JP5866604B2 - 新規微生物、ならびにそれを用いる2,3−ジヒドロキシ安息香酸およびサリチル酸の製造法 - Google Patents
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Description
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするDNA。
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加された配列を含み、かつフタル酸から2,3−ジヒドロキシ安息香酸への転換に関わる機能を有する蛋白質をコードするDNA。
(c)配列番号1に示される塩基配列からなるDNA。
(d)配列番号1に示される塩基配列の全部もしくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフタル酸から2,3−ジヒドロキシ安息香酸への転換に関わる機能を有する蛋白質をコードするDNA。
(e)配列番号4に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするDNA。
(f)配列番号4に示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加された配列を含み、かつフタル酸から2,3−ジヒドロキシ安息香酸への転換に関わる機能を有する蛋白質をコードするDNA。
(g)配列番号3に示される塩基配列からなるDNA。
(h)配列番号3に示される塩基配列の全部もしくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフタル酸から2,3−ジヒドロキシ安息香酸への転換に関わる機能を有する蛋白質をコードするDNA。
(i)配列番号6に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするDNA。
(j)配列番号6に示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加された配列を含み、かつフタル酸から2,3−ジヒドロキシ安息香酸への転換に関わる機能を有する蛋白質をコードするDNA。
(k)配列番号5に示される塩基配列からなるDNA。
(l)配列番号5に示される塩基配列の全部もしくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフタル酸から2,3−ジヒドロキシ安息香酸への転換に関わる機能を有する蛋白質をコードするDNA。
(m)配列番号8に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするDNA。
(n)配列番号8に示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加された配列を含み、かつフタル酸から2,3−ジヒドロキシ安息香酸への転換に関わる機能を有する蛋白質をコードするDNA。
(o)配列番号7に示される塩基配列からなるDNA。
(p)配列番号7に示される塩基配列の全部もしくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフタル酸から2,3−ジヒドロキシ安息香酸への転換に関わる機能を有する蛋白質をコードするDNA。
(q)配列番号10に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするDNA。
(r)配列番号10に示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加された配列を含み、かつフタル酸から2,3−ジヒドロキシ安息香酸への転換に関わる機能を有する蛋白質をコードするDNA。
(s)配列番号9に示される塩基配列からなるDNA。
(t)配列番号9に示される塩基配列の全部もしくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフタル酸から2,3−ジヒドロキシ安息香酸への転換に関わる機能を有する蛋白質をコードするDNA。
ここで、「フタル酸から2,3−ジヒドロキシ安息香酸への転換に関わる機能」とはジオキシゲナーゼ・小サブユニット・ホモログ蛋白質、ジオキシゲナーゼ・フェレドキシン・ホモログ蛋白質、ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ・ホモログ蛋白質、ジヒドロジオール・ジヒドロゲナーゼ・ホモログ蛋白質とともにフタル酸と反応させたときに2,3−ジヒドロキシ安息香酸を生成しうる機能を意味する。
ここで、「フタル酸から2,3−ジヒドロキシ安息香酸への転換に関わる機能」とはジオキシゲナーゼ・大サブユニット・ホモログ蛋白質、ジオキシゲナーゼ・フェレドキシン・ホモログ蛋白質、ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ・ホモログ蛋白質、ジヒドロジオール・ジヒドロゲナーゼ・ホモログ蛋白質とともにフタル酸と反応させたときに2,3−ジヒドロキシ安息香酸を生成しうる機能を意味する。
ここで、「フタル酸から2,3−ジヒドロキシ安息香酸への転換に関わる機能」とはジオキシゲナーゼ・大サブユニット・ホモログ蛋白質、ジオキシゲナーゼ・小サブユニット・ホモログ蛋白質、ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ・ホモログ蛋白質、ジヒドロジオール・ジヒドロゲナーゼ・ホモログ蛋白質とともにフタル酸と反応させたときに2,3−ジヒドロキシ安息香酸を生成しうる機能を意味する。
ここで、「フタル酸から2,3−ジヒドロキシ安息香酸への転換に関わる機能」とはジオキシゲナーゼ・大サブユニット・ホモログ蛋白質、ジオキシゲナーゼ・小サブユニット・ホモログ蛋白質、ジオキシゲナーゼ・フェレドキシン・ホモログ蛋白質、ジヒドロジオール・ジヒドロゲナーゼ・ホモログ蛋白質とともにフタル酸と反応させたときに2,3−ジヒドロキシ安息香酸を生成しうる機能を意味する。
