FR3122882A1 - Biosynthèse de composés phénylpropanoïdes - Google Patents

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Abstract

La présente invention relève du domaine de la production de composés phénylpropanoïdes, et notamment celui des souches génétiquement modifiées pour la production de composés phénylpropanoïdes. En particulier, l’invention porte sur une souche génétiquement modifiée de Pseudomonas putida comprenant un gène AroF-I muté codant pour la 3-Deoxy-D-arabino-Heptulodonate 7-phosphate (DHAP), et son utilisation pour la synthèse de composé phénylpropanoïdes, notamment l’acide coumarique ou la frambinone.

Description

Biosynthèse de composés phénylpropanoïdes
La présente invention relève du domaine de la production de composés phénylpropanoïdes, et notamment celui des souches génétiquement modifiées pour la production de composés phénylpropanoïdes tel que l’acide coumarique ou la frambinone.
La bioproduction d’arômes et fragrances « naturels » représente depuis de nombreuses années un axe de recherche important pour l’industrie afin de répondre aux consommateurs soucieux d’être de plus en plus éco-responsables. La biologie de synthèse, notamment par l’intermédiaire de microorganismes, permet cette production naturelle, mais les rendements ne sont pas toujours suffisants pour une production à grande échelle.
La saveur de la framboise (Rubus idaeus) est liée à plus de 200 composés, mais la frambinone, un composé phénolique naturel, est le composé qui a le plus d'impact, définissant son goût caractéristique (Klesk et al., 2004, J. Agric. Food Chem. 52, 5155- 61; Larsen et al., 1991 , Acta Agric. Scand. 41, 447-54).
Dans la mesure où elle n'est présente qu'en petite quantité dans les framboises (1-4 mg par kg de fruits), la frambinone naturelle est d'une grande valeur (Larsen et al., 1991). Cependant, comme sa disponibilité naturelle est limitée, sa production biotechnologique est hautement désirable.
Dans ce contexte, la voie de biosynthèse de composés phénylpropanoïdes, notamment la frambinone, peut être reconstituée au sein d’un microorganisme grâce à l’insertion de gènes hétérologues codants pour certaines enzymes clés de ladite voie.
La tyrosine est un acide aminé important pour la biosynthèse de composés phénylpropanoïdes car il est notamment le précurseur de l’acide coumarique ou de la frambinone.
En effet, la frambinone peut être obtenue à partir de l'acide aminé aromatique L-tyrosine comme substrat initial via une voie de biosynthèse en 4 étapes.
Selon la première étape, la tyrosine est désaminée par une tyrosine ammonia lyase (TAL, EC 4.3.1.23) pour former de l'acide coumarique. Catalysée par une 4- coumarate:CoA ligase (4CL, EC 6.2.1.12), une molécule de Coenzyme A (CoA) est greffée sur l'acide coumarique. Le coumaroyl-CoA est alors converti par une benzalacétone synthase (BAS, EC 2.3.1.212) en 4-hydroxy benzalacétone. Cette réaction est une condensation décarboxylative et utilise une unité de malonyl-CoA en tant que co- substrat. L'étape finale est la réduction du 4-hydroxy benzalacétone en frambinone par une benzalacétone réductase.
Ainsi, le développement de souche surproductrice de tyrosine comme plateforme pour la production de composés phénylpropanoïdes, notamment la frambinone, est un point de départ crucial pour la biosynthèse de ces composés.
Cependant, la production de tyrosine chez les microorganismes est tout aussi complexe que très finement régulée. En effet, certaines enzymes de la voie de production de la tyrosine, également connue sous le nom de voie du shikimate (en anglais « shikimate pathway »), sont régulées négativement par cet acide aminé qui inhibe leur activité via la fixation sur un site d’inhibition lorsque la concentration devient trop élevée dans la cellule. Ce système de régulation lorsque la tyrosine est présente en trop grande quantité dans le microorganisme est appelée retro-régulation négative.
Malgré tout, il devrait être possible d’obtenir par mutagenèse des enzymes « insensibles » à cette inhibition et donc de déréguler la voie de production de tyrosine. Ces mutants insensibles à la rétro-régulation négative de la tyrosine sont appelés mutant fbr pour « feedback resistant ».
De nombreux articles décrivent la dérégulation de cette voie chez E. coli et une enzyme a été particulièrement très étudiée : la DAHP synthase (DAHP = 3-Deoxy-D-arabino-Heptulodonate 7-phosphate). C’est la première réaction de la voie du shikimate qui consiste en la condensation d’un phospho(enol)pyruvate (PEP) et d’un erythrose-4-phosphate (E4P) en DAHP.
Cette activité DAHP synthase est réalisée par l’intermédiaire de 3 isoenzymes chez E. coli : AroG (retro-régulée par la phénylalanine), AroF (retro-régulée par la tyrosine) et AroH (rétro-régulée par le tryptophane). Les structures de ces protéines sont connues et les sous-structures (ainsi que les acides aminés impliqués) liées à la retro-régulation sont également très bien décrits dans la littérature.
Kikuchi et al., 1997 et Cui et al., 2019, ont identifié, décrit et étudié chez E. coli respectivement des mutants AroGfbr et AroFfbr insensibles à la rétro-régulation de la phenylalanine et de la tyrosine. Des mutants fbr de la protéine TyrA (mutant tyrAfbr) ont également été décrits chezE. colipar Lütke-Eversloh and Stephanopoulos, (2005) (Lütke-Eversloh and Stephanopoulos, Appl. Environ Microbiol. 2005 Nov ; 71(11) : 7224-8).
En 2007, Lütke-Eversloh and Stephanopoulos (Lütke-Eversloh and Stephanopoulos, Appl. Environ Microbiol. 2007 Nov ; 75(1) : 103-10) ont également décrit des souches d’E. colisurproductrices de tyrosine obtenues en combinant ces différentes enzymes mutées. Ces souches ont été utilisées pour produire des phénylpropanoïdes comme l’acide coumarique (Kang et al., 2012), ou la naringenine via notamment une mutation du gènerpoAen plus des mutations aroGfbr et tyrAfbr (Santos et al., 2011).
