JP2024517485A - フェニルプロパノイド化合物の生合成 - Google Patents

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Abstract

本発明は、フェニルプロパノイド化合物の生産の分野、特に、フェニルプロパノイド化合物の生産のための遺伝子改変型菌株の分野に関する。特に、本発明は、3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソン酸-7-リン酸(DAHP)をコードする突然変異型AroF-I遺伝子を含むシュードモナス・プチダの遺伝子改変型菌株、及びフェニルプロパノイド化合物、特にクマル酸又はフランビノンの合成のためのその使用に関する。

Description

本発明は、フェニルプロパノイド化合物の生産の分野、特に、クマル酸又はフランビノン等のフェニルプロパノイド化合物の生産のための遺伝子改変型菌株に関する。
何年にもわたって、「天然」香味料及び香料の生物生産は、ますます環境的に責任を持とうと努力する消費者の必要性を満たすために、工業に関する研究の重要な領域であった。特に微生物を用いる合成の生物学がこの天然生産を可能にするが、収量は、大規模生産に対しては常に十分ではない。
ラズベリー(ルブル・イダエウス(Rubus idaeus))の風味は、200種類超の化合物に関連付けられるが、天然のフェノール性化合物であるフランビノンが最も大きな影響を有する化合物であり、特徴的なラズベリー風味を規定する(Kleskら、2004、J.Agric.Food Chem.52、5155～61頁;Larsenら、1991、Acta Agric.Scand.41、447～54頁)。
ラズベリー中には少量しか存在しないので(果実1kg当たり1～4mg)、天然のフランビノンは極めて高価である(Larsenら、1991)。しかしながら、その天然の入手可能性は限られるので、バイオテクノロジーによりフランビノンを生産することが非常に望ましい。
この文脈において、フェニルプロパノイド化合物、特にフランビノンの生合成経路は、この経路の主要な酵素のうちの一部をコードする異種遺伝子を挿入することにより、微生物内で再現することができる。
チロシンは、特にクマル酸又はフランビノンの前駆体であるので、フェニルプロパノイド化合物の生合成に対して重要なアミノ酸である。
実際には、フランビノンは、4工程生合成経路を介して、最初の基質としての芳香族アミノ酸L-チロシンから取得することができる。
第1工程では、チロシンが、チロシンアンモニアリアーゼ(TAL、EC 4.3.1.23)により脱アミノ化され、クマル酸が形成される。4-クマル酸:CoAリガーゼ(4CL、EC 6.2.1.12)により触媒されて、補酵素A(CoA)の分子がクマル酸へと結び付けられる。続いて、クマロイル-CoAがベンザルアセトンシンターゼ(BAS、EC 2.3.1.212)により4-ヒドロキシベンザルアセトンへと変換される。この反応は、脱炭酸縮合であり、補基質として1単位のマロニル-CoAを用いる。最終工程は、ベンザルアセトン還元酵素によるフランビノンへの4-ヒドロキシベンザルアセトンの還元である。
したがって、フェニルプロパノイド化合物、特にフランビノンの生産のためのプラットフォームとしてのチロシンを過剰産生する菌株の開発は、これらの化合物の生合成に対する重要な出発点である。
しかしながら、微生物におけるチロシンの生産は、厳密に調節されているのと同様に複雑である。これは、シキミ酸経路としても公知であるチロシン産生経路中の一部の酵素が、細胞内での濃度が高すぎるようになった場合に、阻害部位へと結合することによりそれらの活性を阻害する、このアミノ酸による負のフィードバックループで調節されるからである。この調節システムは、多すぎる量のチロシンが微生物中に存在する場合、フィードバック阻害と称される。
このことにもかかわらず、この阻害に対して「抵抗性」である酵素を取得し、したがって、チロシン産生経路を脱調節することは、突然変異誘発により可能であるはずである。チロシンフィードバック阻害に対して抵抗性であるこれらの変異体は、「フィードバック抵抗性」を表すfbr変異体と称される。
多数の論文が、大腸菌(E.coli)におけるこの経路の脱調節を記載し、1種類の酵素が、特によく研究されてきた:DAHPシンターゼ(DAHP=3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソン酸-7-リン酸)。シキミ酸経路における最初の反応は、DAHPを生じるホスホ(エノール)ピルビン酸(PEP)とエリトロース-4-リン酸(erthythrose-4-phosphate)(E4P)との縮合からなる。
このDAHPシンターゼ活性は、大腸菌においては3種類のイソ酵素により行われる:AroG(フェニルアラニンによりフィードバック阻害される)、AroF(チロシンによりフィードバック阻害される)及びAroH(トリプトファンによりフィードバック阻害される)。これらのタンパク質の構造は公知であり、フィードバック阻害に関連付けられる部分構造(及び含まれるアミノ酸も)もまた、文献中に徹底的に記載されている。
Kikuchiら、1997及びCuiら、2019は、それぞれ、フェニルアラニン及びチロシンフィードバック阻害に対して抵抗性である変異体AroGfbr及びAroFfbrを大腸菌において同定、記載及び研究した。タンパク質TyrAのfbr変異体(変異体tyrAfbr)もまた、Lutke-Eversloh及びStephanopoulos(2005)により大腸菌において記載されてきた(Lutke-Eversloh and Stephanopoulos、Appl.Environ Microbiol.2005年11月;71(11):7224～8頁)。
2007年には、Lutke-Eversloh及びStephanopoulos(Lutke-Eversloh and Stephanopoulos、Appl.Environ Microbiol.2007年11月;75(1):103～10頁)はまた、これらの様々な突然変異型酵素を組み合わせることにより取得される、チロシンを過剰産生する大腸菌株も記載した。これらの菌株は、クマル酸(Kangら、2012)、又は、特に、aroGfbr及びtyrAfbr突然変異に加えて、rpoA遺伝子の突然変異を介して、ナリンゲニン(Santosら、2011)等のフェニルプロパノイドを生産するために用いられた。
チロシンを過剰産生する大腸菌株を取得するために行われた改変の総説が、論文「Modular engineering of L-tyrosine production in E. coli」(Juminagaら、2011)に記載されている。
フェニルプロパノイド化合物はまた、Rodriguezら、2015により記載される通り、チロシンを過剰発現するサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)菌株からも合成されてきた。
文献GB2416769は、そのうちの少なくとも一方が異種供給源に由来する酵素4CL及びBASをコードする遺伝子を含む微生物を用いるフランビノンの生産の可能性を記載する。好ましい微生物は大腸菌(菌株BL21)であり、有利には内在性であるBARをコードする配列を含む、BAR、C4H、PAL及び/又はCHSをコードする配列を更に含むことができる。
しかしながら、大腸菌又はS.セレビシエ(S.cerevisiae)は、フェニルプロパノイド化合物の毒性に対して良好な耐性を有さず、したがって、その生産のための最も好適な微生物ではないようである。
シュードモナス属(Pseudomonas)の細菌、特に、細菌シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)は、これらの非常に毒性の分子に対して比較的耐性が高い(Caleroら、2017)。しかしながら、P.プチダ(P.putida)における芳香族アミノ酸の産生に関与する酵素は、詳細に記載されていない。
結果として、P.プチダにおけるチロシン等のシキミ酸経路誘導体の過剰産生は、大腸菌由来のAroGfbr及びTyrAfbr変異体の使用を含み、これは特に効果的ではない(Caleroら、2016)。
チロシン及びフェノールの過剰産生が、3種類の遺伝子:trpEP290S、aroF-I P148L及びpheAT310I中の点突然変異を遂行することにより、細菌シュードモナス・タイワネンシス(Pseudomonas taiwanensis)VLB120において記載されている(Wynandsら、Metab Eng.2018年5月;47:121～133頁)。
しかしながら、フェニルプロパノイド化合物、特にクマル酸及びフランビノンの生産を可能にする、チロシンを過剰産生するシュードモナス・プチダの新規酵素及び新規菌株を開発する必要性が未だにある。
GB2416769
