EP3464556A1 - Production de frambinone par un microorganisme fongique recombinant - Google Patents

Production de frambinone par un microorganisme fongique recombinant

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EP3464556A1
EP3464556A1 EP17732985.1A EP17732985A EP3464556A1 EP 3464556 A1 EP3464556 A1 EP 3464556A1 EP 17732985 A EP17732985 A EP 17732985A EP 3464556 A1 EP3464556 A1 EP 3464556A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
microorganism
tyrosine
rambinone
advantageously
sequence
Prior art date
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Pending
Application number
EP17732985.1A
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German (de)
English (en)
Inventor
Alexander Matthias FARWICK
Thomas Desfougeres
Georges Pignede
Anaïs ROUSSEL
Isabelle MOULY
Brieuc MORVAN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lesaffre et Cie SA
Original Assignee
Lesaffre et Cie SA
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Filing date
Publication date
Application filed by Lesaffre et Cie SA filed Critical Lesaffre et Cie SA
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Pending legal-status Critical Current

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    • C12Y403/00—Carbon-nitrogen lyases (4.3)
    • C12Y403/01—Ammonia-lyases (4.3.1)
    • C12Y403/01023—Tyrosine ammonia-lyase (4.3.1.23)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Y403/01—Ammonia-lyases (4.3.1)
    • C12Y403/01024—Phenylalanine ammonia-lyase (4.3.1.24)
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    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y602/00—Ligases forming carbon-sulfur bonds (6.2)
    • C12Y602/01—Acid-Thiol Ligases (6.2.1)
    • C12Y602/01012—4-Coumarate-CoA ligase (6.2.1.12)

Definitions

  • the present invention provides methods for efficiently producing rambinone from tyrosine using fungal microorganisms and adapted culture conditions.
  • the raspberry flavor (Rubus idaeus) is related to more than 200 compounds, but frambinone, a natural phenolic compound, is the compound that has the greatest impact, defining its characteristic taste (Klesk et al., 2004, J Agric., Food Chem 52, 5155-61, Larsen et al., 1991, Acta Agric., Scand 41, 447-54). It can also be found in other fruits and vegetables, including peach, apple and rhubarb (Beekwilder et al., 2007, Biotechnol, J. 2, 1270-79). Because raspberries are only present in small quantities in raspberries (1-4 mg per kg of fruit), natural rambinone is of great value (Larsen et al., 1991). As its natural availability is limited, its biotech production is highly desirable.
  • Frambinone (CAS No. 5471-51-2), also known as raspberry ketone or 4- (4-hydroxyphenyl) butan-2-one, has the following structure:
  • Frambinone can be used in a wide range of applications, including agri-food and cosmetics (as a flavor), agriculture (as a bait / lure for insects) and even health (as a slimming product) or in medicine (as an inhibitor of melanogenesis).
  • Frambinone can be obtained from the aromatic amino acid L-tyrosine as an initial substrate via a 4-step biosynthetic pathway ( Figure 1, Beekwilder et al., 2007, Biotechnol, J. 2, 1270-79).
  • tyrosine is de-aminated by a tyrosine ammonia lyase (TAL, EC 4.3.1.23) to form coumaric acid.
  • CoA ligase (4CL, EC 6.2.1.12), a Coenzyme A (CoA) molecule is grafted onto coumaric acid. Coumaroyl-CoA is then converted by benzalacetone synthase (BAS, EC 2.3.1.212) to 4-hydroxybenzalacetone. This reaction is a decarboxylative condensation and utilizes a malonyl-CoA unit as a co-substrate. The final step is the reduction of 4-hydroxy benzalacetone to frambinone by benzalacetone reductase (BAR, EC 1.3.1.x).
  • BAR benzalacetone reductase
  • An alternative substrate for frambinone production is coumaric acid, an intermediate of the pathway described above (noted (2) in Figure 1).
  • coumaric acid an intermediate of the pathway described above (noted (2) in Figure 1).
  • industrial applications are more profitable when tyrosine is implemented rather than coumaric acid.
  • L-phenylalanine (denoted (7) in Figure 1) can also be used as a substrate since it can be converted to coumaric acid via cinnamic acid (denoted (8) in Figure 1).
  • frambinone formation in plants uses the general route of phenylpropanoids, which begins with phenylalanine (Borejsza-Wysocki and Hrazdina, 1994, Phytochemistry 35, 623-28.).
  • the first step is phenylalanine ammonia lyase catalyzed deamination (PAL, EC 4.3.1.24).
  • C4H cinnamate 4-hydroxylase
  • CPR cytochrome P450 reductase
  • GB 2 416 769 describes the possibility of producing rambinone with the aid of a microorganism (in particular bacteria and yeasts) containing a 4CL and BAS coding sequence, at least one being of heterologous source. It may further comprise a sequence encoding BAR, C4H, PAL and / or CHS, the BAR coding sequence being advantageously endogenous.
  • a microorganism in particular bacteria and yeasts
  • BAS coding sequence at least one being of heterologous source. It may further comprise a sequence encoding BAR, C4H, PAL and / or CHS, the BAR coding sequence being advantageously endogenous.
  • GB 2 416 770 Based on the assumption that CHS has BAS activity, GB 2 416 770 describes the possibility of producing benzalacetone and frambinone using a microorganism comprising a 4CL (eg tobacco) coding sequence and CHS (eg raspberry or petunia), at least one being of heterologous source. It may further comprise a coding sequence BAR (eg raspberry), C4H and PAL.
  • 4CL eg tobacco
  • CHS eg raspberry or petunia
  • BAR eg raspberry
  • C4H PAL
  • CHS * CHS mutated protein
  • a range from 1 to 6 should be considered as specifically describing each of the ranges it includes, such as ranges from 1 to 3, 1 to 4, 1 to 5, 2 to 4, from 2 to 6, from 3 to 6, etc., as well as each of the values in this range, for example, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 and 6. is worth regardless of the range of the interval.
  • isolated should be understood in the context of the invention as synonymous with removed or extracted from its environment or natural state.
  • an isolated nucleic acid or peptide is a nucleic acid or a peptide extracted from the natural environment in which it is usually found, whether it is a plant or a live animal, for example.
  • nucleic acid or a peptide naturally present in a living animal is not a nucleic acid or an isolated peptide within the meaning of the invention, whereas the same nucleic acid or peptide, partially or completely separated from the other elements present in its natural context is "isolated" within the meaning of the invention.
  • An isolated nucleic acid or peptide may exist in a substantially purified form, or may exist in a non-native environment such as, for example, a host cell.
  • A refers to adenosine
  • C refers to cytosine
  • G refers to guanosine
  • T refers to thymidine
  • U refers to uridine.
  • nucleotide sequence encoding an amino acid sequence refers to all the nucleotide sequences that encode the amino acid sequence, including degenerate nucleotide sequences allowing for obtain said amino acid sequence.
  • the nucleotide sequence that encodes a protein or RNA or cDNA may optionally include introns.
  • coding or “coding for”, “code” or “code for” refer to the property inherent in the specific nucleotide sequences in a polynucleotide, such as a gene, cDNA or AR m, to serve as the matrix for the synthesis of other polymers and macro molecules in biological processes, having either a defined sequence of nucleotides (eg, rRNA, tRNA and mRNA), or a defined sequence of amino acids, and the biological properties that resulting.
  • a gene encodes a protein if the transcription and translation of the mRNA corresponding to that gene produces the protein in a cell or other biological system.
  • both the coding strand whose nucleotide sequence is identical to the mRNA sequence and which is generally described in the sequence and database listings, the non-coding strand, used as a template for the transcription of a gene or cDNA, may be referred to as coding for the protein or other product of that gene or cDNA.
  • nucleic acids are nucleotide polymers.
  • nucleic acids and polynucleotides as used in the context of the invention are interchangeable. It is well known in the field of molecular biology and genetic engineering that nucleic acids are polynucleotides, which can be hydrolyzed to monomers. Nucleotides in monomeric form can be hydrolyzed to nucleosides.
  • polynucleotide refers, without limitation, to any type of nucleic acid molecule, that is to say nucleic acid molecules obtainable by any means available in the art, including by recombinant means, namely the cloning of nucleic acid sequences from a recombinant library or the genome of a cell, using standard cloning technologies such as PCR, or by synthesis.
  • peptide refers to a compound consisting of amino acid residues covalently linked by peptide bonds.
  • a protein contains by definition at least two amino acids, without limitation as to the maximum number of amino acids.
  • the polypeptides interchangeably include several peptides and / or proteins, which themselves comprise two or more amino acids connected to each other by peptide bonds.
  • the term refers to both short chains, which are also commonly referred to in the art as peptides, oligopeptides and oligomers for example, and longer chains, which are generally designated in the art as proteins, of which there are many types.
  • Polypeptides include, for example, for example, logically active bio fragments, substantially homologous polypeptides, oligopeptides, homodimers, heterodimers, polypeptide variants, modified polypeptides, derivatives, analogs, fusion proteins, among others.
  • the polypeptides include natural peptides, recombinant peptides, synthetic peptides, or a combination thereof.
  • homologous and identical refer to sequence similarity or sequence identity between two polypeptides or between two nucleic acid molecules.
  • a position in each of the two compared sequences is occupied by the same amino acid base or subunit monomer (for example, when a position in each of the two DNA molecules is occupied by an adenine)
  • the molecules are homologous or identical for this position.
  • the percentage of identity between two sequences is a function of the number of corresponding positions shared by the two sequences, and corresponds to this number divided by the number of positions compared and multiplied by 100. For example, if 6 out of 10 positions in two sequences matched are identical, so the two sequences are 60% identical.
  • a "vector" within the meaning of the invention is a molecular construct which comprises an isolated nucleic acid and which can be used to deliver the isolated nucleic acid into a cell.
  • Many vectors are known in the art including, but not limited to, linear polynucleotides, polynucleotides associated with ionic or amphiphilic compounds, plasmids, and viruses.
  • the term “vector” designates, for example, an autonomously replicating plasmid or a virus.
  • expression vector denotes a vector comprising a recombinant polynucleotide, which comprises expression control sequences operably linked to a nucleotide sequence to be expressed.
  • An expression vector comprises, in particular, expression elements acting in cis; other elements for expression that may be provided by the host cell or by an in vitro expression system.
  • Expression vectors within the meaning of the invention include all those known in the art, such as cosmids, plasmids (for example naked or contained in liposomes) and viruses (for example lentiviruses, retroviruses, adenovirus and adeno-associated viruses) that incorporate the recombinant polynucleotide.
  • promoter as used herein is defined as a DNA sequence recognized by the cell synthesis machinery, or introduced synthetic machinery, necessary to initiate the specific transcription of a polynucleotide sequence.
  • promoter / regulatory sequence denotes a nucleic acid sequence, necessary for the expression of the polynucleotide operably linked to the promoter / regulatory sequence.
  • this sequence may be the promoter base sequence, while in other cases this sequence may also include an activator sequence and other regulatory elements useful for polynucleotide expression.
  • the promoter / regulatory sequence may be, for example, a sequence allowing the expression of the polynucleotide which is specific for a tissue, that is to say preferably occurring in this tissue.
  • a "constitutive" promoter is a nucleotide sequence which, when operably linked to a polynucleotide, leads to expression of the polynucleotide in most or all physiological conditions of the cell.
  • an "inducible" promoter is a nucleotide sequence which, when operably linked to a polynucleotide, leads to expression of the polynucleotide only when a promoter inducer is present in the cell.
  • the present invention relates to a fungal microorganism genetically modified for the production of rambinone, said microorganism having the following characteristics:
  • the expression "genetically modified microorganism” means that the microorganism according to the invention is not found in nature and is modified by introduction of new genetic elements and / or by deletion or modification of the genetic elements. endogenous microorganisms. Such a microorganism may be subjected to selection pressure by combining site-directed mutagenesis and culturing in the selection medium.
  • the term “genetic element” is used in a manner equivalent to “gene” or “sequence”. It is therefore a nucleic acid sequence, which can have any type of functionality.
  • coding sequence in particular coding an enzyme of the synthesis or degradation pathway of interest
  • regulatory sequence in particular a promoter or a terminator.
  • it can be optimized, that is to say modified to integrate the preferred codons of the host, in this case the fungal microorganism, in which this sequence is to express.
  • only the coding sequence of the gene of interest or ORF for "Open Reading Frame" is isolated and implemented.
  • the new genetic elements introduced into the microorganism targeted by the invention are so-called exogenous or heterogeneous genetic elements, which may be of a synthetic nature or from other organisms (or sources).
  • a microorganism can express exogenous or heterologous genes if they are introduced into said microorganism with all the elements allowing their expression in the host microorganism.
  • the endogenous genes may be modified to modulate their expression and / or their activity, for example by introducing mutations into the coding sequences in order to modify the gene product or by modifying the regulatory sequences, for example by introducing heterologous sequences in addition to or instead of the endogenous regulatory sequences.
  • the modulation of the endogenous genes may result in overexpression or an increase in the activity of the endogenous gene product or, conversely, a decrease in the expression or activity thereof.
  • supernumerary or additional copies of an endogenous gene may also be introduced into the microorganism, thereby increasing the level of expression and thus the activity of the product encoded by the gene.
  • Techniques for introducing DNA into a host are well known to those skilled in the art and include permeabilization membranes by applying an electric field (electroporation), thermally (application of a thermal shock) or chemically, for example using lithium acetate.
  • the introduced genetic elements can be integrated into the genome of the host, in particular by homologous recombination or chromosomal integration, advantageously using integrative cassettes, or expressed extrachromosomally using plasmids or vectors.
  • plasmids advantageously self-replicating, are well known to those skilled in the art, which differ in particular by their origin of replication, their promoter (inducible or constitutive), their marker (for example a resistance to an antibiotic or the ability to grow in a selective medium) and the number of copies per cell.
  • the chromosomal integration of genes is done by the so-called modular cassette integration technique ("modular cassette integration"). technical ").
  • the integration of the gene or genes is at the HO locus.
  • these cassettes are chosen to have ends having homologous sequences, called recombination regions (RR), allowing homologous recombination and integration in the desired order and at the desired position. different cassettes.
  • an expression cassette encodes a marker, for example an antibiotic resistance or the ability to grow in a selective medium, to select or identify microorganisms in which the chromosomal integration actually took place.
  • an expression cassette comprises the coding or ORF part of a gene of interest, in particular enzymes involved in the raspinone biosynthesis pathway from tyrosine, placed under the control of regulatory sequences, advantageously at the level of minus a promoter and a terminator, which may be the native regulatory sequences of this gene or heterologous sequences chosen for their functionality and / or efficacy in the host microorganism.
  • the cassette is a marker cassette, advantageously comprising a dominant marker gene under the control of a promoter and a terminator.
  • said cassette comprises at its 5 'and 3' ends regions homologous to the 5 'and 3' regions of the targeted gene, for example 5 'corresponding to the promoter of the target gene and corresponding in 3' to the terminator of the targeted gene.
  • the cassette may contain loxP sites for excision of this genome cassette through the action of the recombinase cre.
  • suitable markers are genes conferring resistance to antibiotics, which are then introduced into the culture medium of the genetically modified microorganism to ensure the selection and maintenance of the genetic modification.
  • Many markers are available to those skilled in the art, for example:
  • kanMX4 conferring resistance to geneticin (or G418);
  • hphNT1 conferring resistance to hygromycin B
  • the ble gene conferring resistance to phleomycin.
  • targeting of the introduced genetic element for example by sequencing, by PCR ("Polymerase Chain Reaction") or by hybridization ("Southern blot” or “Northern blot”);
  • targeting the product of the targeted gene for example by immunological detection (“Western blot”) or by measuring the activity, for example enzymatic, associated.
  • promoters important elements for controlling gene expression are the promoters, placed upstream of the coding sequence whose expression is governed by the promoter.
  • the genes can be expressed using inducible or constitutive variable force promoters.
  • the promoters used in the context of the invention are constitutive promoters. These promoters may be homologous or heterologous.
  • promoters commonly used by those skilled in the art are, for example:
  • the promoter of the S. cerevisiae PFK2 gene for example that of sequence SEQ ID NO: 4;
  • the promoter of the PGI1 gene of S. cerevisiae for example that of sequence SEQ ID NO: 7
  • the promoter of the S. cerevisiae PMA1 gene for example that of sequence SEQ ID NO: 10;
  • the promoter of the S. cerevisiae PYK1 gene for example that of sequence SEQ ID NO: 13;
  • SEQ ID NO: 15 or S. cerevisiae.
  • terminator sequences also called terminators, placed downstream of the coding sequence to be expressed. Again, they may be homologous terminators, from the microorganism in question, or heterologous, namely artificial sequences or terminators from a source other than the host microorganism.
  • terminators may be homologous terminators, from the microorganism in question, or heterologous, namely artificial sequences or terminators from a source other than the host microorganism.
  • Many terminator sequences are available and known to those skilled in the art, for example:
  • the terminator of the Saccharomyces cerevisiae CYC1 gene for example that of sequence SEQ ID NO: 3;
  • the terminator of the S. cerevisiae PFK2 gene for example that of sequence SEQ ID NO: 6;
  • the terminator of the S. cerevisiae ZWF1 gene for example that of sequence SEQ ID NO: 12;
  • the terminator of the S. cerevisiae PYK1 gene for example that of sequence SEQ ID NO: 14;
  • fungal microorganism advantageously designates a yeast or a fungus.
  • yeast microorganism is understood as a “fungal microorganism strain”.
  • the genetically modified fungal microorganism, object of the present invention is obtained from an isolated strain and at least partially characterized.
  • yeast means a commercial product obtained through the implementation of a method for producing a yeast strain. Thus, yeasts having different characteristics can be obtained from the same strain, these differences being related to the production method used.
  • the invention relates to a yeast strain, in other words a strain belonging to the ascomycete phyla or basidiomycetes.
  • the strain belongs to the genus Saccharomycetales, even more advantageously to the families of Debaryomycetaceae, Dipodascaceae or Saccharomycetaceae.
  • the strain belongs to the genera Yarrowia, Debaryomyces, Arxula, Scheffersomyces, Geotrichum, Pichia or Saccharomyces. It may for example be species Yarrowia lipolytica, Debaryomyces hansenii or Saccharomyces cerevisiae.
  • the strain used for the construction of a strain according to the invention or for the implementation of a method according to the invention is a so-called industrial strain, as opposed to a so-called strain of laboratory.
