合、その微生物が、参照種の野生型株を含め、参照種の天然株では通常見られない遺伝子変化を少なくとも１つ有することを意味するように意図されている。遺伝子変化としては例えば、ポリペプチドをコードする発現可能な核酸を導入する改変、他の核酸の付加、核酸の欠失及び／またはその微生物の遺伝物質の他の機能的破壊が挙げられるが、これらに限らない。上記のような改変としては例えば、参照種に対して非相同なポリペプチド、相同なポリペプチド、または非相同なポリペプチドと相同なポリペプチドの両方のコード領域及びその機能的断片が挙げられるが、これらに限らない。追加の改変としては例えば、その改変により、遺伝子またはオペロンの発現が変化する非コード調節領域が挙げられるが、これらに限らない。
本明細書で使用する場合、「外因性」とは、その言及されている分子または言及されている活性が、宿主微生物に導入されたものであることを意味するように意図されている。その分子は、例えば、コード核酸を宿主遺伝物質に導入することによって、例えば、宿主染色体に、または染色体以外の遺伝物質（プラスミドなど）として組み込むことによって導入できる。すなわち、この用語は、コード核酸の発現に関して使用する場合には、コード核酸が発現可能な形態で、微生物に導入されることを指す。この用語は、酵素活性に関して使用する場合には、宿主である言及生物に導入される活性を指す。その供給源は例えば、宿主微生物に導入した後に、言及されている活性を発現する相同または非相同なコード核酸であることができる。したがって、「内因性」という用語は、言及されている分子または活性が、野生型宿主に、元来または天然において存在することを指す。同様に、この用語は、コード核酸の発現に関して使用する場合には、野生型微生物に含まれるコード核酸の発現を指す。
「非相同な」という用語は、言及されている種以外の供給源に由来する分子または活性を指し、それに対して、「相同な」とは、同様の文脈で使用する場合、宿主微生物に由来する分子または活性を指す。したがって、コード核酸の外因性発現では、非相同なコード核酸もしくは相同なコード核酸のいずれか、またはこれらの両方を利用できる。
２つ以上の外因性核酸が微生物内に含まれる場合、その２つ以上の外因性核酸とは、上で論じたように、言及されているコード核酸または酵素活性を指すことは理解される。さらに、本明細書に開示されているように、２つ以上の外因性核酸を宿主微生物に、別々の核酸分子上、ポリシストロニックな核酸分子上、またはこれらを組み合わせたもので導入でき、この場合でも、２つ以上の外因性核酸としてみなすことができることは理解される。例えば、本明細書に開示されているように、微生物は、所望の経路の酵素またはタンパク質をコードする２つ以上の外因性核酸を発現するように操作できる。所望の活性をコードする２つの外因性核酸を宿主微生物に導入する場合には、その２つの外因性核酸を単一の核酸として導入でき、例えば、１つのプラスミド、別個のプラスミドで、宿主染色体に、単一の部位または複数の部位で組み込むことができ、この場合でも、２つ以上の外因性核酸としてみなすことができることは理解される。同様に、３つ以上の外因性核酸を宿主生物に、いずれかの所望の組み合わせで導入でき、例えば、単一のプラスミド、別個のプラスミドで、宿主染色体に、単一の部位または複数の部位で組み込むことができ、この場合でも、３つ以上の外因性核酸、例えば３つの外因性核酸としてみなすことができることは理解される。したがって、言及されている外因性核酸または酵素活性の数は、コード核酸の数または酵素活性の数を指し、宿主生物に導入された別個の核酸の数を指すのではない。
いくつかの実施形態では、コード核酸の外因性発現を用いる。外因性発現により、宿主及び用途に合わせて発現及び／または調節エレメントをカスタムメイドできるようになり、ユーザーによって制御される所望の発現レベルが実現される。しかしながら、別の実施形態では、負の調節エフェクターを除去すること、または誘導性プロモーターもしくは他の調節エレメントに連結されている場合には、その遺伝子のプロモーターを誘導することによるなどして、内因性発現を用いることもできる。すなわち、適切な誘導剤を供給することによって、天然の誘導性プロモーターを有する内因性遺伝子をアップレギュレートすることもできるし、または内因性遺伝子の調節領域を操作して、誘導性調節エレメントを組み込むことによって、所望の時点に、内因性遺伝子の発現増加を調節可能にすることもできる。同様に、誘導性プロモーターは、天然に存在しない微生物に導入した外因性遺伝子に対する調節エレメントとして含めることもできる。
遺伝子変化は、Ｅ．ｃｏｌｉのような適切な宿主生物及びその対応する代謝反応、または所望の生合成経路の遺伝子のような所望の遺伝物質の適切な起源生物を基準にして説明されることを当業者は理解するであろう。しかしながら、当業者は、多種多様な生物の全ゲノムシーケンシング及びゲノミクス分野の高度な知識に鑑みれば、本質的にすべての他の生物に、本明細書に示されている教示及び手引きを容易に適用できるであろう。例えば、本明細書に例示されている、Ｅ．ｃｏｌｉの代謝変化は、その言及されている種以外の種に由来する同じまたは類似のコード核酸を組み込むことによって、他の種に容易に適用できる。このような遺伝子変化としては例えば、広くは、種ホモログ、特には、オルソログ、パラログまたは非オーソロガス遺伝子置換の遺伝子変化が挙げられる。
経路酵素をコードする核酸の起源としては例えば、コードされる遺伝子産物が、言及されている反応を触媒できるいずれかの種を挙げることができる。このような種には、原核生物及び真核生物の両方が含まれ、細菌（古細菌及び真正細菌を含む）、ならびに真核生物（酵母、植物、昆虫、動物、及びヒトを含む哺乳動物を含む）が挙げられるが、これらに限らない。上記のような起源の例示的な種としては例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｋｎａｃｋｍｕｓｓｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．２０６５、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＡＤＰ１、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂａｒｋｅｒｉ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．Ｍ６２／１、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、及び本明細書に開示されているか、または対応する遺伝子の起源生物として利用可能である他の例示的な種（実施例を参照されたい）が挙げられる。しかしながら、現在、４００種を超える微生物ゲノム、ならびに様々な酵母、真菌、植物及び哺乳動物のゲノムの全ゲノム配列を入手可能なことから、近縁種または遠縁種における１つ以上の遺伝子に関して、必要な経路酵素をコードする遺伝子（例えば、既知の遺伝子のホモログ、オルソログ、パラログ及び非オーソロガス遺伝子置換を含む）の特定、ならびに生物間での遺伝子変化の入れ替えは、当該技術分野において常法かつ周知である。
オルソログとは、異なる種において、種分化によって、共通祖先の遺伝子から進化した遺伝子を指す。通常、オルソログは、進化の過程で、同じ機能を保持する。新たにシーケンシングしたゲノムにおいて、遺伝子機能の予測を高い信頼性で行うには、オルソログの特定は不可欠である。
パラログとは、ゲノム内での重複によって関連付けられる遺伝子を指す。オルソログが概して、進化の過程で同じ機能を保持するのに対して、パラログは、元来の機能と関連する機能であるものの、新しい機能を獲得できる。
非オーソロガス遺伝子置換は、ある１つの種の非オーソロガス遺伝子のうち、異なる種において、対象となる遺伝子機能の代用となり得る非オーソロガス遺伝子である。代用には例えば、起源の種において、異なる種における対象機能と比べて実質的に同じ機能または類似の機能を果たすことができることが含まれる。概して、非オーソロガス遺伝子置換は、対象の機能をコードする既知の遺伝子と構造的な関連性があるものとして特定することになるが、しかしその一方で、本明細書で使用されているように、構造的な関連性が低いものの、機能の類似する遺伝子と、対応するその遺伝子産物も、この用語の意味の範囲内に入る。機能的類似性には、例えば、非オーソロガス遺伝子産物の活性部位または結合領域において、代用を試みる機能をコードする遺伝子と比べて、少なくとも多少の構造的類似性が必要となる。したがって、非オーソロガス遺伝子には例えば、パラログまたは関連性のない遺伝子が含まれる。
本明細書で使用する場合、「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」、「微生物（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｏｒｇａｎｉｓｍ）」または「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」という用語は、同義的に用いられており、生体の単離された生きている原核細胞または真核細胞であって、ＤＮＡまたはＲＮＡのような外因性核酸または組み換え核酸の挿入によって、トランスフォーメーションまたはトランスフェクションできる原核細胞または真核細胞を指す。本開示では、核酸の配列によってトランスフォーメーションした後に生存し続ける限りは、いずれの適切な原核微生物または真核微生物も用いてよい。本開示の適切な微生物は、本発明の方法における工程の少なくとも１つを触媒できる１つ以上の組み換えタンパク質をコードする１つ以上の核酸コンストラクトを発現させることができる微生物である。微生物は、細菌、酵母、真菌、カビ及び古細菌の群から選択できる。これらは、市販されている。
本明細書で使用する場合、「真菌」とは、菌界に分類されるいずれの真核生物も指す。菌界の門には、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ、Ｂｌａｓｔｏｃｌａｄｉｏｍｙｃｏｔａ、Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ、Ｇｌｏｍｅｒｏｍｙｃｏｔａ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ及びＮｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｇｏｍｙｃｏｔａが含まれる。本明細書で使用する場合、「酵母」とは、単細胞の形態で（例えば出芽によって）成長する真菌を指し、それに対して、「カビ」とは、多細胞の菌糸または菌糸体からなるフィラメントで成長する真菌を指す（ＭｃＧｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ｒ．ａｎｄ Ｔｙｒｉｎｇ，Ｓ．Ｋ．“Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｍｙｃｏｌｏｇｙ．”Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．４ｔｈ ｅｄ．Ｇａｌｖｅｓｔｏｎ：Ｕｎｉｖ．ｏｆ ＴＸ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｒａｎｃｈ ａｔ Ｇａｌｖｅｓｔｏｎ，１９９６）。
いくつかの実施形態では、微生物は酵母細胞である。いくつかの実施形態では、酵母細胞は、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓまたはＹａｒｒｏｗｉａの種の細胞である。
いくつかの実施形態では、微生物はカビ細胞である。いくつかの実施形態では、カビ宿主細胞は、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、ＦｕｓａｒｉｕｍまたはＣｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍの種の細胞である。
いくつかの実施形態では、微生物は古細菌である。いくつかの実施形態では、適切な古細菌は、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ、ＭｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓまたはＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａの種の菌である。
「細菌」という用語は、原核生物ドメインまたは原核生物界のいずれかの微生物を指す。細菌ドメインまたは細菌界の門には、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｒｕｌｕｍ、Ａｑｕｉｆｉｃａｅ、Ａｒｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｃａｌｄｉｓｅｒｉｃａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ、Ｃｈｒｙｓｉｏｇｅｎｅｔｅｓ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ－ｔｈｅｒｍｕｓ、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｈａｌａｎａｅｒｏｂｉｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｔｅｓ、Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｚｏｂｅｌｌｅｌｌａ及びＺｙｍｏｍｏｎａｓが含まれる。いくつかの実施形態では、細菌性微生物は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である。いくつかの実施形態では、細菌性微生物は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．細胞である。Ｂａｃｉｌｌｕｓの種の例としては、以下に限らないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ及びＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓが挙げられる。
本開示の方法によって調製されたカルボン酸化合物は、対イオン（金属イオン、例えば、ナトリウムイオン、カリウムイオンのようなアルカリ金属イオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオンのようなアルカリ土類イオン、もしくはアルミニウムイオンが挙げられるが、これらに限らない）と塩を形成できるか、またはテトラアルキルアンモニウム、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トリメチルアミン、Ｎ－メチルグルカミンなどのような有機塩基と配位結合できる。この酸は、反応条件において存在する対イオンもしくは有機塩基と塩を形成できるか、または無機塩基もしくは有機塩基と反応させることによって、塩に変換できる。
本発明の化合物を含むいずれのカルボン酸も、酸または塩のいずれかとして称され、それらは、本明細書の全体を通じて、そのいずれの塩形態も含め、その中性形態またはイオン化形態のいずれかである化合物を指す目的で、同義的に用いられている。具体的な形態はｐＨによって決定されることは、当業者には理解される。
化合物の溶媒和物は、結晶格子内側の１つ未満、１つまたは２つ以上の溶媒分子とともに結晶化する固体形態の化合物である。薬学的に許容される溶媒和物のような溶媒和物を作製するのに使用できる溶媒のいくつかの例としては、水、一般的にはＣ１－Ｃ６アルコール（メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノールなどであり、任意に置換できる）、テトラヒドロフラン、アセトン、エチレングリコール、プロピレングリコール、酢酸、ギ酸及びこれらの溶媒の混合物が挙げられるが、これらに限らない。薬学的に許容される溶媒和物を作る助けとなり得る上記のような生体適合性溶媒の他のものは、当該技術分野において周知である。加えて、様々な有機酸及び無機酸ならびに有機塩基及び無期塩基を加えて、所望の溶媒和物を作ることができる。このような酸及び塩基は、当該技術分野において周知である。溶媒が水であるときには、溶媒和物は、水和物と称することができる。いくつかの実施形態では、１分子の化合物は、０．１～５分子の溶媒（０．５分子の溶媒（半水和物のような半溶媒和物）、１分子の溶媒（一水和物のような一溶媒和物）、及び２分子の溶媒（二水和物のような二溶媒和物）など）と、溶媒和物を形成できる。
いくつかの異性体（例えば、シス異性体及びトランス異性体、ならびにＲ異性体及びＳ異性体またはこれらを組み合わせたもの）が存在する化合物に言及している場合、その化合物には、原則的に、その化合物のあらゆる考え得るエナンチオマー、ジアステレオマー及びシス／トランス異性体のうち、本開示の方法で使用し得るものが含まれる。
それぞれの種において、その種に属するいずれの細胞も、本開示の適切な微生物とみなされる。いずれの種の宿主細胞も、天然の状態から単離したままの状態で存在してもよいし、またはいずれかの数の遺伝子改変（例えば、遺伝子の変異、欠失もしくは組み換えポリヌクレオチド）を含んでもよい。
「組み換え核酸」または「組み換えポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用する場合、（ａ）核酸の配列が、所定の微生物にとって外来のものである（すなわち、天然では見られない）か、（ｂ）その配列が、所定の微生物において、天然の状態で見られ得るが、天然では見られない（例えば、予想を上回る）量であるか、または（ｃ）核酸の配列に、天然においては同じ相互関係では見られない部分配列が２つ以上含まれるという項目のうちの少なくとも１つに該当する核酸ポリマーを指す。例えば、項目（ｃ）に関しては、組み換え核酸配列では、新たな機能的核酸を作製する目的で、関連性のない遺伝子に由来する配列が２つ以上配置されていることになる。
いくつかの実施形態では、本開示の組み換えポリペプチドまたは組み換えタンパク質または組み換え酵素は、１つ以上の発現ベクターの一部としての遺伝物質によってコードさせてよい。発現ベクターは、ポリペプチドコード核酸を１つ以上含み、さらに、核酸（複数可）の発現を制御するいずれかの所望のエレメントと、所定の宿主細胞内で、その発現ベクターの複製及び維持を可能にするいずれかのエレメントとを含んでもよい。すべての組み換え核酸が、単一の発現ベクターに存在してもよいし、または複数の発現ベクターによってコードされてもよい。
１つの発現ベクターまたは複数の発現ベクターは、本明細書に例示されているような経路コード核酸であって、宿主生物において機能する発現制御配列に機能可能に連結された経路コード核酸を１つ以上含むように構築できる。示されている宿主微生物用として適用可能な発現ベクターとしては例えば、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、エピソーム、及びベクターと、宿主染色体への安定な組み込みのために機能可能である選択配列または選択マーカーとを含む人工染色体が挙げられる。加えて、発現ベクターは、１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子及び適切な発現制御配列を含むことができる。例えば、抗生物質もしくは毒素に対する耐性をもたらすか、栄養要求性の欠損を相補するか、または培養培地には見られない重要な栄養を供給する選択可能なマーカー遺伝子も含めることができる。発現制御配列は、当該技術分野において周知である構成的プロモーター、誘導性プロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーターなどを含むことができる。２つ以上の外因性コード核酸を共発現させる場合には、両方の核酸を例えば単一の発現ベクターまたは別々の発現ベクターに挿入することができる。単一のベクターでの発現では、コード核酸は、１つの共通の発現制御配列に機能可能に連結することもできるし、または１つの誘導性プロモーター及び１つの構成的プロモーターのような異なる発現制御配列に連結することもできる。ポリヌクレオチドを機能可能に連結できる両方のプロモーターとクローニング部位を含むベクターは、当該技術分野において周知である。このようなベクターは、ＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで転写でき、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）及びＰｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のような供給元から市販されている。発現及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写を最適化するために、クローンの５’及び／または３’の非翻訳部分を除去、付加または変更して、不適切となり得る余計な選択的翻訳開始コドン、または転写レベルまたは翻訳レベルのいずれかで、発現に干渉したり、もしくは発現を減少させたりし得る他の配列を排除する必要がある場合がある。あるいは、コンセンサスなリボソーム結合部位を、開始コドンの５’に直接挿入して、発現を増強できる。
本明細書に記載されている所望の化合物を合成するための経路に関与する外因性核酸配列は、当該技術分野において周知の技法を用いて、宿主細胞に安定または一過性に導入でき、その技法としては、コンジュゲーション、エレクトロポレーション、化学物質トランスフォーメーション、トランスダクション、トランスフェクション及び超音波トランスフォーメーションが挙げられるが、これらに限らない。Ｅ．ｃｏｌｉまたは他の原核細胞での外因性発現では、真核核酸の遺伝子またはｃＤＮＡにおけるいくつかの核酸配列は、Ｎ－末端ミトコンドリアシグナルまたはその他のターゲティングシグナルなどのターゲティングシグナルをコードでき、所望の場合、このシグナルは、原核宿主細胞にトランスフォーメーションする前に除去できる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉでは、ミトコンドリアリーダー配列の除去により、発現が増加した（Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：４３２９－４３３８（２００５））。酵母またはその他の真核細胞での外因性発現では、遺伝子は、リーダー配列を付加せずに、細胞質ゾルで発現させることもできるし、あるいは宿主細胞に適するミトコンドリアターゲティングシグナルまたは分泌シグナルのような適切なターゲティング配列を付加することによって、ミトコンドリアもしくはその他の細胞小器官に導くか、または分泌させるために導くことができる。ターゲティング配列を除去または含めるための、核酸配列に対する適切な改変を外因性核酸配列に組み込んで、所望の特性を付与できることは理解される。さらに、遺伝子に対して、当該技術分野において周知の技法によってコドン最適化を行って、タンパク質の発現の最適化を実現できる。
すべての数字表記、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度及び分子量は、範囲を含め、０．１刻みで（±に）変動する近似値である。必ずしも明示的に示されるわけではないが、すべての数字表記の前には、「約」という用語が付されることを理解されたい。本明細書で使用する場合、「約」とは、最大で±１０％であることを意味することになる。必ずしも明示的に示されるわけではないが、本明細書に記載されている試薬は、例示的なものに過ぎず、その等価物は、当該技術分野において知られていることも理解されたい。
「機能可能に連結された」とは、それらのエレメントが、機能可能となる配置になっている並列状態を指す。
「培養」という用語は、細胞または生物を様々な種類の培地（培養液）上または培地（培養液）中で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させることを指す。培養液で成長した細胞の子孫は、親細胞とは完全には（すなわち、形態的、遺伝的または表現型的には）同一ではない場合もあることは理解される。
「遺伝子」とは、転写及び翻訳後に、特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードできるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を少なくとも１つ含むポリヌクレオチドを指す。本明細書に記載されているポリヌクレオチド配列のいずれかを用いて、遺伝子の、より大きい断片または完全長コード配列であって、それらのポリヌクレオチド配列と関連する断片または配列を特定してよい。より大きい断片配列を単離する方法は、当業者に知られている。
「発現する」という用語は、遺伝子産物を産生することを指す。過剰発現という用語は、その遺伝子から転写されるｍＲＮＡ、またはその遺伝子によってコードされるタンパク質産物の産生量が、通常細胞またはコントロール細胞よりも多く、例えば、コントロール試料または野生型細胞で検出された発現レベルよりも０．５倍、１．０倍、１．５倍、あるいは２倍、あるいは少なくとも２．５倍、あるいは少なくとも３．０倍、あるいは少なくとも３．５倍、あるいは少なくとも４．０倍、あるいは少なくとも５倍、あるいは１０倍高いことを指す。
本明細書で使用する場合、「相同性」とは、参照配列と、第２の配列の少なくとも断片との配列類似性を指す。ホモログは、当該技術分野において知られているいずれかの方法によって、好ましくは、ＢＬＡＳＴのツールを用いることによって、参照配列と、単一の第２の配列もしくは配列の断片、または配列のデータベースとを比較することによって特定し得る。下に説明されているように、ＢＬＡＳＴは、同一性パーセント及び類似性に基づき、配列を比較することになる。
「同一な」または「同一性」パーセントという用語は、２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列に関しては、同じである２つ以上の配列または部分配列を指す。比較ウィンドウまたは指定の領域にわたって最大限一致するように比較及びアラインメントした際に、下記の配列比較アルゴリズムのうちの１つを用いて、またはマニュアルアラインメント及び目視確認によって測定したとき、２つの配列において、同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドが、所定のパーセンテージである（すなわち、所定の領域において、または定められていない場合には、配列全体において、同一性が２９％、任意に、同一性が３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％である）場合には、２つの配列は「実質的に同一である」。任意に、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド長（または１０アミノ酸長）である領域、より好ましくは、１００～５００ヌクレオチド長、または１０００ヌクレオチド長もしくはこれを超えるヌクレオチド長（または２０アミノ酸長、５０アミノ酸長、２００アミノ酸長もしくはこれを超えるアミノ酸長）である領域において見られるものである。
比較のために配列をアラインメントする方法は、当該技術分野において周知である。例えば、いずれかの２つの配列間の配列同一性パーセントの決定は、数学的なアルゴリズムを用いて行うことができる。このような数学的なアルゴリズムの非限定的な例は、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ４：１１ １７（１９８８）のアルゴリズム、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３ ４５３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４ ２４４８（１９８８）の類似性検索法、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３ ５８７７（１９９３）のアルゴリズムである。
配列比較の際には、典型的には、試験配列の比較対象となる参照配列としての役割は、１つの配列が果たす。配列比較アルゴリズムを使用するときには、試験配列と参照配列をコンピューターに入力し、必要な場合には、部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。デフォルトのプログラムパラメーターを使用することもできるし、または代わりのパラメーターを指定することもできる。その後、配列比較アルゴリズムが、プログラムパラメーターに基づき、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを算出する。同一性に関して、２つの配列を比較するときには、それらの配列は、連続している必要はないが、いずれのギャップにも、全体の同一性パーセントを低下させるペナルティが課されることになる。ｂｌａｓｔｎでは、デフォルトパラメーターは、ギャップオープニングペナルティ＝５、及びギャップエクステンションペナルティ＝２である。ｂｌａｓｔｐでは、デフォルトパラメーターは、ギャップオープニングペナルティ＝１１、及びギャップエクステンションペナルティ＝１である。
本明細書で使用する場合、「比較ウィンドウ」には、２０～６００、通常は約５０～約２００、より通常的には約１００～約１５０（これらに限らない）を含む連続する位置数のうちのいずれか１つのセグメントへの参照が含まれ、２つの配列を最適にアラインメントした後に、連続する位置の数が同じである参照配列と、そのセグメントにおける配列を比較し得る。比較のために配列をアラインメントする方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４８（３）：４４３－４５３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ８５（８）：２４４４－２４４８（１９８８）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムの、コンピューターによるインプリメンテーション（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって、またはマニュアルアラインメント及び目視確認によって、比較のために配列を最適にアラインメントすることができる［例えば、Ｂｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｉｎｇｂｏｕ Ｅｄ）を参照されたい］。
配列同一性パーセント及び配列類似性を求めるのに適するアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０のアルゴリズムであり、ＢＬＡＳＴは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５（１７）：３３８９－３４０２（１９９７）に、ＢＬＡＳＴ２．０は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ２１５（３）－４０３－４１０（１９９０）に説明されている。ＢＬＡＳＴ解析を行うソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて、公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列中の長さＷのワードとアラインメントしたときに、一致するかまたは何らかの正値の閾値スコアＴを満たす、クエリ一配列中の同じ長さの短いワードを特定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を特定することを含む。Ｔは、近傍ワードスコア閾値という（Ａｌｔｓｃｈｕｌらによる上記文献）。これらの最初の近傍ワードヒットは、それらのワードを含む、より長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとしての役割を果たす。そのワードヒットを、それぞれの配列に沿って、累積アラインメントスコアが上昇しうる限り、両方向に伸長させる。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメーターＭ（マッチする残基の対に対するリワードスコア、常に０超）、及びパラメーターＮ（ミスマッチの残基に対するペナルティスコア、常に０未満）を使用して算出する。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを使用して、累積スコアを算出する。それぞれの方向におけるワードヒッ卜の伸長は、累積アラインメントスコアが、その最大達成値から量Ｘ低下したとき、負のスコアの残基アラインメントが１つ以上蓄積したことにより、累積スコアがゼロ以下になったとき、またはいずれかの配列の末端に到達したとき停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ及びＸにより、アラインメントの感度及び速度が決定される。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）では、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）＝１１、期待値（Ｅ）＝１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列用では、ＢＬＡＳＴＰプログラムにおいて、デフォルトとして、ワード長＝３及び期待値（Ｅ）＝１０、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９（２２）：１０９１５－１０９１９（１９９２）を参照されたい）のアラインメント（Ｂ）＝５０、期待値（Ｅ）＝１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、及び両鎖の比較を使用する。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計解析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０（１２）：５８７３－５８７７（１９９３）を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって供給される、類似性の尺度の１つは、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率の指標を示すものである。例えば、試験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に、核酸は、参照配列と類似しているとみなされる。
上記の配列同一性パーセント以外に、２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることの別の指標は、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、第２の核酸によってコードされるポリペプチドに対して産生された抗体と免疫学的に交差反応することである。すなわち、例えば、２つのペプチドが、保存的置換によってのみ異なる場合には、ポリペプチドは典型的には、第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、２つの分子またはそれらの相補体が、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であることのさらに別の指標は、同じプライマーを用いて、配列を増幅できることである。
「機能的に同等なタンパク質」という語句は、ストリンジェントな条件下で、例示されているポリヌクレオチドにハイブリダイズするとともに、ｉｎ ｖｉｖｏでの生物学的活性が、標準またはコントロールの生物学的活性と比べて、同程度であるか、または例えば、１２０％超、あるいは１１０％超、あるいは１００％超、あるいは９０％超、あるいは８５％超、またはあるいは８０％超増強されているタンパク質またはポリヌクレオチドを指す。本開示の範囲内である追加の実施形態は、配列相同性が８０％超、あるいは８５％超、あるいは９０％超、あるいは９５％超、あるいは９７％超、あるいは９８または９９％超であることによって特定される。相同性パーセントは、適切な条件下で実行させたＢＬＡＳＴのような配列比較プログラムによって求めることができる。いくつかの実施形態では、そのプログラムは、デフォルトパラメーター下で実行させる。いくつかの実施形態では、特定の酵素またはタンパク質に言及している場合には、その機能的に同等な酵素またはタンパク質が含まれる。
細胞集団とは、表現型及び／または遺伝型が同一である（クローンである）か、または同一ではない２つ以上の細胞の集合体を意図している。実質的に均質な細胞集団は、事前に選択したマーカーによって測定した場合に、少なくとも７０％、あるいは少なくとも７５％、あるいは少なくとも８０％、あるいは少なくとも８５％、あるいは少なくとも９０％、あるいは少なくとも９５％、あるいは少なくとも９８％同一である表現型を有する集団である。
酵素が、酵素クラス（ＥＣ）を基準にして言及されているときには、その酵素クラスは、Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙの定めた酵素命名法に基づき、その酵素を分類するか、分類し得るクラスである。所定のクラスにまだ分類されていないが、そのクラスに分類される可能性がある他の適切な酵素も含まれる。
天然に存在しない微生物
本明細書に例示されているように、当該技術分野において周知の方法を用いて、本発明で提供する天然に存在しない微生物を構築して、２－ケトペンタン酸、２－ケトヘキサン酸、６－ヒドロキシ－２－ケトヘキサン酸、１，５－ペンタンジオール、アジピン酸、１，６－ヘキサンジオールまたは６－ヒドロキシヘキサン酸のような化合物を産生させるのに十分な量で、本明細書に記載されている生合成経路で用いられる酵素またはタンパク質をコードする核酸を少なくとも１つ外因性に発現させる。
本明細書に記載されている所望の生成物を産生できる微生物宿主をうまく操作するには、その経路、例えば、本明細書の実施例及び文献に記載されている経路において、様々な工程で触媒作用を発揮するのに十分な活性及び特異性を有する適切な酵素セットを特定することが必要となる。外因性ＤＮＡ配列に由来する個々の酵素またはタンパク質の活性も、当該技術分野において周知の方法を用いてアッセイできる。加えて、これらの酵素は、所望の基質特異性を得るため、立体選択性を制御して、エナンチオマー的に純粋な生成物またはラセミ生成物を合成するため、ならびに半減期、熱安定性、阻害剤／生成物耐性を向上させるとともに、選択した所望の産生用微生物宿主において、酵素の発現及び溶解性を向上させることによって、酵素を安定させて、過酷な工業的プロセス条件に耐えられるようにするために、昨今のタンパク質操作アプローチ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｈａｎｄｂｏｏｋ；Ｌｕｔｚ Ｓ．，＆Ｂｏｒｎｓｃｈｅｕｅｒ Ｕ．Ｔ．Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧａＡ：２００８；Ｖｏｌ．１＆２）、例えば、指向性進化法、合理的変異誘発、コンピューターによる設計（Ｚａｎｇｈｅｌｌｉｎｉ，Ａ ｅｔ ａｌ，２００８）またはこれらを組み合わせたものなどを用いて操作できる。その経路の各工程を触媒できる所望の酵素を特徴付けたら、選択した微生物において、これらの酵素をコードする遺伝子をクローニングし、発酵条件を最適化し、発酵後、産物の形成をモニタリングする。酵素を特定後、その酵素の１つ以上に対応する遺伝子を微生物宿主にクローニングする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている特定の経路の各酵素をコードする遺伝子を微生物宿主にクローニングする。
組み換え核酸／外因性核酸／組み換えタンパク質／外因性タンパク質を微生物に導入する方法、及びこの目的に適するベクターは、当該技術分野において周知である。例えば、様々な教示がＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８及び四半期ごとのアップデート）に例示されている。発現ベクターを微生物宿主細胞に移入する方法は、当該技術分野において周知である。具体的な方法及びベクターは、所望の微生物宿主の種によって異なることがある。例えば、細菌宿主細胞は、ヒートショック、塩化カルシウム処理、エレクトロポレーション、リポソームまたはファージ感染によってトランスフォーメーションしてよい。酵母宿主細胞には、酢酸リチウム処理（さらに、キャリアＤＮＡ及びＰＥＧ処理を含んでもよい）またはエレクトロポレーションによってトランスフォーメーションしてよい。これらの方法は、例示目的で含まれているのであり、いかなる場合も、限定するものまたは包括的なものとしては意図されていない。当該技術分野において周知の手段による慣用的な実験を用いて、特定の発現ベクターまたはトランスフォーメーション方法が、所定の微生物宿主に適するか否かを判断し得る。さらに、多くの異なる微生物宿主に適する試薬及びベクターが市販されており、それらは、当該技術分野において周知である。
天然に存在しない微生物宿主において、酵素を構築、発現または過剰発現させる方法、及び発現レベルを試験する方法は、当該技術分野において周知である（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｔｒｅｎｄｓ，Ｂａｎｅｙｘ Ｆ．ｅｄｓ．Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００４，Ｎｏｒｆｏｌｋ，ＵＫ、及びＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９９９））。
微生物を発酵させる方法は、当該技術分野において周知である。例えば、様々な技法がＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ，１９９７，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）に例示されている。具体的な発酵方法は、所望の微生物宿主の種によって異なることがある。典型的には、微生物は、適切な培地において、炭素源とともに、バッチまたは連続発酵方式で成長させる。カタボライトリプレッションまたは酵素活性を調節することが知られている作用剤を用いて、アジピン酸またはグルタル酸の産生を増強できる。発酵に適するｐＨは、３～１０である。発酵は、微生物の要件に基づき、好気性条件、嫌気性条件または無酸素条件下で行うことができる。発酵は、バッチ方式、流加方式または連続方式で行うことができる。発酵は、所望の場合、二相で行うことができる。例えば、第１の相は、高度な成長、すなわち、高い産生性が得られるように、好気性であることができ、その後に、カプロラクトン収率の高い嫌気性相に続くようにできる。
炭素源には、例えば、天然に存在しない微生物に炭素源を供給できるいずれの炭水化物源も含めることができる。このような炭水化物源としては例えば、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、スクロース及びデンプンのような糖が挙げられる。他の炭水化物源としては例えば、再生可能な原材料及びバイオマスが挙げられる。本開示の方法において、原材料として使用できる例示的な種類のバイオマスとしては、セルロース系バイオマス、ヘミセルロース系バイオマス及びリグニン原材料、または原材料の一部分が挙げられる。このようなバイオマス原材料は例えば、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトース及びデンプンのように、炭素源として有用な炭水化物基質を含む。本明細書に示されている教示及び手引きに鑑みれば、上で例示した以外の再生可能な原材料及びバイオマスも、所望の化合物を産生させるために、本開示の微生物を培養するのに使用できることを当業者は理解するであろう。
本明細書に記載されている反応は、モニタリングでき、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）解析、ＧＣ－ＭＳ（ガスクロマトグラフィー－質量分析）及びＬＣ－ＭＳ（液体クロマトグラフィー－質量分析）、または当該技術分野において周知の常法手順を使用するその他の適切な解析方法を用いて、発酵培地を解析することによって、その培地中の出発物質、生成物または中間体を特定できる。
本明細書に記載されている天然に存在しない微生物のいずれかを培養して、本開示の生成物を産生及び／または分泌させることができる。
本明細書に記載されている方法によって調製した化合物は、生合成または発酵によって調製した有機化合物を単離するためのものとして、当該技術分野において一般に知られている方法によって単離できる。例えば、その化合物は、晶出、塩形成、浸透気化、反応抽出、抽出（液－液抽出及び二相抽出）、吸着、イオン交換、透析、蒸留、ガスストリッピング、ならびに膜ベースの分離（Ｒｏｆｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ．２：１２９－１３６（１９８４））によって、溶液から単離できる。１，５－ペンタンジオールは、蒸留、抽出（液－液抽出及び二相抽出）、浸透気化、ならびに膜ベースの分離（Ｒｏｆｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ．２：１２９－１３６（１９８４））を用いて、溶液から単離できる。
本明細書に記載されているように、所望の生成物を生合成させるための例示的な成長条件の１つには、嫌気性の培養条件または発酵条件が含まれる。特定の実施形態では、本開示の天然に存在しない微生物は、嫌気性または実質的に嫌気性の条件下で維持、培養または発酵させることができる。簡潔に述べると、嫌気性条件とは、酸素が欠乏した環境を指す。実質的に嫌気性の条件としては例えば、培地中の溶存酸素濃度が、飽和率で０～１０％に保たれるように、培養、バッチ発酵または連続発酵を行うことが挙げられる。実質的に嫌気性の条件には、酸素が１％未満である雰囲気に保った密封チャンバー内の液体培地中または固形寒天上で、細胞を成長または静置することも含まれる。酸素の割合は、例えば、培養液にＮ２／ＣＯ２混合物または酸素以外の他の適切な１つの気体または複数の気体を吹き込むことによって保つことができる。
生成物の製造の際には、本明細書に記載されている培養条件の規模を大きくして、連続的に成長させることができる。例示的な成長手順としては例えば、流加発酵及びバッチ分離、流加発酵及び連続分離、または連続発酵及び連続分離が挙げられる。これらのプロセスはいずれも、当該技術分野において周知である。発酵手順は、商業的な量での生合成生産に特に有用である。
「十分な量で発現する経路酵素」という用語は、その酵素が、所望の経路産物の検出を可能にするのに十分な量で発現することを示す。
別の態様では、本発明で提供するのは、アルドラーゼヒドラターゼ酵素をコードする第１の外因性核酸を含む組み換え微生物であって、さらに、キノンオキシドレダクターゼを、野生型または改変されていない同じ微生物よりも多い量で発現するように改変されており、任意に、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、クロストリジウム種またはＥ．ｃｏｌｉである組み換え微生物である。
いくつかの実施形態では、その生物は、キノンオキシドレダクターゼをコードする第２の外因性核酸を含む。いくつかの実施形態では、第１の外因性核酸及び／または第２の外因性核酸は、第２の外因性核酸の発現を駆動する調節エレメントをさらに含む。いくつかの実施形態では、第１の外因性核酸及び第２の外因性核酸が、第２の外因性核酸の発現を駆動する調節エレメントをさらに含む。いくつかの実施形態では、第１の外因性核酸または第２の外因性核酸が、第２の外因性核酸の発現を駆動する調節エレメントをさらに含む。いくつかの実施形態では、第１の外因性核酸が、第２の外因性核酸の発現を駆動する調節エレメントをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の外因性核酸が、第２の外因性核酸の発現を駆動する調節エレメントをさらに含む。いくつかの実施形態では、その調節エレメントは、プロモーターまたはエンハンサーから選択されている。いくつかの実施形態では、その調節エレメントは、プロモーターである。いくつかの実施形態では、その調節エレメントは、エンハンサーである。
いくつかの実施形態では、アルドラーゼヒドラターゼ酵素は、ＥＣ番号４．１．２．４５、ＥＣ番号４．１．２．３４またはＥＣ番号４．１．１．４である。いくつかの実施形態では、アルドラーゼヒドラターゼ酵素は、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｄ７Ｃ０Ｅ５、Ｐ０Ａ１４４、Ｑ７９ＥＭ８、Ａ０Ａ０Ｎ０ＡＨＩ８、Ａ０Ａ０Ｎ１ＦＲＹ３、Ｍ３ＤＹＲ１、Ｗ７ＳＵ４８、Ａ０Ａ２８６ＰＨ１８、Ｑ９Ｘ９Ｑ６、Ｑ９ＷＸＨ７、Ａ４ＸＤＳ１、Ｆ２Ｊ６Ｎ９、Ａ０Ａ０６３ＢＦＬ５、Ｑ９ＺＨＨ６、Ａ０Ａ０Ｃ１Ｋ８５３、ＷＰ＿０３４３９８４８２、ＰＹＫ１２１９１、ＷＰ＿１１５４７８０３３、ＷＰ＿０２８２２２２５３、ＷＰ＿０１３６５４８０７、ＷＰ＿０５９４０３０６０、ＷＰ＿０９２５０８５３０、ＷＰ＿１１６６４２６２７、ＷＰ＿００９７７０６５９、ＷＰ＿１０７８１８１９１、ＷＰ＿００３２９２０６１、ＰＹＮ４８８５５、ＷＰ＿１２２２１２９６５、ＷＰ＿０２８２１７２９７、ＷＰ＿０３４５０７０４９、ＫＭＫ６４０８１．１、ＷＰ＿０７００２８０４１．１またはＫＺＬ９２４４９．１で識別される酵素の群から選択した酵素である。いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、ＧｅｎＢａｎｋ、ＲｅｆＳｅｑまたはＵｎｉｐｒｏｔのＩＤ番号Ｄ７Ｃ０Ｅ５、Ｐ０Ａ１４４、Ｑ７９ＥＭ８、Ａ０Ａ０Ｎ０ＡＨＩ８、Ａ０Ａ０Ｎ１ＦＲＹ３、Ｍ３ＤＹＲ１、Ｗ７ＳＵ４８、Ａ０Ａ２８６ＰＨ１８、Ｑ９Ｘ９Ｑ６、Ｑ９ＷＸＨ７、Ａ４ＸＤＳ１、Ｆ２Ｊ６Ｎ９、Ａ０Ａ０６３ＢＦＬ５、Ｑ９ＺＨＨ６、Ａ０Ａ０Ｃ１Ｋ８５３、ＷＰ＿０３４３９８４８２、ＰＹＫ１２１９１、Ａ０Ａ３７０Ｘ７Ｄ８、ＷＰ＿０２８２２２２５３、Ｆ２Ｊ６Ｌ６、Ａ０Ａ０Ｎ０Ｌ９Ｆ６、Ａ０Ａ１Ｇ９ＹＷＧ７、Ａ０Ａ２Ｕ１ＢＴ０９、Ａ０Ａ２４４ＤＨＥ８、ＷＰ＿１０７８１８１９１、Ａ０Ａ０２３ＷＺＦ９、ＰＹＮ４８８５５、Ａ０Ａ４２１ＰＡＱ６、ＷＰ＿０２８２１７２９７、ＷＰ＿０３４５０７０４９、ＫＭＫ６４０８１．１、ＷＰ＿０７００２８０４１．１またはＫＺＬ９２４４９．１で識別される酵素の群から選択した酵素である。いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号８４、配列番号８５または配列番号８６の配列を含む酵素である。
いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、ＧｅｎＢａｎｋ、ＲｅｆＳｅｑまたはＵｎｉｐｒｏｔのＩＤ番号Ｄ７Ｃ０Ｅ５、Ｐ０Ａ１４４、Ｑ７９ＥＭ８、Ａ０Ａ０Ｎ０ＡＨＩ８、Ａ０Ａ０Ｎ１ＦＲＹ３、Ｍ３ＤＹＲ１、Ｗ７ＳＵ４８、Ａ０Ａ２８６ＰＨ１８、Ｑ９Ｘ９Ｑ６、Ｑ９ＷＸＨ７、Ａ４ＸＤＳ１、Ｆ２Ｊ６Ｎ９、Ａ０Ａ０６３ＢＦＬ５、Ｑ９ＺＨＨ６、Ａ０Ａ０Ｃ１Ｋ８５３、ＷＰ＿０３４３９８４８２、ＰＹＫ１２１９１、Ａ０Ａ３７０Ｘ７Ｄ８、ＷＰ＿０２８２２２２５３、Ｆ２Ｊ６Ｌ６、Ａ０Ａ０Ｎ０Ｌ９Ｆ６、Ａ０Ａ１Ｇ９ＹＷＧ７、Ａ０Ａ２Ｕ１ＢＴ０９、Ａ０Ａ２４４ＤＨＥ８、ＷＰ＿１０７８１８１９１、Ａ０Ａ０２３ＷＺＦ９、ＰＹＮ４８８５５、Ａ０Ａ４２１ＰＡＱ６、ＷＰ＿０２８２１７２９７、ＷＰ＿０３４５０７０４９、ＫＭＫ６４０８１．１、ＷＰ＿０７００２８０４１．１もしくはＫＺＬ９２４４９．１で識別される酵素の群から選択した酵素、またはその一部分のうち、アルドール脱水生成物の形成を促す部分（例えば、ドメイン、一連のアミノ酸残基（連続的であることも離れていることもできる）など）との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上である。いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号８４、配列番号８５または配列番号８６の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上である。
いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、表１、５、６、７及び８から選択した酵素である。いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、表１、５、６、７及び８から選択した酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上である。
いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼはさらに、タンパク質タグを１つ以上含む。いくつかの実施形態では、そのタンパク質タグは、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ（グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグ）、ＨＡタグ（ヘマグルチニンタグ）、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、マルトース結合タンパク質タグ、キチン結合タンパク質タグ及び蛍光タグから選択されている。
いくつかの実施形態では、第１の外因性核酸及び第２の外因性核酸はそれぞれ、ベクターに含まれている。いくつかの実施形態では、第１の外因性核酸及び第２の外因性核酸はそれぞれ、同じベクターに含まれている。いくつかの実施形態では、第１の外因性核酸及び第２の外因性核酸はそれぞれ、特有の別々のベクターに含まれている。いくつかの実施形態では、そのベクターは、プラスミドである。いくつかの実施形態では、そのベクターは、ウイルスベクターである。
いくつかの実施形態では、キノンオキシドレダクターゼは、ＥＣ番号１．６．５である酵素である。いくつかの実施形態では、キノンオキシドレダクターゼは、ＥＣ番号１．６．５．５である酵素である。いくつかの実施形態では、キノンオキシドレダクターゼは、ＧｅｎＢａｎｋ、ＲｅｆＳｅｑまたはＵｎｉｐｒｏｔのＩＤ番号Ｐ２８３０４、Ｐ４０７８３、Ｑ０Ｋ２Ｉ０、Ａ０Ａ１Ｚ１ＳＲＹ９、Ｐ４３９０３、Ｉ７Ｇ８Ｇ０、またはＱ１４２Ｌ２、ＡＬＫ１９３２４．１、Ａ０Ａ１Ｇ９Ｒ４０８、Ｇ４Ｑ８Ｒ５、ＡＮＡ９８７２３．１、Ｋ０ＥＵＱ３、Ａ０Ａ０６１ＣＲＳ８、Ｑ９Ａ２１２、Ａ０Ａ１Ｉ６ＲＷＷ２、ＷＰ＿０２６１９７２７７．１、Ｑ５ＮＫＺ３、ＷＰ＿０１２３３３０３４．１またはＷＰ＿１３６８９８０００．１で識別される酵素の群から選択した酵素である。いくつかの実施形態では、キノンオキシドレダクターゼは、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７の配列を含む酵素である。
いくつかの実施形態では、キノンオキシドレダクターゼは、ＧｅｎＢａｎｋ、ＲｅｆＳｅｑまたはＵｎｉｐｒｏｔのＩＤ番号Ｐ２８３０４、Ｐ４０７８３、Ｑ０Ｋ２Ｉ０、Ａ０Ａ１Ｚ１ＳＲＹ９、Ｐ４３９０３、Ｉ７Ｇ８Ｇ０、またはＱ１４２Ｌ２、ＡＬＫ１９３２４．１、Ａ０Ａ１Ｇ９Ｒ４０８、Ｇ４Ｑ８Ｒ５、ＡＮＡ９８７２３．１、Ｋ０ＥＵＱ３、Ａ０Ａ０６１ＣＲＳ８、Ｑ９Ａ２１２、Ａ０Ａ１Ｉ６ＲＷＷ２、ＷＰ＿０２６１９７２７７．１、Ｑ５ＮＫＺ３、ＷＰ＿０１２３３３０３４．１またはＷＰ＿１３６８９８０００．１で識別される酵素の群から選択した酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上である。いくつかの実施形態では、キノンオキシドレダクターゼは、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上である。
いくつかの実施形態では、キノンオキシドレダクターゼはさらに、タンパク質タグを１つ以上含む。いくつかの実施形態では、そのタンパク質タグは、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ（グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグ）、ＨＡタグ（ヘマグルチニンタグ）、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、マルトース結合タンパク質タグ、キチン結合タンパク質タグ及び蛍光タグから選択されている。
いくつかの実施形態では、本発明の組み換え微生物は、下記の式の２－ケトカルボン酸を産生でき、
Figure 2022530467000016
式中、Ｒは、Ｈ、ＣＨ３またはＣＨ２ＯＨである。
いくつかの実施形態では、本発明の組み換え微生物は、１，５－ペンタンジオール、１，６－ヘキサンジオール、アジピン酸または６－ヒドロキシヘキサノエートを産生できる。
いくつかの実施形態では、本発明の組み換え微生物は、炭素源からのピルベートの生成を向上させるように、遺伝子が改変されている。いくつかの実施形態では、その炭素源は、グリセロール、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、スクロース及びデンプンまたはこれらを組み合わせたものから選択されている。
別の態様では、本発明で提供するのは、本明細書に開示されている組み換え微生物の集団である。いくつかの実施形態では、その集団は、実質的に均質である。いくつかの実施形態では、実質的に均質とは、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上均質であることを指す。
別の態様では、本発明で提供するのは、１，５－ペンタンジオール、１，６－ヘキサンジオール、アジピン酸または６－ヒドロキシヘキサノエートの生成方法であって、本明細書に開示されている集団を適切な条件下で培養することを含む方法である。いくつかの実施形態では、その方法は、１，５－ペンタンジオール、１，６－ヘキサンジオール、アジピン酸または６－ヒドロキシヘキサノエートを培養液または微生物から単離することをさらに含む。
特定の実施形態の詳細な説明
とりわけ、本開示には、特定のポリペプチド、例えば、ヒドラターゼ－アルドラーゼポリペプチドであるか、またはヒドラターゼ－アルドラーゼポリペプチドを含む様々なアルドール脱水生成物生合成ポリペプチドを用いて、各種化合物を効果的に生成させることができるという認識が含まれる。いくつかの実施形態では、本開示により、様々なアルデヒド、例えば、本明細書に記載されている様々な脂肪族アルデヒドであって、上記のようなポリペプチドの天然及び／または既知のアルデヒド基質とは構造的に異なる脂肪族アルデヒドが、本明細書に記載されているアルドール脱水生成物生合成ポリペプチドを用いて、多くの生成物を効率的に製造するのに利用できることが示されている。とりわけ、本開示により、単一のアルドール脱水生成物生合成ポリペプチド（例えば、本明細書に記載されているような様々なヒドラターゼ－アルドラーゼポリペプチド）が、様々なアルドール脱水生成物の生成を触媒できることが示されている。
いくつかの実施形態では、本開示は、
ピルベート及びアルデヒドをアルドール脱水生成物生合成ポリペプチドと接触させて、アルドール脱水生成物を生成させるようにすることを含む方法であって、
そのアルドール脱水生成物が、アルデヒド基またはケトン基と、そのアルデヒド基またはケトン基と共役した二重結合を含む化合物である方法を提供する。
いくつかの実施形態では、アルデヒドは、脂肪族アルデヒドである。いくつかの実施形態では、アルデヒドの－ＣＨＯ基は、例えば、二重結合、三重結合または芳香族基に共役していない。
いくつかの実施形態では、本開示は、
ピルベート及び脂肪族アルデヒドをアルドール脱水生成物生合成ポリペプチドと接触させて、アルドール脱水生成物を生成させるようにすることを含む方法であって、
その脂肪族アルデヒドのカルボニル基が、アルケニル基、アルキニル基または芳香族基に共役しておらず、
そのアルドール脱水生成物が、アルデヒド基またはケトン基と、そのアルデヒド基またはケトン基と共役した二重結合を含む化合物である方法を提供する。
いくつかの実施形態では、アルドール脱水生成物生合成ポリペプチドは、ヒドラターゼ－アルドラーゼポリペプチド、例えば、本明細書に例示されているヒドラターゼ－アルドラーゼポリペプチドであるか、またはそのヒドラターゼ－アルドラーゼポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、提供する方法は、ピルベート及び脂肪族アルデヒドをヒドラターゼ－アルドラーゼと接触させて、アルドール脱水生成物を生成させることを含む。
いくつかの実施形態では、アルドール脱水生成物生合成ポリペプチドは、アルドラーゼポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、アルドール脱水生成物生合成ポリペプチドは、ヒドラターゼポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、アルドール脱水生成物生合成ポリペプチドは、ヒドラターゼ－アルドラーゼポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、アルドール脱水生成物生合成ポリペプチドは、ヒドラターゼ－アルドラーゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼポリペプチドは、本明細書に記載されているようなヒドラターゼ－アルドラーゼ、例えば、ＥＣ番号４．１．２．４５もしくはＥＣ番号４．１．２．３４もしくはＥＣ４．１．１．４である酵素、または表１及び５～８から選択した酵素であるか、またはその酵素を含む。
いくつかの実施形態では、アルドール脱水生成物生合成ポリペプチドは、生物、例えば微生物内にある。いくつかの実施形態では、生物は、操作されたアルドール脱水生成物生合成ポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、生物は、向上したレベル及び／または活性のアルドール脱水生成物生合成ポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、生物は、アルドール脱水生成物を産生させる速度及び／または収量を向上させる。いくつかの実施形態では、生物は、アルドール脱水生成物を生成させる際の基質利用率を向上させる。
いくつかの実施形態では、ピルベート及び脂肪族アルデヒドのアルドール脱水生成物への変換は、アルドール脱水生成物生合成ポリペプチドによって触媒される。
いくつかの実施形態では、アルドール脱水生成物は、代替的な経路を通じてもたらすことができる。いくつかの実施形態では、アルドール脱水生成物は、アルドール生成物から生成される。
いくつかの実施形態では、本開示は、
ピルベート及びアルデヒドをアルドール生成物生合成ポリペプチドと接触させて、アルドール生成物を生成させるようにすることを含む方法であって、
そのアルドール脱水生成物が、アルデヒド基またはケトン基と、そのアルデヒド基またはケトン基と共役した二重結合を含む化合物である方法を提供する。
いくつかの実施形態では、アルデヒドは、脂肪族アルデヒドである。いくつかの実施形態では、アルデヒドの－ＣＨＯ基は、二重結合、三重結合または芳香族基に共役していない。
いくつかの実施形態では、本開示は、
ピルベート及び脂肪族アルデヒドをアルドール生成物生合成ポリペプチドと接触させて、アルドール生成物を生成させるようにすることを含む方法であって、
その脂肪族アルデヒドのカルボニル基が、アルケニル基、アルキニル基または芳香族基に共役しておらず、
そのアルドール生成物が、アルデヒド基またはケトン基と、アルデヒド基またはケトンカルボニル基のβ－炭素に結合したヒドロキシル基を含む化合物である方法を提供する。
本開示の様々な方法は、生合成ポリペプチドを用いることを含む。いくつかの実施形態では、特定の生成物とともに用いるときには、生合成ポリペプチド、例えば、アルドール生成物生合成ポリペプチド、還元生成物生合成ポリペプチドなどは、その特定の生成物の合成に関与するポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、生合成ポリペプチドは、特定の生成物とともに用いるときには、その特定の生成物の形成を触媒する酵素であるか、またはその酵素を含む。いくつかの実施形態では、生合成ポリペプチドは、天然において、例えば微生物内で（例えば、天然において見られる特定の生成物に対する参照生合成ポリペプチドにおいて）見られるアミノ酸配列を有する。上記の代わりにまたは上記に加えて、いくつかの実施形態では、生合成ポリペプチドは、適切な参照生合成ポリペプチド（例えば、天然において見られるようなもの、及び／または本明細書（例えば、関連する表のうちの１つ以上）に示されているようなもの）、あるいはその一部分（例えば、関連する反応を促進する部分（例えば、ドメイン（例えば、関連する触媒ドメイン）及び／または一連のアミノ酸残基（連続する残基であることも、または離れた残基であることもできる）））と、特徴的な配列エレメント及び／または全体の同一性パーセントを共有する。
いくつかの実施形態では、アルドール生成物生合成ポリペプチドは、アルドラーゼポリペプチドであるか、またはアルドラーゼポリペプチドを含む。本開示を読んでいる当業者には、本開示に従って、様々なアルドラーゼポリペプチドを使用できることは明らかである。いくつかの実施形態では、アルドラーゼポリペプチドは、ＵＳ２０１７００４４５５１に記載されているアルドラーゼであるか、またはそのアルドラーゼを含み、それらのアルドラーゼは、参照により、本明細書に援用される。
いくつかの実施形態では、アルドール生成物生合成ポリペプチドは、本明細書に記載されているようなアルドラーゼ－ヒドラターゼであるか、またはそのアルドラーゼ－ヒドラターゼを含む。
いくつかの実施形態では、アルドール生成物生合成ポリペプチドは、微生物のような生物内にある。いくつかの実施形態では、生物は、操作されているかまたは外因性であるアルドール生成物生合成ポリペプチドを、多くの場合には、上昇したタンパク質レベル及び／または活性レベルで発現するように操作されている。いくつかの実施形態では、ピルベート及び脂肪族アルデヒドのアルドール生成物への変換は、アルドール生成物生合成ポリペプチドによって触媒される。いくつかの実施形態では、方法は、培養液、例えば細菌培養液で行う。他の生合成ポリペプチドにおいては、アルドール生成物生合成ポリペプチドは、細菌のような生物内にあってもよく、操作されていてもよく、及び／または上昇したタンパク質レベル及び／または活性レベルで発現させてもよく、それらの生成物は、向上した速度及び／または収量及び／または基質利用率で生成されてよい。
いくつかの実施形態では、アルドール生成物は、酵素の触媒によるか、生合成によるか、または酵素触媒反応のない従来型の有機合成によるかのいずれかで、アルドール脱水生成物に変換させせる。いくつかの実施形態では、変換は、アルドール生成物を脱水生成物生合成ポリペプチドと接触させて、アルドール脱水生成物を生成させるようにすることを含む。いくつかの実施形態では、脱水生成物生合成ポリペプチドは、ヒドラターゼであるか、またはヒドラターゼを含む。いくつかの実施形態では、脱水生成物生合成ポリペプチドは、デヒドラターゼであるか、またはデヒドラターゼを含む。いくつかの実施形態では、ヒドラターゼまたはデヒドラターゼは、ＵＳ２０１７００４４５５１に記載されており、それらのヒドラターゼ及びデヒドラターゼは、参照により、本明細書に援用される。他の生合成ポリペプチドにおいては、脱水生成物生合成ポリペプチドは、細菌のような生物内にあってもよく、操作されていてもよく、及び／または上昇したタンパク質レベル及び／または活性レベルで発現させてもよく、それらの生成物は、向上した速度及び／または収量及び／または基質利用率で生成されてよい。
当業者には明らかなように、アルドール脱水生成物を用いて、様々な生成物、例えば、１，５－ペンタンジオール、１，６－ヘキサンジオール、６ＨＨ、アジピン酸などを製造でき、これらの生成物を用いて、ポリマー、樹脂、塗料生成物などのような広範な生成物を製造できる。いくつかの実施形態では、アルドール脱水生成物の利用には、１つ以上の化学変換が含まれ、そのそれぞれが独立して、ポリペプチド（例えば、本明細書に記載されている酵素）によって、任意に生物内で触媒されてもよいし、または酵素を利用しない従来型の化学プロセスによって行われてもよい。当業者には明らかなように、１つ以上またはすべての工程は、１つ以上の生物（そのそれぞれは独立して、その生物内自体で産生された基質（複数可）、もしくはその生物外に由来する基質（複数可）を用いて、１つ以上の反応を行ってよい）、及び／または独立して１つ以上の種類の生物を含む１つ以上の培養液（それぞれ独立して、その培養液自体で産生された基質（複数可）、もしくは培養液に由来する基質（複数可）（例えば、フィード化合物、別の生物によって産生された化合物など）を用いて、１つ以上の反応を行ってよい）で行うことができる。いくつかの実施形態では、１つ以上またはすべての生合成ポリペプチドは独立して、任意に操作された１つの生物、例えば細菌内にある。いくつかの実施形態では、生成物を生成する生合成ポリペプチドセットのうちの１つ以上は、任意に操作された１つの生物、例えば細菌内で発現させ、そのセットにおける他の生合成ポリペプチドのうちの１つ以上は、任意に操作された１つ以上の他の生物、例えば細菌内で発現させる。いくつかの実施形態では、生物、例えば細菌は、その生合成ポリペプチドのうちの１つ以上またはすべてをコードする外因性核酸を１つ以上含むように操作されている。いくつかの実施形態では、生成物の製造は、細菌を１つ以上含む単一の培養液で行う複数の反応工程を含み、それらの細菌はそれぞれ独立して、必要な生合成ポリペプチドを１つ以上またはすべて含み、合わさると、必要な生合成ポリペプチドをすべて含む。いくつかの実施形態では、生成物の製造は、２つ以上の培養液で行う複数の反応工程を含み、それらの培養液はそれぞれ独立して、細菌を１つ以上含み、それらの細菌は独立して、必要な生合成ポリペプチドを１つ以上またはすべて含み、合わさると、必要な生合成ポリペプチドをすべて含む。
例えば、いくつかの実施形態では、アルドール脱水生成物の二重結合は、単結合に変換される。
いくつかの実施形態では、本開示は、
アルケンをアルケン還元生成物生合成ポリペプチドと接触させて、アルケン還元生成物を生成させるようにすることを含む方法であって、
そのアルケンが、カルボニル基に共役した二重結合を含み、
そのアルケンにおける、カルボニル基に共役した二重結合を還元して単結合にして、アルケン還元生成物をもたらす方法を提供する。