Kleskら、2004、J.Agric.Food Chem.52、5155～61頁 Larsenら、1991、Acta Agric.Scand.41、447～54頁 Lutke-Eversloh and Stephanopoulos、Appl.Environ Microbiol.2005年11月;71(11):7224～8頁 Lutke-Eversloh and Stephanopoulos、Appl.Environ Microbiol.2007年11月;75(1):103～10頁 Wynandsら、Metab Eng.2018年5月;47:121～133頁 「Strategies used for genetically modifying bacterial genome: site-directed mutagenesis, gene inactivation」、Journal of Zhejiang Univ-Sci B(Biomed&Biotechnol)2016 17(2):83～99頁 Martinez-Garcia and de Lorenzo、「Pseudomonas putida in the quest of programmable chemistry」、Current Opinion in Biotechnology、59:111～121頁、2019 Ottoら、2019、Front Bioeng Biotechnol、11月20日;7:312 Waterhouse、A.ら、SWISS-MODEL:homology modeling of protein structures and complexes.Nucleic Acids Res.46(W1)、W296-W303(2018) O.Trottら、「AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization and multithreading」、Journal of Computational Chemistry、2010 Cui、Dら、Molecular basis for feedback inhibition of tyrosine-regulated 3-deoxy-d-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase from Escherichia coli、2019 Ding、R.ら、Introduction of two mutations into AroG increases phenylalanine production in Escherichia coli.Biotechnol Lett 36、2103～2108頁(2014) Kikuchi Yら、Mutational analysis of the feedback sites of phenylalanine-sensitive 3-deoxy-d-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase of Escherichia coli.Appl Environ Microbiol 63:761～762頁(1997) Schafer A、Tauch A、Jager W、Kalinowski J、Thierbach G、Puhler A.Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum.Gene 1994年7月22日;145(1):69～73頁 Simon、R.、Priefer、U.及びA.Pulher、A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria. Nature BioTechnology、第1巻、784～791頁(1983)
これまで開発されてきたチロシンを過剰産生する菌株は、原則的に大腸菌及びS.セレビシエ菌株である。しかしながら、これらの菌株は、フェニルプロパノイド化合物の毒性に対して良好な耐性を有さず、且つ、したがって、その生産に対して最も好適な微生物ではない。
したがって、フェニルプロパノイド化合物の生産を可能にする、チロシンを過剰産生する新規菌株を開発する特定の必要性がある。
本開示はこの状況を改善するであろう。
本発明の態様のうちの1つは、配列番号1の配列を有し、少なくとも1つのP160L突然変異、P160L/Q164A二重突然変異、又はP160L/S193A二重突然変異、好ましくはP160L/S193A二重突然変異を有する、3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソン酸-7-リン酸(DAHP)シンターゼをコードする突然変異型AroF-I遺伝子を含む、シュードモナス・プチダの遺伝子改変型菌株に関する。
本発明の別の態様は、本発明に従うシュードモナス・プチダの遺伝子改変型菌株を利用することによる、フェニルプロパノイド化合物又はフェニルプロパノイド誘導体を合成するための方法に関する。
最後に、本発明は、フェニルプロパノイド化合物の合成のための、シュードモナス・プチダの遺伝子改変型菌株の使用にも関する。
以下の段落において説明される特徴は、任意により遂行され得る。それらは、独立して、又は互いに組み合わせて遂行することができる。
他の特徴、詳細及び利点が、以下の詳細な説明を読む際、及び添付の図面を調べる際に明らかになるであろう。
野生型(WT)AroF-Iタンパク質による、芳香族アミノ酸の存在下又は非存在下での、mM単位での消費されたPEPのグラフを示す図である。提示される結果は、3回の独立した反復に由来する。 単一変異体AroF-I-G191、AroF-I-P160及びAroF-I-S193と比較したAroF-I WTタンパク質による、芳香族アミノ酸の存在下又は非存在下での、mM単位での消費されたPEPの割合を示すグラフを示す図である。提示される結果は、3回の独立した反復に由来する。 二重変異体AroF-I-P160_G191、AroF-I-P160L_Q164、AroF-I-P160_S190及びAroF-I-P160_S193と比較したAroF-I WTタンパク質による、芳香族アミノ酸の存在下又は非存在下での、mM単位での消費されたPEPの割合を示すグラフを示す図である。提示される結果は、3回の独立した反復に由来する。 単一変異体AroF-I-P160及びAroF-I-S193並びに二重変異体AroF-I-P160_S193と比較したAroF-I WTタンパク質による、芳香族アミノ酸の存在下又は非存在下での、mM単位での消費されたPEPの割合を示すグラフを示す図である。提示される結果は、3回の独立した反復に由来する。 P.プチダを形質転換及び遺伝子改変するために用いることができる接合プロトコールを表す図である。 酵素AroF-I WT/TAL(aroF-I WT)及びaroF-I fbr P160L/S193A/TAL(aroF-I fbr)を発現するシュードモナス・プチダ菌株によるクマル酸(PCA)及び桂皮酸(CA)の産生を表すグラフを示す図である。 酵素酵素AroF-I WT/TAL(aroF-I WT)、AroF-I WT/TAL+空プラスミド(aroF-I WT+対照)、AroF-I WT/TAL+phhA/Bプラスミド(aroF-I WT+phhA/B)、aroF-I fbr P160L/S193A/TAL(aroF-I fbr)、aroF-I fbr P160L/S193A/TAL+空プラスミド(aroF-I fbr+対照)、及びaroF-I fbr P160L/S193A/TAL+phhA/Bプラスミド(aroF-I fbr+phhA/B)を発現するシュードモナス・プチダ菌株による総フェノール類の産生及び総フェノール類中のクマル酸の割合(%PCA)を表すグラフを示す図である。araC/pBADプロモーターからのphhA/B遺伝子の発現は、誘導されるか又は誘導されない。
したがって、本発明の第1の主題は、その配列が配列番号1の配列に対して少なくとも80%の同一性を有し、且つ少なくとも1つのP160L突然変異、P160L/Q164A二重突然変異、又はP160L/S193A二重突然変異、好ましくはP160L/S193A二重突然変異を有する、3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソン酸-7-リン酸(DAHP)シンターゼをコードする突然変異型AroF-I遺伝子を含む、シュードモナス・プチダの遺伝子改変型菌株に関する。
本記載の目的のために、表現「シュードモナス・プチダの遺伝子改変型菌株」、「シュードモナス・プチダの改変型菌株」、「遺伝子改変型菌株」及び「改変型菌株」は、同義であると見なされる。
特に、「遺伝子改変型菌株」とは、(i)そのゲノムへと安定的にインテグレーションされるか、且つ/若しくはベクター、例えば、プラスミドベクター上に存在する、少なくとも1種の組み換え核酸、若しくは導入遺伝子、又は(ii)当業者に公知の形質転換技術若しくは遺伝子編集技術により取得される、ヌクレオチド挿入、置換若しくは欠失による1つ若しくは複数の非天然突然変異のいずれかを含む菌株を意味する。
実際には、形質転換、突然変異誘発又は遺伝子編集による遺伝子改変のための技術は、当業者に周知であり、例えば、「Strategies used for genetically modifying bacterial genome: site-directed mutagenesis, gene inactivation」、Journal of Zhejiang Univ-Sci B(Biomed&Biotechnol)2016 17(2):83～99頁、及びMartinez-Garcia and de Lorenzo、「Pseudomonas putida in the quest of programmable chemistry」、Current Opinion in Biotechnology、59:111～121頁、2019に記載されている。
