WO2023047070A1 - Souche de microorganisme genetiquement amelioree capable de produire de plus grandes quantites de composes organiques volatils d'interet et methode de criblage pour obtenir de telles souches - Google Patents

Souche de microorganisme genetiquement amelioree capable de produire de plus grandes quantites de composes organiques volatils d'interet et methode de criblage pour obtenir de telles souches Download PDF

Info

Publication number
WO2023047070A1
WO2023047070A1 PCT/FR2022/051807 FR2022051807W WO2023047070A1 WO 2023047070 A1 WO2023047070 A1 WO 2023047070A1 FR 2022051807 W FR2022051807 W FR 2022051807W WO 2023047070 A1 WO2023047070 A1 WO 2023047070A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
strains
vocs
strain
coa
activity
Prior art date
Application number
PCT/FR2022/051807
Other languages
English (en)
Inventor
Mélissa TAN
Jean-Marie Francois
Yanis CARO
Thomas PETIT
Original Assignee
Universite De La Reunion
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universite De La Reunion filed Critical Universite De La Reunion
Priority to EP22790338.2A priority Critical patent/EP4405471A1/fr
Publication of WO2023047070A1 publication Critical patent/WO2023047070A1/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Definitions

  • the invention relates to the field of natural flavorings used in the food industry. More particularly, the invention relates to a strain of genetically modified microorganism capable of producing greater quantities of volatile organic compounds of interest, in particular ⁇ -unsaturated esters. It also relates to a screening method making it possible to select from - natural or modified strains exhibiting these characteristics, and a method for preparing a strain genetically modified to produce satisfactory quantities of volatile organic compounds (VOCs), defined as organic compounds with molecular masses of less than 400 Da.
  • VOCs volatile organic compounds
  • VOCs volatile organic compounds
  • 2-phenylethanol which gives the smell of roses
  • these aromatic compounds are synthesized chemically because of their low cost of production.
  • some of the chemically-synthesized flavors may be altered when integrating human metabolic pathways and be implicated in chronic diseases such as allergies, diarrhea, or cancer.
  • unconventional yeasts show interesting flavor-producing abilities, such as Pichia kluyveri, Torulaspora delbrueckii, Candida stellate, Hanseniaspora delbrueckii, which have been reported to produce high amounts of several flavor compounds like 2- phenylethanol, ethyl octanoate, butanoic acid or phenolic esters.
  • the inventors isolated from Reunion island dragon fruits a strain of filamentous aroma-producing yeast, identified as Saprochaete suaveolens.
  • This species of yeast produces a wide variety of volatile organic compounds (VOCs), including many ⁇ -unsaturated esters (isobutyl tiglate, isoamyl tiglate, butyl tiglate, ethyl tiglate, ethyl 2-methylpropanoate, ethyl 3-methylbut-2-enoate, ethyl but-2-enoate) which is rarely found in the aromatic bouquet of other Saccharomyces and non-Saccharomyces species.
  • the inventors have also demonstrated that the production of these ⁇ -unsaturated esters by 5. suaveolens comes from the catabolism of branched-chain amino acids via the ⁇ -oxidation (BOP) pathway.
  • BOP ⁇ -oxidation
  • FIG. 1 A simplified representation of the metabolic pathways of these branched chain amino acids is shown in Figure 1. Briefly, these branched chain amino acids are first converted to their corresponding branched ⁇ -ketoacid in a transaminase (TA) catalyzed reaction. Then, in Saccharomyces and non-Saccharomyces species, ⁇ -ketoacid enters the Ehrlich pathway (EP) which involves decarboxylation followed by either oxidation to produce carboxylic acids under the action of an aldehyde dehydrogenase (AIDH), or a reduction in higher alcohols under the action of an alcohol dehydrogenase (ADH).
  • TA transaminase
  • EP Ehrlich pathway
  • Esterification of higher alcohols with acetyl-CoA can generate acetates under the catalytic action of ester synthase or alcohol-O-acetyltransferase (AFT).
  • AFT alcohol-O-acetyltransferase
  • a second pathway that has been identified in filamentous fungi but absent in Saccharomyces cerevisiae is the [3-oxidation of branched-chain ⁇ -ketoacid to acetyl-CoA.
  • the ⁇ -keto-acid intermediate is oxidatively decarboxylated to an acyl-CoA, by branched-chain ⁇ -keto acid dehydrogenase (BCKAD) which is the enzyme regulating this pathway.
  • BCKAD branched-chain ⁇ -keto acid dehydrogenase
  • the acyl-CoA produced can be fully degraded to acetyl-CoA (+ propionyl COA in the case of L-leucine and L-isoleucine) via the [3-oxidation pathway.
  • yeasts can produce ethyl esters by condensation of short or medium chain acyl-CoA derived from the degradation of fatty acids with ethanol or higher alcohols (see Figure 1) in a process called “alcoholysis” catalyzed by an acyl-CoA:ethanol-acyltransferase
  • an originality observed in Saprochaete suaveolens is that the enoyl-CoA intermediate derived from the oxidation of amino acids can be esterified with alcohols to give rise to various ct-esters.
  • Agri-food professionals are looking for new sources of natural flavors in order to be able to offer consumers quality products both in terms of taste and food safety.
  • the present invention is based on a common inventive concept, namely the demonstration of the existence of a VOC synthesis pathway based on 6 specific enzymatic activities necessary for the production of VOCs.
  • This pathway stems directly from the establishment of a functional link between, on the one hand, the ability/inability of strains of microorganisms, in particular yeasts, to grow on a medium using only branched amino acids as a source of carbon, and on the other hand their ability to produce VOCs.
  • the inventors first implemented an original screening method based on the ability of strains to grow rapidly on media containing branched-chain amino acids (isoleucine, valine and leucine; so-called “ILV+” strains) as the sole source. of carbon. Then, they studied the ability of ILV+ strains to produce VOCs of interest, in particular ⁇ -unsaturated esters, in order to identify natural strains capable of producing molecules of aromas of interest. Twelve strains producing ⁇ -unsaturated esters were isolated, including two producing ⁇ -unsaturated esters not produced by the reference strain 5. suaveolens, validating the interest of this screening method.