Une vue d’ensemble des modifications effectuées pour obtenir des souches d’E. colisurproductrices de tyrosine est bien décrite par l’article « Modular engineering of L-tyrosine production inE. coli» (Juminaga et al., 2011).
Des composés phénylpropanoïdes ont également été synthétisés à partir de souchesSaccharomyces cerevisiaequi surexpriment la tyrosine, comme décrit par Rodriguez et al., 2015.
Le document GB 2 416 769 décrit la possibilité de produire de la frambinone à l'aide de microorganismes contenant des gènes codant pour les enzymes 4CL et BAS dont au moins une est de source hétérologue. Le microorganisme préféré estE. coli(souche BL21) et peut en outre comprendre une séquence codant BAR, C4H, PAL et/ou CHS, la séquence codant BAR étant avantageusement endogène.
Cependant, il apparait que les souchesE. coliouS . cerevisiaene tolèrent pas bien la toxicité des composés phénylpropanoïdes et ne sont donc pas les microorganismes les mieux adaptés pour leur production.
Les bactéries du genrePseudomonassont plus tolérantes à ces molécules hautement toxiques, notamment la bactériePseudomonas putida(Calero et al., 2017). En revanche, les enzymes impliquées dans la production d’acides aminés aromatiques chezP. putidasont peu décrites.
Par conséquent, la surproduction chezP. putidade dérivés de la voie du shiikimate, tel que la tyrosine, implique l’utilisation de mutants AroGfbr et TyrAfbr provenant de chezE. coli, ce qui n’est pas très efficace (Calero et al., 2016).
La surproduction de tyrosine et de phénol a été décrite chez la bactériePseudomonas taiwanensisVLB120 grâce à la mise en œuvre de mutations ponctuelles dans 3 gènes : trpEP290S, aroF-I P148L et pheAT310I (Wynands et al., Metab Eng. 2018 May ; 47 :121-133).
Cependant, il existe toujours un besoin de développer des nouvelles enzymes et de nouvelles souches de Pseudomonas putida surproductrices de tyrosine permettant la production de composés phénylpropanoïde, notamment l’acide coumarique et la frambinone.
Problème technique
Les souches surproductrices de tyrosine développées à ce jour sont essentiellement des souchesE. colietS. Cerevisiae. Cependant, ces souches ne tolèrent pas bien la toxicité des composés phénylpropanoïdes et ne sont donc pas les microorganismes les mieux adaptés pour leur production.
Ainsi, il existe un besoin particulier de développer de nouvelles souches surproductrices de tyrosine permettant la production de composés phénylpropanoïde.
La présente divulgation vient améliorer la situation.
Résumé
Un des aspects de la présente invention porte sur une souche génétiquement modifiée dePseudomonas putidacomprenant un gène AroF-I muté codant pour la 3-Deoxy-D-arabino-Heptulodonate 7-phosphate (DAHP) synthase ayant la séquence SEQ ID NO :1 et présentant au moins une mutation P160L, une double mutation P160L/Q164A, ou une double mutation P160L/S193A, de préférence une double mutation P160L/S193A.
Un autre aspect de l’invention porte sur un procédé de synthèse de composé phénylpropanoïde ou d’un dérivé de phénylpropanoïde par la mise en œuvre d’une souche génétiquement modifiée selon l’invention dePseudomonas putida.
Enfin, l’invention porte également sur l’utilisation d’une souche génétiquement modifiée dePseudomonas putidapour la synthèse de composé phénylpropanoïdes.
Les caractéristiques exposées dans les paragraphes suivants peuvent, optionnellement, être mises en œuvre. Elles peuvent être mises en œuvre indépendamment les unes des autres ou en combinaison les unes avec les autres :
Brève description des figures
D’autres caractéristiques, détails et avantages apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après, et à l’analyse des dessins annexés, sur lesquels :
Fig. 1
Graphique du PEP consommé en mM en présence ou absence d’acide aminé aromatique par la protéine AroF-I sauvage (WT). Les résultats présentés sont ceux de trois réplicas indépendants.
Fig. 2
Graphique représentant la part de PEP consommé en mM en présence ou absence d’acide aminé aromatique par la protéine aroF-I WT comparativement aux simples mutants AroF-I-G191, AroF-I-P160 et AroF-I-S193. Les résultats présentés sont ceux de trois réplicas indépendants.
Fig. 3
Graphique représentant la part de PEP consommé en mM en présence ou absence d’acide aminé aromatique par la protéine aroF-I WT comparativement aux doubles mutants AroF-I-P160_G191, AroF-I-P160L_Q164, AroF-I-P160_S190 et AroF-I-P160_S193. Les résultats présentés sont ceux de trois réplicas indépendants.
Fig. 4
Graphique représentant la part de PEP consommé en mM en présence ou absence d’acide aminé aromatique par la protéine aroF-I WT comparativement aux simples mutants AroF-I-P160 et AroF-I-S193 et au double mutant AroF-I-P160_S193. Les résultats présentés sont ceux de trois réplicas indépendants.
Fig. 5
présente le protocole de conjugaison utilisable pour transformer et modifier génétiquementP. putida.
Fig. 6
Graphique présentant la production d’acide coumarique (PCA) et d’acide cinnamique (CA) par des souches dePseudomonas putidaexprimant les enzymes AroF-I WT/TAL (aroF-I WT) et aroF-I fbr P160L/S193A/TAL (aroF-I fbr).
Fig. 7
Graphique présentant la production de phénoliques totaux et la proportion d’acide coumarique parmi les phénolique totaux (%PCA) par des souches dePseudomonas putidaexprimant les enzymes AroF-I WT/TAL (aroF-I WT), AroF-I WT/TAL + plasmide vide (aroF-I WT + contrôle), AroF-I WT/TAL + plasmide phhA/B (aroF-I WT + phhA/B), aroF-I fbr P160L/S193A/TAL (aroF-I fbr), aroF-I fbr P160L/S193A/TAL + plasmide vide (aroF-I fbr + contrôle), et aroF-I fbr P160L/S193A/TAL + plasmide phhA/B (aroF-I fbr + phhA/B). L’expression des gènes phhA/B à partir du promoteur araC/pBAD est induite ou non.
Dans la présente demande, il est fait référence aux listages de séquences dont les identificateurs (ou « SEQ ID NO ») sont listés dans le tableau ci-dessous. Quelle que soit la forme sous laquelle les listages sont fournis, ils font partie de la présente demande.
SEQ ID NO:1
AA