好ましくは、実施例2に記載される突然変異誘発技術が、シュードモナス・プチダにおいて突然変異型又は組み換え遺伝子をインテグレーションするために用いられるであろう。
特に、遺伝子改変型菌株は、シュードモナス・プチダにおいて天然に発現される1つ又は複数の遺伝子の発現を変化させる核酸を含むことができる。
特定の実施形態に従えば、遺伝子改変型菌株は、シュードモナス・プチダにおいて天然に発現されない1つ又は複数の酵素をコードする核酸を含むことができる。
P.プチダKT2440の野生型菌株は、例えば、NBRC菌株コレクション(独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター(National Institute of Technology and Evaluation Biological Resource center)https://www.nite.go.jp/en/nbrc/、NBRC100650)において入手可能である。
更に、チロシン産生に対して最適化されたシュードモナス・プチダ又はシュードモナス・タイワネンシスの菌株は、当業者に公知であり、当業者は、本発明に従う遺伝子改変型菌株を取得するための創始菌株としてそれらを用いることができる(Caleroら、2016;Wierckxら、2005、Appl Environ Microbiol.71(12):8221～7頁;Wynandsら、2018;Ottoら、2019、Front Bioeng Biotechnol、11月20日;7:312)。
本発明の目的のために、パーセンテージ同一性とは、参照配列とのアライメント及び比較後の所与の断片全体にわたるヌクレオチド又はアミノ酸配列中の同一残基のパーセンテージを意味する。アライメントアルゴリズムが比較のために用いられ、比較対象の配列が、アルゴリズムの対応するパラメータを用いて入力される。デフォルトアルゴリズムパラメータを用いることができる。
好ましくは、核酸配列比較のために、且つパーセンテージ同一性を決定するために、https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiで記載される通りのBLASTアルゴリズムが、デフォルトパラメータと共に用いられる。
本発明の目的のために、「突然変異型AroF1遺伝子」とは、遺伝子改変型菌株におけるその発現を可能にするプロモーターの制御下に、3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソン酸-7-リン酸(DAHP)シンターゼの突然変異型をコードする少なくとも一部分を含む核酸を意味する。
本発明の目的のために、3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソン酸-7-リン酸(DAHP)シンターゼとは、細菌内で、DAHPを生じるホスホ(エノール)ピルビン酸(PEP)とエリトロース-4-リン酸(erthythrose-4-phosphate)(E4P)との縮合からなるシキミ酸経路における最初の反応を行うことができる酵素(EC 2.5.1.54)を意味する。
特定の実施形態に従えば、シュードモナス・プチダの遺伝子改変型菌株は、そのアミノ酸配列が配列番号1の配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%及び最も詳細には少なくとも98%の同一性を有し、少なくとも1つのP160L突然変異、P160L/Q164A二重突然変異、又はP160L/S193A二重突然変異、好ましくはP160L/S193A二重突然変異を有する、DAHPシンターゼをコードする突然変異型AroF-I遺伝子を含む。
内在性シュードモナス・プチダAroF-I遺伝子は、配列番号1のアミノ酸配列のDAHPシンターゼをコードする。特定の実施形態では、したがって、本発明に従う遺伝子改変型菌株は、内在性AroF-I遺伝子に加えて、P160L突然変異、P160L/Q164A二重突然変異、又はP160L/S193A二重突然変異、好ましくはP160L/S193A二重突然変異を含む突然変異型タンパク質をコードする少なくとも1つの組み換え突然変異型AroF-I核酸配列を含むことができる。
特定の実施形態に従えば、シュードモナス・プチダの遺伝子改変型菌株は、配列番号2のアミノ酸配列により規定される通りのP160L突然変異を含むDAHPシンターゼをコードする突然変異型AroF-I遺伝子を含む。
本実施形態の変形に従えば、シュードモナス・プチダの改変型菌株は、その配列が配列番号2の配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%及び最も詳細には少なくとも98%の同一性を有し、且つP160L突然変異を含むDAHPシンターゼをコードする突然変異型AroF-I遺伝子を含む。
別の特定の実施形態に従えば、シュードモナス・プチダの改変型菌株は、DAHPシンターゼをコードし、且つ少なくとも1つのP160L/Q164A二重突然変異を有する突然変異型AroF-I遺伝子を含む。本実施形態に従えば、突然変異型AroF-I遺伝子は、配列番号3のアミノ酸配列により規定されるP160L/Q164A二重突然変異を含むDAHPシンターゼをコードする。
本実施形態の変形に従えば、シュードモナス・プチダの改変型菌株は、その配列が配列番号3の配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%及び最も詳細には少なくとも98%の同一性を有し、且つP160L/Q164A二重突然変異を含むDAHPシンターゼをコードする突然変異型AroF-I遺伝子を含む。
好ましい実施形態に従えば、シュードモナス・プチダの改変型菌株は、DAHPシンターゼをコードし、且つ少なくとも1つのP160L/S193A二重突然変異を有する突然変異型AroF-I遺伝子を含む。本実施形態に従えば、突然変異型AroF-I遺伝子は、配列番号4のアミノ酸配列により規定されるP160L/S193A二重突然変異を含むDAHPシンターゼをコードする。
本実施形態の変形に従えば、シュードモナス・プチダの改変型菌株は、その配列が配列番号4の配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%及び最も詳細には少なくとも98%の同一性を有し、且つP160L/S193A二重突然変異を含むDAHPシンターゼをコードする突然変異型AroF-I遺伝子を含む。
先行する実施形態と組み合わせることができる一実施形態では、突然変異型AroF-I遺伝子のコード配列は、本発明に従う遺伝子改変型菌株における突然変異型AroF-I遺伝子の過剰発現を可能にする、例えば、プロモーターptrc、xyls/pm又はaraC/pBADから選択される異種プロモーター、特に、構成的又は誘導性プロモーターの制御下に置かれる。好ましい実施形態では、本発明に従う遺伝子改変型菌株における突然変異型AroF-I遺伝子のコード配列は、例えば、AroH遺伝子を破壊することにより、又はAroH遺伝子及び特にそのコード配列のうちの全部若しくは一部分を欠失させることにより、AroH遺伝子を非機能性にするように挿入される。
AroH遺伝子は、別のDAHPシンターゼ(AroFのイソ酵素)をコードする。したがって、一実施形態では、本発明に従う遺伝子改変型菌株は、欠失されたか又は破壊されたAroH遺伝子及び先に記載される通りの突然変異型AroF-I遺伝子を含む少なくとも1つの組み換え核酸又は突然変異型AroF-I遺伝子のコード配列を含む。
完全に有利な様式で、特異的突然変異を遂行することにより、本出願人は、チロシンによるフィードバック阻害に対して抵抗性であり、それにより、チロシン産生経路を脱調節する組み換えDAHPシンターゼを発現することができるシュードモナス・プチダの菌株を開発した。言い換えれば、本発明は、フェニルプロパノイド化合物の合成における最終生成物として又は中間生成物としてチロシンを過剰産生する菌株を生成することを可能にする。特に、この過剰産生は、本発明に従う改変型菌株によるフェニルプロパノイド化合物の生産に対して特に有利である。
フェニルプロパノイド化合物は、フェニルアラニン又はチロシンから生合成される植物由来有機化合物のクラスである。フェニルプロパノイド化合物の例として、クマル酸、p-クマロイル-CoA、4-ヒドロキシベンザルアセトン、フランビノン、ジンゲロン、バニリン、フラボノイド及びスチルベノイドに特に言及することができる。
本発明の目的のために、「チロシンを過剰産生する菌株」とは、最終生成物として又は中間生成物としてのいずれかで、配列番号1のアミノ酸配列(非突然変異型遺伝子)のDAHPシンターゼをコードするAroF-I遺伝子を含むシュードモナス・プチダの野生型菌株よりも多量のチロシンを産生することができる、シュードモナス・プチダの改変型菌株を意味する。