ここで、「フタル酸から2,3−ジヒドロキシ安息香酸への転換に関わる機能」とはジオキシゲナーゼ・大サブユニット・ホモログ蛋白質、ジオキシゲナーゼ・小サブユニット・ホモログ蛋白質、ジオキシゲナーゼ・フェレドキシン・ホモログ蛋白質、ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ・ホモログ蛋白質とともにフタル酸と反応させたときに2,3−ジヒドロキシ安息香酸を生成しうる機能を意味する。
Cloning, A laboratory manual)、第2版〔サンブルック(Sambrook)、フリッチ(Fritsch) 、マニアチス(Maniatis)編集、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press) 、1989年刊〕に記載されている。
上記性質を有する微生物は、前記(1)に記載したDNAのうち1つ以上のDNAを組換え技術を用いて宿主細胞に導入した形質転換体であってもよい。
2,3−ジヒドロキシ安息香酸の生産に用いられる本発明の微生物としては、前記(2)に記載したDNAを組換え技術を用いて宿主細胞に導入した形質転換体であってもよい。
またサリチル酸の生産に用いられる本発明の微生物としては、2,3−ジヒドロキシ安息香酸の生産に用いられる本発明の微生物をもとに、組換え技術などを用いてジヒドロジオール・ジヒドロゲナーゼ・ホモログ蛋白質をコードするDNAに変異を導入することにより、ジヒドロジオール・ジヒドロゲナーゼ・ホモログ蛋白質の機能を失った菌株であってもよいし、または組換え技術などを用いてジヒドロジオール・ジヒドロゲナーゼ・ホモログ蛋白質をコードするDNAの転写に関わるプロモーターへの変異導入、または当該蛋白質の翻訳開始領域への変異導入、またはアンチセンスRNA法により、当該蛋白質の発現を欠損させた菌株であってもよい。
2,3−ジヒドロキシ安息香酸の生産に用いられる本発明の形質転換体は、上記性質を有する微生物から、フタル酸から2,3−ジヒドロキシ安息香酸への転換に関わる機能を有する蛋白質をコードする該DNAをモレキュラー・クローニング第2版に記載の方法に従ってクローニングし、ベクターDNAと連結することで組換えDNAを作製し、該組換えDNAを用いて宿主細胞を形質転換することにより取得することができる。
以下に、DNAのクローニングと形質転換株の作製方法について詳しく述べる。なお、その他の形質転換体も同様の方法により取得することができる。
またこのような微生物を増殖させて、フタル酸を細胞内に取り込ませて2,3−ジヒドロキシ安息香酸およびサリチル酸を製造する場合には、フタル酸の輸送能を有する微生物を用いることが好ましい。野生型微生物のフタル酸の輸送能が小さい場合、または野生型微生物がフタル酸の輸送能を有していない場合には、フタル酸の輸送に関わるトランスポーター蛋白質を組換えDNA技術などを用いて発現させた微生物を用いることができる。具体的には、Burkholderia cepacia ATCC17616のフタル酸トランスポーター遺伝子ophD〔J. Bacterol. 181, 6197 (1999)〕を宿主細胞に発現させることにより、フタル酸の輸送能を増強することができる。フタル酸トランスポーター遺伝子としては以下のようなDNAが包含される。
(u)配列番号32に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするDNA。
(v)配列番号32に示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加された配列を含み、かつフタル酸トランスポーター活性を有する蛋白質をコードするDNA。
(w)配列番号31に示される塩基配列からなるDNA。
(x)配列番号31に示される塩基配列の全部もしくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフタル酸トランスポーター活性を有する蛋白質をコードするDNA。
また本発明のサリチル酸生産微生物を、好ましくは0.1 mM〜1 Mのフタル酸を含有する培地で培養し、培養物中にサリチル酸を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、サリチル酸を製造することができる。好ましくは、本発明のサリチル酸生産微生物を、0.1 mM〜1 Mのフタル酸を含有する培地で培養した後、温度を45℃以上に上げて一定時間(好ましくは1時間以上)放置することにより、培養物中にサリチル酸を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、サリチル酸を製造することができる。本発明の微生物を培地に培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
フタル酸から2,3−ジヒドロキシ安息香酸までの代謝に関わるジオキシゲナーゼ・大サブユニット・ホモログ、ジオキシゲナーゼ・小サブユニット・ホモログ、ジオキシゲナーゼ・フェレドキシン・ホモログ、ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ・ホモログ、およびジヒドロジオール・ジヒドロゲナーゼ・ホモログの5種類の蛋白質をコードするDNAを以下のようにして同定するとともに、これら5種類の蛋白質を発現する菌株を用いてフタル酸から2,3−ジヒドロキシ安息香酸の生産を行った。
(1)シュードモナス・スチュツェリPTH10株によるフタル酸から2,3−ジヒドロキシ安息香酸の生産の確認