AroF-I sauvage		 LAAGTRDLTSNTMADLPIDDLNVASNETLITPDQLKKEIPLSAKALQTVTAGREVVRNILDGKDHRLFVVVGPCSIHDIKAAHEYAERLKVLAEEVSDTLYLVMRVYFEKPRTTVGWKGLINDPYLDDSFKIQDGLHIGRKLLLDLAEMGLPTATEALDPISPQYLQDLISWSAIGARTTESQTHREMASGLSSAVGFKNGTDGGLTVAINALQSVSKPHRFLGINQEGGVSIVTTKGNPYGHVVLRGGNGKPNYDSVSVALCEQDLAKAKIKANIMVDCSHANSNKDPALQPLVMENVANQILEGNQSIIGLMVESHLNWGCQSIPKNLDDLQYGVSITDACIDWSATEKTLRSMHAKLKDVLPQRKRG
SEQ ID NO:2
AA

AroF-I_P160L		 LAAGTRDLTSNTMADLPIDDLNVASNETLITPDQLKKEIPLSAKALQTVTAGREVVRNILDGKDHRLFVVVGPCSIHDIKAAHEYAERLKVLAEEVSDTLYLVMRVYFEKPRTTVGWKGLINDPYLDDSFKIQDGLHIGRKLLLDLAEMGLPTATEALDLISPQYLQDLISWSAIGARTTESQTHREMASGLSSAVGFKNGTDGGLTVAINALQSVSKPHRFLGINQEGGVSIVTTKGNPYGHVVLRGGNGKPNYDSVSVALCEQDLAKAKIKANIMVDCSHANSNKDPALQPLVMENVANQILEGNQSIIGLMVESHLNWGCQSIPKNLDDLQYGVSITDACIDWSATEKTLRSMHAKLKDVLPQRKRG
SEQ ID NO:3
AA

AroF-I_P160L/Q164A		 LAAGTRDLTSNTMADLPIDDLNVASNETLITPDQLKKEIPLSAKALQTVTAGREVVRNILDGKDHRLFVVVGPCSIHDIKAAHEYAERLKVLAEEVSDTLYLVMRVYFEKPRTTVGWKGLINDPYLDDSFKIQDGLHIGRKLLLDLAEMGLPTATEALDLISPAYLQDLISWSAIGARTTESQTHREMASGLSSAVGFKNGTDGGLTVAINALQSVSKPHRFLGINQEGGVSIVTTKGNPYGHVVLRGGNGKPNYDSVSVALCEQDLAKAKIKANIMVDCSHANSNKDPALQPLVMENVANQILEGNQSIIGLMVESHLNWGCQSIPKNLDDLQYGVSITDACIDWSATEKTLRSMHAKLKDVLPQRKRG
SEQ ID NO:4
AA

AroF-I_P160L/S193A		 LAAGTRDLTSNTMADLPIDDLNVASNETLITPDQLKKEIPLSAKALQTVTAGREVVRNILDGKDHRLFVVVGPCSIHDIKAAHEYAERLKVLAEEVSDTLYLVMRVYFEKPRTTVGWKGLINDPYLDDSFKIQDGLHIGRKLLLDLAEMGLPTATEALDLISPQYLQDLISWSAIGARTTESQTHREMASGLASAVGFKNGTDGGLTVAINALQSVSKPHRFLGINQEGGVSIVTTKGNPYGHVVLRGGNGKPNYDSVSVALCEQDLAKAKIKANIMVDCSHANSNKDPALQPLVMENVANQILEGNQSIIGLMVESHLNWGCQSIPKNLDDLQYGVSITDACIDWSATEKTLRSMHAKLKDVLPQRKRG
SEQ ID NO:5
AA

phénylalanine hydroxylase (phhA)		 MKQTQYVAREPDAHGFIDYPQQEHAVWNTLITRQLKVIEGRACQEYLDGIDQLKLPHDRIPQLGEINKVLGATTGWQVARVPALIPFQTFFELLASKRFPVATFIRTPEELDYLQEPDIFHEIFGHCPLLTNPWFAEFTHTYGKLGLAATKEQRVYLARLYWMTIEFGLMETAQGRKIYGGGILSSPKETVYSLSDEPEHQAFDPIEAMRTPYRIDILQPVYFVLPNMKRLFDLAHEDIMGMVHKAMQLGLHAPKFPPKVAA
SEQ ID NO :6
AA

tétrahydrobiopterine deshydratase (phhB)		 MNALNQAHCEACRADAPKVTDEELAELIREIPDWNIEVRDGHMELERVFLFKNFKHALAFTNAVGEIAEAEGHHPGLLTEWGKVTVTWWSHSIKGLHRND FIMCARTDKVAETAEGRK
SEQ ID NO:7
AA