チロシンをクマル酸等のフェニルプロパノイド化合物へと変換することができるために、本発明に従う改変型菌株は、有利には、少なくとも1つの追加の組み換え遺伝子を更に含むことができる。
本発明の目的のために、表現「追加の組み換え遺伝子」とは、先に規定される通りの突然変異型AroF-I遺伝子に加えて、シュードモナス・プチダ菌株中に存在するいずれかの組み換え遺伝子を意味する。追加の組み換え遺伝子は、内在性シュードモナス・プチダ遺伝子を過剰発現するための異種プロモーター、例えば強力プロモーター又はシュードモナス・プチダにおいて天然に発現されないタンパク質をコードする組み換えコード配列の挿入から生じ得る。
特定の実施形態に従えば、シュードモナス・プチダの遺伝子改変型菌株は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ(phhA)活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも追加の組み換え遺伝子及びテトラヒドロビオプテリンデヒドラターゼ(phhB)活性を有するポリペプチドをコードする追加の組み換え遺伝子を含む。
本出願人は、シュードモナス・プチダに内在性に存在するが、これらの2種類の酵素が十分に活性でないか、且つ/又はそれらの発現がフェニルプロパノイド化合物の生産のための菌株の使用の文脈において不十分である可能性があることを観察した。本実施形態に従えば、したがって、活性は、これら2種類の酵素phhA及びphhBを過剰発現させることにより最適化されている。過剰発現は、例えば、異種プロモーター、特に構成的又は誘導性プロモーターの制御下にこれらの酵素に対する追加の組み換え遺伝子を置くことにより、得ることができる。そのようなプロモーターの例は、特に、プロモーターptrc、xylS/pm、araC/pBADである。
酵素phhA及びphhBの過剰発現は、好ましくは、強力な誘導性プロモーターaraC/pBADoptの制御下にこれらの酵素に対する追加の組み換え遺伝子を置くことにより得られる(Priorら、2010)。
遺伝子の過剰発現とは、同じ菌株であるが、遺伝子が天然のプロモーターの制御下にのみ発現される菌株でのものよりも強い、遺伝子改変型菌株での当該遺伝子の発現を意味する。過剰発現は、好ましくは強力プロモーターの制御下に、菌株のゲノムへと遺伝子の1つ若しくは複数のコピーを直接的に挿入することにより、又は、好ましくはこれもまた強力プロモーターの制御下に、プラスミド、特にマルチコピープラスミド中にクローニングすることによっても、得ることができる。
先行する実施形態と組み合わせることができる別の実施形態では、内在性phhA及びphhBコード配列は、例えば、本発明に従う遺伝子改変型菌株において対応する内在性コード配列を過剰発現させるために、先に規定される通りの異種プロモーターの制御下に置かれる。
特に、改変型菌株は、その配列が、配列番号5のアミノ酸配列により、又は配列番号5の配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%及び最も詳細には少なくとも98%の同一性を有する配列により規定され、且つphhA活性を有する酵素をコードする、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ(phhA)(EC 1.14.16.1)をコードする追加の組み換え遺伝子、並びにその配列が、配列番号6のアミノ酸配列により、又は配列番号6の配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%及び最も詳細には少なくとも98%の同一性を有する配列により規定され、且つphhB活性を有する酵素をコードする、テトラヒドロビオプテリンデヒドラターゼ(phhB)(EC 4.2.1.96)をコードする追加の組み換え遺伝子を、特に、それらの過剰発現を可能にする異種プロモーターの制御下に含むことができる。
本実施形態に従えば、本発明に従う遺伝子改変型菌株は、チロシンを過剰産生することができ、且つphhA及びphhB酵素を介してフェニルアラニンをチロシンへと変換することもできる。
特定の実施形態に従えば、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ(phhA)及びテトラヒドロビオプテリンデヒドラターゼ(phhB)をコードする追加の組み換え遺伝子は、シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)(phhA VVN86558.1/phhB:AYF50180.1)又は緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)(phhA AAA25936.1/phhB AAA25937.1)の対応するコード配列を含む。
好ましい実施形態に従えば、シュードモナス・プチダの改変型菌株は、配列番号4のアミノ酸配列又は配列番号4の配列に対して少なくとも85%、90%、95%及び最も詳細には少なくとも98%の同一性を有する配列により規定されるP160L/S193A二重突然変異を含むDAHPシンターゼをコードする突然変異型AroF-I遺伝子、及び以下の2種類の追加の組み換え遺伝子を含む:
- フェニルアラニンヒドロキシラーゼ(phhA)、好ましくは配列番号5の配列又は配列番号5の配列に対して少なくとも85%、90%、95%及び最も詳細には少なくとも98%の同一性を有する配列により規定されるphhAをコードする組み換え遺伝子、並びに
- テトラヒドロビオプテリンデヒドラターゼ(phhB)、好ましくは配列番号6の配列又は配列番号6の配列に対して少なくとも85%、90%、95%及び最も詳細には少なくとも98%の同一性を有する配列により規定されるphhBをコードする組み換え遺伝子;
- 好ましくは、前記遺伝子phhA及びphhBは、それらの過剰発現を可能にする異種プロモーターの制御下に置かれている。
好ましくは先行する実施形態と組み合わせることができる別の特定の実施形態に従えば、シュードモナス・プチダの遺伝子改変型菌株は、チロシンアンモニアリアーゼ(TAL)活性を有するポリペプチドをコードする追加の組み換え遺伝子を含む。TALをコードする組み換え遺伝子は、微生物ロドトルラ・グルチニス(Rhodotorula glutinis)に由来し、参考文献Zhouら、2015(このTAL酵素中の3箇所の点突然変異はこの酵素をより効果的にする:S9N;A11T;E518V)に従って最適化することができる。このTAL酵素は、TAL_rg_optと称される。特に、改変型菌株は、その配列が、配列番号7のアミノ酸配列(TAL_rg_opt)により、又は配列番号7の配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%及び最も詳細には少なくとも98%の同一性を有する配列により規定され、且つTAL活性を有する酵素をコードする、チロシンアンモニアリアーゼ(TAL)(EC 4.3.1.23)をコードする組み換え遺伝子を含むことができる。
特定の実施形態に従えば、本発明に従う遺伝子改変型菌株は、チロシンを過剰産生することができ、且つTAL酵素を介してそれをクマル酸へと変換することもできる。
先行する実施形態と組み合わせることができる別の特定の実施形態に従えば、シュードモナス・プチダの遺伝子改変型菌株は、4-クマル酸-CoAリガーゼ(4-CL)をコードする追加の組み換え遺伝子を含む。特に、改変型菌株は、その配列が、配列番号8のアミノ酸配列により、又は配列番号8の配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%及び最も詳細には少なくとも98%の同一性を有する配列により規定され、且つ4-CL活性を有する酵素をコードする、4-CL(EC 6.2.1.12)をコードする組み換え遺伝子を含むことができる。
この特定の実施形態に従えば、遺伝子改変型菌株は、4-CL酵素を介してクマル酸をp-クマロイル-CoAへと変換することができる。
好ましくは先行する実施形態と組み合わせることができる別の特定の実施形態に従えば、シュードモナス・プチダの遺伝子改変型菌株は、ベンザルアセトンシンターゼ(BAS)活性を有するポリペプチドをコードする追加の組み換え遺伝子を含む。特に、改変型菌株は、その配列が、配列番号9のアミノ酸配列により、又は配列番号9の配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%及び最も詳細には少なくとも98%の同一性を有する配列により規定され、且つBAS活性を有する酵素をコードする、BAS(EC 2.3.1.212)をコードする組み換え遺伝子を含むことができる。
この特定の実施形態に従えば、遺伝子改変型菌株は、BAS酵素を介してp-クマロイル-CoAを4-ヒドロキシベンザルアセトン(4-hydroxybenzalcetone)へと変換することができる。
別の特定の実施形態に従えば、シュードモナス・プチダの遺伝子改変型菌株は、複数の追加の組み換え遺伝子、すなわち、以下の5種類の追加の組み換え遺伝子を含む:
- 特に、その過剰発現を可能にする異種プロモーターの制御下の、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ(phhA)、好ましくは配列番号5の配列により規定されるphhAをコードする組み換え遺伝子、
- 特に、その過剰発現を可能にする異種プロモーターの制御下の、テトラヒドロビオプテリンデヒドラターゼ(phhB)、好ましくは配列番号6の配列により規定されるphhBをコードする組み換え遺伝子、
- チロシンアンモニアリアーゼ(TAL_RG_OPT)、好ましくは配列番号7の配列により規定されるTAL_RG_OPTをコードする組み換え遺伝子、
- 4-クマル酸-CoAリガーゼ(4-CL)、好ましくは配列番号8の配列により規定される4-CLをコードする組み換え遺伝子、
- ベンザルアセトンシンターゼ(BAS)、好ましくは配列番号9の配列により規定されるBASをコードする組み換え遺伝子。
酵素TAL、4-CL及びBASは全て、フェニルプロパノイド化合物の合成に関与する酵素である。
この好ましい実施形態に従えば、改変型菌株は、多数のフェニルプロパノイド化合物、すなわち、特にクマル酸、p-クマロイル-CoA及び4-ヒドロキシベンザルアセトンを産生することができる。
本発明の別の主題は、その配列が配列番号1の配列に対して少なくとも80%の同一性を有する3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソン酸-7-リン酸(DAHP)シンターゼをコードする追加の組み換えAroF-I遺伝子を含み、酵素phhA及びphhBをコードする遺伝子が過剰発現される、シュードモナス・プチダの遺伝子改変型菌株に関する。
フェニルプロパノイド化合物を合成するための方法
本発明の別の主題は、1つ又は複数のフェニルプロパノイド化合物を合成するための方法に関する。
フェニルプロパノイド化合物は、先に規定される通りであり得る。
本発明に従う合成方法は、突然変異型遺伝子及び/又は1つ若しくは複数のフェニルプロパノイド化合物の合成に対して必要とされる追加の組み換え遺伝子の発現を可能にする条件下で、培養培地中において、先に規定される通りのシュードモナス・プチダの遺伝子改変型菌株を生育させる工程の遂行を含む。
特定の実施形態に従えば、本発明に従う合成方法は、多量のクマル酸を生成することを可能にする。
本実施形態の変形に従えば、方法は、例えば、配列番号2、配列番号3又は配列番号4の配列の、3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソン酸-7-リン酸(DAHP)シンターゼをコードする突然変異型AroF-I遺伝子、及び以下の酵素をコードする少なくとも追加の組み換え遺伝子を含むシュードモナス・プチダの遺伝子改変型菌株を生育させる工程を含むことができる:
- 配列番号5の配列のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ(phhA)、
- 配列番号6の配列のテトラヒドロビオプテリンデヒドラターゼ(phhB)、
- 及び配列番号7の配列のチロシンアンモニアリアーゼ(TAL_RG_OPT)。
別の特定の実施形態に従えば、本発明に従う合成方法は、フランビノン、特に、その工業的量を、特に少なくとも500Lの発酵器において少なくとも20g/Lのフランビノンに等しい収率で生成することを可能にする。
本実施形態に従えば、方法は、配列番号2、配列番号3又は配列番号4の配列の3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソン酸-7-リン酸(DAHP)シンターゼをコードする突然変異型AroF-I遺伝子を含み、且つ以下の酵素をコードする追加の組み換え遺伝子を含むシュードモナス・プチダの遺伝子改変型菌株を生育させる工程を含む:
- チロシンアンモニアリアーゼ(TAL_RG_OPT)、好ましくは、配列番号7の配列により規定されるTAL_RG_OPT、
- 4-クマル酸-CoAリガーゼ(4-CL)、好ましくは、配列番号8の配列により規定される4-CL、
- ベンザルアセトンシンターゼ(BAS)、好ましくは、配列番号9の配列により規定されるBAS。
本発明に従う合成方法はまた、クマル酸又はフランビノン等のフェニルプロパノイド化合物を精製及び/又は回収する工程も含むことができる。
特定の実施形態に従えば、菌株は、その配列が配列番号1の配列に対して少なくとも80%の同一性を有する3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソン酸-7-リン酸(DAHP)シンターゼをコードする追加の組み換えAroF-I遺伝子を含み、酵素phhA及びphhBをコードする遺伝子が過剰発現される、シュードモナス・プチダの遺伝子改変型菌株である。
本発明に従う菌株の使用
本発明の別の主題は、フェニルプロパノイド化合物の合成のための、先に規定される通りのシュードモナス・プチダの菌株の使用に関する。
好ましい実施形態に従えばフェニルプロパノイド化合物は、クマル酸、p-クマロイル-CoA、4-ヒドロキシベンザルアセトン及びフランビノンから、好ましくはクマル酸及び/又はフランビノンから選択される。
本発明は、単に例示のために与えられ、且つ特許請求の範囲により規定される通りの本発明の範囲を限定することは意図されない、以下の非限定的実施例に照らして、よりよく理解されるであろう。
(実施例1)
チロシンフィードバック阻害に対して抵抗性である3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソン酸-7-リン酸(DAHP)の生成を可能にする変異体の開発
A.in silico研究
用いられる出発酵素は、P.プチダにおいて3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソン酸-7-リン酸(DAHP)として特定されるAroF-I酵素である(Uniprot識別子Q88KG6)。
この酵素の三次構造(PDB形式での)を、Waterhouse、A.ら(SWISS-MODEL:homology modeling of protein structures and complexes.Nucleic Acids Res.46(W1)、W296-W303(2018))に記載される方法論を用いて、そのタンパク質配列から再構築した。配列相同性により選択された基本構造は、サッカロマイセス・セレビシエの3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソン酸-7-リン酸シンターゼのものであった。
チロシンフィードバック阻害を特徴付ける領域は、大腸菌における相同タンパク質を介して文献中で特定されている。これら2種類の酵素の三次構造のアライメントを用いて、AroF-Iにおけるこのフィードバック阻害に対応する領域を特定した。
次に、チロシン分子のAroF-I酵素とのドッキングを、O.Trottら(「AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization and multithreading」、Journal of Computational Chemistry、2010)により記載される方法論を用いて行った。
この方法は、ドッキングポケット中でのフェニルアラニンとの化学結合の形成に関与するアミノ酸;すなわち、とりわけ160位(P160)、164位(Q164)、190位(S190)、191位(G191)、193位(S193)及び225位(I225)でのアミノ酸を特定することを可能にした。
文献中並びにまたNCBI及びUniprotデータベース中を検索することにより、本発明者らは、AroF-Iに類似するが、特に、ドッキングに関与するものに対応する位置での一定量のアミノ酸多様性を有するタンパク質配列を特定した。
このアプローチは、その構造又は活性を改変することにより、AroF-Iタンパク質のドッキングポケット中に天然に見出されるアミノ酸と置換することができるアミノ酸を特定することを可能にした。
したがって、チロシンに対する結合性のみが、示される突然変異により阻害される。以下のTable 1(表1)は、AroF-Iフィードバック阻害機能を不活性化する可能性があり得る突然変異を特徴付ける、位置及び元のアミノ酸並びに代替アミノ酸を列挙する。
table 1(表1)において特定される様々な突然変異のうちで、代替アミノ酸の特性に従って、及びまた文献中に既に記載されている進化的に近縁のタンパク質におけるそれらの突然変異の影響に従って、突然変異のサブセットを選択した(Cui、Dら、Molecular basis for feedback inhibition of tyrosine-regulated 3-deoxy-d-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase from Escherichia coli、2019)、(Ding、R.ら、Introduction of two mutations into AroG increases phenylalanine production in Escherichia coli.Biotechnol Lett 36、2103～2108頁(2014))、(Kikuchi Yら、Mutational analysis of the feedback sites of phenylalanine-sensitive 3-deoxy-d-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase of Escherichia coli.Appl Environ Microbiol 63:761～762頁(1997))。