いくつかの実施形態では、アルケンは、アルドール脱水生成物である。
いくつかの実施形態では、アルケン還元生成物生合成ポリペプチドは、本明細書に記載されているように、アルドール脱水生成物、例えば２－オキソ－３－エン酸の還元を触媒する酵素であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、このような酵素は、本明細書に記載されているようなキノンオキシドレダクターゼである。いくつかの実施形態では、このような酵素は、ＥＣ１．６．５に属するものである。いくつかの実施形態では、このような酵素は、ＥＣ１．６．５．５に属するものである。いくつかの実施形態では、このような酵素は、表９から選択したものである。
いくつかの実施形態では、アルケン還元生成物生合成ポリペプチドは、生物、例えば微生物内にある。いくつかの実施形態では、生物は、操作されたアルケン還元生成物生合成ポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、生物は、向上したレベル及び／または活性のアルケン還元生成物生合成ポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、生物は、アルケン還元生成物を産生させる速度及び／または収量を向上させる。いくつかの実施形態では、生物は、アルケン還元生成物を生成させる際の基質利用率を向上させる。
いくつかの実施形態では、アルケン還元生成物生合成ポリペプチドは、操作なしに、生物によって内因的にコード及び／または発現される酵素であるか、またはその酵素を含む。
本開示を読んでいる当業者には、本開示に従って、様々なアルデヒドを用いてよいことは明らかである。いくつかの実施形態では、アルデヒドは、生合成ポリペプチド、例えば、ヒドラターゼ－アルドラーゼであるか、またはヒドラターゼ－アルドラーゼを含むアルドール脱水生成物生合成ポリペプチドの天然または既知の基質である。いくつかの実施形態では、アルデヒドは、天然または既知の基質ではない。例えば、とりわけ、本開示によって、その天然または既知の基質が芳香族アルデヒドまたは共役アルデヒドであるヒドラターゼ－アルドラーゼを用いて生成物を製造するのに、脂肪族アルデヒドを利用できることが示されている。
いくつかの実施形態では、アルデヒドは、脂肪族アルデヒドである。いくつかの実施形態では、アルデヒドは、α－水素を１つまたは２つ有する。いくつかの実施形態では、アルデヒドは、下記の式Ａ－１の構造
Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－Ｃ（Ｏ）Ｈ
Ａ－１
またはその塩を有し、式中、
Ｒａは、Ｒ”または－ＯＲ”であり、
Ｌ１及びＬ２のそれぞれは独立して、共有結合であるか、または２価の任意に置換された直鎖もしくは分岐鎖のＣ１－２０脂肪族基もしくはＣ１－２０ヘテロ脂肪族基であり、そのメチレン単位の１つ以上は任意にかつ独立して、－Ｃ≡Ｃ－、－Ｃ（Ｒ”）２－、－Ｃｙ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｎ（Ｒ”）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（ＮＲ”）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）－、－Ｎ（Ｒ”）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）－、－Ｎ（Ｒ”）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ”）－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－によって置き換えられており、
－Ｃｙ－は、２価の任意に置換された３～２０員の単環、二環または多環であり、その各単環は独立して、ヘテロ原子を０～５個有する任意に置換されているか、飽和であるか、部分飽和であるか、または芳香族である３～２０員環であり、
各Ｒ”は独立して、－Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＣＯ２Ｒ’または－ＳＯ２Ｒ’であり、
Ｒ’は、水素であるか、またはＣ１－１０脂肪族基、ヘテロ原子を１～５個有するＣ１－１０ヘテロ脂肪族基、６～１０員のアリール環、ヘテロ原子を１～５個有する５～１０員のヘテロアリール環、及びヘテロ原子を１～５個有する３～１０員のヘテロ環から選択した任意に置換された基であるか、あるいは
２つ以上のＲ’基が、介在する原子と一体となって、ヘテロ原子を、その介在する原子に加えて０～５個有する任意に置換された３～２０員の単環、二環または多環を形成し、その各単環は独立して、ヘテロ原子を０～５個有する任意に置換されているか、飽和であるか、部分飽和であるか、または芳香族である３～２０員環である。
いくつかの実施形態では、アルドール生成物は、下記の式Ｐ－１の構造
Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－Ｃ（Ｏ）ＯＨ
Ｐ－１
またはその塩を有し、式中、
Ｒａは、Ｒ”または－ＯＲ”であり、
Ｌ１及びＬ２のそれぞれは独立して、共有結合であるか、または２価の任意に置換された直鎖もしくは分岐鎖のＣ１－２０脂肪族基もしくはＣ１－２０ヘテロ脂肪族基であり、そのメチレン単位の１つ以上は任意にかつ独立して、－Ｃ≡Ｃ－、－Ｃ（Ｒ”）２－、－Ｃｙ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｎ（Ｒ”）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（ＮＲ”）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）－、－Ｎ（Ｒ”）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）－、－Ｎ（Ｒ”）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ”）－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－によって置き換えられており、
－Ｃｙ－は、２価の任意に置換された３～２０員の単環、二環または多環であり、その各単環は独立して、ヘテロ原子を０～５個有する任意に置換されているか、飽和であるか、部分飽和であるか、または芳香族である３～２０員環であり、
各Ｒ”は独立して、－Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＣＯ２Ｒ’または－ＳＯ２Ｒ’であり、
Ｒ’は、水素であるか、またはＣ１－１０脂肪族基、ヘテロ原子を１～５個有するＣ１－１０ヘテロ脂肪族基、６～１０員のアリール環、ヘテロ原子を１～５個有する５～１０員のヘテロアリール環、及びヘテロ原子を１～５個有する３～１０員のヘテロ環から選択した任意に置換された基であるか、あるいは
２つ以上のＲ’基が、介在する原子と一体となって、ヘテロ原子を、その介在する原子に加えて０～５個有する任意に置換された３～２０員の単環、二環または多環を形成し、その各単環は独立して、ヘテロ原子を０～５個有する任意に置換されているか、飽和であるか、部分飽和であるか、または芳香族である３～２０員環である。
いくつかの実施形態では、アルドール脱水生成物は、下記の式Ｐ－２の構造
Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ＝ＣＨ－Ｃ（Ｏ）－Ｃ（Ｏ）ＯＨ
Ｐ－２
またはその塩を有し、その式中、
Ｒａは、Ｒ”または－ＯＲ”であり、
Ｌ１及びＬ２のそれぞれは独立して、共有結合であるか、または２価の任意に置換された直鎖もしくは分岐鎖のＣ１－２０脂肪族基もしくはＣ１－２０ヘテロ脂肪族基であり、そのメチレン単位の１つ以上は任意にかつ独立して、－Ｃ≡Ｃ－、－Ｃ（Ｒ”）２－、－Ｃｙ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｎ（Ｒ”）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（ＮＲ”）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）－、－Ｎ（Ｒ”）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）－、－Ｎ（Ｒ”）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ”）－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－によって置き換えられており、
－Ｃｙ－は、２価の任意に置換された３～２０員の単環、二環または多環であり、その各単環は独立して、ヘテロ原子を０～５個有する任意に置換されているか、飽和であるか、部分飽和であるか、または芳香族である３～２０員環であり、
各Ｒ”は独立して、－Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＣＯ２Ｒ’または－ＳＯ２Ｒ’であり、
Ｒ’は、水素であるか、またはＣ１－１０脂肪族基、ヘテロ原子を１～５個有するＣ１－１０ヘテロ脂肪族基、６～１０員のアリール環、ヘテロ原子を１～５個有する５～１０員のヘテロアリール環、及びヘテロ原子を１～５個有する３～１０員のヘテロ環から選択した任意に置換された基であるか、あるいは
２つ以上のＲ’基が、介在する原子と一体となって、ヘテロ原子を、その介在する原子に加えて０～５個有する任意に置換された３～２０員の単環、二環または多環を形成し、その各単環は独立して、ヘテロ原子を０～５個有する任意に置換されているか、飽和であるか、部分飽和であるか、または芳香族である３～２０員環である。
いくつかの実施形態では、式Ｐ－２の－ＣＨ＝ＣＨ－は、Ｅ体である。いくつかの実施形態では、式Ｐ－２の－ＣＨ＝ＣＨ－は、Ｚ体である。
いくつかの実施形態では、アルケン還元生成物は、下記の式Ｐ－３の構造
Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－Ｃ（Ｏ）ＯＨ
Ｐ－３
またはその塩を有し、式中、
Ｒａは、Ｒ”または－ＯＲ”であり、
Ｌ１及びＬ２のそれぞれは独立して、共有結合であるか、または２価の任意に置換された直鎖もしくは分岐鎖のＣ１－２０脂肪族基もしくはＣ１－２０ヘテロ脂肪族基であり、そのメチレン単位の１つ以上は任意にかつ独立して、－Ｃ≡Ｃ－、－Ｃ（Ｒ”）２－、－Ｃｙ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｎ（Ｒ”）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（ＮＲ”）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）－、－Ｎ（Ｒ”）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）－、－Ｎ（Ｒ”）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ”）－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－によって置き換えられており、
－Ｃｙ－は、２価の任意に置換された３～２０員の単環、二環または多環であり、その各単環は独立して、ヘテロ原子を０～５個有する任意に置換されているか、飽和であるか、部分飽和であるか、または芳香族である３～２０員環であり、
各Ｒ”は独立して、－Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＣＯ２Ｒ’または－ＳＯ２Ｒ’であり、
Ｒ’は、水素であるか、またはＣ１－１０脂肪族基、ヘテロ原子を１～５個有するＣ１－１０ヘテロ脂肪族基、６～１０員のアリール環、ヘテロ原子を１～５個有する５～１０員のヘテロアリール環、及びヘテロ原子を１～５個有する３～１０員のヘテロ環から選択した任意に置換された基であるか、あるいは
２つ以上のＲ’基が、介在する原子と一体となって、ヘテロ原子を、その介在する原子に加えて０～５個有する任意に置換された３～２０員の単環、二環または多環を形成し、その各単環は独立して、ヘテロ原子を０～５個有する任意に置換されているか、飽和であるか、部分飽和であるか、または芳香族である３～２０員環である。
いくつかの実施形態では、Ｒａは、Ｒ”である。いくつかの実施形態では、Ｒａは、－ＯＲ”である。
いくつかの実施形態では、Ｒ”は、Ｒ’である。いくつかの実施形態では、Ｒ”は、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’である。いくつかの実施形態では、Ｒ”は、－ＣＯ２Ｒ’である。いくつかの実施形態では、Ｒ”は、－ＳＯ２Ｒ’である。
いくつかの実施形態では、Ｒ’は、水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ’は、水素ではない。
いくつかの実施形態では、Ｒａは、Ｒ’である。いくつかの実施形態では、Ｒａは、－ＯＲ’である。いくつかの実施形態では、Ｒａは、－Ｈである。いくつかの実施形態では、Ｒａは、－ＯＨである。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、共有結合である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、共有結合ではない。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、任意に置換されたＣ１－６アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、任意に置換された直鎖Ｃ１－６アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、任意に置換された－ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、任意に置換された－ＣＨ２ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、任意に置換された－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、任意に置換された－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、任意に置換された－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、任意に置換された－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、－Ｃ（Ｏ）Ｈに結合した－ＣＨ２－は、非置換である。いくつかの実施形態では、－Ｃ（Ｏ）Ｈに結合した－ＣＨ２－は、一置換である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、置換されている。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、非置換である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、－ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、－ＣＨ２ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、共有結合である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、共有結合ではない。
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、任意に置換されたＣ１－６アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、任意に置換された直鎖Ｃ１－６アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、任意に置換された－ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、任意に置換された－ＣＨ２ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、任意に置換された－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、任意に置換された－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、任意に置換された－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、任意に置換された－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、－Ｃ（Ｏ）Ｈに結合した－ＣＨ２－は、非置換である。いくつかの実施形態では、－Ｃ（Ｏ）Ｈに結合した－ＣＨ２－は、一置換である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、置換されている。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、非置換である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、－ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、－ＣＨ２ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。
いくつかの実施形態では、Ｌ１及びＬ２のうちの少なくとも１つは、共有結合ではない。
いくつかの実施形態では、アルデヒドは、ＣＨ３ＣＨＯである。いくつかの実施形態では、アルデヒドは、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨＯである。いくつかの実施形態では、アルデヒドは、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨＯである。いくつかの実施形態では、アルデヒドは、ＣＨ２ＯＨＣＨＯである。いくつかの実施形態では、アルデヒドは、ＣＨ２ＯＨＣＨ２ＣＨＯである。いくつかの実施形態では、アルデヒドは、ＣＨ２ＯＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨＯである。
いくつかの実施形態では、アルドール生成物は、ＣＨ３ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＣＯＯＨである。いくつかの実施形態では、アルドール生成物は、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＣＯＯＨである。いくつかの実施形態では、アルドール生成物は、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＣＯＯＨである。いくつかの実施形態では、アルドール生成物は、ＣＨ２ＯＨＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＣＯＯＨである。いくつかの実施形態では、アルドール生成物は、ＣＨ２ＯＨＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＣＯＯＨである。いくつかの実施形態では、アルドール生成物は、ＣＨ２ＯＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＣＯＯＨである。
いくつかの実施形態では、アルドール脱水生成物は、ＣＨ３ＣＨ＝ＣＨＣ（Ｏ）ＣＯＯＨである。いくつかの実施形態では、アルドール脱水生成物は、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣ（Ｏ）ＣＯＯＨである。いくつかの実施形態では、アルドール脱水生成物は、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣ（Ｏ）ＣＯＯＨである。いくつかの実施形態では、アルドール脱水生成物は、ＣＨ２ＯＨＣＨ＝ＣＨＣ（Ｏ）ＣＯＯＨである。いくつかの実施形態では、アルドール脱水生成物は、ＣＨ２ＯＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣ（Ｏ）ＣＯＯＨである。いくつかの実施形態では、アルドール脱水生成物は、ＣＨ２ＯＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣ（Ｏ）ＣＯＯＨである。
いくつかの実施形態では、アルケン還元生成物は、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＣＯＯＨである。いくつかの実施形態では、アルケン還元生成物は、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＣＯＯＨである。いくつかの実施形態では、アルケン還元生成物は、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＣＯＯＨである。いくつかの実施形態では、アルケン還元生成物は、ＣＨ２ＯＨＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＣＯＯＨである。いくつかの実施形態では、アルケン還元生成物は、ＣＨ２ＯＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＣＯＯＨである。いくつかの実施形態では、アルケン還元生成物は、ＣＨ２ＯＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＣＯＯＨである。
いくつかの実施形態では、アルケン還元生成物は、酵素の触媒によるか、生合成によるか、または酵素触媒反応のない従来型の有機合成によるかのいずれかで、カルボニル還元生成物に変換させる。いくつかの実施形態では、アルケン還元生成物は、カルボニル基を含み、そのカルボニル基は、－ＣＨ（ＯＨ）－に変換される。いくつかの実施形態では、方法は、アルケン還元生成物をカルボニル還元生成物生合成ポリペプチドと接触させて、カルボニル還元生成物を生成させるようにすることを含み、
そのアルケン還元生成物は、カルボニル基を含み、
そのアルケン還元生成物のカルボニル基は、－ＣＨ（ＯＨ）－に変換される。
いくつかの実施形態では、カルボニル還元生成物生合成ポリペプチドは、レダクターゼであるか、またはレダクターゼを含む。いくつかの実施形態では、カルボニル還元生成物生合成ポリペプチドは、本明細書に記載されているようなケトレダクターゼであるか、またはそのようなケトレダクターゼを含む。いくつかの実施形態では、カルボニル還元生成物生合成ポリペプチドは、本明細書に記載されているような２－ケト酸－２－レダクターゼであるか、またはそのような２－ケト酸－２－レダクターゼを含む。いくつかの実施形態では、このような酵素は、本明細書に記載されているような６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼである。いくつかの実施形態では、このような酵素は、ＵＳ２０１７００４４５５１に記載されており、それらの酵素は、参照により、本明細書に援用される。
いくつかの実施形態では、アルケン還元生成物のカルボニル還元生成物への変換は、カルボニル還元生成物生合成ポリペプチドによって触媒される。
多くの他の生合成ポリペプチドにおいては、カルボニル還元生成物生合成ポリペプチドは、細菌のような生物内にあってもよく、操作されていてもよく、及び／または上昇したタンパク質レベル及び／または活性レベルで発現させてもよく、それらの生成物は、向上した速度及び／または収量及び／または基質利用率で生成されてよい。
いくつかの実施形態では、カルボニル還元生成物は、下記の式Ｐ－４の構造
Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－Ｃ（Ｏ）ＯＨ
Ｐ－４
またはその塩を有し、式中、各可変基は独立して、本明細書に記載されているとおりである。
いくつかの実施形態では、カルボニル還元生成物は、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨである。いくつかの実施形態では、カルボニル還元生成物は、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨである。いくつかの実施形態では、カルボニル還元生成物は、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨである。いくつかの実施形態では、カルボニル還元生成物は、ＣＨ２ＯＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨである。いくつかの実施形態では、カルボニル還元生成物は、ＣＨ２ＯＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨである。いくつかの実施形態では、カルボニル還元生成物は、ＣＨ２ＯＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨである。
いくつかの実施形態では、カルボニル還元生成物は、酵素の触媒によるか、生合成によるか、または酵素触媒反応のない従来型の有機合成によるかのいずれかで、ＣｏＡ転移生成物に変換させる。いくつかの実施形態では、ＣｏＡ転移生成物は、下記の式Ｐ－５の化合物
Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－Ｃ（Ｏ）－Ｓ－ＣｏＡ
Ｐ－５
またはその塩であり、式中、各可変基は独立して、本明細書に記載されているとおりである。
いくつかの実施形態では、このような変換は、ＣｏＡ（ＣｏＡ＝コエンザイムＡ）転移生成物生合成ポリペプチドによって触媒される。いくつかの実施形態では、ＣｏＡ転移生成物生合成ポリペプチドは、本明細書に記載されているようなＣｏＡトランスフェラーゼ、例えば２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼであるか、またはそのようなＣｏＡトランスフェラーゼを含む。いくつかの実施形態では、ＣｏＡトランスフェラーゼは、ＵＳ２０１７００４４５５１に記載されているＣｏＡトランスフェラーゼであり、それらのＣｏＡトランスフェラーゼは、参照により、本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、このような変換は、ＣｏＡ転移生成物生合成ポリペプチドによって触媒される。
多くの他の生合成ポリペプチドにおいては、ＣｏＡ転移生成物生合成ポリペプチドは、細菌のような生物内にあってもよく、操作されていてもよく、及び／または上昇したタンパク質レベル及び／または活性レベルで発現させてもよく、それらの生成物は、向上した速度及び／または収量及び／または基質利用率で生成されてよい。
いくつかの実施形態では、ＣｏＡ転移生成物は、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）Ｃ（Ｏ）Ｓ－ＣｏＡである。いくつかの実施形態では、ＣｏＡ転移生成物は、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）Ｃ（Ｏ）Ｓ－ＣＯＡである。いくつかの実施形態では、ＣｏＡ転移生成物は、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）Ｃ（Ｏ）Ｓ－ＣＯＡである。いくつかの実施形態では、ＣｏＡ転移生成物は、ＣＨ２ＯＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）Ｃ（Ｏ）Ｓ－ＣＯＡである。いくつかの実施形態では、ＣｏＡ転移生成物は、ＣＨ２ＯＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）Ｃ（Ｏ）Ｓ－ＣＯＡである。いくつかの実施形態では、ＣｏＡ転移生成物は、ＣＨ２ＯＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）Ｃ（Ｏ）Ｓ－ＣＯＡである。
いくつかの実施形態では、ＣｏＡ転移生成物は、酵素の触媒によるか、生合成によるか、または酵素触媒反応のない従来型の有機合成によるかのいずれかで、脱水生成物に変換させる。いくつかの実施形態では、脱水生成物は、下記の式Ｐ－６の化合物
Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ－Ｃ（Ｏ）－Ｓ－ＣｏＡ
Ｐ－６
またはその塩であり、式中、各可変基は独立して、本明細書に記載されているとおりである。
いくつかの実施形態では、このような変換は、脱水生成物生合成ポリペプチドによって触媒される。いくつかの実施形態では、脱水生成物生合成ポリペプチドは、本明細書に記載されているようなデヒドラターゼであるか、またはそのようなデヒドラターゼを含む。いくつかの実施形態では、デヒドラターゼは、本明細書に記載されているような２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼであるか、またはそのような２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼを含む。いくつかの実施形態では、デヒドラターゼは、ＵＳ２０１７００４４５５１に記載されており、それらのデヒドラターゼは、参照により援用される。
いくつかの実施形態では、このような変換は、脱水生成物生合成ポリペプチドによって触媒される。
多くの他の生合成ポリペプチドにおいては、脱水生成物生合成ポリペプチドは、細菌のような生物内にあってもよく、操作されていてもよく、及び／または上昇したタンパク質レベル及び／または活性レベルで発現させてもよく、それらの生成物は、向上した速度及び／または収量及び／または基質利用率で生成されてよい。
いくつかの実施形態では、脱水生成物は、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣ（Ｏ）Ｓ－ＣｏＡである。いくつかの実施形態では、脱水生成物は、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣ（Ｏ）Ｓ－ＣＯＡである。いくつかの実施形態では、脱水生成物は、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣ（Ｏ）Ｓ－ＣＯＡである。いくつかの実施形態では、脱水生成物は、ＣＨ２ＯＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣ（Ｏ）Ｓ－ＣＯＡである。いくつかの実施形態では、脱水生成物は、ＣＨ２ＯＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣ（Ｏ）Ｓ－ＣＯＡである。いくつかの実施形態では、脱水生成物は、ＣＨ２ＯＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣ（Ｏ）Ｓ－ＣＯＡである。
いくつかの実施形態では、脱水生成物、例えば、式Ｐ－６の化合物またはその塩は、酵素の触媒によるか、生合成によるか、または酵素触媒反応のない従来型の有機合成によるかのいずれかで、還元生成物に変換させる。いくつかの実施形態では、還元生成物は、下記の式Ｐ－７の化合物
Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－Ｓ－ＣｏＡ
Ｐ－７
またはその塩であり、式中、各可変基は独立して、本明細書に記載されているとおりである。
いくつかの実施形態では、このような変換は、還元生成物生合成ポリペプチドによって触媒される。いくつかの実施形態では、還元生成物生合成ポリペプチドは、２，３－エノイルＣｏＡレダクターゼ、２，３－デヒドロカルボキシルＣｏＡ２’３－レダクターゼ、例えば本明細書に記載されているような２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、適切なレダクターゼは、ＵＳ２０１７００４４５５１に記載されており、それらのレダクターゼは、参照により、本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、このような変換は、還元生成物生合成ポリペプチドによって触媒される。
多くの他の生合成ポリペプチドにおいては、還元生成物生合成ポリペプチドは、細菌のような生物内にあってもよく、操作されていてもよく、及び／または上昇したタンパク質レベル及び／または活性レベルで発現させてもよく、それらの生成物は、向上した速度及び／または収量及び／または基質利用率で生成されてよい。
いくつかの実施形態では、還元生成物は、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｓ－ＣｏＡである。いくつかの実施形態では、還元生成物は、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｓ－ＣＯＡである。いくつかの実施形態では、還元生成物は、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｓ－ＣＯＡである。いくつかの実施形態では、還元生成物は、ＣＨ２ＯＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｓ－ＣＯＡである。いくつかの実施形態では、還元生成物は、ＣＨ２ＯＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｓ－ＣＯＡである。いくつかの実施形態では、還元生成物は、ＣＨ２ＯＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｓ－ＣＯＡである。
いくつかの実施形態では、還元生成物、例えば、式Ｐ－７の化合物またはその塩は、酵素の触媒によるか、生合成によるか、または酵素触媒反応のない従来型の有機合成によるかのいずれかで、ＣｏＡ転移生成物に変換させる。いくつかの実施形態では、ＣｏＡ転移生成物は、下記の式Ｐ－８の化合物
Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－ＯＨ
Ｐ－８
またはその塩であり、式中、各可変基は独立して、本明細書に記載されているとおりである。
いくつかの実施形態では、このような変換は、ＣｏＡ転移生成物生合成ポリペプチドによって触媒される。いくつかの実施形態では、ＣｏＡ転移生成物生合成ポリペプチドは、本明細書に記載されているようなＣｏＡトランスフェラーゼ、例えば、本明細書に記載されているような６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼであるか、またはそのＣｏＡトランスフェラーゼを含む。いくつかの実施形態では、ＣｏＡトランスフェラーゼは、ＵＳ２０１７００４４５５１に記載されており、それらのＣｏＡトランスフェラーゼは、参照により、本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、このような変換は、ＣｏＡ転移生成物生合成ポリペプチドによって触媒される。
多くの他の生合成ポリペプチドにおいては、ＣｏＡ転移生成物生合成ポリペプチドは、細菌のような生物内にあってもよく、操作されていてもよく、及び／または上昇したタンパク質レベル及び／または活性レベルで発現させてもよく、それらの生成物は、向上した速度及び／または収量及び／または基質利用率で生成されてよい。
いくつかの実施形態では、ＣｏＡ転移生成物は、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＨである。いくつかの実施形態では、ＣｏＡ転移生成物は、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＨである。いくつかの実施形態では、ＣｏＡ転移生成物は、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＨである。いくつかの実施形態では、ＣｏＡ転移生成物は、ＣＨ２ＯＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＨである。いくつかの実施形態では、ＣｏＡ転移生成物は、ＣＨ２ＯＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＨである。いくつかの実施形態では、ＣｏＡ転移生成物は、ＣＨ２ＯＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＨである。
いくつかの実施形態では、ＣｏＡ転移生成物、例えば、式Ｐ－８の化合物またはその塩（式中、Ｒａが－ＯＨである）は、酵素の触媒によるか、生合成によるか、または酵素触媒反応のない従来型の有機合成によるかのいずれかで、酸化生成物に変換させる。いくつかの実施形態では、酸化生成物は、下記の式Ｐ－９の化合物
Ｈ－Ｃ（Ｏ）－Ｌ２’－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－ＯＨ
Ｐ－９
またはその塩であり、式中、Ｌ２’は、共有結合、または２価の任意に置換された直鎖もしくは分岐鎖のＣ１－１９脂肪族基もしくはＣ１－１９ヘテロ脂肪族基であり、そのメチレン単位の１つ以上は任意にかつ独立して、－Ｃ≡Ｃ－、－Ｃ（Ｒ”）２－、－Ｃｙ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｎ（Ｒ”）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（ＮＲ”）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）－、－Ｎ（Ｒ”）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）－、－Ｎ（Ｒ”）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ”）－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－によって置き換えられており、各可変基は独立して、本明細書に記載されているとおりである。
いくつかの実施形態では、Ｌ２’は、共有結合である。いくつかの実施形態では、Ｌ２’は、共有結合ではない。いくつかの実施形態では、Ｌ１及びＬ２’のうちの少なくとも１つは、共有結合ではない。
いくつかの実施形態では、Ｌ２’は、任意に置換されたＣ１－６アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ２’は、任意に置換された直鎖Ｃ１－６アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ２’は、任意に置換された－ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２’は、任意に置換された－ＣＨ２ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２’は、任意に置換された－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２’は、任意に置換された－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２’は、任意に置換された－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２’は、任意に置換された－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、－Ｃ（Ｏ）Ｈに結合した－ＣＨ２－は、非置換である。いくつかの実施形態では、－Ｃ（Ｏ）Ｈに結合した－ＣＨ２－は、一置換である。いくつかの実施形態では、Ｌ２’は、置換されている。いくつかの実施形態では、Ｌ２’は、非置換である。いくつかの実施形態では、Ｌ２’は、－ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２’は、－ＣＨ２ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２’は、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２’は、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２’は、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２’は、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。
いくつかの実施形態では、このような変換は、酸化生成物生合成ポリペプチドによって触媒される。いくつかの実施形態では、酸化生成物生合成ポリペプチドは、アルコールデヒドロゲナーゼ、例えば、本明細書に記載されているような６－ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼなどの１級アルコールデヒドロゲナーゼであるか、またはそのアルコールデヒドロゲナーゼを含む。いくつかの実施形態では、アルコールデヒドロゲナーゼは、ＵＳ２０１７００４４５５１に記載されており、それらのアルコールデヒドロゲナーゼは、参照により、本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、このような変換は、酸化生成物生合成ポリペプチドによって触媒される。
多くの他の生合成ポリペプチドにおいては、酸化生成物生合成ポリペプチドは、細菌のような生物内にあってもよく、操作されていてもよく、及び／または上昇したタンパク質レベル及び／または活性レベルで発現させてもよく、それらの生成物は、向上した速度及び／または収量及び／または基質利用率で生成されてよい。
いくつかの実施形態では、酸化生成物は、ＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＨである。いくつかの実施形態では、酸化生成物は、ＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＨである。いくつかの実施形態では、酸化生成物は、ＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＨである。
いくつかの実施形態では、酸化生成物、例えば、式Ｐ－９の化合物またはその塩は、酵素の触媒によるか、生合成によるか、または酵素触媒反応のない従来型の有機合成によるかのいずれかで、アルデヒド酸化生成物に変換させる。いくつかの実施形態では、酸化生成物は、下記の式Ｐ－１０の化合物
ＨＯ－Ｃ（Ｏ）－Ｌ２’－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－ＯＨ
Ｐ－１０
またはその塩であり、式中、各可変基は独立して、本明細書に記載されているとおりである。
いくつかの実施形態では、このような変換は、アルデヒド酸化生成物生合成ポリペプチドによって触媒される。いくつかの実施形態では、アルデヒド酸化生成物生合成ポリペプチドは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、例えば、本明細書に記載されているような６－ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼであるか、またはそのアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒドデヒドロゲナーゼは、ＵＳ２０１７００４４５５１に記載されており、それらのアルデヒドデヒドロゲナーゼは、参照により、本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、このような変換は、アルデヒド酸化生成物生合成ポリペプチドによって触媒される。
多くの他の生合成ポリペプチドにおいては、アルデヒド酸化生成物生合成ポリペプチドは、細菌のような生物内にあってもよく、操作されていてもよく、及び／または上昇したタンパク質レベル及び／または活性レベルで発現させてもよく、それらの生成物は、向上した速度及び／または収量及び／または基質利用率で生成されてよい。
いくつかの実施形態では、アルデヒド酸化生成物は、ＨＯＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＨである。いくつかの実施形態では、酸化生成物は、ＨＯＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＨである。いくつかの実施形態では、酸化生成物は、ＨＯＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＨである。
いくつかの実施形態では、ＣｏＡ転移生成物、例えば、式Ｐ－８の化合物またはその塩は、酵素の触媒によるか、生合成によるか、または酵素触媒反応のない従来型の有機合成によるかのいずれかで、カルボキシル還元生成物に変換させる。いくつかの実施形態では、カルボキシル還元生成物は、下記の式Ｐ－９’の化合物
Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－Ｈ
Ｐ－９’
またはその塩であり、式中、各可変基は独立して、本明細書に記載されているとおりである。
いくつかの実施形態では、このような変換は、カルボキシル還元生成物生合成ポリペプチドによって触媒される。いくつかの実施形態では、カルボキシル還元生成物生合成ポリペプチドは、本明細書に記載されているようなカルボン酸レダクターゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼであるか、またはそのようなカルボン酸レダクターゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む。いくつかの実施形態では、カルボキシル還元生成物生合成ポリペプチドは、６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼであるか、または６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼを含む。いくつかの実施形態では、カルボキシル還元生成物生合成ポリペプチドは、ＵＳ２０１７００４４５５１に記載されているカルボン酸レダクターゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼであるか、またはそのようなカルボン酸レダクターゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼを含み、それらのカルボン酸レダクターゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼは、参照により、本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、このような変換は、カルボキシル還元生成物生合成ポリペプチドによって触媒される。
多くの他の生合成ポリペプチドにおいては、カルボキシル還元生成物生合成ポリペプチドは、細菌のような生物内にあってもよく、操作されていてもよく、及び／または上昇したタンパク質レベル及び／または活性レベルで発現させてもよく、それらの生成物は、向上した速度及び／または収量及び／または基質利用率で生成されてよい。
いくつかの実施形態では、カルボキシル還元生成物は、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｈである。いくつかの実施形態では、カルボキシル還元生成物は、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｈである。いくつかの実施形態では、カルボキシル還元生成物は、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｈである。いくつかの実施形態では、カルボキシル還元生成物は、ＣＨ２ＯＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｈである。いくつかの実施形態では、カルボキシル還元生成物は、ＣＨ２ＯＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｈである。いくつかの実施形態では、カルボキシル還元生成物は、ＣＨ２ＯＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｈである。
いくつかの実施形態では、カルボキシル還元生成物、例えば、式Ｐ－９’の化合物またはその塩は、酵素の触媒によるか、生合成によるか、または酵素触媒反応のない従来型の有機合成によるかのいずれかで、アルデヒド還元生成物に変換させる。いくつかの実施形態では、アルデヒド還元生成物は、下記の式Ｐ－１０’の化合物
Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＯＨ
Ｐ－１０’
またはその塩であり、式中、各可変基は独立して、本明細書に記載されているとおりである。
いくつかの実施形態では、このような変換は、アルデヒド還元生成物生合成ポリペプチドによって触媒される。いくつかの実施形態では、アルデヒド還元生成物生合成ポリペプチドは、本明細書に記載されているようなアルデヒドレダクターゼまたはアルコール（例えば１級アルコール）デヒドロゲナーゼであるか、またはそのようなアルデヒドレダクターゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼを含む。いくつかの実施形態では、アルデヒドレダクターゼまたはアルコール（例えば１級アルコール）デヒドロゲナーゼは、ＵＳ２０１７００４４５５１に記載されており、それらのレダクターゼ及びデヒドロゲナーゼは、参照により、本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、このような変換は、アルデヒド還元生成物生合成ポリペプチドによって触媒される。
多くの他の生合成ポリペプチドにおいては、アルデヒド還元生成物生合成ポリペプチドは、細菌のような生物内にあってもよく、操作されていてもよく、及び／または上昇したタンパク質レベル及び／または活性レベルで発現させてもよく、それらの生成物は、向上した速度及び／または収量及び／または基質利用率で生成されてよい。
いくつかの実施形態では、アルデヒド還元生成物は、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨである。いくつかの実施形態では、アルデヒド還元生成物は、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨである。いくつかの実施形態では、アルデヒド還元生成物は、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨである。いくつかの実施形態では、アルデヒド還元生成物は、ＣＨ２ＯＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨである。いくつかの実施形態では、アルデヒド還元生成物は、ＣＨ２ＯＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨである。いくつかの実施形態では、アルデヒド還元生成物は、ＣＨ２ＯＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨである。
いくつかの実施形態では、アルケン還元生成物、例えば、式Ｐ－３の化合物またはその塩は、酵素の触媒によるか、生合成によるか、または酵素触媒反応のない従来型の有機合成によるかのいずれかで、脱炭酸生成物に変換させる。いくつかの実施形態では、脱炭酸生成物は、下記の式Ｐ－４’の化合物
Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－Ｈ
Ｐ－４’
またはその塩であり、式中、各可変基は独立して、本明細書に記載されているとおりである。
いくつかの実施形態では、このような変換は、脱炭酸生成物生合成ポリペプチドによって触媒される。いくつかの実施形態では、脱炭酸生成物生合成ポリペプチドは、本明細書に記載されているようなデカルボキシラーゼであるか、またはそのようなデカルボキシラーゼを含む。いくつかの実施形態では、デカルボキシラーゼは、本明細書に記載されているような２－ケト酸デカルボキシラーゼである。いくつかの実施形態では、デカルボキシラーゼは、ＵＳ２０１７００４４５５１に記載されており、それらのデカルボキシラーゼは、参照により、本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、このような変換は、脱炭酸生成物生合成ポリペプチドによって触媒される。
多くの他の生合成ポリペプチドにおいては、脱炭酸生成物生合成ポリペプチドは、細菌のような生物内にあってもよく、操作されていてもよく、及び／または上昇したタンパク質レベル及び／または活性レベルで発現させてもよく、それらの生成物は、向上した速度及び／または収量及び／または基質利用率で生成されてよい。
いくつかの実施形態では、脱炭酸生成物は、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨＯである。いくつかの実施形態では、脱炭酸生成物は、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨＯである。いくつかの実施形態では、脱炭酸生成物は、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨＯである。いくつかの実施形態では、脱炭酸生成物は、ＣＨ２ＯＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨＯである。いくつかの実施形態では、脱炭酸生成物は、ＣＨ２ＯＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨＯである。いくつかの実施形態では、脱炭酸生成物は、ＣＨ２ＯＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨＯである。
いくつかの実施形態では、脱炭酸生成物、例えば、式Ｐ－４’の化合物またはその塩は、酵素の触媒によるか、生合成によるか、または酵素触媒反応のない従来型の有機合成によるかのいずれかで、アルデヒド還元生成物に変換させる。いくつかの実施形態では、アルデヒド還元生成物は、下記の式Ｐ－５’の化合物
Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＯＨ
Ｐ－５’
またはその塩であり、式中、各可変基は独立して、本明細書に記載されているとおりである。
いくつかの実施形態では、このような変換は、アルデヒド還元生成物生合成ポリペプチドによって触媒される。いくつかの実施形態では、アルデヒド還元生成物生合成ポリペプチドは、本明細書に記載されているような１級アルコールデヒドロゲナーゼであるか、またはそのような１級アルコールデヒドロゲナーゼを含む。いくつかの実施形態では、１級アルコールデヒドロゲナーゼは、ＵＳ２０１７００４４５５１に記載されており、その１級アルコールデヒドロゲナーゼは、参照により、本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、このような変換は、アルデヒド還元生成物生合成ポリペプチドによって触媒される。
多くの他の生合成ポリペプチドにおいては、アルデヒド還元生成物生合成ポリペプチドは、細菌のような生物内にあってもよく、操作されていてもよく、及び／または上昇したタンパク質レベル及び／または活性レベルで発現させてもよく、それらの生成物は、向上した速度及び／または収量及び／または基質利用率で生成されてよい。
いくつかの実施形態では、アルデヒド還元生成物は、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨである。いくつかの実施形態では、アルデヒド還元生成物は、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨである。いくつかの実施形態では、アルデヒド還元生成物は、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨである。いくつかの実施形態では、アルデヒド還元生成物は、ＣＨ２ＯＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨである。いくつかの実施形態では、アルデヒド還元生成物は、ＣＨ２ＯＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨである。いくつかの実施形態では、アルデヒド還元生成物は、ＣＨ２ＯＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨである。
いくつかの実施形態では、本開示は、生合成ポリペプチドを１つ以上コードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、このような核酸は、非天然配列を含む。いくつかの実施形態では、このような核酸は、産生生物、例えば細菌での発現のために最適化さている。
本明細書に示されているように、生合成活性に関して、ポリペプチドの活性を評価する際には、様々な技術が利用可能である。例えば、アルドール脱水生成物生合成ポリペプチド（例えば、ヒドラターゼ－アルドラーゼ）またはアルケン還元生成物生合成ポリペプチド（例えば、アルドール脱水生成物を還元するための酵素）の活性を評価するための様々な技術は、実施例に記載されている。
いくつかの実施形態では、様々な生合成ポリペプチド、例えばアルドール脱水生成物生合成ポリペプチドは、生物内、多くの実施形態では、細菌、真菌などのような微生物内にある。いくつかの実施形態では、それらの生合成ポリペプチドは、１つ以上の組み換え核酸から発現させる。いくつかの実施形態では、様々なトランスフォーメーションを生合成によって、例えば、細菌のような生物内で行う。いくつかの実施形態では、生物（例えば、細菌のような微生物）は、生合成ポリペプチド、例えば、ヒドラターゼ－アルドラーゼのようなアルドール脱水生成物生合成ポリペプチドをコードする外因性核酸を含むように操作されている。
いくつかの実施形態では、生物、例えば、アルドール脱水生成物を産生するように操作した生物は、調節されたレベル、典型的には、向上したレベル及び／または活性のアルドール脱水生成物生合成ポリペプチド（ヒドラターゼ－アルドラーゼポリペプチドなど）を発現する。
いくつかの実施形態では、生物は、操作された核酸を含み、及び／または操作された生合成ポリペプチド、例えば、アルドール脱水生成物生合成ポリペプチド（例えば、様々なヒドラターゼ－アルドラーゼ）を発現する。いくつかの実施形態では、操作された核酸は、参照核酸と比べて、配列の違いを１つ以上含む。いくつかの実施形態では、参照核酸は、操作された核酸を導入する生物内の対応する核酸である。いくつかの実施形態では、参照核酸は、天然の核酸である。いくつかの実施形態では、操作された核酸は、参照核酸、例えば天然の核酸と同じポリペプチドまたはその特徴的なエレメントをコードする。いくつかの実施形態では、操作された核酸は、参照核酸によってコードされるものとは異なるポリペプチドまたはその特徴的なエレメントをコードする。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、参照ポリペプチド（例えば、天然において見られる参照核酸によってコードされるポリペプチドなど）との違いを１つ以上含む。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、参照ポリペプチドとは異なるアミノ酸残基を１つ以上含む。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、そのポリペプチドが導入されている生物には見られないポリペプチドである。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、参照ポリペプチドと相同であり、例えば、参照ポリペプチドまたはその特徴的なエレメントと、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９５％、９９％またはそれを超える相同性を共有している。いくつかの実施形態では、特徴的なエレメントは、関連する反応を触媒するドメインである。いくつかの実施形態では、特徴的なエレメントは、一連のアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、特徴的なエレメントは、基質、生成物、補因子などとの接触を確立し、及び／または関連する反応を促進する一連のアミノ酸残基である。当業者には明らかなように、一連のアミノ酸残基における残基は、順次、互いに隣接していることもできるし、または離れていることもできる。いくつかの実施形態では、一連のアミノ酸残基における２つ以上のアミノ酸残基は、空間的に互いに近接していてよく、例えば触媒ポケット内にあってもよい。
いくつかの実施形態では、生合成生成のために、生物は、高レベル及び／または高活性の生合成ポリペプチドを１つ以上発現し得る。いくつかの実施形態では、生物は、所望の生成物を産生する際の速度及び／または収量を向上させる。
本明細書に記載されているように、いくつかの実施形態では、本開示は、高い生成物収量をもたらす。いくつかの実施形態では、例えば、１つ以上の生合成ポリペプチドを伴う１つまたは複数の工程プロセスの収量は、約もしくは少なくとも約１０ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、６０ｍｇ／Ｌ、７０ｍｇ／Ｌ、８０ｍｇ／Ｌ、９０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、１５０ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、２５０ｍｇ／Ｌ、３００ｍｇ／Ｌ、３５０ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、４５０ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、６００ｍｇ／Ｌ、７００ｍｇ／Ｌ、８００ｍｇ／Ｌ、９００ｍｇ／Ｌもしくは１０００ｍｇ／Ｌであるか、または約もしくは少なくとも約１．１ｇ／Ｌ、１．２ｇ／Ｌ、１．３ｇ／Ｌ、１．４ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、１．６ｇ／Ｌ、１．７ｇ／Ｌ、１．８ｇ／Ｌ、１．９ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、２．１ｇ／Ｌ、２．２ｇ／Ｌ、２．３ｇ／Ｌ、２．４ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、２．７ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１６０ｇ／Ｌ、１７０ｇ／Ｌ、１８０ｇ／Ｌ、１９０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、２２０ｇ／Ｌ、２５０ｇ／Ｌもしくは３００ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、提供する技術は、所望の生成物における基質、例えばピルベートの利用率を高くする。いくつかの実施形態では、所望の生成物における利用率は、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％である。
当業者には、本開示の各種化合物、例えば、式Ｐ－１、Ｐ－２、Ｐ－３、Ｐ－４、Ｐ－４’、Ｐ－５、Ｐ－５’、Ｐ－６、Ｐ－７、Ｐ－８、Ｐ－９、Ｐ－９’、Ｐ－１０もしくはＰ－１０’の化合物、またはこれらの塩は、各種の化合物、物質及び生成物を生成させるための材料として有用であることは明らかである。例えば、アジピン酸を用いて、ナイロン６，６、ポリエステルポリオール、ポリエステル樹脂、可塑剤、食品及びその他の物質を生成できる。１，５－ペンタンジオールを用いて、様々なポリウレタン、ポリエステルポリオール及びポリエステルを製造できる。１，６－ヘキサンジオール（ＨＤＯ）を用いて、様々なポリエステルを製造でき、そのうちのいくつかは、工業塗料用途に有用である。ＨＤＯを用いて、ポリウレタンも生成でき、ポリウレタンはとりわけ、自動車用塗料として使用できる。いくつかの実施形態では、ＨＤＯは、マクロジオール、例えば、例えばエラストマー及びポリウレタン分散体（例えば、パーケットフローリング及び皮革用塗料用）で用いるアジピン酸エステル及びポリカーボネートジオールの生成に使われる。従来型の化学プロセスもしくは生合成プロセス、またはこれらを組み合わせたプロセスを通じて、６－ヒドロキシヘキサン酸を環化して、ε－カプロラクトンを作製でき、その後アミノ化して、ε－カプロラクタムを作製できる。従来型の化学プロセスもしくは生合成プロセス、またはこれらを組み合わせたプロセスを通じて、６－ヒドロキシヘキサン酸をアミノ化して、６－アミノヘキサン酸を作製でき、その後環化して、ε－カプロラクタムを作製できる。ε－カプロラクタムはとりわけ、多くの異なる産業において広く用いられているポリマーであるナイロン６の生成に使用できる。ε－カプロラクトンを重合させて、特殊ポリウレタンの作製を含む様々な用途を持つ生分解性ポリエステルであるポリカプロラクトン（ＰＣＬ）を作製できる。様々な２－ケトカルボン酸は、様々な産業関連化学物質及び医薬に有用である。いくつかの実施形態では、このような化学物質及び医薬、またはそれらの中間体は、アミノ酸またはα－ヒドロキシカルボン酸である。いくつかの実施形態では、本開示の化合物を用いて、ポリエステル、ポリエステルポリオール、ポリウレタン、ナイロン（例えば、アジピン酸由来のもの）、ポリカーボネートジオール（例えば、ＨＤＯまたは１，５－ペンタンジオール由来のものなど）、ジアクリレートエステル（例えば、ＨＤＯまたは１，５－ペンタンジオール由来のものなど）、ジグリシジルエーテル（例えば、ＨＤＯまたは１，５－ペンタンジオール由来のものなど）などを製造する。
いくつかの実施形態では、本開示は、提供するプロセスの調製物、例えば、式Ｐ－１、Ｐ－２、Ｐ－３、Ｐ－４、Ｐ－４’、Ｐ－５、Ｐ－５’、Ｐ－６、Ｐ－７、Ｐ－８、Ｐ－９、Ｐ－９’、Ｐ－１０もしくはＰ－１０’の化合物、またはこれらの塩の調製物、ならびに、このような化合物から調製される各種の化合物、物質、生成物などを提供する。
提供する技術により、多くの利点が得られる。とりわけ、提供するプロセスでは、再生可能資源に由来する１つ以上の生合成ポリペプチド及び／または物質を使用することで、効率を向上し、及び／または汚染を低減することができる。いくつかの実施形態では、本開示の調製物（例えば、式Ｐ－１、Ｐ－２、Ｐ－３、Ｐ－４、Ｐ－４’、Ｐ－５、Ｐ－５’、Ｐ－６、Ｐ－７、Ｐ－８、Ｐ－９、Ｐ－９’、Ｐ－１０もしくはＰ－１０’の化合物、またはこれらの塩、及びこのような化合物から調製される各種の化合物、物質、生成物など）は、化石炭素源から調製されるものと比べて、１つ以上の同位体、例えば１４Ｃのレベルが濃縮されている。いくつかの実施形態では、化石炭素源を用いた調製物は、１４Ｃレベルが０であるか、または実質的に０である。化合物、組成物、調製物、生成物などにおける様々な原子の同位体比及び／または同位体レベルを評価する技術は、当業者に周知であり、それらの技術を本開示に従って使用できる。例えば、いくつかの実施形態では、同位体濃縮度は、加速器質量分析（ＡＭＳ）及び／または安定同位体比質量分析（ＳＩＲＭＳ）のような技法を用いた質量分析によって、及び／または位置特異的天然同位体分別核磁気共鳴法（ＳＮＩＦ－ＮＭＲ）によって、容易に評価できる。
当業者には明らかなように、提供する方法は、生合成ポリペプチドを１つ以上含む系で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことができる。多くの実施形態では、提供する技術は、生合成ポリペプチドを１つ以上発現する生物、例えば、細菌のような微生物を用いて行う。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されているような生合成ポリペプチドを１つ以上発現する生物、例えば細菌を提供する。いくつかの実施形態では、このような生物は、操作されている。いくつかの実施形態では、このような生物は、向上したタンパク質レベル及び／または活性レベルの生合成ポリペプチドを１つ以上発現するように操作及び／または培養する。いくつかの実施形態では、上記のような生物は、炭素源を用いて、より効率的に所望の生成物を産生するように操作及び／または培養する。
いくつかの実施形態では、本開示は、脂肪族アルデヒドのアルドール生成物を産生する生物であって、アルドール生成物生合成ポリペプチドの発現または活性が向上されている微生物を提供する。いくつかの実施形態では、生物は、操作されている。いくつかの実施形態では、生物は、細菌である。
いくつかの実施形態では、本開示は、アルデヒドのアルドール脱水生成物を産生する生物であって、アルドール生成物生合成ポリペプチド、アルドール脱水生成物生合成ポリペプチド、脱水生成物生合成ポリペプチド及びこれらを組み合わせたものの発現または活性が向上されている微生物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、アルデヒドのアルドール脱水生成物を産生する生物であって、アルドール脱水生成物生合成ポリペプチドの発現または活性が向上されている微生物を提供する。いくつかの実施形態では、生物は、操作されている。いくつかの実施形態では、生物は、細菌である。いくつかの実施形態では、アルデヒドは、脂肪族アルデヒドである。
いくつかの実施形態では、本開示は、アルケン還元生成物を産生する生物であって、アルケン還元生成物生合成ポリペプチドの発現または活性が向上されている微生物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、アルケン還元生成物をピルベート及びアルデヒドから産生する生物であって、アルケン還元生成物生合成ポリペプチドの発現または活性が向上されている微生物を提供する。いくつかの実施形態では、生物は、操作されている。いくつかの実施形態では、生物は、細菌である。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されているような生物の培養液を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、細菌の培養液を提供する。いくつかの実施形態では、培養液は、１つ以上の生合成ポリペプチドの生成物を１つ以上、例えば、式Ｐ－１、Ｐ－２、Ｐ－３、Ｐ－４、Ｐ－４’、Ｐ－５、Ｐ－５’、Ｐ－６、Ｐ－７、Ｐ－８、Ｐ－９、Ｐ－９’、Ｐ－１０もしくはＰ－１０’の化合物、またはこれらの塩を１つ以上含む。