tyrosine ammonia lyase (TAL_RG_OPT)		 MAPRPTSQNQTRTCPTTQVTQVDIVEKMLAAPTDSTLELDGYSLNLGDVVSAARKGRPVRVKDSDEIRSKIDKSVEFLRSQLSMSVYGVTTGFGGSADTRTEDAISLQKALLEHQLCGVLPSSFDSFRLGRGLENSLPLEVVRGAMTIRVNSLTRGHSAVRLVVLEALTNFLNHGITPIVPLRGTISASGDLSPLSYIAAAISGHPDSKVHVVHEGKEKILYAREAMALFNLEPVVLGPKEGLGLVNGTAVSASMATLALHDAHMLSLLSQSLTAMTVEAMVGHAGSFHPFLHDVTRPHPTQIEVAGNIRKLLEGSRFAVHHEEEVKVKDDEGILRQDRYPLRTSPQWLGPLVSDLIHAHAVLTIEAGQSTTDNPLIDVENKTSHHGGNFQAAAVANTMEKTRLGLAQIGKLNFTQLTEMLNAGMNRGLPSCLAAEDPSLSYHCKGLDIAAAAYTSELGHLANPVTTHVQPAEMANQAVNSLALISARRTTESNDVLSLLLATHLYCVLQAIDLRAIVFEFKKQFGPAIVSLIDQHFGSAMTGSNLRDELVEKVNKTLAKRLEQTNSYDLVPRWHDAFSFAAGTVVEVLSSTSLSLAAVNAWKVAAAESAISLTRQVRETFWSAASTSSPALSYLSPRTQILYAFVREELGVKARRGDVFLGKQEVTIGSNVSKIYEAIKSGRINNVLLKMLA
SEQ ID NO: 8
AA

4-coumarate-CoA ligase (4-CL)		 MNNEARSGSTDPGQRPRYRQVAIGHPQVQVSHVDDVLRMQPVEPLAPLPARLLERLVHWAQVRPDTTFIAARQADGAWRSISYVQMLADVRTIAANLLGLGLSAERPLALLSGNDIEHLQIALGAMYAGIAYCPVSPAYALLSQDFAKLRHVCEVLTPGVVFVSDSQPFQRAFEAVLDDSVGVISVRGQVAGRPHISFDSLLQPGDLAAADAAFAATGPDTIAKFLFTSGSTKLPKAVITTQRMLCANQQMLLQTFPTFAEEPPVLVDWLPWNHTFGGSHNLGIVLYNGGSFYLDAGKPTPQGFAETLRNLREISPTAYLTVPKGWEELVKALEQDPALREVFFARIKLFFFAAAGLSQSVWDRLDRIAEQHCGERIRMMAGLGMTEASPSCTFTTGPLSMAGYVGLPAPGCEVKLVPVGDKLEARFRGPHIMPGYWRSPQQTAEAFDEEGFYCSGDALKLADARQPELGLMFDGRIAEDFKLSSGVFVSVGPLRNRAVLEGSPYVQDIVVTAPDRECLGLLVFPRLPECRRLAGLAEDASDARVLANDTVRSWFADWLERLNRDAQGNASRIEWLSLLAEPPSIDAGEITDKGSINQRAVLQRRAAQVEALYRGEDPDALHAKVRP
SEQ ID NO :9
AA

benzalacétone synthase (BAS)		 MATEEMKKLATVMAIGTANPPNCYYQADFPDFYFRVTNSDHLINLKQKFKRLCENSRIEKRYLHVTEEILKENPNIAAYEATSLNVRHKMQVKGVAELGKEAALKAIKEWGQPKSKITHLIVCCLAGVDMPGADYQLTKLLDLDPSVKRFMFYHLGCYAGGTVLRLAKDIAENNKGARVLIVCSEMTTTCFRGPSETHLDSMIGQAILGDGAAAVIVGADPDLTVERPIFELVSTAQTIVPESHGAIEGHLLESGLSFHLYKTVPTLISNNIKTCLSDAFTPLNISDWNSLFWIAHPGGPAILDQVTAKVGLEKEKLKVTRQVLKDYGNMSSATVFFIMDEMRKKSLENGQATTGEGLEWGVLFGFGPGITVETVVLRSVPVIS
SEQ ID NO :10
Nt

AroF-I_P160L

 5’-TTGGCGGCCGGCACCCGTGACCTGACGAGTAACACGATGGCTGATTTACCGATCGATGACTTGAACGTTGCCTCCAACGAGACCCTGATCACCCCTGATCAGCTCAAGAAGGAAATCCCCCTCAGCGCCAAGGCCCTGCAGACCGTGACTGCCGGCCGTGAAGTGGTGCGCAATATTCTCGACGGCAAGGACCATCGCCTGTTCGTCGTGGTCGGCCCTTGCTCCATCCACGACATCAAGGCAGCCCACGAATACGCCGAGCGCCTGAAAGTGCTGGCCGAAGAAGTGTCCGATACGCTGTACCTGGTCATGCGCGTGTACTTCGAAAAGCCGCGCACCACCGTCGGCTGGAAAGGCCTGATCAACGATCCGTACCTGGATGACTCGTTCAAGATCCAGGACGGCCTGCACATCGGCCGCAAGTTGCTGCTGGACCTGGCCGAAATGGGCCTGCCGACCGCCACCGAAGCGCTCGACCTGATTTCGCCGCAGTACCTGCAAGACCTGATCAGCTGGTCGGCCATCGGTGCCCGCACCACCGAATCGCAAACACACCGCGAGATGGCCTCGGGCCTGTCCTCGGCGGTGGGTTTCAAGAACGGTACCGATGGCGGCCTGACCGTTGCCATCAATGCCCTGCAGTCGGTGTCCAAGCCGCACCGCTTCCTGGGCATCAACCAGGAAGGCGGCGTGTCGATCGTCACCACCAAGGGCAACCCATACGGCCACGTGGTACTGCGCGGCGGCAATGGCAAGCCGAACTACGACTCGGTCAGCGTCGCCCTGTGCGAACAGGACCTGGCCAAGGCCAAGATCAAGGCCAACATCATGGTCGACTGCAGCCATGCCAACTCCAACAAGGACCCGGCCCTGCAACCGCTGGTGATGGAGAACGTCGCCAACCAGATTCTCGAAGGCAACCAGTCGATCATCGGCCTGATGGTCGAAAGCCACCTGAACTGGGGCTGTCAGTCCATTCCGAAAAACCTGGACGATTTGCAGTATGGCGTGTCGATCACGGACGCCTGCATCGACTGGTCGGCTACCGAGAAAACCCTGCGCAGCATGCATGCCAAGCTCAAGGATGTGCTGCCGCAGCGTAAGCGCGGCTGA-3’
SEQ ID NO :11
Nt