10 mMフタル酸を含有する5 mlのW液体培地〔W培地の組成は、リン酸1カリウム 1.7 g/l、リン酸2ナトリウム 9.8 g/l、硫酸アンモニウム 1.0 g/l、硫酸マグネシウム七水和物 0.1 gg/l、硫酸鉄七水和物 0.95 m g/l、酸化マグネシウム 10.75 mg/l、炭酸カルシウム 2.0 mg/l、硫酸亜鉛七水和物 1.44 mg/l、硫酸銅五水和物 mg/l、硫酸コバルト七水和物 0.28 mg/l、ホウ酸 0.06 mg/l、塩酸 51.3 ml/l〕〕にシュードモナス・スチュツェリPTH10株を接種し、25℃、150 rpmで振とう培養を行った。培養後0時間および24時間に培養液から0.2 mlとり、20μlの1N HClと1 mlの酢酸エチルを加え、激しく5分間懸濁し、遠心にかけた。二層に分かれた上層(酢酸エチル層)を0.8 mlとり、新しい1.5 mlチューブに移し、遠心乾燥機にかけた。乾固したサンプルを10μLのアセトニトリルで激しく懸濁し、190μLの水で希釈した。さらに5%のアセトニトリル溶液で40倍に希釈した後、孔径0.2μmのフィルターで濾過しした後、LC−TOF型質量分析計(Waters社、LCT Premier XE)による分析に供した。なお、LC−TOF型質量分析計のHPLC(高速液体クロマトグラフィー)およびHPLC検出器は、それぞれACQUITY UPLC(Waters社製)およびACQUITY UPLCフォトダイオードアレイ検出器(Waters社製)を用いた。以下、LC−TOF型質量分析計を用いた化合物の分析はすべてこの構成を有する機器を用いて行った。本機器を用いて、表1に示すHPLC分離条件でシュードモナス・スチュツェリPTH10株の代謝産物の分析を行ったところ、質量数153.0184の化合物ピークが培養24時間のサンプルから新たに検出された。
シュードモナス・スチュツェリPTH10株(受託番号:NITE BP-1006)を10 mM フタル酸を含有する5 mlのW液体培地に接種し、30℃で36時間振とう培養を行った後、10 mMフタル酸を含有する120 mlのW液体培地に全量接種した。30℃でさらに48時間振とう培養を行った後、菌体を集菌し、QIAGEN社製Gentra Puregene Yeast/Bact Kit用いてPTH10株のゲノムDNAを調製した。
シュードモナス・スチュツェリPTH10株のゲノム配列を、以下のようにしてBeckman Coulter Genomics社(米国・マサチューセッツ州・Danvers市)に外注することにより決定した。
上記(2)で調製したシュードモナス・スチュツェリPTH10株のゲノムDNA約250μgをBeckman Coulter Genomics社に送付した。Beckman Coulter Genomics社において、454 Life Sciences Genome Sequencer FLX (GS FLX) Titaniumシーケンサーを用いて、PTH10株ゲノムDNAのフラグメント・ライブラリーより約8000万塩基の配列を決定し、またPTH10株ゲノムDNAのメイトペア・ライブラリーより約6000万塩基の配列を決定した。両方の配列を合わせてBeckman Coulter Genomics社において塩基配列のアセンブリーが行われ、合計4,214,254塩基のゲノム配列が得られた。さらに、Beckman Coulter Genomics社において、Illumina Genome Analyzer IIxシーケンサーを用いて、PTH10株ゲノムDNAのペアエンド・ライブラリーより約22億塩基の配列を決定し、配列アセンブリーを行った後、合計4,196,341塩基のゲノム配列が得られた。
上記で明らかになった454 Life Sciences Genome Sequencer FLX (GS FLX) Titaniumシーケンサーを用いて得られたPTH10株の4,214,254塩基のゲノムDNA配列について、翻訳領域予測プログラムであるGeneLook〔Nishi T, Ikemura T, とKanaya S. Gene 346, 115-125 (2005)〕を用いて翻訳領域を予測した。続いて、予測された翻訳領域に対してBLAST相同性解析を用いて既存の蛋白質のアミノ酸配列との相同性解析を行った。その結果、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するジオキシゲナーゼ・大サブユニット・ホモログ蛋白質をコードするDNA(配列番号1)、配列番号4に示されるアミノ酸配列を有するジオキシゲナーゼ・小サブユニット・ホモログ蛋白質をコードするDNA(配列番号3)、配列番号6に示されるアミノ酸配列を有するジオキシゲナーゼ・フェレドキシン・ホモログ蛋白質をコードするDNA(配列番号5)、配列番号8に示されるアミノ酸配列を有するジオキシゲナーゼ・レダクターゼ・ホモログ蛋白質をコードするDNA(配列番号7)、および配列番号10に示されるアミノ酸配列を有するジヒドロジオール・ジヒドロゲナーゼ・ホモログ蛋白質をコードするDNA(配列番号9)を同定でき、これら5種類の蛋白質がフタル酸から2,3−ジヒドロキシ安息香酸までの代謝に関わっていると推定された。なお、配列番号1,3,5,7および9に示した塩基配列については、いずれも454 Life Sciences Genome Sequencer FLX (GS FLX) Titaniumシーケンサーを用いて得られた配列とIllumina Genome Analyzer IIxシーケンサーを用いて得られた配列の間で完全に一致した。
(1)遺伝子クローニング用のPCRプライマーの設計と合成
上記で明らかになった5種類の蛋白質のDNA配列情報をもとに、PCR法を用いてこれら蛋白質をコードするDNAをクローニングするためのPCRプライマーを設計し、合成した。各PCRプライマーの塩基配列は表2に示した。なお、プライマーの合成は株式会社日本遺伝子研究所に外注した。
タカラバイオ社から購入したPrimeSTAR DNAポリメラーゼを用いて、上記1(2)で得た染色体DNAを鋳型にし、表2記載のDNAプライマーを用いて、添付の説明書に従って表2に示した各蛋白質をコードするDNAを増幅させた。