  • the inventors propose to select strains capable of producing VOCs, in particular ⁇ -unsaturated esters, and which are of interest either for the diversity of the aroma molecules produced, or for their level of production. . These strains can then be exploited as is or genetically modified to improve their yield performance.
  • the invention relates to a strain of genetically modified microorganism capable of producing volatile organic compounds characterized in that: it expresses the activities transaminase (TA), branched-chain keto-acid decarboxylase (BCKAD), acyl-CoA dehydrogenase ( ACyD), alcohol acyl transferase (AAT) and acyl CoA hydrolase (ACyH) by expression or overexpression of the genes responsible for these activities; its enoyl-CoA hydratase (ECH) activity is reduced/suppressed, if such activity is present in said microorganism.
  • TA transaminase
  • BCKAD branched-chain keto-acid decarboxylase
  • ACyD acyl-CoA dehydrogenase
  • AAT alcohol acyl transferase
  • ACyH acyl CoA hydrolase
  • the invention also relates to the screening of yeast strains capable of producing VOCs consisting of: select, in natural isolates, the strains capable of growing on a medium containing only branched amino acids (isoleucine, leucine and valine, “ILV+” strains) as carbon source quantify the production of VOCs in the isolated strains select the strains capable of producing the required amount of VOCs.
  • yeast strains capable of producing VOCs consisting of: select, in natural isolates, the strains capable of growing on a medium containing only branched amino acids (isoleucine, leucine and valine, “ILV+” strains) as carbon source quantify the production of VOCs in the isolated strains select the strains capable of producing the required amount of VOCs.
  • It also relates to a method for screening a strain of mutated microorganism exhibiting increased VOC production relative to the non-mutated reference parent strain capable of producing VOCs.
  • the present invention also relates to a process for the preparation of a strain of genetically modified microorganism in which the production of VOCs is increased.
  • the present invention has the advantage of describing a new method for screening strains naturally producing VOCs of interest, in particular ⁇ -unsaturated esters with aromatic notes, based on their ability to grow on a medium containing only amino acids. plugged in as a carbon source. This method is simple and quick.
  • the invention also proposes to screen among strains producing COVs of interest, mutant strains having acquired the capacity to produce COVs in greater quantity.
  • This screening method is simple to analyze and quick to implement. It consists of random mutagenesis followed by selection on a medium containing only branched amino acids as carbon source. Random mutagenesis techniques generate a very large number of strains potentially carrying the desired mutation and therefore require a subsequent screening method that is rapid.
  • the screening of microorganisms for the production of VOCs is today essentially based on chromatographic methods which can prove to be very time-consuming when the number of strains to be analyzed is high.
  • the inventors propose an innovative approach based on physiological screening established by hypothesizing that the ability of strains to grow on a medium containing the branched amino acids isoleucine, leucine or valine (ILV medium) is at the origin of a reduction performance in VOC production. It is therefore a matter of selecting, from a parent strain producing the COV of interest, mutant strains that have lost the ability to grow on ILV medium as the sole carbon source. These mutant strains potentially increased their production of VOCs by promoting the flow of branched-chain amino acids into the flavor-producing pathway. The relevance of this approach is confirmed by the experimental results described below and the identification of a mutant strain meeting these selection criteria.
  • the present invention also describes a genetically modified 5.
  • suaveolens yeast strain capable of producing total VOCs at a level significantly higher than that of currently available strains (experimental data shows an 8-fold increase in the amount of total VOCs) . It makes it possible to envisage production on an industrial scale.
  • the target production thresholds are specific to each farm.
  • the present invention provides a method for preparing a microorganism capable of producing VOCs, in particular ⁇ -unsaturated esters, consisting in: reducing or eliminating the activity of enoyl-CoA hydratase, if this activity is present in the targeted microorganism, and to increase the activity of the acyl-CoA hydrolase if it is present or to provide it if it is not present in the targeted microorganism.
  • This method is applicable to a large number of cells, in particular cells validated for industrial production, such as 5. cerevisae.
  • a first object of the invention relates to a strain of genetically modified microorganism capable of producing volatile organic compounds, characterized in that: it expresses the activities transaminase (TA), branched-chain keto-acid decarboxylase (BCKAD), Acyl-Coa dehydrogenase (ACyD), alcohol acyl transferase (AAT) and acyl CoA hydrolase (ACyH) by expression or overexpression of the genes responsible for these activities; its enoyl-CoA hydratase (ECH) activity is reduced/suppressed, if such activity is present in said microorganism.
  • TA transaminase
  • BCKAD branched-chain keto-acid decarboxylase
  • ACyD Acyl-Coa dehydrogenase
  • AAT alcohol acyl transferase
  • ACyH acyl CoA hydrolase
  • microorganism within the meaning of the invention, is meant within the meaning of the invention preferably a yeast, a bacterium or a fungus. Specific examples are 5. suaveolens, S. cerevisae, E. coli, Aspergillus sp.
  • the production levels to be achieved depend on the desired VOC.
  • the invention is implemented as soon as the latter is capable of producing VOCs.
  • the invention allows an increase in the total production level of VOCs by a factor of 1.5 or more.
  • the strains according to the invention produce at least 1000 mg/L of total VOCs, and preferably at least 1500 mg/L, even more preferably at least 2000 mg/L of head space after 48 hours of growth .
  • the strains according to the invention produce at least 400 mg/L of alpha-unsaturated esters, and preferably at least 800 mg/L, even more preferably at least 1000 mg/L of headspace after 48 h of growth.
  • VOCs are by nature “volatile” compounds, they are found after production in the gaseous phase located above the culture medium, which is called “head space”; their recovery and quantification can be done from this gaseous phase, or other techniques such as distillation.
  • the modified strains should be considered in comparison with the quantities produced by the same unmodified strains.
  • the M10 strain described in the experimental part produces 1800 mg/L of total VOCs against 231 mg/L for the wild strain.
  • the microorganism is a strain of 5. suaveolens capable of producing VOCs and which has been genetically modified in order to increase this production, in which the activity of acyl CoA hydrolase and reduced/suppressed enoyl-CoA hydratase activity.
  • a strain produces more total VOCs after genetic modification; preferably, it produces 1.5 times, 2 times, 5 times, 10 times more VOC than the natural strain.