AroF-I_P16L/Q164A		 5’-TTGGCGGCCGGCACCCGTGACCTGACGAGTAACACGATGGCTGATTTACCGATCGATGACTTGAACGTTGCCTCCAACGAGACCCTGATCACCCCTGATCAGCTCAAGAAGGAAATCCCCCTCAGCGCCAAGGCCCTGCAGACCGTGACTGCCGGCCGTGAAGTGGTGCGCAATATTCTCGACGGCAAGGACCATCGCCTGTTCGTCGTGGTCGGCCCTTGCTCCATCCACGACATCAAGGCAGCCCACGAATACGCCGAGCGCCTGAAAGTGCTGGCCGAAGAAGTGTCCGATACGCTGTACCTGGTCATGCGCGTGTACTTCGAAAAGCCGCGCACCACCGTCGGCTGGAAAGGCCTGATCAACGATCCGTACCTGGATGACTCGTTCAAGATCCAGGACGGCCTGCACATCGGCCGCAAGTTGCTGCTGGACCTGGCCGAAATGGGCCTGCCGACCGCCACCGAAGCGCTCGACCTGATTTCGCCGGCCTACCTGCAAGACCTGATCAGCTGGTCGGCCATCGGTGCCCGCACCACCGAATCGCAAACACACCGCGAGATGGCCTCGGGCCTGTCCTCGGCGGTGGGTTTCAAGAACGGTACCGATGGCGGCCTGACCGTTGCCATCAATGCCCTGCAGTCGGTGTCCAAGCCGCACCGCTTCCTGGGCATCAACCAGGAAGGCGGCGTGTCGATCGTCACCACCAAGGGCAACCCATACGGCCACGTGGTACTGCGCGGCGGCAATGGCAAGCCGAACTACGACTCGGTCAGCGTCGCCCTGTGCGAACAGGACCTGGCCAAGGCCAAGATCAAGGCCAACATCATGGTCGACTGCAGCCATGCCAACTCCAACAAGGACCCGGCCCTGCAACCGCTGGTGATGGAGAACGTCGCCAACCAGATTCTCGAAGGCAACCAGTCGATCATCGGCCTGATGGTCGAAAGCCACCTGAACTGGGGCTGTCAGTCCATTCCGAAAAACCTGGACGATTTGCAGTATGGCGTGTCGATCACGGACGCCTGCATCGACTGGTCGGCTACCGAGAAAACCCTGCGCAGCATGCATGCCAAGCTCAAGGATGTGCTGCCGCAGCGTAAGCGCGGCTGA-3’
SEQ ID NO :12
Nt

AroF-I_P160L/S193A
 5’-TTGGCGGCCGGCACCCGTGACCTGACGAGTAACACGATGGCTGATTTACCGATCGATGACTTGAACGTTGCCTCCAACGAGACCCTGATCACCCCTGATCAGCTCAAGAAGGAAATCCCCCTCAGCGCCAAGGCCCTGCAGACCGTGACTGCCGGCCGTGAAGTGGTGCGCAATATTCTCGACGGCAAGGACCATCGCCTGTTCGTCGTGGTCGGCCCTTGCTCCATCCACGACATCAAGGCAGCCCACGAATACGCCGAGCGCCTGAAAGTGCTGGCCGAAGAAGTGTCCGATACGCTGTACCTGGTCATGCGCGTGTACTTCGAAAAGCCGCGCACCACCGTCGGCTGGAAAGGCCTGATCAACGATCCGTACCTGGATGACTCGTTCAAGATCCAGGACGGCCTGCACATCGGCCGCAAGTTGCTGCTGGACCTGGCCGAAATGGGCCTGCCGACCGCCACCGAAGCGCTCGACCTGATTTCGCCGCAGTACCTGCAAGACCTGATCAGCTGGTCGGCCATCGGTGCCCGCACCACCGAATCGCAAACACACCGCGAGATGGCCTCGGGTTTGGCATCGGCGGTGGGTTTCAAGAACGGTACCGATGGCGGCCTGACCGTTGCCATCAATGCCCTGCAGTCGGTGTCCAAGCCGCACCGCTTCCTGGGCATCAACCAGGAAGGCGGCGTGTCGATCGTCACCACCAAGGGCAACCCATACGGCCACGTGGTACTGCGCGGCGGCAATGGCAAGCCGAACTACGACTCGGTCAGCGTCGCCCTGTGCGAACAGGACCTGGCCAAGGCCAAGATCAAGGCCAACATCATGGTCGACTGCAGCCATGCCAACTCCAACAAGGACCCGGCCCTGCAACCGCTGGTGATGGAGAACGTCGCCAACCAGATTCTCGAAGGCAACCAGTCGATCATCGGCCTGATGGTCGAAAGCCACCTGAACTGGGGCTGTCAGTCCATTCCGAAAAACCTGGACGATTTGCAGTATGGCGTGTCGATCACGGACGCCTGCATCGACTGGTCGGCTACCGAGAAAACCCTGCGCAGCATGCATGCCAAGCTCAAGGATGTGCTGCCGCAGCGTAAGCGCGGCTGA-3’
SEQ ID NO :13
Nt