上記(2)で得られたジオキシゲナーゼ・大サブユニット・ホモログ蛋白質をコードするDNA、ジオキシゲナーゼ・小サブユニット・ホモログ蛋白質をコードするDNA、ジオキシゲナーゼ・フェレドキシン・ホモログ蛋白質をコードするDNA、ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ・ホモログ蛋白質をコードするDNA、およびジヒドロジオール・ジヒドロゲナーゼ・ホモログ蛋白質をコードするDNAをTaq ポリメラーゼ(タカラ・バイオ社製)による3'末端にA残基を付与する処理を行った後、ゲル電気泳動後により目的DNAを精製した。精製した目的DNAをpT7Blue(Novagen社製で、タカラバイオ社から購入)のTベクターに組み込むことにより、それぞれの遺伝子を運ぶプラスミドpT7Blue_large、pT7Blue_small、pT7Blue_ferredoxin、pT7Blue_reductase、pT7Blue_dehydrogenaseを造成した。ジオキシゲナーゼ・大サブユニット・ホモログ蛋白質をコードするDNAについては、配列番号21と22で表される1組の合成DNAを用いたPCR法によりジオキシゲナーゼ・大サブユニット・ホモログ蛋白質の遺伝子内部の制限酵素NotI部位を破壊したプラスミドpT7Blue_LdNを造成した。
上記の各蛋白質をコードする遺伝子を大腸菌JM109株、大腸菌JM109(DE3)株や大腸菌BL21(DE3)株でそれぞれ転写・翻訳効率に依存しない効率よい発現を行うために、各遺伝子の転写がその遺伝子の上流に配置した疑似遺伝子に依存し、疑似遺伝子の翻訳効率を維持した状態で各遺伝子も翻訳される発現系の構築を行った。より具体的には、T7プロモーター配列と疑似遺伝子及び各蛋白質をコードする遺伝子を連結するための制限酵素PacI部位をpUC19プラスミドDNA内に挿入するために、配列番号23〜26で表される4本の合成DNAを合成した。これら合成DNAをpUC19(タカラバイオ社製)のHindIII部位とSphI部位の間に挿入したプラスミドpUTCP19を構築した。次いで、ターミネーター配列を挿入するため、配列番号27〜30で表される4本の合成DNAを合成し、pUTCP19のEcoRI部位とKpnI部位の間に挿入し、発現ベクターpUTCTP19を構築した。
上記(3)で造成したプラスミドpT7Blue_LdNから制限酵素PacIと制限酵素NotIによりジオキシゲナーゼ・大サブユニット・ホモログ蛋白質をコードする遺伝子を切り出し、上記(4)で造成した発現ベクターpUTCTP19に組込むことにより、pUTCTP_LdNを造成した。ジオキシゲナーゼ・小サブユニット・ホモログ蛋白質をコードする遺伝子、ジオキシゲナーゼ・フェレドキシン・ホモログ蛋白質をコードする遺伝子、ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ・ホモログ蛋白質をコードする遺伝子、ジヒドロジオール・ジヒドロゲナーゼ・ホモログ蛋白質をコードする遺伝子はそれぞれ翻訳開始コドンの上流に制限酵素SwaI部位を、終止コドン下流に制限酵素PmeI部位と制限酵素NotI部位を有している。各遺伝子は制限酵素SwaI部位と制限酵素NotI部位により切り出すことができ、各遺伝子の終止コドン下流の制限酵素PmeI部位とNotI部位に挿入することができる。pUTCTP_LdNの制限酵素PmeI部位とNotI部位にジオキシゲナーゼ・小サブユニット・ホモログ蛋白質をコードする遺伝子を挿入したpUTCTP_LS、pUTCTP_LSにジオキシゲナーゼ・フェレドキシン・ホモログ蛋白質をコードする遺伝子を挿入したpUTCTP_LSF、pUTCTP_LSFにジオキシゲナーゼ・レダクターゼ・ホモログ蛋白質をコードする遺伝子を挿入したpUTCTP_LSFR、pUTCTP_LSFRにジヒドロジオール・ジヒドロゲナーゼ・ホモログ蛋白質をコードする遺伝子を挿入して、5遺伝子の発現プラスミドpUTCTP_LSFRDを造成した。さらに、同様なDNA連結法により、フタル酸から2,3−ジヒドロキシ安息香酸までの代謝に関わる5種類の蛋白質をコードする遺伝子のうち、ジオキシゲナーゼ・小サブユニット・ホモログ蛋白質をコードする遺伝子以外の4種類の遺伝子を保持するプラスミドpUTCTP_LFRD、ジオキシゲナーゼ・フェレドキシン・ホモログ蛋白質をコードする遺伝子以外の4種類の遺伝子を保持するプラスミドpUTCTP_LSRD、ジヒドロジオール・ジヒドロゲナーゼ・ホモログ蛋白質をコードする遺伝子以外の4種類の遺伝子を保持するプラスミドpUTCTP_LSFDを造成した。ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ・ホモログ蛋白質をコードする遺伝子以外の4種類の遺伝子を保持する発現プラスミドとしてはプラスミドpUTCTP_LSFRを造成した。ジオキシゲナーゼ・大サブユニット・ホモログ蛋白質をコードする遺伝子以外の4種類の遺伝子を発現する発現プラスミドpUTCTP_LdNSXSFRDは、ジオキシゲナーゼ・大サブユニット・ホモログ蛋白質をコードする遺伝子内部の制限酵素SalI部位からXhoI部位までを切り出し、自己再結合法により生成したプラスミドpUTCTP_LdNSXを造成した後、pUTCTP_LdNSXの制限酵素PmeI部位とNotI部位に当該4種類の遺伝子を挿入することにより造成した。
大腸菌K-12株などフタル酸輸送能が不明である微生物が存在する。このような微生物を用いて化合物生産を行う場合、当該微生物にフタル酸の取り込みを促進するフタル酸トランスポーターを発現させることにより、フタル酸からの2,3−ジヒドロキシ安息香酸の生成量を向上できる可能性が考えられる。この可能性を調べるために、フタル酸からの菌体内へのフタル酸の取り込みを促進させる効果があるBurkholderia multivorans ATCC17616株のフタル酸トランスポーターophDをコードするDNAを得ることにした。ophD遺伝子の塩基配列については、ナショナル・センター・フォア・バイオテクノロジー・インフォメーション(以下、NCBIと略記する)のジェンバンク(GenBank;以下、GBと略記する)データベースから、アクセッション番号NC_010805Nにおける塩基番号539901〜541247の配列(配列番号31)として得た。Burkholderia multivorans ATCC17616株の染色体DNAは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(以下、ATCCと略記する)から入手した。