  • the VOCs produced or whose production is increased are alpha-unsaturated esters. These compounds are compounds having particularly interesting aromatic properties.
  • ⁇ -unsaturated esters is meant in particular isobutyl tiglate, isoamyl tiglate and ethyl tiglate.
  • a strain according to the invention is a genetically modified strain obtained from an initial strain (before genetic modification) producing a basal level of ⁇ -unsaturated esters and in which the genetic modifications consist of a reduction in the activity of the enzyme enoyl-CoA hydratase and an increase in the activity of acyl-CoA hydrolase compared to the initial strain.
  • Such a strain may be a yeast strain Saprochaete suaveolens.
  • a strain of microorganism according to this embodiment may be a strain in which the activity of the enzyme enoyl-CoA hydratase is reduced and the activity of the enzyme acyl-CoA hydrolase is increased by at least 50% compared to the activity of the initial strain.
  • a strain according to the invention is a genetically modified strain obtained from an initial strain (before genetic modification) not producing ⁇ -unsaturated esters and in which the genetic modifications consist of (i ) an expression or overexpression of transaminase (TA), branched-chain keto-acid decarboxylase (BCKAD), Acyl-CoA dehydrogenase (ACyD), alcohol acyl transferase (AAT) and acyl CoA hydrolase (ACyH) activities (by expression or overexpression genes responsible for these activities) and (ii) a reduction or elimination of the activity of the enzyme enoyl-CoA hydratase (ECH) if it exists.
  • TA transaminase
  • BCKAD branched-chain keto-acid decarboxylase
  • ACyD Acyl-CoA dehydrogenase
  • AAT alcohol acyl transferase
  • ACyH acyl CoA hydrolase
  • EHC enoyl-
  • a second object of the invention relates to a method for screening microorganism strains capable of producing VOCs consisting in: isolating, in natural media, the strains capable of growing on culture media containing at least one branched amino acid (isoleucine, leucine or valine) as sole carbon source quantify the production of ⁇ -unsaturated esters in isolated strains select strains capable of producing the required quantity of ⁇ -unsaturated esters.
  • branched amino acid isoleucine, leucine or valine
  • This method can be used either to directly select strains producing VOCs, in particular ⁇ -unsaturated esters (for example at least 400 mg/L of ⁇ -unsaturated ester headspace), or to select strains producing VOC of interest at a level lower than a target level of interest (for example lower than 400 mg/L of ⁇ -unsaturated esters in headspace) and which can be modified to increase this production.
  • ⁇ -unsaturated esters for example at least 400 mg/L of ⁇ -unsaturated ester headspace
  • a target level of interest for example lower than 400 mg/L of ⁇ -unsaturated esters in headspace
  • this screening method can be integrated as a first step in the methods described below.
  • the natural media in which the strains are sought can be soil samples, plant microbial flora or any other natural medium likely to contain microorganisms.
  • a third subject of the invention relates to a method for screening a mutated microorganism strain exhibiting increased COV production compared to the non-mutated reference parent strain capable of producing COVs, comprising the steps of: a. Random mutagenesis by UV irradiation of isolates of microorganism strains “mother strains” on a medium containing glucose as the sole carbon source b. Transfer of each of the irradiated strains so as to obtain four series of identical strains c.
  • the quantification of the production of VOCs is done by chromatography, in particular gas chromatography.
  • This analysis can be both quantitative and qualitative in terms of the VOCs produced.
  • the selected strains produce at least 400 mg/L of ⁇ -unsaturated esters in headspace.
  • An increase in production can also be evaluated by comparison with the level of production of the strain before mutagenesis, and be applied to VOCs in general or to ⁇ -unsaturated esters, or to a particular ⁇ -unsaturated ester such as tiglate. ethyl.
  • the non-mutated reference parent strains capable of producing ⁇ -unsaturated esters are selected by the strain screening method from natural isolates as described previously.
  • a fourth object of the invention relates to a process for the preparation of a strain of genetically modified microorganism in which the production of VOCs is increased, consisting in: a. Have a strain producing a basal level of a-unsaturated esters b. Reduce enoyl-CoA hydratase activity c. Increase acyl-coA hydrolase activity d. Quantify the VOCs produced to select the strains of interest
  • a fifth object of the invention relates to a process for the preparation of a strain of genetically modified microorganism capable of producing VOCs, consisting in: a. Have a strain that does not produce VOCs b. Introduce one or more gene expression cassettes containing the genes responsible for the expression of the enzymes transaminase (TA), branched-chain keto-acid decarboxylase (BCKAD), acyl-CoA dehydrogenase (ACyD), alcohol acyl transferase (AAT) and acyl CoA hydrolase. vs. Reduce or abolish enoyl-CoA hydratase activity by mutagenesis, if such activity is present in said microorganism d. Quantify the VOCs produced to select the strains of interest.
  • TA transaminase
  • BCKAD branched-chain keto-acid decarboxylase
  • ACyD acyl-CoA dehydrogenase
  • AAT alcohol acyl transfera
  • Steps b. etc. can be carried out by mutagenesis of the gene(s) encoding these enzymes.
  • the reduction of the enoyl-CoA hydratase (ECH) activity can be obtained by mutation or deletion of the gene responsible for the ECH activity or of a gene regulating the expression of the ECH gene.
  • transaminase TA
  • BCKAD branched-chain keto acid decarboxylase
  • ACyD acyl-CoA dehydrogenase
  • AAT alcohol acyl transferase
  • ACyH acyl-CoA hydrolase
  • Figure 1 Simplified diagram of branched-chain amino acid catabolism involving the Ehrlich pathway (EP) and the [3-oxidation (BOP) pathway in Saprochaete suaveolens.
  • TA transaminase
  • BCKAD branched chain keto acid dehydrogenase
  • ADH alcohol dehydrogenase
  • DC decarboxylase
  • ACyD FAD-dependent acyl-CoA dehydrogenase
  • ACyH acyl-CoA hydrolase
  • ECH enoyl-CoA hydratase
  • ACyDH -acyl-CoA NAD-dependent dehydrogenase
  • KT -keto acyl-CoA thiolase
  • AAT alcohol acyl transferase
  • ACyH acyl-CoA hydrolase.