  • the so-called industrial yeast strains are those capable of being produced using industrial substrates as a carbon source.
  • said carbon source may be sugar cane molasses or beetroot.
  • the microorganism is chosen in connection with at least one of the following characteristics:
  • the microorganism that will be genetically modified may have at least one endogenous enzymatic activity involved in the conversion of tyrosine to rambinone. According to a particular embodiment, it is capable of converting 4-hydroxy benzalacetone to rambinone and thus naturally has a BAR activity, as detailed below.
  • the microorganism may be chosen for other characteristics of interest, particularly in view of its application in biotechnology (knowledge of the genome, tools available for genetic manipulation, etc.), its metabolism (especially respiratory and lipidic promoting production malonyl-CoA or acetyl-CoA, co-substrates of the synthetic route of rambinone), or conditions of its industrial exploitation (aerobic growth, tolerance to stress and toxic compounds, etc.).
  • a microorganism of interest is chosen from the following list: Beauveria bassiana, Candida boidinii, Galactomyces candidum (Geotrichum candidum), Kloeckera saturnus, Kodamaea ohmeri (Pichia ohmeri), Komagataella pastoris (Pichia pastoris), Mucor Nederlandicus (Mucor subtilissimus), Pichia membranifaciens, Schwanniomyces etchellsii (Pichia etchellsii), Torulaspora delbrueckii (Saccharomyces fermentati), Wickerhamomyces anomalus (Hansenula anomala), Yarrowia lipolytica (Candida lipolytica), Saccharomyces cerevisiae, Debaryomyces hansenii.
  • it is Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica or Deb
  • Fungal microorganisms of particular interest are, for example, Yarrowia lipolytica or Debaryomyces hansenii.
  • a microorganism according to the invention is intended to produce frambinone from tyrosine.
  • a microorganism has an improved ability to produce rambinone from tyrosine, especially with respect to the strains already described or with respect to this same microorganism that has not been genetically modified.
  • tyrosine is of obvious interest.
  • the addition of tyrosine in the culture medium advantageously a fermentation medium, was possible in terms of solubility and did not exhibit any known toxicity.
  • the production of frambinone is from exogenous tyrosine to the microorganism according to the invention, preferably by addition in its culture medium.
  • the concentration of tyrosine in the culture medium is greater than or equal to 50 mg / l, or even greater than or equal to 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 or even 450 mg / l.
  • it is advantageously less than or equal to 1 g / L, or even less than or equal to 950, 900, 850, 800, 750, 700, 650, 600, 550, 500 or even 450 mg / L.
  • the invention also relates to the use of a microorganism as defined in the context of the present application for the production of rambinone from tyrosine.
  • the levels of production of rambinone by a microorganism that have not yet been reached advantageously a concentration in the culture medium of the microorganism greater than 4 mg / L, more advantageously greater than or equal to 5 , 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or even 20, 25 or 30 mg / L.
  • the rambinone remains soluble and shows no toxicity with respect to the microorganisms according to the invention.
  • a microorganism according to the invention or used in a process according to the invention is genetically modified to exhibit an ability to produce or synthesize rambinone from tyrosine, or even to have an improved ability to produce or synthesize rambinone from tyrosine.
  • the microorganism can naturally have an ability to synthesize frambinone from tyrosine and the genetic modifications made are intended to improve this capacity.
  • the microorganism does not naturally have the capacity to synthesize frambinone from tyrosine and the genetic modifications made are intended to confer this capacity.
  • TAL tyrosine ammonia lyase activity
  • CoA ligase (EC 6.2.1.12), denoted 4CL, capable of catalyzing the grafting of a Coenzyme A (CoA) molecule on coumaric acid to form coumaroyl-CoA;
  • BAS benzalacetone synthase activity, labeled BAS, capable of converting coumaroyl-CoA to 4-hydroxybenzalacetone in the presence of malonyl-CoA as a co-substrate;
  • the microorganism according to the invention is genetically modified to ensure or improve the production of rambinone from tyrosol.
  • the genetic modifications made make it possible to increase at least one of the four enzymatic activities mentioned above. It can for example be:
  • TAL the enzymes of the family of lyases having a predominant activity for tyrosine (tyrosine ammonia lyase, EC 4.3.1.23) are rare. Often, it has an affinity for the phenylalanine substrate at least equal to or even greater (phenylalanine / tyrosine ammonia lyase, PAL / TAL, EC 4.3.1.25).
  • a TAL enzyme which has no or very little PAL activity so as to avoid the accumulation of the cinnamic acid intermediate which may have some toxicity.
  • the selected TAL enzyme has a notorious PAL activity, it may be advantageous to ensure that the microorganism further has a C4H and / or CPR activity, and possibly to modify it to introduce sequences coding for these enzymatic activities. useful for the conversion of cinnamic acid into coumaric acid.
  • a cinnamic acid buildup may exert a negative feedback on TAL so that a balanced expression of 4CL may be required.
  • the TAL protein encoded by the gene introduced into the microorganism according to the invention has the sequence SEQ ID NO: 18, or a protein sequence exhibiting at least 70%, or even 80, 85, 90, 95 or even 99%> homology or identity with the sequence SEQ ID NO: 18 and having a TAL activity.
  • the sequence coding for the TAL protein, introduced into the microorganism according to the invention has the sequence SEQ ID NO: 5, or a sequence exhibiting at least 60%> or even 70, 80, 85, 90, 95 or even 99% identity with the sequence SEQ ID NO: 5. Its expression can be placed under the control of the regulatory sequences SEQ ID NO: 4 and / or SEQ ID NO: 6.
  • CoA ligases (4CL; EC6.2.1.12) are found in plants.
  • Genes of interest that can be used in the context of the invention are listed in Table 2 below:
  • the 4CL protein encoded by the gene introduced into the microorganism according to the invention has the sequence SEQ ID NO: 19, or a protein sequence exhibiting at least 70%, or even 80, 85, 90, 95 or even 99% homology or identity with the sequence SEQ ID NO: 19 and having a 4CL activity.
  • the sequence encoding the 4CL protein, introduced into the microorganism according to the invention has the sequence SEQ ID NO: 8, or a sequence exhibiting at least 60%, or even 70, 80, 85, 90 , 95 or even 99% identity with the sequence SEQ ID NO: 8. Its expression can be placed under the control of the regulatory sequences SEQ ID NO: 7 and / or SEQ ID NO: 9.
  • the accumulation of coumaryl-CoA generated by the action of 4CL can cause the undesirable formation of phloretic acid and inhibit the TAL activity. It is therefore important that the microorganism according to the invention has a BAS activity (catalyzing the next step in the route of synthesis of rambinone) adapted.
  • Benzalacetone synthases (BAS, EC2.3.1.212) are part of the family of PKS (PolyKetone Synthase), which also includes chalcone synthases (CHS, for example involved in the synthesis of naringenin) and stilbene synthases (STS; involved for example in the synthesis of resveratrol). These enzymes accept coumaroyl-CoA and other substrates, and catalyze condensation with malonyl-CoA. Malonyl-CoA is an intermediate in the synthesis of fatty acids and its formation requires ⁇ . While the CHS and STS add three malonyl-CoA units, BAS adds only one. However, the described BAS enzymes also have CHS activity. Genes of interest that can be used in the context of the invention are listed in Table 3 below:
  • the BAS protein encoded by the gene introduced into the microorganism according to the invention has the sequence SEQ ID NO: 20, or a protein sequence exhibiting at least 70%, or even 80, 85, 90, 95 or even 99% homology or identity with the sequence SEQ ID NO: 20 and having a BAS activity.
  • the sequence coding for the BAS protein, introduced into the microorganism according to the invention has the sequence SEQ ID NO: 11, or a sequence exhibiting at least 60%> or even 70, 80, 85, 90, 95 or even 99% identity with the sequence SEQ ID NO: 11. Its expression can be placed under the control of the regulatory sequences, in particular a promoter of sequence SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 13 and or a terminator of sequence SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 14.
  • At least two BAS coding sequences are introduced into the microorganism according to the invention. Note that they can be placed under the control of different regulatory sequences.
  • the final step in the synthesis pathway of rambinone is the reduction of the ⁇ , ⁇ double bond to p-hydroxy benzalacetone, which requires NADPH, catalyzed by benzalacetone reductase (BAR, EC 1.3.1.x). Only two enzymes with this activity have been identified to date. However, some microorganisms have been reported to have endogenous BAR activity such as E. coli and S. cerevisiae (Beckwilder et al., 2007, Biotechnol, J.
  • the first enzyme is described in GB 2 416 769: a 309 amino acid protein was isolated from raspberry protein fractions having BAR activity. It has homology with isoflavone reductases (EC 1.3.1.45) and is capable of converting p-hydroxy benzalacetone to frambinone in in vitro assays with purified enzyme.
  • Koeduka et al. Biochem Biophys Res Commun 412, 104-108 have identified a ketone / zingerone synthase of R. idaeus that has BAR activity (RiRZS1, Uniprot G1FCG0).
  • the purified protein effectively converts p-hydroxy benzalacetone to rambinone in an enzyme test.
  • the BAR protein is encoded by a gene introduced into the microorganism according to the invention and it has the sequence SEQ ID NO: 21, or a protein sequence exhibiting at least 70%, or even 80, 85, 90 , 95 or even 99% homology or identity with the sequence SEQ ID NO: 21 and having a BAR activity.
  • the sequence coding for the BAR protein, introduced into the microorganism according to the invention has the sequence SEQ ID NO: 2, or a sequence presenting at least 60%, or even 70, 80, 85, 90, 95 or even 99% identity with the sequence SEQ ID NO: 2. Its expression can be placed under the control of the regulatory sequences, in particular sequences SEQ ID NO: 1 and / or SEQ ID NO: 3.
  • the fungal microorganism according to the invention naturally lacks at least one enzymatic activity among 4CL and BAS, or even 2.
  • the fungal microorganism according to the invention comprises at least one heterologous sequence encoding the enzyme 4-coumarate: CoA ligase (4CL) or benzalacetone synthase (BAS), advantageously the 4CL and BAS enzymes.
  • said sequence encodes a 4CL enzyme having the sequence SEQ ID NO: 19, or a protein sequence exhibiting at least 70%, even 80, 85, 90, 95 or even 99% homology or homology. identity with the sequence SEQ ID NO: 19 and having a 4CL activity.
  • this sequence comprises the sequence SEQ ID NO: 8, or a sequence having at least 60%, even 70, 80, 85, 90, 95 or even 99% identity with the sequence SEQ ID NO: 8 It may also comprise the sequence SEQ ID NO: 7, advantageously located upstream of the 4CL coding sequence, and / or the sequence SEQ ID NO: 9, advantageously located downstream of the 4CL coding sequence.
  • said sequence encodes a BAS enzyme having the sequence SEQ ID NO: 20, or a protein sequence exhibiting at least 70%), or even 80, 85, 90, 95 or even 99% homology or identity with the sequence SEQ ID NO: 20 and having a BAS activity.
  • this sequence comprises the sequence SEQ ID NO: 11, or a sequence having at least 60%, even 70, 80, 85, 90, 95 or even 99% identity with the sequence SEQ ID NO: 11 It may also comprise the sequence SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 13, advantageously located upstream of the BAS coding sequence, and / or the sequence SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 14, advantageously located downstream. of the BAS coding sequence.
  • the fungal microorganism according to the invention comprises at least two heterologous sequences encoding the enzyme benzalacetone synthase (BAS), advantageously from the same source, still more advantageously of the same coding sequence but possibly placed under the control different regulatory sequences.
  • BAS benzalacetone synthase
  • the fungal microorganisms targeted by the present invention do not exhibit at least one of the following activities: TAL, 4CL, BAS and / or BAR.
  • the fungal microorganism according to the invention comprises at least one heterologous or supernumerary sequence encoding the enzyme tyrosine ammonia lyase (TAL) or benzalacetone reductase (BAR), advantageously the TAL and BAR enzymes.
  • said sequence encodes a TAL enzyme having the sequence SEQ ID NO: 18, or a protein sequence exhibiting at least 70%, even 80, 85, 90, 95 or even 99% homology or homology. identity with the sequence SEQ ID NO: 18 and having a TAL activity.
  • this sequence comprises the sequence SEQ ID NO: 5, or a sequence having at least 60%, even 70, 80, 85, 90, 95 or even 99% identity with the sequence SEQ ID NO: 5 It may also comprise the sequence SEQ ID NO: 4, advantageously located upstream of the TAL coding sequence, and / or the sequence SEQ ID NO: 6, advantageously located downstream of the TAL coding sequence.
  • said sequence encodes a BAR enzyme having the sequence SEQ ID NO: 21, or a protein sequence exhibiting at least 70%), or even 80, 85, 90, 95 or even 99% homology or identity with the sequence SEQ ID NO: 21 and having a BAR activity.
  • this sequence comprises the sequence SEQ ID NO: 2, or a sequence having at least 60%, even 70, 80, 85, 90, 95 or even 99% identity with the sequence SEQ ID NO: 2
  • It may also comprise the sequence SEQ ID NO: 1, advantageously located upstream of the BAR coding sequence, and / or the sequence SEQ ID NO: 3, advantageously located downstream of the BAR coding sequence.
  • the fungal microorganisms targeted by the present invention comprise at least one heterologous sequence encoding the enzymes 4-coumarate: CoA ligase (4CL) and benzalacetone synthase (BAS), as well as at least one heterologous or supernumerary sequence encoding the enzyme tyrosine ammonia lyase (TAL) and benzalacetone reductase (BAR).
  • 4-coumarate CoA ligase (4CL) and benzalacetone synthase (BAS)
  • BAS benzalacetone synthase
  • TAL tyrosine ammonia lyase
  • BAR benzalacetone reductase
  • a particular strain of Saccharomyces cerevisiae having these characteristics, and therefore a conversion route from tyrosine to functional rambinone adapted to the targeted applications, is the industrial strain R 4, deposited with the CNCM (National Collection of Cultures of Microorganisms, Institut Pasteur 25 rue du Dondel Roux, 75724 Paris Cedex 15) dated 1 June 2016 under the number 1-5101. This was obtained by chromosomal integration, at the HO locus of the strain deposited with the CNCM on September 4, 2008 under the number 1-4071, of expression cassettes encoding these 4 enzymes, as described below. below (Examples of realization).
  • the fungal microorganisms according to the invention may undergo other genetic modifications, such as, for example: any means for introducing or increasing the capacity of the microorganism to synthesize rambinone from phenylalanine, for example via the introduction of a gene encoding a PAL enzyme.
  • PAL enzymes are close to the TAL enzymes described above.
  • it can be implemented a TAL enzyme also having a PAL activity.
  • any means for introducing or increasing the ability of the microorganism to convert cinnamic acid to coumaric acid for example via the introduction of a gene encoding a C4H enzyme, optionally in combination with a gene encoding a CPR enzyme.
  • any means of increasing the ability of the microorganism to produce malonyl-CoA for example as reported in Y. lipolytica (Qiao et al., 2015, Metab.Eng .: 29: 56-65) or by overproduction of the Acetyl-CoA carboxylase
  • the microorganism used in the context of the invention comprises at least one heterologous or supernumerary sequence coding for the enzyme phenylalanine ammonia lyase (PAL) or cinnamate 4-hydroxylase (C4H), advantageously the PAL and C4H enzymes.
  • PAL phenylalanine ammonia lyase
  • C4H cinnamate 4-hydroxylase
  • a fungal microorganism targeted by the invention is affected in its tyrosine degradation pathway as shown in FIG. 2.
  • this pathway called the tyrosine tyrosine degradation pathway in the
  • tyrosine is converted to p-hydroxyphenyl acetaldehyde, which may persist as it is or may be converted to either tyrosol or p-hydroxyphenyl acetate.
  • a fungal microorganism of the invention has low ability or inability to degrade or convert tyrosine to tyrosol, p-hydroxyphenylacetaldehyde and / or p-hydroxyphenylacetate. It has been demonstrated, in the context of the present application, that the predominant degradation pathway of tyrosine in the fungal microorganisms of interest was the Tyrosine tyrosine degradation pathway, as illustrated in FIG.
  • a microorganism may be of interest if under the conditions described in the experimental part, namely under aerobic fermentation conditions carried out in advantageously mineral medium, for example composed of 1.7 g / l of YNB (Difco TM), 5 g / L of ammonium sulfate, 2.7 g / L of potassium phosphate and 20 g / L of dextrose, and containing tyrosine, advantageously up to 300 mg / L, the amount of tyrosol produced is less than or equal to at 150 mg / l, advantageously less than or equal to 100 mg / l, or even 50, 40, 30, 20 mg / l or even 10 mg / l.
  • advantageously mineral medium for example composed of 1.7 g / l of YNB (Difco TM), 5 g / L of ammonium sulfate, 2.7 g / L of potassium phosphate and 20 g / L of dextrose, and containing ty
  • strains of fungal microorganisms of interest can be selected on the basis of their hydroxyphenyl pyruvate decarboxylase (HPPDC) activity, a method of measurement of which is detailed in the embodiment examples below.
  • HPPDC hydroxyphenyl pyruvate decarboxylase
  • the HPPDC activity in the microorganism according to the invention is less than or equal to 2 ⁇ 10 -6 kat per g of protein, advantageously less than or equal to 1 ⁇ 10 -6 kat per g of protein, or even to 5 ⁇ 10 "7 kat per g of protein. in the context of the invention, it refers to proteins extracted from the microorganism.
  • the HPPDC activity measured in a microorganism according to the invention is preferably less than or equal to 10 -5 kat per g of protein, advantageously less than or equal to 5 ⁇ 10 -6 , 4 ⁇ 10 -6 , 3 ⁇ 10 "6 , 2 x 10 " 6 , 1 x 10 "6 kat per g of protein,
  • the microorganism is selected for its low or no capacity to degrade tyrosine, evaluated for example according to one of the two methods mentioned above. As already stated, this selection of adapted microorganisms can be carried out before or after the genetic modification of said microorganism.
  • the microorganism is selected for its natural ability to degrade tyrosol tyrosol, p-hydroxyphenyl acetaldehyde and / or p-hydroxyphenyl acetate weakly or not at all.