該染色体DNA(100 ng)を鋳型として、配列番号33で表される配列を有するDNAプライマーと配列番号34で表される配列を有するDNAプライマーを用いて、配列番号32に示されるアミノ酸配列を有するフタル酸トランスポータータンパク質をコードしているophD遺伝子の全領域をPrimeSTAR DNAポリメラーゼを用いたPCR反応により増幅させた。Taq DNA ポリメラーゼによって増幅DNA断片の3'末端にA残基を付加した後、増幅DNA断片をゲル電気泳動法により精製し、pT7BlueのTベクターに組み込むことにより、ophD遺伝子の全領域を保持するプラスミドpTOPHD1を構築した。さらに配列番号35と36に示す1対の合成DNA、および配列番号37と38で表される1対の合成DNAを用いたPCR法によりophD遺伝子内部に2箇所ある制限酵素NotI部位を破壊したプラスミドpTOPHD_dNABを造成した。pTOPHD_dNABから制限酵素PacIと制限酵素NotIによりophD遺伝子を切り出し、大腸菌中で発現ベクターpUTCTP19と共存可能な発現ベクターpRTCKMの制限酵素PacIと制限酵素NotIに組込むことでプラスミドpRTCKM_ophDを造成した。プラスミドpRTCKM_ophDにおいては、挿入したophD遺伝子の発現は、制限酵素PacIサイトの上流にあるカナマイシン耐性遺伝子のプロモーターの制御下にある。発現ベクターpRTCKMは、プラスミドベクターpRTC_SfiIのSfiIサイトに配列番号39に示す配列を有する合成DNA由来のDNAが挿入されたプラスミドである。なお配列番号39に示したDNAの配列は、その両末端にpRTC_SfiI由来のSfiIサイトの配列も含んでいる。上述のプラスミドpRTCKM_ophDの造成に用いた制限酵素PacI部位と制限酵素NotI部位は、配列番号39に示す配列においては、それぞれ塩基番号227と塩基番号245に存在する。
また、プラスミドベクターpRTC_SfiIは、プラスミドベクターpREP4(インビトロジェン社から製品番号V004-50として入手可能)をもとに下記の手順で造成した。pREP4を制限酵素HindIIIで切断した後、平滑末端化して連結、pREP4DHを造成した。さらにpREP4DHを制限酵素XbaIで切断した後、平滑末端化して連結、pREP4DHXを造成した。pREP4DHXを鋳型に配列番号40と41で表される1組の合成DNAを用いたPCR法により、末端に制限酵素SfiI部位を導入したPCR増幅断片を得た。得られた断片を制限酵素BamHIで消化・連結することで、pRTC_SfiIを造成した。
上記(5)で造成した6種の発現プラスミドを上記(6)で造成したプラスミドpRTCKM _ophDを保持する大腸菌JM109に形質転換法により導入し、組換え大腸菌JM109/(pUTCTP_LSFRD, pRTCKM_ophD)、JM109/(pUTCTP_LdNSXSFRD, pRTCKM_ophD)、JM109/(pUTCTP_LFRD, pRTCKM_ophD)、JM109/(pUTCTP_LSRD, pRTCKM_ophD)、JM109/(pUTCTP_LSFD, pRTCKM_ophD)、JM109/(pUTCTP_LSFR, pRTCKM_ophD)を造成した。これら形質転換体を、2 mlのLB液体培地(10 g/l トリプトン(Difco社製)、5 g/l 乾燥酵母エキス(Difco社製)、10 g/l 塩化ナトリウム、)で一晩培養した。プラスミドを維持するためにアンピシリンを最終濃度100 mg/l、カナマイシンを最終濃度50 mg/lになるように加えた。2 mlのF液体培地(グルコース 50 g/l、リン酸2カリウム 0.72 g/l、リン酸2アンモニウム 1.94 g/l、クエン酸一水和物 2.1 g/l、硫酸アンモニウム 9.9 g/l、硫酸鉄(II)アンモニウム 0.4 g/l、硫酸鉄七水和物 1.39 g/l、硫酸マグネシウム七水和物 0.246 g/l、塩化カルシウム 0.111 g/l、チアミン 10 mg/l、pH7.0)にアンピシリンを最終濃度100 mg/l、カナマイシンを最終濃度50 mg/l加えた後、1/50容量接種し、37℃で培養し対数増殖期にIPTG (isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)を終濃度1 mMになるように添加し、30℃で18時間蛋白質生産誘導を行った。誘導後の培養液にフタル酸を終濃度で1 mMになるように添加し、30℃で24時間振とう培養して、フタル酸から2,3−ジヒドロキシ安息香酸の生産を行った。なおコントロールとしてフタル酸を加えない培養も行った。0時間、24時間に培養液から50μlとり、5μlの1N HCl と0.25 mlの酢酸エチルを加え、激しく5分間懸濁し、遠心にかけた。二層に分かれた上層(酢酸エチル層)を200μlとり、新しい1.5 mlチューブに移し、遠心乾燥機にかけた。乾固したサンプルを10μlのアセトニトリルで激しく懸濁し、190μlの水で希釈した。孔径0.2μmのフィルターで濾過した後、LC−TOF型質量分析計(Waters社、LCT Premier XE)による分析に供した。
プラスミドpUTCTP_LSFRDを大腸菌JM109に導入した形質転換株JM109/pUTCTP_LSFRDを終濃度100 mg/mlアンピシリンを含むLB液体培地2 mlで一晩培養した。終濃度100 mg/mlアンピシリンを含むF液体培地 5 mlに1/20容量接種し、37℃で培養した後、対数増殖期にIPTGを終濃度1 mMになるように添加し、30℃で18時間蛋白質生産誘導を行った。誘導後、大腸菌を遠心によって集菌し、上清を捨てた後、終濃度100 mg/mlのアンピシリンと終濃度1 mMのIPTGを含むF培地に吸光度600 nmで5.0になるように懸濁し、大腸菌懸濁液を調製した。この懸濁液にフタル酸を終濃度で1 mMになるように添加し、30℃で24時間振とう培養して、フタル酸から2,3−ジヒドロキシ安息香酸の生産を行った。0時間、24時間に培養液から50μlとり、5μlの1N HCl と0.25 mlの酢酸エチルを加え、激しく5分間懸濁し、遠心にかけた。二層に分かれた上層(酢酸エチル層)を200 μlとり、新しい1.5 mlチューブに移し、遠心乾燥機にかけた。乾固したサンプルを10 μlのアセトニトリルで激しく懸濁し、190 μlの水で希釈した。孔径0.2 μmのフィルターで濾過した後、表3に示すHPLC分離条件のもとでLC−TOF型質量分析計(Waters社、LCT Premier XE)で分析した。その結果、0.39 mMの2,3−ジヒドロキシ安息香酸が生産されたことを確認した。