当業者には明らかなように、ピルベートは、ピルビン酸またはその塩として供給してよい。
一態様では、本発明で提供するのは、下記の式Ｉの化合物
Figure 2022530467000017
（式中、Ｒが、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ３もしくはＨである）、
またはその塩、あるいはその化合物またはその塩の溶媒和物を調製する方法であって、酵素的工程を含む方法である。
いくつかの実施形態では、その方法は、（ａ）ＥＣ番号４．１．２．４５またはＥＣ番号４．１．２．３４またはＥＣ番号４．１．１．４であるヒドラターゼ－アルドラーゼ（本明細書では、Ａｄｓ－Ｈｙｄと称する）によって触媒されるアルドール縮合反応を通じて、式
Figure 2022530467000018
 のＣＮアルデヒドであって、式中、Ｒが、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ３またはＨであるＣＮアルデヒド及びピルベートを中間体ＣＮ＋３３，４－デヒドロ－２－ケトカルボン酸に変換し、その後、（ｂ）ＥＣ番号１．６．５（例えばＥＣ番号１．６．５．５．）であるオキシドレダクターゼを用いて、そのＣＮ＋３３，４－デヒドロ２－ケトカルボン酸をＣＮ＋３２－ケトカルボン酸（すなわち、式Ｉの化合物）もしくはその塩、またはその化合物もしくはその塩の溶媒和物に変換する条件下で、上記のＣＮアルデヒドと、ピルベートとを溶液で合わせるかまたはインキュベートすることを含むか、あるいは、そのことから本質的になるか、またはさらには、そのことからなる。
いくつかの実施形態では、その方法は、（ａ）まず、ＥＣ番号４．１．２．４５またはＥＣ番号４．１．２．３４またはＥＣ番号４．１．１．４であるヒドラターゼ－アルドラーゼ（本明細書では、Ａｄｓ－Ｈｙｄと称する）によって触媒されるアルドール付加反応を通じて、式
Figure 2022530467000019
 のＣＮアルデヒドであって、式中、Ｒが、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ３またはＨであるＣＮアルデヒド及びピルベートを中間体ＣＮ＋３４－ヒドロキシ－２－ケトカルボン酸に変換し、その後、（ｂ）上記のヒドラターゼ－アルドラーゼを用いて、４－ヒドロキシ－２－ケトカルボン酸をＣＮ＋３３，４－デヒドロ－２－ケトカルボン酸に変換し、その後、（ｃ）ＥＣ番号１．６．５（例えばＥＣ番号１．６．５．５）であるオキシドレダクターゼを用いて、そのＣＮ＋３３，４－デヒドロ－２－ケトカルボン酸をＣＮ＋３２－ケトカルボン酸（すなわち、式Ｉの化合物）もしくはその塩、またはその化合物もしくはその塩の溶媒和物に変換する条件下で、上記のＣＮアルデヒドと、ピルベートとを溶液で合わせるかまたはインキュベートすることを含むか、あるいは、そのことから本質的になるか、またはさらには、そのことからなる。
別の態様では、本発明で提供するのは、１，５－ペンタンジオール、アジピン酸、１，６－ヘキサンジオール及び６－ヒドロキシヘキサン酸から選択した化合物を調製する方法であって、ａ）ＥＣ番号４．１．２．４５またはＥＣ番号４．１．２．３４またはＥＣ番号４．１．１．４であるヒドラターゼ－アルドラーゼ、及びＥＣ番号１．６．５（例えばＥＣ番号１．６．５．５）であるオキシドレダクターゼを組み合わせたものを用いて、３－ヒドロキシプロパナール及びピルベートを中間体６－ヒドロキシ－２－ケトカルボン酸に変換することと、ｂ）酵素的工程を通じて、その中間体６－ヒドロキシ－２－ケトカルボン酸を上記の化合物に変換することを含むか、あるいは、そのことから本質的になるか、またはさらには、そのことからなる方法である。
いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、ＥＣ番号４．１．２．４５であるトランス－ｏ－ヒドロキシベンジリデンピルベートヒドラターゼ－アルドラーゼである。いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、ＥＣ番号４．１．２．３４であるトランス－２’－カルボキシベンザルピルベートヒドラターゼ－アルドラーゼである。いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、ＥＣ番号４．１．１．４であるアセトアセテートデカルボキシラーゼである。
いくつかの実施形態では、微生物は、式Ｉの化合物、もしくは１，５－ペンタンジオール、アジピン酸、１，６－ヘキサンジオール及び６－ヒドロキシヘキサン酸から選択した化合物、またはその塩、あるいはその化合物またはその塩の溶媒和物を調製するための宿主として使用する。本明細書で使用する場合、「宿主」とは、その細胞内もしくは微生物内で（例えば、出発物質（複数可）を取り込み、任意にその産生物（複数可）を分泌することによって）、またはその細胞外もしくは微生物外で（例えば、酵素を分泌することによって）、反応を触媒できる酵素を１つ以上産生できる細胞または微生物を指す。
いくつかの実施形態では、その方法はさらに、１，５－ペンタンジオール、アジピン酸、１，６－ヘキサンジオール及び６－ヒドロキシヘキサン酸から選択した化合物もしくはその塩、またはその化合物もしくはその塩の溶媒和物を溶液、培養液及び／または宿主細胞から単離することを含むか、あるいは、そのことから本質的になるか、またはさらには、そのことからなる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法の条件は、その構成成分を約１０～約２００℃、あるいは少なくとも（すべての温度は、摂氏温度で示されている）１０℃、少なくとも１５℃、少なくとも２０℃、少なくとも２５℃、少なくとも２８℃、少なくとも２９℃、少なくとも３０℃、少なくとも３１℃、少なくとも３２℃、少なくとも３３℃、少なくとも３４℃、少なくとも３５℃、少なくとも３７℃、少なくとも３７℃、少なくとも３８℃、少なくとも３９℃、少なくとも４０℃、少なくとも４５℃、少なくとも５０℃、少なくとも６０℃、少なくとも７０℃、少なくとも８０℃、少なくとも９０℃、少なくとも１００℃、少なくとも１１０℃、少なくとも１２０℃、少なくとも１３０℃、少なくとも１４０℃、少なくとも１５０℃、少なくとも１６０℃、少なくとも１７０℃、少なくとも１８０℃もしくは少なくとも１９０℃、または１９０℃以下、１８０℃以下、１７０℃以下、１６０℃以下、１５０℃以下、１４０℃以下、１３０℃以下、１２０℃以下、１１０℃以下、１００℃以下、９０℃以下、８０℃以下、７０℃以下、６０℃以下、５０℃以下、４０℃以下、３９℃以下、３８℃以下、３７℃以下、３６℃以下、３５℃以下、３４℃以下、３３℃以下、３２℃以下、３１℃以下、３０℃以下、２９℃以下、２８℃以下もしくは２５℃以下の温度（下限温度は１０℃である）でインキュベートまたは接触させることを含むか、あるいは、そのことから本質的になるか、またはさらにはそのことからなる。いくつかの実施形態では、その条件は、インキュベート溶液のｐＨが約２～約１２であることを含むか、あるいは、そのことから本質的になるか、またはさらにはそのことからなる。いくつかの実施形態では、そのｐＨは、少なくとも２であるか、または３、４、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８もしくは９であり、最大で約１２である。いくつかの実施形態では、そのｐＨは、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、７．５以下、７以下、６．５以下、６以下、５．５以下または４以下であり、下限ｐＨは、２を下回らない。
いくつかの実施形態では、その条件は、ピルベート及びＣＮアルデヒドのモル濃度が約０．１μＭ～約５Ｍであることを含むか、あるいは、そのことから本質的になるか、またはさらにはそのことからなる。いくつかの実施形態では、その濃度は、少なくとも約０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、５００μＭまたは１Ｍである。いくつかの実施形態では、その濃度は、約４Ｍ以下、３Ｍ以下、２Ｍ以下、１Ｍ以下、５００μＭ以下、２００μＭ以下、１００μＭ以下または１０μＭ以下である。ピルベート及びＣＮの濃度は独立して、同じであることも異なることもでき、他のインキュベート条件によって変動することがある。
いくつかの実施形態では、その条件は、クラスＩ／ＩＩのピルベート依存性のアルドラーゼ、ヒドラターゼ－アルドラーゼ、デヒドラターゼ、キノンオキシドレダクターゼ、エノイルＣｏＡレダクターゼ、１級アルコールデヒドロゲナーゼ、ケト酸デカルボキシラーゼ、コエンザイムＡトランスフェラーゼ及びカルボン酸レダクターゼからなる群から選択した酵素を１つ以上産生する、天然に存在しない微生物が存在することを含む。これらの酵素のそれぞれは、反応特異的酵素である。
いくつかの実施形態では、その微生物、すなわち宿主は、その酵素を過剰発現するか、または酵素を、野生型の対応物よりも多い量で発現するように遺伝子操作されている。酵素または発現生成物の発現レベルを求める方法は、当該技術分野において知られており、例えばＰＣＲによるものである。
いくつかの実施形態では、ＣＮアルデヒドは、３－ヒドロキシプロパナールである。
いくつかの実施形態では、その方法はさらに、３－ヒドロキシプロパナール及びピルベートをグリセロール、Ｃ５糖、Ｃ６糖、ホスホグリセレート、その他の炭素源、解糖経路の中間体、プロパノエート代謝の中間体またはこれらを組み合わせたものから調製することを含むか、あるいは、そのことから本質的になるか、またはさらには、そのことからなる。
いくつかの実施形態では、３－ヒドロキシプロパナールは、グリセロールの脱水によって得られる。
いくつかの実施形態では、Ｃ５糖は、キシロース、キシルロース、リブロース、アラビノース、リキソース及びリボースのうちの１つ以上を含むか、あるいは、その１つ以上から本質的になるか、またはさらには、その１つ以上からなる。
いくつかの実施形態では、Ｃ６糖は、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、タロース、ガラクトース、フルクトース、プシコース、ソルボース及びタガトースのうちの１つ以上を含むか、あるいは、その１つ以上から本質的になるか、またはさらには、その１つ以上からなる。
いくつかの実施形態では、その他の炭素源とは、微生物用の炭素源として適切な原材料であり、その原材料は、アミノ酸、脂質、コーンストーバー、ミスカンサス、都市ゴミ、エネルギー原料用サトウキビ、砂糖用サトウキビ、バガス、デンプン流、デキストロース流、メタノール、フォーメートまたはこれらを組み合わせたものを含むか、あるいは、これらから本質的になるか、またはさらには、これらからなる。
いくつかの実施形態では、微生物は、１，５－ペンタンジオール、アジピン酸、１，６－ヘキサンジオールまたは６－ヒドロキシヘキサン酸を調製する際の宿主として使用する。
いくつかの実施形態では、その微生物には、Ｃ５糖、Ｃ６糖、グリセロール、その他の炭素源またはこれらを組み合わせたものをピルベートに変換する能力がある。
いくつかの実施形態では、その微生物は、糖の取り込み、例えば、Ｃ５糖の取り込み、Ｃ６／Ｃ５糖の同時取り込み、Ｃ６糖／グリセロールの同時取り込み、Ｃ５糖／グリセロールの同時取り込みまたはこれらを組み合わせた取り込みが増強されるように操作されている。
別の態様では、本発明で提供するのは、下記の式の２－ケトカルボン酸の生成方法であって、
Figure 2022530467000020
式中、Ｒが、Ｈ、ＣＨ３またはＣＨ２ＯＨであり、
その方法が、天然に存在しない１つ以上の微生物を含む培養液において、ピルベート及び
Figure 2022530467000021
 をヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼと接触させて、２－ケトカルボン酸を生成させることを含むか、そのことから本質的になるか、またはそのことからなり、そのヒドラターゼ－アルドラーゼ及びそのキノンオキシドレダクターゼが、その天然に存在しない１つ以上の微生物によって発現される方法である。
別の態様では、本発明で提供するのは、下記の式の２－ケトカルボン酸の生成方法であって、
Figure 2022530467000022
式中、Ｒが、Ｈ、ＣＨ３またはＣＨ２ＯＨであり、
その方法が、天然に存在しない１つ以上の微生物を含む培養液において、ピルベート及び
Figure 2022530467000023
 をヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼと接触させて、２－ケトカルボン酸を生成させることを含むか、そのことから本質的になるか、またはそのことからなり、そのヒドラターゼ－アルドラーゼ及びそのキノンオキシドレダクターゼが、その天然に存在しない１つ以上の微生物によって発現され、その方法を、その天然に存在しない１つ以上の微生物の存在下で行う方法である。
別の態様では、本発明で提供するのは、下記の式の２－ケトカルボン酸の生成方法であって、
Figure 2022530467000024
式中、Ｒが、Ｈ、ＣＨ３またはＣＨ２ＯＨであり、
その方法が、天然に存在しない１つ以上の微生物を含む培養液において、ピルベート及び
Figure 2022530467000025
 をトランス－ｏ－ヒドロキシベンジリデンピルベートヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼと接触させて、２－ケトカルボン酸を生成させることを含むか、そのことから本質的になるか、またはそのことからなり、そのトランス－ｏ－ヒドロキシベンジリデンピルベートヒドラターゼ－アルドラーゼ及びそのキノンオキシドレダクターゼが、その天然に存在しない１つ以上の微生物によって発現され、その方法を、その天然に存在しない１つ以上の微生物の存在下で行う方法である。
別の態様では、本発明で提供するのは、下記の式の２－ケトカルボン酸の生成方法であって、
Figure 2022530467000026
式中、Ｒが、Ｈ、ＣＨ３またはＣＨ２ＯＨであり、
その方法が、天然に存在しない１つ以上の微生物を含む培養液において、ピルベート及び
Figure 2022530467000027
 をヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼと接触させて、２－ケトカルボン酸を生成させることを含むか、そのことから本質的になるか、またはそのことからなり、そのヒドラターゼ－アルドラーゼ及びそのキノンオキシドレダクターゼが、その天然に存在しない１つ以上の微生物によって発現され、そのピルベート及び
Figure 2022530467000028
 が、そのヒドラターゼ－アルドラーゼによってのみ触媒されるアルドール縮合反応を起こして、２－オキソ－３－エン酸を生成させ、その２－オキソ－３－エン酸が、そのキノンオキシドレダクターゼによってのみ触媒される還元を起こして、２－ケトカルボン酸を生成させる方法である。
別の態様では、本発明で提供するのは、下記の式の２－ケトカルボン酸の生成方法であって、
Figure 2022530467000029
式中、Ｒが、Ｈ、ＣＨ３またはＣＨ２ＯＨであり、
その方法が、天然に存在しない１つ以上の微生物を含む培養液において、ピルベート及び
Figure 2022530467000030
 をヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼと接触させて、２－ケトカルボン酸を生成させることを含むか、そのことから本質的になるか、またはそのことからなり、そのヒドラターゼ－アルドラーゼ及びそのキノンオキシドレダクターゼが、その天然に存在しない１つ以上の微生物によって発現され、その方法を、その天然に存在しない１つ以上の微生物の存在下で行い、そのピルベート及び
Figure 2022530467000031
 が、そのヒドラターゼ－アルドラーゼによってのみ触媒されるアルドール縮合反応を起こして、２－オキソ－３－エン酸を生成させ、その２－オキソ－３－エン酸が、そのキノンオキシドレダクターゼによってのみ触媒される還元を起こして、２－ケトカルボン酸を生成させる方法である。
別の態様では、本発明で提供するのは、下記の式の２－ケトカルボン酸の生成方法であって、
Figure 2022530467000032
式中、Ｒが、Ｈ、ＣＨ３またはＣＨ２ＯＨであり、
その方法が、天然に存在しない２つ以上の微生物を含む培養液において、ピルベート及び
Figure 2022530467000033
 をヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼと接触させて、２－ケトカルボン酸を生成させることを含むか、そのことから本質的になるか、またはそのことからなり、そのヒドラターゼ－アルドラーゼ及びそのキノンオキシドレダクターゼが、その天然に存在しない２つ以上の微生物によって発現される方法である。
別の態様では、本発明で提供するのは、下記の式の２－ケトカルボン酸の生成方法であって、
Figure 2022530467000034
式中、Ｒが、Ｈ、ＣＨ３またはＣＨ２ＯＨであり、
その方法が、天然に存在しない２つ以上の微生物を含む培養液において、ピルベート及び
Figure 2022530467000035
 をヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼと接触させて、２－ケトカルボン酸を生成させることを含むか、そのことから本質的になるか、またはそのことからなり、そのヒドラターゼ－アルドラーゼ及びそのキノンオキシドレダクターゼが、その天然に存在しない２つ以上の微生物によって発現され、その方法を、その天然に存在しない２つ以上の微生物の存在下で行う方法である。
別の態様では、本発明で提供するのは、下記の式の２－ケトカルボン酸の生成方法であって、
Figure 2022530467000036
式中、Ｒが、Ｈ、ＣＨ３またはＣＨ２ＯＨであり、
その方法が、天然に存在しない２つ以上の微生物を含む培養液において、ピルベート及び
Figure 2022530467000037
 をトランス－ｏ－ヒドロキシベンジリデンピルベートヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼと接触させて、２－ケトカルボン酸を生成させることを含むか、そのことから本質的になるか、またはそのことからなり、そのトランス－ｏ－ヒドロキシベンジリデンピルベートヒドラターゼ－アルドラーゼ及びそのキノンオキシドレダクターゼが、その天然に存在しない２つ以上の微生物によって発現され、その方法を、その天然に存在しない２つ以上の微生物の存在下で行う方法である。
別の態様では、本発明で提供するのは、下記の式の２－ケトカルボン酸の生成方法であって、
Figure 2022530467000038
式中、Ｒが、Ｈ、ＣＨ３またはＣＨ２ＯＨであり、
その方法が、天然に存在しない２つ以上の微生物を含む培養液において、ピルベート及び
Figure 2022530467000039
 をヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼと接触させて、２－ケトカルボン酸を生成させることを含むか、そのことから本質的になるか、またはそのことからなり、そのヒドラターゼ－アルドラーゼ及びそのキノンオキシドレダクターゼが、その天然に存在しない２つ以上の微生物によって発現され、そのピルベート及び
Figure 2022530467000040
 が、そのヒドラターゼ－アルドラーゼによってのみ触媒されるアルドール縮合反応を起こして、２－オキソ－３－エン酸を生成させ、その２－オキソ－３－エン酸が、そのキノンオキシドレダクターゼによってのみ触媒される還元を起こして、２－ケトカルボン酸を生成させる方法である。
別の態様では、本発明で提供するのは、下記の式の２－ケトカルボン酸の生成方法であって、
Figure 2022530467000041
式中、Ｒが、Ｈ、ＣＨ３またはＣＨ２ＯＨであり、
その方法が、天然に存在しない２つ以上の微生物を含む培養液において、ピルベート及び
Figure 2022530467000042
 をヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼと接触させて、２－ケトカルボン酸を生成させることを含むか、そのことから本質的になるか、またはそのことからなり、そのヒドラターゼ－アルドラーゼ及びそのキノンオキシドレダクターゼが、その天然に存在しない２つ以上の微生物によって発現され、その方法を、その天然に存在しない２つ以上の微生物の存在下で行い、そのピルベート及び
Figure 2022530467000043
 が、ヒドラターゼ－アルドラーゼによってのみ触媒されるアルドール縮合反応を起こして、２－オキソ－３－エン酸を生成させ、その２－オキソ－３－エン酸が、そのキノンオキシドレダクターゼによってのみ触媒される還元を起こして、２－ケトカルボン酸を生成させる方法である。
いくつかの実施形態では、
Figure 2022530467000044
 は、３－ヒドロキシプロパナールである。いくつかの実施形態では、その３－ヒドロキシプロパナールは、天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現されるグリセロールデヒドラターゼ酵素による、グリセロールの脱水によって生成される。
いくつかの実施形態では、２－ケトカルボン酸の生成方法はさらに、２－ケトカルボン酸を、天然に存在しない１つ以上の微生物、または天然に存在しない１つ以上の微生物を含む培養液から分離することを含む。
別の態様では、本発明で提供するのは、１，５－ペンタンジオールの生成方法であって、
ピルベート及び３－ヒドロキシプロパナールをヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼと接触させて、下記の式の２－ケトカルボン酸を生成させることと、
Figure 2022530467000045
（式中、Ｒが、ＣＨ２ＯＨである）
その２－ケトカルボン酸を２－ケト酸デカルボキシラーゼと接触させて、５－ヒドロキシペンタナールを生成させることと、
その５－ヒドロキシペンタナールを１級アルコールデヒドロゲナーゼと接触させて、１，５－ペンタンジオールを生成させることと、
を含み、
天然に存在しない１つ以上の微生物を含む培養液において行う方法である。
別の態様では、本発明で提供するのは、１，５－ペンタンジオールの生成方法であって、
ピルベート及び３－ヒドロキシプロパナールをヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼと接触させて、下記の式の２－ケトカルボン酸を生成させることと、
Figure 2022530467000046
（式中、Ｒが、ＣＨ２ＯＨである）
その２－ケトカルボン酸を２－ケト酸デカルボキシラーゼと接触させて、５－ヒドロキシペンタナールを生成させることと、
その５－ヒドロキシペンタナールを１級アルコールデヒドロゲナーゼと接触させて、１，５－ペンタンジオールを生成させることと、
を含み、
天然に存在しない２つ以上の微生物を含む培養液において行う方法である。
別の態様では、本発明で提供するのは、１，６－ヘキサンジオールの生成方法であって、
ピルベート及び３－ヒドロキシプロパナールをヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼと接触させて、下記の式の２－ケトカルボン酸を生成させることと、
Figure 2022530467000047
（式中、Ｒが、ＣＨ２ＯＨである）
その２－ケトカルボン酸を６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼと接触させて、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを生成させることと、
その２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼと接触させて、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
その２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼと接触させて、６－ヒドロキシ－２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
その６－ヒドロキシ－２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡを２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
その６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサノエートを生成させることと、
その６－ヒドロキシヘキサノエートを６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサナールを生成させることと、
その６－ヒドロキシヘキサナールを６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼと接触させて、１，６－ヘキサンジオールを生成させることと、
を含み、
天然に存在しない１つ以上の微生物を含む培養液において行う方法である。
別の態様では、本発明で提供するのは、１，６－ヘキサンジオールの生成方法であって、
ピルベート及び３－ヒドロキシプロパナールをヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼと接触させて、下記の式の２－ケトカルボン酸を生成させることと、
Figure 2022530467000048
（式中、Ｒが、ＣＨ２ＯＨである）
その２－ケトカルボン酸を６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼと接触させて、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを生成させることと、
その２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼと接触させて、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
その２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼと接触させて、６－ヒドロキシ－２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
その６－ヒドロキシ－２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡを２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
その６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサノエートを生成させることと、
その６－ヒドロキシヘキサノエートを６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサナールを生成させることと、
その６－ヒドロキシヘキサナールを６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼと接触させて、１，６－ヘキサンジオールを生成させることと、
を含み、
天然に存在しない２つ以上の微生物を含む培養液において行う方法である。
別の態様では、本発明で提供するのは、６－ヒドロキシヘキサノエートの生成方法であって、
ピルベート及び３－ヒドロキシプロパナールをヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼと接触させて、下記の式の２－ケトカルボン酸を生成させることと、
Figure 2022530467000049
（式中、Ｒが、ＣＨ２ＯＨである）
その２－ケトカルボン酸を６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼと接触させて、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを生成させることと、
その２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼと接触させて、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
その２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼと接触させて、６－ヒドロキシ－２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
その６－ヒドロキシ－２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡを２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
その６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサノエートを生成させることと、
を含み、
天然に存在しない１つ以上の微生物を含む培養液において行う方法である。
別の態様では、本発明で提供するのは、６－ヒドロキシヘキサノエートの生成方法であって、
ピルベート及び３－ヒドロキシプロパナールをヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼと接触させて、下記の式の２－ケトカルボン酸を生成させることと、
Figure 2022530467000050
（式中、Ｒが、ＣＨ２ＯＨである）
その２－ケトカルボン酸を６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼと接触させて、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを生成させることと、
その２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼと接触させて、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
その２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼと接触させて、６－ヒドロキシ－２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
その６－ヒドロキシ－２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡを２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
その６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサノエートを生成させることと、
を含み、
天然に存在しない２つ以上の微生物を含む培養液において行う方法である。
別の態様では、本発明で提供するのは、アジピン酸（ＡＡ）の生成方法であって、
ピルベート及び３－ヒドロキシプロパナールをヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼと接触させて、下記の式の２－ケトカルボン酸を生成させることと、
Figure 2022530467000051
（式中、Ｒが、ＣＨ２ＯＨである）
その２－ケトカルボン酸を６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼと接触させて、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを生成させることと、
その２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼと接触させて、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
その２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼと接触させて、６－ヒドロキシ－２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
その６－ヒドロキシ－２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡを２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
その６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサノエートを生成させることと、
その６－ヒドロキシヘキサノエートを６－ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼと接触させて、６－オキソヘキサノエートを生成させることと、
その６－オキソヘキサノエートを６－オキソヘキサノエートオキシダーゼと接触させて、アジピン酸を生成させることと、
を含み、
天然に存在しない１つ以上の微生物を含む培養液において行う方法である。
別の態様では、本発明で提供するのは、アジピン酸（ＡＡ）の生成方法であって、
ピルベート及び３－ヒドロキシプロパナールをヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼと接触させて、下記の式の２－ケトカルボン酸を生成させることと、
Figure 2022530467000052
（式中、Ｒが、ＣＨ２ＯＨである）
その２－ケトカルボン酸を６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼと接触させて、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを生成させることと、
その２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼと接触させて、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
その２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼと接触させて、６－ヒドロキシ－２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
その６－ヒドロキシ－２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡを２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
その６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサノエートを生成させることと、
その６－ヒドロキシヘキサノエートを６－ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼと接触させて、６－オキソヘキサノエートを生成させることと、
その６－オキソヘキサノエートを６－オキソヘキサノエートオキシダーゼと接触させて、アジピン酸を生成させることと、
を含み、
天然に存在しない２つ以上の微生物を含む培養液において行う方法である。
いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、ＥＣ番号４．１．２．４５またはＥＣ番号４．１．２．３４またはＥＣ番号４．１．１．４である酵素である。いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、ＥＣ番号４．１．２．４５である酵素である。いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、ＥＣ番号４．１．２．４５であるトランス－ｏ－ヒドロキシベンジリデンピルベートヒドラターゼ－アルドラーゼである。いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、ＥＣ番号４．１．２．３４である酵素である。いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、ＥＣ番号４．１．１．４である酵素である。
いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、ＧｅｎＢａｎｋまたはＲｅｆＳｅｑまたはＵｎｉｐｒｏｔのＩＤ番号Ｄ７Ｃ０Ｅ５、Ｐ０Ａ１４４、Ｑ７９ＥＭ８、Ａ０Ａ０Ｎ０ＡＨＩ８、Ａ０Ａ０Ｎ１ＦＲＹ３、Ｍ３ＤＹＲ１、Ｗ７ＳＵ４８、Ａ０Ａ２８６ＰＨ１８、Ｑ９Ｘ９Ｑ６、Ｑ９ＷＸＨ７、Ａ４ＸＤＳ１、Ｆ２Ｊ６Ｎ９、Ａ０Ａ０６３ＢＦＬ５、Ｑ９ＺＨＨ６、Ａ０Ａ０Ｃ１Ｋ８５３、ＷＰ＿０３４３９８４８２、ＰＹＫ１２１９１、ＷＰ＿１１５４７８０３３、ＷＰ＿０２８２２２２５３、ＷＰ＿０１３６５４８０７、ＷＰ＿０５９４０３０６０、ＷＰ＿０９２５０８５３０、ＷＰ＿１１６６４２６２７、ＷＰ＿００９７７０６５９、ＷＰ＿１０７８１８１９１、ＷＰ＿００３２９２０６１、ＰＹＮ４８８５５、ＷＰ＿１２２２１２９６５、ＷＰ＿０２８２１７２９７、ＷＰ＿０３４５０７０４９、ＫＭＫ６４０８１．１、ＷＰ＿０７００２８０４１．１またはＫＺＬ９２４４９．１で識別される酵素の群から選択した酵素である。いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、ＧｅｎＢａｎｋ、ＲｅｆＳｅｑまたはＵｎｉｐｒｏｔのＩＤ番号Ｄ７Ｃ０Ｅ５、Ｐ０Ａ１４４、Ｑ７９ＥＭ８、Ａ０Ａ０Ｎ０ＡＨＩ８、Ａ０Ａ０Ｎ１ＦＲＹ３、Ｍ３ＤＹＲ１、Ｗ７ＳＵ４８、Ａ０Ａ２８６ＰＨ１８、Ｑ９Ｘ９Ｑ６、Ｑ９ＷＸＨ７、Ａ４ＸＤＳ１、Ｆ２Ｊ６Ｎ９、Ａ０Ａ０６３ＢＦＬ５、Ｑ９ＺＨＨ６、Ａ０Ａ０Ｃ１Ｋ８５３、ＷＰ＿０３４３９８４８２、ＰＹＫ１２１９１、Ａ０Ａ３７０Ｘ７Ｄ８、ＷＰ＿０２８２２２２５３、Ｆ２Ｊ６Ｌ６、Ａ０Ａ０Ｎ０Ｌ９Ｆ６、Ａ０Ａ１Ｇ９ＹＷＧ７、Ａ０Ａ２Ｕ１ＢＴ０９、Ａ０Ａ２４４ＤＨＥ８、ＷＰ＿１０７８１８１９１、Ａ０Ａ０２３ＷＺＦ９、ＰＹＮ４８８５５、Ａ０Ａ４２１ＰＡＱ６、ＷＰ＿０２８２１７２９７、ＷＰ＿０３４５０７０４９、ＫＭＫ６４０８１．１、ＷＰ＿０７００２８０４１．１またはＫＺＬ９２４４９．１で識別される酵素の群から選択した酵素である。いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号８４、配列番号８５または配列番号８６の配列を含む酵素である。
いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、ＧｅｎＢａｎｋまたはＲｅｆＳｅｑまたはＵｎｉｐｒｏｔのＩＤ番号Ｄ７Ｃ０Ｅ５、Ｐ０Ａ１４４、Ｑ７９ＥＭ８、Ａ０Ａ０Ｎ０ＡＨＩ８、Ａ０Ａ０Ｎ１ＦＲＹ３、Ｍ３ＤＹＲ１、Ｗ７ＳＵ４８、Ａ０Ａ２８６ＰＨ１８、Ｑ９Ｘ９Ｑ６、Ｑ９ＷＸＨ７、Ａ４ＸＤＳ１、Ｆ２Ｊ６Ｎ９、Ａ０Ａ０６３ＢＦＬ５、Ｑ９ＺＨＨ６、Ａ０Ａ０Ｃ１Ｋ８５３、ＷＰ＿０３４３９８４８２、ＰＹＫ１２１９１、Ａ０Ａ３７０Ｘ７Ｄ８、ＷＰ＿０２８２２２２５３、Ｆ２Ｊ６Ｌ６、Ａ０Ａ０Ｎ０Ｌ９Ｆ６、Ａ０Ａ１Ｇ９ＹＷＧ７、Ａ０Ａ２Ｕ１ＢＴ０９、Ａ０Ａ２４４ＤＨＥ８、ＷＰ＿１０７８１８１９１、Ａ０Ａ０２３ＷＺＦ９、ＰＹＮ４８８５５、Ａ０Ａ４２１ＰＡＱ６、ＷＰ＿０２８２１７２９７、ＷＰ＿０３４５０７０４９、ＫＭＫ６４０８１．１、ＷＰ＿０７００２８０４１．１またはＫＺＬ９２４４９．１で識別される酵素の群から選択した酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上である。いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号８４、配列番号８５または配列番号８６の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上である。
いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、表１、５、６、７及び８から選択した酵素である。いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、表１、５、６、７及び８から選択した酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上である。
いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼはさらに、タンパク質タグを１つ以上含む。いくつかの実施形態では、そのタンパク質タグは、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ（グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグ）、ＨＡタグ（ヘマグルチニンタグ）、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、マルトース結合タンパク質タグ、キチン結合タンパク質タグ及び蛍光タグから選択されている。
いくつかの実施形態では、キノンオキシドレダクターゼは、ＥＣ番号１．６．５である酵素である。いくつかの実施形態では、キノンオキシドレダクターゼは、ＥＣ番号１．６．５．５である酵素である。いくつかの実施形態では、キノンオキシドレダクターゼは、ＧｅｎＢａｎｋ、ＲｅｆＳｅｑまたはＵｎｉｐｒｏｔのＩＤ番号Ｐ２８３０４、Ｐ４０７８３、Ｑ０Ｋ２Ｉ０、Ａ０Ａ１Ｚ１ＳＲＹ９、Ｐ４３９０３、Ｉ７Ｇ８Ｇ０、またはＱ１４２Ｌ２、ＡＬＫ１９３２４．１、Ａ０Ａ１Ｇ９Ｒ４０８、Ｇ４Ｑ８Ｒ５、ＡＮＡ９８７２３．１、Ｋ０ＥＵＱ３、Ａ０Ａ０６１ＣＲＳ８、Ｑ９Ａ２１２、Ａ０Ａ１Ｉ６ＲＷＷ２、ＷＰ＿０２６１９７２７７．１、Ｑ５ＮＫＺ３、ＷＰ＿０１２３３３０３４．１またはＷＰ＿１３６８９８０００．１で識別される酵素の群から選択した酵素である。いくつかの実施形態では、キノンオキシドレダクターゼは、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７の配列を含む酵素である。
いくつかの実施形態では、キノンオキシドレダクターゼは、ＧｅｎＢａｎｋ、ＲｅｆＳｅｑまたはＵｎｉｐｒｏｔのＩＤ番号Ｐ２８３０４、Ｐ４０７８３、Ｑ０Ｋ２Ｉ０、Ａ０Ａ１Ｚ１ＳＲＹ９、Ｐ４３９０３、Ｉ７Ｇ８Ｇ０、またはＱ１４２Ｌ２、ＡＬＫ１９３２４．１、Ａ０Ａ１Ｇ９Ｒ４０８、Ｇ４Ｑ８Ｒ５、ＡＮＡ９８７２３．１、Ｋ０ＥＵＱ３、Ａ０Ａ０６１ＣＲＳ８、Ｑ９Ａ２１２、Ａ０Ａ１Ｉ６ＲＷＷ２、ＷＰ＿０２６１９７２７７．１、Ｑ５ＮＫＺ３、ＷＰ＿０１２３３３０３４．１またはＷＰ＿１３６８９８０００．１で識別される酵素の群から選択した酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上である。いくつかの実施形態では、キノンオキシドレダクターゼは、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上である。
いくつかの実施形態では、キノンオキシドレダクターゼはさらに、タンパク質タグを１つ以上含む。いくつかの実施形態では、そのタンパク質タグは、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ（グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグ）、ＨＡタグ（ヘマグルチニンタグ）、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、マルトース結合タンパク質タグ、キチン結合タンパク質タグ及び蛍光タグから選択されている。
いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼのうちの少なくとも１つは、天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現される。いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼのうちの少なくとも１つは、天然に存在しない２つ以上の微生物によって外因性に発現される。
いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼ酵素のうちの少なくとも１つは、天然に存在しない１つ以上の微生物によって発現される１つ以上の外因性遺伝子によって発現される。いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼ酵素のうちの少なくとも１つは、天然に存在しない２つ以上の微生物によって発現される１つ以上の外因性遺伝子によって発現される。いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼ酵素のうちの少なくとも１つは、天然に存在しない１つ以上の微生物によって発現される２つ以上の外因性遺伝子によって発現される。いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼ酵素のうちの少なくとも１つは、天然に存在しない２つ以上の微生物によって発現される２つ以上の外因性遺伝子によって発現される。１つ以上の外因性遺伝子は、外因性遺伝子を１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個または２０個以上含む。２つ以上の外因性遺伝子は、外因性遺伝子を２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個または２０個以上含む。
いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現される。いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、天然に存在しない２つ以上の微生物によって外因性に発現される。
いくつかの実施形態では、キノンオキシドレダクターゼは、天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現される。いくつかの実施形態では、キノンオキシドレダクターゼは、天然に存在しない１つ以上の微生物によって過剰発現される。いくつかの実施形態では、キノンオキシドレダクターゼは、天然に存在しない２つ以上の微生物によって外因性に発現される。いくつかの実施形態では、キノンオキシドレダクターゼは、天然に存在しない２つ以上の微生物によって過剰発現される。
いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現され、そのキノンオキシドレダクターゼは、天然に存在しない１つ以上の微生物によって過剰発現される。いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、天然に存在しない２つ以上の微生物によって外因性に発現され、そのキノンオキシドレダクターゼは、天然に存在しない２つ以上の微生物によって過剰発現される。
いくつかの実施形態では、２－ケト酸デカルボキシラーゼ及び１級アルコールデヒドロゲナーゼは、天然に存在しない１つ以上の微生物によって発現される。いくつかの実施形態では、２－ケト酸デカルボキシラーゼ及び１級アルコールデヒドロゲナーゼは、天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現される。
いくつかの実施形態では、２－ケト酸デカルボキシラーゼは、ＥＣ番号４．１．１．１、ＥＣ番号４．１．１．２、ＥＣ番号４．１．１．３、ＥＣ番号４．１．１．４、ＥＣ番号４．１．１．５、ＥＣ番号４．１．１．６、ＥＣ番号４．１．１．７、ＥＣ番号４．１．１．１１、ＥＣ番号４．１．１．１２、ＥＣ番号４．１．１．１５、ＥＣ番号４．１．１．１６、ＥＣ番号４．１．１．１７、ＥＣ番号４．１．１．１８、ＥＣ番号４．１．１．１９、ＥＣ番号４．１．１．２０、ＥＣ番号４．１．１．３４、ＥＣ番号４．１．１．３５、ＥＣ番号４．１．１．４０、ＥＣ番号４．１．１．５４、ＥＣ番号４．１．１．５６、ＥＣ番号４．１．１．７１、ＥＣ番号４．１．１．７２、ＥＣ番号４．１．１．７３、ＥＣ番号４．１．１．７４、ＥＣ番号４．１．１．７５またはＥＣ番号４．１．１．７７で識別される酵素の群から選択した酵素である。いくつかの実施形態では、２－ケト酸デカルボキシラーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ６ＱＢＳ４、Ａ７Ｍ７Ｄ６またはＰ２０９０６で識別される酵素の群から選択した酵素である。いくつかの実施形態では、２－ケト酸デカルボキシラーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ６ＱＢＳ４、Ａ７Ｍ７Ｄ６またはＰ２０９０６で識別される酵素の群から選択した酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上である。
いくつかの実施形態では、２－ケト酸デカルボキシラーゼはさらに、タンパク質タグを１つ以上含む。いくつかの実施形態では、そのタンパク質タグは、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ（グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグ）、ＨＡタグ（ヘマグルチニンタグ）、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、マルトース結合タンパク質タグ、キチン結合タンパク質タグ及び蛍光タグから選択されている。
いくつかの実施形態では、１級アルコールデヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．１．１．６１である酵素である。いくつかの実施形態では、１級アルコールデヒドロゲナーゼは、ＵｎｉｐｒｏｔまたはＧｅｎＢａｎｋのＩＤ番号ＮＰ＿４１７２７９．１、ＮＰ＿３４９８９２．１、ＮＰ＿３４９８９１．１、ＢＡＢ１２２７３．１、Ｌ２１９０２．１、Ｑ９４Ｂ０７、ＡＡＢ０３０１５．１、ＮＰ＿０１４０３２．１、ＮＰ＿０１３８９２．１、ＮＰ＿０１５０１９．１、ＮＰ＿０１０９９６．２、ＡＢＸ３９１９２．１、ＸＰ＿００１２１０６２５．１、ＡＢＯ６７１１８、ＡＢＯ６８２２３、ＢＡＥ７７０６８．１またはＣＡＡ４７７４３．１で識別される酵素の群から選択した酵素である。いくつかの実施形態では、１級アルコールデヒドロゲナーゼは、ＵｎｉｐｒｏｔまたはＧｅｎＢａｎｋのＩＤ番号ＮＰ＿４１７２７９．１、ＮＰ＿３４９８９２．１、ＮＰ＿３４９８９１．１、ＢＡＢ１２２７３．１、Ｌ２１９０２．１、Ｑ９４Ｂ０７、ＡＡＢ０３０１５．１、ＮＰ＿０１４０３２．１、ＮＰ＿０１３８９２．１、ＮＰ＿０１５０１９．１、ＮＰ＿０１０９９６．２、ＡＢＸ３９１９２．１、ＸＰ＿００１２１０６２５．１、ＡＢＯ６７１１８、ＡＢＯ６８２２３、ＢＡＥ７７０６８．１またはＣＡＡ４７７４３．１で識別される酵素の群から選択した酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上である。いくつかの実施形態では、１級アルコールデヒドロゲナーゼは、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３または配列番号７４の配列を含む酵素である。いくつかの実施形態では、１級アルコールデヒドロゲナーゼは、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３または配列番号７４の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上である。
いくつかの実施形態では、１級アルコールデヒドロゲナーゼはさらに、タンパク質タグを１つ以上含む。いくつかの実施形態では、タンパク質タグは、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ（グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグ）、ＨＡタグ（ヘマグルチニンタグ）、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、マルトース結合タンパク質タグ、キチン結合タンパク質タグ及び蛍光タグから選択されている。
いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ａ０Ａ２８６ＰＨ１８で識別される酵素であり、キノンオキシドレダクターゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｐ２８３０４で識別される酵素であり、２－ケト酸デカルボキシラーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ６ＱＢＳ４で識別される酵素であり、１級アルコールデヒドロゲナーゼは、ＵｎｉｐｒｏｔまたはＧｅｎＢａｎｋのＩＤ番号Ｄ６Ｚ８６０、ＹＰ＿００１７０５４３６．１、ＡＮＯ０６４０７．１、ＡＡＲ９１６８１．１、ＡＨＨ９８１２１．１、ＡＮＢ００６１２．１、ＡＮＯ０４６５５．１、Ａ０Ｒ４８４、ＡＦＰ４２０２６．１、ＧＡＪ８６５１０．１、ＹＰ＿００１７０４０９７．１、ＡＮＡ９９３１５．１、ＧＡＪ８３０２７．１、ＡＮＡ９８９２５．１、ＡＮＡ９８９２４．１、ＡＮＯ０４６５６．１、ＹＰ＿００１７０３６９４で識別される酵素である。いくつかの実施形態では、ヒドラターゼ－アルドラーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ａ０Ａ２８６ＰＨ１８で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、キノンオキシドレダクターゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｐ２８３０４で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、２－ケト酸デカルボキシラーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ６ＱＢＳ４で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、１級アルコールデヒドロゲナーゼは、ＵｎｉｐｒｏｔまたはＧｅｎＢａｎｋのＩＤ番号Ｄ６Ｚ８６０、ＹＰ＿００１７０５４３６．１、ＡＮＯ０６４０７．１、ＡＡＲ９１６８１．１、ＡＨＨ９８１２１．１、ＡＮＢ００６１２．１、ＡＮＯ０４６５５．１、Ａ０Ｒ４８４、ＡＦＰ４２０２６．１、ＧＡＪ８６５１０．１、ＹＰ＿００１７０４０９７．１、ＡＮＡ９９３１５．１、ＧＡＪ８３０２７．１、ＡＮＡ９８９２５．１、ＡＮＡ９８９２４．１、ＡＮＯ０４６５６．１、ＹＰ＿００１７０３６９４で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上である。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼ、６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼ及び６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼは、天然に存在しない１つ以上の微生物によって発現される。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼ、６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼ及び６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼは、天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現される。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼは、ＥＣ番号１．１．９９．６、ＥＣ番号１．１．１．１６９、ＥＣ番号１．１．１．２１５、ＥＣ番号１．１．１．２８またはＥＣ番号１．１．１．１１０で識別される酵素の群から選択されており、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼは、ＥＣ番号２．８．３、ＥＣ番号２．８．３．１またはＥＣ番号２．８．３．１２である酵素であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼは、ＥＣ番号４．２．１．１６７である酵素であり、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼは、ＥＣ番号１．３．１．４４である酵素であり、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼは、ＥＣ番号２．８．３、ＥＣ番号２．８．３．１またはＥＣ番号２．８．３．１２である酵素であり、６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼは、ＥＣ番号１．２．９９．６である酵素であり、６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼは、ＥＣ番号１．１．１である酵素である。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼは、ＵｎｉｐｒｏｔまたはＧｅｎＢａｎｋのＩＤ番号ＷＰ＿００３４３１４０７．１、ＢＡＬ５１２９２．１、Ｑ５ＦＴＵ６、ＡＫＣ６４０９４．１、ＷＰ＿００２８７６８６２．１、ＡＧＰ６９０１７．１、ＷＰ＿００３６４０７４１．１、ＡＫＣ６４０９で識別される酵素の群から選択した酵素であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｔ４ＶＷ９３で識別される酵素であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ５Ｕ９２４、Ｑ５Ｕ９２５及びＱ５Ｕ９２３で識別される酵素であり、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ７３Ｑ４７で識別される酵素であり、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｔ４ＶＷ９３で識別される酵素であり、６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼは、ＵｎｉｐｒｏｔまたはＧｅｎＢａｎｋのＩＤ番号Ｄ６Ｚ８６０、ＹＰ＿００１７０５４３６．１、ＡＮＯ０６４０７．１、ＡＡＲ９１６８１．１、ＡＨＨ９８１２１．１、ＡＮＢ００６１２．１、ＡＮＯ０４６５５．１、Ａ０Ｒ４８４、ＡＦＰ４２０２６．１、ＧＡＪ８６５１０．１、ＹＰ＿００１７０４０９７．１、ＡＮＡ９９３１５．１、ＧＡＪ８３０２７．１、ＡＮＡ９８９２５．１、ＡＮＡ９８９２４．１、ＡＮＯ０４６５６．１、ＹＰ＿００１７０３６９４．１、ＷＰ＿０３６３３８３０１．１、ＷＰ＿００７４７２１０６．１またはＡ０ＱＷＩ７で識別される酵素であり、６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼは、ＵｎｉｐｒｏｔまたはＧｅｎＢａｎｋのＩＤ番号Ｄ６Ｚ８６０、ＹＰ＿００１７０５４３６．１、ＡＮＯ０６４０７．１、ＡＡＲ９１６８１．１、ＡＨＨ９８１２１．１、ＡＮＢ００６１２．１、ＡＮＯ０４６５５．１、Ａ０Ｒ４８４、ＡＦＰ４２０２６．１、ＧＡＪ８６５１０．１、ＹＰ＿００１７０４０９７．１、ＡＮＡ９９３１５．１、ＧＡＪ８３０２７．１、ＡＮＡ９８９２５．１、ＡＮＡ９８９２４．１、ＡＮＯ０４６５６．１、ＹＰ＿００１７０３６９４で識別される酵素である。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼは、ＵｎｉｐｒｏｔまたはＧｅｎＢａｎｋのＩＤ番号ＷＰ＿００３４３１４０７．１、ＢＡＬ５１２９２．１、Ｑ５ＦＴＵ６、ＡＫＣ６４０９４．１、ＷＰ＿００２８７６８６２．１、ＡＧＰ６９０１７．１、ＷＰ＿００３６４０７４１．１、ＡＫＣ６４０９で識別される酵素の群から選択した酵素であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｔ４ＶＷ９３、Ａ０Ａ０Ｃ７ＧＤ１６、Ａ０Ａ１７５Ｌ１Ｗ４または０Ａ２Ｘ３ＢＴＱ９で識別される酵素であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ５Ｕ９２４、Ｑ５Ｕ９２５及びＱ５Ｕ９２３、またはＡ０Ａ２Ｘ３ＢＫ０９、Ａ０Ａ２Ｘ３ＢＵ１９及びＡ０Ａ１Ｖ９ＩＸＡ９で識別される酵素であり、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ７３Ｑ４７で識別される酵素であり、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｔ４ＶＷ９３、Ａ０Ａ０Ｃ７ＧＤ１６、Ａ０Ａ１７５Ｌ１Ｗ４またはＡ０Ａ２Ｘ３ＢＴＱ９で識別される酵素であり、６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼは、ＵｎｉｐｒｏｔまたはＧｅｎＢａｎｋのＩＤ番号Ｄ６Ｚ８６０、ＹＰ＿００１７０５４３６．１、ＡＮＯ０６４０７．１、ＡＡＲ９１６８１．１、ＡＨＨ９８１２１．１、ＡＮＢ００６１２．１、ＡＮＯ０４６５５．１、Ａ０Ｒ４８４、ＡＦＰ４２０２６．１、ＧＡＪ８６５１０．１、ＹＰ＿００１７０４０９７．１、ＡＮＡ９９３１５．１、ＧＡＪ８３０２７．１、ＡＮＡ９８９２５．１、ＡＮＡ９８９２４．１、ＡＮＯ０４６５６．１、ＹＰ＿００１７０３６９４．１、ＷＰ＿０３６３３８３０１．１、ＷＰ＿００７４７２１０６．１またはＡ０ＱＷＩ７で識別される酵素であり、６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼは、ＵｎｉｐｒｏｔまたはＧｅｎＢａｎｋのＩＤ番号Ｄ６Ｚ８６０、ＹＰ＿００１７０５４３６．１、ＡＮＯ０６４０７．１、ＡＡＲ９１６８１．１、ＡＨＨ９８１２１．１、ＡＮＢ００６１２．１、ＡＮＯ０４６５５．１、Ａ０Ｒ４８４、ＡＦＰ４２０２６．１、ＧＡＪ８６５１０．１、ＹＰ＿００１７０４０９７．１、ＡＮＡ９９３１５．１、ＧＡＪ８３０２７．１、ＡＮＡ９８９２５．１、ＡＮＡ９８９２４．１、ＡＮＯ０４６５６．１、ＹＰ＿００１７０３６９４で識別される酵素である。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼは、ＵｎｉｐｒｏｔまたはＧｅｎＢａｎｋのＩＤ番号ＷＰ＿００３４３１４０７．１、ＢＡＬ５１２９２．１、Ｑ５ＦＴＵ６、ＡＫＣ６４０９４．１、ＷＰ＿００２８７６８６２．１、ＡＧＰ６９０１７．１、ＷＰ＿００３６４０７４１．１、ＡＫＣ６４０９５．１及びＡＫＣ６４０９４．１で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｔ４ＶＷ９３、Ａ０Ａ０Ｃ７ＧＤ１６、Ａ０Ａ１７５Ｌ１Ｗ４または０Ａ２Ｘ３ＢＴＱ９で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ５Ｕ９２４、Ｑ５Ｕ９２５及びＱ５Ｕ９２３、またはＡ０Ａ２Ｘ３ＢＫ０９、Ａ０Ａ２Ｘ３ＢＵ１９及びＡ０Ａ１Ｖ９ＩＸＡ９で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ７３Ｑ４７で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｔ４ＶＷ９３、Ａ０Ａ０Ｃ７ＧＤ１６、Ａ０Ａ１７５Ｌ１Ｗ４またはＡ０Ａ２Ｘ３ＢＴＱ９で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼは、ＵｎｉｐｒｏｔまたはＧｅｎＢａｎｋのＩＤ番号Ｄ６Ｚ８６０、ＹＰ＿００１７０５４３６．１、ＡＮＯ０６４０７．１、ＡＡＲ９１６８１．１、ＡＨＨ９８１２１．１、ＡＮＢ００６１２．１、ＡＮＯ０４６５５．１、Ａ０Ｒ４８４、ＡＦＰ４２０２６．１、ＧＡＪ８６５１０．１、ＹＰ＿００１７０４０９７．１、ＡＮＡ９９３１５．１、ＧＡＪ８３０２７．１、ＡＮＡ９８９２５．１、ＡＮＡ９８９２４．１、ＡＮＯ０４６５６．１、ＹＰ＿００１７０３６９４．１、ＷＰ＿０３６３３８３０１．１、ＷＰ＿００７４７２１０６．１またはＡ０ＱＷＩ７で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼは、ＵｎｉｐｒｏｔまたはＧｅｎＢａｎｋのＩＤ番号Ｄ６Ｚ８６０、ＹＰ＿００１７０５４３６．１、ＡＮＯ０６４０７．１、ＡＡＲ９１６８１．１、ＡＨＨ９８１２１．１、ＡＮＢ００６１２．１、ＡＮＯ０４６５５．１、Ａ０Ｒ４８４、ＡＦＰ４２０２６．１、ＧＡＪ８６５１０．１、ＹＰ＿００１７０４０９７．１、ＡＮＡ９９３１５．１、ＧＡＪ８３０２７．１、ＡＮＡ９８９２５．１、ＡＮＡ９８９２４．１、ＡＮＯ０４６５６．１、ＹＰ＿００１７０３６９４で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上である。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼは、配列番号５３、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４または配列番号１０５の配列を含む酵素であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼは、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼは、配列番号５９、配列番号６１及び配列番号６３、または配列番号６０、配列番号６２及び配列番号６４の配列を含む酵素であり、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼは、配列番号６５の配列を含む酵素であり、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼは、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素であり、６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼは、配列番号６６、配列番号６７または配列番号６８の配列を含む酵素であり、６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼは、配列番号７０の配列を含む酵素である。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼは、配列番号５３、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４または配列番号１０５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼは、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼは、配列番号５９、配列番号６１及び配列番号６３、または配列番号６０、配列番号６２及び配列番号６４の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼは、配列番号６５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼは、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼは、配列番号６６、配列番号６７または配列番号６８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼは、配列番号７０の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上である。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼ、６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼ及び６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼのうちの１つ以上はさらに、タンパク質タグを１つ以上含む。いくつかの実施形態では、そのタンパク質タグは、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ（グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグ）、ＨＡタグ（ヘマグルチニンタグ）、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、マルトース結合タンパク質タグ、キチン結合タンパク質タグ及び蛍光タグから選択されている。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼは、ＥＣ番号１．１．９９．６、ＥＣ番号１．１．１．１６９、ＥＣ番号１．１．１．２１５、ＥＣ番号１．１．１．２８またはＥＣ番号１．１．１．１１０で識別される酵素の群から選択されており、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼは、ＥＣ番号２．８．３、ＥＣ番号２．８．３．１またはＥＣ番号２．８．３．１２である酵素であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼは、ＥＣ番号４．２．１．１６７である酵素であり、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼは、ＥＣ番号１．３．１．４４である酵素であり、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼは、ＥＣ番号２．８．３、ＥＣ番号２．８．３．１またはＥＣ番号２．８．３．１２である酵素である。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼは、ＵｎｉｐｒｏｔまたはＧｅｎＢａｎｋのＩＤ番号ＷＰ＿００３４３１４０７．１、ＢＡＬ５１２９２．１、Ｑ５ＦＴＵ６、ＡＫＣ６４０９４．１、ＷＰ＿００２８７６８６２．１、ＡＧＰ６９０１７．１、ＷＰ＿００３６４０７４１．１、ＡＫＣ６４０９５．１及びＡＫＣ６４０９４．