  • a microorganism of interest in particular for its capacity to synthesize rambinone, is subjected to genetic modifications so as to reduce or even eliminate its ability to degrade tyrosine to tyrosol, p-hydroxyphenyl acetaldehyde and / or p-hydroxyphenyl acetate
  • this can be achieved by inhibiting or inactivating one of the steps ensuring the transformation of tyrosine into tyrosol, p-hydroxyphenyl acetaldehyde and / or p-hydroxyphenyl acetate, in particular the deamination step. , decarboxylation, or even reduction.
  • various means are available to those skilled in the art for effecting this inhibition or inactivation by genetic modification of the microorganism, in particular the chromosomal insertion of exogenous genetic elements or at the level of the regulatory regions so as to interfere with the expression of the target gene, either at the level of the coding sequence so as to prevent the production of the gene product or to cause the production of a truncated and / or inactive protein. It is also possible to mutate the target gene at the level of critical sequences for its expression or activity.
  • the target gene is inactivated using a cassette capable of expressing a marker (Goldstein and McCusker, 1999, Yeast Chichester Engl 15, 1541-53, Guldener et al, 2002, Nucleic Acids Res 30, e23, Guldener et al., 1996, Nucleic Acids Res 24, 2519-24, Janke et al., 2004, Yeast 21, 947-62, Sauer, 1987, Mol Cell Biol. 2087-96), at the ends of which the 5 'and 3' regions of the target gene are inserted to allow homologous recombination and replace the coding portion of the gene with the marker expression cassette.
  • a marker Goldstein and McCusker, 1999, Yeast Chichester Engl 15, 1541-53, Guldener et al, 2002, Nucleic Acids Res 30, e23, Guldener et al., 1996, Nucleic Acids Res 24, 2519-24, Janke et al., 2004, Yeast 21, 947-62,
  • the fungal microorganism according to the invention is inactivated at the level of the activity involved in the decarboxylation of hydroxyphenyl pyruvate.
  • at least 3 genes have been described as being involved in this activity, namely ARO10, PDC5 and PDC6 (Hazelwood et al., 2008; Appl. Environ. Microbiol. 74, 2259-66). Kneen et al., 2011, FEBS J. 278, 1842-53, Vuralhan et al., 2005, Appl., Environ Microbiol 71, 3276-84, Vuralhan et al., 2003, Appl., Environ Microbiol.
  • At least one of the genes encoding phenylpyruvate decarboxylase ArolO, pyruvate decarboxylase Pdc5 and pyruvate decarboxylase Pdc6 is inactivated.
  • the genes encoding phenylpyruvate decarboxylase ArolO, pyruvate decarboxylase Pdc5 and pyruvate decarboxylase Pdc6 are inactivated.
  • the deaminase (s) involved in the first step of the tyrosine degradation pathway are inactivated.
  • it may be Aro8 deaminase and / or Aro9 deaminase, or their counterparts in other fungal microorganisms.
  • the alcohol (s) dehydrogenase (denoted DHA) involved in the third step of tyrosine tyrosine degradation pathway may be targeted.
  • the present invention is directed to a fungal microorganism comprising at least one mutation or deletion in at least one of the genes encoding the following enzymes: Aro8 deaminase, Aro9 deaminase, ArolO decarboxylase, Pdc5 decarboxylase, Pdc6 decarboxylase, alcohol dehydrogenase ( ADH).
  • said mutations and / or deletion result in a reduction or even a suppression of the ability of the microorganism to degrade tyrosine to tyrosol, p-hydroxyphenyl acetaldehyde and / or p-hydroxyphenyl acetate.
  • said microorganism also has an ability to synthesize frambinone from tyrosine, possibly through the introduction of genetic modifications as described above.
  • such a microorganism is a strain of Saccharomyces cerevisiae which has an ability to produce rambinone and inactivation of the ARO10 gene encoding a decarboxylase.
  • This microorganism thus has a tyrosine to functional rambinone conversion pathway and a low capacity or inability to degrade tyrosine to tyrosol, p-hydroxyphenyl acetaldehyde and / or p-hydroxyphenyl acetate as described above.
  • This is for example the industrial strain named R 8, filed with the CNCM on April 26, 2017, under the number 1-5200. This was obtained from the strain R 5, by insertion of a cassette allowing the inactivation of the ARO10 gene (see the embodiments below).
  • the present invention relates to the use of a fungal microorganism having the ability to produce raspinone from tyrosine and a low capacity or inability to degrade tyrosine to tyrosol, p-hydroxyphenyl acetaldehyde and / or or p-hydroxyphenyl acetate, advantageously as described above and in particular the 1-5200 strain, for the production of rambinone, advantageously by aerobic fermentation.
  • the invention also relates to a process for producing rambinone comprising culturing a fungal microorganism having the ability to produce raspinone from tyrosine and a low capacity or inability to degrade tyrosine to tyrosol , p-hydroxyphenyl acetaldehyde and / or p-hydroxyphenyl acetate, advantageously as described above and in particular the 1-5200 strain, in a medium comprising tyrosine.
  • the tyrosine is added to the culture medium at a concentration of between 50 and 450 or 500 mg / l, for example of the order of 300 mg / l.
  • the culture medium may also be supplemented with coumaric acid and / or phenylalanine.
  • the microorganism used in the context of the invention naturally has a certain capacity to degrade tyrosine tyrosol, p-hydroxyphenyl acetaldehyde and / or p-hydroxyphenyl acetate, but this pathway of degradation is inhibited by the addition of a repressor of this pathway, for example an inhibitor of one of the enzymes involved in this pathway.
  • the invention is directed to a process for producing rambinone comprising culturing a fungal microorganism having the capacity to produce rambinone from tyrosine in a medium comprising tyrosine and at least one repressor of the tyrosine degradation pathway to tyrosol, p-hydroxyphenyl acetaldehyde and / or p-hydroxyphenyl acetate.
  • it is a genetically modified microorganism to confer or increase the ability of said microorganism to produce rambinone from tyrosine, as described above.
  • the microorganism used is the industrial strain Saccharomyces cerevisiae RK4, deposited with the CNCM (National Collection of Cultures of Microorganisms, Pasteur Institute, 25 rue du Dondel Roux, 75724 Paris Cedex 15) dated 1 June 2016 under the number 1-5101.
  • the microorganism used is the industrial strain Saccharomyces cerevisiae R 5, deposited with the CNCM (National Collection of Cultures of Microorganisms, Pasteur Institute, 25 rue du Dondel Roux, 75724 Paris Cedex 15) dated April 26, 2017 under the number 1-5199.
  • CNCM National Collection of Cultures of Microorganisms, Pasteur Institute, 25 rue du Dondel Roux, 75724 Paris Cedex 15
  • the tyrosine degradation repressor tyrosol, p-hydroxyphenyl acetaldehyde and / or p-hydroxyphenyl acetate is chosen from glutamate, glutamine or one of their derivatives, advantageously glutamate .
  • this repressor, in particular glutamate is added to the culture medium at a concentration greater than or equal to 0.5 g / L, or even 1, 2 or 3 g / L, for example order of 2 g / L.
  • the fungal microorganism is cultured under conditions favoring the production of rambinone.
  • Particularly suitable conditions of culture are the following:
  • a mineral medium for example composed of 1.7 g / l of YNB (Difco TM), 5 g / l of ammonium sulphate, 2.7 g / l of potassium phosphate and 20 g / L dextrose; - for a duration ranging from several hours to several days;
  • the culture medium having a frambinone concentration advantageously greater than 4 mg / l, more advantageously greater than or equal to 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or even 20, 25 or 30 mg / L.
  • the rambinone thus produced can be isolated from the culture medium.
  • TAL tyrosine ammonia lyase
  • 4Cl 4-coumarate-CoA ligase
  • BAS benzalacetone synthase
  • BAR benzalacetone reductase
  • PAL phenylalanine ammonia lyase
  • C4H cinnamate 4 hydroxylase
  • Figure 3 Diagram of the modified HO locus in the genome of strains S. cerevisiae RK4, RK5 and RK8 and the cassette allowing to modify the locus ARO10
  • Five gene expression cassettes and a marker cassette were integrated at the HO locus using different overlapping recombination regions (RR1-5) between the cassettes for in vivo assembly.
  • RR1-5 overlapping recombination regions
  • the marker cassette pTEF-KanMX-tTEF is absent.
  • Figure 4 Production of rambinone by S. cerevisiae strain RK4 after 7 days The concentration of frambinone (in mg / L) was determined after 7 days of culture depending on the substrate (tyrosine synthesized by the cell from glucose and glucose). ammonium sulphate (so-called de novo production), tyrosine or coumaric acid added to the culture medium).
  • Figure 5 Tyrosol production by S. cerevisiae strain RK4 after 7 days
  • the concentration of tyrosol was determined after 7 days of culture depending on the substrate (tyrosine synthesized by the cell from glucose and ammonium sulphate (called de novo), tyrosine or coumaric acid added in the culture medium).
  • FIG. 6 HDPPC activity in cell extracts (strain S. cerevisiae RK4, RK5 and RK8) after 16 hours of fermentation in a synthetic medium containing tyrosine with or without glutamate
  • HDPPC hydroxy-phenylpyruvate activity
  • the present invention will be further illustrated in connection with a genetically engineered strain of Saccharomyces cerevisiae for expressing 4 heterologous genes encoding the integrated TAL, 4CL, BAS and BAR enzymes at its HO locus and effectively producing rambinone from tyrosine. in a medium supplemented with glutamate, or with a derived strain having an inactivated ARO10 gene.
  • a genetically engineered strain of Saccharomyces cerevisiae for expressing 4 heterologous genes encoding the integrated TAL, 4CL, BAS and BAR enzymes at its HO locus and effectively producing rambinone from tyrosine.
  • a medium supplemented with glutamate or with a derived strain having an inactivated ARO10 gene.
  • these examples are in no way limiting.
  • Enzyme Source Reference Sequence (codon-optimized for expression in S. cerevisiae)
  • the coding sequences were "codon-optimized" for expression in S. cerevisiae.
  • the corresponding sequences are shown in Table 4 above.
  • Rg Rhodotorula glutinis
  • Ai Arabidopsis thaliana
  • strain Rp Rheum palmatum From strain RK4 described above, strain R 5 was obtained by removing the kanMX marker cassette. This was achieved by expression of Cre recombinase which drives the excision of the kanMX marker which is flanked by loxP sites (Steensma and Linde, 2001, Yeast, 18 (5): 469-72). This is the strain filed with the CNCM on April 26, 2017, under number 1-5199.
  • An inactivation cassette of the ARO10 gene was then constructed (FIG. 3B). It is composed of a hygromycin marker cassette, pTEFlshort-hph-tTEF1 (pTEF1 short: SEQ ID NO: 22, hph: SEQ ID NO: 23, tTEF1: SEQ ID NO: 24), flanked by sequences homologous to promoter (pARO10: SEQ ID NO: 25) and terminator (tARO10, SEQ ID NO: 26) of ARO10, upstream and downstream, respectively.
  • a guide RNA sequence specific for the ARO10 gene was cloned into a plasmid making it possible to express Cas9p and said RNA in S. cerevisiae.
  • the strain R 5 described above was cotransformed with this plasmid and the inactivation cassette of the ARO10 gene. Positive clones (resistant to hygromycin) were selected and verified for inactivation of all ARO10 alleles.
  • the strain RK8 thus obtained was filed with the CNCM on April 26, 2017, under the number 1-5200.
  • HPLC devices and parameters are summarized in Table 6 below and allow the separation of rambinone and tyrosol from other compounds.
  • a calibration was performed using standard solutions between 0.1 and 300 mg / L. The samples of the yeast cultures were centrifuged (> 15,000 ⁇ g, 10 min) and the supernatant was filtered through a 0.45 ⁇ filter before injection into the HPLC.
  • Table 6 HPLC Devices and Parameters
  • HPPDC activity Enzyme detection of hydroxyphenyl pyruvate decarboxylase (HPPDC) activity
  • HPPDC activity an enzymatic test coupled with a crude cell extract was developed.
  • the cell extract was prepared from a culture on the night (16h) of the strain of interest in a synthetic medium composed of 1.7 g / L of YNB (Difco TM), 5 g / L of sodium sulfate. ammonium, 2.7 g / L potassium phosphate and 20 g / L dextrose.
  • the medium was further supplemented with 300 mg / L of L-tyrosine and optionally different sources of nitrogen (eg L-glutamate). After aerobic growth at 30 ° C, the cells were harvested by centrifugation (5000xg, 4 min, 4 ° C) and washed twice in wash buffer (10 mM potassium phosphate, 2 mM EDTA, pH 6.8).
  • wash buffer 10 mM potassium phosphate, 2 mM EDTA, pH 6.8
  • the cell pellet was taken up in extraction buffer (100 mM potassium phosphate, 2 mM magnesium chloride, 1 mM DTT, 1x Coplete TM proteinase inhibitors, pH 6.8) and the cells were broken with a "FastPrep disruptor” disruptor (with 0.45 mm diameter glass beads, four cycles of 30 seconds at 6 m / s and 1 min on ice). Cell debris was removed by centrifugation and the supernatant was used as a crude cell extract. The protein concentration was determined using the "Uptima BC Assay Protein Quantification Kit” according to the manufacturer's instructions. The enzymatic assay was performed as described by Kneen et al. (2011, FEBS J. 278, 1842-53), with minor modifications.
  • the test couples the HPPDC reaction (decarboxylation of hydroxyphenyl pyruvate (HPP) to hydroxyphenyl acetaldehyde) with a second reaction (oxidation of hydroxyphenyl acetaldehyde to hydroxyphenyl ethanol / Tyrosol) catalyzed by the auxiliary enzyme alcohol dehydrogenase (ADH).
  • ADH activity leads to a reduction of NADH to NAD + which can be monitored by decreasing absorption at 340 nm in a spectrophotometer.
  • the reaction mixture (1 ml) contained 100 mM potassium phosphate, 1 mM magnesium chloride, 0.5 mM thiamine pyrophosphate, 0.1 mM NADH, 0.5 U horse liver ADH, 4 mM HPP and 0.1 crude cell extract equivalent to approximately 200 ⁇ g of total protein.
  • the reactions were measured at 32 ° C and pH 6.8. The reaction was initiated by adding the HPP substrate.
  • the fermentation tests were carried out with strain R 4 grown in a mineral medium, composed of 1.7 g / L of YNB (Difco TM), 5 g / L of ammonium sulfate, 2.7 g / L of potassium phosphate and 20 g / L of dextrose.
  • the medium may contain 300 mg / L of tyrosine or 100 mg / L of coumaric acid.
  • fermentation tests were conducted under aerobic conditions to optimize frambinone production.
  • strain R 4 can synthesize about 6 mg / L of rambinone from tyrosine.
  • concentration of rambinone in media is approximately 14 mg / L.
  • Tyrosine degradation to tyrosol is a well-known degradation pathway ( Figure 2) (Hazelwood et al., 2008, Appl., Environ Microbiol 74, 2259-66).
  • the first step is a transamination of tyrosine leading to the formation of hydroxyphenyl pyruvate.
  • This compound is then decarboxylated to hydroxyphenyl acetaldehyde (EC: 4.1.1.80).
  • the aldehyde function is reduced to form a hydroxylated molecule called tyrosol (EC: 1.1.1.90).
  • HPPDC P-hydroxyphenyl pyruvate decarboxylase
  • FIG. 6 shows the activity in the cell extract of R 4 after culturing in the fermentation medium containing tyrosine with or without 2 g / L of glutamate. The results confirm the decrease in HPPDC activity in fermenting cells in the presence of glutamate.
  • Figure 6 also reveals that, as expected, strains R 4 and R 5 (from which strain R 8 is derived) have the same level of HPPDC activity in the presence of tyrosine. 4 / Impact of the inhibition of tyrosine degradation on the production of rambinone and tyrosol
  • HPLC long method

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Abstract

La présente invention concerne un microorganisme fongique modifié génétiquement pour la production de frambinone, ledit microorganisme présentant les caractéristiques suivantes: -la capacité à produirede la frambinone à partir de tyrosine; et -une capacité faible ou une incapacité à dégrader la tyrosine en tyrosol,en p-hydroxyphényl acétaldéhydeet/ou en p-hydroxyphénylacétate, et son utilisation pour la production de frambinone.

Description

PRODUCTION DE FRAMBINONE PAR UN MICROORGANISME
FONGIQUE RECOMBINANT
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention vise des méthodes permettant de produire efficacement de la frambinone à partir de tyrosine en utilisant des microorganismes fongiques et des conditions de culture adaptés.
ETAT DE LA TECHNIQUE
La saveur de la framboise {Rubus idaeus) est liée à plus de 200 composés, mais la frambinone, un composé phénolique naturel, est le composé qui a le plus d'impact, définissant son goût caractéristique (Klesk et al., 2004, J. Agric. Food Chem. 52, 5155- 61; Larsen et al., 1991 , Acta Agric. Scand. 41, 447-54). Elle peut aussi être trouvée dans d'autres fruits et légumes, incluant la pêche, la pomme et la rhubarbe (Beekwilder et al., 2007, Biotechnol. J. 2, 1270-79). Dans la mesure où elle n'est présente qu'en petite quantité dans les framboises (1-4 mg par kg de fruits), la frambinone naturelle est d'une grande valeur (Larsen et al., 1991). Comme sa disponibilité naturelle est limitée, sa production biotechnologique est hautement désirable.
La frambinone (N° CAS: 5471-51-2), également appelée cétone framboise ou 4-(4- hydroxyphényl)butan-2-one, possède la structure suivante:
La frambinone peut être utilisée dans un grand nombre d'applications, notamment dans le domaine agro alimentaire et pour les cosmétiques (en tant qu'arôme), pour l'agriculture (en tant qu'appât/leurre pour insectes) et même dans le domaine de la santé (en tant que produit amincissant) ou en médecine (en tant qu'inhibiteur de la mélanogénèse). La frambinone peut être obtenue à partir de l'acide aminé aromatique L-tyrosine comme substrat initial via une voie de biosynthèse en 4 étapes (Figure 1 ; Beekwilder et al., 2007, Biotechnol. J. 2, 1270-79): La tyrosine est désaminée par une tyrosine ammonia lyase (TAL, EC 4.3.1.23) pour former de l'acide coumarique. Catalysée par une 4- coumarate:CoA ligase (4CL, EC 6.2.1.12), une molécule de Coenzyme A (CoA) est greffée sur l'acide coumarique. Le coumaroyl-CoA est alors converti par une benzalacétone synthase (BAS, EC 2.3.1.212) en 4-hydroxy benzalacétone. Cette réaction est une condensation décarboxylative et utilise une unité de malonyl-CoA en tant que co- substrat. L'étape finale est la réduction du 4-hydroxy benzalacétone en frambinone par une benzalacétone réductase (BAR, EC 1.3.1.x).