選択されたサブセットは、以下の通りである:P160L、Q164A、S190A、G191K、S193A、及びI225P。
B.実験
材料及び方法
AroF-I酵素及び誘導された変異体をコードする遺伝子のクローニング
AroF-I酵素及びそれから誘導される変異体を発現及び精製するために、対応する遺伝子を、タンパク質のN末端部分(遺伝子のATGの上流)に結び付けられたHisタグと共にpET28_b(+)プラスミド中にクローニングする。
これらの構築物を作製するために、Gibsonアセンブリ法(Gibsonら、2009)を用いる。反応生成物を、大腸菌BL21(DE3)株(Novagen社)に形質転換する。形質転換された細胞を、選択のための抗生物質を含む寒天培地上にプレートする。得られたコロニーを、続いて、PCRを用いて確認し、それらを検証するために配列決定する。
酵素の発現及び精製
プラスミドを含む大腸菌BL21(DE3)株を、以下の組成を有するZYM自己誘導培地中で24時間培養する:
a)生理食塩水ベース:
- 酵母抽出物:5g/L
- トリプトン:10g/L
- Na2SO4:0.7g/L
- NH4Cl:2.7g/L
- KH2PO4:3.4g/L
- Na2HPO4:4.45g/L
b)糖溶液(50倍濃縮):
- グリセロール:250g/L
- グルコース:25g/L
- ラクトース:100g/L
c)金属溶液(5000倍濃縮)
d)完全培地の調製:
培地に、一晩前培養物からOD=0.05で播種する。培養を、250mLエルレンマイヤーフラスコ中の50mLの最終体積で行う。培養パラメータは以下の通りである:25℃で5時間、続いて15℃で19時間の140rpmでの撹拌。
培地を調製するために用いられる全ての化学製品は、Sigma-Aldrich社、Roth社又はEuromedex社から入手する。
インキュベーション後、50mLの培養物を、5000×g、4℃で10分間遠心分離する。上清を廃棄し、ペレットを3mLのLEWバッファー(Macherey-Nagel社、以下を参照されたい)中に取り、1mg/mLのリゾチーム(lyzosyme)を添加し、懸濁物を30分間氷上で静置する。
続いて、超音波破砕(Omni Sonic Ruptor 400、Omni International社、出力30%、パルス40、8分間)を用いて細胞を溶解させる。0.22%のストレプトマイシンの添加後、続いて、サンプルを、15000×g、4℃で30分間遠心分離する。上清を回収し、可溶性タンパク質を、Protino(登録商標)Ni-TED 2000キット(Macherey-Nagel社)を用いて、供給業者の推奨に従って精製する。
最後に、精製されたタンパク質を、Amicon Ultra-4 30Kd遠心フィルター(Merck社)を用いて約10倍に濃縮し、溶出バッファーを、0.1M Tris-HCl、pH7.5+10%グリセロールを用いて置換する。精製されたタンパク質を、-80℃で保存する。
酵素活性アッセイ
酵素の活性を、HPLC(高圧液体クロマトグラフィー)検出を用いて基質の消失をモニタリングすることにより測定する。
40mMのリン酸バッファー、pH7、300μMのホスホ(エノール)ピルビン酸(PEP)、20μgの精製酵素、1mMのチロシン(又は別の芳香族アミノ酸)又は3μMのHClを含み、超純水を用いて体積を満たした200μLの最終体積で反応を行う。
30℃で2分間の予備インキュベーション後、300μMのエリトロース-4-リン酸(E4P)を添加することにより反応を開始させ、反応混合物を30℃で60分間インキュベートする。
最後に、反応を停止させ、且つタンパク質を沈殿させるために、混合物を80℃で5分間加熱する。
HPLCを用いるPEPの消費の測定
タンパク質を沈殿させるために、酵素活性アッセイを、最初に15000×gで10分間遠心分離する。得られた上清を、HPLC分析前に0.22μmメンブレンを通してろ過する。
用いられる方法は、以下に記載される:
- システム:Agilent 1100(Agilent社)
- カラム:Luna OMEGA polar C18(Phenomenex社)
- 移動相:1mMリン酸
- 流速:0.3mL/分
- UV検出:220nm
- 注入:5μL
- 分析の持続時間:15分間
サンプル中に存在するPEPの量を定量化するために、0.1mM～1mMのPEP濃度を有する標準系列を分析する。
HPLCを用いるPCA及びCAの濃度の測定
用いられるカラムは、以下の通りである:Kinetex(登録商標)5μm F5 100A 150×4.6mm
移動相:0.1%ギ酸及びアセトニトリル
勾配:
5分:100%ギ酸
5分～25分:75%ギ酸-25%アセトニトリル
25分～30分:62%ギ酸-38%アセトニトリル
30分～35分:100%ギ酸
流速:1mL/分
オーブン温度:40℃
サンプル注入:10μL
クマル酸検出:315nm
桂皮酸検出:280nm
アラビノース依存性発現プラスミドにおけるphhaA/B遺伝子のクローニング
phhA/B遺伝子を、シュードモナス・プチダ菌株KT2440のgDNAから直接的にPCRにより増幅し、araC/pBADプロモーターの制御下にpBBR1-MCS2プラスミド中にクローニングする。
これらの構築物を作製するために、Gibsonアセンブリ法(Gibsonら、2009)を用いる。反応生成物を、大腸菌BL21(DE3)株(Novagen社)に形質転換する。形質転換された細胞を、選択のための抗生物質を含む寒天培地上にプレートする。得られたコロニーを、続いて、PCRを用いて確認し、それらを検証するためにプラスミドを配列決定する。
続いて、接合により対象となるシュードモナス・プチダ菌株へと移すために、発現プラスミドを、ドナー大腸菌株S17.1に形質転換する。
結果
野生型シュードモナス・プチダAroF-I酵素の活性は、実際にチロシンにより阻害される(図1)。P160L突然変異の導入は、酵素をチロシンによるこの阻害に対して部分的に抵抗性にすることを可能にし(図2)、効果は、P160L/Q164A二重突然変異を導入することにより若干改善することができる(図3)。しかしながら、P160L/G191K及びP160L/S190二重突然変異は、AroF-I酵素に対して有害作用を有し、AroF-I酵素は、チロシンの存在下又は非存在下にかかわらず、もはやいかなる活性も有しない(図3)。
対照的に、特に有益に且つ驚くべきことに、P160L/S193A二重突然変異の導入は、略全ての酵素活性を回復させ、AroF-I酵素をチロシン阻害に対して略完全に抵抗性にする(図3)。
これらの結果は図4により確認され、図4は、単一P160L又はS193A突然変異と比較して、チロシンにより引き起こされるフィードバック阻害に対するこの二重突然変異の相乗効果を示す。
(実施例2)
フェニルプロパノイド化合物の合成のためのシュードモナス・プチダの遺伝子改変型菌株
フェニルプロパノイド化合物の生合成を可能にするために、複数の遺伝子改変を、シュードモナス・プチダ菌株内で行う。この目的のために、クマル酸又はフランビノン等のフェニルプロパノイド化合物の合成のための酵素をコードする追加の組み換え遺伝子を、以下のプロトコールに従って、シュードモナス・プチダ染色体にインテグレーションする。
シュードモナス・プチダの遺伝子突然変異導入のためのプロトコール:
シュードモナス・プチダにおける遺伝子突然変異導入を、染色体へとインテグレーションし、続いて再びそこから離れ、所望の遺伝子欠失又は挿入をもたらす自殺プラスミドを用いて行う。用いられる自殺プラスミドは、pK18mobsacBである(Schafer A、Tauch A、Jager W、Kalinowski J、Thierbach G、Puhler A.Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum.Gene 1994年7月22日;145(1):69～73頁)。このプラスミドは、カナマイシン抗生物質耐性カセット及びsacBカウンター選択カセットを保有する。このプラスミドはまた、細菌大腸菌のみで機能する複製起点、及びシュードモナス・プチダ等の別の細菌株へと大腸菌から接合により伝達することを可能にする伝達起点oriTも含む。
挿入対象の遺伝子を、細菌染色体中の選択された挿入部位での相同領域と同じく、このプラスミド中にクローニングする。これらの相同領域は、挿入対象の遺伝子のどちらかの側にクローニングされ、800塩基対の最小サイズを有するべきである。
クローニングは、接合可能な大腸菌株において行う(一般的に、菌株S17.1、Simon、R.、Priefer、U.及びA.Pulher、A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria.Nature BioTechnology、第1巻、784～791頁(1983))。