１で識別される酵素であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｔ４ＶＷ９３、Ａ０Ａ２Ｘ３ＢＴＱ９、Ａ０Ａ０Ｃ７ＧＤ１６またはＡ０Ａ１７５Ｌ１Ｗ４で識別される酵素であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ５Ｕ９２４、Ｑ５Ｕ９２５及びＱ５Ｕ９２３、またはＡ０Ａ２Ｘ３ＢＫ０９、Ａ０Ａ２Ｘ３ＢＵ１９及びＡ０Ａ１Ｖ９ＩＸＡ９で識別される酵素であり、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ７３Ｑ４７で識別される酵素であり、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｔ４ＶＷ９３、Ａ０Ａ２Ｘ３ＢＴＱ９、Ａ０Ａ０Ｃ７ＧＤ１６またはＡ０Ａ１７５Ｌ１Ｗ４で識別される酵素である。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼは、ＵｎｉｐｒｏｔまたはＧｅｎＢａｎｋのＩＤ番号ＷＰ＿００３４３１４０７．１、ＢＡＬ５１２９２．１、Ｑ５ＦＴＵ６、ＡＫＣ６４０９４．１、ＷＰ＿００２８７６８６２．１、ＡＧＰ６９０１７．１、ＷＰ＿００３６４０７４１．１、ＡＫＣ６４０９５．１及びＡＫＣ６４０９４．１で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｔ４ＶＷ９３、Ａ０Ａ２Ｘ３ＢＴＱ９、Ａ０Ａ０Ｃ７ＧＤ１６またはＡ０Ａ１７５Ｌ１Ｗ４で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ５Ｕ９２４、Ｑ５Ｕ９２５及びＱ５Ｕ９２３、またはＡ０Ａ２Ｘ３ＢＫ０９、Ａ０Ａ２Ｘ３ＢＵ１９及びＡ０Ａ１Ｖ９ＩＸＡ９で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ７３Ｑ４７で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｔ４ＶＷ９３、Ａ０Ａ２Ｘ３ＢＴＱ９、Ａ０Ａ０Ｃ７ＧＤ１６またはＡ０Ａ１７５Ｌ１Ｗ４で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上である。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼは、配列番号５３、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４または配列番号１０５の配列を含む酵素であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼは、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼは、配列番号５９、配列番号６１及び配列番号６３、または配列番号６０、配列番号６２及び配列番号６４の配列を含む酵素であり、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼは、配列番号６５の配列を含む酵素であり、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼは、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素である。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼは、配列番号５３、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４または配列番号１０５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼは、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼは、配列番号５９、配列番号６１及び配列番号６３、または配列番号６０、配列番号６２及び配列番号６４の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼは、配列番号６５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼは、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上である。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼは、ＥＣ番号１．１．９９．６、ＥＣ番号１．１．１．１６９、ＥＣ番号１．１．１．２１５、ＥＣ番号１．１．１．２８またはＥＣ番号１．１．１．１１０で識別される酵素の群から選択されており、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼは、ＥＣ番号２．８．３、ＥＣ番号２．８．３．１またはＥＣ番号２．８．３．１２である酵素であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼは、ＥＣ番号４．２．１．１６７である酵素であり、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼは、ＥＣ番号１．３．１．４４である酵素であり、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼは、ＥＣ番号２．８．３、ＥＣ番号２．８．３．１またはＥＣ番号２．８．３．１２である酵素であり、６－ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．１．１．２５８である酵素であり、６－オキソヘキサノエートオキシダーゼは、ＥＣ番号１．２．１．６３である酵素である。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ５ＦＴＵ６で識別される酵素であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｔ４ＶＷ９３またはＡ０Ａ２Ｘ３ＢＴＱ９で識別される酵素であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ５Ｕ９２４、Ｑ５Ｕ９２５及びＱ５Ｕ９２３、またはＡ０Ａ２Ｘ３ＢＫ０９、Ａ０Ａ２Ｘ３ＢＵ１９及びＡ０Ａ１Ｖ９ＩＸＡ９で識別される酵素であり、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ７３Ｑ４７で識別される酵素であり、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｔ４ＶＷ９３またはＡ０Ａ２Ｘ３ＢＴＱ９で識別される酵素であり、６－ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ７ＷＶＤ０またはＱ８４Ｈ７８で識別される酵素であり、６－オキソヘキサノエートオキシダーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ９Ｒ２Ｆ４で識別される酵素である。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ５ＦＴＵ６で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｔ４ＶＷ９３またはＡ０Ａ２Ｘ３ＢＴＱ９で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ５Ｕ９２４、Ｑ５Ｕ９２５及びＱ５Ｕ９２３、またはＡ０Ａ２Ｘ３ＢＫ０９、Ａ０Ａ２Ｘ３ＢＵ１９及びＡ０Ａ１Ｖ９ＩＸＡ９で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ７３Ｑ４７で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｔ４ＶＷ９３またはＡ０Ａ２Ｘ３ＢＴＱ９で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、６－ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ７ＷＶＤ０またはＱ８４Ｈ７８で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、６－オキソヘキサノエートオキシダーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ９Ｒ２Ｆ４で識別される酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上である。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼは、配列番号５３の配列を含む酵素であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼは、配列番号５５または配列番号５８の配列を含む酵素であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼは、配列番号５９、配列番号６１及び配列番号６３、または配列番号６０、配列番号６２及び配列番号６４の配列を含む酵素であり、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼは、配列番号６５の配列を含む酵素であり、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼは、配列番号５５または配列番号５８の配列を含む酵素であり、６－ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼは、配列番号７１または配列番号７２の配列を含む酵素であり、６－オキソヘキサノエートオキシダーゼは、配列番号７５の配列を含む酵素である。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼは、配列番号５３の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼは、配列番号５５または配列番号５８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼは、配列番号５９、配列番号６１及び配列番号６３、または配列番号６０、配列番号６２及び配列番号６４の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼは、配列番号６５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼは、配列番号５５または配列番号５８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、６－ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼは、配列番号７１及び配列番号７２の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であり、６－オキソヘキサノエートオキシダーゼは、配列番号７５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上である。
いくつかの実施形態では、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼ、６－ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼ及び６－オキソヘキサノエートオキシダーゼのうちの１つ以上はさらに、タンパク質タグを１つ以上含む。いくつかの実施形態では、そのタンパク質タグは、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ（グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグ）、ＨＡタグ（ヘマグルチニンタグ）、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、マルトース結合タンパク質タグ、キチン結合タンパク質タグ及び蛍光タグから選択されている。
いくつかの実施形態では、ピルベートは、グリセロール、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、スクロース及びデンプンまたはこれらを組み合わせたものから選択した炭素源から生成される。
いくつかの実施形態では、３－ヒドロキシプロパナールは、天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現されるグリセロールデヒドラターゼ酵素による、グリセロールの脱水によって生成される。
その天然に存在しない１つ以上の微生物は、天然に存在しない微生物を１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個または２０個以上含む。天然に存在しない２つ以上の微生物は、天然に存在しない微生物を２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個または２０個以上含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法は、天然に存在しない１つの微生物の存在下で行う。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法は、天然に存在しない２つの微生物の存在下で行う。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法は、天然に存在しない３つの微生物の存在下で行う。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法は、天然に存在しない４つの微生物の存在下で行う。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法は、天然に存在しない５つの微生物の存在下で行う。
本願の全体を通じて、様々な刊行物が参照されている。これらの刊行物の開示内容の全体は、これらの刊行物におけるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号（複数可）、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号（複数可）またはＲｅｆＳｅｑ ＩＤ番号を含め、本願での参照により、本開示が属する技術分野の現状をさらに十分に説明する目的で、本明細書に援用される。
いくつかの実施形態では、本開示は、下記の実施形態を例として示す。
１．下記の式の２－ケトカルボン酸の生成方法であって、
Figure 2022530467000053
式中、Ｒが、Ｈ、ＣＨ３またはＣＨ２ＯＨであり、
前記方法が、天然に存在しない１つ以上の微生物を含む培養液において、ピルベート及び
Figure 2022530467000054
 をヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼと接触させて、前記２－ケトカルボン酸を生成させることを含み、前記ヒドラターゼ－アルドラーゼ及び前記キノンオキシドレダクターゼが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって発現される前記方法。
２．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼ及び前記キノンオキシドレダクターゼのうちの少なくとも１つが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現される、実施形態１に記載の方法。
３．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現される、実施形態１に記載の方法。
４．前記キノンオキシドレダクターゼが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現される、実施形態１に記載の方法。
５．前記キノンオキシドレダクターゼが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって過剰発現される、実施形態１に記載の方法。
６．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現され、前記キノンオキシドレダクターゼが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって過剰発現される、実施形態１に記載の方法。
７．
Figure 2022530467000055
 が、３－ヒドロキシプロパナールである、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法。
８．前記３－ヒドロキシプロパナールが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現されるグリセロールデヒドラターゼ酵素による、グリセロールの脱水によって生成される、実施形態７に記載の方法。
９．前記２－ケトカルボン酸を、前記天然に存在しない１つ以上の微生物、または前記天然に存在しない１つ以上の微生物を含む培養液から分離することをさらに含む、実施形態１～８のいずれか１つに記載の方法。
１０．下記の式の２－ケトカルボン酸の生成方法であって、
Figure 2022530467000056
式中、Ｒが、Ｈ、ＣＨ３またはＣＨ２ＯＨであり、
前記方法が、天然に存在しない２つ以上の微生物を含む培養液において、ピルベート及び
Figure 2022530467000057
 をヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼと接触させて、前記２－ケトカルボン酸を生成させることを含み、前記ヒドラターゼ－アルドラーゼ及び前記キノンオキシドレダクターゼが、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって発現される前記方法。
１１．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼ及び前記キノンオキシドレダクターゼのうちの少なくとも１つが、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって外因性に発現される、実施形態１０に記載の方法。
１２．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼが、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって外因性に発現される、実施形態１０に記載の方法。
１３．前記キノンオキシドレダクターゼが、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって外因性に発現される、実施形態１０に記載の方法。
１４．前記キノンオキシドレダクターゼが、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって過剰発現される、実施形態１０に記載の方法。
１５．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼが、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって外因性に発現され、前記キノンオキシドレダクターゼが、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって過剰発現される、実施形態１０に記載の方法。
１６．
Figure 2022530467000058
 が、３－ヒドロキシプロパナールである、実施形態１０～１５のいずれか１つに記載の方法。
１７．前記３－ヒドロキシプロパナールが、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって外因性に発現されるグリセロールデヒドラターゼ酵素による、グリセロールの脱水によって生成される、実施形態１６に記載の方法。
１８．前記２－ケトカルボン酸を、前記天然に存在しない２つ以上の微生物、または前記天然に存在しない２つ以上の微生物を含む培養液から分離することをさらに含む、実施形態１０～１７のいずれか１つに記載の方法。
１９．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼが、ＥＣ番号４．１．２．４５またはＥＣ番号４．１．２．３４またはＥＣ番号４．１．１．４である酵素である、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
２０．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼが、ＧｅｎＢａｎｋ、ＲｅｆＳｅｑまたはＵｎｉｐｒｏｔのＩＤ番号Ｄ７Ｃ０Ｅ５、Ｐ０Ａ１４４、Ｑ７９ＥＭ８、Ａ０Ａ０Ｎ０ＡＨＩ８、Ａ０Ａ０Ｎ１ＦＲＹ３、Ｍ３ＤＹＲ１、Ｗ７ＳＵ４８、Ａ０Ａ２８６ＰＨ１８、Ｑ９Ｘ９Ｑ６、Ｑ９ＷＸＨ７、Ａ４ＸＤＳ１、Ｆ２Ｊ６Ｎ９、Ａ０Ａ０６３ＢＦＬ５、Ｑ９ＺＨＨ６、Ａ０Ａ０Ｃ１Ｋ８５３、ＷＰ＿０３４３９８４８２、ＰＹＫ１２１９１、ＷＰ＿１１５４７８０３３、ＷＰ＿０２８２２２２５３、ＷＰ＿０１３６５４８０７、ＷＰ＿０５９４０３０６０、ＷＰ＿０９２５０８５３０、ＷＰ＿１１６６４２６２７、ＷＰ＿００９７７０６５９、ＷＰ＿１０７８１８１９１、ＷＰ＿００３２９２０６１、ＰＹＮ４８８５５、ＷＰ＿１２２２１２９６５、ＷＰ＿０２８２１７２９７、ＷＰ＿０３４５０７０４９、ＫＭＫ６４０８１．１、ＷＰ＿０７００２８０４１．１またはＫＺＬ９２４４９．１で識別される酵素の群から選択した酵素である、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
２１．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号８４、配列番号８５または配列番号８６の配列を含む酵素である、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
２２．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼにおいて、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号８４、配列番号８５または配列番号８６の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも５０％である、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
２３．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼにおいて、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号８４、配列番号８５または配列番号８６の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも７０％である、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
２４．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼにおいて、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号８４、配列番号８５または配列番号８６の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも９０％である、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
２５．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼが、表１、５～８から選択した酵素である、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
２６．前記キノンオキシドレダクターゼが、ＥＣ番号１．６．５（例えばＥＣ１．６．５．５）である酵素である、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の方法。
２７．前記キノンオキシドレダクターゼが、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７の配列を含む酵素である、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の方法。
２８．前記キノンオキシドレダクターゼにおいて、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも５０％である、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の方法。
２９．前記キノンオキシドレダクターゼにおいて、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも７０％である、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の方法。
３０．前記キノンオキシドレダクターゼにおいて、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも９０％である、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の方法。
３１．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼ及び前記キノンオキシドレダクターゼのうちの１つ以上がさらに、タンパク質タグを１つ以上含む、実施形態１～３０のいずれか１つに記載の方法。
３２．前記タンパク質タグが、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ（グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグ）、ＨＡタグ（ヘマグルチニンタグ）、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、マルトース結合タンパク質タグ、キチン結合タンパク質タグ及び蛍光タグから選択されている、実施形態３１に記載の方法。
３３．前記ピルベートが、グリセロール、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、スクロース及びデンプンまたはこれらを組み合わせたものから選択した炭素源から生成される、実施形態１～３２のいずれか１つに記載の方法。
３４．前記式中、Ｒが、ＣＨ２ＯＨである、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の方法。
３５．１，５－ペンタンジオールの生成方法であって、
ピルベート及び３－ヒドロキシプロパナールをヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼと接触させて、下記の式の２－ケトカルボン酸を生成させることと、
Figure 2022530467000059
（式中、Ｒが、ＣＨ２ＯＨである）
前記２－ケトカルボン酸を２－ケト酸デカルボキシラーゼと接触させて、５－ヒドロキシペンタナールを生成させることと、
前記５－ヒドロキシペンタナールを１級アルコールデヒドロゲナーゼと接触させて、前記１，５－ペンタンジオールを生成させることと、
を含み、
天然に存在しない１つ以上の微生物を含む培養液において行う前記方法。
３６．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼ及び前記キノンオキシドレダクターゼが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって発現される、実施形態３５に記載の方法。
３７．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼ及び前記キノンオキシドレダクターゼのうちの少なくとも１つが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現される、実施形態３５に記載の方法。
３８．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現される、実施形態３５に記載の方法。
３９．前記キノンオキシドレダクターゼが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現される、実施形態３５に記載の方法。
４０．前記キノンオキシドレダクターゼが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって過剰発現される、実施形態３５に記載の方法。
４１．前記２－ケト酸デカルボキシラーゼ及び前記１級アルコールデヒドロゲナーゼが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって発現される、実施形態３５～４０のいずれか１つに記載の方法。
４２．前記２－ケト酸デカルボキシラーゼ及び前記１級アルコールデヒドロゲナーゼが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現される、実施形態３５～４０のいずれか１つに記載の方法。
４３．前記２－ケト酸デカルボキシラーゼ及び前記１級アルコールデヒドロゲナーゼのうちの１つ以上が、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって過剰発現される、実施形態３５～４０のいずれか１つに記載の方法。
４４．前記１，５－ペンタンジオールを、前記天然に存在しない１つ以上の微生物、または前記天然に存在しない１つ以上の微生物を含む培養液から分離することをさらに含む、実施形態３５～４３のいずれか１つに記載の方法。
４５．１，５－ペンタンジオールの生成方法であって、
ピルベート及び３－ヒドロキシプロパナールをヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼと接触させて、下記の式の２－ケトカルボン酸を生成させることと、
Figure 2022530467000060
（式中、Ｒが、ＣＨ２ＯＨである）
前記２－ケトカルボン酸を２－ケト酸デカルボキシラーゼと接触させて、５－ヒドロキシペンタナールを生成させることと、
前記５－ヒドロキシペンタナールを１級アルコールデヒドロゲナーゼと接触させて、前記１，５－ペンタンジオールを生成させることと、
を含み、
天然に存在しない２つ以上の微生物を含む培養液において行う前記方法。
４６．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼ及び前記キノンオキシドレダクターゼが、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって発現される、実施形態４５に記載の方法。
４７．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼ及び前記キノンオキシドレダクターゼのうちの少なくとも１つが、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって外因性に発現される、実施形態４５に記載の方法。
４８．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼが、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって外因性に発現される、実施形態４５に記載の方法。
４９．前記キノンオキシドレダクターゼが、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって外因性に発現される、実施形態４５に記載の方法。
５０．前記キノンオキシドレダクターゼが、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって過剰発現される、実施形態４５に記載の方法。
５１．前記２－ケト酸デカルボキシラーゼ及び前記１級アルコールデヒドロゲナーゼが、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって発現される、実施形態４５～５０のいずれか１つに記載の方法。
５２．前記２－ケト酸デカルボキシラーゼ及び前記１級アルコールデヒドロゲナーゼが、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって外因性に発現される、実施形態４５～５０のいずれか１つに記載の方法。
５３．前記２－ケト酸デカルボキシラーゼ及び前記１級アルコールデヒドロゲナーゼのうちの１つ以上が、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって過剰発現される、実施形態４５～５０のいずれか１つに記載の方法。
５４．前記１，５－ペンタンジオールを、前記天然に存在しない２つ以上の微生物、または前記天然に存在しない２つ以上の微生物を含む培養液から分離することをさらに含む、実施形態４５～５３のいずれか１つに記載の方法。
５５．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼが、ＥＣ番号４．１．２．４５またはＥＣ番号４．１．２．３４またはＥＣ番号４．１．１．４である酵素である、実施形態３５～５４のいずれか１つに記載の方法。
５６．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼが、ＧｅｎＢａｎｋ、ＲｅｆＳｅｑまたはＵｎｉｐｒｏｔのＩＤ番号Ｄ７Ｃ０Ｅ５、Ｐ０Ａ１４４、Ｑ７９ＥＭ８、Ａ０Ａ０Ｎ０ＡＨＩ８、Ａ０Ａ０Ｎ１ＦＲＹ３、Ｍ３ＤＹＲ１、Ｗ７ＳＵ４８、Ａ０Ａ２８６ＰＨ１８、Ｑ９Ｘ９Ｑ６、Ｑ９ＷＸＨ７、Ａ４ＸＤＳ１、Ｆ２Ｊ６Ｎ９、Ａ０Ａ０６３ＢＦＬ５、Ｑ９ＺＨＨ６、Ａ０Ａ０Ｃ１Ｋ８５３、ＷＰ＿０３４３９８４８２、ＰＹＫ１２１９１、ＷＰ＿１１５４７８０３３、ＷＰ＿０２８２２２２５３、ＷＰ＿０１３６５４８０７、ＷＰ＿０５９４０３０６０、ＷＰ＿０９２５０８５３０、ＷＰ＿１１６６４２６２７、ＷＰ＿００９７７０６５９、ＷＰ＿１０７８１８１９１、ＷＰ＿００３２９２０６１、ＰＹＮ４８８５５、ＷＰ＿１２２２１２９６５、ＷＰ＿０２８２１７２９７、ＷＰ＿０３４５０７０４９、ＫＭＫ６４０８１．１、ＷＰ＿０７００２８０４１．１またはＫＺＬ９２４４９．１で識別される酵素の群から選択した酵素である、実施形態３５～５４のいずれか１つに記載の方法。
５７．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号８４、配列番号８５または配列番号８６の配列を含む酵素である、実施形態３５～５４のいずれか１つに記載の方法。
５８．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼにおいて、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号８４、配列番号８５または配列番号８６の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも５０％である、実施形態３５～５４のいずれか１つに記載の方法。
５９．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼにおいて、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号８４、配列番号８５または配列番号８６の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも７０％である、実施形態３５～５４のいずれか１つに記載の方法。
６０．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼにおいて、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号８４、配列番号８５または配列番号８６の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも９０％である、実施形態３５～５４のいずれか１つに記載の方法。
６１．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼが、表１、５～８から選択した酵素である、実施形態３５～５４のいずれか１つに記載の方法。
６２．前記キノンオキシドレダクターゼが、ＥＣ番号１．６．５（例えばＥＣ１．６．５．５）である酵素である、実施形態３５～６１のいずれか１つに記載の方法。
６３．前記キノンオキシドレダクターゼが、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７の配列を含む酵素である、実施形態３５～６１のいずれか１つに記載の方法。
６４．前記キノンオキシドレダクターゼにおいて、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも５０％である、実施形態３５～６１のいずれか１つに記載の方法。
６５．前記キノンオキシドレダクターゼにおいて、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも７０％である、実施形態３５～６１のいずれか１つに記載の方法。
６６．前記キノンオキシドレダクターゼにおいて、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも９０％である、実施形態３５～６１のいずれか１つに記載の方法。
６７．前記２－ケト酸デカルボキシラーゼが、ＥＣ番号４．１．１．１、ＥＣ番号４．１．１．２、ＥＣ番号４．１．１．３、ＥＣ番号４．１．１．４、ＥＣ番号４．１．１．５、ＥＣ番号４．１．１．６、ＥＣ番号４．１．１．７、ＥＣ番号４．１．１．１１、ＥＣ番号４．１．１．１２、ＥＣ番号４．１．１．１５、ＥＣ番号４．１．１．１６、ＥＣ番号４．１．１．１７、ＥＣ番号４．１．１．１８、ＥＣ番号４．１．１．１９、ＥＣ番号４．１．１．２０、ＥＣ番号４．１．１．３４、ＥＣ番号４．１．１．３５、ＥＣ番号４．１．１．４０、ＥＣ番号４．１．１．５４、ＥＣ番号４．１．１．５６、ＥＣ番号４．１．１．７１、ＥＣ番号４．１．１．７２、ＥＣ番号４．１．１．７３、ＥＣ番号４．１．１．７４、ＥＣ番号４．１．１．７５またはＥＣ番号４．１．１．７７である酵素である、実施形態３５～６６のいずれか１つに記載の方法。
６８．前記２－ケト酸デカルボキシラーゼが、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ６ＱＢＳ４、Ａ７Ｍ７Ｄ６またはＰ２０９０６で識別される酵素の群から選択した酵素である、実施形態３５～６６のいずれか１つに記載の方法。
６９．前記２－ケト酸デカルボキシラーゼにおいて、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ６ＱＢＳ４、Ａ７Ｍ７Ｄ６またはＰ２０９０６で識別される酵素の群から選択した酵素との同一性が、少なくとも５０％である、実施形態３５～６６のいずれか１つに記載の方法。
７０．前記２－ケト酸デカルボキシラーゼにおいて、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ６ＱＢＳ４、Ａ７Ｍ７Ｄ６またはＰ２０９０６で識別される酵素の群から選択した酵素との同一性が、少なくとも７０％である、実施形態３５～６６のいずれか１つに記載の方法。
７１．前記２－ケト酸デカルボキシラーゼにおいて、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ６ＱＢＳ４、Ａ７Ｍ７Ｄ６またはＰ２０９０６で識別される酵素の群から選択した酵素との同一性が、少なくとも９０％である、実施形態３５～６６のいずれか１つに記載の方法。
７２．前記１級アルコールデヒドロゲナーゼが、ＥＣ番号１．１．１．６１である酵素である、実施形態３５～７１のいずれか１つに記載の方法。
７３．前記１級アルコールデヒドロゲナーゼが、ＵｎｉｐｒｏｔまたはＧｅｎＢａｎｋのＩＤ番号ＮＰ＿４１７２７９．１、ＮＰ＿３４９８９２．１、ＮＰ＿３４９８９１．１、ＢＡＢ１２２７３．１、Ｌ２１９０２．１、Ｑ９４Ｂ０７、ＡＡＢ０３０１５．１、ＮＰ＿０１４０３２．１、ＮＰ＿０１３８９２．１、ＮＰ＿０１５０１９．１、ＮＰ＿０１０９９６．２、ＡＢＸ３９１９２．１、ＸＰ＿００１２１０６２５．１、ＡＢＯ６７１１８、ＡＢＯ６８２２３、ＢＡＥ７７０６８．１またはＣＡＡ４７７４３．１で識別される酵素の群から選択した酵素である、実施形態３５～７１のいずれか１つに記載の方法。
７４．前記１級アルコールデヒドロゲナーゼが、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３または配列番号７４の配列を含む酵素である、実施形態３５～７１のいずれか１つに記載の方法。
７５．前記１級アルコールデヒドロゲナーゼにおいて、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３または配列番号７４の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも５０％である、実施形態３５～７１のいずれか１つに記載の方法。
７６．前記１級アルコールデヒドロゲナーゼにおいて、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３または配列番号７４の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも７０％である、実施形態３５～７１のいずれか１つに記載の方法。
７７．前記１級アルコールデヒドロゲナーゼにおいて、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３または配列番号７４の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも９０％である、実施形態３５～７１のいずれか１つに記載の方法。
７８．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼが、配列番号８の配列を含む酵素であり、
前記キノンオキシドレダクターゼが、配列番号４５の配列を含む酵素であり、
前記２－ケト酸デカルボキシラーゼが、配列番号８３の配列を含む酵素であり、
前記１級アルコールデヒドロゲナーゼが、配列番号７０の配列を含む酵素である、実施形態３５～５４のいずれか１つに記載の方法。
７９．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼ、前記キノンオキシドレダクターゼ、前記２－ケト酸デカルボキシラーゼ及び前記１級アルコールデヒドロゲナーゼのうちの１つ以上がさらに、タンパク質タグを１つ以上含む、実施形態３５～７８のいずれか１つに記載の方法。
８０．前記タンパク質タグが、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ（グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグ）、ＨＡタグ（ヘマグルチニンタグ）、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、マルトース結合タンパク質タグ、キチン結合タンパク質タグ及び蛍光タグから選択されている、実施形態７９に記載の方法。
８１．前記ピルベートが、グリセロール、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、スクロース及びデンプンまたはこれらを組み合わせたものから選択した炭素源から生成される、実施形態３５～８０のいずれか１つに記載の方法。
８２．前記３－ヒドロキシプロパナールが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現されるグリセロールデヒドラターゼ酵素による、グリセロールの脱水によって生成される、実施形態３５～８１のいずれか１つに記載の方法。
８３．１，６－ヘキサンジオールの生成方法であって、
ピルベート及び３－ヒドロキシプロパナールをヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼと接触させて、下記の式の２－ケトカルボン酸を生成させることと、
Figure 2022530467000061
（式中、Ｒが、ＣＨ２ＯＨである）
前記２－ケトカルボン酸を６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼと接触させて、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを生成させることと、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼと接触させて、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼと接触させて、６－ヒドロキシ－２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
前記６－ヒドロキシ－２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡを２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサノエートを生成させることと、
前記６－ヒドロキシヘキサノエートを６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサナールを生成させることと、
前記６－ヒドロキシヘキサナールを６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼと接触させて、前記１，６－ヘキサンジオールを生成させることと、
を含み、
天然に存在しない１つ以上の微生物を含む培養液において行う前記方法。
８４．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼ及び前記キノンオキシドレダクターゼが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって発現される、実施形態８３に記載の方法。
８５．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼ及び前記キノンオキシドレダクターゼのうちの少なくとも１つが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現される、実施形態８３に記載の方法。
８６．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現される、実施形態８３に記載の方法。
８７．前記キノンオキシドレダクターゼが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現される、実施形態８３に記載の方法。
８８．前記キノンオキシドレダクターゼが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって過剰発現される、実施形態８３に記載の方法。
８９．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ、前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼ、前記６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼ及び前記６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって発現される、実施形態８３～８８のいずれか１つに記載の方法。
９０．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ、前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼ、前記６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼ及び前記６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現される、実施形態８３～８８のいずれか１つに記載の方法。
９１．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ、前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼ、前記６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼ及び前記６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼのうちの１つ以上が、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって過剰発現される、実施形態８３～８８のいずれか１つに記載の方法。
９２．前記１，６－ヘキサンジオールを、前記天然に存在しない１つ以上の微生物、または前記天然に存在しない１つ以上の微生物を含む培養液から分離することをさらに含む、実施形態８３～９１のいずれか１つに記載の方法。
９３．１，６－ヘキサンジオールの生成方法であって、
ピルベート及び３－ヒドロキシプロパナールをヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼと接触させて、下記の式の２－ケトカルボン酸を生成させることと、
Figure 2022530467000062
（式中、Ｒが、ＣＨ２ＯＨである）
前記２－ケトカルボン酸を６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼと接触させて、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを生成させることと、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼと接触させて、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼと接触させて、６－ヒドロキシ－２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
前記６－ヒドロキシ－２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡを２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサノエートを生成させることと、
前記６－ヒドロキシヘキサノエートを６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサナールを生成させることと、
前記６－ヒドロキシヘキサナールを６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼと接触させて、前記１，６－ヘキサンジオールを生成させることと、
を含み、
天然に存在しない２つ以上の微生物を含む培養液において行う前記方法。
９４．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼ及び前記キノンオキシドレダクターゼが、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって発現される、実施形態９３に記載の方法。
９５．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼ及び前記キノンオキシドレダクターゼのうちの少なくとも１つが、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって外因性に発現される、実施形態９３に記載の方法。
９６．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼが、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって外因性に発現される、実施形態９３に記載の方法。
９７．前記キノンオキシドレダクターゼが、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって外因性に発現される、実施形態９３に記載の方法。
９８．前記キノンオキシドレダクターゼが、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって過剰発現される、実施形態９３に記載の方法。
９９．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ、前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼ、前記６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼ及び前記６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼが、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって発現される、実施形態９３～９８のいずれか１つに記載の方法。
１００．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ、前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼ、前記６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼ及び前記６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼが、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって外因性に発現される、実施形態９３～９８のいずれか１つに記載の方法。
１０１．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ、前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼ、前記６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼ及び前記６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼのうちの１つ以上が、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって過剰発現される、実施形態９３～９８のいずれか１つに記載の方法。
１０２．前記１，６－ヘキサンジオールを、前記天然に存在しない２つ以上の微生物、または前記天然に存在しない２つ以上の微生物を含む培養液から分離することをさらに含む、実施形態９３～１０１のいずれか１つに記載の方法。
１０３．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼが、ＥＣ番号４．１．２．４５またはＥＣ番号４．１．２．３４またはＥＣ番号４．１．１．４である酵素である、実施形態８３～１０２のいずれか１つに記載の方法。
１０４．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼが、ＧｅｎＢａｎｋ、ＲｅｆＳｅｑまたはＵｎｉｐｒｏｔのＩＤ番号Ｄ７Ｃ０Ｅ５、Ｐ０Ａ１４４、Ｑ７９ＥＭ８、Ａ０Ａ０Ｎ０ＡＨＩ８、Ａ０Ａ０Ｎ１ＦＲＹ３、Ｍ３ＤＹＲ１、Ｗ７ＳＵ４８、Ａ０Ａ２８６ＰＨ１８、Ｑ９Ｘ９Ｑ６、Ｑ９ＷＸＨ７、Ａ４ＸＤＳ１、Ｆ２Ｊ６Ｎ９、Ａ０Ａ０６３ＢＦＬ５、Ｑ９ＺＨＨ６、Ａ０Ａ０Ｃ１Ｋ８５３、ＷＰ＿０３４３９８４８２、ＰＹＫ１２１９１、ＷＰ＿１１５４７８０３３、ＷＰ＿０２８２２２２５３、ＷＰ＿０１３６５４８０７、ＷＰ＿０５９４０３０６０、ＷＰ＿０９２５０８５３０、ＷＰ＿１１６６４２６２７、ＷＰ＿００９７７０６５９、ＷＰ＿１０７８１８１９１、ＷＰ＿００３２９２０６１、ＰＹＮ４８８５５、ＷＰ＿１２２２１２９６５、ＷＰ＿０２８２１７２９７、ＷＰ＿０３４５０７０４９、ＫＭＫ６４０８１．１、ＷＰ＿０７００２８０４１．１またはＫＺＬ９２４４９．１で識別される酵素の群から選択した酵素である、実施形態８３～１０２のいずれか１つに記載の方法。
１０５．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号８４、配列番号８５または配列番号８６の配列を含む酵素である、実施形態８３～１０２のいずれか１つに記載の方法。
１０６．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼにおいて、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号８４、配列番号８５または配列番号８６の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも５０％である、実施形態８３～１０２のいずれか１つに記載の方法。
１０７．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼにおいて、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号８４、配列番号８５または配列番号８６の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも７０％である、実施形態８３～１０２のいずれか１つに記載の方法。
１０８．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼにおいて、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号８４、配列番号８５または配列番号８６の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも９０％である、実施形態８３～１０２のいずれか１つに記載の方法。
１０９．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼが、表１及び５～８から選択した酵素である、実施形態８３～１０２のいずれか１つに記載の方法。
１１０．前記キノンオキシドレダクターゼが、ＥＣ番号１．６．５（例えばＥＣ１．６．５．５）である酵素である、実施形態８３～１０９のいずれか１つに記載の方法。
１１１．前記キノンオキシドレダクターゼが、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７の配列を含む酵素である、実施形態８３～１０９のいずれか１つに記載の方法。
１１２．前記キノンオキシドレダクターゼにおいて、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも５０％である、実施形態８３～１０９のいずれか１つに記載の方法。
１１３．前記キノンオキシドレダクターゼにおいて、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも７０％である、実施形態８３～１０９のいずれか１つに記載の方法。
１１４．前記キノンオキシドレダクターゼにおいて、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも９０％である、実施形態８３～１０９のいずれか１つに記載の方法。
１１５．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼが、ＥＣ番号１．１．９９．６、ＥＣ番号１．１．１．１６９、ＥＣ番号１．１．１．２１５、ＥＣ番号１．１．１．２８またはＥＣ番号１．１．１．１１０である酵素であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼが、ＥＣ番号２．８．３、ＥＣ番号２．８．３．１またはＥＣ番号２．８．３．１２である酵素であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼが、ＥＣ番号４．２．１．１６７である酵素であり、
前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼが、ＥＣ番号１．３．１．４４である酵素であり、
前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼが、ＥＣ番号２．８．３、ＥＣ番号２．８．３．１またはＥＣ番号２．８．３．１２である酵素であり、
前記６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼが、ＥＣ番号１．２．９９．６である酵素であり、
前記６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼが、ＥＣ番号１．１．１である酵素である、実施形態８３～１０２のいずれか１つに記載の方法。
１１６．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼが、配列番号５３、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４または配列番号１０５の配列を含む酵素であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼが、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼが、配列番号５９、配列番号６１及び配列番号６３、または配列番号６０、配列番号６２及び配列番号６４の配列を含む酵素であり、
前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼが、配列番号６５の配列を含む酵素であり、
前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼが、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素であり、
前記６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼが、配列番号６６、配列番号６７または配列番号６８の配列を含む酵素であり、
前記６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼが、配列番号７０の配列を含む酵素である、実施形態８３～１０２のいずれか１つに記載の方法。
１１７．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼにおいて、配列番号５３、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４または配列番号１０５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも５０％であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼにおいて、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも５０％であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼにおいて、配列番号５９、配列番号６１及び配列番号６３、または配列番号６０、配列番号６２及び配列番号６４の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも５０％であり、
前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼにおいて、配列番号６５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも５０％であり、
前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼにおいて、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも５０％であり、
前記６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼにおいて、配列番号６６、配列番号６７または配列番号６８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも５０％であり、
前記６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼにおいて、配列番号７０の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも５０％である、実施形態８３～１０２のいずれか１つに記載の方法。
１１８．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼにおいて、配列番号５３、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４または配列番号１０５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも７０％であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼにおいて、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも７０％であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼにおいて、配列番号５９、配列番号６１及び配列番号６３、または配列番号６０、配列番号６２及び配列番号６４の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも７０％であり、
前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼにおいて、配列番号６５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも７０％であり、
前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼにおいて、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも７０％であり、
前記６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼにおいて、配列番号６６、配列番号６７または配列番号６８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも７０％であり、
前記６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼにおいて、配列番号７０の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも７０％である、実施形態８３～１０２のいずれか１つに記載の方法。
１１９．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼにおいて、配列番号５３、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４または配列番号１０５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも９０％であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼにおいて、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも９０％であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼにおいて、配列番号５９、配列番号６１及び配列番号６３、または配列番号６０、配列番号６２及び配列番号６４の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも９０％であり、
前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼにおいて、配列番号６５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも９０％であり、
前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼにおいて、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも９０％であり、
前記６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼにおいて、配列番号６６、配列番号６７または配列番号６８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも９０％であり、
前記６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼにおいて、配列番号７０の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも９０％である、実施形態８３～１０２のいずれか１つに記載の方法。
１２０．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ、前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼ、前記６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼ及び前記６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼのうちの１つ以上がさらに、タンパク質タグを１つ以上含む、実施形態８３～１１９のいずれか１つに記載の方法。