phénylalanine hydroxylase (phhA)		 5’-ATGAAACAGACGCAATACGTGGCACGCGAGCCCGATGCGCATGGTTTTATCGATTACCCGCAGCAAGAGCATGCGGTGTGGAACACCCTGATCACCCGCCAGCTGAAAGTGATCGAAGGCCGTGCGTGCCAGGAATACCTGGACGGCATCGACCAGCTGAAATTGCCGCATGACCGCATTCCGCAACTGGGCGAGATCAACAAGGTGCTGGGTGCCACCACCGGCTGGCAGGTTGCCCGGGTTCCGGCGCTGATCCCCTTCCAGACCTTCTTCGAATTGCTGGCCAGCAAGCGCTTTCCGGTCGCCACCTTCATCCGCACCCCGGAAGAGCTGGACTACCTGCAAGAGCCGGATATCTTCCACGAGATCTTCGGCCACTGCCCGCTGCTGACCAATCCCTGGTTCGCCGAATTCACCCACACCTACGGCAAGCTCGGCCTGGCCGCGACCAAGGAACAACGTGTGTACCTGGCACGCTTGTACTGGATGACCATCGAGTTTGGCCTGATGGAAACCGCGCAAGGCCGCAAAATCTATGGTGGTGGCATCCTCTCGTCGCCGAAAGAGACCGTCTACAGTCTGTCTGACGAGCCTGAGCACCAGGCCTTCGACCCGATCGAGGCCATGCGTACACCCTACCGCATCGACATTCTGCAACCGGTGTATTTCGTACTGCCGAACATGAAGCGCCTGTTCGACCTGGCCCACGAGGACATCATGGGCATGGTCCATAAAGCCATGCAGCTGGGTCTGCATGCACCGAAGTTTCCACCCAAGGTCGCTGCCTGA-3’
SEQ ID NO :14
Nt
Tétrahydrobiopterine deshydratase (phhB)		 5’-ATGAATGCCTTGAACCAAGCCCATTGCGAAGCCTGCCGCGCCGACGCACCGAAAGTCACCGACGAAGAGCTGGCCGAGCTGATCCGCGAAATCCCGGACTGGAACATCGAAGTACGTGACGGCCACATGGAGCTGGAGCGCGTGTTCCTGTTCAAGAACTTCAAGCACGCCCTGGCGTTCACCAATGCCGTGGGCGAAATTGCCGAAGCCGAAGGCCACCACCCAGGGCTGCTGACTGAATGGGGCAAGGTCACCGTGACCTGGTGGAGCCACTCGATCAAAGGCCTGCACCGCAACGACTTCATCATGTGCGCACGCACTGACAAGGTGGCGGAAACGGCTGAAGGCCGGAAGTAA-3’
SEQ ID NO :15
Nt

tyrosine ammonia lyase (TAL_RG_OPT)		 5’-ATGGCCCCTCGCCCTACCTCACAGAACCAAACCCGCACATGCCCGACGACGCAGGTTACTCAAGTTGATATAGTTGAGAAGATGCTCGCTGCACCAACTGACAGCACCCTAGAGCTCGACGGGTATTCACTAAATCTTGGGGACGTCGTTTCAGCTGCAAGGAAAGGAAGACCTGTAAGAGTAAAAGATAGTGATGAAATTCGGAGTAAAATAGATAAGTCCGTAGAGTTTTTAAGGTCACAACTTAGCATGTCCGTATACGGGGTCACTACCGGGTTCGGCGGTTCCGCCGACACCCGCACCGAGGACGCTATATCATTGCAGAAAGCTCTTCTAGAGCATCAGCTCTGCGGCGTTCTTCCAAGTTCCTTCGATTCGTTTAGGCTGGGGCGCGGGCTTGAGAACTCTCTGCCCCTAGAAGTGGTAAGGGGCGCTATGACAATACGGGTGAACAGTCTAACAAGAGGTCACAGCGCGGTTAGACTAGTTGTACTTGAAGCTCTGACTAACTTCTTAAACCACGGGATTACCCCGATTGTCCCACTCCGGGGAACCATCAGTGCGTCCGGTGACCTATCGCCCCTCTCATATATTGCGGCAGCTATATCAGGACATCCAGATTCAAAGGTTCATGTAGTACATGAAGGAAAAGAGAAAATACTTTACGCACGCGAGGCCATGGCCCTTTTTAACCTCGAGCCCGTGGTACTTGGTCCGAAAGAGGGCCTCGGACTAGTTAACGGTACTGCCGTCAGTGCCTCAATGGCTACGCTTGCACTCCACGATGCGCACATGCTGAGCCTGCTAAGTCAAAGTCTCACAGCGATGACCGTGGAGGCCATGGTGGGGCATGCGGGGTCATTTCATCCATTTTTGCATGATGTCACTCGTCCGCATCCTACGCAGATTGAGGTAGCAGGCAACATTCGCAAGCTTCTCGAGGGAAGTCGTTTCGCCGTCCATCATGAGGAAGAAGTAAAAGTAAAGGATGACGAAGGAATATTAAGGCAAGACCGATACCCGCTCCGCACGTCACCGCAATGGTTGGGTCCACTGGTTTCAGACCTCATCCACGCACACGCCGTCTTAACTATTGAAGCAGGGCAATCGACGACAGACAATCCTCTCATCGACGTAGAGAATAAGACCTCGCATCATGGAGGAAATTTTCAAGCTGCAGCTGTCGCGAACACAATGGAAAAGACACGTCTCGGCCTGGCGCAAATAGGGAAACTGAATTTCACCCAGCTCACGGAAATGCTGAACGCCGGCATGAACCGCGGCCTGCCGTCTTGTCTCGCCGCGGAAGATCCTTCTTTATCATATCACTGTAAGGGTTTAGATATCGCGGCAGCTGCATATACGTCCGAACTAGGTCATCTGGCTAACCCTGTCACGACCCACGTACAACCGGCGGAGATGGCTAATCAAGCAGTTAACTCCCTTGCACTAATTTCCGCCCGCCGGACAACAGAGAGTAACGACGTGTTATCACTGCTGCTCGCTACCCACTTATACTGCGTCTTGCAGGCTATCGACTTACGCGCAATCGTGTTCGAATTTAAGAAGCAATTCGGGCCAGCTATTGTGTCCCTAATTGATCAGCACTTCGGAAGCGCCATGACTGGGTCTAATCTTCGAGACGAGCTAGTCGAAAAAGTAAATAAGACACTCGCAAAGAGGCTGGAACAGACTAACAGCTACGACCTAGTTCCACGGTGGCACGACGCCTTTAGTTTTGCAGCGGGAACGGTAGTAGAGGTATTGTCATCGACTTCGTTGTCGTTGGCTGCTGTCAACGCGTGGAAAGTTGCAGCTGCAGAGTCAGCAATTTCGCTGACGCGGCAAGTACGCGAAACATTTTGGAGCGCTGCTTCGACAAGCTCGCCAGCCCTTTCTTACCTGTCCCCACGTACGCAGATCTTGTACGCATTCGTAAGAGAGGAGTTAGGAGTCAAAGCCCGAAGGGGTGACGTATTCCTTGGAAAGCAAGAAGTTACAATTGGATCCAACGTTTCAAAGATCTATGAGGCCATTAAGAGTGGGCGCATAAATAACGTCCTGTTGAAGATGCTGGCCTGA-3’
SEQ ID NO :16
Nt