  • Figure 2 Representative curve of PC2 versus PCI scores according to the aroma production of the strains and their origins Component analysis was performed using the XLStat Applied Sensory software (2020.1.3).
  • Group 1 included S13, S18, S21, S37, S38, S70, S74, S82, S84, S105 and S106.
  • Group 2 consisted only of S88.
  • Group 3 included S3, S12, S64, S68, S75 and S91.
  • Group 4 included S27, S99 and S100.
  • Figure 3 Cluster analysis of isolated VOC-producing strains. Strains were grouped based on their aroma production and origin using Ward's method and using XL Stat Applied Sensory software (2020.1.3). Automatic truncation (dashed line) identified four consistent groups of strains. Most of the strains were classified in group 1 (11 strains) and group 3 (6 strains). Group 4 included three strains. The S88 strain was found alone in group 2. The dendrogram is more flattened for group 4, suggesting that this group of strains is more homogeneous than the other two groups.
  • Figure 4 Survival rate of 5. suaveolens as a function of UV exposure time. Values are from eight independent experiments, with the standard value shown as a vertical bar.
  • Figure 5 Total VOCs determined by gas chromatography coupled to a mass spectrum detector (HS-SPME-GC/MS) produced by the wild strain of Saprochaete suaveolens and 9 isolated ILV- mutants. Data presented are the mean ⁇ SD of three independent cultures.
  • FIG. 6 Principal component analysis (PCA) of the VOCs produced by the wild strain of wild Saprochaete suaveolens and its 9 ILV- mutants generated by UV irradiation.
  • PCA Principal component analysis
  • Figure 7 Representation by map in color code mode of the COVs determined in the wild type and in 9 ILV- mutants of 5. suaveolens obtained by UV mutagenesis. The data is represented as the ratio of the COV value in the mutant versus the wild type. VOCs have been classified as originating primarily from the Ehrlich pathway (EP), acyl-COA or enoyl-COA intermediates from the oxidation pathway.
  • EP Ehrlich pathway
  • acyl-COA or enoyl-COA intermediates from the oxidation pathway.
  • EXAMPLE 1 Screening of yeast biodiversity from wild animal faeces from South Africa for the production of volatile ⁇ -unsaturated esters
  • Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 112-2N van Dijken et al., 2000 was used in this study.
  • a strain of Saprochaete suaveolens previously isolated from Pitaya (Hylecereus polyrhisus) fruits in Reunion Island, France (Grondin et al., 2015a) was also used.
  • Fresh faeces from wild animals were collected aseptically from different locations in zoos, reserves and national parks in South Africa. The collection was carried out under sterile conditions and the samples were then stored at 4°C until their use. In addition, freeze-dried samples of wild animal faeces were obtained from an anonymous donor. A total of 118 samples were studied.
  • swab specimens For swab specimens, the swabs were added directly to 10 mL of sterile Ringer's solution. For tube samples, 1 g of faeces was pre-weighed and dissolved in Ringer's solution. Serial dilutions were then prepared and 100 ⁇ L of each dilution were spread on the surface of Yeast-Peptone-Dextrose agar medium (Biolab diagnostics LTD, South Africa) supplemented with 0.1 gL 1 of chloramphenicol (EMDQ Millipore Corp. Billerica, MA USA) (YPD-chloramphenicol) to promote yeast growth and selection. Petri dishes were then incubated at 30°C for 48 hours until cell colonies were completely formed.
  • Yeast-Peptone-Dextrose agar medium Biolab diagnostics LTD, South Africa
  • chloramphenicol EMDQ Millipore Corp. Billerica, MA USA
  • the colonies were then isolated by repeating the subculture on YPD-chloramphenicol agar medium and stored at 4°C.
  • 1 g of faeces was resuspended in 10 ml of sterile nutrient broth (Merck, South Africa) and vortexed before being incubated at 25°C for 5 days before being inoculated on a YPD-chloramphenicol medium.
  • strains capable of growing on media containing only branched-chain amino acids isoleucine, leucine and valine
  • ILV+ strains The selection of strains capable of growing on media containing only branched-chain amino acids (isoleucine, leucine and valine) as the sole carbon source (ILV+ strains) was carried out as follows. 5 ml of YPD broth was inoculated with each isolated strain and the culture was incubated overnight at 30°C with shaking. After centrifugation of the culture (13,000 rpm, 5 min), the cell pellet was washed twice with 5 mL of sterile physiological water and resuspended in 10 mL of sterile physiological water. Next, a culture of 10 6 cells. mL 1 was prepared in sterile physiological water and cultures of 10 5 and 10 4 cells. mL 1 were prepared by serial dilution.
  • VOCs volatile organic compounds
  • the strains were inoculated into a 20 mL screw cap tube containing 15 mL of slanted YPD-agar medium and incubated at 30°C for 24 hours. Then the vials were sealed and incubated for 24 hours at 30°C.
  • the headspace of the slant cultures was directly subjected to solid-phase microextraction (HS-SPME) using a 2 cm long fiber coated with 50/30 ⁇ m of divinylbenzene /Carboxene on polydimethylsiloxane bonded to a flexible fused silica core (Supelco).
  • octan-1-ol (at 0.5 gL 1 in dichloromethane) were added to the sealed tubes as an internal standard.
  • the fiber was then exposed to the headspace of the strains for 15 min at 30°C and inserted into the injection port at 250°C for 2 min.
  • Metabolites were separated by gas chromatography (GC) using a ZB-5MSI column (30m * 0.32mm * 0.25 ⁇ m film thickness), coupled to a mass spectrometer (Shimadzu GCMS-Q.P2010 Ultra).
  • the carrier gas (H2) was adjusted to a flow rate of 1.4 mL.min -1 .
  • the temperature of the column was maintained at 45° C.
  • Colony PCR was performed using fresh cells as an amplifiable template. The cells were taken directly from a colony of fresh yeast using an lpL loop. Cells were suspended in 100 ⁇ L PCR reaction mixture containing 0.5 ⁇ M ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3') or NL1 (5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG) primers, 0.5 ⁇ M ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC 3' ) or NL4 (5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG), 200 ⁇ M of each deoxynucleotide, 1x buffer and 2.5 units of DNA polymerase (Qiagen).