１２１．前記タンパク質タグが、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ（グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグ）、ＨＡタグ（ヘマグルチニンタグ）、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、マルトース結合タンパク質タグ、キチン結合タンパク質タグ及び蛍光タグから選択されている、実施形態１２０に記載の方法。
１２２．前記ピルベートが、グリセロール、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、スクロース及びデンプンまたはこれらを組み合わせたものから選択した炭素源から生成される、実施形態８３～１２１のいずれか１つに記載の方法。
１２３．前記３－ヒドロキシプロパナールが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現されるグリセロールデヒドラターゼ酵素による、グリセロールの脱水によって生成される、実施形態８３～１２２のいずれか１つに記載の方法。
１２４．６－ヒドロキシヘキサノエートの生成方法であって、
ピルベート及び３－ヒドロキシプロパナールをヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼと接触させて、下記の式の２－ケトカルボン酸を生成させることと、
Figure 2022530467000063
（式中、Ｒが、ＣＨ２ＯＨである）
前記２－ケトカルボン酸を６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼと接触させて、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを生成させることと、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼと接触させて、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼと接触させて、６－ヒドロキシ－２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
前記６－ヒドロキシ－２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡを２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼと接触させて、前記６－ヒドロキシヘキサノエートを生成させることと、
を含み、
天然に存在しない１つ以上の微生物を含む培養液において行う前記方法。
１２５．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼ及び前記キノンオキシドレダクターゼが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって発現される、実施形態１２４に記載の方法。
１２６．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼ及び前記キノンオキシドレダクターゼのうちの少なくとも１つが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現される、実施形態１２４に記載の方法。
１２７．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現される、実施形態１２４に記載の方法。
１２８．前記キノンオキシドレダクターゼが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現される、実施形態１２４に記載の方法。
１２９．前記キノンオキシドレダクターゼが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって過剰発現される、実施形態１２４に記載の方法。
１３０．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ及び前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって発現される、実施形態１２４～１２９のいずれか１つに記載の方法。
１３１．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ及び前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現される、実施形態１２４～１２９のいずれか１つに記載の方法。
１３２．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ及び前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼのうちの１つ以上が、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって過剰発現される、実施形態１２４～１２９のいずれか１つに記載の方法。
１３３．前記６－ヒドロキシヘキサノエートを、前記天然に存在しない１つ以上の微生物、または前記天然に存在しない１つ以上の微生物を含む培養液から分離することをさらに含む、実施形態１２４～１３２のいずれか１つに記載の方法。
１３４．６－ヒドロキシヘキサノエートの生成方法であって、
ピルベート及び３－ヒドロキシプロパナールをヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼと接触させて、下記の式の２－ケトカルボン酸を生成させることと、
Figure 2022530467000064
（式中、Ｒが、ＣＨ２ＯＨである）
前記２－ケトカルボン酸を６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼと接触させて、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを生成させることと、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼと接触させて、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼと接触させて、６－ヒドロキシ－２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
前記６－ヒドロキシ－２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡを２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼと接触させて、前記６－ヒドロキシヘキサノエートを生成させることと、
を含み、
天然に存在しない２つ以上の微生物を含む培養液において行う前記方法。
１３５．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼ及び前記キノンオキシドレダクターゼが、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって発現される、実施形態１３４に記載の方法。
１３６．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼ及び前記キノンオキシドレダクターゼのうちの少なくとも１つが、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって外因性に発現される、実施形態１３４に記載の方法。
１３７．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼが、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって外因性に発現される、実施形態１３４に記載の方法。
１３８．前記キノンオキシドレダクターゼが、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって外因性に発現される、実施形態１３４に記載の方法。
１３９．前記キノンオキシドレダクターゼが、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって過剰発現される、実施形態１３４に記載の方法。
１４０．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ及び前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼが、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって発現される、実施形態１３４～１３９のいずれか１つに記載の方法。
１４１．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ及び前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼが、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって外因性に発現される、実施形態１３４～１３９のいずれか１つに記載の方法。
１４２．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ及び前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼのうちの１つ以上が、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって過剰発現される、実施形態１３４～１３９のいずれか１つに記載の方法。
１４３．前記６－ヒドロキシヘキサノエートを、前記天然に存在しない２つ以上の微生物、または前記天然に存在しない２つ以上の微生物を含む培養液から分離することをさらに含む、実施形態１３４～１４２のいずれか１つに記載の方法。
１１５．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼが、ＥＣ番号１．１．９９．６、ＥＣ番号１．１．１．１６９、ＥＣ番号１．１．１．２１５、ＥＣ番号１．１．１．２８またはＥＣ番号１．１．１．１１０である酵素であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼが、ＥＣ番号２．８．３、ＥＣ番号２．８．３．１またはＥＣ番号２．８．３．１２である酵素であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼが、ＥＣ番号４．２．１．１６７である酵素であり、
前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼが、ＥＣ番号１．３．１．４４である酵素であり、
前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼが、ＥＣ番号２．８．３、ＥＣ番号２．８．３．１またはＥＣ番号２．８．３．１２である酵素であり、
前記６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼが、ＥＣ番号１．２．９９．６である酵素であり、
前記６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼが、ＥＣ番号１．１．１である酵素である、実施形態８３～１０２のいずれか１つに記載の方法。
１１６．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼが、配列番号５３、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４または配列番号１０５の配列を含む酵素であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼが、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼが、配列番号５９、配列番号６１及び配列番号６３、または配列番号６０、配列番号６２及び配列番号６４の配列を含む酵素であり、
前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼが、配列番号６５の配列を含む酵素であり、
前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼが、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素であり、
前記６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼが、配列番号６６、配列番号６７または配列番号６８の配列を含む酵素であり、
前記６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼが、配列番号７０の配列を含む酵素である、実施形態８３～１０２のいずれか１つに記載の方法。
１１７．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼにおいて、配列番号５３、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４または配列番号１０５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも５０％であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼにおいて、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも５０％であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼにおいて、配列番号５９、配列番号６１及び配列番号６３、または配列番号６０、配列番号６２及び配列番号６４の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも５０％であり、
前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼにおいて、配列番号６５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも５０％であり、
前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼにおいて、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも５０％であり、
前記６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼにおいて、配列番号６６、配列番号６７または配列番号６８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも５０％であり、
前記６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼにおいて、配列番号７０の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも５０％である、実施形態８３～１０２のいずれか１つに記載の方法。
１１８．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼにおいて、配列番号５３、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４または配列番号１０５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも７０％であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼにおいて、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも７０％であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼにおいて、配列番号５９、配列番号６１及び配列番号６３、または配列番号６０、配列番号６２及び配列番号６４の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも７０％であり、
前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼにおいて、配列番号６５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも７０％であり、
前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼにおいて、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも７０％であり、
前記６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼにおいて、配列番号６６、配列番号６７または配列番号６８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも７０％であり、
前記６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼにおいて、配列番号７０の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも７０％である、実施形態８３～１０２のいずれか１つに記載の方法。
１１９．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼにおいて、配列番号５３、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４または配列番号１０５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも９０％であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼにおいて、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも９０％であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼにおいて、配列番号５９、配列番号６１及び配列番号６３、または配列番号６０、配列番号６２及び配列番号６４の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも９０％であり、
前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼにおいて、配列番号６５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも９０％であり、
前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼにおいて、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも９０％であり、
前記６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼにおいて、配列番号６６、配列番号６７または配列番号６８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも９０％であり、
前記６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼにおいて、配列番号７０の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも９０％である、実施形態８３～１０２のいずれか１つに記載の方法。
１５６．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼが、ＥＣ番号１．１．９９．６、ＥＣ番号１．１．１．１６９、ＥＣ番号１．１．１．２１５、ＥＣ番号１．１．１．２８またはＥＣ番号１．１．１．１１０である酵素であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼが、ＥＣ番号２．８．３、ＥＣ番号２．８．３．１またはＥＣ番号２．８．３．１２である酵素であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼが、ＥＣ番号４．２．１．１６７である酵素であり、
前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼが、ＥＣ番号１．３．１．４４である酵素であり、
前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼが、ＥＣ番号２．８．３、ＥＣ番号２．８．３．１またはＥＣ番号２．８．３．１２である酵素である、実施形態１２４～１４３のいずれか１つに記載の方法。
１５７．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼが、配列番号５３、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４または配列番号１０５の配列を含む酵素であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼが、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼが、配列番号５９、配列番号６１及び配列番号６３、または配列番号６０、配列番号６２及び配列番号６４の配列を含む酵素であり、
前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼが、配列番号６５の配列を含む酵素であり、
前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼが、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素である、実施形態１２４～１４３のいずれか１つに記載の方法。
１５８．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼにおいて、配列番号５３、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４または配列番号１０５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも５０％であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼにおいて、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも５０％であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼにおいて、配列番号５９、配列番号６１及び配列番号６３、または配列番号６０、配列番号６２及び配列番号６４の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも５０％であり、
前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼにおいて、配列番号６５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも５０％であり、
前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼにおいて、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも５０％である、実施形態１２４～１４３のいずれか１つに記載の方法。
１５９．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼにおいて、配列番号５３、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４または配列番号１０５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも７０％であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼにおいて、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも７０％であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼにおいて、配列番号５９、配列番号６１及び配列番号６３、または配列番号６０、配列番号６２及び配列番号６４の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも７０％であり、
前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼにおいて、配列番号６５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも７０％であり、
前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼにおいて、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも７０％である、実施形態１２４～１４３のいずれか１つに記載の方法。
１６０．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼにおいて、配列番号５３、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４または配列番号１０５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも９０％であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼにおいて、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも９０％であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼにおいて、配列番号５９、配列番号６１及び配列番号６３、または配列番号６０、配列番号６２及び配列番号６４の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも９０％であり、
前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼにおいて、配列番号６５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも９０％であり、
前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼにおいて、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７または配列番号５８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも９０％ある、実施形態１２４～１４３のいずれか１つに記載の方法。
１６１．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ及び前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼのうちの１つ以上がさらに、タンパク質タグを１つ以上含む、実施形態１２４～１６０のいずれか１つに記載の方法。
１６２．前記タンパク質タグが、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ（グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグ）、ＨＡタグ（ヘマグルチニンタグ）、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、マルトース結合タンパク質タグ、キチン結合タンパク質タグ及び蛍光タグから選択されている、実施形態１６１に記載の方法。
１６３．前記ピルベートが、グリセロール、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、スクロース及びデンプンまたはこれらを組み合わせたものから選択した炭素源から生成される、実施形態１２４～１６２のいずれか１つに記載の方法。
１６４．前記３－ヒドロキシプロパナールが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現されるグリセロールデヒドラターゼ酵素による、グリセロールの脱水によって生成される、実施形態１２４～１６３のいずれか１つに記載の方法。
１６５．アジピン酸の生成方法であって、
ピルベート及び３－ヒドロキシプロパナールをヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼと接触させて、下記の式の２－ケトカルボン酸を生成させることと、
Figure 2022530467000065
（式中、Ｒが、ＣＨ２ＯＨである）
前記２－ケトカルボン酸を６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼと接触させて、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを生成させることと、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼと接触させて、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼと接触させて、６－ヒドロキシ－２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
前記６－ヒドロキシ－２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡを２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサノエートを生成させることと、
前記６－ヒドロキシヘキサノエートを６－ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼと接触させて、６－オキソヘキサノエートを生成させることと、
前記６－オキソヘキサノエートを６－オキソヘキサノエートオキシダーゼと接触させて、前記アジピン酸を生成させることと、
を含み、
天然に存在しない１つ以上の微生物を含む培養液において行う前記方法。
１６６．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼ及び前記キノンオキシドレダクターゼが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって発現される、実施形態１６５に記載の方法。
１６７．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼ及び前記キノンオキシドレダクターゼのうちの少なくとも１つが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現される、実施形態１６５に記載の方法。
１６８．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現される、実施形態１６５に記載の方法。
１６９．前記キノンオキシドレダクターゼが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現される、実施形態１６５に記載の方法。
１７０．前記キノンオキシドレダクターゼが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって過剰発現される、実施形態１６５に記載の方法。
１７１．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ、前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼ、前記６－ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼ及び前記６－オキソヘキサノエートオキシダーゼが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって発現される、実施形態１６５～１７０のいずれか１つに記載の方法。
１７２．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ、前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼ、前記６－ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼ及び前記６－オキソヘキサノエートオキシダーゼが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現される、実施形態１６５～１７０のいずれか１つに記載の方法。
１７３．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ、前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼ、前記６－ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼ及び前記６－オキソヘキサノエートオキシダーゼのうちの１つ以上が、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって過剰発現される、実施形態１６５～１７０のいずれか１つに記載の方法。
１７４．前記アジピン酸を、前記天然に存在しない１つ以上の微生物、または前記天然に存在しない１つ以上の微生物を含む培養液から分離することをさらに含む、実施形態１６５～１７３のいずれか１つに記載の方法。
１７５．アジピン酸の生成方法であって、
ピルベート及び３－ヒドロキシプロパナールをヒドラターゼ－アルドラーゼ及びキノンオキシドレダクターゼと接触させて、下記の式の２－ケトカルボン酸を生成させることと、
Figure 2022530467000066
（式中、Ｒが、ＣＨ２ＯＨである）
前記２－ケトカルボン酸を６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼと接触させて、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを生成させることと、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼと接触させて、２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼと接触させて、６－ヒドロキシ－２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
前記６－ヒドロキシ－２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡを２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを生成させることと、
前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼと接触させて、６－ヒドロキシヘキサノエートを生成させることと、
前記６－ヒドロキシヘキサノエートを６－ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼと接触させて、６－オキソヘキサノエートを生成させることと、
前記６－オキソヘキサノエートを６－オキソヘキサノエートオキシダーゼと接触させて、前記アジピン酸を生成させることと、
を含み、
天然に存在しない２つ以上の微生物を含む培養液において行う前記方法。
１７６．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼ及び前記キノンオキシドレダクターゼが、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって発現される、実施形態１７５に記載の方法。
１７７．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼ及び前記キノンオキシドレダクターゼのうちの少なくとも１つが、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって外因性に発現される、実施形態１７５に記載の方法。
１７８．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼが、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって外因性に発現される、実施形態１７５に記載の方法。
１７９．前記キノンオキシドレダクターゼが、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって外因性に発現される、実施形態１７５に記載の方法。
１８０．前記キノンオキシドレダクターゼが、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって過剰発現される、実施形態１７５に記載の方法。
１８１．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ、前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼ、前記６－ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼ及び前記６－オキソヘキサノエートオキシダーゼが、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって発現される、実施形態１７５～１８０のいずれか１つに記載の方法。
１８２．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ、前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼ、前記６－ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼ及び前記６－オキソヘキサノエートオキシダーゼが、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって外因性に発現される、実施形態１７５～１８０のいずれか１つに記載の方法。
１８３．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ、前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼ、前記６－ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼ及び前記６－オキソヘキサノエートオキシダーゼのうちの１つ以上が、前記天然に存在しない２つ以上の微生物によって過剰発現される、実施形態１７５～１８０のいずれか１つに記載の方法。
１８４．前記アジピン酸を、前記天然に存在しない２つ以上の微生物、または前記天然に存在しない２つ以上の微生物を含む培養液から分離することをさらに含む、実施形態１７５～１８３のいずれか１つに記載の方法。
１８５．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼが、ＥＣ番号４．１．２．４５またはＥＣ番号４．１．２．３４またはＥＣ番号４．１．１．４である酵素である、実施形態１６５～１８４のいずれか１つに記載の方法。
１８６．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼが、ＧｅｎＢａｎｋ、ＲｅｆＳｅｑまたはＵｎｉｐｒｏｔのＩＤ番号Ｄ７Ｃ０Ｅ５、Ｐ０Ａ１４４、Ｑ７９ＥＭ８、Ａ０Ａ０Ｎ０ＡＨＩ８、Ａ０Ａ０Ｎ１ＦＲＹ３、Ｍ３ＤＹＲ１、Ｗ７ＳＵ４８、Ａ０Ａ２８６ＰＨ１８、Ｑ９Ｘ９Ｑ６、Ｑ９ＷＸＨ７、Ａ４ＸＤＳ１、Ｆ２Ｊ６Ｎ９、Ａ０Ａ０６３ＢＦＬ５、Ｑ９ＺＨＨ６、Ａ０Ａ０Ｃ１Ｋ８５３、ＷＰ＿０３４３９８４８２、ＰＹＫ１２１９１、ＷＰ＿１１５４７８０３３、ＷＰ＿０２８２２２２５３、ＷＰ＿０１３６５４８０７、ＷＰ＿０５９４０３０６０、ＷＰ＿０９２５０８５３０、ＷＰ＿１１６６４２６２７、ＷＰ＿００９７７０６５９、ＷＰ＿１０７８１８１９１、ＷＰ＿００３２９２０６１、ＰＹＮ４８８５５、ＷＰ＿１２２２１２９６５、ＷＰ＿０２８２１７２９７、ＷＰ＿０３４５０７０４９、ＫＭＫ６４０８１．１、ＷＰ＿０７００２８０４１．１またはＫＺＬ９２４４９．１で識別される酵素の群から選択した酵素である、実施形態１６５～１８４のいずれか１つに記載の方法。
１８７．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号８４、配列番号８５または配列番号８６の配列を含む酵素である、実施形態１６５～１８４のいずれか１つに記載の方法。
１８８．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼにおいて、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号８４、配列番号８５または配列番号８６の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも５０％である、実施形態１６５～１８４のいずれか１つに記載の方法。
１８９．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼにおいて、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号８４、配列番号８５または配列番号８６の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも７０％である、実施形態１６５～１８４のいずれか１つに記載の方法。
１９０．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼにおいて、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号８４、配列番号８５または配列番号８６の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも９０％である、実施形態１６５～１８４のいずれか１つに記載の方法。
１９１．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼが、表１及び５～８から選択した酵素である、実施形態１６５～１８４のいずれか１つに記載の方法。
１９２．前記キノンオキシドレダクターゼが、ＥＣ番号１．６．５（例えばＥＣ１．６．５．５）である酵素である、実施形態１６５～１９１のいずれか１つに記載の方法。
１９３．前記キノンオキシドレダクターゼが、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７の配列を含む酵素である、実施形態１６５～１９１のいずれか１つに記載の方法。
１９４．前記キノンオキシドレダクターゼにおいて、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも５０％である、実施形態１６５～１９１のいずれか１つに記載の方法。
１９５．前記キノンオキシドレダクターゼにおいて、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも７０％である、実施形態１６５～１９１のいずれか１つに記載の方法。
１９６．前記キノンオキシドレダクターゼにおいて、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも９０％である、実施形態１６５～１９１のいずれか１つに記載の方法。
１９７．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼが、ＥＣ番号１．１．９９．６、ＥＣ番号１．１．１．１６９、ＥＣ番号１．１．１．２１５、ＥＣ番号１．１．１．２８またはＥＣ番号１．１．１．１１０である酵素であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼが、ＥＣ番号２．８．３、ＥＣ番号２．８．３．１またはＥＣ番号２．８．３．１２である酵素であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼが、ＥＣ番号４．２．１．１６７である酵素であり、
前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼが、ＥＣ番号１．３．１．４４である酵素であり、
前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼが、ＥＣ番号２．８．３、ＥＣ番号２．８．３．１またはＥＣ番号２．８．３．１２である酵素であり、
前記６－ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼが、ＥＣ番号１．１．１．２５８である酵素であり、
前記６－オキソヘキサノエートオキシダーゼが、ＥＣ番号１．２．１．６３である酵素である、実施形態１６５～１８４のいずれか１つに記載の方法。
１９８．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼが、配列番号５３、配列番号５４、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４または配列番号１０５の配列を含む酵素であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼが、配列番号５５または配列番号５８の配列を含む酵素であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼが、配列番号５９、配列番号６１及び配列番号６３、または配列番号６０、配列番号６２及び配列番号６４の配列を含む酵素であり、
前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼが、配列番号６５の配列を含む酵素であり、
前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼが、配列番号５５または配列番号５８の配列を含む酵素であり、
前記６－ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼが、配列番号７１または配列番号７２の配列を含む酵素であり、
前記６－オキソヘキサノエートオキシダーゼが、配列番号７５の配列を含む酵素である、実施形態１６５～１８４のいずれか１つに記載の方法。
１９９．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼにおいて、配列番号５３、配列番号５４、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４または配列番号１０５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも５０％であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼにおいて、配列番号５５または配列番号５８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも５０％であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼにおいて、配列番号５９、配列番号６１及び配列番号６３、または配列番号６０、配列番号６２及び配列番号６４の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも５０％であり、
前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼにおいて、配列番号６５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも５０％であり、
前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼにおいて、配列番号５５または配列番号５８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも５０％であり、
前記６－ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼにおいて、配列番号７１または配列番号７２の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも５０％であり、
前記６－オキソヘキサノエートオキシダーゼにおいて、配列番号７５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも５０％である、実施形態１６５～１８４のいずれか１つに記載の方法。
２００．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼにおいて、配列番号５３、配列番号５４、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４または配列番号１０５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも７０％であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼにおいて、配列番号５５または配列番号５８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも７０％であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼにおいて、配列番号５９、配列番号６１及び配列番号６３、または配列番号６０、配列番号６２及び配列番号６４の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも７０％であり、
前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼにおいて、配列番号６５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも７０％であり、
前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼにおいて、配列番号５５または配列番号５８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも７０％であり、
前記６－ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼにおいて、配列番号７１または配列番号７２の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも７０％であり、
前記６－オキソヘキサノエートオキシダーゼにおいて、配列番号７５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも７０％である、実施形態１６５～１８４のいずれか１つに記載の方法。
２０１．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼにおいて、配列番号５３、配列番号５４、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４または配列番号１０５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも９０％であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼにおいて、配列番号５５または配列番号５８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも９０％であり、
前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼにおいて、配列番号５９、配列番号６１及び配列番号６３、または配列番号６０、配列番号６２及び配列番号６４の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも９０％であり、
前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼにおいて、配列番号６５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも９０％であり、
前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼにおいて、配列番号５５または配列番号５８の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも９０％であり、
前記６－ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼにおいて、配列番号７１または配列番号７２の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも９０％であり、
前記６－オキソヘキサノエートオキシダーゼにおいて、配列番号７５の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも９０％である、実施形態１６５～１８４のいずれか１つに記載の方法。
２０２．前記６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート－２－レダクターゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノエートＣｏＡトランスフェラーゼ、前記２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ２－デヒドラターゼ、前記２，３－デヒドロヘキサノイルＣｏＡ２，３－レダクターゼ、前記６－ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡトランスフェラーゼ、前記６－ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼ及び前記６－オキソヘキサノエートオキシダーゼのうちの１つ以上がさらに、タンパク質タグを１つ以上含む、実施形態１６５～２０１のいずれか１つに記載の方法。
２０３．前記タンパク質タグが、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ（グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグ）、ＨＡタグ（ヘマグルチニンタグ）、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、マルトース結合タンパク質タグ、キチン結合タンパク質タグ及び蛍光タグから選択されている、実施形態２０２に記載の方法。
２０４．前記ピルベートが、グリセロール、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、スクロース及びデンプンまたはこれらを組み合わせたものから選択した炭素源から生成される、実施形態１６５～２０３のいずれか１つに記載の方法。
２０５．前記３－ヒドロキシプロパナールが、前記天然に存在しない１つ以上の微生物によって外因性に発現されるグリセロールデヒドラターゼ酵素による、グリセロールの脱水によって生成される、実施形態１６５～２０４のいずれか１つに記載の方法。
２０６．アルドラーゼヒドラターゼ酵素をコードする第１の外因性核酸を含む組み換え微生物であって、さらに、キノンオキシドレダクターゼを、野生型または改変されていない同じ微生物よりも多い量で発現するように改変されており、任意に、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、クロストリジウム種またはＥ．ｃｏｌｉである前記組み換え微生物。
２０７．キノンオキシドレダクターゼをコードする第２の外因性核酸を含む、実施形態２０６に記載の組み換え微生物。
２０８．前記第１及び／または前記第２の外因性核酸がさらに、前記第２の外因性核酸の発現を駆動する調節エレメントを含む、実施形態２０７に記載の組み換え微生物。
２０９．前記調節エレメントが、プロモーターまたはエンハンサーから選択されている、実施形態２０８に記載の組み換え微生物。
２１０．前記アルドラーゼヒドラターゼ酵素が、ＥＣ番号４．１．２．４５またはＥＣ番号４．１．２．３４またはＥＣ番号４．１．１．４である、実施形態２０６～２０９のいずれか１つに記載の組み換え微生物。
２１１．前記アルドラーゼヒドラターゼ酵素が、ＧｅｎＢａｎｋまたはＲｅｆＳｅｑまたはＵｎｉｐｒｏｔのＩＤ番号、Ｄ７Ｃ０Ｅ５、Ｐ０Ａ１４４、Ｑ７９ＥＭ８、Ａ０Ａ０Ｎ０ＡＨＩ８、Ａ０Ａ０Ｎ１ＦＲＹ３、Ｍ３ＤＹＲ１、Ｗ７ＳＵ４８、Ａ０Ａ２８６ＰＨ１８、Ｑ９Ｘ９Ｑ６、Ｑ９ＷＸＨ７、Ａ４ＸＤＳ１、Ｆ２Ｊ６Ｎ９、Ａ０Ａ０６３ＢＦＬ５、Ｑ９ＺＨＨ６、Ａ０Ａ０Ｃ１Ｋ８５３、ＷＰ＿０３４３９８４８２、ＰＹＫ１２１９１、ＷＰ＿１１５４７８０３３、ＷＰ＿０２８２２２２５３、ＷＰ＿０１３６５４８０７、ＷＰ＿０５９４０３０６０、ＷＰ＿０９２５０８５３０、ＷＰ＿１１６６４２６２７、ＷＰ＿００９７７０６５９、ＷＰ＿１０７８１８１９１、ＷＰ＿００３２９２０６１、ＰＹＮ４８８５５、ＷＰ＿１２２２１２９６５、ＷＰ＿０２８２１７２９７、ＷＰ＿０３４５０７０４９、ＫＭＫ６４０８１．１、ＷＰ＿０７００２８０４１．１またはＫＺＬ９２４４９．１で識別される酵素の群から選択した酵素である、実施形態２０６～２０９のいずれか１つに記載の組み換え微生物。
２１２．前記アルドラーゼヒドラターゼ酵素が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号８４、配列番号８５または配列番号８６の配列を含む酵素である、実施形態２０６～２０９のいずれか１つに記載の組み換え微生物。
２１３．前記アルドラーゼヒドラターゼ酵素において、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号８４、配列番号８５または配列番号８６の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも５０％である、実施形態２０６～２０９のいずれか１つに記載の組み換え微生物。
２１４．前記アルドラーゼヒドラターゼ酵素において、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号８４、配列番号８５または配列番号８６の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも７０％である、実施形態２０６～２０９のいずれか１つに記載の組み換え微生物。
２１５．前記アルドラーゼヒドラターゼ酵素において、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号８４、配列番号８５または配列番号８６の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも９０％である、実施形態２０６～２０９のいずれか１つに記載の組み換え微生物。
２１６．前記アルドラーゼヒドラターゼ酵素が、表１、５～８から選択した酵素である、実施形態２０６～２０９のいずれか１つに記載の組み換え微生物。
２１７．前記第１の外因性核酸及び前記第２の外因性核酸がそれぞれ、ベクターに含まれている、実施形態２０６～２１６のいずれか１つに記載の組み換え微生物。
２１８．前記第１の外因性核酸及び前記第２の外因性核酸がそれぞれ、同じベクターに含まれている、実施形態２１７に記載の組み換え微生物。
２１９．前記第１の外因性核酸及び前記第２の外因性核酸がそれぞれ、特有の別々のベクターに含まれている、実施形態２１８に記載の組み換え微生物。
２２０．前記ベクターが、プラスミドである、実施形態２１７～２１９のいずれか１つに記載の組み換え微生物。
２２１．前記キノンオキシドレダクターゼが、ＥＣ番号１．６．５（例えばＥＣ１．６．５．５）である酵素である、実施形態２０６～２２０のいずれか１つに記載の組み換え微生物。
２２２．前記キノンオキシドレダクターゼが、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７の配列を含む酵素である、実施形態２０６～２２０のいずれか１つに記載の組み換え微生物。
２２３．前記キノンオキシドレダクターゼにおいて、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも５０％である、実施形態２０６～２２０のいずれか１つに記載の組み換え微生物。
２２４．前記キノンオキシドレダクターゼにおいて、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも７０％である、実施形態２０６～２２０のいずれか１つに記載の組み換え微生物。
２２５．前記キノンオキシドレダクターゼにおいて、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７の配列を含む酵素との同一性が、少なくとも９０％である、実施形態２０６～２２０のいずれか１つに記載の組み換え微生物。
２２６．前記ヒドラターゼ－アルドラーゼ酵素及び前記キノンオキシドレダクターゼのうちの１つ以上がさらに、タンパク質タグを１つ以上含む、実施形態２０６～２２０のいずれか１つに記載の組み換え微生物。
２２７．前記タンパク質タグが、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ（グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグ）、ＨＡタグ（ヘマグルチニンタグ）、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、マルトース結合タンパク質タグ、キチン結合タンパク質タグ及び蛍光タグから選択されている、実施形態２２６に記載の組み換え微生物。
２２８．前記組み換え微生物が、下記の式の２－ケトカルボン酸を産生でき、
Figure 2022530467000067
式中、Ｒが、Ｈ、ＣＨ３またはＣＨ２ＯＨである、実施形態２０６～２２７のいずれか１つに記載の組み換え微生物。
２２９．前記組み換え微生物が、１，５－ペンタンジオール、１，６－ヘキサンジオール、アジピン酸または６－ヒドロキシヘキサノエートを産生できる、実施形態２０６～２２８のいずれか１つに記載の組み換え微生物。
２３０．前記組み換え微生物が、炭素源からのピルベートの生成を向上させるように、遺伝子が改変されている、実施形態２０６～２２９のいずれか１つに記載の組み換え微生物。
２３１．前記炭素源が、グリセロール、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、スクロース及びデンプンまたはこれらを組み合わせたものから選択されている、実施形態２３０に記載の組み換え微生物。
２３２．実施形態２０６～２３１のいずれか１つに記載の組み換え微生物の集団。
２３３．実質的に均質である、実施形態２３２に記載の集団。
２３４．１，５－ペンタンジオール、１，６－ヘキサンジオール、アジピン酸または６－ヒドロキシヘキサノエートの生成方法であって、実施形態２３２または実施形態２３３に記載の集団を適切な条件下で培養することを含む前記方法。
２３５．前記１，５－ペンタンジオール、１，６－ヘキサンジオール、アジピン酸または６－ヒドロキシヘキサノエートを前記培養液または前記微生物から単離することをさらに含む、実施形態２３４に記載の方法。
２３６．実施形態２０６～２３１のいずれか１つに記載の組み換え微生物を含む培養液。
２３７．実施形態２３２または実施形態２３３に記載の集団を含む培養液。
２３８．ピルベート及びアルデヒドをアルドール生成物生合成ポリペプチドと接触させて、アルドール生成物を生成させるようにすることを含む方法であって、
前記アルドール生成物が、アルデヒド基またはケトン基と、アルデヒド基またはケトンカルボニル基のβ－炭素に結合したヒドロキシル基を含む化合物である前記方法。
２３９．前記アルデヒドの－ＣＨＯ基が、二重結合、三重結合または芳香族基に共役していない、実施形態２３８に記載の方法。
２４０．ピルベート及び脂肪族アルデヒドをアルドール生成物生合成ポリペプチドと接触させて、アルドール生成物を生成させるようにすることを含む方法であって、
前記脂肪族アルデヒドのカルボニル基が、アルケニル基、アルキニル基または芳香族基に共役しておらず、
前記アルドール生成物が、アルデヒド基またはケトン基と、アルデヒド基またはケトンカルボニル基のβ－炭素に結合したヒドロキシル基を含む化合物である前記方法。
２４１．前記アルドール生成物生合成ポリペプチドが、アルドラーゼであるか、またはアルドラーゼを含む、実施形態２３８～２４０のいずれか１つに記載の方法。
２４２．前記アルドール生成物生合成ポリペプチドが、微生物内にある、実施形態２３８～２４１のいずれか１つに記載の方法。
２４３．前記微生物が、前記アルドール生成物生合成ポリペプチドをコードする外因性核酸を含むように操作されている、実施形態２４２に記載の方法。
２４４．前記微生物が、調節されたレベルの前記アルドール生成物生合成ポリペプチドを発現する、実施形態２４２～２４３のいずれか１つに記載の方法。
２４５．前記微生物が、操作されたアルドール生成物生合成ポリペプチドを発現する、実施形態２４２～２４４のいずれか１つに記載の方法。
２４６．前記ピルベート及び脂肪族アルデヒドのアルドール生成物への変換が、前記アルドール生成物生合成ポリペプチドによって触媒される、実施形態２３８～２４５のいずれか１つに記載の方法。
２４７．培養液において行う、実施形態２３８～２４６のいずれか１つに記載の方法。
２４８．前記アルドール生成物をアルドール脱水生成物に変換することを含み、前記アルドール脱水生成物が、アルデヒド基またはケトン基と、前記アルデヒド基またはケトン基と共役した二重結合を含む化合物である、実施形態２３８～２４７のいずれか１つに記載の方法。
２４９．前記変換が、前記アルドール生成物を脱水生成物生合成ポリペプチドと接触させて、前記アルドール脱水生成物を生成させるようにすることを含む、実施形態２４８に記載の方法。
２５０．前記脱水生成物生合成ポリペプチドが、微生物内にある、実施形態２４８～２４９のいずれか１つに記載の方法。
２５１．前記微生物が、前記脱水生成物生合成ポリペプチドをコードする外因性核酸を含むように操作されている、実施形態２５０に記載の方法。
２５２．前記微生物が、調節されたレベルの前記脱水生成物生合成ポリペプチドを発現する、実施形態２５０～２５１のいずれか１つに記載の方法。
２５３．前記微生物が、操作された脱水生成物生合成ポリペプチドを発現する、実施形態２５０～２５２のいずれか１つに記載の方法。
２５４．前記アルドール生成物のアルドール脱水生成物への変換が、前記脱水生成物生合成ポリペプチドによって触媒される、実施形態２４８～２５３のいずれか１つに記載の方法。
２５５．培養液において行う、実施形態２４８～２５４のいずれか１つに記載の方法。
２５６．前記脱水生成物生合成ポリペプチドが、デヒドラターゼである、実施形態２４９に記載の方法。
２５７．ピルベート及びアルデヒドをアルドール脱水生成物生合成ポリペプチドと接触させて、アルドール脱水生成物を生成させるようにすることを含む方法であって、
前記アルドール脱水生成物が、アルデヒド基またはケトン基と、前記アルデヒド基またはケトン基と共役した二重結合を含む化合物である前記方法。
２５８．前記アルデヒドの－ＣＨＯ基が、二重結合、三重結合または芳香族基に共役していない、実施形態２５７に記載の方法。
２５９．ピルベート及び脂肪族アルデヒドをアルドール脱水生成物生合成ポリペプチドと接触させて、アルドール脱水生成物を生成させるようにすることを含む方法であって、
前記脂肪族アルデヒドのカルボニル基が、アルケニル基、アルキニル基または芳香族基に共役しておらず、
前記アルドール脱水生成物が、アルデヒド基またはケトン基と、前記アルデヒド基またはケトン基と共役した二重結合を含む化合物である前記方法。
２６０．前記アルドール脱水生成物生合成ポリペプチドが、ヒドラターゼ－アルドラーゼであるか、またはヒドラターゼ－アルドラーゼを含む、実施形態２５７～２５９のいずれか１つに記載の方法。
２６１．前記ピルベート及び前記脂肪族アルデヒドをヒドラターゼ－アルドラーゼと接触させることによって、前記アルドール脱水生成物を生成させる、実施形態２６０に記載の方法。
２６２．前記アルドール脱水生成物生合成ポリペプチドが、ＥＣ番号４．１．２．４５もしくはＥＣ番号４．１．２．３４もしくはＥＣ４．１．１．４である酵素、または表１及び５～８から選択した酵素であるか、前記酵素を含む、実施形態２５７～２５９のいずれか１つに記載の方法。
２６３．前記アルドール脱水生成物生合成ポリペプチドが、実施形態２６２に記載の酵素と１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９５％、９９％またはそれ以上の相同性を共有するポリペプチドであるか、または前記ポリペプチドを含む、実施形態２５７～２５９のいずれか１つに記載の方法。
２６４．前記アルドール脱水生成物生合成ポリペプチドが、アルドラーゼであるか、またはアルドラーゼを含む、実施形態２５７～２５９のいずれか１つに記載の方法。
２６５．前記アルドール脱水生成物生合成ポリペプチドが、微生物内にある、実施形態２５７～２６４のいずれか１つに記載の方法。
２６６．前記微生物が、前記アルドール脱水生成物生合成ポリペプチドをコードする外因性核酸を含むように操作されている、実施形態２６５に記載の方法。
２６７．前記微生物が、調節されたレベルの前記アルドール脱水生成物生合成ポリペプチドを発現する、実施形態２６５～２６６のいずれか１つに記載の方法。
２６８．前記微生物が、操作されたアルドール脱水生成物生合成ポリペプチドを発現する、実施形態２６５～２６７のいずれか１つに記載の方法。
２６９．前記ピルベート及び脂肪族アルデヒドのアルドール脱水生成物への変換が、前記アルドール脱水生成物生合成ポリペプチドによって触媒される、実施形態２５７～２６８のいずれか１つに記載の方法。