接合プロトコールは、以下の通りである:
S17.1/自殺プラズマ(suicide plasma)(ドナー菌株)の培養物液滴を、LB寒天富栄養培地(Luria-Miller、Roth社、参照番号X968.2、1.5%寒天含有)上に置き、シュードモナス・プチダ菌株(レシピエント菌株)の培養物液滴を、最初の液滴の上に置く。培養ディッシュを、30℃で一晩インキュベートする。続いて、液滴を10mM MgSO4中に希釈し、図6に記載される通りのプロトコールを行う。
pK18mobsacB接合プラスミドは、接合完了体を生成するためにレシピエント細菌株のゲノムへとインテグレーションすることができる、インテグレーション性プラスミドである。プラスミドはカナマイシンに対して耐性であるので、接合完了体に対する選択培地は、100mg/mLアンピシリン(シュードモナス・プチダはこの抗生物質に対して天然で耐性である)、及び50mg/mLカナマイシンを含有するLB寒天である(カナマイシン、ROTH社、参照番号T832.4;アンピシリン、EUROMEDEX社、参照番号EU0400-D)。したがって、この培地は、プラスミドがインテグレーションされたシュードモナス・プチダを選択することを可能にする。
プロトコールの残りは、以下の工程を含む:
- 自殺プラスミドの除去:8個のKn+AmpRクローンを採取し、10mLの100mg/mL LB+Amp培地(1/2000希釈)中、撹拌しながら30℃で培養する。12時間～24時間インキュベートする。
- 25%スクロースに対するカウンター選択sacB:YT寒天及びYT+スクロース25%寒天上に、クローンのプールの培養物を塗り付ける。次の朝まで30℃でインキュベートする。スクロース+YT寒天、YT+スクロース25%寒天、及びYT寒天+Kn 50mg/mLの20～25個のクローンを再採取する。次の朝まで30℃でインキュベートする。
YT:酵母抽出物トリプトン
- PCRを用いる遺伝子挿入の検証。
染色体挿入領域のいずれかの側にハイブリダイズするプライマーは、KnS及びスクロース+クローンに対してコロニーPCRを行うことにより、変異体クローンを検証することを可能にする。
シュードモナス・プチダへと挿入される対象の遺伝子
フェニルプロパノイド化合物、例えば、クマル酸又はフランビノンの生合成を可能にするために、以下に列挙される遺伝子のうちの1つ又は複数をシュードモナス・プチダへと挿入する。
これらの遺伝子は、既知の微生物において特異的に特定及び選択されている。遺伝子を合成し、シュードモナス・プチダにおける最大発現のためにコドンを最適化する。
一部の遺伝子はシュードモナス・プチダに対して内在性であるが、それらがコードするタンパク質の活性を試験することが推奨され、これらの酵素が十分に活性でないか又は不十分に発現される場合、これらの活性を最適化することができる。
突然変異型3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソン酸-7-リン酸(DAHP)シンターゼ酵素をコードする遺伝子:
配列番号10:配列番号2の配列のDAHPシンターゼをコードする、P160L突然変異を有する3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソン酸-7-リン酸(DAHP)シンターゼ遺伝子の配列(シュードモナス・プチダKT2440)。
配列番号11:配列番号3の配列のDAHPシンターゼをコードする、P160L/Q164A二重突然変異を有する3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソン酸-7-リン酸(DAHP)シンターゼ遺伝子の配列(シュードモナス・プチダKT2440)。
配列番号12:配列番号4の配列のDAHPシンターゼをコードする、P160L/S193A二重突然変異を有する3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソン酸-7-リン酸(DAHP)シンターゼ遺伝子の配列(シュードモナス・プチダKT2440)。
フェニルプロパノイド化合物の合成を可能にする追加の遺伝子
配列番号13:配列番号5の配列のphhAをコードする、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ(phhA)に対する遺伝子(シュードモナス・プチダKT2440)。
配列番号14:配列番号6の配列のphhBをコードする、テトラヒドロビオプテリンデヒドラターゼ(phhB)に対する遺伝子(シュードモナス・プチダKT2440)。
配列番号15:配列番号7の配列のβ-キシロシダーゼをコードする、チロシンアンモニアリアーゼに対する遺伝子(ロドトルラ・グルチニス)。
配列番号16:配列番号8の配列の4-CLをコードする、4-クマル酸-CoAリガーゼ(4-CL)に対する遺伝子(シュードモナス・プチダKT2440 fcs遺伝子)。
配列番号17:配列番号9の配列のBASをコードする、ベンザルアセトンシンターゼ(BAS)に対する遺伝子(ショウヨウダイオウ(Rheum palmatum))。
(実施例3)
本発明に従うシュードモナス・プチダの遺伝子改変型菌株のin vivo活性
AroF-I-fbr P160L/S193A変異体の作製
シュードモナス・プチダKT2440株を、配列番号4のアミノ酸配列により規定されるP160L/S193A二重突然変異を含むDAHPシンターゼをコードするAroF-I遺伝子を発現するように、且つ配列番号7の配列の異種チロシンアンモニアリアーゼ(TAL_RG_OPT)をコードする追加の組み換え遺伝子を発現するように、実施例1に記載される通りに遺伝子改変した。
この菌株は、「AroF-I-fbr P160L/S193A変異体」と称される。
クマル酸(PCA)又は桂皮酸(CA)の産生に対するAroF-I-fbr P160L/S193A変異体の活性を、野生型AroF-I酵素を発現するように遺伝子改変されたシュードモナス・プチダKT2440株と比較して、これらの酸の産生量を測定することにより決定し、後者の菌株は対照として機能した(AroF-I-WT変異体)。
結果
桂皮酸産生は、P160L/S193A二重突然変異を有するAroF-I酵素を発現するP.プチダ菌株において顕著に増加する(図6)。
クマル酸の産生に対するAroF-I-fbr P160L/S193A変異体の最適化
AroF-I-fbr P160L/S193A変異体を、配列番号5の配列のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ(phhA)、及び配列番号6の配列のテトラヒドロビオプテリンデヒドラターゼ(phhB)をコードする追加の組み換え遺伝子を発現させるために改変した。これらの酵素をコードする遺伝子をプラスミド中にクローニングし、araC/pBADopt誘導性プロモーターの制御下で発現させ、誘導は、0.5%アラビノース:プラスミドpC2F387を用いて行った。
この菌株は、「最適化型AroF-I-fbr変異体」と称される。
続いて、最適化型AroF-I-fbr変異体によるクマル酸(PCA)又は桂皮酸(CA)の産生を、AroF-I-fbr P160L/S193A変異体を用いて得られたもの及び2種類の対照菌株、すなわち:
- 野生型AroF-I酵素を発現するシュードモナス・プチダKT2440株(AroF-I-WT変異体)、及び
- 野生型AroF-I並びにそれぞれ配列番号5及び配列番号6の配列の2種類のphhA及びphhB酵素を発現するシュードモナス・プチダKT2440株(AroF-I-WT phhA/B変異体)
を用いて得られたものと比較して測定した。
結果
図6に提示される結果は、AroF-I-WT変異体菌株におけるphhA及びphhB遺伝子の過剰発現が、より多くのフェノール酸(PCA+CA)産生をもたらすことを示す。
特に興味深いことに、最適化型AroF-I-fbr変異体は、AroF-I-fbr P160L/S193A変異体及びAroF-I-WT phhA/B変異体よりもはるかに高い総フェノール酸の産生を得ることを可能にする。相対的に、クマル酸は産生される総フェノール類のうちの略全てに相当し、桂皮酸はフェニルプロパノイド化合物の産生に関して工業的に有用な化合物ではないので、このことは有利である。
これらの結果は、最適化型AroF-I-fbr変異体が、フェニルプロパノイド化合物の、特にクマル酸の産生に対して特に適していることを明らかに実証する。
本出願において、配列表に対する参照が行われ、その識別子(「配列番号」)が以下の表に列挙される。配列表が提供される形態にかかわらず、それらは本出願の一部分を形成する。
引用文献のリスト
特許文献
有用であり得る場合、以下の特許文献が引用される:
- patcit1:FR1234567(出願番号);
- patcit2:US2004230550(公開番号);及び
- patcit3:FR2795457(公開番号)。
非特許文献
有用であり得る場合、以下の非特許文献が引用される:
- nplcit1:Kleskら、2004、J.Agric.Food Chem.52、5155～61頁;
- nplcit2:Larsenら、1991、Acta Agric.Scand.41、447～54).