4-coumarate-CoA ligase (4-CL)		 5’-GTGAATAACGAAGCCCGCTCAGGGTCGACCGACCCTGGCCAACGTCCGCGCTACCGCCAGGTGGCCATCGGGCATCCCCAGGTGCAGGTCAGTCACGTCGACGACGTGCTGCGCATGCAACCTGTCGAGCCACTGGCGCCGCTGCCGGCGCGCCTGCTCGAGCGCCTGGTGCATTGGGCCCAGGTGCGCCCGGACACCACTTTCATCGCGGCACGCCAGGCAGACGGTGCCTGGCGTTCGATCAGCTACGTGCAGATGCTCGCCGATGTGCGCACCATCGCCGCCAACTTGCTAGGACTGGGCCTCAGTGCCGAGCGCCCGCTGGCGCTGCTTTCCGGCAACGACATCGAACACCTGCAAATCGCCCTCGGCGCCATGTATGCCGGTATTGCCTATTGCCCGGTGTCGCCGGCCTACGCGCTGTTGTCGCAAGACTTCGCCAAGTTGCGCCATGTCTGCGAGGTGCTCACCCCCGGAGTGGTCTTCGTCAGCGACAGCCAGCCGTTCCAGCGCGCCTTCGAGGCGGTGCTGGACGATTCGGTCGGCGTGATCAGCGTGCGTGGCCAGGTCGCAGGTCGCCCCCATATAAGCTTCGACAGCCTGTTGCAACCGGGTGACCTGGCGGCGGCCGATGCGGCTTTCGCCGCCACCGGGCCGGACACCATCGCCAAATTCCTCTTCACCTCGGGCTCGACCAAGCTGCCCAAGGCGGTGATCACCACCCAGCGCATGCTGTGCGCCAATCAGCAGATGCTTCTGCAGACTTTTCCGACGTTCGCCGAGGAGCCGCCGGTGCTGGTGGACTGGCTGCCGTGGAACCACACGTTCGGCGGTAGCCACAACCTCGGCATCGTGCTTTACAACGGGGGCAGTTTCTACCTGGACGCCGGCAAGCCGACCCCGCAAGGCTTCGCCGAGACCTTGCGCAATCTGCGCGAGATTTCCCCCACGGCCTACCTCACCGTACCCAAGGGCTGGGAGGAACTGGTCAAGGCACTGGAGCAGGACCCCGCGCTACGCGAGGTGTTCTTTGCCCGCATCAAGCTGTTCTTCTTTGCCGCCGCAGGCCTGTCGCAAAGCGTCTGGGACCGGCTGGACCGCATTGCCGAGCAACACTGTGGCGAACGCATCCGCATGATGGCCGGCCTTGGCATGACCGAAGCCTCGCCATCGTGCACCTTCACCACCGGGCCTTTGTCGATGGCCGGCTATGTCGGGCTGCCGGCACCTGGCTGCGAAGTGAAGCTGGTGCCGGTGGGCGACAAGCTCGAGGCGCGCTTCCGTGGCCCGCATATCATGCCGGGCTACTGGCGCTCGCCGCAGCAGACCGCCGAGGCGTTCGACGAGGAGGGCTTCTACTGTTCGGGCGACGCGTTGAAGCTGGCCGATGCCAGGCAGCCCGAGCTTGGCCTGATGTTCGATGGCCGTATCGCTGAGGACTTCAAACTTTCGTCCGGGGTATTCGTCAGTGTCGGGCCGCTGCGCAACCGCGCAGTGCTGGAGGGCTCGCCTTACGTACAGGACATCGTGGTCACCGCGCCGGACCGTGAATGCCTGGGCCTGCTGGTGTTCCCGCGTCTGCCCGAGTGTCGGCGCCTGGCCGGGCTGGCAGAGGATGCCAGCGATGCGCGGGTGCTGGCCAACGACACCGTGCGCAGTTGGTTCGCTGACTGGCTGGAGCGCTTGAACCGCGATGCCCAAGGCAACGCCAGCCGTATCGAATGGCTGTCGCTGCTGGCCGAGCCGCCGTCGATCGACGCCGGTGAAATCACCGACAAGGGCTCGATCAATCAGCGCGCCGTGCTGCAGCGGCGCGCCGCTCAGGTCGAGGCGCTGTACCGTGGCGAAGACCCCGACGCATTGCACGCCAAGGTGCGGCCTTGA-3’
SEQ ID NO :17
Nt