Un substrat alternatif pour la production de frambinone est l'acide coumarique, un intermédiaire de la voie décrite ci-dessus (notée (2) à la Figure 1). Toutefois, au vu du prix des substrats utilisés pour la bioconversion, les applications industrielles sont davantage profitables lorsque la tyrosine est mise en œuvre plutôt que l'acide coumarique.
La L-phénylalanine (notée (7) à la Figure 1) peut également être utilisée comme substrat puisqu'elle peut être convertie en acide coumarique via l'acide cinnamique (notée (8) à la Figure 1). En effet, la formation de frambinone dans les plantes utilise la voie générale des phénylpropanoides, qui débute avec la phénylalanine (Borejsza-Wysocki and Hrazdina, 1994, Phytochemistry 35, 623-28.). La première étape est une désamination catalysée par une phénylalanine ammonia lyase (PAL, EC 4.3.1.24). L'acide cinnamique produit est alors hydroxylé par une cinnamate 4-hydroxylase (C4H, EC 1.14.13.11) pour former de l'acide coumarique qui est converti comme décrit ci-dessus. C4H est un cytochrome P450 et est associée avec la membrane du réticulum endoplasmique. Son expression semble problématique et la pleine activité nécessite également une enzyme auxiliaire (cytochrome P450 réductase, CPR) (Bassard et al., 2012, Plant Cell 24, 4465- 82; Schuckel et al, 2012, ChemBioChem 13, 2758-63; Winkel, 2004, Rev. Plant Biol. 55, 85-107).
Les biosynthèses de deux autres composés d'intérêt biotechnologique, resvératrol et naringénine, montrent de nombreuses similarités avec la voie proposée de la frambinone (Jeandet et al., 2012, J. Biomed. Biotechnol. 2012, 1-14; Lussier et al., 2012, Comput. Struct. Biotechnol. J. 3, 1-11.). TAL et 4CL sont utilisées pour convertir la tyrosine et l'acide coumarique en coumaroyl-CoA. Une stilbène synthase (STS) ou chalcone synthase (CHS) catalyse alors la condensation consécutive avec trois unités malonyl- CoA pour former du resvératrol ou du naringénine chalcone, respectivement. Au vu de l'intérêt pour une production alternative à la synthèse chimique de la frambinone, il a été tenté de transposer ces voies de synthèse dans des microorganismes recombinants, en particulier chez Escherichia coli et Saccharomyces cerevisiae.
En particulier, GB 2 416 769 décrit la possibilité de produire de la frambinone à l'aide d'un microorganisme (en particulier bactéries et levures) contenant une séquence codant 4CL et BAS, au moins une étant de source hétérologue. Il peut en outre comprendre une séquence codant BAR, C4H, PAL et/ou CHS, la séquence codant BAR étant avantageusement endogène. Dans les exemples, ce document rapporte:
- le clonage du gène CHS du framboisier;
- le clonage du gène 4CL du tabac;
- le clonage du gène BAS de la rhubarbe;
- la transformation d'E. coli avec le gène BAR du framboisier;
- la production de benzalacétone et de frambinone (0.2 μg dans 50 ml) à partir d'acide coumarique chez E. coli transformé avec BAS et 4CL;
- la production de frambinone à partir de benzalacétone chez E. coli ayant une activité BAR endogène.
Sur la base de l'hypothèse que CHS possède une activité BAS, GB 2 416 770 décrit la possibilité de produire du benzalacétone et de la frambinone à l'aide d'un microorganisme comprenant une séquence codant 4CL (par exemple de tabac) et CHS (par exemple du framboisier ou de Pétunia), au moins une étant de source hétérologue. Il peut en outre comprendre une séquence codant BAR (par exemple du framboisier), C4H et PAL. Dans les exemples, ce document rapporte:
- la production de benzalacétone et de naringénine à partir d'acide coumarique chez E. coli transformé avec CHS et 4CL;
- la construction d'une protéine mutée CHS (CHS*) présumée avoir une activité BAS supérieure;
- la production de benzalacétone et de frambinone (14.2/0.3 μg dans 50 ml) à partir d'acide coumarique chez E. coli ayant une activité BAR endogène et transformée avec CHS/CHS* et 4CL;
- la production de benzalacétone à partir d'acide coumarique chez S. cerevisiae (ayant une activité BAR endogène) transformée avec CHS et 4CL. Aucune valeur n'est donnée en rapport avec la frambinone. De plus, la protéine mutante CHS* semble inefficace. De manière similaire, Beekwilder et al. (2007, Biotechnol. J. 2, 1270-79) rapporte uniquement la production avec succès de frambinone à partir d'acide coumarique chez E. coli transformée avec CHS et 4CL mais avec un rendement de 0.3 mg/L. Aucune donnée convaincante n'est rapportée pour la production chez la levure.
Récemment, Lee et al. (2016, Microb. Cell Factories 15. doi:10.1186/sl2934-016-0446- 2) ont démontré la synthèse de frambinone à partir d'acide coumarique en exprimant un gène 4CL et BAS chez S. cerevisiae (jusqu'à 8 mg/L). De plus, l'expression de PAL/TAL et de C4H a permis la production de novo de frambinone (jusqu'à 4 mg/L).
Par ailleurs, Rodriguez et al. (2015, Metabolic Engineering 31, 181-188) ont décrit une levure génétiquement modifiée pour la production d'acide coumarique, le précurseur de flavonoïdes comme le resvératrol et la naringénine. Ainsi, il est rapporté que l'inactivation des gènes PDC5 et ARO10 codant une pyruvate décarboxylase et une phénylpyruvate décarboxylase, respectivement, entraine une surproduction d'acide coumarique.
Il existe toutefois un besoin évident de développer de nouvelles solutions techniques permettant une production efficace de frambinone.
DESCRIPTION DE L'INVENTION
Définitions
Les définitions ci-dessous correspondent au sens généralement utilisé dans le contexte de l'invention et sont à prendre en compte, à moins qu'une autre définition ne soit explicitement indiquée. Au sens de l'invention, les articles « un » et « une » sont utilisés pour se référer à une ou à plusieurs (par exemple à au moins une) unités de l'objet grammatical de l'article. A titre d'exemple, « un élément » désigne au moins un élément, c'est-à-dire un élément ou plus.
Les termes « environ » ou « approximativement », utilisés en référence à une valeur mesurable telle qu'une quantité, une durée, et autres valeurs analogues, doivent être compris comme englobant des incertitudes de mesure de ± 20% ou de ± 10%, préférentiellement de ± 5%, encore plus préférablement de ± 1%, et de manière particulièrement préférée de ± 0,1 % de la valeur spécifiée. Intervalles: tout au long de la présente description, les différentes caractéristiques de l'invention peuvent être présentées sous forme d'intervalle de valeurs. Il doit être compris que la description de valeurs sous forme d'intervalle a uniquement pour finalité de rendre la lecture plus simple et ne doit pas être interprétée comme une limitation rigide de la portée de l'invention. En conséquence, la description d'un intervalle de valeurs devrait être considérée comme divulguant spécifiquement tous les intervalles intermédiaires possibles ainsi que chacune des valeurs au sein de cet intervalle. Par exemple, la description d'un intervalle allant de 1 à 6 devrait être considérée comme décrivant spécifiquement chacun des intervalles qu'il comprend, tels que les intervalles allant de 1 à 3, de 1 à 4, de 1 à 5, de 2 à 4, de 2 à 6, de 3 à 6, etc., ainsi que chacune des valeurs dans cet intervalle, par exemple, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 et 6. Cette définition vaut indépendamment de la portée de l'intervalle. Le terme « isolé » doit être compris dans le contexte de l'invention comme synonyme de retiré ou extrait de son environnement ou état naturel. Par exemple, un acide nucléique ou un peptide isolé est un acide nucléique ou un peptide extrait de l'environnement naturel dans lequel on le trouve habituellement, qu'il s'agisse d'une plante ou d'un animal vivant par exemple. Ainsi, un acide nucléique ou un peptide naturellement présent dans un animal vivant n'est pas un acide nucléique ou un peptide isolé au sens de l'invention, tandis que le même acide nucléique ou peptide, partiellement ou complètement séparé des autres éléments présents dans son contexte naturel, est quant à lui « isolé » au sens de l'invention. Un acide nucléique ou un peptide isolé peut exister sous une forme substantiellement purifiée, ou peut exister dans un environnement non natif tel que, par exemple, une cellule hôte.
Dans le contexte de l'invention, les abréviations suivantes sont utilisées pour les bases d'acide nucléique les plus courantes. « A» » se réfère à l'adénosine, « C » se réfère à la cytosine, « G » désigne la guanosine, « T » désigne la thymidine, et « U » se réfère à l'uridine.
Sauf indication contraire, au sens de l'invention, une « séquence de nucléotides codant pour une séquence d'acides aminés » désigne toutes les séquences nucléotidiques qui codent pour la séquence d'acides aminés, y compris les séquences de nucléotides dégénérées permettant d'obtenir ladite séquence d'acide aminés. La séquence nucléotidique qui code pour une protéine ou un ARN ou un ADNc peut éventuellement comprendre des introns. Les termes « codant » ou « codant pour », « code » ou « code pour » se réfèrent à la propriété inhérente aux séquences spécifiques de nucléotides dans un polynucléotide, tel qu'un gène, un ADNc ou un AR m, à servir de matrice pour la synthèse d'autres polymères et macro molécules dans des processus biologiques, ayant soit une séquence définie de nucléotides (par exemple ARNr, ARNt et de l'ARNm), ou une séquence définie d'acides aminés, et les propriétés biologiques qui en découlent. Ainsi, un gène code pour une protéine si la transcription et la traduction de l'ARNm correspondant à ce gène produisent la protéine dans une cellule ou un autre système biologique. Tant le brin codant, dont la séquence nucléotidique est identique à la séquence d'ARNm et qui est généralement décrite dans les listages de séquences et bases de données, que le brin non codant, utilisé comme matrice pour la transcription d'un gène ou de l'ADNc, peuvent être désignés comme codant pour la protéine ou un autre produit de ce gène ou ADNc.
Le terme « polynucléotide » tel qu'utilisé dans le contexte de l'invention est défini comme une chaîne de nucléotides. En outre, les acides nucléiques sont des polymères de nucléotides. Ainsi, les termes acides nucléiques et polynucléotides tels qu'utilisés dans le cadre de l'invention sont interchangeables. Il est bien connu dans le domaine de la biologie moléculaire et du génie génétique que les acides nucléiques sont des polynucléotides, qui peuvent être hydrolysés en monomères. Les nucléotides sous forme monomère peuvent être hydrolysés en nucléosides. Tel qu'utilisé dans le contexte de l'invention, le terme polynucléotide désigne, à titre non limitatif, tout type de molécules d'acides nucléiques, c'est-à-dire les molécules d'acides nucléiques pouvant être obtenues par tout moyen disponible dans la technique, y compris par des moyens recombinants, à savoir le clonage de séquences d'acides nucléiques à partir d'une bibliothèque recombinante ou le génome d'une cellule, en utilisant des technologies de clonage ordinaire telle la PCR, ou par synthèse.
Au sens de l'invention, les termes « peptide », « polypeptide » et « protéine » sont utilisés de manière interchangeable et font référence à un composé constitué de résidus d'acides aminés liés de manière covalente par des liaisons peptidiques. Une protéine contient par définition au moins deux acides aminés, sans limitation quant au nombre maximum d'acides aminés. Les polypeptides comprennent indifféremment plusieurs peptides et/ou protéines, lesquels comprennent eux-mêmes deux acides aminés ou plus reliés les uns aux autres par des liaisons peptidiques. Tel qu'il est utilisé ici, le terme se réfère à la fois à des chaînes courtes, qui sont également couramment désignés dans la technique comme des peptides, des oligopeptides et oligomères par exemple, et à des chaînes plus longues, qui sont généralement désignés dans la technique comme des protéines, dont il existe de nombreux types. Les « polypeptides » comprennent, par exemple, des fragments bio logiquement actifs, des polypeptides substantiellement homologues, des oligopeptides, des homodimères, des hétérodimères, des variants de polypeptides, des polypeptides modifiés, des dérivés, des analogues, des protéines de fusion, entre autres. Les polypeptides comprennent des peptides naturels, des peptides recombinants, des peptides synthétiques, ou une combinaison de ceux-ci.
Les termes « homologue » et « identique » se réfèrent à la similarité de séquence ou l'identité de séquence entre deux polypeptides ou entre deux molécules d'acide nucléique. Quand une position dans chacune des deux séquences comparées est occupée par la même base ou sous-unité monomère d'acide aminé (par exemple, lorsqu'une position dans chacune des deux molécules d'ADN est occupée par une adénine), alors les molécules sont homologues ou identiques pour cette position. Le pourcentage d'identité entre deux séquences est fonction du nombre de positions correspondant partagées par les deux séquences, et correspond à ce nombre divisé par le nombre de positions comparées et multiplié par 100. Par exemple, si 6 sur 10 des positions dans deux séquences appariées sont identiques, alors les deux séquences sont identiques à 60%. En règle générale, la comparaison est effectuée en alignant les deux séquences de façon à donner une homologie/identité maximale. Un « vecteur » au sens de l'invention est une construction moléculaire qui comprend un acide nucléique isolé et qui peut être utilisée pour délivrer l'acide nucléique isolé à l'intérieur d'une cellule. De nombreux vecteurs sont connus dans l'art y compris, mais sans s'y limiter, les polynucléotides linéaires, des polynucléotides associés à des composés ioniques ou amphiphiles, des plasmides et des virus. Ainsi, le terme « vecteur » désigne par exemple un plasmide à réplication autonome ou un virus. Le terme doit également être interprété comme comprenant des composés non plasmidiques ou non viraux qui facilitent le transfert d'acides nucléiques dans des cellules, tels que, par exemple, les composés de polylysine, des liposomes, et analogues. Les termes « vecteur d'expression » désignent un vecteur comprenant un polynucléotide recombinant, lequel comprend des séquences de contrôle d'expression liées de manière opérationnelle à une séquence nucléotidique à exprimer. Un vecteur d'expression comprend notamment des éléments d'expression agissant en cis; d'autres éléments pour l'expression pouvant être fournis par la cellule hôte ou par un système d'expression in vitro. Les vecteurs d'expression au sens de l'invention incluent tous ceux connus dans l'art, tels que des cosmides, des plasmides (par exemple nus ou contenus dans des liposomes) et des virus (par exemple les lentivirus, les rétrovirus, les adénovirus et les virus adéno-associés) qui incorporent le polynucléotide recombinant. Le terme « promoteur » tel qu'utilisé ici est défini comme une séquence d'ADN reconnue par la machinerie de synthèse de la cellule, ou la machinerie de synthèse introduite, nécessaire pour initier la transcription spécifique d'une séquence de polynucléotides.
Au sens de l'invention, les termes « séquence promotrice/régulatrice » désignent une séquence d'acide nucléique, nécessaire pour l'expression du polynucléotide lié de manière opérationnelle à la séquence promotrice/régulatrice. Dans certains cas, cette séquence peut être la séquence de base du promoteur, tandis que dans d'autres cas cette séquence peut également comprendre une séquence activatrice et d'autres éléments régulateurs, utiles pour l'expression du polynucléotide. La séquence promotrice/régulatrice peut être, par exemple, une séquence permettant l'expression du polynucléotide qui soit spécifique d'un tissu, c'est-à-dire se produisant préférentiellement dans ce tissu.
Au sens de l'invention, un promoteur « constitutif » est une séquence nucléotidique qui, lorsqu'elle est liée de manière opérationnelle à un polynucléotide, conduit à une expression du polynucléotide dans la plupart ou toutes les conditions physiologiques de la cellule.
Au sens de l'invention, un promoteur « inductible » est une séquence de nucléotides qui, lorsqu'elle est liée de manière opérationnelle à un polynucléotide, conduit à une expression du polynucléotide uniquement quand un inducteur du promoteur est présent dans la cellule.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un microorganisme fongique modifié génétiquement pour la production de frambinone, ledit microorganisme présentant les caractéristiques suivantes :
la capacité à produire de la frambinone à partir de tyrosine ; et
une capacité faible ou une incapacité à dégrader la tyrosine en tyrosol, en p- hydroxyphényl acétaldéhyde et/ou en p-hydroxyphényl acétate.
Dans le cadre de l'invention, l'expression « microorganisme modifié génétiquement » signifie que le microorganisme selon l'invention ne se trouve pas dans la nature et est modifié par introduction de nouveaux éléments génétiques et/ou par délétion ou modification des éléments génétiques endogènes du microorganisme. Un tel microorganisme peut être soumis à une pression de sélection, en combinant mutagénèse dirigée et mise en culture dans le milieu de sélection. Dans la suite de l'exposé et pour des raisons de simplification, le terme « élément génétique » est utilisé de manière équivalente à « gène » ou « séquence ». Il s'agit donc d'une séquence d'acide nucléique, qui peut avoir tout type de fonctionnalité. Elle peut par exemple correspondre à une séquence codante (codant notamment une enzyme de la voie de synthèse ou de dégradation d'intérêt), ou bien une séquence régulatrice, en particulier un promoteur ou un terminateur. Notamment lorsqu'il s'agit d'une séquence codante, celle-ci peut être optimisée, c'est-à-dire modifiée pour intégrer les codons préférentiels de l'hôte, en l'occurrence le microorganisme fongique, dans lequel cette séquence est à exprimer. Selon un autre mode de réalisation privilégié, seule la séquence codante du gène d'intérêt ou ORF (pour « Open Reading Frame ») est isolée et mise en œuvre.
Selon un premier aspect, les nouveaux éléments génétiques introduits dans le microorganisme visé par l'invention sont des éléments génétiques dits exogènes ou hétéro logues, qui peuvent aussi bien être de nature synthétique ou issus d'autres organismes (ou sources). En particulier, un microorganisme peut exprimer des gènes exogènes ou hétérologues si ceux-ci sont introduits dans ledit microorganisme avec tous les éléments permettant leur expression chez le microorganisme hôte.