形質転換株JM109/pUTCTP_LSFRDを100 mg/mlアンピシリンを含むLB液体培地2 mlで一晩培養した。100 mg/mlアンピシリンを含むF液体培地 5 mlに1/20容量接種し、37℃で培養した後、対数増殖期にIPTGを終濃度1 mMになるように添加し、30℃で18時間蛋白質生産誘導を行った。誘導後、大腸菌を遠心によって集菌し、上清を捨て、1 mlの10%グリセロールを含むHEPES緩衝液(50 mM HEPES−NaOH, pH7.5)に懸濁し、2回洗浄した。洗浄後、0.2 ml HEPES緩衝液に懸濁した大腸菌懸濁液を超音波破砕機によって、細胞破砕を行った。破砕後、遠心分離(4℃、10分、20000×g)を行い、上清と沈殿物に分離し、上清を粗酵素液とした。粗酵素液の蛋白質濃度をブラッドフォード法に基づいたバイオラッド(Bio-Rad)プロテイン・アッセイ(Bio-Rad Laboratories, CA, USA)を用いて計測した。粗酵素による2,3−ジヒドロキシ安息香酸の生産は、FAD 10 μM、FMN 10 μM、NADH 2.5 mM、NADPH 2.5 mM、粗酵素液100 μgを含む200 μlの反応液にフタル酸を100 mM加えた後、30℃で24時間行った。コントロールとしてフタル酸を100 mM加えない反応も行った。反応後、表3に示すHPLC分離条件のもとでLC−TOF型質量分析計(Waters社、LCT Premier XE)を用いて、生成した2,3−ジヒドロキシ安息香酸の量を測定した。その結果、フタル酸を加えたときのみ、54.66 μMの2,3−ジヒドロキシ安息香酸の生産を確認できた。
フタル酸から2,3−ジヒドロキシ安息香酸までの代謝に関わるジオキシゲナーゼ・大サブユニット・ホモログ、ジオキシゲナーゼ・小サブユニット・ホモログ、ジオキシゲナーゼ・フェレドキシン・ホモログ、およびジオキシゲナーゼ・レダクターゼ・ホモログの4種類の蛋白質を発現する大腸菌株を用いて、以下のようにしてフタル酸からサリチル酸の生産を行った。
形質転換株JM109/(pUTCTP_LSFR, pRTCKM_ophD)を100 mg/mlアンピシリンと50 mg/mlカナマイシンを含むLB液体培地2 mlで一晩培養した。100 mg/mlアンピシリンと50 mg/mlカナマイシンを含むF液体培地 20 mlに1/20容量接種し、37℃で培養した後、対数増殖期にIPTGを終濃度1 mMになるように添加し、30℃で18時間蛋白質生産誘導を行った。誘導後、大腸菌を遠心によって集菌し、上清を捨てた後、終濃度100 mg/mlのアンピシリンと50 mg/mlカナマイシン、さらに終濃度1 mMのIPTGを含むF培地に吸光度600 nmで5.0になるように懸濁し、大腸菌懸濁液を調製した。この懸濁液にフタル酸を終濃度で1 mMになるように添加し、30℃で24時間振とう培養して、フタル酸の変換反応を行った。24時間後の培養液から50μlとり、5μlの1N HClと0.25 mlの酢酸エチルを加え、激しく5分間懸濁し、遠心にかけた。二層に分かれた上層(酢酸エチル層)を200μlとり、新しい1.5 mlチューブに移し、遠心乾燥機にかけた。乾固したサンプルを10μlのアセトニトリルで激しく懸濁し、190μlの水で希釈した。孔径0.2μmのフィルターで濾過し、LC−TOF型質量分析計(Waters社、LCT Premier XE)で分析した。
LC−TOF型質量分析計を用いて、表3に示すHPLC分離条件で形質転換株JM109/(pUTCTP_LSFR, pRTCKM_ophD)の代謝産物の分析を行った結果、フタル酸 1 mMを基質として加えた培養を行った場合にのみ、3つの新しいピークA、B、Cが出現し、ピークA、B、CのHPLC保持時間それぞれ0.53分、1.54分、1.96分であった。ピークA由来の化合物の精密質量を分析した結果、その質量数は199.0247であった。このピークAがジオキシゲナーゼ反応によりフタル酸に酸素2原子が付加された2,3−ジハイドロキシ1,2−ジカルボキシ シクロヘキサ−4,6−ジエン由来のピークとした場合、水素原子が引き抜かれた結果イオン化したピークと想定できるので、その精密質量数は199.0242となる。両者の質量数の差が0.005となり、LC−TOF型質量分析計(Waters社、LCT Premier XE)の測定誤差内で、両者の質量数は一致した。ピークB由来の化合物の精密質量を分析した結果、その質量数は153.0234であった。このピークBが2,3−ジヒドロキシ安息香酸由来のピークとした場合、水素原子が引き抜かれた結果イオン化したピークと想定できるので、その理論精密質量数は153.0188となる。両者の質量数の差が0.0046となり、LC−TOF型質量分析計(Waters社、LCT Premier XE)の測定誤差内で、両者の質量数は一致した。一方、使用したHPLC分析条件で2,3−ジヒドロキシ安息香酸の標準化合物のHPLC保持時間も1.54分であり、両化合物のHPLC保持時間は一致していた。ピークC由来の化合物の精密質量を分析した結果、その質量数は137.0262であった。このピークCがジオキシゲナーゼ反応によりフタル酸に酸素2原子が付加された2,3−ジハイドロキシ1,2−ジカルボキシ シクロヘキサ−4,6−ジエンの脱水産物であるヒドロキシ安息香酸のピークとした場合、水素原子が引き抜かれた結果イオン化したピークと想定できるので、その理論精密質量数は137.0239となる。両者の質量数の差が0.0023となり、LC−TOF型質量分析計(Waters社、LCT Premier XE)の測定誤差内で、両者の質量数は一致した。一方、サリチル酸、メタヒドロキシ安息香酸、パラヒドロキシ安息香酸の標準化合物のHPLC保持時間は1.96分、1.53分、1.40分であったことから、生成した化合物はHPLC保持時間が一致するサリチル酸であった。