benzalacétone synthase (BAS)		 5’-ATGGCAACTGAGGAGATGAAGAAATTGGCCACCGTGATGGCCATTGGCACGGCCAACCCTCCGAACTGCTACTACCAGGCCGACTTTCCCGACTTCTACTTCCGCGTCACCAACAGCGACCACCTCATCAACCTCAAGCAAAAGTTCAAGCGCCTTTGTGAAAACTCAAGGATTGAGAAGCGTTACCTTCATGTGACCGAAGAGATTCTCAAGGAAAACCCAAACATTGCTGCCTACGAGGCAACCTCGTTGAATGTAAGACACAAAATGCAAGTGAAAGGAGTTGCAGAGCTTGGGAAAGAGGCTGCCCTCAAGGCCATCAAAGAATGGGGCCAACCCAAGTCCAAGATCACACATCTCATCGTGTGTTGCCTAGCCGGCGTTGACATGCCCGGCGCGGATTATCAACTCACTAAGCTTCTTGACCTTGACCCTTCCGTCAAGCGTTTTATGTTTTACCACCTAGGATGCTACGCTGGTGGCACTGTCCTTCGCCTTGCAAAGGACATAGCGGAGAACAACAAGGGAGCTCGTGTTCTCATCGTTTGCTCAGAGATGACAACAACTTGTTTTCGTGGGCCATCTGAAACCCATCTGGACTCCATGATAGGCCAAGCAATATTAGGCGATGGGGCTGCAGCTGTCATAGTTGGCGCAGATCCAGACCTAACCGTTGAGAGGCCCATATTCGAGTTGGTTTCCACAGCCCAGACTATTGTACCCGAATCCCATGGTGCAATTGAGGGCCACTTGCTTGAATCTGGACTCAGTTTCCATTTGTACAAGACCGTTCCTACACTAATCTCTAACAACATTAAAACTTGCCTTTCTGATGCTTTCACTCCTCTAAACATTAGCGATTGGAACTCTCTTTTCTGGATCGCACACCCTGGTGGTCCTGCCATCCTAGACCAAGTTACTGCTAAGGTTGGTCTTGAAAAGGAGAAACTCAAGGTAACTAGACAAGTGTTGAAGGACTATGGAAACATGTCGAGTGCTACGGTGTTTTTCATCATGGATGAGATGAGGAAGAAGTCACTCGAAAACGGTCAAGCAACCACTGGAGAAGGGCTCGAGTGGGGTGTTTTGTTTGGGTTCGGGCCTGGAATCACCGTTGAAACTGTAGTGCTACGCAGTGTGCCCGTAATTAGCTAG-3’

Claims (8)

  1. Souche génétiquement modifiée dePseudomonas putidacaractérisée en ce qu’elle comprend un gène AroF-I muté codant pour la 3-Deoxy-D-arabino-Heptulodonate 7-phosphate (DAHP) synthase dont la séquence présente au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO :1 et présentant au moins une mutation P160L, une double mutation P160L/Q164A, ou une double mutation P160L/S193A, de préférence une double mutation P160L/S193A.
  2. Souche génétiquement modifiée selon la revendication 1, caractérisée en ce qu’elle comprend un gène recombinant additionnel codant pour une phénylalanine hydroxylase (phhA) dont la séquence présente au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 5, et un gène recombinant additionnel codant pour une tétrahydrobiopterine deshydratase (phhB) dont la séquence présente au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 6, de préférence lesdits gènes recombinants phhA et phhB étant placés sous contrôle d’un promoteur hétérologue permettant leur surexpression.
  3. Souche génétiquement modifiée selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu’elle exprime une DAHP synthase présentant une séquence d’acide aminés ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 2, la séquence SEQ ID NO :3, ou la séquence SEQ ID NO :4.
  4. Souche génétiquement modifiée selon la revendication 3, caractérisée en ce qu’elle exprime une DAHP synthase ayant une séquence d’acide aminés définie par la séquence SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO :3, ou SEQ ID NO :4.
  5. Souche génétiquement modifiée selon l’une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu’elle comprend en outre un ou plusieurs gènes recombinants additionnels choisis parmi :
    - le gène recombinant codant un polypeptide à activité tyrosine ammonia lyase (TAL), en particulier un polypeptide TALayant au moins 80% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO :7 du polypeptide TAL_RG_OPT,
    - le gène recombinant codant un polypeptide à activité 4-coumarate-CoA ligase (4-CL), en particulier, un polypeptide 4CL ayant au moins 80% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO :8, et/ou
    - le gène recombinant codant un polypeptide à activité benzalacétone synthase (BAS), en particulier un polypeptide BAS ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO :9.
  6. Procédé de synthèse d’un composé phénylpropanoïde, caractérisé en ce qu’il comprend une étape de croissance de la souche génétiquement modifiée selon la revendication 5, dans un milieu de culture sous des conditions permettant l’expression des gènes recombinants nécessaires à la synthèse dudit phénylpropanoïde, ledit composé phénylpropanoïde étant synthétisé par ladite souche génétiquement modifiée.
  7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu’il comprend également une étape de récupération du composé phénylpropanoïde dans le milieu de culture.
  8. Utilisation de la souche selon l’une des revendication 1 à 5, pour la synthèse d’un composé phénylpropanoïde ou d’un dérivé de phénylpropanoïde, de préférence l’acide coumarique ou la frambinone.
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