Selon un autre mode de réalisation, les gènes endogènes peuvent être modifiés pour moduler leur expression et/ou leur activité, par exemple en introduisant des mutations dans les séquences codantes pour modifier le produit du gène ou en modifiant les séquences régulatrices, par exemple en introduisant des séquences hétérologues en plus ou en remplacement des séquences régulatrices endogènes. La modulation des gènes endogènes peut résulter en une surexpression ou une augmentation de l'activité du produit du gène endogène ou au contraire une diminution de l'expression ou de l'activité de celui-ci. De surcroît, des copies surnuméraires ou additionnelles d'un gène endogène peuvent également être introduites dans le microorganisme, permettant ainsi d'augmenter le niveau d'expression et donc l'activité du produit codé par le gène.
Les techniques permettant l'introduction d'ADN dans un hôte (ou transformation) sont bien connues de l'homme du métier et comprennent notamment la perméabilisation des membranes par application d'un champ électrique (électroporation), par voie thermique (application d'un choc thermique) ou par voie chimique, par exemple à l'aide d'acétate de Lithium. Les éléments génétiques introduits peuvent être intégrés dans le génome de l'hôte, notamment par recombinaison homologue ou intégration chromosomique, avantageusement à l'aide de cassettes intégratives, ou exprimés de manière extrachromosomique à l'aide de plasmides ou de vecteurs. Différents types de plasmides, avantageusement autoréplicatifs, sont bien connus de l'homme du métier, qui diffèrent notamment par leur origine de réplication, leur promoteur (inductible ou constitutif), leur marqueur (par exemple une résistance à un antibiotique ou la capacité à croître dans un milieu sélectif) et le nombre de copies par cellule.
De manière avantageuse chez un microorganisme fongique, l'intégration chromosomique de gènes, notamment de cassettes d'expression portant des gènes hétérologues ou des copies surnuméraires de gènes endogènes, se fait par la technique dite d'intégration modulaire de cassette (« modular cassette intégration technique »). Selon un mode de réalisation particulier, l'intégration du ou des gènes se fait au niveau du locus HO. Dans le cas d'intégration de plusieurs cassettes, celles-ci sont choisies pour avoir des extrémités présentant des séquences homologues, appelées régions de recombinaison (RR), permettant la recombinaison homologue et l'intégration dans l'ordre souhaité et à la position souhaitée des différentes cassettes. De manière avantageuse, l'une des cassettes appelée « cassette marqueur » code un marqueur, par exemple une résistance à un antibiotique ou la capacité à croître dans un milieu sélectif, permettant de sélectionner ou d'identifier les microorganismes dans lesquels l'intégration chromosomique a effectivement eu lieu. De manière avantageuse, une cassette d'expression comprend la partie codante ou ORF d'un gène d'intérêt, notamment des enzymes impliquées dans la voie de biosynthèse de la frambinone à partir de tyrosine, placée sous le contrôle de séquences régulatrices, avantageusement au moins un promoteur et un terminateur, qui peuvent être les séquences régulatrices natives de ce gène ou des séquences hétérologues choisies pour leur fonctionnalité et/ou efficacité chez le microorganisme hôte. Concernant l'inactivation de gènes endogènes, celle-ci peut être réalisée en introduisant, par exemple par recombinaison homologue au niveau du gène cible, une cassette, soit au niveau des régions régulatrices inhibant ainsi l'expression du gène, soit au niveau de la séquence codante entraînant une inactivation du produit du gène. Selon un mode de réalisation particulier, la cassette est une cassette marqueur, comprenant avantageusement un gène marqueur dominant sous le contrôle d'un promoteur et d'un terminateur. De manière encore plus avantageuse, ladite cassette comprend à ses extrémités 5' et 3' des régions homologues aux régions 5' et 3' du gène visé, par exemple correspondant en 5 ' au promoteur du gène visé et correspondant en 3 ' au terminateur du gène visé. En outre, la cassette peut contenir des sites loxP permettant l'excision de cette cassette du génome grâce à l'action de la recombinase cre.
Dans le cadre de l'invention, des marqueurs adaptés sont des gènes conférant des résistances à des antibiotiques, qui sont alors introduits dans le milieu de culture du microorganisme modifié génétiquement pour assurer la sélection et le maintien de la modification génétique. De nombreux marqueurs sont à la disposition de l'homme du métier, comme par exemple :
le gène kanMX4 conférant une résistance à la généticine (ou G418) ;
le gène hphNTl conférant une résistance à l'hygromycine B ;
le gène bsd conférant une résistance à la blasticidine ;
le gène ble conférant une résistance à la phléomycine.
La bonne introduction et la fonctionnalité des modifications génétiques souhaitées peuvent être vérifiées par toute technique connue de l'homme du métier, notamment : sélection grâce au(x) marqueur(s) présent(s) dans la cassette d'expression ou dans le vecteur ;
ciblage de l'élément génétique introduit, par exemple par séquençage, par PCR (« Polymerase Chain Reaction ») ou par hybridation (« Southern blot » ou « Northern blot ») ;
ciblage du produit du gène visé, par exemple par détection immunologique (« Western blot ») ou par mesure de l'activité, par exemple enzymatique, associée.
Comme déjà dit, des éléments importants pour contrôler l'expression des gènes sont les promoteurs, placés en amont de la séquence codante dont l'expression est gouvernée par le promoteur. Ainsi, les gènes peuvent être exprimés à l'aide de promoteurs de force variable, inductibles ou constitutifs. Selon un mode de réalisation particulier, les promoteurs utilisés dans le cadre de l'invention sont des promoteurs constitutifs. Ces promoteurs peuvent être homologues ou hétérologues. Dans le contexte de l'invention, des promoteurs couramment utilisés par l'homme du métier sont par exemple :
le promoteur du gène TDH3 de S. cerevisiae, par exemple celui de séquence SEQ
ID NO : 1 ;
le promoteur du gène PFK2 de S. cerevisiae, par exemple celui de séquence SEQ ID NO : 4 ;
le promoteur du gène PGI1 de S. cerevisiae, par exemple celui de séquence SEQ ID NO : 7 ; le promoteur du gène PMA1 de S. cerevisiae, par exemple celui de séquence SEQ ID NO : 10 ;
le promoteur du gène PYK1 de S. cerevisiae, par exemple celui de séquence SEQ ID NO : 13 ;
- le promoteur du gène TEF1 de Ashbya gossypii, par exemple celui de séquence
SEQ ID NO : 15 ou de S. cerevisiae.
D'autres éléments importants pour contrôler l'expression des gènes sont les séquences terminatrices, également appelés terminateurs, placés en aval de la séquence codante à exprimer. Là encore, il peut s'agir de terminateurs homologues, issus du microorganisme en question, ou hétérologues, à savoir des séquences artificielles ou des terminateurs issus d'une autre source que le microorganisme hôte. De nombreuses séquences terminatrices sont à la disposition et connues de l'homme du métier, comme par exemple :
- le terminateur du gène CYC1 de Saccharomyces cerevisiae, par exemple celui de séquence SEQ ID NO : 3 ;
le terminateur du gène PFK2 de S. cerevisiae, par exemple celui de séquence SEQ ID NO : 6 ;
le terminateur du gène PGll de S. cerevisiae, par exemple celui de séquence SEQ ID NO : 9 ;
le terminateur du gène ZWF1 de S. cerevisiae, par exemple celui de séquence SEQ ID NO : 12 ;
le terminateur du gène PYK1 de S. cerevisiae, par exemple celui de séquence SEQ ID NO : 14 ;
- le terminateur du gène TEF1 de Ashbya gossypii, par exemple celui de séquence
SEQ ID NO : 17.
Dans le cadre de l'invention, le terme « microorganisme fongique » désigne avantageusement une levure ou un champignon.
Dans le cadre de l'invention, le terme « microorganisme fongique » s'entend comme une « souche de microorganisme fongique ». En effet et de manière avantageuse, le microorganisme fongique modifié génétiquement, objet de la présente invention, est obtenu à partir d'une souche isolée et au moins partiellement caractérisée. A titre d'illustration et en rapport avec les levures, on entend par « levure » un produit commercial obtenu grâce à la mise en œuvre d'un procédé de production d'une souche de levure. Ainsi, des levures présentant des caractéristiques différentes peuvent être obtenues à partir d'une même souche, ces différences étant liées au procédé de production mis en œuvre.
Plus précisément, l'invention vise une souche de levure, en d'autres termes une souche appartenant aux phylums des ascomycètes ou des basidiomycètes . Avantageusement, la souche appartient au genre des Saccharomycetales, encore plus avantageusement aux familles des Debaryomycetaceae, des Dipodascaceae ou des Saccharomycetaceae. Selon un mode de réalisation privilégié, la souche appartient aux genres Yarrowia, Debaryomyces, Arxula, Scheffersomyces, Geotrichum, Pichia ou Saccharomyces. Il peut par exemple s'agir des espèces Yarrowia lipolytica, Debaryomyces hansenii ou Saccharomyces cerevisiae.
Selon un mode de réalisation particulier, la souche mise en œuvre pour la construction d'une souche selon l'invention ou pour la mise en œuvre d'un procédé selon l'invention est une souche dite industrielle, par opposition à une souche dite de laboratoire. Les souches de levure dites industrielles sont celles aptes à être produites en utilisant des substrats industriels comme source de carbone. A titre d'exemple, ladite source de carbone peut être de la mélasse de canne à sucre ou de betterave.
Selon un mode de réalisation avantageux, le microorganisme est choisi en rapport avec au moins l'une des caractéristiques suivantes :
une capacité au moins partielle à produire de la frambinone à partir de tyrosine ; et/ou
une faible capacité ou une incapacité à dégrader la tyrosine en tyrosol, en p- hydroxyphényl acétaldéhyde et/ou en p-hydroxyphényl acétate.
Concernant la première caractéristique, le microorganisme qui va être modifié génétiquement peut présenter au moins une activité enzymatique endogène impliquée dans la conversion de la tyrosine en frambinone. Selon un mode de réalisation particulier, il est capable de convertir le 4-hydroxy benzalacétone en frambinone et présente donc naturellement une activité BAR, comme détaillée ci-dessous. Le microorganisme peut être choisi pour d'autres caractéristiques d'intérêt, notamment au vu de son application en biotechnologie (connaissance du génome, outils disponibles pour la manipulation génétique, ...), de son métabolisme (notamment respiratoire et lipidique favorisant la production du malonyl-CoA ou de l'acétyl-CoA, des co-substrats de la voie de synthèse de la frambinone), ou des conditions de son exploitation industrielle (croissance aérobie, tolérance au stress et aux composés toxiques, ...).
Selon un mode de réalisation particulier, un microorganisme d'intérêt est choisi dans la liste suivante : Beauveria bassiana, Candida boidinii, Galactomyces candidum (Geotrichum candidum), Kloeckera saturnus, Kodamaea ohmeri (Pichia ohmeri), Komagataella pastoris (Pichia pastoris), Mucor nederlandicus (Mucor subtilissimus), Pichia membranifaciens, Schwanniomyces etchellsii (Pichia etchellsii), Torulaspora delbrueckii (Saccharomyces fermentati), Wickerhamomyces anomalus (Hansenula anomala), Yarrowia lipolytica (Candida lipolytica), Saccharomyces cerevisiae, Debaryomyces hansenii. Avantageusement, il s'agit de Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica ou Debaryomyces hansenii.
Des microorganismes fongiques d'intérêt particulier sont par exemple Yarrowia lipolytica ou Debaryomyces hansenii.
Un microorganisme selon l'invention est destiné à produire de la frambinone à partir de tyrosine. De manière avantageuse, un tel microorganisme présente une capacité améliorée à produire de la frambinone à partir de tyrosine, notamment par rapport aux souches déjà décrites ou par rapport à ce même microorganisme n'ayant pas été modifié génétiquement.
Il est connu de produire de la frambinone à partir d'autres substrats mais d'un point de vue économique notamment, la tyrosine présente un intérêt évident. De surcroît, il a été montré que l'ajout de tyrosine dans le milieu de culture, avantageusement un milieu de fermentation, était possible en termes de solubilité et ne présentait pas de toxicité notoire. De manière adaptée et comme il sera vu plus en détail en rapport avec le procédé selon l'invention, la production de frambinone se fait à partir de tyrosine exogène au microorganisme selon l'invention, avantageusement par ajout dans son milieu de culture. Typiquement, la concentration en tyrosine dans le milieu de culture est supérieure ou égale à 50 mg/L, voire supérieure ou égale à 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 voire même 450 mg/L. En outre, elle est avantageusement inférieure ou égale à 1 g/L, voire inférieure ou égale à 950, 900, 850, 800, 750, 700, 650, 600, 550, 500 voire même 450 mg/L. Selon un autre aspect, l'invention concerne également l'utilisation d'un microorganisme tel que défini dans le cadre de la présente demande pour la production de frambinone à partir de tyrosine. Dans le cadre de l'invention, il est attendu des niveaux de production de la frambinone par un microorganisme encore jamais atteints, avantageusement une concentration dans le milieu de culture du microorganisme supérieure à 4 mg/L, encore plus avantageusement supérieure ou égale à 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 voire même 20, 25 ou 30 mg/L. A ces concentrations et dans les conditions du procédé selon l'invention, la frambinone reste soluble et ne présente pas de toxicité vis-à- vis des microorganismes selon l'invention.
Selon une première caractéristique, un microorganisme selon l'invention ou mis en œuvre dans un procédé selon l'invention est modifié génétiquement pour présenter une capacité à produire ou synthétiser de la frambinone à partir de tyrosine, voire pour présenter une capacité améliorée à produire ou synthétiser de la frambinone à partir de tyrosine.
Selon l'invention, le microorganisme peut présenter naturellement une capacité à synthétiser de la frambinone à partir de tyrosine et les modifications génétiques apportées ont pour but d'améliorer cette capacité. Alternativement, le microorganisme ne présente pas naturellement de capacité à synthétiser de la frambinone à partir de tyrosine et les modifications génétiques apportées ont pour but de lui conférer cette capacité.
Pour rappel et comme illustré à la Figure 1, une voie de synthèse de la frambinone à partir de tyrosine implique 4 activités enzymatiques, à savoir :
une activité tyrosine ammonia lyase (EC 4.3.1.23), notée TAL, capable de désaminer la tyrosine pour former de l'acide coumarique ;
une activité 4-coumarate:CoA ligase (EC 6.2.1.12), notée 4CL, capable de catalyser le greffage d'une molécule de Coenzyme A (CoA) sur l'acide coumarique pour former le coumaroyl-CoA ;
une activité benzalacétone synthase (EC 2.3.1.212), notée BAS, capable de convertir le coumaroyl-CoA en 4-hydroxy benzalacétone en présence de malonyl- CoA en tant que co-substrat ;
- une activité benzalacétone réductase (EC 1.3.1.x), notée BAR, pour réduire le 4- hydroxy benzalacétone en frambinone. Selon un mode de réalisation avantageux, le microorganisme selon l'invention est modifié génétiquement pour assurer ou améliorer la production de frambinone à partir de tyrosol. Avantageusement, les modifications génétiques apportées permettent d'augmenter au moins l'une des quatre activités enzymatiques susmentionnées. Il peut par exemple s'agir :
de mutations dans la partie codante du gène permettant d'obtenir une enzyme présentant l'activité recherchée ou ayant une activité améliorée, notamment en termes de spécificité et d'affinité du substrat ;
de la modification des séquences régulatrices permettant d'augmenter le niveau d'expression d'un gène endogène codant une enzyme présentant l'activité recherchée ;
de l'apport de copie(s) surnuméraire(s) d'un gène endogène codant une enzyme présentant l'activité recherchée, ayant éventuellement été muté pour améliorer l'activité ;
de l'apport d'une ou plusieurs copies d'au moins un gène hétérologue (artificiel ou issu d'un autre organisme source) codant une enzyme présentant l'activité recherchée, placé sous le contrôle de séquences régulatrices adaptées pour produire ladite enzyme.
Concernant TAL, les enzymes de la famille des lyases ayant une activité prédominante pour la tyrosine (tyrosine ammonia lyase, EC 4.3.1.23) sont rares. Souvent, elle présente une affinité pour le substrat phénylalanine au moins égale voire supérieure (phénylalanine/tyrosine ammonia lyase, PAL/TAL, EC 4.3.1.25).
Dans certains cas de figure, il peut être souhaitable de choisir une enzyme TAL n'ayant pas ou présentant très peu d'activité PAL de manière à éviter l'accumulation de l'intermédiaire acide cinnamique qui peut présenter une certaine toxicité. Dans le cas où l'enzyme TAL choisi présente une activité PAL notoire, il peut être avantageux de s'assurer que le microorganisme possède en outre une activité C4H et/ou CPR, et éventuellement de le modifier pour introduire des séquences codant ces activités enzymatiques utiles à la conversion de l'acide cinnamique en acide coumarique. Alternativement, il peut être envisagé de muter la séquence codant TAL pour diminuer l'activité PAL éventuellement associée. En outre, une accumulation d'acide cinnamique peut exercer un rétrocontrôle négatif sur TAL de sorte qu'une expression balancée de 4CL peut être nécessaire. A noter que des tests enzymatiques pour évaluer les activités TAL et PAL sont bien connus de l'homme du métier et sont par exemple décrits dans les documents Berner et al. (J. Bacteriol, 2006, 188, 2666-73), Kyndt et al. (FEBS Lett., 2002 512, 240-44) et Rosier et al. (Plant Physiol., 1997, 113, 175-79).
Des gènes d'intérêt pouvant être mis en œuvre dans le cadre de l'invention sont listés dans le tableau 1 ci-dessous :
Nom Organisme Nom du gène / Références
Uniprot
RgTAL Rhodotorula glutinis 1 PAL Vannelli et al., 2007, Metab.
Eng. 9, 142-51.
Rhodosporidium PI 1544 US 6,521,748
toruloides SEQ ID NO: 18 Santos et al., 2011 , Metab. Eng.
13, 392-400
Wu et al., 2013, J. Biotechnol. 167, 404-11
Wu et al., 2014, PLoS ONE 9, el01492
Jiang et al., 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71, 2962- 69
RsTAL Rhodobacter sphaeroides hutH Watts et al, 2004,
Chembiochem Eur. J. Chem. Q3IWB0 Biol. 5, 500-507
Watts et al, 2006, Chem. Biol. 13, 1317-26
Louie et al, 2006, Chem. Biol. 13, 1327-1338
Schroeder et al, 2008,
Phytochem. 69, 1496-1506 Xue et al, 2007, J. Ind.