  • ITS1 5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3'
  • NL1 5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG
  • ITS4 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC 3'
  • NL4 5'-GGTCCGTGTTTCAAGAC
  • the PCR conditions were as follows: initial denaturation at 95°C for 5 min; 35 cycles of denaturation at 94°C for 1 min, 1 min of primer annealing at 55.5°C for 1 min, 1 min of extension at 72°C, and a final extension at 72°C for 10 min.
  • PCR products were analyzed by electrophoresis on 2% agarose gels, with 1 x TAE buffer at 100V for 20 min. Gels were stained with Midori Green (Nippon Genetics Europe) and visualized under UV light. The sizes were estimated by comparison with a 1 kbp DNA ladder (1 kbp ladder, Gene O'ruler, ThermoFischer). Strain identification was performed by sequencing PCR products obtained by Eurofins Genomics (Germany). Sequences were analyzed using BLAST at NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).
  • suaveolens metabolism was used as the basis for the development of a selection method using the ability of yeasts to grow on media containing only branched-chain amino acids (isoleucine, leucine and valine) such as only carbon source (ILV+ strains). Assuming that this method would make it possible to select strains overproducing ⁇ -unsaturated esters, we searched for ILV+ strains among the 119 strains isolated from the faeces of wild animals, while using 5. suaveolens and 5. cerevisiae as controls. positive and negative respectively. Surprisingly, we found that 43 of the 119 strains tested presented the ILV+ criteria.
  • volatilomes of the selected strains i.e. the volatile organic compounds produced by all the ILV+ strains (43 strains isolated from the faeces and the positive control 5. suaveolens S0) were extracted by solid phase microextraction from space top, and analyzed by gas chromatography coupled to a mass spectrometry detector (HS-SPME-GC/MS) after 48 h of growth on a YPD medium at 30°C.
  • PCA principal component analysis
  • the number of acids was not correlated with any of the other parameters, probably because they represent only a small part of the VOCs detected compared to the other categories of VOCs.
  • VOCs come from amino acid catabolism.
  • ethyl 2-methylbutanoate and ethyl 3-methylbutanoate are likely produced in the Ehrlich pathway via the catabolism of isoleucine and leucine respectively (Hazelwood et al., 2008).
  • ethyl 2-methylbut-2-enoate and ethyl 3-methylbut-2-enoate are probably also produced by the catabolism of isoleucine and leucine, but via the [3 -oxidation (Grondin et al., 2015).
  • the main metabolic pathways involved in the production of the other VOCs detected in this study are the fatty acid [3-oxidation (ethyl hexanoate, ethyl octanoate, etc.), the butanoate pathway (butyl acetate, butyl butanoate, ethyl butanoate, etc.), the propanoate pathway (butyl propanoate) and the pentanoate pathway (ethyl pentanoate ).
  • some esters probably result from the esterification of two units generated by two different metabolic pathways. For example, the formation of 2-methylbutyl butanoate is likely generated by the esterification of 2-methylbutanol (synthesized via the Ehrlich pathway) and butanoic acid (synthesized via the butanoate pathway).
  • Esters represent 37 of the 50 VOCs detected in this study. They are present in the volatilome of all strains except strains S74 and S82 which only produce 2-phenylethanol. S0 (5. suaveolens), S12, and S91 strains exhibited the highest ester diversities in their volatilome. The S0 volatilome exhibited the greatest diversity of esters, with 30 different compounds in this category detected. Of these, 13 esters were not identified in the other strains investigated in this study. However, pentyl butanoate, which gives off an apricot-pineapple aroma frequently used in food and perfumery, was not detected in S0 volatilome, but was detected in S12 and S91 strains. This result is interesting because this compound is mainly present in fruits (apple and cocoa bean) but rarely detected in the volatilome of microorganisms.
  • This strain was incubated in 10 mL of peptone dextrose yeast extract medium (YPD; 20 gL 1 peptone, 20 gL 1 dextrose and 10 gL 1 yeast extract) at 30°C overnight, collected and washed twice with 10 mL of sterile water. An aliquot of 100 pL at 5.10 4 cells. mL 1 was plated on a nitrogen and yeast base medium (YNB) supplemented with 2g. L 1 of glucose (YNB-GIc) before exposure to UV irradiation (254 nm, 30 cm high) at times ranging from 0 and 540 sec. To stop the photoreactions, the plates were kept in the dark and incubated at 30°C for 15 h.
  • YNB nitrogen and yeast base medium
  • UV irradiation 254 nm, 30 cm high
  • the irradiated colonies were replicated on YNB supplemented with 1 gL 1 of isoleucine, leucine or valine or 2 gL 1 of glucose (YNB-lle, YNB-Leu, YNB-Val, YNB -GIc respectively) and incubated for 5 days at 30°C.
  • the colonies developing on YNB-GIc and not on YNB-lle, YNB-Leu or YNB-Val were then subcultured onto YPD agar medium.
  • the confirmation of the selected mutant clones was carried out by an additional growth test on YPD medium followed by YNB-lle.
  • the clones were suspended in 5 ml of YPD and incubated overnight at 30°C. The culture was then centrifuged (13,000 rpm, 5 min) and resuspended in 5 mL of sterile water. Then, 5pL of 10 6 , 10 5 and 10 4 cells. ml 1 prepared in sterile water were deposited in duplicate in a YNB-agar plate containing glucose, leucine, valine or isoleucine as a carbon source. The plates were incubated for 48 hours at 30°C before being read. This procedure was performed two more times to ensure the stability of the mutation. Wild strains of 5. suaveolens and 5. cerevisiae were used as positive and negative controls, respectively.
  • the strains were inoculated into a 20 ml crimp bottle containing 15 ml of YNB agar medium supplemented with 2 gL 1 of glucose and 1 gL 1 of isoleucine (YNB-GIc-lle) and incubated at 30°C for 24 h . Then the flask was sealed and re-incubated for 24 h at 30°C. Before the analysis, 10 ⁇ L of octan-l-ol (at 1 gL 1 in dichloromethane) were added in sealed vials as internal standard.
  • the headspace of the slant cultures was subjected to SPME analysis using a 2 cm long fiber coated with 50/30 ⁇ m divinylbenzene/carboxene on polydimethylsiloxane bonded to a flexible core of fused silica ( Supelco).