- nplcit3:Kikuchi Yら、「Mutational analysis of the feedback sites of phenylalanine-sensitive 3-deoxy-d-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase of Escherichia coli.」、Appl Environ Microbiol 63:761～762頁(1997).):P160L、Q164A、S190A、G191K、S193A、I225P.
- nplcit4:Cui、Diら、「Molecular basis for feedback inhibition of tyrosine-regulated 3-deoxy-d-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase from Escherichia coli」、J Struct Biol.2019年6月1日;206(3):322～334頁.
- nplcit5:Lutke-Eversloh and Stephanopoulos、2005
- nplcit6:Lutke-Eversloh and Stephanopoulos、2007.「L-Tyrosine production by deregulated strains of Escherichia coli」.
- nplcit7:Kangら、2012「Artificial biosynthesis of phenylpropanoic acids in a tyrosine overproducing Escherichia coli strain」
- nplcit8:Santosら、2011.「Optimization of a heterologous pathway for the production of flavonoids from glucose」、
- nplcit9:Juminagaら、2011.「Modular engineering of L-tyrosine production in E. coli」.
- nplcit10:Rodriguezら、2015、「Establishment of a yeast platform strain for production of p-coumaric acid through metabolic engineering of aromatic amino acid biosynthesis.」
- nplcit11:Caleroら、2016.「Broad-host range ProUSER vectors enable fast characterization of inducible promoters and optimization of p-coumaric acid production in Pseudomonas putida KT2440」.
- nplcit12:Caleroら、2017.「Genome-wide identification of tolerance mechanisms toward p-coumaric acid in Pseudomonas putida」.
- nplcit13:Koeduka、T.ら(2011).「Characterization of raspberry ketone/zingerone synthase, catalyzing the alpha, beta-hydrogenation of phenylbutenones in raspberry fruits」. Biochemical and Biophysical Research Communications 412、104～108頁.
- nplcit14:Beekwilderら、2007.「Microbial production of natural raspberry ketone」.
- nplcit15:Leeら、2017.「Heterologous production of raspberry ketone in the wine yeast Saccharomyces cerevisiae via pathway engineering and synthetic enzyme fusion」.
- nplcit16:Waterhouse、A.ら、「SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes」. Nucleic Acids Res.46(W1)、W296-W303(2018)
- nplcit17:O.Trottら、「AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization and multithreading」、Journal of computational chemistry、2010).
- nplcit18:Ding、R.ら「Introduction of two mutations into AroG increases phenylalanine production in Escherichia coli」. Biotechnol Lett 36、2103～2108頁(2014).
- nplcit19:(Gibsonら、2009).
- nplcit20:Schafer Aら、「Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum」. Gene 1994年7月22日;145(1):69～73頁)
- nplcit21:Simon、R.ら「A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria」. Nature BioTechnology、第1巻、784～791頁(1983)).
- nplcit22:O.Trottら、2010.「AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization and multithreading」、Journal of computational chemistry.
- nplcit23:Zhouら、「Characterization of mutants of a tyrosine ammonia-lyase from Rhodotorula glutinis」. Appl.Microbiol.Biotechnol、2015.
- nplcit23:Priorら、「Broad-host-range vectors for protein expression across gram negative hosts」. Biotechnol Bioeng、2010年6月1日;106(2):326～32頁.

Claims (10)

  1. その配列が配列番号1の配列に対して少なくとも90%の同一性を有し、少なくとも1つのP160L突然変異、P160L/Q164A二重突然変異、又はP160L/S193A二重突然変異、好ましくはP160L/S193A二重突然変異を有する、3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソン酸-7-リン酸(DAHP)シンターゼをコードする突然変異型AroF-I遺伝子を含むことを特徴とする、シュードモナス・プチダの遺伝子改変型菌株。
  2. チロシンによるフィードバック阻害に対して抵抗性である組み換えDAHPシンターゼを発現することができることを特徴とする、請求項1に記載のシュードモナス・プチダの遺伝子改変型菌株。
  3. その配列が配列番号5の配列に対して少なくとも80%の同一性を有するフェニルアラニンヒドロキシラーゼ(phhA)をコードする追加の組み換え遺伝子、及びその配列が配列番号6の配列に対して少なくとも80%の同一性を有するテトラヒドロビオプテリンデヒドラターゼ(phhB)をコードする追加の組み換え遺伝子を含み;前記組み換え遺伝子phhA及びphhBが、好ましくは、それらの過剰発現を可能にする異種プロモーターの制御下に置かれることを特徴とする、請求項1又は2に記載の遺伝子改変型菌株。
  4. 配列番号2の配列、配列番号3の配列、又は配列番号4の配列に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を有するDAHPシンターゼを発現することを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載の遺伝子改変型菌株。
  5. 配列番号2、配列番号3、又は配列番号4の配列により規定されるアミノ酸配列を有するDAHPシンターゼを発現することを特徴とする、請求項4に記載の遺伝子改変型菌株。
  6. 以下の組み換え遺伝子:
    - チロシンアンモニアリアーゼ(TAL)活性を有するポリペプチド、特にポリペプチドTAL_RG_OPTの配列番号7のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有するTALポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、
    - 4-クマル酸-CoAリガーゼ(4-CL)活性を有するポリペプチド、特に配列番号8のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有する4CLポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、
    - ベンザルアセトンシンターゼ(BAS)活性を有するポリペプチド、特に配列番号9の配列に対して少なくとも80%の同一性を有するBASポリペプチドをコードする組み換え遺伝子
    から選択される1つ又は複数の追加の組み換え遺伝子を更に含むことを特徴とする、請求項1から5のいずれか一項に記載の遺伝子改変型菌株。
  7. フェニルプロパノイド化合物、好ましくはクマル酸、p-クマロイル-CoA、4-ヒドロキシベンザルアセトン又はフランビノンを産生することができることを特徴とする、請求項1から6のいずれか一項に記載の遺伝子改変型菌株。
  8. フェニルプロパノイドの合成に対して必要とされる組み換え遺伝子の発現を可能にする条件下で、培養培地中において請求項7に記載の遺伝子改変型菌株を生育させる工程を含み、前記フェニルプロパノイド化合物が前記遺伝子改変型菌株により合成されることを特徴とする、フェニルプロパノイド化合物を合成するための方法。
  9. 培養培地からフェニルプロパノイド化合物を回収する工程も含むことを特徴とする、請求項8に記載の方法。
  10. フェニルプロパノイド化合物又はフェニルプロパノイド誘導体、好ましくはクマル酸又はフランビノンの合成のための、請求項1から9のいずれか一項に記載の菌株の使用。
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