Microbiol. Biotechnol. 34, 599- 604
Wang and Yu, 2012, J.
Biotechnol. 157, 258-260 Wang et al, 2011, Metab. Eng. 13, 455-463
Zhang et al, 2006, J. Am.
Chem. Soc. 128, 13030-31
RcTAL Rhodobacter capsulatus Xue et al, 2007, J. Ind.
Microbiol. Biotechnol. 34, 599- 604
Kyndt et al, 2002, FEBS Lett. 512, 240-44
SeTAL Saccharothrix sam8 Berner et al, 2006, J. Bacteriol.
188, 2666-73. espanaensis Q2EYY5 Choi et al, 2011, J. Ind.
Microbiol. Biotechnol. 38, 1657-65
Kang et al., 2012, Microb Cell Fact 11, 153
CpTAL Chitinophaga pinensis Cpin_1853/FlxA Schôner et al., 2014, Microb.
C7PAX7 Biotechnol. 7, 232-41
TcTAL Trichosporon cutaneum Vannelli et al., 2007, Enzyme
Microb. Technol. 41, 413-22
Selon un mode de réalisation particulier, la protéine TAL codée par le gène introduit dans le microorganisme selon l'invention présente la séquence SEQ ID NO : 18, ou une séquence protéique présentant au moins 70%, voire 80, 85, 90, 95 ou même 99%> d'homologie ou d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 18 et possédant une activité TAL.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la séquence codant la protéine TAL, introduite dans le microorganisme selon l'invention, présente la séquence SEQ ID NO : 5, ou une séquence présentant au moins 60%>, voire 70, 80, 85, 90, 95 ou même 99%> d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5. Son expression peut être placée sous le contrôle des séquences régulatrices SEQ ID NO : 4 et/ou SEQ ID NO : 6.
Concernant 4CL, il s'agit a priori d'une enzyme non présente dans les microorganismes fongiques visés par la présente invention. Ainsi et de manière avantageuse, au moins une copie d'au moins un gène hétérologue est introduit.
A noter que des tests enzymatiques pour évaluer l'activité 4CL sont bien connus de l'homme du métier et sont par exemple décrits dans les documents Ehlting et al. (Plant J., 1999, 19, 9-20), Knobloch and Hahlbrock (Arch. Biochem. Biophys., 1977, 184, 237- 48) et Lee and Douglas (Plant Physiol, 1996, 112, 193-205).
La majorité des 4-coumarate:CoA ligases (4CL ; EC6.2.1.12) sont trouvées dans les plantes. Des gènes d'intérêt pouvant être mis en œuvre dans le cadre de l'invention sont listés dans le tableau 2 ci-dessous :
Nom Organisme Nom du gène / Références
Uniprot
At4CL- Arabidopsis thaliana 4CL1 Ehlting et al., 1999, Plant J. 19, 1 9-20
Q42524 (NCBI: Hamberger and Hahlbrock, AAA82888.1) 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. U. SEQ ID NO: 19 S. A. 101, 2209-14 Watts et al, 2004,
Chembiochem Eur. J. Chem.
Biol. 5, 500-507
Watts et al, 2006, BMC
Biotechnol. 6, 22
Koopman et al, 2012, Microb
Cell Fact ii, 155
Sydor et al, 2010, Appl.
Environ. Microbiol. 76, 3361-
63
Nt4CL- Nicotiana tabacum 4CL2 Beekwilder et al, 2007, 2 Biotechnol. J. 2, 1270-79
024146 (NCBI: Beekwilder et al, 2006, Appl. U50846) Environ. Microbiol. 72, 5670- 72
Pc4CL- Petroselinum crispum 4CL2 Léonard et al, 2008, Mol. 2 P14913 Pharm. 5, 257-65
(GenBank: Lim et al, 2011, Appl. Environ. CAA31697.1) Microbiol. 77, 3451-60
Wu et al, 2014, PLoS ONE 9, el01492
Xu et al, 2011, Metab. Eng. 13, 578-87.
Léonard et al, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71, 8241— 48.
Yan et al, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71, 5610-13
Lithospermum Q42880 Yazaki et al, 1997, Biosci. erythrorhizon Biotechnol. Biochem. 61, 1995- 2003
Populus trichocarpa x P.
deltoïdes
Glycine max
ScCCL Streptomyces coelicolor SC04383 Kaneko et al, 2003, J.
Q9K3W1 Bacteriol. 185, 20-27
Miyahisa et al, 2005, Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 498- 504
Cp4CL Chitinophaga pinensis Cpin 1877/FlxY Schôner et al, 2014, Microb.
C7PB01 Biotechnol. 7, 232-41
Selon un mode de réalisation particulier, la protéine 4CL codée par le gène introduit dans le microorganisme selon l'invention présente la séquence SEQ ID NO : 19, ou une séquence protéique présentant au moins 70%, voire 80, 85, 90, 95 ou même 99% d'homologie ou d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 19 et possédant une activité 4CL. Selon un autre mode de réalisation particulier, la séquence codant la protéine 4CL, introduite dans le microorganisme selon l'invention, présente la séquence SEQ ID NO : 8, ou une séquence présentant au moins 60%, voire 70, 80, 85, 90, 95 ou même 99% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 8. Son expression peut être placée sous le contrôle des séquences régulatrices SEQ ID NO : 7 et/ou SEQ ID NO : 9.
A noter que l'accumulation de coumaryl-CoA générée sous l'action de 4CL peut engendrer la formation indésirable d'acide phlorétique et inhiber l'activité TAL. Il est donc important que le microorganisme selon l'invention présente une activité BAS (catalysant l'étape suivante dans la voie de synthèse de la frambinone) adaptée.
Concernant BAS, il s'agit a priori d'une enzyme non présente dans les microorganismes fongiques visés par la présente invention. Ainsi et de manière avantageuse, au moins une copie d'au moins un gène hétérologue est introduite.
A noter que des tests enzymatiques pour évaluer l'activité BAS sont bien connus de l'homme du métier et sont par exemple décrits dans les documents Abe et al. (Eur. J. Biochem., 2001, 268, 3354-59 et Morita et al, 2010). Morita et al. Acad. Sci., 2010, 107, 669-673).
Les benzalacetone synthases (BAS; EC2.3.1.212) font partie de la famille des PKS (PolyKetone Synthase), qui inclut également les chalcone synthases (CHS; impliquées par exemple dans la synthèse de la naringénine) et des stilbène synthases (STS; impliquées par exemple dans la synthèse du resvératrol). Ces enzymes acceptent le coumaroyl-CoA et d'autres substrats, et catalysent une condensation avec le malonyl- CoA. Le malonyl-CoA est un intermédiaire dans la synthèse des acides gras et sa formation nécessite de ΑΤΡ. Alors que les CHS et STS ajoutent trois unités malonyl- CoA, BAS en ajoute seulement une. Cependant, les enzymes BAS décrites ont aussi une activité CHS. Des gènes d'intérêt pouvant être mis en œuvre dans le cadre de l'invention sont listés dans le tableau 3 ci-dessous :
Nom Organisme Nom du gène / Références
Uniprot
RpBAS Rheum palmatum BAS Abe et al., 2001, Eur. J.
Q94FV7 Biochem. 268, 3354-59.
SEQ ID NO: 20 Shimokawa et al., 2012, Front.
Pla nt Sci. 3.
Abe et al., 2003, J. Biol. Chem. 278, 25218-26. Abe et al., 2007, Bioorg. Med.
Chem. Lett. 17, 3161-66.
Jez et al., 2001, J. Ind.
Microbiol. Biotechnol. 27, 393- 398.
Morita et al., 2010, Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 669-673.
RiPKS Rubus idaeus PKS4 Kumar and Ellis, 2003, 4 B0LDU5 Phytochemistry 62, 513-26.
Zheng and Hrazdina, 2008, Arch. Biochem. Biophys. 470, 139-145.
Zheng et al., 2001, Plant Mol. Biol. 46, 1-15
Beekwilder et al., 2007, Biotechnol. J. 2, 1270-79.
PKS1 Wachendorfia thyrsiflora
Brand et al., 2006, Planta 224, 413-28.
PKS1 Polygonum cuspidatum
Ma et al., 2009, Planta 229, 1077-86
PKS2 Polygonum cuspidatum Ma et al, 2009, Planta 229,
457-69.
Selon un mode de réalisation particulier, la protéine BAS codée par le gène introduit dans le microorganisme selon l'invention présente la séquence SEQ ID NO : 20, ou une séquence protéique présentant au moins 70%, voire 80, 85, 90, 95 ou même 99% d'homologie ou d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 20 et possédant une activité BAS.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la séquence codant la protéine BAS, introduite dans le microorganisme selon l'invention, présente la séquence SEQ ID NO : 11, ou une séquence présentant au moins 60%>, voire 70, 80, 85, 90, 95 ou même 99%> d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 11. Son expression peut être placée sous le contrôle des séquences régulatrices, en particulier un promoteur de séquence SEQ ID NO : 10 ou SEQ ID NO : 13 et/ou un terminateur de séquence SEQ ID NO : 12 ou SEQ ID NO : 14.
Selon un autre mode de réalisation particulier, au moins deux séquences codant BAS, par exemple deux copies d'une même séquence, sont introduites dans le microorganisme selon l'invention. A noter qu'elles peuvent être placées sous le contrôle de séquences régulatrices différentes. La dernière étape de la voie de synthèse de la frambinone est la réduction de la double liaison α,β en p-hydroxy benzalacétone, qui nécessite du NADPH, catalysée par une benzalacétone réductase (BAR ; EC 1.3.1.x). Seulement deux enzymes possédant cette activité ont été identifiées à ce jour. Toutefois, certains microorganismes ont été rapportés comme possédant une activité BAR endogène comme par exemple E. coli et S. cerevisiae (Beekwilder et al., 2007, Biotechnol. J. 2, 1270-79). La première enzyme est décrite dans le document GB 2 416 769 : une protéine de 309 acides aminés a été isolée à partir de fractions protéiques de framboisier présentant une activité BAR. Elle présente de l'homologie avec les isoflavone réductases (EC 1.3.1.45) et est capable de convertir le p- hydroxy benzalacétone en frambinone dans des essais in vitro réalisés avec de l'enzyme purifiée. En 2011, Koeduka et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 412, 104-108) ont identifié une cétone/zingérone synthase de R. idaeus qui possède une activité BAR (RiRZSl, Uniprot G1FCG0). La protéine purifiée convertit effectivement le p-hydroxy benzalacétone en frambinone dans un test enzymatique.
A noter que des tests enzymatiques pour évaluer l'activité BAR sont bien connus de l'homme du métier et sont par exemple décrits dans le document Koeduka et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun., 2011, 412, 104-108).
Selon un mode de réalisation particulier, la protéine BAR est codée par un gène introduit dans le microorganisme selon l'invention et elle présente la séquence SEQ ID NO : 21, ou une séquence protéique présentant au moins 70%, voire 80, 85, 90, 95 ou même 99% d'homologie ou d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 21 et possédant une activité BAR.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la séquence codant la protéine BAR, introduite dans le microorganisme selon l'invention, présente la séquence SEQ ID NO : 2, ou une séquence présentant au moins 60%>, voire 70, 80, 85, 90, 95 ou même 99% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 2. Son expression peut être placée sous le contrôle des séquences régulatrices, en particulier de séquences SEQ ID NO : 1 et/ou SEQ ID NO : 3.
Selon un mode de réalisation particulier, le microorganisme fongique selon l'invention est dépourvu naturellement d'au moins une activité enzymatique parmi 4CL et BAS, voire des 2. Avantageusement, le microorganisme fongique selon l'invention comprend au moins une séquence hétérologue codant l'enzyme 4-coumarate:CoA ligase (4CL) ou benzalacétone synthase (BAS), avantageusement les enzymes 4CL et BAS. Selon un mode de réalisation privilégié, ladite séquence code une enzyme 4CL présentant la séquence SEQ ID NO : 19, ou une séquence protéique présentant au moins 70%, voire 80, 85, 90, 95 ou même 99% d'homologie ou d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 19 et possédant une activité 4CL. De manière préférée, cette séquence comprend la séquence SEQ ID NO : 8, ou une séquence présentant au moins 60%>, voire 70, 80, 85, 90, 95 ou même 99% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 8. Elle peut également comprendre la séquence SEQ ID NO : 7, avantageusement située en amont de la séquence codant 4CL, et/ou la séquence SEQ ID NO : 9, avantageusement située en aval de la séquence codant 4CL. Selon un autre mode de réalisation privilégié, ladite séquence code une enzyme BAS présentant la séquence SEQ ID NO : 20, ou une séquence protéique présentant au moins 70%), voire 80, 85, 90, 95 ou même 99% d'homologie ou d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 20 et possédant une activité BAS. De manière préférée, cette séquence comprend la séquence SEQ ID NO : 11 , ou une séquence présentant au moins 60%>, voire 70, 80, 85, 90, 95 ou même 99% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 11. Elle peut également comprendre la séquence SEQ ID NO : 10 ou SEQ ID NO : 13, avantageusement située en amont de la séquence codant BAS, et/ou la séquence SEQ ID NO : 12 ou SEQ ID NO : 14, avantageusement située en aval de la séquence codant BAS. Selon un mode de réalisation particulier, le microorganisme fongique selon l'invention comprend au moins deux séquences hétérologues codant l'enzyme benzalacétone synthase (BAS), avantageusement provenant de la même source, encore plus avantageusement de même séquence codante mais éventuellement placées sous le contrôle de séquences régulatrices différentes.
Selon un autre mode de réalisation, les microorganismes fongiques visés par la présente invention ne présentent pas au moins l'une des activités suivantes : TAL, 4CL, BAS et/ou BAR. Selon un autre aspect, le microorganisme fongique selon l'invention comprend au moins une séquence hétérologue ou surnuméraire codant l'enzyme tyrosine ammonia lyase (TAL) ou benzalacétone réductase (BAR), avantageusement les enzymes TAL et BAR. Selon un mode de réalisation privilégié, ladite séquence code une enzyme TAL présentant la séquence SEQ ID NO : 18, ou une séquence protéique présentant au moins 70%, voire 80, 85, 90, 95 ou même 99% d'homologie ou d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 18 et possédant une activité TAL. De manière préférée, cette séquence comprend la séquence SEQ ID NO : 5, ou une séquence présentant au moins 60%>, voire 70, 80, 85, 90, 95 ou même 99% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5. Elle peut également comprendre la séquence SEQ ID NO : 4, avantageusement située en amont de la séquence codant TAL, et/ou la séquence SEQ ID NO : 6, avantageusement située en aval de la séquence codant TAL.
Selon un mode de réalisation privilégié, ladite séquence code une enzyme BAR présentant la séquence SEQ ID NO : 21, ou une séquence protéique présentant au moins 70%), voire 80, 85, 90, 95 ou même 99% d'homologie ou d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 21 et possédant une activité BAR. De manière préférée, cette séquence comprend la séquence SEQ ID NO : 2, ou une séquence présentant au moins 60%>, voire 70, 80, 85, 90, 95 ou même 99% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 2. Elle peut également comprendre la séquence SEQ ID NO : 1 , avantageusement située en amont de la séquence codant BAR, et/ou la séquence SEQ ID NO : 3, avantageusement située en aval de la séquence codant BAR.
Selon un mode de réalisation particulier, les microorganismes fongiques visés par la présente invention comprennent au moins une séquence hétérologue codant les enzymes 4-coumarate:CoA ligase (4CL) et benzalacétone synthase (BAS), ainsi qu'au moins une séquence hétérologue ou surnuméraire codant l'enzyme tyrosine ammonia lyase (TAL) et benzalacétone réductase (BAR).
Une souche particulière de Saccharomyces cerevisiae présentant ces caractéristiques, et donc une voie de conversion de la tyrosine en frambinone fonctionnelle et adaptée aux applications visées, est la souche industrielle R 4, déposée auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) en date du 1er Juin 2016, sous le numéro 1-5101. Celle-ci a été obtenue par intégration chromosomique, au niveau du locus HO de la souche déposée auprès de la CNCM en date du 4 Septembre 2008 sous le numéro 1-4071, de cassettes d'expression codant ces 4 enzymes, comme décrit ci-dessous (Exemples de réalisation). Une autre souche particulière de Saccharomyces cerevisiae, présentant ces mêmes caractéristiques, est la souche industrielle nommée R 5, déposée auprès de la CNCM en date du 26 avril 2017, sous le numéro 1-5199. Celle-ci a été obtenue à partir de la souche R 4, par excision du gène kanMX4 dans la cassette d'expression (voir les exemples de réalisation ci-dessous).
En rapport avec la voie de synthèse de la frambinone, les microorganismes fongiques selon l'invention peuvent subir d'autres modifications génétiques, telles que par exemple : tout moyen permettant d'instaurer ou d'augmenter la capacité du microorganisme à synthétiser de la frambinone à partir de phénylalanine, par exemple via l'introduction d'un gène codant une enzyme PAL. Comme déjà dit, les enzymes PAL sont proches des enzymes TAL décrites ci-dessus. Eventuellement, il peut être mis en œuvre une enzyme TAL présentant également une activité PAL. tout moyen permettant d'instaurer ou d'augmenter la capacité du microorganisme à convertir l'acide cinnamique en acide coumarique, par exemple via l'introduction d'un gène codant une enzyme C4H, éventuellement en combinaison avec un gène codant une enzyme CPR. tout moyen permettant d'augmenter la capacité du microorganisme à produire du malonyl-CoA, par exemple comme rapporté chez Y. lipolytica (Qiao et al., 2015, Metab. Eng. 29: 56-65) ou par la surproduction de l'Acétyl-CoA carboxylase
ACC1 chez S. cerevisiae (Shin et al., 2012, Enzyme Microb. Technol. 51, 211- 216).
Ainsi et selon un mode de réalisation particulier, le microorganisme mis en œuvre dans le cadre de l'invention comprend au moins une séquence hétérologue ou surnuméraire codant l'enzyme phénylalanine ammonia lyase (PAL) ou cinnamate 4-hydroxylase (C4H), avantageusement les enzymes PAL et C4H.