  • the fiber was exposed to the headspace for 15 minutes at 30°C and inserted into the injection port at 250°C for 2 minutes.
  • the metabolites were separated by GC, on a ZB-5MSI column (30m * 0.32mm * 0.25pm film thickness), coupled to a mass spectrometer (Shimadzu GCMS-Q.P2010 Ultra).
  • the carrier gas (H2) was adjusted to a flow rate of 2 mL.min -1 .
  • the temperature of the column was maintained at 40° C. for 2 min, brought to 150° C. at 10° C. min ⁇ 1 , then brought to 240° C. at 30° C. min 1 before the end.
  • Volatile organic compounds were identified by comparing their mass spectra and their experimental Kovats index with the NIST database (www.chemdata.nist.gov).
  • Yeast cells were cultured in 250 ml Erlenmeyer flasks containing 50 ml of YNB-GIc or YNB-GIc-lle for 24 h at 30°C. Then, the equivalent of 100 DO units at 600 nm of the culture was collected in 50 ml Falcon tubes by centrifugation (2000 rpm, 4° C., 1 min). Cell pellets were resuspended in 1 ml cold water, transferred to Eppendorf tubes, washed once more with cold water. The pellets obtained after centrifugation (2 min at 10,000 rpm) were stored at -20° C. until their use.
  • the reaction mixture containing 50 mM potassium phosphate buffer pH 7.4, 2 mM EDTA, 0.2 mM DTT, 0.5 mM TPP, 5 mM MgSO4, 0.5 mM CoA-SH and 1.5 mM NAD+ was initiated by the addition of 0.2 mM 2-oxo-4-methylpentanoic acid.
  • Enoyl-CoA hydratase (ECH) activity was determined according to [24] using 0.225 mM crotonyl-CoA as substrate. Conversion of this substrate to 3-hydroxy-butanoyl-CoA was measured at 263 nm at pH 8.0 in 45 mM Tris-HCl pH 8.0.
  • DC activity was determined using 2-oxo-4-methylpentanoic acid as a substrate in a reaction mixture containing 50 mM Na+citrate pH 6.2, 100 mM KCl, 0.2 mM of DTT, 0.5 mM TPP, 5 mM MgSO, 0.2 mM NADH and 5 U/mL yeast alcohol dehydrogenase.
  • the reaction was started by the addition of 0.2 mM 2-oxo-4-methylpentanoic acid and the oxidation of NAD+ was monitored at 340 nm.
  • Alcohol dehydrogenase (ADH) was tested with 2 mM 2-methylpropanal or 100 mM ethanol.
  • the reduction of 0.2 mM NADH to NAD+ was monitored at 340 nm in a mixture containing 50 mM Na+citrate buffer pH 6.2, 100 mM KCl, 0.2 mM DTT, 0.5 mM TPP and 5 mM MgSO4.
  • the reaction was carried out in 50 mM potassium phosphate pH 7.4, 100 mM KCl, 0.2 mM DTT, 0.5 mM TPP, 5 mM MgSO4 and 0.2 mM NADH. The reaction was initiated with 100 mM ethanol.
  • aldehyde dehydrogenase (AIDH) activity the reaction was carried out in the presence of 50 mM Na+-citrate buffer pH 6.2, 100 mM KCl, 0.2 mM DTT, 0.5 mM TPP, 5 mM MgSO4 and 1.5 mM NAD+.
  • the reaction was initiated by the addition of 2 mM 2-methylpropanal and followed at 340 nm by the reduction of NAD+ to NADH.
  • Acyl-CoA dehydrogenase (ACyD) activity was determined after reduction of DCIP to DCIPH2 at 655 nm.
  • the reaction was carried out in 50 mM potassium phosphate buffer pH 7.4, 2 mM EDTA, 100 mM KCI, 0.1 mM FAD+, 0.5 mM DCIP and 0.2 mM DTT and was initiated by the addition of 0.2 mM 2-methylbutanoyl-CoA.
  • Alcohol acyltransferase (AAT) was tested in the hydrolytic (esterase) sense, which was achieved according to [25] using p-nitrophenyl butyrate which is hydrolyzed to butyrate and p-nitrophenol, which absorbs at 415 nm .
  • the reaction was carried out in a mixture containing 50 mM potassium phosphate pH 7.4, 2 mM EDTA and 100 mM KCl and started with the addition of 2 mM p-nitrophenyl butyrate.
  • the assay of the acyl-CoA hydrolase (ACyH) activity was carried out in a 10 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5), 50 mM MgCl2 and 0.1 mM DTNB.
  • the reaction was started by the addition of 0.1 mM 2-methylbutanoyl-CoA and the release of CoASH was monitored at 415 nm, which corresponds to the production of reduced DTNBH.
  • the protein concentration was determined at 550 nm by the Bradford method [26], with bovine serum albumin (BSA, Sigma-Aldrich) as standard. All the tests were carried out in triplicate from independent cultures and for each culture, the tests were carried out in duplicate.
  • mutants M2 to M10 To screen for mutants that lost the ability to grow on media containing isoleucine, leucine, or valine as the sole carbon source, these 15,000 irradiated clones were replicated on YNB-lle medium plates, YNB-Leu and YNB-Val geloses. Only 10 failed to grow out of the three branched chain amino acids. These 10 clones were then cultured again on YNB-GIc, and tested again for growth/absence of growth on non-permeable YNB-Leu/Ile/Val medium. With this procedure, only one of the 10 UV-irradiated clones was lost, thus leaving 9 potentially stable ILV- mutants, designated mutants M2 to M10.
  • VOCs Volatile organic compounds produced by the wild type of 5.
  • suaveolens and the 9 ILV- mutants were extracted by solid phase microextraction from space and then analyzed by gas chromatography coupled with a mass spectral detector (HS-SPME-GC/MS) after 48 h of growth on YNB agar tubes containing 20 gL-1 of glucose and 1 gL-1 of isoleucine (YNB-GIc-lle) at 30°C. Assuming similar growth of mutants and wild-type 5. suaveolens on agar plates, we found that mutants M9 and MIO had total COV production levels 1.8 and 8 times higher respectively than wild type 5.