続いて、加熱処理がサリチル酸の生成量を向上させるか調べるために、上述したフタル酸変換反応後の培養液に対して、25℃、35℃、45℃、55℃、65℃、75℃、85℃、95℃の8条件で60分間静置する処理を加えた。これらの処理を施した後、50μlとり、5μlの1N HClと0.25 mlの酢酸エチルを加え、激しく5分間懸濁し、遠心にかけた。二層に分かれた上層(酢酸エチル層)を200μlとり、新しい1.5 mlチューブに移し、遠心乾燥機にかけた。乾固したサンプルを10μlのアセトニトリルで激しく懸濁し、190μlの水で希釈した。孔径0.2μmのフィルターで濾過し、LC−TOF型質量分析計(Waters社、LCT Premier XE)で分析した。分析の結果、各条件で生成したサリチル酸の量は表4に示すとおりで、45℃以上に加熱したときに、サリチル酸の生産量が向上することがわかった。
配列番号2:ジオキシゲナーゼ・大サブユニット・ホモログ蛋白質
配列番号3:ジオキシゲナーゼ・小サブユニット・ホモログ蛋白質をコードするDNA
配列番号4:ジオキシゲナーゼ・小サブユニット・ホモログ蛋白質
配列番号5:ジオキシゲナーゼ・フェレドキシン・ホモログ蛋白質をコードするDNA
配列番号6:ジオキシゲナーゼ・フェレドキシン・ホモログ蛋白
配列番号7:ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ・ホモログ蛋白質をコードするDNA
配列番号8:ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ・ホモログ蛋白質
配列番号9:ジヒドロジオール・ジヒドロゲナーゼ・ホモログ蛋白質をコードするDNA
配列番号10:ジヒドロジオール・ジヒドロゲナーゼ・ホモログ蛋白質
配列番号11:ジオキシゲナーゼ・大サブユニット・ホモログ蛋白質をコードするDNA増幅用フォワード・プライマー
配列番号12:ジオキシゲナーゼ・大サブユニット・ホモログ蛋白質をコードするDNA増幅用リバース・プライマー
配列番号13:ジオキシゲナーゼ・小サブユニット・ホモログ蛋白質をコードするDNA増幅用フォワード・プライマー
配列番号14:ジオキシゲナーゼ・小サブユニット・ホモログ蛋白質をコードするDNA増幅用リバース・プライマー
配列番号15:ジオキシゲナーゼ・フェレドキシン・ホモログ蛋白質をコードするDNA増幅用フォワード・プライマー
配列番号16:ジオキシゲナーゼ・フェレドキシン・ホモログ蛋白質をコードするDNA増幅用リバース・プライマー
配列番号17:ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ・ホモログ蛋白質をコードするDNA増幅用フォワード・プライマー
配列番号18:ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ・ホモログ蛋白質をコードするDNA増幅用リバース・プライマー
配列番号19:ジヒドロジオール・ジヒドロゲナーゼ・ホモログ蛋白質をコードするDNA増幅用フォワード・プライマー
配列番号20:ジヒドロジオール・ジヒドロゲナーゼ・ホモログ蛋白質をコードするDNA増幅用リバース・プライマー
配列番号21:ジオキシゲナーゼ・大サブユニット・ホモログ蛋白質の遺伝子内部の制限酵素NotI部位の破壊用PCRフォワード・プライマー
配列番号22:ジオキシゲナーゼ・大サブユニット・ホモログ蛋白質の遺伝子内部の制限酵素NotI部位の破壊用PCRリバース・プライマー
配列番号23:T7プロモーター構築用合成DNA
配列番号24:T7プロモーター構築用合成DNA
配列番号25:T7プロモーター構築用合成DNA
配列番号26:T7プロモーター構築用合成DNA
配列番号27:ターミネーター構築用合成DNA
配列番号28:ターミネーター構築用合成DNA
配列番号29:ターミネーター構築用合成DNA
配列番号30:ターミネーター構築用合成DNA
配列番号31:Burkholderia multivorans ATCC17616株のophD遺伝子の塩基配列
配列番号32:Burkholderia multivorans ATCC17616株のフタル酸トランスポーターophD遺伝子がコードするフタル酸トランスポータータンパク質のアミノ酸配列
配列番号33:ophD遺伝子増幅用フォワード・プライマー
配列番号34:ophD遺伝子増幅用リバース・プライマー
配列番号35:ophD遺伝子内のNotI部位欠損用PCRプライマー
配列番号36:ophD遺伝子内のNotI部位欠損用PCRプライマー
配列番号37:ophD遺伝子内のNotI部位欠損用PCRプライマー
配列番号38:ophD遺伝子内のNotI部位欠損用PCRプライマー
配列番号39:発現ベクターpRTCKM内の2つのSfiI部位に挟まれた合成DNA由来の塩基配列
配列番号40:発現ベクターpRTC_SfiIの造成用のPCRプライマー
配列番号41:発現ベクターpRTC_SfiIの造成用のPCRプライマー
Claims (11)
- 以下の(a)、(b)、(c)または(d)に示すDNA、以下の(e)、(f)、(g)または(h)に示すDNA、以下の(i)、(j)、(k)または(l)に示すDNA、及び以下の(m)、(n)、(o)または(p)に示すDNAを保有し、フタル酸からサリチル酸を生産する能力を有する微生物。
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするDNA。
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において1〜20個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加された配列を含み、かつフタル酸から2,3−ジヒドロキシ安息香酸への転換に関わる機能を有する蛋白質をコードするDNA。
(c)配列番号1に示される塩基配列からなるDNA。