Selon une seconde caractéristique avantageuse, un microorganisme fongique visé par l'invention est affecté dans sa voie de dégradation de la tyrosine telle qu'illustrée à la Figure 2. Selon cette voie, appelé « voie de dégradation de la tyrosine en tyrosol » dans la suite de l'exposé, la tyrosine est convertie en p-hydroxyphényl acétaldéhyde, qui peut persister en l'état ou être converti soit en tyrosol soit en p-hydroxyphényl acétate. Ainsi et de manière avantageuse, un microorganisme fongique visé par l'invention présente une capacité faible ou une incapacité à dégrader ou à convertir la tyrosine en tyrosol, en p- hydroxyphényl acétaldéhyde et/ou en p-hydroxyphényl acétate. II a été mis en évidence, dans le cadre de la présente demande, que la voie de dégradation prédominante de la tyrosine dans les microorganismes fongiques d'intérêt était la voie de dégradation de la tyrosine en tyrosol, comme illustré à la Figure 2.
Cette capacité peut être évaluée comme décrit dans la partie « Exemples de réalisation » ci-dessous, en cultivant des microorganismes fongiques potentiellement d'intérêt pour la production de la frambinone, modifiés génétiquement ou pas, en présence de tyrosine et en suivant la production de tyrosol, par exemple par HPLC. Typiquement, un microorganisme peut s'avérer d'intérêt si dans les conditions décrites dans la partie expérimentale, à savoir dans des conditions de fermentation aérobie réalisée en milieu avantageusement minéral, par exemple composé de 1.7 g/L de YNB (Difco™), 5 g/L de sulfate d'ammonium, 2.7 g/L de phosphate de potassium et 20 g/L de dextrose, et contenant de la tyrosine, avantageusement à hauteur de 300 mg/L, la quantité de tyrosol produit est inférieure ou égale à 150 mg/L, avantageusement inférieure ou égale à 100 mg/L, voire à 50, 40, 30, 20 mg/L voire même 10 mg/L.
Alternativement et comme il ressort de la figure 2, des souches de microorganismes fongiques d'intérêt peuvent être sélectionnées sur la base de leur activité hydroxyphényl pyruvate décarboxylase (HPPDC), dont une méthode de mesure est détaillée dans les exemples de réalisation ci-dessous.
De manière avantageuse, l'activité HPPDC dans le microorganisme selon l'invention est inférieure ou égale à 2 x 10"6 kat par g de protéine, avantageusement inférieure ou égale à lxlO"6 kat par g de protéine, voire même à 5 x 10"7 kat par g de protéine. Dans le cadre de l'invention, il s'entend des protéines extraites du microorganisme.
Plus précisément, l'activité HPPDC mesurée dans un microorganisme selon l'invention est préférentiellement inférieure ou égale à 10"5 kat par g de protéine, avantageusement inférieure ou égale à 5 x 10"6, 4 x 10"6, 3 x 10"6, 2 x 10"6, 1 x 10"6 kat par g de protéine,
7 7 7 7 7
voire même inférieure ou égale à 9 x 10" , 8 x 10" , 7 x 10" , 6 x 10" , 5 x 10" kat par g de protéine. Selon un mode de réalisation particulier, elle est inférieure ou égale à 4 x 10"7 kat par g de protéine, avantageusement inférieure ou égale à 3 x 10"7 kat par g de protéine, encore plus avantageusement inférieure ou égale à 2 x 10"7, 1,5 x 10"7, lx 10"7, voire 0,5x 10"7 kat par g de protéine. Ainsi et selon l'invention, le microorganisme est sélectionné pour sa capacité faible voire nulle à dégrader la tyrosine, évaluée par exemple selon l'une des deux méthodes mentionnées ci-dessus. Comme déjà dit, cette sélection des microorganismes adaptés peut être réalisée avant ou après la modification génétique dudit microorganisme.
Selon un premier mode de réalisation, le microorganisme est sélectionné pour sa capacité naturelle à dégrader faiblement voire pas du tout la tyrosine en tyrosol, en p- hydroxyphényl acétaldéhyde et/ou en p-hydroxyphényl acétate.
Alternativement, un microorganisme d'intérêt, en particulier pour sa capacité à synthétiser de la frambinone, est soumis à des modifications génétiques de manière à diminuer voire à supprimer sa capacité à dégrader la tyrosine en tyrosol, en p- hydroxyphényl acétaldéhyde et/ou en p-hydroxyphényl acétate
Comme illustré à la figure 2, ceci peut être réalisé en inhibant ou en inactivant l'une des étapes assurant la transformation de la tyrosine en tyrosol, en p-hydroxyphényl acétaldéhyde et/ou en p-hydroxyphényl acétate, notamment l'étape de désamination, de décarboxylation, voire de réduction.
Comme déjà dit, différents moyens sont à la disposition de l'homme du métier pour réaliser cette inhibition ou inactivation par modification génétique du microorganisme, notamment l'insertion chromosomique d'éléments génétiques exogènes soit au niveau des régions régulatrices de manière à interférer avec l'expression du gène cible, soit au niveau de la séquence codante de manière à empêcher la production du produit du gène ou à entraîner la production d'une protéine tronquée et/ou inactive. Il est également possible de muter le gène cible au niveau des séquences critiques pour son expression ou son activité. Selon un mode de réalisation particulier, le gène cible est inactivé à l'aide d'une cassette capable d'exprimer un marqueur (Goldstein and McCusker, 1999, Yeast Chichester Engl. 15, 1541-53; Guldener et al, 2002, Nucleic Acids Res. 30, e23; Guldener et al, 1996, Nucleic Acids Res. 24, 2519-24.; Janke et al, 2004, Yeast 21, 947-62.; Sauer, 1987, Mol. Cell. Biol. 7, 2087-96), aux extrémités de laquelle les régions 5' et 3' du gène cible sont insérées de manière à permettre la recombinaison homologue et à remplacer la partie codante du gène par la cassette d'expression du marqueur. Selon un mode de réalisation avantageux, le microorganisme fongique selon l'invention est inactivé au niveau de l'activité impliquée dans la décarboxylation de l'hydroxyphényl pyruvate. En particulier et concernant S. cerevisiae, au moins 3 gènes ont été décrits comme étant impliqués dans cette activité, en l'occurrence ARO10, PDC5 et PDC6 (Hazelwood et al., 2008; Appl. Environ. Microbiol. 74, 2259-66 ; Kneen et al., 2011, FEBS J. 278, 1842-53; Vuralhan et al, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71, 3276-84. ; Vuralhan et al., 2003, Appl. Environ. Microbiol. 69, 4534-41). Avantageusement, au moins l'un des gènes codant la phénylpyruvate décarboxylase ArolO, la pyruvate décarboxylase Pdc5 et la pyruvate décarboxylase Pdc6 est inactivé. Selon un mode de réalisation particulier, les gènes codant la phénylpyruvate décarboxylase ArolO, la pyruvate décarboxylase Pdc5 et la pyruvate décarboxylase Pdc6 sont inactivés.
Alternativement, la ou les désaminases impliquées dans la première étape de la voie de dégradation de la tyrosine sont inactivées. En relation avec S. cerevisiae, il peut s'agir de la désaminase Aro8 et/ou de la désaminase Aro9, ou de leurs homologues dans les autres microorganismes fongiques.
De même, la ou les alcool déshydrogénases (notées ADH) impliquées dans la troisième étape de la voie de dégradation de la tyrosine en tyrosol peuvent être ciblées.
Ainsi et selon un aspect particulier, la présente invention vise un microorganisme fongique comprenant au moins une mutation ou délétion dans au moins un des gènes codant les enzymes suivantes : désaminase Aro8, désaminase Aro9, décarboxylase ArolO, décarboxylase Pdc5, décarboxylase Pdc6, alcool déshydrogenase (ADH). Dans le cadre de l'invention, lesdites mutations et/ou délétion entraînent une diminution voire une suppression de la capacité du microorganisme à dégrader la tyrosine en tyrosol, en p- hydroxyphényl acétaldéhyde et/ou en p-hydroxyphényl acétate. De manière avantageuse, ledit microorganisme présente également une capacité à synthétiser de la frambinone à partir de tyrosine, éventuellement grâce à l'introduction de modifications génétiques comme décrites ci-dessus.
Selon un mode de réalisation particulier, un tel microorganisme est une souche de Saccharomyces cerevisiae qui présente une capacité à produire de la frambinone et une inactivation du gène ARO10 codant une décarboxylase. Ce microorganisme possède donc une voie de conversion de la tyrosine en frambinone fonctionnelle et une capacité faible ou une incapacité à dégrader la tyrosine en tyrosol, en p-hydroxyphényl acétaldéhyde et/ou en p-hydroxyphényl acétate comme décrit ci-dessus. Il s'agit par exemple de la souche industrielle nommée R 8, déposée auprès de la CNCM en date du 26 avril 2017, sous le numéro 1-5200. Celle-ci a été obtenue à partir de la souche R 5, par insertion d'une cassette permettant l'inactivation du gène ARO10 (voir les exemples de réalisation ci-dessous).
Selon un autre aspect, la présente invention concerne l'utilisation d'un microorganisme fongique présentant la capacité à produire de la frambinone à partir de tyrosine et une capacité faible ou une incapacité à dégrader la tyrosine en tyrosol, en p-hydroxyphényl acétaldéhyde et/ou en p-hydroxyphényl acétate, avantageusement comme décrit ci-dessus et notamment la souche 1-5200, pour la production de frambinone, avantageusement par fermentation aérobie.
En d'autres termes, l'invention concerne également un procédé de production de frambinone comprenant la culture d'un microorganisme fongique présentant la capacité à produire de la frambinone à partir de tyrosine et une capacité faible ou une incapacité à dégrader la tyrosine en tyrosol, en p-hydroxyphényl acétaldéhyde et/ou en p- hydroxyphényl acétate, avantageusement comme décrit ci-dessus et notamment la souche 1-5200, dans un milieu comprenant de la tyrosine. Selon un mode de réalisation particulier, la tyrosine est ajoutée dans le milieu de culture à une concentration comprise entre 50 et 450 ou 500 mg/L, par exemple de l'ordre de 300 mg/L. Eventuellement, le milieu de culture peut également être supplémenté en acide coumarique et/ou en phénylalanine.
Alternativement, le microorganisme mis en œuvre dans le cadre de l'invention présente naturellement une certaine capacité à dégrader la tyrosine en tyrosol, en p-hydroxyphényl acétaldéhyde et/ou en p-hydroxyphényl acétate, mais cette voie de dégradation est inhibée par l'ajout d'un répresseur de cette voie, par exemple un inhibiteur de l'une des enzymes impliquées dans cette voie. Ainsi et selon un autre aspect, l'invention vise un procédé de production de frambinone comprenant la culture d'un microorganisme fongique présentant une capacité à produire de la frambinone à partir de tyrosine dans un milieu comprenant de la tyrosine et au moins un répresseur de la voie de dégradation de la tyrosine en tyrosol, en p- hydroxyphényl acétaldéhyde et/ou en p-hydroxyphényl acétate. Eventuellement, il s'agit d'un microorganisme modifié génétiquement pour conférer ou augmenter la capacité dudit microorganisme à produire de la frambinone à partir de tyrosine, comme décrit ci- dessus. Selon un mode de réalisation particulier, le microorganisme mis en œuvre est la souche industrielle Saccharomyces cerevisiae RK4, déposée auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) en date du 1er Juin 2016 sous le numéro 1-5101.
Alternativement, le microorganisme mis en œuvre est la souche industrielle Saccharomyces cerevisiae R 5, déposée auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) en date du 26 Avril 2017 sous le numéro 1-5199.
Selon un mode de réalisation particulier, le répresseur de la voie de dégradation de la tyrosine en tyrosol, en p-hydroxyphényl acétaldéhyde et/ou en p-hydroxyphényl acétate est choisi parmi le glutamate, la glutamine ou un de leurs dérivés, avantageusement le glutamate. Selon un mode de réalisation particulier, ce répresseur, en particulier le glutamate, est ajouté dans le milieu de culture à une concentration supérieure ou égale à 0,5 g/L, voire 1, 2 ou 3 g/L, par exemple de l'ordre de 2 g/L.
Dans le cadre de l'invention, le microorganisme fongique est mis en culture dans des conditions favorisant la production de frambinone. Des conditions particulièrement adaptées de culture sont les suivantes :
en aérobiose ;
dans un milieu de croissance permettant la fermentation, avantageusement un milieu minéral, par exemple composé de 1.7 g/L de YNB (Difco™), 5 g/L de sulfate d'ammonium, 2.7 g/L de phosphate de potassium et 20 g/L de dextrose ; - pendant une durée pouvant aller de plusieurs heures à plusieurs jours ;
à un pH compris entre 5 et 7, par exemple égal à 6 ;
à une température comprise entre 25°C et 32°C, par exemple égale à 30°C.
Comme déjà dit et dans ces conditions, il a été observé des niveaux de production de frambinone encore jamais atteints, le milieu de culture présentant une concentration en frambinone avantageusement supérieure à 4 mg/L, encore plus avantageusement supérieure ou égale à 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 voire même 20, 25 ou 30 mg/L. De manière connue de l'homme du métier, la frambinone ainsi produite peut être isolée du milieu de culture. L'invention va être décrite plus en détail dans les exemples de réalisation qui suivent à l'appui des figures annexées. Ces exemples sont fournis uniquement pour illustrer l'invention et n'ont aucune portée limitative.
Il est considéré que sans plus de précision, l'homme du métier sera capable, au vu de la description et des exemples de réalisation de mettre en œuvre et d'utiliser les microorganismes selon l'invention et les méthodes revendiquées.
LEGENDES DES FIGURES
Figure 1: Voie de biosynthèse de la frambinone
(1) L-tyrosine (2) acide p-coumarique (3) coumaroyl-CoA (4) p-hydroxy benzalacétone (5) frambinone (6) malonyl-CoA (7) phénylalanine (8) acide cinnamique
TAL: tyrosine ammonia lyase, 4CL: 4-coumarate-CoA ligase, BAS: benzalacétone synthase, BAR: benzalacétone réductase, PAL: phénylalanine ammonia lyase, C4H: cinnamate 4 hydroxylase
Figure 2: Voie de dégradation de la tyrosine
Elle consiste en des étapes de désamination (Aro8/9) et de décarboxylation (Arol0/Pdc5/Pdc6), aboutissant à la formation de p-hydroxyphényl acétaldéhyde. Celui- ci peut être réduit à l'aide d'une alcool déshydrogénase (ADH) en tyrosol ou oxydé en p- hydroxyphényl acétate. Une inactivation possible de la voie est indiquée par une croix.
Figure 3: Schéma du locus HO modifié dans le génome des souches S. cerevisiae RK4, RK5 et RK8 et la cassette permettant de modifier le locus ARO10
A) Schéma des cassettes intégrées au locus HO permettant la synthèse de frambinone. Cinq cassettes d'expression génique et une cassette marqueur ont été intégrées au niveau du locus HO en utilisant différentes régions de recombinaison chevauchantes (RR1-5) entre les cassettes pour l'assemblage in vivo. Dans les souches R 5 et R 8 la cassette marqueur (pTEF-KanMX-tTEF) est absente.
B) Schéma de la cassette permettant l'inactivation du gène ARO10 et conférant une résistance à l'hygromycine.
Figure 4: Production de frambinone par la souche S. cerevisiae RK4 après 7 jours La concentration en frambinone (en mg/L) a été déterminée après 7 jours de culture en fonction du substrat (tyrosine synthétisée par la cellule à partir de glucose et de sulfate d'ammonium (dite obtention de novo), tyrosine ou acide coumarique ajoutés dans le milieu de culture). Figure 5: Production de tyrosol par la souche S. cerevisiae RK4 après 7 jours
La concentration en tyrosol (en mg/L) a été déterminée après 7 jours de culture en fonction du substrat (tyrosine synthétisée par la cellule à partir de glucose et de sulfate d'ammonium (dite obtention de novo), tyrosine ou acide coumarique ajoutés dans le milieu de culture).
Figure 6: Activité HDPPC dans des extraits cellulaires (souche S. cerevisiae RK4, RK5 et RK8) après 16 heures de fermentation en milieu synthétique contenant de la tyrosine avec ou sans glutamate
L'activité hydroxy-phénylpyruvate (HDPPC) (exprimée en nmol/min/mg de protéine) a été déterminée dans l'extrait cellulaire après 16 heures de fermentation en milieu synthétique contenant 0.3 g/L de tyrosine et de manière optionnelle 2 g/L de glutamate.
EXEMPLES DE REALISATION
La présente invention va être illustrée plus avant en rapport avec une souche de Saccharomyces cerevisiae modifiée génétiquement pour exprimer 4 gènes hétérologues codant les enzymes TAL, 4CL, BAS et BAR intégrés au niveau de son locus HO et produisant efficacement de la frambinone à partir de tyrosine dans un milieu supplémenté en glutamate, ou avec une souche dérivée présentant un gène ARO10 inactivé. Toutefois, ces exemples ne sont en aucun cas limitatifs.
Il Matériel et Méthodes Génération des cassettes d'expression et des souches recombinantes
Pour synthétiser de la frambinone à partir de tyrosine, il a été choisi d'exprimer quatre gènes hétérologues chez Saccharomyces cerevisiae comme montré dans le Tableau 4 ci- dessous: Tableau 4: Gènes hétérologues utilisés pour établir une voie de synthèse de la frambinone chez S. cerevisiae
Enzyme Source Référence Séquence (codon-optimisée pour l'expression chez S. cerevisiae)
TAL Rhodotorula Uniprot SEQ ID NO: 5
glutinis PI 1544
4CL Ara bi do psi s Uniprot SEQ ID NO: 8
thaliana Q42524 BAS Rheum Uniprot SEQ ID NO: 1 1 palmatum Q94FV7
BAR Rubus idaeus Uniprot SEQ ID NO: 2
G1FCG0
Les séquences codantes ont été « codon-optimisées » pour l'expression chez S. cerevisiae. Les séquences correspondantes sont indiquées dans le Tableau 4 ci-dessus.
Elles ont été clonées entre des promoteurs et des terminateurs individuels pour assurer leur expression. Cinq cassettes d'expression génique ont été construites (Tableau 5 ci- dessous) et, en plus d'une cassette marqueur, ont été intégrées dans le génome de la souche industrielle S. cerevisiae déposée auprès de la CNCM en date du 4 Septembre 2008 sous le numéro 1-4071 , au niveau du locus HO en utilisant la technique d'intégration modulaire de cassette (Figure 3A). La souche résultante, appelée R 4, a été déposée auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) en date du 1er Juin 2016, sous le numéro 1-5101.