２７０．培養液において行う、実施形態２５７～２６９のいずれか１つに記載の方法。
２７１．アルケンをアルケン還元生成物生合成ポリペプチドと接触させて、アルケン還元生成物を生成させるようにすることを含む方法であって、
前記アルケンが、カルボニル基に共役した二重結合を含み、
前記アルケンにおける、前記カルボニル基に共役した二重結合を還元して単結合にして、アルケン還元生成物をもたらす前記方法。
２７２．前記アルケンが、実施形態２５７～２７０のいずれか１つに記載のアルドール脱水生成物である、実施形態２７１に記載の方法。
２７３．前記アルケン還元生成物生合成ポリペプチドが、２－オキソ－３－エン酸またはその塩の還元を触媒する酵素であるか、または前記酵素を含む、実施形態２７１～２７２のいずれか１つに記載の方法。
２７４．前記アルケン還元生成物生合成ポリペプチドが、ＥＣ１．６．５に属する酵素であるか、または前記酵素を含む、実施形態２７１～２７２のいずれか１つに記載の方法。
２７５．前記アルケン還元生成物生合成ポリペプチドが、ＥＣ１．６．５．５に属する酵素、または表９から選択した酵素であるか、前記酵素を含む、実施形態２７１～２７２のいずれか１つに記載の方法。
２７６．前記アルケン還元生成物生合成ポリペプチドが、実施形態２７４～２７５のいずれか１つに記載の酵素と１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９５％、９９％またはそれ以上の相同性を共有するポリペプチドであるか、または前記ポリペプチドを含む、実施形態２７１～２７２のいずれか１つに記載の方法。
２７７．前記アルケン還元生成物生合成ポリペプチドが、微生物内にある、実施形態２７１～２７６のいずれか１つに記載の方法。
２７８．前記微生物が、前記アルケン還元生成物生合成ポリペプチドをコードする外因性核酸を含むように操作されている、実施形態２７７に記載の方法。
２７９．前記微生物が、調節されたレベルの前記アルケン還元生成物生合成ポリペプチドを発現する、実施形態２７７～２７８のいずれか１つに記載の方法。
２８０．前記微生物が、操作されたアルケン還元生成物生合成ポリペプチドを発現する、実施形態２７７～２７９のいずれか１つに記載の方法。
２８１．前記アルケンのアルケン還元生成物への変換が、前記アルケン還元生成物生合成ポリペプチドによって触媒される、実施形態２７１～２８０のいずれか１つに記載の方法。
２８２．培養液において行う、実施形態２７１～２８１のいずれか１つに記載の方法。
２８３．実施形態２７１～２８２のいずれか１つに記載の方法を含む、実施形態２３８～２７０のいずれか１つに記載の方法。
２８４．前記アルデヒドが、下記の式Ａ－１の構造
Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－Ｃ（Ｏ）Ｈ
Ａ－１
またはその塩を有し、式中、
Ｒａが、Ｒ”または－ＯＲ”であり、
Ｌ１及びＬ２のそれぞれが独立して、共有結合であるか、または２価の任意に置換された直鎖もしくは分岐鎖のＣ１－２０脂肪族基もしくはＣ１－２０ヘテロ脂肪族基であり、そのメチレン単位の１つ以上が任意にかつ独立して、－Ｃ≡Ｃ－、－Ｃ（Ｒ”）２－、－Ｃｙ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｎ（Ｒ”）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（ＮＲ”）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）－、－Ｎ（Ｒ”）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）－、－Ｎ（Ｒ”）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ”）－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－によって置き換えられており、
－Ｃｙ－が、２価の任意に置換された３～２０員の単環、二環または多環であり、その各単環が独立して、ヘテロ原子を０～５個有する任意に置換されているか、飽和であるか、部分飽和であるか、または芳香族である３～２０員環であり、
各Ｒ”が独立して、－Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＣＯ２Ｒ’または－ＳＯ２Ｒ’であり、
Ｒ’が、水素であるか、またはＣ１－１０脂肪族基、ヘテロ原子を１～５個有するＣ１－１０ヘテロ脂肪族基、６～１０員のアリール環、ヘテロ原子を１～５個有する５～１０員のヘテロアリール環、及びヘテロ原子を１～５個有する３～１０員のヘテロ環から選択した任意に置換された基であるか、あるいは
２つ以上のＲ’基が、介在する原子と一体となって、ヘテロ原子を、前記介在する原子に加えて０～５個有する任意に置換された３～２０員の単環、二環または多環を形成し、その各単環が独立して、ヘテロ原子を０～５個有する任意に置換されているか、飽和であるか、部分飽和であるか、または芳香族である３～２０員環である、実施形態２３８～２８３のいずれか１つに記載の方法。
２８５．前記アルドール生成物が、下記の式Ｐ－１の構造
Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－Ｃ（Ｏ）ＯＨ
Ｐ－１
またはその塩を有し、式中、
Ｒａが、Ｒ”または－ＯＲ”であり、
Ｌ１及びＬ２のそれぞれが独立して、共有結合であるか、または２価の任意に置換された直鎖もしくは分岐鎖のＣ１－２０脂肪族基もしくはＣ１－２０ヘテロ脂肪族基であり、そのメチレン単位の１つ以上が任意にかつ独立して、－Ｃ≡Ｃ－、－Ｃ（Ｒ”）２－、－Ｃｙ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｎ（Ｒ”）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（ＮＲ”）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）－、－Ｎ（Ｒ”）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）－、－Ｎ（Ｒ”）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ”）－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－によって置き換えられており、
－Ｃｙ－が、２価の任意に置換された３～２０員の単環、二環または多環であり、その各単環が独立して、ヘテロ原子を０～５個有する任意に置換されているか、飽和であるか、部分飽和であるか、または芳香族である３～２０員環であり、
各Ｒ”が独立して、－Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＣＯ２Ｒ’または－ＳＯ２Ｒ’であり、
Ｒ’が、水素であるか、またはＣ１－１０脂肪族基、ヘテロ原子を１～５個有するＣ１－１０ヘテロ脂肪族基、６～１０員のアリール環、ヘテロ原子を１～５個有する５～１０員のヘテロアリール環、及びヘテロ原子を１～５個有する３～１０員のヘテロ環から選択した任意に置換された基であるか、あるいは
２つ以上のＲ’基が、介在する原子と一体となって、ヘテロ原子を、前記介在する原子に加えて０～５個有する任意に置換された３～２０員の単環、二環または多環を形成し、その各単環が独立して、ヘテロ原子を０～５個有する任意に置換されているか、飽和であるか、部分飽和であるか、または芳香族である３～２０員環である、実施形態２３８～２５６及び２８４のいずれか１つに記載の方法。
２８６．前記アルドール脱水生成物が、下記の式Ｐ－２の構造
Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ＝ＣＨ－Ｃ（Ｏ）－Ｃ（Ｏ）ＯＨ
Ｐ－２
またはその塩を有し、式中、
Ｒａが、Ｒ”または－ＯＲ”であり、
Ｌ１及びＬ２のそれぞれが独立して、共有結合であるか、または２価の任意に置換された直鎖もしくは分岐鎖のＣ１－２０脂肪族基もしくはＣ１－２０ヘテロ脂肪族基であり、そのメチレン単位の１つ以上が任意にかつ独立して、－Ｃ≡Ｃ－、－Ｃ（Ｒ”）２－、－Ｃｙ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｎ（Ｒ”）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（ＮＲ”）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）－、－Ｎ（Ｒ”）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）－、－Ｎ（Ｒ”）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ”）－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－によって置き換えられており、
－Ｃｙ－が、２価の任意に置換された３～２０員の単環、二環または多環であり、その各単環が独立して、ヘテロ原子を０～５個有する任意に置換されているか、飽和であるか、部分飽和であるか、または芳香族である３～２０員環であり、
各Ｒ”が独立して、－Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＣＯ２Ｒ’または－ＳＯ２Ｒ’であり、
Ｒ’が、水素であるか、またはＣ１－１０脂肪族基、ヘテロ原子を１～５個有するＣ１－１０ヘテロ脂肪族基、６～１０員のアリール環、ヘテロ原子を１～５個有する５～１０員のヘテロアリール環、及びヘテロ原子を１～５個有する３～１０員のヘテロ環から選択した任意に置換された基であるか、あるいは
２つ以上のＲ’基が、介在する原子と一体となって、ヘテロ原子を、前記介在する原子に加えて０～５個有する任意に置換された３～２０員の単環、二環または多環を形成し、その各単環が独立して、ヘテロ原子を０～５個有する任意に置換されているか、飽和であるか、部分飽和であるか、または芳香族である３～２０員環である、実施形態２５７～２８５のいずれか１つに記載の方法。
２８７．前記式中、－ＣＨ＝ＣＨ－がＥ体である、実施形態２８６に記載の方法。
２８８．前記式中、－ＣＨ＝ＣＨ－がＺ体である、実施形態２８６に記載の方法。
２８９．前記アルケン還元生成物が、下記の式Ｐ－３の構造
Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－Ｃ（Ｏ）ＯＨ
Ｐ－３
またはその塩を有し、式中、
前記Ｒａが、Ｒ”または－ＯＲ”であり、
Ｌ１及びＬ２のそれぞれが独立して、共有結合であるか、または２価の任意に置換された直鎖もしくは分岐鎖のＣ１－２０脂肪族基もしくはＣ１－２０ヘテロ脂肪族基であり、そのメチレン単位の１つ以上が任意にかつ独立して、－Ｃ≡Ｃ－、－Ｃ（Ｒ”）２－、－Ｃｙ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｎ（Ｒ”）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（ＮＲ”）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）－、－Ｎ（Ｒ”）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）－、－Ｎ（Ｒ”）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ”）－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－によって置き換えられており、
－Ｃｙ－が、２価の任意に置換された３～２０員の単環、二環または多環であり、その各単環が独立して、ヘテロ原子を０～５個有する任意に置換されているか、飽和であるか、部分飽和であるか、または芳香族である３～２０員環であり、
各Ｒ”が独立して、－Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＣＯ２Ｒ’または－ＳＯ２Ｒ’であり、
Ｒ’が、水素であるか、またはＣ１－１０脂肪族基、ヘテロ原子を１～５個有するＣ１－１０ヘテロ脂肪族基、６～１０員のアリール環、ヘテロ原子を１～５個有する５～１０員のヘテロアリール環、及びヘテロ原子を１～５個有する３～１０員のヘテロ環から選択した任意に置換された基であるか、あるいは
２つ以上のＲ’基が、介在する原子と一体となって、ヘテロ原子を、前記介在する原子に加えて０～５個有する任意に置換された３～２０員の単環、二環または多環を形成し、その各単環が独立して、ヘテロ原子を０～５個有する任意に置換されているか、飽和であるか、部分飽和であるか、または芳香族である３～２０員環である、実施形態２７１～２８８のいずれか１つに記載の方法。
２９０．前記アルケン還元生成物を下記の式Ｐ－１０の化合物
ＨＯ－Ｃ（Ｏ）－Ｌ２’－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－ＯＨ
Ｐ－１０
またはその塩に変換することを含む、実施形態２３８～２８４のいずれか１つに記載の方法。
２９１．前記アルケン還元生成物を下記の式Ｐ－１０’の化合物
Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＯＨ
Ｐ－１０’
またはその塩に変換することを含む、実施形態２３８～２８４のいずれか１つに記載の方法。
２９２．前記アルケン還元生成物をカルボニル還元生成物に変換することを含み、
前記アルケン還元生成物が、カルボニル基を含み、
前記アルケン還元生成物のカルボニル基が、－ＣＨ（ＯＨ）－に変換される、実施形態２３８～２９１のいずれか１つに記載の方法。
２９３．前記アルケン還元生成物をカルボニル還元生成物生合成ポリペプチドと接触させて、前記カルボニル還元生成物を生成させるようにすることを含み、
前記アルケン還元生成物が、カルボニル基を含み、
前記アルケン還元生成物のカルボニル基が、－ＣＨ（ＯＨ）－に変換される、実施形態２３８～２９１のいずれか１つに記載の方法。
２９４．前記カルボニル還元生成物生合成ポリペプチドが、ケトレダクターゼもしくは２－ケト酸－２－レダクターゼであるか、またはケトレダクターゼもしくは２－ケト酸－２－レダクターゼを含む、実施形態２９３に記載の方法。
２９５．前記カルボニル還元生成物生合成ポリペプチドが、微生物内にある、実施形態２９３～２９４のいずれか１つに記載の方法。
２９６．前記微生物が、前記カルボニル還元生成物生合成ポリペプチドをコードする外因性核酸を含むように操作されている、実施形態２９５に記載の方法。
２９７．前記微生物が、調節されたレベルの前記カルボニル還元生成物生合成ポリペプチドを発現する、実施形態２９５～２９６のいずれか１つに記載の方法。
２９８．前記微生物が、操作されたカルボニル還元生成物生合成ポリペプチドを発現する、実施形態２９５～２９７のいずれか１つに記載の方法。
２９９．前記アルケン還元生成物のカルボニル還元生成物への変換が、前記カルボニル還元生成物生合成ポリペプチドによって触媒される、実施形態２９０～２９８のいずれか１つに記載の方法。
３００．培養液において行う、実施形態２９０～２９９のいずれか１つに記載の方法。
３０１．前記カルボニル還元生成物が、下記の式Ｐ－４の構造
Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－Ｃ（Ｏ）ＯＨ
Ｐ－４
またはその塩を有し、式中、
Ｒａが、Ｒ”または－ＯＲ”であり、
Ｌ１及びＬ２のそれぞれが独立して、共有結合であるか、または２価の任意に置換された直鎖もしくは分岐鎖のＣ１－２０脂肪族基もしくはＣ１－２０ヘテロ脂肪族基であり、そのメチレン単位の１つ以上が任意にかつ独立して、－Ｃ≡Ｃ－、－Ｃ（Ｒ”）２－、－Ｃｙ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｎ（Ｒ”）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（ＮＲ”）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）－、－Ｎ（Ｒ”）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）－、－Ｎ（Ｒ”）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ”）－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－によって置き換えられており、
－Ｃｙ－が、２価の任意に置換された３～２０員の単環、二環または多環であり、その各単環は独立して、ヘテロ原子を０～５個有する任意に置換されているか、飽和であるか、部分飽和であるか、または芳香族である３～２０員環であり、
各Ｒ”が独立して、－Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＣＯ２Ｒ’または－ＳＯ２Ｒ’であり、
Ｒ’が、水素であるか、またはＣ１－１０脂肪族基、ヘテロ原子を１～５個有するＣ１－１０ヘテロ脂肪族基、６～１０員のアリール環、ヘテロ原子を１～５個有する５～１０員のヘテロアリール環、及びヘテロ原子を１～５個有する３～１０員のヘテロ環から選択した任意に置換された基であるか、あるいは
２つ以上のＲ’基が、介在する原子と一体となって、ヘテロ原子を、前記介在する原子に加えて０～５個有する任意に置換された３～２０員の単環、二環または多環を形成し、その各単環が独立して、ヘテロ原子を０～５個有する任意に置換されているか、飽和であるか、部分飽和であるか、または芳香族である３～２０員環である、実施形態２９０～３００のいずれか１つに記載の方法。
３０２．前記式Ｐ－４の化合物またはその塩を下記の式Ｐ－５の化合物
Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－Ｃ（Ｏ）－Ｓ－ＣｏＡ
Ｐ－５
またはその塩に変換することを含む、実施形態２３８～３０１のいずれか１つに記載の方法。
３０３．前記変換が、前記式Ｐ－４の化合物またはその塩をＣｏＡ転移生成物生合成ポリペプチドと接触させることを含む、実施形態３０２に記載の方法。
３０４．前記式Ｐ－５の化合物またはその塩を下記の式Ｐ－６の化合物
Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ－Ｃ（Ｏ）－Ｓ－ＣｏＡ
Ｐ－６
またはその塩に変換することを含む、実施形態２３８～３０３のいずれか１つに記載の方法。
３０５．前記変換が、前記式Ｐ－５の化合物またはその塩を脱水生成物生合成ポリペプチドと接触させることを含む、実施形態３０４に記載の方法。
３０６．前記式Ｐ－６の化合物またはその塩を下記の式Ｐ－７の化合物
Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－Ｓ－ＣｏＡ
Ｐ－７
またはその塩に変換することを含む、実施形態２３８～３０５のいずれか１つに記載の方法。
３０７．前記変換が、前記式Ｐ－６の化合物またはその塩を還元生成物生合成ポリペプチドとを接触させることを含み、前記還元生成物生合成ポリペプチドが、２，３－エノイルＣｏＡレダクターゼであるか、または２，３－エノイルＣｏＡレダクターゼを含む、実施形態３０６に記載の方法。
３０８．前記式Ｐ－７の化合物またはその塩を下記の式Ｐ－８の化合物
Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－ＯＨ
Ｐ－８
またはその塩に変換することを含む、実施形態２３８～３０７のいずれか１つに記載の方法。
３０９．前記変換が、前記式Ｐ－７の化合物またはその塩をＣｏＡ転移生成物生合成ポリペプチドと接触させることを含む、実施形態３０８に記載の方法。
３１０．前記方法が、前記式Ｐ－８の化合物であって、式中、Ｌ２が－ＣＨ２－Ｌ２’－である前記化合物またはその塩を下記の式Ｐ－９化合物
Ｈ－Ｃ（Ｏ）－Ｌ２’－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－ＯＨ
Ｐ－９
またはその塩に変換することを含み、式中、
Ｌ２’が、共有結合であるか、または２価の任意に置換された直鎖もしくは分岐鎖のＣ１－１９脂肪族基もしくはＣ１－１９ヘテロ脂肪族基であり、そのメチレン単位の１つ以上が任意にかつ独立して、－Ｃ≡Ｃ－、－Ｃ（Ｒ”）２－、－Ｃｙ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｎ（Ｒ”）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（ＮＲ”）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）－、－Ｎ（Ｒ”）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）－、－Ｎ（Ｒ”）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ”）－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－によって置き換えられている、実施形態２３８～３０９のいずれか１つに記載の方法。
３１１．前記変換が、前記式Ｐ－８の化合物またはその塩を酸化生成物生合成ポリペプチドと接触させることを含み、前記酸化生成物生合成ポリペプチドが、アルコールデヒドロゲナーゼであるか、またはアルコールデヒドロゲナーゼを含む、実施形態３１０に記載の方法。
３１２．前記式Ｐ－９の化合物またはその塩を下記の式Ｐ－１０の化合物
ＨＯ－Ｃ（Ｏ）－Ｌ２’－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－ＯＨ
Ｐ－１０
またはその塩に変換することを含む、実施形態２３８～３１１のいずれか１つに記載の方法。
３１３．前記変換が、前記式Ｐ－９の化合物またはその塩をアルデヒド酸化生成物生合成ポリペプチドと接触させることを含む、実施形態３１２に記載の方法。
３１４．前記式Ｐ－８の化合物またはその塩を下記の式Ｐ－９’の化合物
Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－Ｈ
Ｐ－９’
またはその塩に変換することを含む、実施形態２３８～３１２のいずれか１つに記載の方法。
３１５．前記式Ｐ－８の化合物またはその塩をカルボキシル還元生成物生合成ポリペプチドと接触させることを含む、実施形態３１４に記載の方法。
３１６．前記式Ｐ－９’の化合物またはその塩を下記の式Ｐ－１０’の化合物
Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＯＨ
Ｐ－１０’
またはその塩に変換することを含む、実施形態２３８～３１５のいずれか１つに記載の方法。
３１７．前記式Ｐ－９’の化合物またはその塩をアルデヒド還元生成物生合成ポリペプチドと接触させることを含み、前記アルデヒド還元生成物生合成ポリペプチドが、アルデヒドレダクターゼもしくは１級アルコールデヒドロゲナーゼであるか、またはアルデヒドレダクターゼもしくは１級アルコールデヒドロゲナーゼを含む、実施形態３１６に記載の方法。
３１８．前記式Ｐ－３の化合物またはその塩を下記の式Ｐ－５’の化合物
Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＯＨ
Ｐ－５’
またはその塩に変換することを含む、実施形態２３８～２９０のいずれか１つに記載の方法。
３１９．前記式Ｐ－３の化合物またはその塩を下記の式Ｐ－４’の化合物
Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－Ｈ
Ｐ－４’
またはその塩に変換することを含む、実施形態２３８～２９０または３１８のいずれか１つに記載の方法。
３２０．前記式Ｐ－３の化合物またはその塩を脱炭酸生成物生合成ポリペプチドと接触させることを含む、実施形態３１９に記載の方法。
３２１．前記式Ｐ－４’の化合物またはその塩を下記の式Ｐ－５’の化合物
Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＯＨ
Ｐ－５’
またはその塩に変換することを含む、実施形態２３８～２９０のいずれか１つに記載の方法。
３２２．前記式Ｐ－４’の化合物またはその塩をアルデヒド還元生成物生合成ポリペプチドと接触させることを含む、実施形態３２１に記載の方法。
３２３．前記変換のうちの１つ以上またはそれぞれが独立して、化合物を適切な生合成ポリペプチドと接触させることを含む、実施形態３０１～３２２のいずれか１つに記載の方法。
３２４．前記生合成ポリペプチドのうちの１つ以上またはすべてが独立して、微生物内にある、実施形態３２３に記載の方法。
３２５．前記微生物が、前記生合成ポリペプチドのうちの１つ以上またはすべてをコードする１つ以上の外因性核酸を含むように操作されている、実施形態３２４に記載の方法。
３２６．前記微生物が、前記生合成ポリペプチドのうちの１つ以上またはすべてを、調節されたレベルで発現する、実施形態３２４～３２５のいずれか１つに記載の方法。
３２７．前記生合成ポリペプチドのうちの１つ以上またはすべてが独立して、操作されている、実施形態３２４～３２６のいずれか１つに記載の方法。
３２８．適切な生合成ポリペプチドが、対応する変換を触媒する、実施形態３２４～３２６のいずれか１つに記載の方法。
３２９．前記式中、Ｒａが、－Ｈである、実施形態２８５～３２８のいずれか１つに記載の方法。
３３０．前記式中、Ｒａが、－ＯＨである、実施形態２８５～３２８のいずれか１つに記載の方法。
３３１．前記式中、Ｌ１が任意に、置換されたＣ１－６アルキレンである、実施形態２８５～３３０のいずれか１つに記載の方法。
３３２．前記式中、Ｌ１が、非置換のＣ１－６アルキレンである、実施形態２８５～３３０のいずれか１つに記載の方法。
３３３．前記アルキレンが、－ＣＨ２－である、実施形態３３１～３３２のいずれか１つに記載の方法。
３３４．前記アルキレンが、－ＣＨ２ＣＨ２－である、実施形態３３１～３３２のいずれか１つに記載の方法。
３３５．前記アルキレンが、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である、実施形態３３１～３３２のいずれか１つに記載の方法。
３３６．前記式中、Ｌ１が、共有結合である、実施形態２８５～３３０のいずれか１つに記載の方法。
３３７．前記式中、Ｌ２が、共有結合である、実施形態２８５～３３６のいずれか１つに記載の方法。
３３８．前記式中、Ｌ２が、任意に置換されたＣ１－６アルキレンである、実施形態２８５～３３６のいずれか１つに記載の方法。
３３９．前記式中、Ｌ２が、非置換のＣ１－６アルキレンである、実施形態２８５～３３６のいずれか１つに記載の方法。
３４０．前記アルキレンが、－ＣＨ２－である、実施形態３３８～３３９のいずれか１つに記載の方法。
３４１．前記アルキレンが、－ＣＨ２ＣＨ２－である、実施形態３３８～３３９のいずれか１つに記載の方法。
３４２．前記アルキレンが、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である、実施形態３３８～３３９のいずれか１つに記載の方法。
３４３．前記脂肪族アルデヒドが、ＨＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨＯである、実施形態２８４に記載の方法。
３４４．前記アルドール生成物が、ＨＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－ＣＯＯＨまたはその塩である、実施形態２８５または３４３に記載の方法。
３４５．前記アルドール脱水生成物が、ＨＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＯＯＨまたはその塩である、実施形態２８６及び３４３～３４４のいずれか１つに記載の方法。
３４６．前記アルケン還元生成物が、ＨＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－ＣＯＯＨまたはその塩である、実施形態２８９及び３４３～３４５のいずれか１つに記載の方法。
３４７．前記カルボニル還元生成物が、ＨＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＯＯＨまたはその塩である、実施形態３０１及び３４３～３４６のいずれか１つに記載の方法。
３４８．前記式Ｐ－５の化合物またはその塩が、ＨＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＯ－Ｓ－ＣｏＡまたはその塩である、実施形態３０２及び３４３～３４７のいずれか１つに記載の方法。
３４９．前記式Ｐ－６の前記化合物またはその塩が、ＨＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ－ＣＯ－Ｓ－ＣｏＡまたはその塩である、実施形態３０３及び３４３～３４８のいずれか１つに記載の方法。
３５０．前記式Ｐ－７の前記化合物またはその塩が、ＨＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯ－Ｓ－ＣｏＡまたはその塩である、実施形態３０５及び３４３～３４９のいずれか１つに記載の方法。
３５１．前記式Ｐ－８の化合物またはその塩が、ＨＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯ－ＯＨまたはその塩である、実施形態３０８及び３４３～３５０のいずれか１つに記載の方法。
３５２．前記式Ｐ－９の化合物またはその塩が、Ｈ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯ－ＯＨまたはその塩である、実施形態３１０及び３４３～３５１のいずれか１つに記載の方法。
３５３．前記式Ｐ－１０の化合物またはその塩が、ＨＯ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯ－ＯＨまたはその塩である、実施形態３１２及び３４３～３５２のいずれか１つに記載の方法。
３５４．前記式Ｐ－９’の化合物またはその塩が、ＨＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－Ｈまたはその塩である、実施形態３１０及び３４３～３５１のいずれか１つに記載の方法。
３５５．前記式Ｐ－１０’の化合物またはその塩が、ＨＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＯＨまたはその塩である、実施形態３１２、３４３～３５１及び３５４のいずれか１つに記載の方法。
３５６．前記式Ｐ－４’の化合物またはその塩が、ＨＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－Ｈまたはその塩である、実施形態３１７及び３４３～３４６のいずれか１つに記載の方法。
３５７．前記式Ｐ－５’の化合物またはその塩が、ＨＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＯＨまたはその塩である、実施形態３１７、３４３～３４６及び３５６のいずれか１つに記載の方法。
３５８．前記接触工程において、前記微生物が、前記生合成ポリペプチドを２つ以上含む、実施形態２３８～３５７のいずれか１つに記載の方法。
３５９．ある１つの種類の微生物において、接触工程及び／または変換工程を１回以上行い、別の種類の微生物において、別の接触工程及び／または変換工程を１回以上行うことを含む、実施形態２３８～３５８のいずれか１つに記載の方法。
３６０．ある１つの培養液において、接触工程及び／または変換工程を１回以上行い、別の培養液において、別の接触工程及び／または変換工程を１回以上行うことを含む、実施形態２３８～３５９のいずれか１つに記載の方法。
３６１．単一の培養液において、前記接触工程及び／または前記変換工程を行うことを含む、実施形態２３８～３５９のいずれか１つに記載の方法。
３６２．前記微生物が、前記接触工程で列挙されている前記生合成ポリペプチドをすべて含む、実施形態２３８～３６１のいずれか１つに記載の方法。
３６３．単一の培養液において、前記接触工程及び／または前記変換工程を行うことを含む、実施形態３６２に記載の方法。
３６４．前記生成物が、培養液において約または少なくとも約０．１ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ、０．３ｇ／Ｌ、０．４ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、０．６ｇ／Ｌ、０．７ｇ／Ｌ、０．８ｇ／Ｌ、０．９ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１６０ｇ／Ｌ、１７０ｇ／Ｌ、１８０ｇ／Ｌ、１９０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、２２０ｇ／Ｌ、２５０ｇ／Ｌまたは３００ｇ／Ｌで生成される、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３６５．所望の生成物を得るためのピルベートの利用率が、約または少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％である、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３６６．先行実施形態のいずれか１つに記載の方法によって調製した調製物。
３６７．前記式Ｐ－１、Ｐ－２、Ｐ－３、Ｐ－４、Ｐ－４’、Ｐ－５、Ｐ－５’、Ｐ－６、Ｐ－７、Ｐ－８、Ｐ－９、Ｐ－９’、Ｐ－１０もしくはＰ－１０’の化合物、またはその塩の調製物、あるいは先行実施形態のいずれか１つに記載の方法によって調製した調製物であって、前記調製物において、同位体１４Ｃが、前記化合物の参照調製物で観察される前記同位体と比べて濃縮されており、前記参照調製物が、化石炭素源を用いて調製したものである前記調製物。
３６８．ポリエステル、ポリエステルポリオール、ポリウレタン、ナイロン６、ナイロン６，６、ポリカーボネートジオール、ジアクリレートエステルまたはジグリシジルエーテルの調製物であって、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法によって調製した調製物を用いて製造したものである前記調製物。
３６９．前記調製物において、同位体１４Ｃが、前記化合物の参照調製物で観察される前記同位体と比べて濃縮されており、前記参照調製物が、化石炭素源を用いて調製したものである、実施形態３６８に記載の調製物。
３７０．先行実施形態のいずれか１つに記載の１つ以上の生合成ポリペプチドをコードする核酸。
３７１．前記と同じ生合成ポリペプチドをコードする天然の核酸とは異なる、実施形態３７０に記載の核酸。
３７２．微生物内での発現のために最適化されている、実施形態３７０または３７１に記載の核酸。
３７３．脂肪族アルデヒドのアルドール生成物を産生する操作微生物であって、前記微生物において、アルドール生成物生合成ポリペプチドの発現または活性が向上されており、
前記脂肪族アルデヒドのカルボニル基が、アルケニル基、アルキニル基または芳香族基に共役しておらず、
前記アルドール生成物が、アルデヒド基またはケトン基と、アルデヒド基またはケトンカルボニル基のβ－炭素に結合したヒドロキシル基を含む化合物である前記微生物。
３７４．前記脂肪族アルデヒドが、実施形態２３８～３６３のいずれか１つに記載のものである、実施形態３７３に記載の微生物。
３７５．前記アルドール生成物が、実施形態２３８～３６３のいずれか１つに記載のものである、実施形態３７３に記載の微生物。
３７６．脂肪族アルデヒドのアルドール脱水生成物を産生する操作微生物であって、前記微生物において、アルドール生成物生合成ポリペプチド、アルドール脱水生成物生合成ポリペプチド、脱水生成物生合成ポリペプチド、またはこれらをいずれかに組み合わせたものの発現または活性が向上されており、
前記脂肪族アルデヒドのカルボニル基が、アルケニル基、アルキニル基または芳香族基に共役しておらず、
前記アルドール脱水生成物が、アルデヒド基またはケトン基と、前記アルデヒド基またはケトン基と共役した二重結合を含む化合物である前記微生物。
３７７．前記脂肪族アルデヒドが、実施形態２３８～３６３のいずれか１つに記載のものである、実施形態３７６に記載の微生物。
３７８．前記アルドール脱水生成物が、実施形態２３８～３６３のいずれか１つに記載のものである、実施形態３７６に記載の微生物。
３７９．アルケン還元生成物を産生する操作微生物であって、前記微生物において、アルケン還元生成物生合成ポリペプチドの発現または活性が向上されており、
前記アルケンが、カルボニル基に共役した二重結合を含み、
前記アルケンにおける、前記カルボニル基に共役した二重結合を還元して単結合にして、前記アルケン還元生成物をもたらす前記微生物。
３８０．前記アルケンが、実施形態２７１～３６３のいずれか１つに記載のものである、実施形態３７９に記載の微生物。
３８１．前記アルケン還元生成物が、実施形態２３８～３６３のいずれか１つに記載のものである、実施形態３７９に記載の微生物。
３８２．さらに、実施形態２７１～３６３のいずれか１つに記載の生合成ポリペプチドの発現または活性が向上されている、実施形態３７３～３８１のいずれか１つに記載の微生物。
３８３．実施形態２３８～３８２のいずれか１つに記載の微生物と、独立して、前記式Ｐ－１～Ｐ－１０、Ｐ－９’、Ｐ－１０’、Ｐ－４’もしくはＰ－５’の化合物、またはその塩のうちの１つ以上を含む培養液。
３８４．生合成ポリペプチド（複数可）の発現または活性が向上されていない対応する微生物の参照培養液よりも、前記１つ以上の化合物のレベルが独立して高い、実施形態３８３に記載の培養液。
３８５．前記式Ｐ－１～Ｐ－１０、Ｐ－９’、Ｐ－１０’、Ｐ－４’もしくはＰ－５’の化合物、またはその塩のそれぞれが独立して、実施形態２３８～３６３のいずれか１つに記載されているようなものである、実施形態３８３～３８４のいずれか１つに記載の培養液。
３８６．前記実施形態に記載されているような方法、調製物、化合物、生物、微生物、培養液または生成物。
下記の実施例は、本開示の主題による方法及び結果を例示する目的で、以下に示されている。これらの実施例は、本発明で開示する主題の態様をすべて含むものとしては意図されておらず、むしろ、特定の代表的な方法及び結果を例示するものとして意図されている。これらの実施例は、本明細書に記載されている主題の均等物及び変形形態を除外するようには意図されておらず、その均等物及び変形形態は、当業者には明らかである。実施例全体を通じて、酵素またはタンパク質の配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤまたはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤもしくはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号として称されている）またはＲｅｆＳｅｑ ＩＤによって識別されている。Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤの場合には、配列は、プライマリー（引用可能な）アクセッション番号によって示されている。ＲｅｆＳｅｑのタンパク質の記録は、ＮＣＢＩデータベース内のノンリダンダントなタンパク質配列を表している。タンパク質のノンリダンダントな記録は、異なる株または異なる種において、１回または何度も観察されている１つの正確な配列を表している。
実施例１：脂肪族アルデヒドを用いたアルドール脱水生成物の生合成を触媒する酵素
トランス－ｏ－ヒドロキシベンジリデンピルベートヒドラターゼ－アルドラーゼ（ＥＣ４．１．２．４５）１－５または４－（２－カルボキシフェニル）－２－オキソブタ－３－エノエートアルドラーゼ（Ｅ．Ｃ．４．１．２．３４、トランス－２’－カルボキシベンザルピルベートヒドラターゼ－アルドラーゼともいう）６（これらは、本明細書では、ヒドラターゼ－アルドラーゼまたはＡｄｓ－Ｈｙｄと総称する）が、脂肪族アルデヒド１－６、特に、アルデヒド基の隣にいずれの不飽和基も持たない脂肪族アルデヒド５に対して、任意のアルドール付加活性またはアルドール縮合活性を有することは以前には示されていなかった。その代わりに、これらの酵素のアルドール縮合活性は以前には、アルデヒド基質に存在する不飽和基への共役を介して、新たに形成された不飽和基を安定化できる基質に限られていた１－５。このようなアルデヒド基質の例としては、ベンズアルデヒドまたはアルケナール（すなわち、Ｃ２とＣ３の間に二重結合を有する脂肪族アルデヒド）のような芳香族共役アルデヒドが挙げられる。いずれの理論にも拘束されることを意図しないが、これらのヒドラターゼ－アルドラーゼが、多くの脂肪族アルデヒド、例えば異なる炭素長及び異なる官能基の直鎖アルデヒドを基質として利用できるとともに、供与体（求核剤）としてのピルベートとともに、アルドール付加反応及びアルドール縮合反応の両方を起こすことを通じて、アルドール脱水生成物をもたらして、それぞれ、対応する４－ヒドロキシ－２－ケトカルボン酸及び３，４－デヒドロ－２－ケトカルボン酸を生成物として生じさせることができることが予想外にも発見された。代表的なトランス－ｏ－ヒドロキシベンジリデンピルベートヒドラターゼ－アルドラーゼ（例えば、表１の項目Ａｄｓ－Ｈｙｄ２及びＡｄｓ－Ｈｙｄ９）及びトランス－２’－カルボキシベンザルピルベートヒドラターゼ－アルドラーゼ（例えば、表１の項目Ａｄｓ－Ｈｙｄ３）のアルドール脱水活性（アルドール付加及びアルドール縮合の両方）に関する結果が、表１にまとめられており、その際には、ピルベートが供与体として使用されており、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド及び３－ヒドロキシプロパナールが受容体アルデヒドとして使用されている。
Figure 2022530467000068
Figure 2022530467000069
異なる炭素長及び異なる官能基の脂肪族非共役アルデヒドに対する、表１の酵素サブセットによるアルドール付加活性及びアルドール縮合活性が、表２にまとめられており、この反応に適する非共役アルデヒド基質の多様性がさらに示されている。
Figure 2022530467000070
とりわけ、本発明の技術は、例えば、生成物の生成速度、収量及び／または基質、例えばピルベートの利用率という点で、効率を高くする。いくつかの実施形態では、生合成ポリペプチドは、適切な条件下における、匹敵する生成物の生成量によって測定した場合、関連する参照生合成ポリペプチドと比べて、活性が約５０％、１００％、または１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍以上である。いくつかの実施形態では、本開示は、基質、例えばピルベートの利用効率を高くする。いくつかの実施形態では、基質、例えばピルベートの利用率は、約または少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％である。いくつかの実施形態では、培養液中の所望の生成物の濃度は、生成時間（例えば９０分）の経過後、約または少なくとも約０．１ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ、０．３ｇ／Ｌ、０．４ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、０．６ｇ／Ｌ、０．７ｇ／Ｌ、０．８ｇ／Ｌ、０．９ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌまたは１０ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、収量は、約もしくは少なくとも約１０ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、６０ｍｇ／Ｌ、７０ｍｇ／Ｌ、８０ｍｇ／Ｌ、９０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、１５０ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、２５０ｍｇ／Ｌ、３００ｍｇ／Ｌ、３５０ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、４５０ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、６００ｍｇ／Ｌ、７００ｍｇ／Ｌ、８００ｍｇ／Ｌ、９００ｍｇ／Ｌもしくは１０００ｍｇ／Ｌ、または約もしくは少なくとも約１．１ｇ／Ｌ、１．２ｇ／Ｌ、１．３ｇ／Ｌ、１．４ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、１．６ｇ／Ｌ、１．７ｇ／Ｌ、１．８ｇ／Ｌ、１．９ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、２．１ｇ／Ｌ、２．２ｇ／Ｌ、２．３ｇ／Ｌ、２．４ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、２．７ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１６０ｇ／Ｌ、１７０ｇ／Ｌ、１８０ｇ／Ｌ、１９０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、２２０ｇ／Ｌ、２５０ｇ／Ｌもしくは３００ｇ／Ｌである。例えば、表３には、対応する反応を触媒することが以前から知られているアルドラーゼと比べて、提供する技術が、効率を大幅に向上させることが示されており、表３における代表的なトランス－ｏ－ヒドロキシベンジリデンピルベートヒドラターゼ－アルドラーゼは、試験した基質に対するアルドール付加活性の点で、他のアルドラーゼよりも優れている（例えば、活性が５倍超である）。とりわけ、表４には、Ａｄｓ－Ｈｙｄ酵素が、比較用のアルドラーゼと比べて、生成物の収量を向上できるとともに、基質であるピルベートの使用効率を高くできることが示されている。ピルベートは、主要な代謝産物であり、微生物内の他の反応物によって消費される可能性があるので、このことは特に注目に値する。本明細書に示されているように、アルドール脱水生成物生合成ポリペプチドを含む提供技術は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、望ましくない反応によってピルベートが消費されるのを効果的に最小限に抑えることができ、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、所望の生成物の収量を向上させるには、このことが不可欠である。
Figure 2022530467000071
Figure 2022530467000072
いくつかのヒドラターゼ－アルドラーゼは、ＥＣ４．１．２．４５またはＥＣ４．１．２．３４に属するものとして分類されているが（表５を参照されたい）、表１に示されている大半の酵素配列、及び相同性検索によって特定された配列（ＢＬＡＳＴを使用。表６～８を参照されたい）には、ＥＣ番号は割り当てられていない。加えて、これらの酵素は、他のクラスの酵素との類似性により、文献またはデータベース（例えばＵｎｉｐｒｏｔ）において、アセトアセテートデカルボキシラーゼもしくはジヒドロジピコリネートシンセターゼとしても、または単にアルドラーゼとしてもアノテーションされていない。例えば、Ａｄｓ－Ｈｙｄ８酵素は、ヒドラターゼ－アルドラーゼとしてはアノテーションされておらず、ヒドラターゼ－アルドラーゼとして機能する場合には（表１を参照されたい）、アセトアセテートデカルボキシラーゼであるとしてアノテーションされている（この配列のＵｎｉｐｒｏｔページを参照されたい）。同様に、Ａｄｓ－Ｈｙｄ１１～１３の酵素は、ジヒドロジピコリネートシンセターゼとしてアノテーションされているが、ヒドラターゼ－アルドラーゼとして機能する（表１を参照されたい）。多くのヒドラターゼ－アルドラーゼ酵素の配列は、公共データベースにおいて、アセトアセテートデカルボキシラーゼまたはジヒドロジピコリネートシンセターゼまたはアルドラーゼに属するものとして、アノテーションもしくは推定されているか、またはアノテーションもしくは推定されることになり、ＥＣ４．１．２．４５またはＥＣ４．１．２．３４のいずれかに属するものと分類されないと予測される。したがって、ヒドラターゼ－アルドラーゼ酵素の配列を特定するために、ヒドラターゼ－アルドラーゼの配列に関して、相同性に基づく検索を行い、その後、本明細書に記載されている方法を用いて、得られた酵素の活性に関して検証した。（ａ）ＥＣ４．１．２．３４に属する配列の１つ（Ａｄｓ－Ｈｙｄ３、結果は表８）、（ｂ）ＥＣ４．１．２．３４及びＥＣ４．１．２．４５に属する酵素との相同性が非常に低く、番号未付与の酵素に属する配列の１つ（Ａｄｓ－Ｈｙｄ８、結果は表６）、ならびに（ｃ）番号未付与の酵素に属する配列の１つを用いて、相同性に基づく例示的な検索結果から、ＥＣ４．１．２．３４及びＥＣ４．１．２．４５に属する酵素との相同性が中程度である酵素（Ａｄｓ－Ｈｙｄ１０、結果は表７）が、５００個超であることが示されており、その一部は、下記の表に列挙されており、その多くでは、試験を行ったところ、アルドール付加活性及びアルドール縮合活性があることが確認された（表１のデータ）。例えば、表６で確認される１３個の配列（表６で下線の付された配列を参照されたい。それらの配列のデータは表１に記載されている）、及び表７で確認される１１個の配列（表７で下線の付された配列を参照されたい。それらの配列のデータは表１に記載されている）が、機能的なＡｄｓ－Ｈｙｄ酵素であることが確認された。とりわけ、本開示では、Ａｄｓ－Ｈｙｄ１１２（Ｅ．Ｃ４．１．１．４に属するものとして分類されており、アセトアセテートデカルボキシラーゼとしてアノテーションされている）も、多くの異なるアルデヒド（表２）によるアルドール付加反応及びアルドール縮合反応を触媒することが明らかになったことが示されている。いくつかの実施形態では、アセトアセテートデカルボキシラーゼとしてアノテーションされている酵素、及びＥ．Ｃ４．１．１．４に属する酵素も、アルドール縮合反応及びアルドール付加反応を触媒するのに有用である。ＥＣ４．１．２．３４に属するＡｄｓ－Ｈｙｄ３の酵素との同一性が３５％ほどの低い範囲である酵素（表１のＡｄｓ－Ｈｙｄ６８）、ＥＣ４．１．２．４５に属するＡｄｓ－Ｈｙｄ２の酵素との同一性が３８％ほどの低い範囲である酵素（表１のＡｄｓ－Ｈｙｄ３）、及びＡｄｓ－Ｈｙｄ８の酵素との４９％ほどの低い範囲である酵素（表１のＡｄｓ－Ｈｙｄ９３）に、ヒドラターゼ－アルドラーゼ活性があることが確認された。
Figure 2022530467000073
Figure 2022530467000074
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Figure 2022530467000093
Figure 2022530467000094
クローニング及び発現：非相同なアルドラーゼヒドラターゼ酵素をコードするＤＮＡのコドンを、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現用に最適化し、民間のＤＮＡ合成業者で合成を行った。標準的なクローニング方法を用いて、ｐＢ１１バックボーンプラスミドにおいて、各遺伝子をＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの下流及びＴ７ターミネーター配列の上流にクローニングした。加えて、選択したアルデヒドが３－ヒドロキシプロピオンアルデヒドである実験用に、Ｂ１２依存性酵素であるグリセロールデヒドラターゼ酵素（ｐｄｕＣ［Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ａ５ＶＭＢ２］、ｐｄｕＤ［Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ａ５ＶＭＢ１］、ｐｄｕＥ［Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ａ５ＶＭＢ０］、ｐｄｕＧ［Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ａ５ＶＭＡ９］及びｐｄｕＨ［Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ａ５ＶＭＡ８］という５つの遺伝子で構成されるＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉグリセロールデヒドラターゼ）も、第２の和合性プラスミドにクローニングして、この酵素を用いて、３－ヒドロキシプロピオンアルデヒドをグリセロールから生成できるようにした。これらのプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１＊（ＤＥ３）ΔｌｄｈＡにトランスフォーメーションした。１ｇ／ＬのＤ－グルコース及び適切な抗生物質とともに、５ｍＬの２×ＹＴ培地の入ったチューブで、各クローンの種母培養液を一晩成長させた。９６ウェルプレート内の成長培地２ｍＬで、発現のための細胞培養を行った。複合（２×ＹＴ）成長培地を使用し、２ｇ／ＬのＤ－グルコース、０．５ｇ／Ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）及び１００ｍｇ／Ｌのクエン酸鉄アンモニウムを添加した。誘導前の成長を２時間、好気性条件下、３０℃で行った。０．２～０．４のＯＤ６００で、２５０μＭのＩＰＴＧとともに、組み換えタンパク質の発現を誘導した。誘導後の発現を３０～１８０分、３０℃及び好気性条件下で行った後、０～６０分、嫌気性条件下で行った。
酵素アッセイ：発現後、細胞を回収し、反応用の基質とともに、１５ｇ／Ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を含む新鮮な培地０．４ｍＬ（ＯＤ６００：約３０）に再懸濁させた。活性を求めるために、ピルベート（１０～２０ｇ／Ｌ）を５～４０ｇ／Ｌのアルデヒド（例えば、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、２－ヒドロキシアセトアルデヒドまたは４－ヒドロキシブチルアルデヒド）と１２時間、好気的にインキュベートした。３－ヒドロキシプロパナールによって活性を求めるために、発現後の細胞を回収し、１０～２０ｇ／Ｌのグルコース、５～１０ｇ／Ｌのグリセロール及び１０ｇ／Ｌのピルベートとともに、１５ｇ／Ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を含む新鮮な培地０．４ｍＬ（ＯＤ６００：約３０）に、１５時間、嫌気性条件下で再懸濁させた。その反応混合物には、１０μＭのビタミンＢ１２及び１ｇ／Ｌのグルタチオンも添加した。室温でインキュベート後、細胞を遠心分離し、その上清をろ過し、ＨＰＬＣによって解析した。
生成物の解析：アイソクラティックＨＰＬＣを主に用いて、酵素生成物、アルドール付加生成物（４－ヒドロキシ－２－ケトカルボン酸）、アルドール縮合生成物（３，４－デヒドロ－２－ケトカルボン酸）の生成を検出及び定量した。ある１つの方法では、Ｂｉｏ－ＲａｄのＡｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７カラムと、０．７ｍＬ／分の０．０５％のギ酸（または５ｍＭの硫酸）を３５℃で用いた。検出は、ＲＩＤ（屈折率検出器）及びＵＶ検出器を用いて行い、ＵＶ検出器は、２１０ｎｍ及び２６０ｎｍにおけるシグナルを測定する目的で使用した。加えて、ＬＣ－ＭＳによっても、事前にＨＰＬＣによって特性されたそれぞれのピークの質量を測定することによって（データは本明細書には含まれていない）、アルドール付加生成物及びアルドール縮合生成物を確認した。
実施例２：アルドール脱水生成物の還元を触媒する酵素
本明細書に示されているように、活性化された二重結合、すなわち、カルボニル基またはカルボキシレート基の隣の二重結合の還元を酵素によって触媒できる。酵素を用いて、アルドール脱水生成物、例えば２－オキソ－３－エン酸をさらに還元して、対応する２－オキソカルボン酸をもたらすことができる。予想外にも、キノンの還元にＮＡＤＨ及び／またはＮＡＤＰＨを利用するＥＣ１．６．５（例えばＥＣ１．６．５．５）に属するオキシドレダクターゼが、この反応を触媒できることが発見された。例えば、実施例１に記載されているように、２－ケトカルボン酸の生成のために、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１株またはＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５株において、Ａｄｓ－Ｈｙｄ酵素（実施例１を参照されたい）を組み換え発現させると、そのＡｄｓ－Ｈｙｄ酵素生成物（すなわち、２－オキソ－３－エン酸）の一部が、対応する２－ケトカルボン酸に変換されることが発見された。これにより、天然において発現する酵素、または上記のＥ．ｃｏｌｉ株内の酵素には、２－オキソ－３－エン酸の還元に関与するものもある可能性が導かれた。既知のオキシドレダクターゼのうち、上記の株において、活性化された二重結合を還元できると考えられるオキシドレダクターゼ（すなわち、ＥＣ１．３．－及びＥＣ１．６．－）の調査を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５及びＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１それぞれにおいて、上記のような有望な酵素１７個が特定された。当該技術分野における既知の方法を用いて、上記の両方の宿主において、これらの酵素がそれぞれノックアウトされた株を調製した。その後、上記の方法を用いて、かつ組み換え発現させたＡｄｓ－Ｈｙｄ酵素を用いて、このような各ノックアウト株において、２－オキソ－３－エン酸、及びその生成物である２－ケトカルボン酸の両方を生成する能力について試験した。これにより、ｑｏｒＡ遺伝子、すなわちキノンオキシドレダクターゼ－１をノックアウトすると、２－オキソ－３－エン酸は生成され、２－ケトカルボン酸は生成されないという認識が得られた。これにより、ｑｏｒＡによってコードされる酵素が、天然の状態において、この反応の実施を担う可能性が高いことが確認された。続いて、Ｎ末端にＨｉｓ６タグを付加したＱｏｒＡ酵素を過剰発現させ、精製したところ、所望の反応を起こす活性が確かにあることが確認された（図６）。ＥＣ１．６．５（例えばＥＣ１．６．５．５）に属する、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のキノンオキシドレダクターゼ酵素が、その天然の基質（環状構造である）とは大きく異なる基質に対して機能を発揮できることが初めて、明らかに確認された。さらに、この酵素が、その反応の際に、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの両方を補因子として利用できることが確認され（図６）、バイオプロダクションの際に、この酵素を好気性条件及び嫌気性条件の両方で利用可能になるので、非常に有益である。
ＥＣ１．６．５に属する様々な生合成ポリペプチドは、本開示に従って、例えば、アルケン還元生成物生合成ポリペプチドとして、及び／またはアルドール脱水生成物の還元用に使用できる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｑｏｒ－１酵素との同一性が３７～９０％の範囲である１８個の酵素（表９を参照されたい）を含め、ＥＣ１．６．５．５のキノンオキシドレダクターゼの多くにおいて、本開示による活性について評価した。選択したすべての酵素は、少なくとも１つの基質に対する活性があることが確認され（表９）、さらに、この反応を行うための、このクラスの酵素の一般性が確認された。
Figure 2022530467000095
クローニング及び発現：非相同なアルドラーゼヒドラターゼ（Ａｄｓ－Ｈｙｄ１）及び表５に示されているキノンオキシドレダクターゼ酵素をコードするＤＮＡのコドンを、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現用に最適化し、民間のＤＮＡ合成業者で合成を行った。ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性の測定のために、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグをＱｏｒ－１酵素に付加した。標準的なクローニング方法を用いて、単一のｐＢ１１バックボーンプラスミドにおいて、各遺伝子をＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの下流及びＴ７ターミネーター配列の上流にクローニングした。加えて、選択したアルデヒドが３－ヒドロキシプロピオンアルデヒドである実験用に、Ｂ１２依存性酵素であるグリセロールデヒドラターゼ酵素（ｐｄｕＣ［Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ａ５ＶＭＢ２］、ｐｄｕＤ［Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ａ５ＶＭＢ１］、ｐｄｕＥ［Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ａ５ＶＭＢ０］、ｐｄｕＧ［Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ａ５ＶＭＡ９］及びｐｄｕＨ［Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ａ５ＶＭＡ８］という５つの遺伝子で構成されるＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉグリセロールデヒドラターゼ）も、第２の和合性プラスミドにクローニングして、この酵素を用いて、３－ヒドロキシプロピオンアルデヒドをグリセロールから生成できるようにした。これらのプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１＊（ＤＥ３）ΔｌｄｈＡ ΔｑｏｒＡにトランスフォーメーションした。組み換えタンパク質の発現を実施例１で上記したようにして行った。ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験のために、Ｑｏｒ－１酵素を０．２～０．４のＯＤ６００で、２５０μＭのＩＰＴＧとともに誘導した。誘導後の発現を１８０分、３０℃及び好気性条件下で行った。誘導後、当該技術分野における標準的な方法を用いたＮｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して、その酵素を精製した。
酵素アッセイ：様々なキノンオキシドレダクターゼにおける、実施例１と同じｉｎ ｖｉｖｏ活性測定：図６に示されているｉｎ ｖｉｔｒｏ活性測定では、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）において、Ｑｏｒ－１酵素（０．３ｍｇ／ｍｌ）を約１０ｍＭの６－ヒドロキシ－３，４－デヒドロ－２－オキソヘキサノエート（自家合成品）と、０．５ｍＭのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのいずれかとインキュベートした。
生成物の解析：実施例１に記載されているアイソクラティックＨＰＬＣ法を用いて、酵素生成物、すなわち２－ケトカルボン酸の生成を検出及び定量した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性測定では、３４０ｎｍにおける吸光度の低下を利用して、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ補因子の枯渇、すなわち、Ｑｏｒ－１活性を測定した。
実施例３：２－ケトカルボン酸をピルベート及び脂肪族アルデヒドから生成させる二酵素系
様々な２－ケト酸を生成するために、アルドラーゼ－ヒドラターゼ酵素（複数可）をキノンオキシドレダクターゼ酵素と併用することについて調べた。この併用により、１，５－ペンタンジオール、１，６－ヘキサンジオール、アジピン酸、カプロラクタム、カプロラクトン、６－ヒドロキシヘキサン酸、６－アミノカプロン酸、アミノ酸及び多くの異なる脂肪分子など、産業上望ましい多くの生成物を生成する際の前駆体である様々な２－ケト酸の生成が可能になる。アルドラーゼ－ヒドラターゼ酵素とオキシドレダクターゼとの多種多様な組み合わせが、様々な２－ケト酸の生成に有効であることが確認された（表１０）。本明細書に示されているように、提供する技術は、生成物濃度を高くでき、例えば、約または少なくとも約１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１５ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、５００ｍＭ、６００ｍＭ、７００ｍＭ、８００ｍＭ、９００ｍＭ、１０００ｍＭ、１２００ｍＭ、１５００ｍＭ、２０００ｍＭ、２５００ｍＭ、３０００ｍＭにすることができる。
Figure 2022530467000096
Figure 2022530467000097
Figure 2022530467000098
還元のためには、様々な生合成ポリペプチド、特にＥＣ１．６．５に属するものを用いてよい。例えば、ＥＣ１．６．５．５に属するキノンオキシドレダクターゼは、電子キャリア活性に関与することが報告されているとともに、ユビキタスな酵素であることが報告されている。例えば、哺乳動物、真菌及び細菌に存在することが報告されているからである（Ｂｒｅｎｄａ．ｏｒｇで、このＥＣクラスの項目を参照されたい）。様々な宿主にわたり、天然において、これらの酵素が発現するレベルは知られていないが、このクラスの酵素の発現レベルは、天然において、微生物宿主が受ける酸化ストレスの影響を受け得るという仮説が以前に立てられている。Ｅ．ｃｏｌｉ（ＭＧ１６５５及びＢＬ２１株）ＱｏｒＡ遺伝子（Ｑｏｒ－１）が天然において、特に、実施例２に記載されている条件下で発現することが発見された。Ａｄｓ－Ｈｙｄ酵素（例えばＡｄｓ－Ｈｙｄ８）をＥ．ｃｏｌｉで過剰発現させると、Ｅ．ｃｏｌｉでのＱｏｒ－１の天然における酵素レベルでも、２－ケト酸を生成させるのに十分であり得ることが示された。例えば、Ａｄｓ－Ｈｙｄ８をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ ２１＊（ＤＥ３）ΔｌｄｈＡで過剰発現させたところ、約３ｍＭの６－ヒドロキシ２－ケトヘキサノエートが生成された。しかしながら、Ａｄｓ－Ｈｙｄ８に加えて、Ｑｏｒ－１をプラスミドから過剰発現させたところ、生成量が約２倍向上した（約５．８ｍＭの６－ヒドロキシ２－ケトヘキサノエート）。この結果、内部で集めたｉｎ ｖｉｔｒｏでの動態データ、及びＥ．ｃｏｌｉで見られる典型的な酵素レベルに基づき、いくつかの実施形態では、これらの条件下で発現されるＱｏｒ－１酵素の天然での量は、１００μＭ未満であり、０．１～１００μＭの範囲である可能性が高いと推定される。
３つの別々の酵素によって、アルドールの付加、脱水及び脱水後の還元を行う三酵素系と比べて、二酵素系を用いる提供技術では、有意な改善が得られた。例えば、（１）３つの酵素ではなく、２つの酵素のみを発現させればよいので、必要な触媒が減少し、反応をｉｎ ｖｉｖｏで行うときに、タンパク質産生用の細胞資源が軽減され、（２）単一の生合成ポリペプチドに、アルドール付加反応及びアルドール縮合反応の両方を行わせることによって、反応平衡が、所望の生成物の生成される方向に移動し、この移動は、プロセスを通じて実現可能な全収量にとって好都合であり得る。
クローニング及び発現：表５に示されている非相同なアルドラーゼヒドラターゼ及びキノンオキシドレダクターゼ酵素をコードするＤＮＡのコドンを、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現用に最適化し、民間のＤＮＡ合成業者で合成を行った。標準的なクローニング方法を用いて、２つの和合性プラスミド上で、各遺伝子をＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの下流及びＴ７ターミネーター配列の上流にクローニングした。加えて、選択したアルデヒドが３－ヒドロキシプロピオンアルデヒドである実験用に、Ｂ１２依存性酵素であるグリセロールデヒドラターゼ酵素（ｐｄｕＣ［Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ａ５ＶＭＢ２］、ｐｄｕＤ［Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ａ５ＶＭＢ１］、ｐｄｕＥ［Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ａ５ＶＭＢ０］、ｐｄｕＧ［Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ａ５ＶＭＡ９］及びｐｄｕＨ［Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ａ５ＶＭＡ８］という５つの遺伝子で構成されるＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉグリセロールデヒドラターゼ）も、第３の和合性プラスミドにクローニングして、この酵素を用いて、３－ヒドロキシプロピオンアルデヒドをグリセロールから生成できるようにした。これらのプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５（ＤＥ３）ｒｎｅ１３１ ΔｌｄｈＡ ΔａｄｈＥ ΔｆｒｄＢＣ ΔｐｏｘＢ ΔｐｆｌＢ ΔａｃｋＡ－ｐｔａ ΔｙｑｈＤ，ΔａｄｈＰ，ΔｅｕｔＧ，ΔｇｌｄＡ，ΔｙｉａＹ，ΔｆｕｃＯにトランスフォーメーションした。組み換えタンパク質の発現を実施例１で上記したようにして行った。
酵素アッセイ：実施例１と同じ。
生成物の解析：実施例１に記載されているアイソクラティックＨＰＬＣ法を用いて、酵素生成物、すなわち２－ケトカルボン酸の生成を検出及び定量した。
実施例４：１，５－ペンタンジオールを生成する生合成経路
この実施例では、１，５－ペンタンジオールをピルベート及び３－ヒドロキシプロピオンアルデヒドから生成する生合成経路を説明する。図２に示されているように、ピルベート及び３－ヒドロキシプロピオンアルデヒドからの生合成経路は、５つの反応を含む。最初の３つの反応は、実施例３に記載されており、ピルベート及び３－ヒドロキシプロピオンアルデヒドを６－ヒドロキシ－２－ケトヘキサノエートに変換することを含む。下に記載されているのは、この経路の残りの２つの工程の既知の酵素の両方である。とりわけ、５つのすべの反応において、酵素が検証されており、ｉｎ ｖｉｖｏでの完全な経路を実証することを含めた（実施例５を参照されたい）。