  • PCA principal component analysis
  • the second axis (PC2) which represents about 10% of the total variance, separated the M9 mutant from the wild-type (WT) strain and the M5 mutant, which were roughly grouped in the same group, indicating that this mutant exhibited a similar COV profile to the wild type.
  • the COV profiles of the M9 and M10 mutants were the most different from each other and from the wild type, which is also consistent with the higher amount of COVs produced by these mutants.
  • M2, M3, M4, M6, M7 and M8 mutants were clustered and not far apart from M5 and WT, these data also suggest that these mutants have a very similar COV profile to each other and not significantly different from the wild type.
  • this PCR analysis showed that UV mutagenesis succeeded in generating at least two interesting mutants with a very different COV profile from the wild type.
  • suaveolens are essentially ester type compounds. Two types of esters have been detected, namely acetate esters which are formed by condensation of a higher alcohol generally produced in the Ehrlich pathway with acetyl-CoA and ethyl esters which are formed by condensation of an acyl-CoA with ethanol or another alcohol such as methanol, propanol or butanol [19]. While these two types of esters have also been found in the VOCs of mutants and wild-type 5. suaveolens, other types of esters have been identified.
  • esters can be produced from an acid such as 2-methylbutanoate acid which must be activated as a CoA-intermediate to condense with ethanol to give ethyl 2-methylbutanoate.
  • These esters have been classified in the category of compounds deriving from the Ehrlich pathway (EP) due to the higher alcohols and acids that come from this pathway.
  • Another category are esters which are formed by the condensation of an acyl-COA with ethanol or a higher alcohol such as octanol to give octyl acetate, octyl propanoate and butanoate of octyl.
  • BOP [3-oxidation
  • VOCs whose acid precursor is an enoyl-COA which can be esterified with ethanol (i.e. ethyl tiglate, ethyl but-2-enoate) or with a higher alcohol from the Ehrlich pathway such as 2-methylbutanol and 2-methylpropanol, to give 3-methylbutyl-2-methylbut-2Z-enoate (angelate d isoamyl) and 2-methylpropyl-2-methylbut-2E-enoate (isobutyl tiglate).
  • ethanol i.e. ethyl tiglate, ethyl but-2-enoate
  • 2-methylpropanol 2-methylpropanol
  • esters obtained by condensation of acyl-CoA with ethanol and of enoyl-CoA with ethanol or alcohols derived from EP i.e. ethyl tiglate, butyl tiglate, isobutyl tiglate, etc.
  • EP i.e. ethyl tiglate, butyl tiglate, isobutyl tiglate, etc.
  • the loss of Enoyl-CoA hydratase activity in the oxidation pathway may explain the higher COV production in the M10 mutant.
  • the Ehrlich pathway involves a decarboxylase (DC) and an alcohol dehydrogenase (ADH) for the reductive pathway or an aldehyde dehydrogenase for the oxidative pathway.
  • DC decarboxylase
  • ADH alcohol dehydrogenase
  • aldehyde dehydrogenase for the oxidative pathway.
  • BCKAD branched-chain ⁇ -keto-dehydrogenase
  • This acyl-COA intermediate can lose the CoA by an acyl-CoA hydrolase (AcyH) to give the corresponding acid, to be reduced to enoyl-CoA by an FAD+ dependent acyl-CoA dehydrogenase (ACyD) or even esterified to ethyl esters by a medium-chain fatty acid ester synthase [28].
  • acyl-CoA hydrolase AcyH
  • ACAD FAD+ dependent acyl-CoA dehydrogenase
  • enoyl-COA can be esterified into esters by an alcohol acetyltransferase, the nature of which remains to be identified.
  • suaveolens The enzymes of these two metabolic pathways were therefore determined in the crude extracts of the wild type and the M10 mutant of 5. suaveolens. Overall, the enzyme activities measured in the crude extracts of wild-type and mutant strains of 5. suaveolens were highly variable between cultures, which could be explained by the unexpected difficulty in breaking cells and obtain cell disruption reproducible. However, statistical analysis of the data allows us to be confident about enzymatic differences, when they occurred, between the mutant type and the wild type. Thus, the DC activity of the wild type of 5. suaveolens and of the M10 mutant was approximately comparable, whether the yeasts were cultured in YNB glucose supplemented or not with 1 gL 1 of isoleucine.
  • BCKAD activity which catalyzes the initial step of branched-chain amino acid oxidation, was also measured. It was found that while this enzyme showed similar activity between the mutant type and the wild type, its activity was 4 to 10 times lower than that of the enzymes downstream of the pathway. These data appear to be consistent with previous reports that argue that this enzyme may be rate-limiting in the catabolism of branched-chain amino acids through the P-oxidation pathway as has been reported in mammalian cells. In addition, this enzyme shows an activity at least 4 times lower than Ehrlich pathway enzymes, which could indicate that branched-chain amino acids would be preferentially catabolized by the Ehrlich pathway (EP), at least when yeast is grown with glucose as the carbon source.
  • EP Ehrlich pathway
  • suaveolens As mentioned previously, the overall activity of this esterase was similar in the two strains but was 2 times higher in a synthetic medium containing glucose and isoleucine, suggesting a positive effect of branched amino acids on the expression of genes encoding this esterase.
  • these enzymatic analyzes support the idea that the increased COV production in the M10 mutant of 5.
  • suaveolens can be explained by the almost complete absence of enoyl-CoA hydratase (ECH) activity.This loss of ECH activity in turn leads to an increased availability of the acyl-CoA and enoyl-CoA precursors for ester synthesis, and may explain the inability of this mutant to grow on branched amino acids.
  • ECH enoyl-CoA hydratase
  • UV mutagenesis has been employed to generate S. suaveolens mutants that harbor higher VOC production from branched-chain amino acids. Our selection was based on the inability to grow with these amino acids as the sole carbon source. It made it possible to isolate 9 mutants, one of which (the M10 mutant) proved to present 8 times more COV than the wild strain of 5. suaveolens. By determining the specific activities of key enzymes involved in isoleucine catabolism, we provided evidence that the higher production of VOCs observed in this mutant of 5. suaveolens is mainly due to the loss of activity of the isoleucine. enoyl-CoA hydratase and an increase in acyl-CoA hydrolase activity.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

L'invention se rapporte au domaine des arômes naturels utilisés dans le domaine de l'agroalimentaire. Plus particulièrement, l'invention concerne une souche de microorganisme génétiquement modifiée capable de produire de plus grandes quantités de composés organiques volatils d'intérêt, notamment des esters a-insaturés. Elle concerne également une méthode de criblage permettant de sélectionner de - des souches naturelles ou modifiées présentant ces caractéristiques, et un procédé de préparation d'une souche génétiquement modifiée pour produire des quantités satisfaisantes de composés organiques volatiles (COV), définis comme des composés organiques de masses moléculaires inférieures à 400 Da.