Tableau 5 : Cassettes d'ex ression éni ue et mar ueur utilisés dans la souche R 4
* de S. cerevisiae à l'exception de TEF1 (dc Ashbya gossypii)
Ri = Rubus idaeus
Rg = Rhodotorula glutinis
Ai = Arabidopsis thaliana
Rp = Rheum palmatum A partir de la souche RK4 décrite ci-dessus, la souche R 5 a été obtenue par élimination de la cassette marqueur kanMX. Ceci a été réalisé par expression de la Cre recombinase qui entraine l'excision du marqueur kanMX qui est flanqué de sites loxP (Steensma et Linde, 2001, Yeast, 18(5) : 469-72). Il s'agit de la souche déposée auprès de la CNCM en date du 26 avril 2017, sous le numéro 1-5199.
Une cassette d'inactivation du gène ARO10 a ensuite été construite (Figure 3B). Elle est composée d'une cassette marqueur à l'hygromycine, pTEFlshort-hph-tTEFl (pTEFl short: SEQ ID NO: 22; hph: SEQ ID NO: 23; tTEFl : SEQ ID NO: 24), flanquée de séquences homologues au promoteur (pAROlO : SEQ ID NO : 25) et au terminateur (tAROlO; SEQ ID NO : 26) de ARO10, en amont et en aval, respectivement. Une séquence ARN guide, spécifique du gène ARO10, a été clonée dans un plasmide permettant d'exprimer Cas9p et ledit ARN chez S. cerevisiae. La souche R 5 décrite ci-dessus a été cotransformée avec ce plasmide et la cassette d'inactivation du gène ARO10. Les clones positifs (résistants à l'hygromycine) ont été sélectionnés et vérifiés pour l'inactivation de tous les allèles de ARO10.
La souche RK8 ainsi obtenue a été déposée auprès de la CNCM en date du 26 avril 2017, sous le numéro 1-5200.
Mesure par HPLC des intermédiaires et des produits de la voie
La frambinone, le tyrosol et les autres intermédiaires de la voie ont été analysés et quantifiés par deux méthodes de HPLC appelées « méthode longue » et «ACE 29 », respectivement. Les dispositifs de HPLC et leurs paramètres sont résumés dans le Tableau 6 ci-dessous et permettent la séparation de la frambinone et du tyrosol des autres composés. Pour la quantification, une calibration a été réalisée à l'aide de solutions standards entre 0.1 and 300 mg/L. Les échantillons des cultures de levure ont été centrifugées (>15000x g, 10 min) et le surnageant a été filtré à travers un filtre de 0.45 μιη avant injection dans l'HPLC. Tableau 6: Dispositifs d'HPLC et paramètres
Détection enzymatique de l'activité hydroxyphényl pyruvate décarboxylase (HPPDC) Pour quantifier l'activité enzymatique de la décarboxylation de Γ hydroxyphényl pyruvate (activité HPPDC), un test enzymatique couplé avec un extrait cellulaire brut a été mis au point. L'extrait cellulaire a été préparé à partir d'une culture sur la nuit (16h) de la souche d'intérêt dans un milieu synthétique composé de 1.7 g/L de YNB (Difco™), 5 g/L de sulfate d'ammonium, 2.7 g/L de phosphate de potassium et 20 g/L de dextrose. Le milieu a en outre été complété par 300 mg/L de L-tyrosine et optionnellement différentes sources d'azote (par exemple le L-glutamate). Après croissance aérobie à 30°C, les cellules ont été récoltées par centrifugation (5000x g, 4 min, 4°C) et lavées deux fois dans un tampon de lavage (10 mM phosphate de potassium, 2 mM EDTA, pH 6.8). Le culot cellulaire a été repris dans un tampon d'extraction (100 mM phosphate de potassium, 2 mM de chlorure de magnésium, 1 mM DTT, lx cOmplete™ proteinase inhibitors, pH 6.8) et les cellules ont été cassées à l'aide d'un disrupteur « FastPrep disruptor » (avec des billes de verre de diamètre 0.45 mm; quatre cycles de 30 s à 6 m/s et 1 min sur la glace). Les débris cellulaires ont été éliminés par centrifugation et le surnageant a été utilisé comme extrait cellulaire brut. La concentration en protéines a été déterminée à l'aide du kit « Uptima BC Assay Protein Quantification kit » selon les instructions du fabricant. L'essai enzymatique a été réalisé comme décrit par Kneen et al. (2011, FEBS J. 278, 1842-53), avec des modifications mineures. L'essai couple la réaction HPPDC (décarboxylation de l'hydroxyphényl pyruvate (HPP) en hydroxyphényl acétaldéhyde) avec une seconde réaction (oxydation de l'hydroxyphényl acétaldéhyde en hydroxyphényl éthanol/Tyrosol) catalysée par l'enzyme auxiliaire alcool déshydrogénase (ADH). L'activité ADH mène à une réduction du NADH en NAD+ qui peut être suivie grâce à la diminution de l'absorption à 340 nm dans un spectrophotomètre. Le mélange réactionnel (1 ml) contenait 100 mM de phosphate de potassium, 1 mM de chlorure de magnésium, 0.5 mM de thiamine pyrophosphate, 0.1 mM de NADH, 0.5 U d'ADH de foie de cheval, 4 mM de HPP et de l'extrait cellulaire brut équivalent à approximativement 200 μg de protéines totales. Les réactions ont été mesurées à 32°C et à pH 6.8. La réaction a été initiée par l'ajout du substrat HPP.
II/ Résultats
1/ Production de frambinone et d'autres métabolites à partir de tyrosine ou d'acide coumarique en tant que substrat par la souche RK4.
Les tests de fermentation ont été réalisés avec la souche R 4 cultivée dans un milieu minéral, composé de 1.7 g/L de YNB (Difco™), 5 g/L de sulfate d'ammonium, 2.7 g/L de phosphate de potassium et 20 g/L de dextrose. Optionnellement, le milieu peut contenir 300 mg/L de tyrosine ou 100 mg/L d'acide coumarique. Comme proposé par Lee et al. (2016, Microb. Cell Factories 15. doi: 10.1186/sl2934-016-0446-2), les tests de fermentation ont été réalisés en conditions aérobies pour optimiser la production de frambinone.
Comme montré à la figure 4, la souche R 4 peut synthétiser environ 6 mg/L de frambinone à partir de tyrosine. Lorsque l'acide coumarique est utilisé comme substrat, la concentration en frambinone dans les milieux atteint approximativement 14 mg/L. Ces résultats sont en accord avec ceux de l'art antérieur et confirment le fait que la production de frambinone à partir d'acides aminés aromatiques est moins performante qu'à partir d'acide coumarique. Toutefois, en prenant en compte le prix du substrat utilisé pour la bioconversion, les applications industrielles sont plus bénéfiques lorsque la tyrosine est utilisée plutôt que l'acide coumarique.
Un dernier point de ces résultats concerne la synthèse de novo de frambinone par la souche construite R 4. Il est à noter que la concentration en frambinone est plus ou moins la même que celle observée en présence de tyrosine. L'hypothèse a été faite que cela est probablement lié à la régulation de la bio synthèse de la tyrosine par la tyrosine extracellulaire mais aussi au détournement de cet acide aminé par une voie de dégradation.
2/ Dégradation de la tyrosine en tyrosol dans la souche RK4
La dégradation de la tyrosine en tyrosol est une voie de dégradation bien connue (Figure 2) (Hazelwood et al., 2008, Appl. Environ. Microbiol. 74, 2259-66). La première étape consiste en une transamination de la tyrosine menant à la formation d'hydroxyphényl pyruvate. Ce composé est alors décarboxylé en hydroxyphényl acétaldéhyde (EC: 4.1.1.80). Finalement, la fonction aldéhyde est réduite pour former une molécule hydroxylée appelée tyrosol (EC : 1.1.1.90).
La production de tyrosol pendant la fermentation de la souche R 4 a été suivie. La Figure 5 révèle les concentrations en tyrosol dans les différents milieux après 7 jours de fermentation. Les résultats confirment que la majeure partie de la tyrosine fournie est utilisée pour la production de tyrosol.
3/ Inhibition de l'activité de P hydroxyphényl pyruvate décarboxylase (HPPDC). Pour réduire la production de tyrosol dans la souche R 4, il a été décidé d'inhiber l'activité enzymatique impliquée dans la décarboxylation de Γ hydroxyphényl pyruvate, en ajoutant dans le milieu de fermentation des composés qui diminue l'activité HPPDC.
Il a été choisi d'ajouter du glutamate dans le milieu pour réduire l'activité HPPDC. Pour être sûr que l'addition de cet acide aminé supplémentaire entraine une réduction de l'activité enzymatique, le test enzymatique a été mis en œuvre comme décrit ci-dessus. La Figure 6 montre l'activité dans l'extrait cellulaire de R 4 après culture dans le milieu de fermentation contenant de la tyrosine avec ou sans 2 g/L de glutamate. Les résultats confirment la diminution de l'activité HPPDC dans les cellules fermentant en présence de glutamate.
En parallèle, l'activité HPPDC de la souche R 8 a été mesurée. On constate à la figure 6 que la délétion du gène ARO10 codant pour la décarboxylase permet de diminuer l'activité HPPDC, dans les mêmes proportions que pour la souche RK4 en présence de glutamate.
La figure 6 révèle également que, de manière attendue, les souches R 4 et R 5 (dont dérive la souche R 8) ont le même niveau d'activité HPPDC en présence de tyrosine. 4/ Impact de l'inhibition de la dégradation de la tyrosine sur la production de frambinone et de tyrosol Dans une première série d'expériences, la production de tyrosol et de frambinone par la souche R 4 a été suivie par HPLC (« méthode longue ») dans les deux conditions (avec ou sans glutamate). Les concentrations de tyrosol observées démontrent que la réduction de l'activité HPPDC réduit aussi la formation de tyrosol: une réduction de 27% de la concentration en tyrosol a été observée en réponse au glutamate, en accord avec la réduction de l'activité HPPDC. Dans le même temps, la production de frambinone a augmenté de 40%. Ces données suggèrent fortement que la réduction de l'activité HPPDC réduit la production de tyrosol, rendant ainsi la tyrosine plus disponible pour la voie de la frambinone. Dans une seconde série d'expériences, la détermination des niveaux de frambinone (Tableau 7) et de tyrosol (Tableau 8) produits par les trois souches de S. cerevisiae construites (R 4, R 5 et RK8) a été évaluée par HPLC selon les deux méthodes décrites (« méthode longue » et « ACE 29 »). La méthode ACE 29 utilise une nouvelle génération de colonne qui permet d'augmenter la séparation et résolution des composés, et ainsi de diminuer les risques de co-élution, notamment de la frambinone, avec d'autres composés en comparaison avec la « méthode longue ».
Les résultats obtenus avec la « méthode longue » à partir d'une fermentation dans un milieu de culture contenant du glutamate montrent une augmentation de la synthèse de frambinone par la souche RK5 (+ 58%) en comparaison avec une fermentation dans un milieu de culture en absence de glutamate, équivalente à celle de la souche R 4 dans les mêmes conditions. Les augmentations observées sont également proches des valeurs de la première série d'expériences. La production de frambinone par la souche R 8, cultivée en l'absence de glutamate, a été comparée à celle de la souche R 5 dans les mêmes conditions. Une augmentation de la synthèse de frambinone de + 36%>, du même ordre que celle observée pour les souches R 4 et R 5 cultivées en présence de glutamate, a été observée. La détermination des niveaux de synthèse de frambinone par les souches R 4, R 5 et R 8 par la méthode ACE 29 démontre de la même manière une augmentation de la production de frambinone, dans des proportions toutefois supérieures, à savoir + 100%), + 95%o et + 129 %>, respectivement. Tableau 7 : Détermination par HPLC de la concentration en frambinone à l'issue de la fermentation par les différentes souches construites dans des milieux sans (Glu-) et avec (Glu+) glutamate.
n.d. : non déterminé
MD : écart moyen
Les résultats obtenus avec la « méthode longue » à partir d'une fermentation dans un milieu de culture contenant du glutamate montrent une diminution de la synthèse de tyrosol par la souche RK5 (- 20%) par rapport à une fermentation en absence de glutamate, comparable à celle de la souche R 4 dans les mêmes conditions. Les diminutions observées sont également proches des valeurs de la première série d'expériences. La production de tyrosol par la souche R 8, cultivée en l'absence de glutamate, a été comparée à celle de la souche R 5 dans les mêmes conditions. Une diminution de la synthèse de tyrosol de - 49%, du même ordre que celle observée pour les souches R 4 et R 5 cultivées en présence de glutamate, a été observée. La détermination des niveaux de synthèse de tyrosol par les souches R 4, R 5 et R 8 par la méthode ACE 29 démontrent de la même manière une diminution de la production de tyrosol, dans des proportions similaires, à savoir - 19%, - 19%> et - 52 %>, respectivement . Tableau 8 : Détermination par HPLC de la concentration en tyrosol à l'issue de la fermentation par les différentes souches construites dans des milieux sans (Glu-) et avec (Glu+) glutamate.
n.d. : non déterminé
MD : écart moyen III/ Conclusions: En conclusion, l'introduction de la voie de la frambinone comme montrée dans la Figure 1 est suffisante pour la production par S. cerevisiae de frambinone à partir de tyrosine. Cependant, lorsque de la tyrosine est ajoutée dans le milieu de fermentation, la bioconversion n'est pas très efficace et mène à la production d'une grande quantité de coproduits, essentiellement du tyrosol comme rapporté ci-dessus. Pour réduire le « détournement » du substrat, l'activité HPPDC impliquée dans la dégradation de la tyrosine en tyrosol a été réduite avec succès par l'ajout d'un inhibiteur de ladite activité enzymatique ou l'inactivation du gène ARO10. Comme rapporté, cela a permis d'augmenter la production de frambinone. Alternativement, d'autres stratégies peuvent être mises en œuvre comme la sélection d'une souche microbienne présentant une très faible activité HPPDC, basée sur un fond génétique naturel ou via l'introduction d'autres modifications génétiques telles que la délétion des gènes codant les enzymes HPPDC.

Claims

REVENDICATIONS
Microorganisme fongique modifié génétiquement pour la production de frambinone, ledit microorganisme présentant les caractéristiques suivantes :
la capacité à produire de la frambinone à partir de tyrosine ; et
une capacité faible ou une incapacité à dégrader la tyrosine en tyrosol, en p- hydroxyphényl acétaldéhyde et/ou en p-hydroxyphényl acétate.
Microorganisme selon la revendication 1 caractérisé en ce que le microorganisme est choisi parmi les ascomycètes ou les basidiomycètes, avantageusement du genre des Saccharomycetales, encore plus avantageusement de la famille des Debaryomycetaceae, des Dipodascaceae ou des Saccharomycetaceae, de manière préférée du genre Yarrowia, Debaryomyces, Arxula, Scheffersomyces, Geotrichum, Pichia ou Saccharomyces, préférentiellement de l'espèce Yarrowia lipolytica, Debaryomyces hansenii ou Saccharomyces cerevisiae.
Microorganisme selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le microorganisme comprend au moins une séquence hétérologue codant l'enzyme 4- coumarate:CoA ligase (4CL) ou benzalacétone synthase (BAS), avantageusement les enzymes 4CL et BAS.
Microorganisme selon la revendication 3 caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins une séquence hétérologue ou surnuméraire codant l'enzyme tyrosine ammonia lyase (TAL) ou benzalacétone réductase (BAR), avantageusement les enzymes TAL et BAR.
Microorganisme selon la revendication 3 ou 4 caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins une séquence hétérologue ou surnuméraire codant l'enzyme phénylalanine ammonia lyase (PAL) ou cinnamate 4-hydroxylase (C4H), avantageusement les enzymes PAL et C4H.
Microorganisme selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il présente une activité hydroxyphényl pyruvate décarboxylase (HPPDC) inférieure ou égale à 2 x 10~6 kat par g de protéine, avantageusement inférieure ou égale à 5 x 10~7 kat par g de protéine.
7. Microorganisme selon la revendication 6 caractérisé en ce qu'il comprend au moins une mutation ou une délétion dans au moins un des gènes codant les enzymes suivantes : désaminase Aro8, désaminase Aro9, décarboxylase ArolO, décarboxylase Pdc5, décarboxylase Pdc6, alcool déshydrogénase (ADH), avantageusement ArolO, Pdc5 et/ou Pdc6.
8. Microorganisme selon la revendication 7 caractérisé en ce qu'il s'agit de la souche Saccharomyces cerevisiae R 8 déposée auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures et Microorganisme, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) en date du 26 avril 2017, sous le numéro 1-5200.
9. Utilisation d'un microorganisme fongique selon l'un des revendications 1 à 8 pour la production de frambinone, avantageusement par fermentation aérobie.
10. Procédé de production de frambinone comprenant la culture d'un microorganisme fongique selon l'un des revendications 1 à 8 dans un milieu comprenant de la tyrosine.
11. Procédé de production de frambinone comprenant la culture d'un microorganisme fongique présentant une capacité à produire de la frambinone à partir de tyrosine dans un milieu comprenant de la tyrosine et un répresseur de la voie de dégradation de la tyrosine en tyrosol, en p-hydroxyphényl acétaldéhyde et/ou en p-hydroxyphényl acétate.
12. Procédé de production de frambinone selon la revendication 11 caractérisé en ce que le répresseur est le glutamate.
13. Procédé de production de frambinone selon la revendication 11 ou 12 caractérisé en ce que le microorganisme présente les caractéristiques déclinées aux revendications 2 à 5.
14. Procédé de production de frambinone selon l'une des revendications 11 à 13 caractérisé en ce que le microorganisme est la souche industrielle Saccharomyces cerevisiae R 4 déposée auprès de la CNCM en date du 1er Juin 2016, sous le numéro 1-5101.
15. Procédé de production de frambinone selon l'une des revendications 11 à 13 caractérisé en ce que le microorganisme est la souche industrielle Saccharomyces cerevisiae R 5 déposée auprès de la CNCM en date du 26 avril 2017, sous le numéro 1-5199.
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