工程１～３：ピルベート及び３－ヒドロキシプロピオンアルデヒドの６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエートへの変換詳細は、実施例３を参照されたい。
工程４：６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエートの５－ヒドロキシペンタナールへの変換：例示的な酵素は、表１１に示されている。２－ケト酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．７）は、（Ｃｎ）２－ケト酸のチアミン二リン酸（ＴＰＰ）依存性脱炭酸を触媒して、対応する（Ｃｎ－１）アルデヒドをもたらす。長鎖２－オキソ酸に対して高い活性を有するとともに、ピルベートに対する活性が最小限であるか、またはその活性を持たない酵素が望ましい。ピルベートとの交差反応は、この経路の収量に大きな影響を及ぼし得るからである。Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓピルベートデカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）を変異させて（Ｉ４７２Ａ／Ｉ４７６Ｆ）、長鎖２－オキソ酸に対する効率の上昇のために、その活性部位を著しく改変しているとともに、ピルベートに対する活性を大幅に（２０００倍超）低下させている７。Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ ＰＤＣ変異体Ｉ４７２Ａ／Ｉ４７６Ｆでは、所望の基質と構造が似ている２－オキソヘキサノエートに対する優れた動態特性も示されている。この工程を触媒する別の有望な酵素候補は、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼＫｄｃＡ（ケト酸デカルボキシラーゼ）及びＰ．ｐｕｔｉｄａベンゾイルフォーメートデカルボキシラーゼ（ＢＦＤ）変異体Ａ４６０Ｉである８－１０。そのｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＢＦＤ及びｌ．ｌａｃｔｉｓ ＫｄｃＡでは、脱炭酸の際に、長鎖２－オキソ酸に対する選択性が、ピルベートと比べて、５０倍超及び５００倍超であることが示される。特に、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ＫｄｃＡは、２－オキソヘキサン酸に対する特異的活性を有し、Ｃ３位及びＣ４位の置換を許容できる。この酵素は、上記の脱炭酸反応を触媒する活性があることが確認された（表１４）。
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他のＥＣ番号であるデカルボキシラーゼも、この反応を行うのに適する。代表的なリストは、表１２に示されている。
Figure 2022530467000100
工程５：５－ヒドロキシペントアルデヒドの１，５－ペンタンジオールへの変換。１級アルコールデヒドロゲナーゼは、アルデヒドの１級アルコールへのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性還元を触媒する。
多くの１級アルコールデヒドロゲナーゼが文献で知られており、この工程を触媒する例示的な候補は、下に記載されており、下記の表１３に示されている。ＡｄｈＥ、ａｄｈＰ、ｅｕｔＧ、ｙｉａＹ、ｙｑｈＤ、ｆｕｃＯ及びｙｊｇＢを含め、多くのＥ．ｃｏｌｉアルコール－アルデヒドデヒドロゲナーゼが知られている１１。最近、４４個のアルデヒドレダクターゼがＥ．ｃｏｌｉで特定された。これらのトランスフォーメーションを触媒するのには、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来のブタノールデヒドロゲナーゼ１２が注目されている。ＡＤＨ２～６を含め、多くのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼが、多種多様なアルデヒドを還元することが示されている。特に注目されているのは、長鎖アルカン分解株Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＮＧ８０－２の２つのアルキルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）遺伝子１３に由来するＡＤＨＩ～ＡＤＨＩＩである。他のプロミスキャスなＡＤＨとしては、中鎖アルコールデヒドロゲナーゼをコードするＡｌｒＡが挙げられる１４。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ１５、Ｅ．ｃｏｌｉ（ｙｉｈｕ）１６及びＣ．Ｅｌｕｙｖｅｒｉ１７で見出された４－オキソブチレートの還元を触媒する４－ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．６１）も注目されている。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ酵素及びＡ．ｔｅｒｒｕｓ酵素（表１３におけるＡＴＥＧ）は、グルタレートセミアルデヒドを還元できる（ＷＯ２０１０／０６８９５３Ａ２、ＷＯ２０１０／０６８９５３Ａ２）。この反応を行うものとして、多くのアルコールデヒドロゲナーゼが注目されているが、５－ヒドロキシペンタナールを還元する活性レベルが高いことから、特に注目されている具体的な酵素は、Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ ｓｐ．Ｓ７４９に由来するアルコールデヒドロゲナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ番号ＡＢ２１３４５９．１）である。この酵素及び４つの他のアルコールデヒドロゲナーゼが、この反応を行うことが確認された（表１４）。
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Figure 2022530467000102
クローニング及び発現：下記の表１４に示されている非相同な２－ケト酸デカルボキシラーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼ酵素をコードするＤＮＡのコドンを、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現用に最適化し、合成を行った。標準的なクローニング方法を用いて、単一のプラスミドにおいて、各遺伝子をＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの下流及びＴ７ターミネーター配列の上流にクローニングした。そのプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５（ＤＥ３）ｒｎｅ１３１ ΔｌｄｈＡ ΔａｄｈＥ ΔｆｒｄＢＣにトランスフォーメーションした。組み換えタンパク質の発現を実施例１で上記したようにして行った。
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活性アッセイ：外部から供給した６－ヒドロキシ－２－ケトヘキサノエートから１，５－ペンタンジオールが生成されるのが観察されたことにより、その２－ケト酸デカルボキシラーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼ酵素の有効な活性が示された。すなわち、発現後、細胞を回収し、６－ヒドロキシ－２－ケトヘキサノエート（約５ｇ／Ｌ）及び１０ｇ／Ｌのグルコースとともに、１５ｇ／Ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を含む新鮮な培地０．４ｍＬ（ＯＤ６００：約３０）に１５時間、嫌気性条件下で再懸濁させた。室温でインキュベート後、細胞を遠心分離し、その上清をろ過し、６－ヒドロキシ－２－ケトヘキサノエートからの１，５－ペンタンジオールの形成について、ＨＰＬＣによって解析した。
１，５－ペンタンジオールの生成のＨＰＬＣ解析：アイソクラティックＨＰＬＣを用いて、１，５－ペンタンジオールを検出及び定量した。この方法では、Ｂｉｏ－ＲａｄのＡｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７カラムと、０．７ｍＬ／分の０．０５％のギ酸（または５ｍＭの硫酸）を３５℃で用いた。検出は、ＲＩＤ（屈折率検出器）及びＵＶ検出器を用いて行い、ＵＶ検出器は、２１０ｎｍ及び２６０ｎｍにおけるシグナルを測定する目的で使用した。ＨＰＬＣの結果から、１，５－ペンタンジオールが生成されたことが示され、特定の調製物の結果を表１４に示した。
実施例５：様々な炭素源から、中間体６－ヒドロキシ－２－ケトヘキサノエートを介して、１，５－ペンタンジオールを生成するための微生物の調製及び利用
いくつかの実施形態では、本開示は、１，５－ペンタンジオールを生成するための技術を提供する。いくつかの実施形態では、グリセロールを炭素源として使用する。いくつかの実施形態では、生合成工程の１つ以上またはすべてを１つの生物（例えば細菌）及び培養液で行う。いくつかの実施形態では、収量は、約もしくは少なくとも約１０ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、６０ｍｇ／Ｌ、７０ｍｇ／Ｌ、８０ｍｇ／Ｌ、９０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、１５０ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、２５０ｍｇ／Ｌ、３００ｍｇ／Ｌ、３５０ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、４５０ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、６００ｍｇ／Ｌ、７００ｍｇ／Ｌ、８００ｍｇ／Ｌ、９００ｍｇ／Ｌもしくは１０００ｍｇ／Ｌであるか、または約もしくは少なくとも約１．１ｇ／Ｌ、１．２ｇ／Ｌ、１．３ｇ／Ｌ、１．４ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、１．６ｇ／Ｌ、１．７ｇ／Ｌ、１．８ｇ／Ｌ、１．９ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、２．１ｇ／Ｌ、２．２ｇ／Ｌ、２．３ｇ／Ｌ、２．４ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、２．７ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１６０ｇ／Ｌ、１７０ｇ／Ｌ、１８０ｇ／Ｌ、１９０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、２２０ｇ／Ｌ、２５０ｇ／Ｌもしくは３００ｇ／Ｌである。
例示的な生物としてＥ．ｃｏｌｉを使用して、図２に示されているとともに、実施例４にも記載されている代謝経路を用いて、グリセロール及び／またはグルコースのような炭素源から得られる代謝前駆体であるピルベート及び３－ヒドロキシプロピオンアルデヒドを介して、これらの炭素源からの１，５－ペンタンジオールの生成を操作した。この経路によって、所望の炭素源（例えば、グリセロール及び／またはグルコース）から、１，５－ペンタンジオールを生成できるＥ．ｃｏｌｉを作製するために、その経路におけるそれぞれの個別の酵素、及び３－ヒドロキシプロピオンアルデヒドの生成に必要な他の酵素をコードする核酸のコドンをＥ．ｃｏｌｉに合わせて最適化し、業者で合成を行うか、またはＥ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡを用いて、ＰＣＲ増幅によって得るかした。遺伝子をプラスミドにクローニングし、そのプラスミドをＥ．ｃｏｌｉにトランスフォーメーションした。その経路の酵素をすべてＩｎ ｖｉｖｏ発現させたところ、１，５－ペンタンジオールが生成された。
１，５－ペンタンジオール経路遺伝子のクローニング：１，５－ペンタンジオール経路における非相同な酵素をコードするＤＮＡのコドンを、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現用に最適化し、民間のＤＮＡ合成業者（例えばＴｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で合成を行った。１，５－ペンタンジオール経路における天然型の酵素をコードするＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡから、ＰＣＲによって増幅した。標準的なクローニング方法を用いて、各遺伝子をＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの下流及びターミネーター配列の上流にクローニングした。遺伝子の発現カセットを有する和合性プラスミドには、マーカーとレプリコンとの組み合わせのうち、（１）クロラムフェニコールマーカー＋Ｐ１５Ａレプリコン、（２）アンピシリンマーカー＋ＣｏｌＥ１レプリコン及び（３）カナマイシンマーカー＋ＣＯＬＡレプリコンの１つを含めた。用いた遺伝子の例としては、Ａｄｓ－Ｈｙｄ８（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ａ０Ａ２８６ＰＨ１８）、Ｑｏｒ－１（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｐ２８３０４）、６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエートデカルボキシラーゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ６ＱＢＳ４）、１級アルコールデヒドロゲナーゼ（５－ヒドロキシペンタナール１－レダクターゼともいう）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ番号ＡＢ２１３４５９．１）が挙げられる。加えて、ビタミンＢ１２非依存性であるグリセロールデヒドラターゼ酵素（例えば、ＤｈａＢ１［Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ８ＧＥＺ８］、ＤｈａＢ２［Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ８ＧＥＺ７］という２つのサブユニットで構成されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍグリセロールデヒドラターゼ）、またはＢ１２依存性酵素であるグリセロールデヒドラターゼ酵素（ｐｄｕＣ［Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ａ５ＶＭＢ２］、ｐｄｕＤ［Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ａ５ＶＭＢ１］、ｐｄｕＥ［Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ａ５ＶＭＢ０］、ｐｄｕＧ［Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ａ５ＶＭＡ９］及びｐｄｕＨ［Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ａ５ＶＭＡ８］という５つの遺伝子で構成されるＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉグリセロールデヒドラターゼ）もクローニングして、３－ヒドロキシプロピオンアルデヒド（１，５－ペンタンジオール経路の前駆体であって、この酵素を用いてグリセロールから生成できる前駆体）を生成できるようにした。Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉグリセロールデヒドラターゼをコードする５つの遺伝子すべてを単一の遺伝子オペロンとしてクローニングした。
１，５－ペンタンジオールを生成するための株（複数可）の構築：１，５－ペンタンジオール経路の酵素を試験する際には、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１＊（ＤＥ３）ΔｌｄｈＡをバックグラウンド株として使用した。Ｅ．ｃｏｌｉへのトランスフォーメーションに関する標準的なエレクトロポレーション法を用いて、その経路の酵素をコードする遺伝子を有するプラスミドをトランスフォーメーションした。
１，５－ペンタンジオールの生成：下記のプラスミドをＥ．ｃｏｌｉに順次トランスフォーメーションした後、下記の発現株を得た。
株ＰｅＤＯ１：プラスミド１（ＣＯＬＡレプリコン、カナマイシンマーカー）：遺伝子１（グリセロールデヒドラターゼ－ＤｈａＢ１）、遺伝子２（グリセロールデヒドラターゼ－ＤｈａＢ２）、遺伝子３（Ｑｏｒ１）。プラスミド２（ＣｏｌＥ１レプリコン、アンピシリンマーカー）：遺伝子１（６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエートデカルボキシラーゼ）、遺伝子２（Ａｄｓ－Ｈｙｄ８）。プラスミド３（Ｐ１５Ａレプリコン、クロラムフェニコールマーカー）：遺伝子１（５－ヒドロキシペンタナール１－レダクターゼ）。
株ＰｅＤＯ２：プラスミド１（ＣＯＬＡレプリコン、カナマイシンマーカー）：遺伝子１（グリセロールデヒドラターゼ－ＤｈａＢ１）、遺伝子２（グリセロールデヒドラターゼ－ＤｈａＢ２）、遺伝子３（Ｑｏｒ１）。プラスミド２（ＣｏｌＥ１レプリコン、アンピシリンマーカー）：遺伝子１（６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエートデカルボキシラーゼ）、遺伝子２（Ａｄｓ－Ｈｙｄ８）。
株ＰｅＤＯ３：プラスミド１（ＣＯＬＡレプリコン、カナマイシンマーカー）：遺伝子１（グリセロールデヒドラターゼ－ｐｄｕＣＤＥＧＨ）。プラスミド２（ＣｏｌＥ１レプリコン、アンピシリンマーカー）：遺伝子１（６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエートデカルボキシラーゼ）、遺伝子２（Ａｄｓ－Ｈｙｄ８）、遺伝子３（５－ヒドロキシペンタナール１－レダクターゼ）。プラスミド３（Ｐ１５Ａレプリコン、クロラムフェニコールマーカー）：遺伝子１（Ｑｏｒ１）。
株ＰｅＤＯ４：プラスミド１（ＣＯＬＡレプリコン、カナマイシンマーカー）：遺伝子１（グリセロールデヒドラターゼ－ｐｄｕＣＤＥＧＨ）。プラスミド２（ＣｏｌＥ１レプリコン、アンピシリンマーカー）：遺伝子１（６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエートデカルボキシラーゼ）、遺伝子２（Ａｄｓ－Ｈｙｄ８）。プラスミド３（Ｐ１５Ａレプリコン、クロラムフェニコールマーカー）：遺伝子１（５－ヒドロキシペンタナール１－レダクターゼ）。
株ＰｅＤＯ１及びＰｅＤＯ２の培養：１ｇ／ＬのＤ－グルコース及び適切な抗生物質とともに、５ｍＬの２×ＹＴ培地の入ったチューブで、種母培養液を一晩成長させた。１２５ｍＬのバッフル付きフラスコを用いて、４０ｍＬの成長培地で、発現及び１，５－ペンタンジオール経路酵素のための細胞培養を行った。複合（２×ＹＴ）成長培地を使用し、２ｇ／ＬのＤ－グルコース、０．５ｇ／Ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）及び１００ｍｇ／Ｌのクエン酸鉄アンモニウムを添加した。誘導前の成長を２時間、好気性条件下、３０℃で行った。０．２～０．４のＯＤ６００で、２５０μＭのＩＰＴＧとともに、組み換えタンパク質の発現を誘導した。誘導後の発現を３０分、３０℃及び好気性条件下で行った。続いて、細胞培養液を１００ｍＬのガラス瓶に移し、Ｌ－システインＨＣｌ一水和物を成長培地に加え（終濃度１ｇ／Ｌ）、その瓶を嫌気性のグローブボックス（Ｃｏｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）内で密封した。そして、培養液をそのガラス瓶において２時間、３０℃、嫌気性条件下で成長させた。その後、細胞を回収し、８ｇ／Ｌのグルコース、４ｇ／Ｌのグリセロール及び１５ｇ／Ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を含む新鮮な培地０．４ｍＬ（ＯＤ６００：約３０）に再懸濁させた。嫌気性条件下で２４時間、室温でインキュベート後、細胞を遠心分離し、その上清をろ過し、ＨＰＬＣによって解析した。
株ＰｅＤＯ３及びＰｅＤＯ４の培養：生成培地は、１×ＭＯＰＳ最少培地、５ｇ／Ｌの酵母エキス、１０ｇ／Ｌのグリセロール、２０ｇ／Ｌのグルコース及び１０ｕＭのＣｙａｎｏｃｏｂａｌａｍｉｎ（ｐＨ７．２）の組成物を含むものである。１×ＭＯＰＳ最少培地は、４０ｍＭのＭＯＰＳ、４ｍＭのトリシン、０．０１ｍＭのＦｅＳＯ４、９．５ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、０．２７６ｍＭのＫ２ＳＯ４、０．５μＭのＣａＣｌ２、０．５２５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＮａＣｌ、２．９２Ｅ－７ｍＭの（ＮＨ４）２ＭｏＯ４、４．０Ｅ－５ｍＭのＨ３ＢＯ３、３．０２Ｅ－６ｍＭのＣｏＣｌ２、９．６２Ｅ－７ｍＭのＣｕＳＯ４、８．０８Ｅ－６ｍＭのＭｎＣｌ２、９．７４Ｅ－７ｍＭのＺｎＳＯ４及び１．３２ｍＭのＫ２ＰＯ４で構成されるものである。１０ｍＬの２×ＹＴ培地及び適切な抗生物質の入ったチューブで、種母培養液を一晩成長させた。栓付きの１２５ｍＬのフラスコで、適切な抗生物質を含む生成培地１０ｍＬを用いて、１，５－ペンタンジオール生成用の細胞培養液を調製し、１ｍＬの種母培養液を播種し、誘導前に、細胞を３７℃で２時間成長させた。２時間後、細胞培養液を０．１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、その培養液を２６℃に移して、生成を開始させた。１２時間ごとに、試料を好気的に採取し、最後の試料を７２時間の時点に採取し、その上清をろ過し、ＨＰＬＣによって解析した。
１，５－ペンタンジオールの生成のＨＰＬＣ解析：アイソクラティックＨＰＬＣを用いて、１，５－ペンタンジオールを検出及び定量した。この方法では、Ｂｉｏ－ＲａｄのＡｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７カラムと、０．７ｍＬ／分の０．０５％のギ酸（または５ｍＭの硫酸）を３５℃で用いた。検出は、ＲＩＤ（屈折率検出器）及びＵＶ検出器を用いて行い、ＵＶ検出器は、２１０ｎｍ及び２６０ｎｍにおけるシグナルを測定する目的で使用した。ＨＰＬＣの結果から、８００ｍｇ／Ｌ（株ＰｅＤＯ１）、４００ｍｇ／Ｌ（ＰｅＤＯ２）、２１２ｍｇ／Ｌ（ＰｅＤＯ３）及び４１ｍｇ／Ｌ（ＰｅＤＯ４）の最終力価で、１，５－ペンタンジオールが生成されたという事実が示された。
１，５－ペンタンジオールの生成のさらなる実施例：
上記の株を用いて、１，５－ペンタンジオールの生成に成功したことに基づき、実施例２及び３で特定された代替的なキノンオキシドレダクターゼを１，５－ペンタンジオールの生成に用いることについて評価した。簡潔に述べると、上記の実施例における株ＰｅＤＯ３のプラスミドの組み合わせを使用し、そのプラスミド３に、異なるＱｏｒ酵素、すなわち、Ｑｏｒ－１（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｐ２８３０４）、Ｑｏｒ－２（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｐ４０７８３）及びＱｏｒ－５（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｐ４３９０３）を含めた。株の構築、生成、解析の方法は、上記の実施例と同じであった。上記の生成条件下で、株ＰｅＤＯ５（Ｑｏｒ－１を含む）では、１，５－ペンタンジオールは約２ｇ／Ｌ生成され、株ＰｅＤＯ６（Ｑｏｒ－２を含む）では、１，５－ペンタンジオールは２．２ｇ／Ｌ生成され、株ＰｅＤＯ６（Ｑｏｒ－５を含む）では、１，５－ペンタンジオールは２．４ｇ／Ｌ生成された。
実施例６：１，６－ヘキサンジオールを中間体６－ヒドロキシヘキサノエートから生成するための微生物の調製及び利用
いくつかの実施形態では、本開示は、６ＨＨ及びＨＤＯを調製する技術を提供する。いくつかの実施形態では、収量は、約もしくは少なくとも約１０ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、６０ｍｇ／Ｌ、７０ｍｇ／Ｌ、８０ｍｇ／Ｌ、９０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、１５０ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、２５０ｍｇ／Ｌ、３００ｍｇ／Ｌ、３５０ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、４５０ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、６００ｍｇ／Ｌ、７００ｍｇ／Ｌ、８００ｍｇ／Ｌ、９００ｍｇ／Ｌもしくは１０００ｍｇ／Ｌ、または約もしくは少なくとも約１．１ｇ／Ｌ、１．２ｇ／Ｌ、１．３ｇ／Ｌ、１．４ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、１．６ｇ／Ｌ、１．７ｇ／Ｌ、１．８ｇ／Ｌ、１．９ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、２．１ｇ／Ｌ、２．２ｇ／Ｌ、２．３ｇ／Ｌ、２．４ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、２．７ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１６０ｇ／Ｌ、１７０ｇ／Ｌ、１８０ｇ／Ｌ、１９０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、２２０ｇ／Ｌ、２５０ｇ／Ｌもしくは３００ｇ／Ｌである。１，６－ヘキサンジオールを中間体６－ヒドロキシヘキサノエート（６ＨＨ）から生成する生合成経路は、図３に示されている。下に示されているのは、６ＨＨからの１，６－ヘキサンジオールの生成を実証するために、この経路の各工程用に異なる酵素の利用を組み込んだ例である。中間体６ＨＨから１，６－ヘキサンジオールを生合成する経路の各工程を行うために用いた遺伝子及びその遺伝子からコードされる対応する酵素の例は、下記の表１５に示されている。その表中の各酵素は、同じＥ．Ｃ．クラスに属する相同な酵素で置換してもよい。
Figure 2022530467000104
遺伝子１によってコードされる６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼという酵素によって触媒される反応：６－ヒドロキシヘキサノエート→６－ヒドロキシヘキサナール。遺伝子２によってコードされる酵素：６－ヒドロキシヘキサノエート１－レダクターゼ活性化剤。遺伝子３によってコードされる６－ヒドロキシヘキサナール１－レダクターゼという酵素によって触媒される反応：６－ヒドロキシヘキサナール→１，６－ヘキサンジオール
（ｉ）ＨＤＯ生成用のプラスミドの調製：
ＨＤＯ生成経路遺伝子を下記の２つのプラスミドにクローニングした。合成遺伝子を民間の販売業者から入手し、各遺伝子のコドンを、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現用に最適化した。標準的な分子生物学手法を用いて、各遺伝子をそれ自体のＴ７プロモーター及びターミネーターによりクローニングした。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを標的生物として使用して、１，６－ヘキサンジオールの生成を操作した。２つのすべてのプラスミドをエレクトロコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５（ＤＥ３）Δｒｎｅ１３１，ΔｌｄｈＡにコトランスフォーメーション後、発現株を得た。
プラスミド１（ＣｏｌＥ１レプリコン、アンピシリンマーカー）：遺伝子１。プラスミド２（ＣＯＬＡレプリコン、カナマイシンマーカー）：遺伝子２及び遺伝子３
（ｉｉ）細胞の培養、タンパク質の発現、及びＨＤＯ生成の解析：
適切な抗生物質とともに、１０ｍＬのＬＢ培地の入ったチューブで、種母培養液を一晩成長させた。ガラス瓶を用いて、１００ｍＬの体積で、発現及びＨＤＯ生成のための細胞培養を行った。複合成長培地を使用し、２ｇ／ＬのＤ－グルコース、０．５ｇ／Ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、及び酵素の発現のために重要なその他の基質／栄養素を添加した。誘導前の成長を約２時間、好気性条件下、３０℃で行った。０．２～０．４のＯＤ６００で、２５０μＭのＩＰＴＧとともに、組み換えタンパク質の発現を誘導した。誘導後の発現を３０℃、好気性条件下で６０～９０分行った後、２～３時間、嫌気性条件で行った。その後、細胞を回収し、濃縮し、０．５ｍｌの体積、約４０のＯＤ６００で、約１０ｇ／Ｌのグルコース、６－ヒドロキシヘキサノエート（約５ｇ／Ｌ）及び１５ｇ／Ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を含む新鮮な培地に再懸濁させた。２４時間、室温でインキュベート後、細胞を遠心分離し、上清をろ過し、ＨＰＬＣによって解析した。
（ｉｉｉ）ＨＤＯの生成のＨＰＬＣ解析：アイソクラティックＨＰＬＣを用いて、ＨＤＯを検出及び定量した。この方法では、Ｂｉｏ－ＲａｄのＡｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７カラムと、０．７ｍＬ／分の０．５％のギ酸（または５ｍＭの硫酸）を３５℃で用いた。検出は、ＲＩＤ（屈折率検出器）及びＵＶ検出器を用いて行い、ＵＶ検出器は典型的には、２１０ｎｍ、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおけるシグナルを測定する目的で使用した。結果により、表１５のすべての例において、０．１～２．５ｇ／Ｌの１，６－ヘキサンジオールの生成が示された。
実施例７：１，６－ヘキサンジオールを中間体６－ヒドロキシ－２－ケトヘキサノエートから生成するための微生物の調製及び利用
いくつかの実施形態では、本開示は、６ＨＨ及びＨＤＯを調製する技術を提供する。いくつかの実施形態では、収量は、約もしくは少なくとも約１０ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、６０ｍｇ／Ｌ、７０ｍｇ／Ｌ、８０ｍｇ／Ｌ、９０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、１５０ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、２５０ｍｇ／Ｌ、３００ｍｇ／Ｌ、３５０ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、４５０ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、６００ｍｇ／Ｌ、７００ｍｇ／Ｌ、８００ｍｇ／Ｌ、９００ｍｇ／Ｌもしくは１０００ｍｇ／Ｌ、または約もしくは少なくとも約１．１ｇ／Ｌ、１．２ｇ／Ｌ、１．３ｇ／Ｌ、１．４ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、１．６ｇ／Ｌ、１．７ｇ／Ｌ、１．８ｇ／Ｌ、１．９ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、２．１ｇ／Ｌ、２．２ｇ／Ｌ、２．３ｇ／Ｌ、２．４ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、２．７ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１６０ｇ／Ｌ、１７０ｇ／Ｌ、１８０ｇ／Ｌ、１９０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、２２０ｇ／Ｌ、２５０ｇ／Ｌもしくは３００ｇ／Ｌである。１，６－ヘキサンジオールを中間体６－ヒドロキシ－２－ケトヘキサノエートから生成する生合成経路は、図３に示されている。下に示されているのは、この経路による１，６－ヘキサンジオールの生成を実証するために、この経路の各工程用に異なる酵素の利用を組み込んだ例である。中間体６－ヒドロキシ－２－ケトヘキサノエートから１，６－ヘキサンジオールを生合成する経路の各工程を行うために用いた遺伝子及びその遺伝子からコードされる対応する酵素の例は、下記の表１６に示されている。その表中の各酵素は、同じＥ．Ｃ．クラスに属する相同な酵素で置換してもよい。加えて、下記の例では、ＣｏＡ転移反応及び２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ脱水反応の両方を行う複数の酵素が確認されたことが明らかにされている。
（ｉ）ＨＤＯ生成用のプラスミドの調製：
Figure 2022530467000105
Figure 2022530467000106
ＨＤＯ生成経路遺伝子を、下に示されている２つの別々の和合性プラスミドにクローニングした。示されているように、各プラスミドは、異なる複製起点及び異なる抗生物質マーカーを有していた。合成遺伝子を民間の販売業者から入手し、各遺伝子のコドンを、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現用に最適化した。標準的な分子生物学手法を用いて、各遺伝子をそれ自体のＴ７プロモーター及びターミネーターによりクローニングした。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを標的生物として使用して、１，６－ヘキサンジオールの生成を操作した。３つのすべてのプラスミドをエレクトロコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１＊（ＤＥ３）Δｌｄｈ，ΔａｄｈＥ，ΔｆｒｄＡにコトランスフォーメーション後、発現株を得た。
プラスミド１（ＣＯＬＡレプリコン、カナマイシンマーカー）：遺伝子１０、遺伝子９
プラスミド２（ＣｏｌＥ１レプリコン、アンピシリンマーカー）：遺伝子１、遺伝子２、遺伝子３及び遺伝子４
プラスミド３（Ｐ１５Ａレプリコン、クロラムフェニコールマーカー）：遺伝子５、遺伝子６、遺伝子７、遺伝子８及び遺伝子１１
（ｉｉ）細胞の培養、タンパク質の発現、及びＨＤＯ生成の解析：
適切な抗生物質とともに、１０ｍＬのＬＢ培地の入ったチューブで、種母培養液を一晩成長させた。ガラス瓶を用いて、１００ｍＬの体積で、発現及びＨＤＯ生成のための細胞培養を行った。複合成長培地を使用し、２ｇ／ＬのＤ－グルコース、０．５ｇ／Ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、及び酵素の発現のために重要なその他の基質／栄養素を添加した。誘導前の成長を約２時間、好気性条件下、３０℃で行った。０．２～０．４のＯＤ６００で、２５０μＭのＩＰＴＧとともに、組み換えタンパク質の発現を誘導した。誘導後の発現を３０℃、好気性条件下で６０～９０分行った後、２～３時間、嫌気性条件で行った。その後、細胞を回収し、濃縮し、０．５ｍｌの体積、約４０のＯＤ６００で、約１０ｇ／Ｌのグルコース、６－ヒドロキシ－２－ケトヘキサノエート（約５ｇ／Ｌ）及び１５ｇ／Ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を含む新鮮な培地に再懸濁させた。２４時間、室温でインキュベート後、細胞を遠心分離し、上清をろ過し、ＨＰＬＣによって解析した。
（ｉｉｉ）ＨＤＯの生成のＨＰＬＣ解析：アイソクラティックＨＰＬＣを用いて、ＨＤＯを検出及び定量した。この方法では、Ｂｉｏ－ＲａｄのＡｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７カラムと、０．７ｍＬ／分の０．５％のギ酸（または５ｍＭの硫酸）を３５℃で用いた。検出は、ＲＩＤ（屈折率検出器）及びＵＶ検出器を用いて行い、ＵＶ検出器は典型的には、２１０ｎｍ、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおけるシグナルを測定する目的で使用した。結果により、表１６の実施例７Ａ～７Ｅにおいてそれぞれ、７００ｍｇ／Ｌ、１．２ｇ／Ｌ、１．１ｇ／Ｌ、１．１ｇ／Ｌ及び１ｇ／Ｌの１，６－ヘキサンジオールが生成されたことが示された。
実施例８：異なる炭素源から、中間体６－ヒドロキシ－２－ケトヘキサノエートを介して１，６－ヘキサンジオールを生成するための微生物の調製及び利用
いくつかの実施形態では、本開示は、６ＨＨ及びＨＤＯを調製する技術を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、グリセロールを炭素源として用いて、ＨＤＯを生成する技術を提供する。いくつかの実施形態では、生成は、１つの生物で行う。いくつかの実施形態では、生成は、異なる生合成ポリペプチドセットをそれぞれ発現する２つ以上の生物で行う。いくつかの実施形態では、生成は、１つの細菌株で行う。いくつかの実施形態では、生成は、それぞれ独立して１つ以上の生合成反応を行う２つ以上の細菌株で行う。いくつかの実施形態では、培養液は、ＨＤＯ生成用の２つ以上の株またはすべての株を含む。いくつかの実施形態では、収量は、約もしくは少なくとも約１０ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、６０ｍｇ／Ｌ、７０ｍｇ／Ｌ、８０ｍｇ／Ｌ、９０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、１５０ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、２５０ｍｇ／Ｌ、３００ｍｇ／Ｌ、３５０ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、４５０ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、６００ｍｇ／Ｌ、７００ｍｇ／Ｌ、８００ｍｇ／Ｌ、９００ｍｇ／Ｌもしくは１０００ｍｇ／Ｌ、または約もしくは少なくとも約１．１ｇ／Ｌ、１．２ｇ／Ｌ、１．３ｇ／Ｌ、１．４ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、１．６ｇ／Ｌ、１．７ｇ／Ｌ、１．８ｇ／Ｌ、１．９ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、２．１ｇ／Ｌ、２．２ｇ／Ｌ、２．３ｇ／Ｌ、２．４ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、２．７ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１６０ｇ／Ｌ、１７０ｇ／Ｌ、１８０ｇ／Ｌ、１９０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、２２０ｇ／Ｌ、２５０ｇ／Ｌもしくは３００ｇ／Ｌである。ピルベート及び３－ヒドロキシプロパナールから、中間体６－ヒドロキシ－２－ケトヘキサノエートを介して、１，６－ヘキサンジオールを生成する生合成経路は、図３に示されている。下に示されているのは、この経路による１，６－ヘキサンジオールの生成に、アルドラーゼ－ヒドラターゼベースの二酵素系の利用を組み込んだ実施例（８ａ及び８ｂ）である。ビタミンＢ１２非依存性であるグリセロールデヒドラターゼ酵素、またはＢ１２依存性酵素であるグリセロールデヒドラターゼ酵素をクローニングして、３－ヒドロキシプロピオンアルデヒド（この酵素を用いて、グリセロールから作製できる１，６－ヘキサンジオール経路前駆体）を生成可能にできる。この実施例では、Ｂ１２依存性グリセロールデヒドラターゼを使用した。１，６－ヘキサンジオール生合成経路の各工程、及び３－ヒドロキシプロピオンアルデヒドの生成を行うために用いた遺伝子及びその遺伝子がコードする対応する酵素の例は、表１７に示されている。この実施例における各酵素は、同じＥ．Ｃクラスに属する相同な酵素で置換できることに留意することが重要である。
Figure 2022530467000107
Figure 2022530467000108
実施例８ａ：１つのＥ．ｃｏｌｉ株での１，６－ヘキサンジオール（ＨＤＯ）の生成
（ｉ）ＨＤＯ生成用のプラスミドの調製：
下に示されている３つの別々の和合性プラスミドに、ＨＤＯの生成経路遺伝子をクローニングした。示されているように、各プラスミドは、異なる複製起点及び異なる抗生物質マーカーを有していた。合成遺伝子を民間の販売業者から入手し、各遺伝子のコドンを、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現用に最適化した。標準的な分子生物学手法を用いて、各遺伝子をそれ自体のＴ７プロモーター及びターミネーターによりクローニングした。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを標的生物として使用して、１，６－ヘキサンジオールの生成を操作した。３つのすべてのプラスミドをエレクトロコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１＊（ＤＥ３）Δｌｄｈ，ΔａｄｈＥ，ΔｆｒｄＡにコトランスフォーメーション後、発現株を得た。
プラスミド１（ＣＯＬＡレプリコン、カナマイシンマーカー）：遺伝子１２、遺伝子１３、遺伝子２、遺伝子１０
プラスミド２（ＣｏｌＥ１レプリコン、アンピシリンマーカー）：遺伝子３、遺伝子４、遺伝子１及び遺伝子９
プラスミド３（Ｐ１５Ａレプリコン、クロラムフェニコールマーカー）：遺伝子５、遺伝子６、遺伝子７、遺伝子８及び遺伝子１１
（ｉｉ）細胞の培養、タンパク質の発現、及びＨＤＯ生成の解析：
適切な抗生物質とともに、１０ｍＬのＬＢ培地の入ったチューブで、種母培養液を一晩成長させた。ガラス瓶を用いて、１００ｍＬの体積で、発現及びＨＤＯ生成のための細胞培養を行った。複合成長培地を使用し、２ｇ／ＬのＤ－グルコース、０．５ｇ／Ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、及び酵素の発現のために重要なその他の基質／栄養素を添加した。誘導前の成長を約２時間、好気性条件下、３０℃で行った。０．２～０．４のＯＤ６００で、２５０μＭのＩＰＴＧとともに、組み換えタンパク質の発現を誘導した。誘導後の発現を３０℃、好気性条件下で６０～９０分行った後、２～３時間、嫌気性条件で行った。その後、細胞を回収し、濃縮し、０．５ｍｌの体積、約４０のＯＤ６００で、５～２０ｇ／Ｌのグルコース、２．５～５ｇ／Ｌのグリセロール及び１５ｇ／Ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を含む新鮮な培地に再懸濁させた。２４時間、室温でインキュベート後、細胞を遠心分離し、上清をろ過し、ＨＰＬＣによって解析した。
（ｉｉｉ）ＨＤＯの生成のＨＰＬＣ解析：アイソクラティックＨＰＬＣを用いて、ＨＤＯを検出及び定量した。この方法では、Ｂｉｏ－ＲａｄのＡｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７カラムと、０．７ｍＬ／分の０．５％のギ酸（または５ｍＭの硫酸）を３５℃で用いた。検出は、ＲＩＤ（屈折率検出器）及びＵＶ検出器を用いて行い、ＵＶ検出器は典型的には、２１０ｎｍ、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおけるシグナルを測定する目的で使用した。結果により、２５～１００ｍｇ／Ｌの１，６－ヘキサンジオールが生成されたことが示された。この方法を用いてＨＤＯを生成する際に、その経路の所定の工程を行うことが以前に確認された代替的な酵素を使用できることを例証するために、遺伝子５がＵｎｉｐｏｒｔ ＩＤ Ａ０Ａ２Ｘ３ＢＫ０９によってコードされ、遺伝子６がＵｎｉｐｏｒｔ ＩＤ Ａ０Ａ２Ｘ３ＢＵ１９によってコードされ、遺伝子７がＵｎｉｐｏｒｔ ＩＤ Ａ０Ａ１Ｖ９ＩＸＡ９によってコードされる代替的なＨＤＯ生成株を構築し、上記の方法を用いて評価した。この生成株でも、１０ｍｇ／Ｌ超の１，６－ヘキサンジオールが生成された。
実施例８ｂ：２つのＥ．ｃｏｌｉ株での１，６－ヘキサンジオール（ＨＤＯ）の生成
（ｉ）ＨＤＯ生成用のプラスミド及び株の調製：
プラスミドから発現させるＨＤＯ生成経路遺伝子の数を最小限にするために、特定の経路遺伝子がゲノムに組み込まれたＥ．ｃｏｌｉ発現株を構築した。具体的には、ＨＤＯ経路遺伝子（遺伝子１２、遺伝子１３）をａｒｓＢの位置に含むＨＤＯ生成株ＢＬ２１＊（ＤＥ３）Δｌｄｈ，ΔａｄｈＥ，ΔｆｒｄＡであり、各遺伝子の発現は、それ自体のＴ７プロモーターによって制御される。残りのＨＤＯ生成経路遺伝子は、上記の実施例に記載されている技法を用いて、下に示されている４つの別々のプラスミドにクローニングした。遺伝子の同一性は、実施例８ａに記載されているとおりであった。Ｅ．ｃｏｌｉベースの２つの発現株を構築した。プラスミド１及びプラスミド２をＥ．ｃｏｌｉにコトランスフォーメーション後、発現株１を得、プラスミド３及びプラスミド４をＥ．ｃｏｌｉにコトランスフォーメーション後、発現株２を得た。
プラスミド１（ＣｏｌＥ１レプリコン、アンピシリンマーカー）：遺伝子４、遺伝子３及び遺伝子１
プラスミド２（Ｐ１５Ａレプリコン、クロラムフェニコールマーカー）：遺伝子５、遺伝子６、遺伝子７、遺伝子８及び遺伝子２
プラスミド３（ＲＳＦレプリコン、カナマイシンマーカー）：遺伝子４及び遺伝子１１
プラスミド４（ＣｏｌＥ１レプリコン、アンピシリンマーカー）：遺伝子９及び遺伝子１０
（ｉｉ）細胞の培養、タンパク質の発現、及びＨＤＯ生成の解析：
発現株ごとに別々に、適切な抗生物質とともに、１０ｍＬのＬＢ培地の入ったチューブで、種母培養液を一晩成長させた。発現株ごとに別々に、ガラス瓶を用いて、１００ｍＬの体積で、発現及びＨＤＯ生成のための細胞培養を行った。複合成長培地を使用し、２ｇ／ＬのＤ－グルコース、０．５ｇ／Ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、及び酵素の発現のために重要なその他の基質／栄養素を添加した。発現株ごとに別々に、誘導前の成長を約２時間、好気性条件下、３０℃で行った。０．２～０．４のＯＤ６００で、２５０μＭのＩＰＴＧとともに、組み換えタンパク質の発現を誘導し、発現株ごとに別々に行った。発現株ごとに別々に、誘導後の発現を３０℃、好気性条件下で３０分行った後、２～３時間、嫌気性条件で行った。その後、両方の発現株由来の細胞を当量で混合し、その後、それらの細胞を回収し、濃縮し、０．５ｍｌの体積、約４０のＯＤ６００で、５～２０ｇ／Ｌのグルコース、２．５～５ｇ／Ｌのグリセロール及び１５ｇ／Ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を含む新鮮な培地に再懸濁させた。２４時間、室温でインキュベート後、細胞を遠心分離し、上清をろ過し、ＨＰＬＣによって解析した。
（ｉｉｉ）ＨＤＯの生成のＨＰＬＣ解析：アイソクラティックＨＰＬＣを用いて、ＨＤＯを検出及び定量した。この方法では、Ｂｉｏ－ＲａｄのＡｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７カラムと、０．７ｍＬ／分の０．５％のギ酸（または５ｍＭの硫酸）を３５℃で用いた。検出は、ＲＩＤ（屈折率検出器）及びＵＶ検出器を用いて行い、ＵＶ検出器は典型的には、２１０ｎｍ、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおけるシグナルを測定する目的で使用した。結果により、１００～５５０ｍｇ／Ｌの１，６－ヘキサンジオールが生成されたことが示された。
実施例９：６－ヒドロキシヘキサノエートを中間体６－ヒドロキシ－２－ケトヘキサノエートから生成するための微生物の調製及び利用
いくつかの実施形態では、本開示は、６ＨＨを調製する技術を提供する。いくつかの実施形態では、生成は、１つの生物で行う。いくつかの実施形態では、生成は、異なる生合成ポリペプチドセットをそれぞれ発現する２つ以上の生物で行う。いくつかの実施形態では、生成は、１つの細菌株で行う。いくつかの実施形態では、生成は、それぞれ独立して１つ以上の生合成反応を行う２つ以上の細菌株で行う。いくつかの実施形態では、培養液は、６ＨＨ生成用の２つ以上の株またはすべての株を含む。いくつかの実施形態では、収量は、約もしくは少なくとも約１０ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、６０ｍｇ／Ｌ、７０ｍｇ／Ｌ、８０ｍｇ／Ｌ、９０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、１５０ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、２５０ｍｇ／Ｌ、３００ｍｇ／Ｌ、３５０ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、４５０ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、６００ｍｇ／Ｌ、７００ｍｇ／Ｌ、８００ｍｇ／Ｌ、９００ｍｇ／Ｌもしくは１０００ｍｇ／Ｌ、または約もしくは少なくとも約１．１ｇ／Ｌ、１．２ｇ／Ｌ、１．３ｇ／Ｌ、１．４ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、１．６ｇ／Ｌ、１．７ｇ／Ｌ、１．８ｇ／Ｌ、１．９ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、２．１ｇ／Ｌ、２．２ｇ／Ｌ、２．３ｇ／Ｌ、２．４ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、２．７ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１６０ｇ／Ｌ、１７０ｇ／Ｌ、１８０ｇ／Ｌ、１９０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、２２０ｇ／Ｌ、２５０ｇ／Ｌもしくは３００ｇ／Ｌの６ＨＨである。６－ヒドロキシヘキサノエート（６ＨＨ）を中間体６－ヒドロキシ－２－ケトヘキサノエートから生成する生合成経路は、図４に示されている。下に示されているのは、この経路による６ＨＨの生成を実証するために、この経路の各工程用に異なる酵素の利用を組み込んだ例である。中間体６－ヒドロキシ－２－ケトヘキサノエートから６ＨＨを生合成する経路の各工程を行うために用いた遺伝子及びその遺伝子からコードされる対応する酵素の例は、表１８に示されている。その表中の各酵素は、同じＥ．Ｃ．クラスに属する相同な酵素で置換してもよい。加えて、下記の実施例には、ＣｏＡ転移反応及び２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ脱水反応の両方を行う複数の酵素が確認されたことが明らかにされている。
（ｉ）６ＨＨ生成用のプラスミドの調製：
下に示されている２つの別々の和合性プラスミドに、６ＨＨの生成経路遺伝子をクローニングした。示されているように、各プラスミドは、異なる複製起点及び異なる抗生物質マーカーを有していた。合成遺伝子を民間の販売業者から入手し、各遺伝子のコドンを、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現用に最適化した。標準的な分子生物学手法を用いて、各遺伝子をそれ自体のＴ７プロモーター及びターミネーターによりクローニングした。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを標的生物として使用して、６ＨＨの生成を操作した。３つのすべてのプラスミドをエレクトロコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１＊（ＤＥ３）Δｌｄｈ，ΔａｄｈＥ，ΔｆｒｄＡにコトランスフォーメーション後、発現株を得た。
プラスミド１（ＣｏｌＥ１レプリコン、アンピシリンマーカー）：遺伝子１、遺伝子２及び遺伝子３（例６及び７のみ）
プラスミド３（Ｐ１５Ａレプリコン、クロラムフェニコールマーカー）：遺伝子４、遺伝子５、遺伝子６及び遺伝子７
Figure 2022530467000109
（ｉｉ）細胞の培養、タンパク質の発現、及び６ＨＨ生成の解析：
適切な抗生物質とともに、１０ｍＬのＬＢ培地の入ったチューブで、種母培養液を一晩成長させた。ガラス瓶を用いて、１００ｍＬの体積で、発現及び６ＨＨ生成のための細胞培養を行った。複合成長培地を使用し、２ｇ／ＬのＤ－グルコース、０．５ｇ／Ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、及び酵素の発現のために重要なその他の基質／栄養素を添加した。誘導前の成長を約２時間、好気性条件下、３０℃で行った。０．２～０．４のＯＤ６００で、２５０μＭのＩＰＴＧとともに、組み換えタンパク質の発現を誘導した。誘導後の発現を３０℃、好気性条件下で６０～９０分行った後、２～３時間、嫌気性条件で行った。その後、細胞を回収し、濃縮し、０．５ｍｌの体積、約４０のＯＤ６００で、約１０ｇ／Ｌのグルコース、６－ヒドロキシ－２－ケトヘキサノエート（５～１０ｇ／Ｌ）及び１５ｇ／Ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を含む新鮮な培地に再懸濁させた。２４時間、室温でインキュベート後、細胞を遠心分離し、上清をろ過し、ＨＰＬＣによって解析した。
（ｉｉｉ）ＨＤＯの生成のＨＰＬＣ解析：アイソクラティックＨＰＬＣを用いて、ＨＤＯを検出及び定量した。この方法では、Ｂｉｏ－ＲａｄのＡｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７カラムと、０．７ｍＬ／分の０．５％のギ酸（または５ｍＭの硫酸）を３５℃で用いた。検出は、ＲＩＤ（屈折率検出器）及びＵＶ検出器を用いて行い、ＵＶ検出器は典型的には、２１０ｎｍ、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおけるシグナルを測定する目的で使用した。結果により、表１８の実施例９Ａ～９Ｇの株から、約０．４～５ｇ／Ｌの６ＨＨが生成されたことが示された。
実施例１０：異なる炭素源から、中間体６－ヒドロキシ－２－ケトヘキサノエートを介して、６－ヒドロキシヘキサン酸（６ＨＨ）を生成するための微生物の調製及び利用
いくつかの実施形態では、本開示は、６ＨＨを調製する技術を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、グリセロールを炭素源として用いて、６ＨＨを生成する技術を提供する。いくつかの実施形態では、生成は、１つの生物で行う。いくつかの実施形態では、生成は、異なる生合成ポリペプチドセットをそれぞれ発現する２つ以上の生物で行う。いくつかの実施形態では、生成は、１つの細菌株で行う。いくつかの実施形態では、生成は、それぞれ独立して１つ以上の生合成反応を行う２つ以上の細菌株で行う。いくつかの実施形態では、培養液は、６ＨＨ生成用の２つ以上の株またはすべての株を含む。いくつかの実施形態では、収量は、約もしくは少なくとも約１０ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、６０ｍｇ／Ｌ、７０ｍｇ／Ｌ、８０ｍｇ／Ｌ、９０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、１５０ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、２５０ｍｇ／Ｌ、３００ｍｇ／Ｌ、３５０ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、４５０ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、６００ｍｇ／Ｌ、７００ｍｇ／Ｌ、８００ｍｇ／Ｌ、９００ｍｇ／Ｌもしくは１０００ｍｇ／Ｌ、または約もしくは少なくとも約１．１ｇ／Ｌ、１．２ｇ／Ｌ、１．３ｇ／Ｌ、１．４ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、１．６ｇ／Ｌ、１．７ｇ／Ｌ、１．８ｇ／Ｌ、１．９ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、２．１ｇ／Ｌ、２．２ｇ／Ｌ、２．３ｇ／Ｌ、２．４ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、２．７ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１６０ｇ／Ｌ、１７０ｇ／Ｌ、１８０ｇ／Ｌ、１９０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、２２０ｇ／Ｌ、２５０ｇ／Ｌもしくは３００ｇ／Ｌである。ピルベート及び３－ヒドロキシプロパナールから、中間体６－ヒドロキシ－２－ケトヘキサノエートを通じて、６ＨＨを生成する生合成経路は、図４に示されている。下に示されているのは、この経路による６ＨＨの生成に、アルドラーゼ－ヒドラターゼベースの二酵素系の利用を組み込んだ例である。ビタミンＢ１２非依存性であるグリセロールデヒドラターゼ酵素、またはＢ１２依存性酵素であるグリセロールデヒドラターゼ酵素をクローニングして、３－ヒドロキシプロピオンアルデヒド（この酵素を用いて、グリセロールから作製できる６ＨＨ経路前駆体）を生成可能にできる。この実施例では、両方のタイプのグリセロールデヒドラターゼを用いたが、表１９に示されている項目では、Ｂ１２非依存性のグリセロールデヒドラターゼ酵素を用いる例を中心としている。この実施例における各酵素は、６ＨＨをもたらすために、同じＥ．Ｃ．クラスに属する相同な酵素で置換してもよく、表１９の実施例１０Ｂ及び１０Ｃ（ＣｏＡ転移反応及び２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ脱水反応の両方を触媒する酵素が、相同な酵素で置換されている）により、このことが示されている。
（ｉ）６ＨＨ生成用のプラスミド及び株の調製：
プラスミドから発現させる６ＨＨ生成経路遺伝子の数を最小限にするために、特定の経路遺伝子がゲノムに組み込まれたＥ．ｃｏｌｉ発現株を構築した。具体的には、６ＨＨ経路遺伝子（遺伝子１２、遺伝子１３）をａｒｓＢの位置に含む６ＨＨ生成株ＢＬ２１＊（ＤＥ３）Δｌｄｈ，ΔａｄｈＥ，ΔｆｒｄＡであり、各遺伝子の発現は、それ自体のＴ７プロモーターによって制御される。残りの６ＨＨ生成経路遺伝子は、上記の実施例記載されている技法を用いて、下に示されている２つの別々のプラスミドにクローニングした。
プラスミド１（ＣｏｌＥ１レプリコン、アンピシリンマーカー）：遺伝子４、遺伝子３及び遺伝子１
プラスミド２（Ｐ１５Ａレプリコン、クロラムフェニコールマーカー）：遺伝子５、遺伝子６、遺伝子７、遺伝子８及び遺伝子２
（ｉｉ）細胞の培養、タンパク質の発現、及び６ＨＨ生成の解析：
発現株ごとに別々に、適切な抗生物質とともに、１０ｍＬのＬＢ培地の入ったチューブで、種母培養液を一晩成長させた。発現株ごとに別々に、ガラス瓶を用いて、１００ｍＬの体積で、発現及びＨＤＯ生成のための細胞培養を行った。複合成長培地を使用し、２ｇ／ＬのＤ－グルコース、０．５ｇ／Ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、及び酵素の発現のために重要なその他の基質／栄養素を添加した。発現株ごとに別々に、誘導前の成長を約２時間、好気性条件下、３０℃で行った。０．２～０．４のＯＤ６００で、２５０μＭのＩＰＴＧとともに、組み換えタンパク質の発現を誘導し、発現株ごとに別々に行った。発現株ごとに別々に、誘導後の発現を３０℃、好気性条件下で３０分行った後、２～３時間、嫌気性条件で行った。その後、細胞を回収し、濃縮し、０．５ｍｌの体積、約４０のＯＤ６００で、５～２０ｇ／Ｌのグルコース、２．５～５ｇ／Ｌのグリセロール及び１５ｇ／Ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を含む新鮮な培地に再懸濁させた。２４時間、室温でインキュベート後、細胞を遠心分離し、上清をろ過し、ＨＰＬＣによって解析した。
Figure 2022530467000110
Figure 2022530467000111
（ｉｉｉ）６ＨＨの生成のＨＰＬＣ解析：アイソクラティックＨＰＬＣを用いて、ＨＤＯを検出及び定量した。この方法では、Ｂｉｏ－ＲａｄのＡｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７カラムと、０．７ｍＬ／分の０．５％のギ酸（または５ｍＭの硫酸）を３５℃で用いた。検出は、ＲＩＤ（屈折率検出器）及びＵＶ検出器を用いて行い、ＵＶ検出器は典型的には、２１０ｎｍ、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおけるシグナルを測定する目的で使用した。結果により、表１９の実施例１０Ａ～１０Ｃの株から、約５０～８００ｍｇ／Ｌの６ＨＨが生成されたことが示された。代替的な実施例は、Ｂ１２非依存性のグリセロールデヒドラターゼの代わりに、Ｂ１２依存性のグリセロールデヒドラターゼｐｄｕＣＤＥＧＨ（ＣＯＬＡレプリコン、カナマイシンマーカーを有する第３のプラスミドで、単一の遺伝子オペロンとしてコードされる）を用いたものであり、その経路の残りの酵素は、実施例１０Ａと同じであった。実施例５で、Ｂ１２依存性酵素を含む株ＰｅＤＯ３及びＰｅＤＯ４において記載されている培養条件を用いたところ、上記のような系でも、約３５０ｍｇ／Ｌの６ＨＨが生成された。
実施例１１：アジピン酸（ＡＡ）を中間体６－ヒドロキシヘキサノエート（６ＨＨ）から生成するための微生物の調製及び利用
いくつかの実施形態では、本開示は、ＡＡを調製する技術を提供する。いくつかの実施形態では、収量は、約もしくは少なくとも約１０ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、６０ｍｇ／Ｌ、７０ｍｇ／Ｌ、８０ｍｇ／Ｌ、９０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、１５０ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、２５０ｍｇ／Ｌ、３００ｍｇ／Ｌ、３５０ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、４５０ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、６００ｍｇ／Ｌ、７００ｍｇ／Ｌ、８００ｍｇ／Ｌ、９００ｍｇ／Ｌもしくは１０００ｍｇ／Ｌ、または約もしくは少なくとも約１．１ｇ／Ｌ、１．２ｇ／Ｌ、１．３ｇ／Ｌ、１．４ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、１．６ｇ／Ｌ、１．７ｇ／Ｌ、１．８ｇ／Ｌ、１．９ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、２．１ｇ／Ｌ、２．２ｇ／Ｌ、２．３ｇ／Ｌ、２．４ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、２．７ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１６０ｇ／Ｌ、１７０ｇ／Ｌ、１８０ｇ／Ｌ、１９０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、２２０ｇ／Ｌ、２５０ｇ／Ｌもしくは３００ｇ／Ｌである。ピルベート及び３－ヒドロキシプロパナールから、中間体６－ヒドロキシヘキサノエートを通じて、ＡＡを生成する生合成経路は、図５に示されている、表２０に示されているのは、６ＨＨをＡＡに変換可能にする酵素の例である。この実施例における各酵素は、ＡＡを生成するために、同じＥ．Ｃクラスに属する相同な酵素で置換できることに留意することが重要である。
Figure 2022530467000112
（ｉ）ＡＡを６ＨＨから生成するためのプラスミド及び株の調製：下に示されている単一のプラスミドにおいて、上記の実施例に記載されている技法を用いて、ＡＡ生成経路遺伝子をクローニングした。ＢＬ２１＊（ＤＥ３）Δｌｄｈ，ΔａｄｈＥ，ΔｆｒｄＡを産生株として使用した。
プラスミド１（ＣｏｌＥ１レプリコン、アンピシリンマーカー）：遺伝子１及び遺伝子２
（ｉｉ）細胞の培養、タンパク質の発現、及びＡＡ生成の解析：発現株ごとに別々に、適切な抗生物質とともに、１０ｍＬのＬＢ培地の入ったチューブで、種母培養液を一晩成長させた。発現株ごとに別々に、ガラス瓶を用いて、１００ｍＬの体積で、発現及びＡＡ生成のための細胞培養を行った。複合成長培地を使用し、２ｇ／ＬのＤ－グルコース、０．５ｇ／Ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、及び酵素の発現のために重要なその他の基質／栄養素を添加した。発現株ごとに別々に、誘導前の成長を約２時間、好気性条件下、３０℃で行った。０．２～０．４のＯＤ６００で、２５０μＭのＩＰＴＧとともに、組み換えタンパク質の発現を誘導し、発現株ごとに別々に行った。発現株ごとに別々に、誘導後の発現を３０℃、好気性条件下で３０～１２０分行った後、２～３時間、嫌気性条件で行った。その後、細胞を回収し、濃縮し、０．５ｍｌの体積、約４０のＯＤ６００で、５～１０ｇ／Ｌのグルコース、５ｇ／Ｌの６ＨＨ及び１５ｇ／Ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を含む新鮮な培地に再懸濁させた。３時間、室温でインキュベート後、細胞を遠心分離し、上清をろ過し、ＨＰＬＣによって解析した。
（ｉｉｉ）ＡＡの生成のＨＰＬＣ解析：アイソクラティックＨＰＬＣを用いて、ＡＡを検出及び定量した。この方法では、Ｂｉｏ－ＲａｄのＡｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７カラムと、０．７ｍＬ／分の０．５％のギ酸（または５ｍＭの硫酸）を３５℃で用いた。検出は、ＲＩＤ（屈折率検出器）及びＵＶ検出器を用いて行い、ＵＶ検出器は典型的には、２１０ｎｍ、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおけるシグナルを測定する目的で使用した。結果により、表２０の実施例１１Ａ及び１１Ｂにおいて、５００～１５００ｍｇ／ＬのＡＡが生成されたことが示された。
実施例１２：アジピン酸（ＡＡ）を中間体６－ヒドロキシ－２－ケトヘキサノエートから生成するための微生物の調製及び利用
いくつかの実施形態では、本開示は、ＡＡを６Ｈ２ＫＨから調製する技術を提供する。いくつかの実施形態では、収量は、約もしくは少なくとも約１０ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、６０ｍｇ／Ｌ、７０ｍｇ／Ｌ、８０ｍｇ／Ｌ、９０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、１５０ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、２５０ｍｇ／Ｌ、３００ｍｇ／Ｌ、３５０ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、４５０ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、６００ｍｇ／Ｌ、７００ｍｇ／Ｌ、８００ｍｇ／Ｌ、９００ｍｇ／Ｌもしくは１０００ｍｇ／Ｌ、または約もしくは少なくとも約１．１ｇ／Ｌ、１．２ｇ／Ｌ、１．３ｇ／Ｌ、１．４ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、１．６ｇ／Ｌ、１．７ｇ／Ｌ、１．８ｇ／Ｌ、１．９ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、２．１ｇ／Ｌ、２．２ｇ／Ｌ、２．３ｇ／Ｌ、２．４ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、２．７ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１６０ｇ／Ｌ、１７０ｇ／Ｌ、１８０ｇ／Ｌ、１９０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、２２０ｇ／Ｌ、２５０ｇ／Ｌもしくは３００ｇ／Ｌである。ピルベート及び３－ヒドロキシプロパナールから、中間体６－ヒドロキシ－２－ケトヘキサノエートを通じて、ＡＡを生成する生合成経路は、図５に示されている。下に示されているのは、この経路によるＡＡの生成を実証するために、この経路の各工程用に異なる酵素の利用を組み込んだ例である。中間体６－ヒドロキシ－２－ケトヘキサノエートからＡＡを生合成する経路の各工程を行うために用いた遺伝子及びその遺伝子からコードされる対応する酵素の例は、下記の表２１に示されている。その表中の各酵素は、同じＥ．Ｃ．クラスに属する相同な酵素で置換してもよい。表２１の実施例１２Ａ及び１２Ｂには、この経路によるＡＡの生成を成功可能にするように、ＣｏＡ転移反応及び２，６－ジヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ脱水反応の両方を行う複数の酵素が確認されたことが明らかにされている。
（ｉ）６－ヒドロキシ－２－ケトヘキサノエートからＡＡを生成するためのプラスミド及び株の調製：下に示されている２つの別々の和合性プラスミドに、ＡＡ生成経路遺伝子をクローニングした。示されているように、各プラスミドは、異なる複製起点及び異なる抗生物質マーカーを有していた。合成遺伝子を民間の販売業者から入手し、各遺伝子のコドンを、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現用に最適化した。標準的な分子生物学手法を用いて、各遺伝子をそれ自体のＴ７プロモーター及びターミネーターによりクローニングした。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを標的生物として使用して、６ＨＨの生成を操作した。両方のプラスミドをエレクトロコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５（ＤＥ３）ｒｎｅ１３１ ΔｌｄｈＡ ΔａｄｈＥ ΔｆｒｄＢＣにコトランスフォーメーション後、発現株を得た。