(d)配列番号1に示される塩基配列の全部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフタル酸から2,3−ジヒドロキシ安息香酸への転換に関わる機能を有する蛋白質をコードするDNA。
(e)配列番号4に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするDNA。
(f)配列番号4に示されるアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加された配列を含み、かつフタル酸から2,3−ジヒドロキシ安息香酸への転換に関わる機能を有する蛋白質をコードするDNA。
(g)配列番号3に示される塩基配列からなるDNA。
(h)配列番号3に示される塩基配列の全部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフタル酸から2,3−ジヒドロキシ安息香酸への転換に関わる機能を有する蛋白質をコードするDNA。
(i)配列番号6に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするDNA。
(j)配列番号6に示されるアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加された配列を含み、かつフタル酸から2,3−ジヒドロキシ安息香酸への転換に関わる機能を有する蛋白質をコードするDNA。
(k)配列番号5に示される塩基配列からなるDNA。
(l)配列番号5に示される塩基配列の全部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフタル酸から2,3−ジヒドロキシ安息香酸への転換に関わる機能を有する蛋白質をコードするDNA。
(m)配列番号8に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするDNA。
(n)配列番号8に示されるアミノ酸配列において1〜20個のアミノ酸が欠失、置換お
よび/または付加された配列を含み、かつフタル酸から2,3−ジヒドロキシ安息香酸への転換に関わる機能を有する蛋白質をコードするDNA。
(o)配列番号7に示される塩基配列からなるDNA。
(p)配列番号7に示される塩基配列の全部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフタル酸から2,3−ジヒドロキシ安息香酸への転換に関わる機能を有する蛋白質をコードするDNA。 - さらに、以下の(q)、(r)、(s)または(t)に示すDNAを保有し、フタル酸から2,3−ジヒドロキシ安息香酸を生産する能力を有する請求項1記載の微生物。
(q)配列番号10に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするDNA。
(r)配列番号10に示されるアミノ酸配列において1〜20個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加された配列を含み、かつフタル酸から2,3−ジヒドロキシ安息香酸への転換に関わる機能を有する蛋白質をコードするDNA。
(s)配列番号9に示される塩基配列からなるDNA。
(t)配列番号9に示される塩基配列の全部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフタル酸から2,3−ジヒドロキシ安息香酸への転換に関わる機能を有する蛋白質をコードするDNA。 - 請求項1記載の微生物をフタル酸を含有する培地中でフタル酸と反応させることにより、該培地中にサリチル酸を生成、蓄積させ、該培地からサリチル酸を採取することを特徴とするサリチル酸の製造法。
- 請求項1記載の微生物の培養物または該培養物の処理物およびフタル酸を水性媒体中で混合させることにより、該媒体中にサリチル酸を生成、蓄積させ、該媒体からサリチル酸を採取することを特徴とするサリチル酸の製造法。
- 請求項1記載の微生物をフタル酸を含有する培地中でフタル酸と反応させた後に、該培地の温度を45℃以上にすることにより、サリチル酸の生成・蓄積量を増強することを特徴とする請求項3に記載のサリチル酸の製造法。
- 請求項1記載の微生物の培養物または該培養物の処理物およびフタル酸を水性媒体中で混合させた後に、該媒体の温度を45℃以上にすることにより、サリチル酸の生成・蓄積量を増強することを特徴とする請求項4に記載のサリチル酸の製造法。
- 前記微生物が上記(a)から(p)記載のDNAのいずれか1つ以上のDNAがコードする蛋白質の生産量が増強された微生物であることを特徴とする請求項3から6のいずれか1項に記載のサリチル酸の製造法。
- 請求項2記載の微生物をフタル酸を含有する培地中でフタル酸と反応させることにより、該培地中に2,3−ジヒドロキシ安息香酸を生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする2,3−ジヒドロキシ安息香酸の製造法。
- 請求項2記載の微生物の培養物または該培養物の処理物およびフタル酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に2,3−ジヒドロキシ安息香酸を生成、蓄積させ、該媒体から2,3−ジヒドロキシ安息香酸を採取することを特徴とする2,3−ジヒドロキシ安息香酸の製造法。
- 前記微生物が上記(a)から(t)記載のDNAのいずれか1つ以上のDNAがコードする蛋白質の生産量が増強された微生物であることを特徴とする請求項8または9に記載の2,3−ジヒドロキシ安息香酸の製造法。
- 受託番号がNITE BP-1006であるシュードモナス・スチュツェリ(Pseudomonas stutzeri)PTH10株。
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JPN6015007391; Appl. Microbiol. Biotechnol., 2006, Vol.72, p.1263-1269 * |
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