プラスミド１（ＣｏｌＥ１レプリコン、アンピシリンマーカー）：遺伝子３、遺伝子４、遺伝子９及び遺伝子１０
プラスミド３（Ｐ１５Ａレプリコン、クロラムフェニコールマーカー）：遺伝子５、遺伝子６、遺伝子７及び遺伝子８
（ｉｉ）細胞の培養、タンパク質の発現、及びＡＡ生成の解析：（実施例１１で用いた６ＨＨの代わりに）１０ｇ／Ｌの６－ヒドロキシ－２－ケトヘキサノエートを基質として用いたのを除き、実施例１１と同じである。
（ｉｉｉ）ＡＡの生成のＨＰＬＣ解析：上記のようにして、アイソクラティックＨＰＬＣを用いて、ＡＡを検出及び定量した。結果により、表２１の実施例１２Ａ～１２Ｃにおいて、１００～８００ｍｇ／ＬのＡＡが生成されたことが示された。
Figure 2022530467000113
実施例１３：異なる炭素源から、中間体６－ヒドロキシ－２－ケトヘキサノエートを介して、アジピン酸（ＡＡ）を生成するための微生物の調製及び利用
いくつかの実施形態では、本開示は、ＡＡを調製する技術を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、３ＨＰＡ及びピルベートを用いて、ＡＡを生成する技術を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、グリセロールを炭素源として用いて、ＡＡを生成する技術を提供する。いくつかの実施形態では、生成は、１つの生物で行う。いくつかの実施形態では、生成は、異なる生合成ポリペプチドセットをそれぞれ発現する２つ以上の生物で行う。いくつかの実施形態では、生成は、１つの細菌株で行う。いくつかの実施形態では、生成は、それぞれ独立して１つ以上の生合成反応を行う２つ以上の細菌株で行う。いくつかの実施形態では、培養液は、ＡＡ生成用の２つ以上の株またはすべての株を含む。いくつかの実施形態では、収量は、約もしくは少なくとも約１０ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、６０ｍｇ／Ｌ、７０ｍｇ／Ｌ、８０ｍｇ／Ｌ、９０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、１５０ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、２５０ｍｇ／Ｌ、３００ｍｇ／Ｌ、３５０ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、４５０ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、６００ｍｇ／Ｌ、７００ｍｇ／Ｌ、８００ｍｇ／Ｌ、９００ｍｇ／Ｌもしくは１０００ｍｇ／Ｌ、または約もしくは少なくとも約１．１ｇ／Ｌ、１．２ｇ／Ｌ、１．３ｇ／Ｌ、１．４ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、１．６ｇ／Ｌ、１．７ｇ／Ｌ、１．８ｇ／Ｌ、１．９ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、２．１ｇ／Ｌ、２．２ｇ／Ｌ、２．３ｇ／Ｌ、２．４ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、２．７ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１６０ｇ／Ｌ、１７０ｇ／Ｌ、１８０ｇ／Ｌ、１９０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、２２０ｇ／Ｌ、２５０ｇ／Ｌもしくは３００ｇ／Ｌである。ピルベート及び３－ヒドロキシプロパナールから、中間体６－ヒドロキシ－２－ケトヘキサノエートを通じて、ＡＡを生成する生合成経路は、図５に示されている。下に示されているのは、この経路によるＡＡの生成に、アルドラーゼ－ヒドラターゼベースの二酵素系の利用を組み込んだ例である。ビタミンＢ１２非依存性であるグリセロールデヒドラターゼ酵素、またはＢ１２依存性酵素であるグリセロールデヒドラターゼ酵素をクローニングして、３－ヒドロキシプロピオンアルデヒド（この酵素を用いて、グリセロールから作製できる６ＨＨ経路前駆体）を生成可能にできる。この実施例では、Ｂ１２依存性グリセロールデヒドラターゼを使用した。ＡＡ生合成経路の各工程、及び３－ヒドロキシプロピオンアルデヒドの生成を行うために用いた遺伝子及びその遺伝子がコードする対応する酵素の例は、表２２に示されている。その表中の各酵素は、同じＥ．Ｃ．クラスに属する相同な酵素で置換してもよい。
Figure 2022530467000114
Figure 2022530467000115
（ｉ）ＡＡ生成用のプラスミド及び株の調製：
プラスミドから発現させるＡＡ生成経路遺伝子の数を最小限にするために、特定の経路遺伝子がゲノムに組み込まれたＥ．ｃｏｌｉ発現株を構築した。具体的には、経路遺伝子（遺伝子１２、遺伝子１３）をａｒｓＢの位置に含むＡＡ生成株ＢＬ２１＊（ＤＥ３）Δｌｄｈ，ΔａｄｈＥ，ΔｆｒｄＡであり、各遺伝子の発現は、それ自体のＴ７プロモーターによって制御される。Ｅ．ｃｏｌｉベースの２つの発現株を構築した。プラスミド１及びプラスミド２をＥ．ｃｏｌｉにコトランスフォーメーション後、発現株１を得、プラスミド３をＥ．ｃｏｌｉにトランスフォーメーション後、発現株２を得た。
プラスミド１（ＣｏｌＥ１レプリコン、アンピシリンマーカー）：遺伝子４、遺伝子３及び遺伝子１
プラスミド２（Ｐ１５Ａレプリコン、クロラムフェニコールマーカー）：遺伝子５、遺伝子６、遺伝子７、遺伝子８及び遺伝子２
プラスミド３（ＣｏｌＥ１レプリコン、アンピシリンマーカー）：遺伝子９、遺伝子１０及び遺伝子３
（ｉｉ）細胞の培養、タンパク質の発現、及びＡＡ生成の解析：
発現株ごとに別々に、適切な抗生物質とともに、１０ｍＬのＬＢ培地の入ったチューブで、種母培養液を一晩成長させた。発現株ごとに別々に、ガラス瓶を用いて、１００ｍＬの体積で、発現及びＡＡ生成のための細胞培養を行った。複合成長培地を使用し、２ｇ／ＬのＤ－グルコース、０．５ｇ／Ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、及び酵素の発現のために重要なその他の基質／栄養素を添加した。発現株ごとに別々に、誘導前の成長を約２時間、好気性条件下、３０℃で行った。０．２～０．４のＯＤ６００で、２５０μＭのＩＰＴＧとともに、組み換えタンパク質の発現を誘導し、発現株ごとに別々に行った。発現株ごとに別々に、誘導後の発現を３０℃、好気性条件下で３０分行った後、２～３時間、嫌気性条件で行った。その後、細胞を回収し、濃縮し、０．５ｍｌの体積、約４０のＯＤ６００で、５～２０ｇ／Ｌのグルコース、２．５～５ｇ／Ｌのグリセロール及び１５ｇ／Ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を含む新鮮な培地に再懸濁させた。２４時間、室温でインキュベート後、細胞を遠心分離し、上清をろ過し、ＨＰＬＣによって解析した。
（ｉｉｉ）ＡＡの生成のＨＰＬＣ解析：アイソクラティックＨＰＬＣを用いて、ＡＡを検出及び定量した。この方法では、Ｂｉｏ－ＲａｄのＡｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７カラムと、０．７ｍＬ／分の０．５％のギ酸（または５ｍＭの硫酸）を３５℃で用いた。検出は、ＲＩＤ（屈折率検出器）及びＵＶ検出器を用いて行い、ＵＶ検出器は典型的には、２１０ｎｍ、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおけるシグナルを測定する目的で使用した。結果により、２０～３５０ｍｇ／ＬのＡＡが生成されたことが示された。
実施例１４：６－ヒドロキシヘキサノエートの複数株及び複数ポットでの生成
いくつかの実施形態では、生成物、例えば６ＨＨの生成は、１つの株で行う。いくつかの実施形態では、生成は、２つ以上の株で行う。いくつかの実施形態では、その２つ以上の株は合わさって、生成の際に利用されるすべての生合成ポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、一方の株における生合成ポリペプチドの生成物は、もう一方の株の生合成ポリペプチドの基質である。いくつかの実施形態では、一方の株の２つ以上の生合成ポリペプチドの生成物は独立して、１つ以上の別の株における２つ以上の生合成ポリペプチドの基質である。いくつかの実施形態では、収量は、約もしくは少なくとも約１０ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、６０ｍｇ／Ｌ、７０ｍｇ／Ｌ、８０ｍｇ／Ｌ、９０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、１５０ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、２５０ｍｇ／Ｌ、３００ｍｇ／Ｌ、３５０ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、４５０ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、６００ｍｇ／Ｌ、７００ｍｇ／Ｌ、８００ｍｇ／Ｌ、９００ｍｇ／Ｌもしくは１０００ｍｇ／Ｌ、または約もしくは少なくとも約１．１ｇ／Ｌ、１．２ｇ／Ｌ、１．３ｇ／Ｌ、１．４ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、１．６ｇ／Ｌ、１．７ｇ／Ｌ、１．８ｇ／Ｌ、１．９ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、２．１ｇ／Ｌ、２．２ｇ／Ｌ、２．３ｇ／Ｌ、２．４ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、２．７ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１６０ｇ／Ｌ、１７０ｇ／Ｌ、１８０ｇ／Ｌ、１９０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、２２０ｇ／Ｌ、２５０ｇ／Ｌもしくは３００ｇ／Ｌの６－ヒドロキシヘキサノエートである。
上記の実施例１０には、１つのＥ．ｃｏｌｉ株での６ＨＨの生成が記載されており、その場合、ピルベート及び３－ヒドロキシプロパナールの変換（ならびにグリセロールからのその生成）に必要なすべての生合成経路酵素が、いずれも１つのＥ．ｃｏｌｉ株で同時に発現される。いくつかの実施形態では、複数株のアプローチを追及するのが有益である場合があり、このアプローチでは、生合成経路全体を規模のより小さいセクション（モジュールという）に分割し、各モジュールは、その生合成経路の酵素のうち、そのモジュール特有のＥ．ｃｏｌｉ株で発現する一連の逐次的酵素を含む。例えば、６ＨＨ生合成経路全体を２つのモジュールに分割することが可能であることが示された。具体的には、上記の実施例３に記載されているのは、第１のモジュールの構築であり、それにより、１つのＥ．ｃｏｌｉ株で６ＨＨ生合成経路の中間体である６－ヒドロキシ－２－ケトヘキサノエートを生成可能になり、ピルベート及び３－ヒドロキシプロパナールの変換（及びグリセロールからのその生成）に必要なすべての酵素がすべて、１つのＥ．ｃｏｌｉ株で同時に発現される。上記の実施例９に記載されているのは、第２のモジュールの構築であり、それにより、第２の（別の）Ｅ．ｃｏｌｉ株で６－ヒドロキシ－２－ケトヘキサノエートから６ＨＨを生成可能になり、６－ヒドロキシ－２－ケトヘキサノエートの６ＨＨへの変換に必要なすべての酵素がいずれも、この１つのＥ．ｃｏｌｉ株で同時に発現される。両方のモジュールを用いることで、２つの別個のＥ．ｃｏｌｉ株で６ＨＨを生成させる完全な生合成経路が得られる。このような複数株のアプローチは、以下に限らないが、ａ）上記のような広範な生合成経路を開発するために、プラスミドを構築及び試験することで、大規模なライブラリーを得ることができ、機能的な（または最良の）遺伝子コンストラクトについてスクリーニングする従来の総当たり的な方法が、非効率かつ高価となり得る、ｂ）経路全体にわたり、酵素の発現が簡略化され、その発現のバランスが取られることで、開発サイクルを実質的に高速化し得る、ｃ）（１つの株を最適化しても、経路全体においては効率的ではない場合があるため、）別個のモジュールごとに、Ｅ．ｃｏｌｉ株の遺伝的背景をカスタマイズして、モジュールごとに、酸化還元、ＡＴＰ、及び生成を最大化するためのその他のニーズに合わせられるといった多くの理由から、有益であり得る。下記の表２３まとめられている結果から、同時に（すなわち、１つのポットで）、または逐次的な生成方法によるかのいずれかで、６ＨＨを生成する際に、この複数株のアプローチを用いることが有効であることが示されている。
Figure 2022530467000116
（ｉ）６ＨＨ生成用のプラスミド及び株の調製：
６ＨＨ生合成経路全体を上記のように、２つのＥ．ｃｏｌｉ株（すなわちモジュール）に分割した。２つのＥ．ｃｏｌｉベースの発現株を構築した。プラスミド１及びプラスミド２をＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５（ＤＥ３）ｒｎｅ１３１ ΔｌｄｈＡ ΔａｄｈＥ ΔｆｒｄＢＣ ΔｐｏｘＢ ΔｐｆｌＢ ΔａｃｋＡ－ｐｔａ ΔｙｑｈＤ，ΔａｄｈＰ，ΔｅｕｔＧ，ΔｇｌｄＡ，ΔｙｉａＹ，ΔｆｕｃＯにコトランスフォーメーション後、発現株１を得、プラスミド３及び４をＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５（ＤＥ３）ｒｎｅ１３１ ΔｌｄｈＡ ΔａｄｈＥ ΔｆｒｄＢＣにトランスフォーメーション後、発現株２を得た。
プラスミド１（ＣｏｌＥ１レプリコン、アンピシリンマーカー）：遺伝子１、遺伝子２及び遺伝子１
プラスミド２（Ｐ１５Ａレプリコン、クロラムフェニコールマーカー）：遺伝子９
プラスミド３（ＣｏｌＥ１レプリコン、アンピシリンマーカー）：遺伝子４
プラスミド４（Ｐ１５Ａレプリコン、クロラムフェニコールマーカー）：遺伝子５、遺伝子６、遺伝子７、遺伝子８及び遺伝子３
（ｉｉ）細胞の培養、タンパク質の発現、及び６ＨＨ生成の解析：
発現株ごとに別々に、適切な抗生物質とともに、１０ｍＬのＬＢ培地の入ったチューブで、種母培養液を一晩成長させた。発現株ごとに別々に、ガラス瓶を用いて、１００ｍＬの体積で、発現及び６ＨＨ生成のための細胞培養を行った。複合成長培地を使用し、２ｇ／ＬのＤ－グルコース、０．５ｇ／Ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、及び酵素の発現のために重要なその他の基質／栄養素を添加した。発現株ごとに別々に、誘導前の成長を約２時間、好気性条件下、３０℃で行った。０．２～０．４のＯＤ６００で、２５０μＭのＩＰＴＧとともに、組み換えタンパク質の発現を誘導し、発現株ごとに別々に行った。発現株ごとに別々に、誘導後の発現を３０℃、好気性条件下で３０分行った後、２～３時間、嫌気性条件で行った。その後、両方の発現株に由来する細胞を回収し、濃縮し、０．５ｍｌの体積、約４０のＯＤ６００で再懸濁させた。実施例１４Ａでは、５～２０ｇ／Ｌのグルコース、２．５～５ｇ／Ｌのグリセロール及び１５ｇ／Ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を含む培地に、両方の株に由来する細胞を同数、再懸濁させた。２４時間、室温でインキュベート後、細胞を遠心分離し、上清をろ過し、ＨＰＬＣによって解析した。実施例１４Ｂでは、５～２０ｇ／Ｌのグルコース、２．５～５ｇ／Ｌのグリセロール及び１５ｇ／Ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を含む培地に、発現株１に由来する細胞を懸濁させた。２４時間、室温でインキュベート後、細胞を遠心分離し、上清をろ過し、発現株２に由来する細胞と混合した。２４時間、室温でインキュベート後、細胞を遠心分離し、上清をろ過し、ＨＰＬＣによって解析した。
（ｉｉｉ）６ＨＨの生成のＨＰＬＣ解析：このＨＰＬＣ解析は、上述のようにして行った。結果により、３５０～１１００ｍｇ／Ｌの６ＨＨが生成されたことが示された。
実施例１５：１，６－ヘキサンジオールの複数株及び複数ポットでの生成
いくつかの実施形態では、本開示は、ＨＤＯを調製する技術を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＨＤＯを３ＨＰＡ及びピルベートから生成する技術を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、グリセロールを炭素源として用いて、ＨＤＯを生成する技術を提供する。いくつかの実施形態では、生成は、１つの生物で行う。いくつかの実施形態では、生成は、異なる生合成ポリペプチドセットをそれぞれ発現する２つ以上の生物で行う。いくつかの実施形態では、生成は、１つの細菌株で行う。いくつかの実施形態では、生成は、それぞれ独立して１つ以上の生合成反応を行う２つ以上の細菌株で行う。いくつかの実施形態では、培養液は、ＨＤＯ生成用の２つ以上の株またはすべての株を含む。いくつかの実施形態では、収量は、約もしくは少なくとも約１０ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、６０ｍｇ／Ｌ、７０ｍｇ／Ｌ、８０ｍｇ／Ｌ、９０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、１５０ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、２５０ｍｇ／Ｌ、３００ｍｇ／Ｌ、３５０ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、４５０ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、６００ｍｇ／Ｌ、７００ｍｇ／Ｌ、８００ｍｇ／Ｌ、９００ｍｇ／Ｌもしくは１０００ｍｇ／Ｌ、または約もしくは少なくとも約１．１ｇ／Ｌ、１．２ｇ／Ｌ、１．３ｇ／Ｌ、１．４ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、１．６ｇ／Ｌ、１．７ｇ／Ｌ、１．８ｇ／Ｌ、１．９ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、２．１ｇ／Ｌ、２．２ｇ／Ｌ、２．３ｇ／Ｌ、２．４ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、２．７ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１６０ｇ／Ｌ、１７０ｇ／Ｌ、１８０ｇ／Ｌ、１９０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、２２０ｇ／Ｌ、２５０ｇ／Ｌもしくは３００ｇ／Ｌである。上記の実施例８には、１つまたは２つのＥ．ｃｏｌｉ株でのＨＤＯの生成が記載されており、その場合、ピルベート及び３－ヒドロキシプロパナールの変換（ならびにグリセロールからのその生成）に必要なすべての生合成経路酵素はいずれも、１つのＥ．ｃｏｌｉ株または２つの別々のＥ．ｃｏｌｉ株で同時に発現される。このような複数株のアプローチは、実施例１４で述べた多くの理由から、有益であり得る。表２４にまとめられている結果から、同時に（すなわち、１つのポットで）、または逐次的な生成方法によるかのいずれかで、ＨＤＯを生成する際に、この複数株のアプローチを用いることが、この場合にも有効であることが示されている。
Figure 2022530467000117
（ｉ）ＨＤＯ生成用のプラスミド及び株の調製：
ＨＤＯ生合成経路全体を上記のように、２つのＥ．ｃｏｌｉ株（すなわちモジュール）に分割した。２つのＥ．ｃｏｌｉベースの発現株を構築した。プラスミド１及びプラスミド２をＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５（ＤＥ３）ｒｎｅ１３１ ΔｌｄｈＡ ΔａｄｈＥ ΔｆｒｄＢＣ ΔｐｏｘＢ ΔｐｆｌＢ ΔａｃｋＡ－ｐｔａ ΔｙｑｈＤ，ΔａｄｈＰ，ΔｅｕｔＧ，ΔｇｌｄＡ，ΔｙｉａＹ，ΔｆｕｃＯにコトランスフォーメーション後、発現株１を得、プラスミド３及び４をＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５（ＤＥ３）ｒｎｅ１３１ ΔｌｄｈＡ ΔａｄｈＥ ΔｆｒｄＢＣにトランスフォーメーション後、発現株２を得た。
プラスミド１（ＣｏｌＥ１レプリコン、アンピシリンマーカー）：遺伝子１、遺伝子２及び遺伝子１
プラスミド２（Ｐ１５Ａレプリコン、クロラムフェニコールマーカー）：遺伝子１２
プラスミド３（ＣｏｌＥ１レプリコン、アンピシリンマーカー）：遺伝子３、遺伝子９、遺伝子４、遺伝子１１及び遺伝子１０
プラスミド４（Ｐ１５Ａレプリコン、クロラムフェニコールマーカー）：遺伝子５、遺伝子６、遺伝子７、遺伝子８及び遺伝子４
（ｉｉ）細胞の培養、タンパク質の発現、及びＨＤＯ生成の解析：
発現株ごとに別々に、適切な抗生物質とともに、１０ｍＬのＬＢ培地の入ったチューブで、種母培養液を一晩成長させた。発現株ごとに別々に、ガラス瓶を用いて、１００ｍＬの体積で、発現及び６ＨＨ生成のための細胞培養を行った。複合成長培地を使用し、２ｇ／ＬのＤ－グルコース、０．５ｇ／Ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、及び酵素の発現のために重要なその他の基質／栄養素を添加した。発現株ごとに別々に、誘導前の成長を約２時間、好気性条件下、３０℃で行った。０．２～０．４のＯＤ６００で、２５０μＭのＩＰＴＧとともに、組み換えタンパク質の発現を誘導し、発現株ごとに別々に行った。発現株ごとに別々に、誘導後の発現を３０℃、好気性条件下で３０分行った後、２～３時間、嫌気性条件で行った。その後、両方の発現株に由来する細胞を回収し、濃縮し、０．５ｍｌの体積、約４０のＯＤ６００で再懸濁させた。実施例１５Ａでは、５～２０ｇ／Ｌのグルコース、２．５～５ｇ／Ｌのグリセロール及び１５ｇ／Ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を含む培地に、両方の株に由来する細胞を同数、再懸濁させた。２４時間、室温でインキュベート後、細胞を遠心分離し、上清をろ過し、ＨＰＬＣによって解析した。実施例１５Ｂでは、５～２０ｇ／Ｌのグルコース、２．５～５ｇ／Ｌのグリセロール及び１５ｇ／Ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を含む培地に、発現株１に由来する細胞を懸濁させた。２４時間、室温でインキュベート後、細胞を遠心分離し、上清をろ過し、発現株２に由来する細胞と混合した。２４時間、室温でインキュベート後、細胞を遠心分離し、上清をろ過し、ＨＰＬＣによって解析した。
（ｉｉｉ）ＨＤＯの生成のＨＰＬＣ解析：このＨＰＬＣ解析は、上述のようにして行った。結果により、４００～８００ｍｇ／ＬのＨＤＯが生成されたことが示された。
実施例１６：３－ヒドロキシプロパナールのグリセロールからの合成
グリセロールデヒドラターゼを用いて、３－ヒドロキシプロパナールをグリセロールから合成する。グリセロールデヒドラターゼは、コエンザイムＢ１２依存性またはコエンザイムＢ１２非依存性の形で、再活性化剤タンパク質の存在下で、脱水を触媒できる。コエンザイムＢ１２依存性デヒドラターゼは、大サブユニット、すなわち「α」サブユニット、中サブユニット、すなわち「β」サブユニット、及び小サブユニット、すなわち「γ」サブユニットという３つのサブユニットで構成されている。これらのサブユニットは、α２β２γ２の構造で組み合わさって、アポ酵素を形成する。コエンザイムＢ１２（活性な補因子種）が、そのアポ酵素に結合して、触媒活性を持つホロ酵素を形成する。触媒活性には、コエンザイムＢ１２が必要とされる。コエンザイムＢ１２は、触媒作用を起こすラジカルメカニズムに関与するからである。生化学的には、コエンザイムＢ１２依存性グリセロール及びコエンザイムＢ１２依存性ジオールデヒドラターゼのいずれも、グリセロール及びその他の基質による、メカニズムベースの自殺失活が起きることが知られている（Ｄａｎｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２２：５５３－５６６（１９９９）、Ｓｅｉｆｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８：２３６９－２３７８（２００１））。失活は、デヒドラターゼ再活性化因子に依存して、デヒドラターゼ活性を回復させることによって解消することができる（Ｔｏｒａｙａ ａｎｄ Ｍｏｒｉ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３３７２（１９９９）及びＴｏｂｉｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａ １８１：４１１０（１９９９））。デヒドラターゼの再活性化プロセス及びコエンザイムＢ１２再生プロセスのいずれも、ＡＴＰを必要とする。下に示されているのは、グリセロールデヒドラターゼ、ジオールデヒドラターゼ及び再活性化因子のいくつかの例である。Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはそれらの株のグリセロールデヒドラターゼ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａまたはＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのジオールデヒドラターゼ、及び下記の表２５に列挙されているＥ．Ｃ．群に属するその他のデヒドラターゼ酵素またはこれらの配列の相同な酵素を用いても、この工程を実施できることを当業者は認識するであろう。これらの酵素の変異体（米国特許第８４４５６５９号及び同第７４１０７５４号）を本発明で用いても、プロセス効率を上昇できる。特に、工業的プロセスでは、ビタミンＢ１２のコストの高さから、コエンザイムＢ１２非依存性デヒドラターゼ（Ｒａｙｎａｕｄ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，５０１０－５０１５（２００３））が好ましい。
Figure 2022530467000118
実施例１７：ピルベートの合成
糖のピルベートへの変換
解糖による、糖のピルベートへの変換は、よく知られている。解糖では、グルコース１モル当たり、２モルのＡＴＰ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの形態での２モルの還元対応物、及び２モルのピルベートが得られる。
グリセロールのピルベートへの変換
嫌気的及び微好気的の両方で、グリセロールを解糖中間体に変換できる。嫌気的に、グリセロールを脱水素化させて、ジヒドロキシアセトンにし、そのジヒドロキシアセトンは、（ホスホエノールピルベートまたはＡＴＰを用いて）リン酸化後、ジヒドロキシアセトンリン酸（解糖経路中間体）に変換する（Ｄｈａｒｍａｄｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９４：８２１－８２９（２００６））。グリセロールを変換するための呼吸経路には、グリセロールを（ＡＴＰによって）リン酸化した後、酸化して（電子受容体としてのキノン）、ジヒドロキシアセトンリン酸（解糖によって、ピルベートに変換できる）をもたらすことが含まれる（Ｂｏｏｔｈ ＩＲ．Ｇｌｙｃｅｒｏｌ ａｎｄ ｍｅｔｈｙｌｇｌｙｏｘａｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ ＦＣ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｉｎ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（ｗｅｂ ｅｄｉｔｉｏｎ）．２００５，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ、Ｄｕｒｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．１０３（１）：１４８－１６１（２００９））。
実施例１８：２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを中間体６－ヒドロキシ－２－ケトヘキサノエートから生成するための微生物の調製及び利用
いくつかの実施形態では、本開示は、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを６－ヒドロキシ－２－ケトヘキサノエートから生成する技術を提供する。特定の例が、下に記載されている。
図４に示されているのは、２，６－ジヒドロキシヘキサノエート（６Ｈ２ＨＨ）を中間体６－ヒドロキシ－２－ケトヘキサノエートから生成する生合成経路である。下に示されているのは、６Ｈ２ＫＨを６Ｈ２ＨＨ、すなわち６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート２－レダクターゼに還元するのに、異なる２－ケトレダクターゼ酵素の利用を組み込んだ例である。この工程に用いた遺伝子及びその遺伝子がコードする対応する酵素の例は、表２６に示されている。その表中の各酵素は、同じＥ．Ｃ．クラスに属する相同な酵素で置換してもよい。
（ｉ）６Ｈ２ＨＨ生成用のプラスミドの調製：
６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート２－レダクターゼをコードする遺伝子をプラスミドにクローニングし、発現は、標準的な分子生物学手法を用いて、Ｔ７プロモーターによって駆動させた。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを標的生物として使用して、６Ｈ２ＨＨの生成を操作した。３つのすべてのプラスミドをエレクトロコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１＊（ＤＥ３）Δｌｄｈにコトランスフォーメーション後、発現株を得た。
Figure 2022530467000119
（ｉｉ）細胞の培養、タンパク質の発現、及び６Ｈ２ＨＨ生成の解析：
適切な抗生物質とともに、１０ｍＬのＬＢ培地の入ったチューブで、種母培養液を一晩成長させた。ガラス瓶を用いて、１００ｍＬの体積で、発現及び６Ｈ２ＨＨ生成のための細胞培養を行った。複合成長培地を使用し、２ｇ／ＬのＤ－グルコース、０．５ｇ／Ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、及び酵素の発現のために重要なその他の基質／栄養素を添加した。誘導前の成長を約２時間、好気性条件下、３０℃で行った。０．２～０．４のＯＤ６００で、２５０μＭのＩＰＴＧとともに、組み換えタンパク質の発現を誘導した。誘導後の発現を３０℃、好気性条件下で６０～９０分行った後、２～３時間、嫌気性条件で行った。その後、細胞を回収し、濃縮し、０．５ｍｌの体積、約４０のＯＤ６００で、約１０ｇ／Ｌのグルコース、６－ヒドロキシ－２－ケトヘキサノエート（５～１０ｇ／Ｌ）及び１５ｇ／Ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を含む新鮮な培地に再懸濁させた。２４時間、室温でインキュベート後、細胞を遠心分離し、上清をろ過し、ＨＰＬＣによって解析した。
（ｉｉｉ）６Ｈ２ＨＨの生成のＨＰＬＣ解析：アイソクラティックＨＰＬＣを用いて、６Ｈ２ＨＨを検出及び定量した。この方法では、Ｂｉｏ－ＲａｄのＡｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７カラムと、０．７ｍＬ／分の０．５％のギ酸（または５ｍＭの硫酸）を３５℃で用いた。検出は、ＲＩＤ（屈折率検出器）を用いて行った。結果により、表２６の例１～９のすべての株から、６Ｈ２ＨＨが生成されたことが示された。
実施例１９：異なる炭素源から、中間体６－ヒドロキシ－２－ケトヘキサノエートを介して、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを生成するための微生物の調製及び利用
いくつかの実施形態では、本開示は、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートを様々な炭素源から生成する技術を提供する。特定の例が、下に記載されている。いくつかの実施形態では、本開示は、２，６－ジヒドロキシヘキサノエートをピルベート及び３ＨＰＡから生成する技術を提供する。いくつかの実施形態では、収量は、約もしくは少なくとも約１０ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、６０ｍｇ／Ｌ、７０ｍｇ／Ｌ、８０ｍｇ／Ｌ、９０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、１５０ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、２５０ｍｇ／Ｌ、３００ｍｇ／Ｌ、３５０ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、４５０ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、６００ｍｇ／Ｌ、７００ｍｇ／Ｌ、８００ｍｇ／Ｌ、９００ｍｇ／Ｌもしくは１０００ｍｇ／Ｌ、または約もしくは少なくとも約１．１ｇ／Ｌ、１．２ｇ／Ｌ、１．３ｇ／Ｌ、１．４ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、１．６ｇ／Ｌ、１．７ｇ／Ｌ、１．８ｇ／Ｌ、１．９ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、２．１ｇ／Ｌ、２．２ｇ／Ｌ、２．３ｇ／Ｌ、２．４ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、２．７ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１６０ｇ／Ｌ、１７０ｇ／Ｌ、１８０ｇ／Ｌ、１９０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、２２０ｇ／Ｌ、２５０ｇ／Ｌもしくは３００ｇ／Ｌである。
ピルベート及び３－ヒドロキシプロパナールから、中間体６－ヒドロキシ－２－ケトヘキサノエートを介して、６Ｈ２ＨＨを生成する生合成経路は、図４に示されている。下に示されているのは、この経路による６Ｈ２ＨＨの生成に、アルドラーゼ－ヒドラターゼベースの二酵素系の利用を組み込んだ例である。ビタミンＢ１２非依存性であるグリセロールデヒドラターゼ酵素、またはＢ１２依存性酵素であるグリセロールデヒドラターゼ酵素をクローニングして、３－ヒドロキシプロピオンアルデヒド（この酵素を用いて、グリセロールから作製できる６Ｈ２ＨＨ経路前駆体）を生成可能にできる。この実施例では、両方のタイプのグリセロールデヒドラターゼを使用できるが、この実施例に示されている例では、Ｂ１２依存性のグリセロールデヒドラターゼ酵素が用いられている。この実施例の各酵素は、６Ｈ２ＨＨを生成するために、同じＥ．Ｃ．クラスに属する相同な酵素で置換してもよい。
（ｉ）６Ｈ２ＨＨ生成用のプラスミド及び株の調製：以下のプラスミドの組み合わせを有する株として、ＭＧ１６５５（ＤＥ３）Δｒｎｅ１３１，ΔｌｄｈＡ，Δ［ｆｒｄＢ，ｆｒｄＣ］，ΔａｄｈＥ，ΔｐｏｘＢ，ΔｐｆｌＢ，Δ［ａｃｋＡ，ｐｔａ］を使用した。プラスミド１（ＣＯＬＡレプリコン、カナマイシンマーカー）：遺伝子１（グリセロールデヒドラターゼ－ｐｄｕＣＤＥＧＨ）。プラスミド２（ＣｏｌＥ１レプリコン、アンピシリンマーカー）：遺伝子２（Ａｄｓ－Ｈｙｄ８）、遺伝子２（Ｑｏｒ－１）及び遺伝子３（６－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエート２－レダクターゼ－Ｑ５ＦＴＵ６）
（ｉｉ）細胞の培養、タンパク質の発現、及び６Ｈ２ＨＨ生成の解析：
（適切な抗生物質との）細胞の培養及びタンパク質の発現は、３－ヒドロキシプロパナールに関して実施例１に記載したものと同様とした。２４時間、室温でインキュベート後、細胞を遠心分離し、上清をろ過し、ＨＰＬＣによって解析した。
（ｉｉｉ）６Ｈ２ＨＨの生成のＨＰＬＣ解析：解析は、実施例１８で述べたようにして行った。上記の株は、それらの条件下で、１ｇ／Ｌ超の６Ｈ２ＨＨを生成できた。
均等物
別段の定義のない限り、本明細書で用いられている技術用語及び科学用語はすべて、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味である。本明細書に示されているヌクレオチド配列はいずれも、５’から３’の方向で示されている。
本明細書に例示として記載されている実施形態は、本明細書に具体的には開示されていないいずれかの１つの要素または複数の要素、１つの制限または複数の制限がなくても、適切に実施し得る。すなわち、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語は、範囲を広げて、制限なしに解釈するものとする。加えて、本明細書で用いられている用語及び表現は、限定するためではなく、説明するための用語として用いられており、このような用語及び表現を使用することで、図示及び記載されている特徴またはその一部のいずれの均等物も排除する意図はなく、むしろ、特許請求する本発明の範囲内で、様々な修正が可能であることが認識される。
本発明の技術について、上記の態様と関連させて説明してきたが、上記の説明及び実施例は、本発明の技術の範囲を限定するのではなく、本発明の技術を例示するためのものとして意図されていることは理解される。本発明の技術の範囲内である他の態様、利点及び修正形態は、本発明の技術に関わる当業者には明らかであろう。
参照文献：
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２．Ｅａｔｏｎ，Ｒ．Ｗ．（２０００）． Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６６，２６６８－２６７２
３．Ｆｅｒｒａｒａ，Ｓ．，Ｍａｐｅｌｌｉ，Ｅ．，Ｓｅｌｌｏ，Ｇ．，＆Ｄｉ Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｐ．（２０１１） Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１８１４，６２２－６２９
４．Ｇｕｉｄｏ Ｓｅｌｌｏ，＆Ｐａｔｒｉｚｉａ Ｄｉ Ｇｅｎｎａｒ（２０１３）．Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１７０：１７０２－１７１２
５．Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｌ．Ｓ．，Ｈｏｐｐｅ，Ｒ．Ｗ．，Ｏｃｈｓｅｎｗａｌｄ，Ｊ．Ｍ．，Ｂｅｒｎｄｔ，Ｒ．Ｔ．，Ｓｅｖｅｒｉｎ，Ｇ．Ｂ．，Ｓｃｈｗａｂａｃｈｅｒ，Ａ．Ｗ．＆Ｓｉｌｖａｇｇｉ，Ｎ．Ｒ．（２０１５）．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５４，３９７８－３９８８
６．Ｉｗａｂｕｃｈｉ，Ｔ．，ａｎｄ Ｈａｒａｙａｍａ，Ｓ．（１９９８）．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０，９４５－９４９
７．Ｓｉｅｇｅｒｔ Ｐ，ＭｃＬｅｉｓｈ ＭＪ，Ｂａｕｍａｎｎ Ｍ，Ｉｄｉｎｇ Ｈ，Ｋｎｅｅｎ ＭＭ，Ｋｅｎｙｏｎ ＧＬ，Ｐｏｈｌ Ｍ：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２００５，１８（７）：３４５－３５７
８．ｄｅ ｌａ Ｐｌａｚａ Ｍ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ｄｅ Ｐａｌｅｎｃｉａ Ｐ，Ｐｅｌａｅｚ Ｃ，Ｒｅｑｕｅｎａ Ｔ．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ ２００４，２３８（２）：３６７－３７４．
９．Ｇｏｃｋｅ Ｄｒ，Ｇｒａｆ Ｔ，Ｂｒｏｓｉ Ｈ，Ｆｒｉｎｄｉ－Ｗｏｓｃｈ Ｉ，Ｗａｌｔｅｒ Ｌ，Ｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ２００９，６１（１，Ａｉ２）：３０－３５
１０．Ａｎｄｒｅｗｓ ＦＨ，ＭｃＬｅｉｓｈ ＭＪ．Ｂｉｏｏｒｇ Ｃｈｅｍ ２０１２，４３：２６－３６
１１．Ｇ．Ｍ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｓ．Ａｔｓｕｍｉ，Ｍｉｃｒｏｂ． Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ １１（２０１２）９０
１２．Ｄ．Ｊ．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｒ．Ｗ．Ｗｅｌｃｈ，Ｆ．Ｂ．Ｒｕｄｏｌｐｈ，Ｇ．Ｎ．Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３（１９９１）１８３１
１３．Ｘ．Ｌｉｕ，Ｙ．Ｄｏｎｇ，Ｊ．Ｚｈａｎｇ，Ａ．Ｚｈａｎｇ，Ｌ．Ｗａｎｇ，Ｌ．Ｆｅｎｇ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅａｄ．Ｅｎｇｌ．１５５（２００９）２０７８
１４．Ａ．Ｔａｎｉ，Ｙ．Ｓａｋａｉ，Ｔ．Ｉｓｈｉｇｅ，Ｎ．Ｋａｔｏ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６（２０００）５２３１
１５．Ｋ．Ｅ．Ｂｒｅｉｔｋｒｅｕｚ，Ｗ．Ｌ．Ａｌｌａｎ，Ｏ．Ｒ．Ｖａｎ Ｃａｕｗｅｎｂｅｒｇｈｅ，Ｃ．Ｊａｋｏｂｓ，Ｄ．Ｔａｌｉｂｉ，Ｂ．Ａｎｄｒｅ，Ｂ．Ｊ．Ｓｈｅｌｐ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（２００３）４１５５２
１６．Ｎ．Ｓａｉｔｏ，Ｍ．Ｒｏｂｅｒｔ，Ｈ．Ｋｏｃｈｉ，Ｇ．Ｍａｔｓｕｏ，Ｙ．Ｋａｋａｚｕ，Ｔ．Ｓｏｇａ，Ｍ．Ｔｏｍｉｔａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４（２００９）１６４４２
１７．Ｒ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ，Ｗ．Ｒ．Ｋｅｎｅａｌｙ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６（１９９５）２０６．
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Claims (73)

  1. ピルベート及び脂肪族アルデヒドをアルドール脱水生成物生合成ポリペプチドと接触させて、アルドール脱水生成物を生成させるようにすることを含む方法であって、
    前記脂肪族アルデヒドのカルボニル基が、アルケニル基、アルキニル基または芳香族基に共役しておらず、
    前記アルドール脱水生成物が、アルデヒド基またはケトン基と、前記アルデヒド基またはケトン基と共役した二重結合を含む化合物である前記方法。
  2. 前記アルドール脱水生成物生合成ポリペプチドが、ヒドラターゼ－アルドラーゼであるか、またはヒドラターゼ－アルドラーゼを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記アルドール脱水生成物生合成ポリペプチドが、ＥＣ番号４．１．２．４５もしくはＥＣ番号４．１．２．３４もしくはＥＣ４．１．１．４である酵素、または表１及び５～８から選択した酵素であるか、前記酵素を含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記アルドール脱水生成物生合成ポリペプチドが、微生物内にある、請求項３に記載の方法。
  5. アルケンをアルケン還元生成物生合成ポリペプチドと接触させて、アルケン還元生成物を生成させるようにすることを含む方法であって、
    前記アルケンが、カルボニル基に共役した二重結合を含み、
    前記アルケンにおける、前記カルボニル基に共役した二重結合を還元して単結合にして、アルケン還元生成物をもたらす前記方法。
  6. 前記アルケンが、請求項１に記載のアルドール脱水生成物である、請求項５に記載の方法。
  7. 前記アルケン還元生成物生合成ポリペプチドが、ＥＣ１．６．５に属する酵素、または表９から選択した酵素であるか、または前記酵素を含む、請求項６に記載の方法。
  8. 前記脂肪族アルデヒドが、下記の式Ａ－１の構造
    Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－Ｃ（Ｏ）Ｈ
    Ａ－１
    またはその塩を有し、式中、
    Ｒａが、Ｒ”または－ＯＲ”であり、
    Ｌ１及びＬ２のそれぞれが独立して、共有結合であるか、または２価の任意に置換された直鎖もしくは分岐鎖のＣ１－２０脂肪族基もしくはＣ１－２０ヘテロ脂肪族基であり、そのメチレン単位の１つ以上が任意にかつ独立して、－Ｃ≡Ｃ－、－Ｃ（Ｒ”）２－、－Ｃｙ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｎ（Ｒ”）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（ＮＲ”）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）－、－Ｎ（Ｒ”）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）－、－Ｎ（Ｒ”）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ”）－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－によって置き換えられており、
    －Ｃｙ－が、２価の任意に置換された３～２０員の単環、二環または多環であり、その各単環が独立して、ヘテロ原子を０～５個有する任意に置換されているか、飽和であるか、部分飽和であるか、または芳香族である３～２０員環であり、
    各Ｒ”が独立して、－Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＣＯ２Ｒ’または－ＳＯ２Ｒ’であり、
    Ｒ’が、水素であるか、またはＣ１－１０脂肪族基、ヘテロ原子を１～５個有するＣ１－１０ヘテロ脂肪族基、６～１０員のアリール環、ヘテロ原子を１～５個有する５～１０員のヘテロアリール環、及びヘテロ原子を１～５個有する３～１０員のヘテロ環から選択した任意に置換された基であるか、あるいは
    ２つ以上のＲ’基が、介在する原子と一体となって、ヘテロ原子を、前記介在する原子に加えて０～５個有する任意に置換された３～２０員の単環、二環または多環を形成し、その各単環が独立して、ヘテロ原子を０～５個有する任意に置換されているか、飽和であるか、部分飽和であるか、または芳香族である３～２０員環である、請求項４に記載の方法。
  9. 前記アルドール脱水生成物が、下記の式Ｐ－２の構造
    Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ＝ＣＨ－Ｃ（Ｏ）－Ｃ（Ｏ）ＯＨ
    Ｐ－２
    またはその塩を有し、式中、
    Ｒａが、Ｒ”または－ＯＲ”であり、
    Ｌ１及びＬ２のそれぞれが独立して、共有結合であるか、または２価の任意に置換された直鎖もしくは分岐鎖のＣ１－２０脂肪族基もしくはＣ１－２０ヘテロ脂肪族基であり、そのメチレン単位の１つ以上が任意にかつ独立して、－Ｃ≡Ｃ－、－Ｃ（Ｒ”）２－、－Ｃｙ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｎ（Ｒ”）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（ＮＲ”）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）－、－Ｎ（Ｒ”）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）－、－Ｎ（Ｒ”）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ”）－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－によって置き換えられており、
    －Ｃｙ－が、２価の任意に置換された３～２０員の単環、二環または多環であり、その各単環が独立して、ヘテロ原子を０～５個有する任意に置換されているか、飽和であるか、部分飽和であるか、または芳香族である３～２０員環であり、
    各Ｒ”が独立して、－Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＣＯ２Ｒ’または－ＳＯ２Ｒ’であり、
    Ｒ’が、水素であるか、またはＣ１－１０脂肪族基、ヘテロ原子を１～５個有するＣ１－１０ヘテロ脂肪族基、６～１０員のアリール環、ヘテロ原子を１～５個有する５～１０員のヘテロアリール環、及びヘテロ原子を１～５個有する３～１０員のヘテロ環から選択した任意に置換された基であるか、あるいは
    ２つ以上のＲ’基が、介在する原子と一体となって、ヘテロ原子を、前記介在する原子に加えて０～５個有する任意に置換された３～２０員の単環、二環または多環を形成し、その各単環が独立して、ヘテロ原子を０～５個有する任意に置換されているか、飽和であるか、部分飽和であるか、または芳香族である３～２０員環である、請求項８に記載の方法。
  10. 前記式中、－ＣＨ＝ＣＨ－がＥ体である、請求項９に記載の方法。
  11. 前記式中、－ＣＨ＝ＣＨ－がＺ体である、請求項９に記載の方法。
  12. 前記アルケン還元生成物が、下記の式Ｐ－３の構造
    Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－Ｃ（Ｏ）ＯＨ
    Ｐ－３
    またはその塩を有し、式中、
    Ｒａが、Ｒ”または－ＯＲ”であり、
    Ｌ１及びＬ２のそれぞれが独立して、共有結合であるか、または２価の任意に置換された直鎖もしくは分岐鎖のＣ１－２０脂肪族基もしくはＣ１－２０ヘテロ脂肪族基であり、そのメチレン単位の１つ以上が任意にかつ独立して、－Ｃ≡Ｃ－、－Ｃ（Ｒ”）２－、－Ｃｙ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｎ（Ｒ”）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（ＮＲ”）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）－、－Ｎ（Ｒ”）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）－、－Ｎ（Ｒ”）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ”）－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－によって置き換えられており、
    －Ｃｙ－が、２価の任意に置換された３～２０員の単環、二環または多環であり、その各単環が独立して、ヘテロ原子を０～５個有する任意に置換されているか、飽和であるか、部分飽和であるか、または芳香族である３～２０員環であり、
    各Ｒ”が独立して、－Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＣＯ２Ｒ’または－ＳＯ２Ｒ’であり、
    Ｒ’が、水素であるか、またはＣ１－１０脂肪族基、ヘテロ原子を１～５個有するＣ１－１０ヘテロ脂肪族基、６～１０員のアリール環、ヘテロ原子を１～５個有する５～１０員のヘテロアリール環、及びヘテロ原子を１～５個有する３～１０員のヘテロ環から選択した任意に置換された基であるか、あるいは
    ２つ以上のＲ’基が、介在する原子と一体となって、ヘテロ原子を、前記介在する原子に加えて０～５個有する任意に置換された３～２０員の単環、二環または多環を形成し、その各単環が独立して、ヘテロ原子を０～５個有する任意に置換されているか、飽和であるか、部分飽和であるか、または芳香族である３～２０員環である、請求項５～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記アルケン還元生成物を下記の式Ｐ－１０の化合物
    ＨＯ－Ｃ（Ｏ）－Ｌ２’－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－ＯＨ
    Ｐ－１０
    またはその塩に変換することを含む、請求項５に記載の方法。
  14. 前記アルケン還元生成物を下記の式Ｐ－１０’の化合物
    Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＯＨ
    Ｐ－１０’
    またはその塩に変換することを含む、請求項５に記載の方法。
  15. 前記方法が、前記式Ｐ－３の化合物またはその塩を下記の式Ｐ－４の化合物
    Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－Ｃ（Ｏ）ＯＨ
    Ｐ－４
    またはその塩に変換することを含み、式中、
    Ｒａが、Ｒ”または－ＯＲ”であり、
    Ｌ１及びＬ２のそれぞれが独立して、共有結合であるか、または２価の任意に置換された直鎖もしくは分岐鎖のＣ１－２０脂肪族基もしくはＣ１－２０ヘテロ脂肪族基であり、そのメチレン単位の１つ以上が任意にかつ独立して、－Ｃ≡Ｃ－、－Ｃ（Ｒ”）２－、－Ｃｙ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｎ（Ｒ”）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（ＮＲ”）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）－、－Ｎ（Ｒ”）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）－、－Ｎ（Ｒ”）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ”）－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－によって置き換えられており、
    －Ｃｙ－が、２価の任意に置換された３～２０員の単環、二環または多環であり、その各単環が独立して、ヘテロ原子を０～５個有する任意に置換されているか、飽和であるか、部分飽和であるか、または芳香族である３～２０員環であり、
    各Ｒ”が独立して、－Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＣＯ２Ｒ’または－ＳＯ２Ｒ’であり、
    Ｒ’が、水素であるか、またはＣ１－１０脂肪族基、ヘテロ原子を１～５個有するＣ１－１０ヘテロ脂肪族基、６～１０員のアリール環、ヘテロ原子を１～５個有する５～１０員のヘテロアリール環、及びヘテロ原子を１～５個有する３～１０員のヘテロ環から選択した任意に置換された基であるか、あるいは
    ２つ以上のＲ’基が、介在する原子と一体となって、ヘテロ原子を、前記介在する原子に加えて０～５個有する任意に置換された３～２０員の単環、二環または多環を形成し、その各単環が独立して、ヘテロ原子を０～５個有する任意に置換されているか、飽和であるか、部分飽和であるか、または芳香族である３～２０員環である、請求項１２に記載の方法。
  16. 前記変換が、前記式Ｐ－３の化合物またはその塩をカルボニル還元生成物生合成ポリペプチドと接触させることを含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記式Ｐ－４の化合物またはその塩を下記の式Ｐ－５の化合物
    Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－Ｃ（Ｏ）－Ｓ－ＣｏＡ
    Ｐ－５
    またはその塩に変換することを含む、請求項１５に記載の方法。
  18. 前記変換が、前記式Ｐ－４の化合物またはその塩をＣｏＡ転移生成物生合成ポリペプチドと接触させることを含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記式Ｐ－５の化合物またはその塩を下記の式Ｐ－６の化合物
    Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ－Ｃ（Ｏ）－Ｓ－ＣｏＡ
    Ｐ－６
    またはその塩に変換することを含む、請求項１７に記載の方法。
  20. 前記変換が、前記式Ｐ－５の化合物またはその塩を脱水生成物生合成ポリペプチドと接触させることを含む、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記式Ｐ－６の化合物またはその塩を下記の式Ｐ－７の化合物
    Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－Ｓ－ＣｏＡ
    Ｐ－７
    またはその塩に変換することを含む、請求項１９に記載の方法。
  22. 前記変換が、前記式Ｐ－６の化合物またはその塩と、２，３－エノイルＣｏＡレダクターゼであるか、または２，３－エノイルＣｏＡレダクターゼを含む還元生成物生合成ポリペプチドとを接触させることを含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記式Ｐ－７の化合物またはその塩を下記の式Ｐ－８の化合物
    Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－ＯＨ
    Ｐ－８
    またはその塩に変換することを含む、請求項２１に記載の方法。
  24. 前記変換が、前記式Ｐ－７の化合物またはその塩をＣｏＡ転移生成物生合成ポリペプチドと接触させることを含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記式Ｐ－８の化合物であって、式中、Ｌ２が－ＣＨ２－Ｌ２’－である前記化合物またはその塩を下記の式Ｐ－９の化合物
    Ｈ－Ｃ（Ｏ）－Ｌ２’－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－ＯＨ
    Ｐ－９
    またはその塩に変換させることを含み、前記式中、
    Ｌ２’が、共有結合であるか、または２価の任意に置換された直鎖もしくは分岐鎖のＣ１－１９脂肪族基もしくはＣ１－１９ヘテロ脂肪族基であり、そのメチレン単位の１つ以上が任意にかつ独立して、－Ｃ≡Ｃ－、－Ｃ（Ｒ”）２－、－Ｃｙ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｎ（Ｒ”）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（ＮＲ”）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）－、－Ｎ（Ｒ”）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）－、－Ｎ（Ｒ”）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ”）－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－によって置き換えられている、請求項２３に記載の方法。
  26. 前記変換が、前記式Ｐ－８の化合物またはその塩と、アルコールデヒドロゲナーゼであるか、またはアルコールデヒドロゲナーゼを含む酸化生成物生合成ポリペプチドとを接触させることを含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記式Ｐ－９の化合物またはその塩を下記の式Ｐ－１０の化合物
    ＨＯ－Ｃ（Ｏ）－Ｌ２’－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－ＯＨ
    Ｐ－１０
    またはその塩に変換することを含む、請求項２５に記載の方法。
  28. 前記変換が、前記式Ｐ－９の化合物またはその塩をアルデヒド酸化生成物生合成ポリペプチドと接触させることを含む、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記式Ｐ－８の化合物またはその塩を下記の式Ｐ－９’の化合物
    Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－Ｈ
    Ｐ－９’
    またはその塩に変換することを含む、請求項２３に記載の方法。
  30. 前記式Ｐ－８の化合物またはその塩をカルボキシル還元生成物生合成ポリペプチドと接触させることを含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記式Ｐ－９’の化合物またはその塩を下記の式Ｐ－１０’の化合物
    Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＯＨ
    Ｐ－１０’
    またはその塩に変換することを含む、請求項２９に記載の方法。
  32. 前記式Ｐ－９’の化合物またはその塩と、アルデヒドレダクターゼもしくは１級アルコールデヒドロゲナーゼであるか、またはアルデヒドレダクターゼもしくは１級アルコールデヒドロゲナーゼを含むアルデヒド還元生成物生合成ポリペプチドとを接触させることを含む、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記式Ｐ－３の化合物またはその塩を下記の式Ｐ－４’の化合物
    Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－Ｈ
    Ｐ－４’
    またはその塩に変換することを含む、請求項１２に記載の方法。
  34. 前記式Ｐ－３の化合物またはその塩を脱炭酸生成物生合成ポリペプチドと接触させることを含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記式Ｐ－４’の化合物またはその塩を下記の式Ｐ－５’の化合物
    Ｒａ－Ｌ２－Ｌ１－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＯＨ
    Ｐ－５’
    またはその塩に変換することを含む、請求項３３に記載の方法。
  36. 前記式Ｐ－４’の化合物またはその塩をアルデヒド還元生成物生合成ポリペプチドと接触させることを含む、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記式中、Ｒａが、－Ｈである、請求項１～３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. 前記式中、Ｒａが、－ＯＨである、請求項１～３６のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記式中、Ｌ１が、任意に置換されたＣ１－６アルキレンである、請求項１～３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. 前記式中、Ｌ１が、非置換のＣ１－６アルキレンである、請求項１～３８のいずれか１項に記載の方法。
  41. 前記アルキレンが、－ＣＨ２－である、請求項３９～４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記アルキレンが、－ＣＨ２ＣＨ２－である、請求項３９～４０のいずれか１項に記載の方法。
  43. 前記アルキレンが、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である、請求項３９～４０のいずれか１項に記載の方法。
  44. 前記式中、Ｌ１が、共有結合である、請求項１～３８のいずれか１項に記載の方法。
  45. 前記式中、Ｌ２が、共有結合である、請求項１～４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. 前記式中、Ｌ２が、任意に置換されたＣ１－６アルキレンである、請求項１～４４のいずれか１項に記載の方法。
  47. 前記式中、Ｌ２が、非置換のＣ１－６アルキレンである、請求項１～４４のいずれか１項に記載の方法。
  48. 前記アルキレンが、－ＣＨ２－である、請求項４６～４７のいずれか１項に記載の方法。
  49. 前記アルキレンが、－ＣＨ２ＣＨ２－である、請求項４６～４７のいずれか１項に記載の方法。
  50. 前記アルキレンが、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である、請求項４６～４７のいずれか１項に記載の方法。
  51. 前記脂肪族アルデヒドが、ＨＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨＯである、請求項８に記載の方法。
  52. 前記アルドール脱水生成物が、ＨＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＯＯＨまたはその塩である、請求項９に記載の方法。
  53. 前記アルケン還元生成物が、ＨＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－ＣＯＯＨまたはその塩である、請求項１２に記載の方法。
  54. 前記カルボニル還元生成物が、ＨＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＯＯＨまたはその塩である、請求項１５に記載の方法。
  55. 前記式Ｐ－５の化合物またはその塩が、ＨＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＯ－Ｓ－ＣｏＡまたはその塩である、請求項１６に記載の方法。
  56. 前記式Ｐ－６の化合物またはその塩が、ＨＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ－ＣＯ－Ｓ－ＣｏＡまたはその塩である、請求項１８に記載の方法。
  57. 前記式Ｐ－７の化合物またはその塩が、ＨＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯ－Ｓ－ＣｏＡまたはその塩である、請求項２０に記載の方法。
  58. 前記式Ｐ－８の化合物またはその塩が、ＨＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯ－ＯＨまたはその塩である、請求項２３に記載の方法。
  59. 前記式Ｐ－９の化合物またはその塩が、Ｈ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯ－ＯＨまたはその塩である、請求項２５に記載の方法。
  60. 前記式Ｐ－１０の化合物またはその塩が、ＨＯ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯ－ＯＨまたはその塩である、請求項２７に記載の方法。
  61. 前記式Ｐ－９’の化合物またはその塩が、ＨＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－Ｈまたはその塩である、請求項２５に記載の方法。
  62. 前記式Ｐ－１０’の化合物またはその塩が、ＨＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＯＨまたはその塩である、請求項２７に記載の方法。
  63. 前記式Ｐ－４’の化合物またはその塩が、ＨＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－Ｈまたはその塩である、請求項３２に記載の方法。
  64. 前記式Ｐ－５’の化合物またはその塩が、ＨＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＯＨまたはその塩である、請求項３２に記載の方法。
  65. 先行請求項のいずれか１項に記載の方法によって調製した調製物。
  66. 前記式Ｐ－１、Ｐ－２、Ｐ－３、Ｐ－４、Ｐ－４’、Ｐ－５、Ｐ－５’、Ｐ－６、Ｐ－７、Ｐ－８、Ｐ－９、Ｐ－９’、Ｐ－１０もしくはＰ－１０’の化合物、またはその塩の調製物、あるいは先行請求項のいずれか１項に記載の方法によって調製した調製物であって、前記調製物において、同位体１４Ｃが、前記化合物の参照調製物で観察される前記同位体と比べて濃縮されており、前記参照調製物が、化石炭素源を用いて調製したものである前記調製物。
  67. ポリエステル、ポリエステルポリオール、ポリウレタン、ナイロン６、ナイロン６，６、ポリカーボネートジオール、ジアクリレートエステルまたはジグリシジルエーテルの調製物であって、先行請求項のいずれか１項に記載の方法によって調製した調製物を用いて製造したものである前記調製物。
  68. 前記調製物において、同位体１４Ｃが、前記化合物の参照調製物で観察される前記同位体と比べて濃縮されており、前記参照調製物が、化石炭素源を用いて調製したものである、請求項６７に記載の調製物。
  69. 先行請求項のいずれか１項に記載の生合成ポリペプチドをコードする核酸。
  70. 脂肪族アルデヒドのアルドール脱水生成物を産生する操作微生物であって、前記微生物において、アルドール生成物生合成ポリペプチド、アルドール脱水生成物生合成ポリペプチド、脱水生成物生合成ポリペプチド、またはこれらをいずれかに組み合わせたものの発現または活性が向上されており、
    前記脂肪族アルデヒドのカルボニル基が、アルケニル基、アルキニル基または芳香族基に共役しておらず、
    前記アルドール脱水生成物が、アルデヒド基またはケトン基と、前記アルデヒド基またはケトン基と共役した二重結合を含む化合物である前記操作微生物。
  71. アルケン還元生成物を産生する操作微生物であって、前記微生物において、アルケン還元生成物生合成ポリペプチドの発現または活性が向上されており、
    前記アルケンが、カルボニル基に共役した二重結合を含み、
    前記アルケンにおける、前記カルボニル基に共役した二重結合を還元して単結合にして、前記アルケン還元生成物をもたらす前記操作微生物。
  72. 請求項７０～７１のいずれか１項に記載の微生物を含む培養液であって、独立して、前記式Ｐ－１～Ｐ－１０、Ｐ－９’、Ｐ－１０’、Ｐ－４’もしくはＰ－５’の化合物、またはその塩のうちの１つ以上を含む前記培養液。
  73. 実施形態１～３８６のいずれか１つに記載の方法、調製物、核酸、微生物または培養液。
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