Description

SOUCHE DE MICROORGANISME GENETIQUEMENT AMELIOREE CAPABLE DE PRODUIRE DE PLUS GRANDES QUANTITES DE COMPOSES ORGANIQUES VOLATILS D'INTERET ET METHODE DE CRIBLAGE POUR OBTENIR DE TELLES SOUCHES
L'invention se rapporte au domaine des arômes naturels utilisés dans le domaine de l'agroalimentaire. Plus particulièrement, l'invention concerne une souche de microorganisme génétiquement modifiée capable de produire de plus grandes quantités de composés organiques volatils d'intérêt, notamment des esters a-insaturés. Elle concerne également une méthode de criblage permettant de sélectionner de - des souches naturelles ou modifiées présentant ces caractéristiques, et un procédé de préparation d'une souche génétiquement modifiée pour produire des quantités satisfaisantes de composés organiques volatiles (COV), définis comme des composés organiques de masses moléculaires inférieures à 400 Da.
Domaine de l'invention
La perception des arômes résulte d'un mélange complexe de composés organiques volatils (COV) qui sont des composés organiques de faible poids moléculaire (<400 Da), dans des proportions définies, qui confèrent l'originalité du goût des aliments. Jusqu'à présent, certains de ces composés aromatiques, comme le 2-phényléthanol qui donne l'odeur de rose, sont synthétisés chimiquement en raison de leur faible coût de production. Cependant, certains des arômes synthétisés chimiquement peuvent être modifiés lors de l'intégration des voies métaboliques humaines et être impliqués dans des maladies chroniques telles que les allergies, la diarrhée ou le cancer. Ces effets secondaires potentiels ainsi que la non-durabilité des processus chimiques ont suscité des inquiétudes chez les consommateurs qui deviennent progressivement plus conscients des risques associés à ces composés synthétiques, ainsi que des problèmes de durabilité des procédés et de sécurité alimentaire. L'extraction directe d'arômes naturels à partir de fruits ou de plantes pourrait répondre à la demande des consommateurs. Cependant, la production de ces arômes à partir de leur source naturelle dépend des conditions météorologiques de la saison, nécessite de grandes surfaces de terre en raison de leur faible concentration en plantes, ce qui peut réduire l'espace pour d'autres cultures destinées à l'alimentation. En outre, l'utilisation de solvants d'origine pétrolière est souvent nécessaire pour extraire ces arômes, ce qui peut porter atteinte à la qualification « naturelle » de ces produits.
Pour surmonter ces limitations, la production d'arômes par activité microbienne est une solution prometteuse, compte tenu du fait que les cultures microbiennes sont réalisées dans des bioréacteurs contrôlés et indépendamment de la saison. Cependant, cette approche microbienne présente d'importants goulots d'étranglement. Si certains systèmes microbiens produisent naturellement des arômes d'intérêt, c'est généralement à un faible rendement, un faible titre et une faible productivité, ce qui entraîne un coût de production élevé. Ce défi peut maintenant être relevé grâce aux outils et techniques bien maîtrisés d'ingénierie métabolique. De plus, tous les systèmes microbiens ne disposent pas des voies métaboliques permettant de produire des arômes. Pour résoudre ce problème, la ou les voies métaboliques qui permettent de produire ces produits spécifiques peuvent être modifiées ou reconstruites dans un microorganisme industriellement tel que 5. cerevisiae ou E. coli en appliquant des outils de biologie systémique et synthétique. Comme cette solution peut poser des problèmes d'acceptation sociétale du fait que le produit serait réalisé par des organismes génétiquement modifiés, une alternative à cette solution serait donc de rechercher, dans les écosystèmes encore largement inexplorés, de nouveaux micro-organismes capables de produire des composés aromatisants en quantité et en diversité.
À cet égard, les levures non conventionnelles présentent des capacités intéressantes de production d'arômes, comme Pichia kluyveri, Torulaspora delbrueckii, Candida stellate, Hanseniaspora delbrueckii, qui ont été signalées comme produisant des quantités élevées de plusieurs composés d'arômes comme le 2-phényléthanol, l'octanoate d'éthyle, l'acide butanoïque ou les esters phénoliques. Dans un travail précédent, les inventeurs ont isolé à partir de fruits du dragon de l'île de la Réunion, une souche de levure filamenteuse produisant des arômes, identifiée comme étant Saprochaete suaveolens. Cette espèce de levure produit des composés organiques volatils (COV) très diversifiés, parmi lesquels de nombreux esters ct- insaturés (tiglate d'isobutyle, tiglate d'isoamyle, tiglate de butyle, tiglate d'éthyle, 2- méthylpropanoate d'éthyle, 3-méthylbut-2-énoate d'éthyle, but-2-énoate d'éthyle) que l'on trouve rarement dans le bouquet aromatique d'autres espèces de Saccharomyces et non- Saccharomyces. Les inventeurs ont également démontré que la production de ces esters ct- insaturés par 5. suaveolens provient du catabolisme des acides aminés à chaîne ramifiée par la voie de la [3-oxydation (BOP). Une représentation simplifiée des voies métaboliques de ces acides aminés ramifiés est présentée dans la Figure 1. Brièvement, ces acides aminés ramifiés sont d'abord convertis en leur a-cétoacide ramifié correspondant dans une réaction catalysée par une transaminase (TA). Ensuite, chez les espèces Saccharomyces et non-Saccharomyces, l'a-cétoacide entre dans la voie d'Ehrlich (EP) qui implique une décarboxylation suivie soit d'une oxydation pour produire des acides carboxyliques sous l'action d'une aldéhyde déshydrogénase (AIDH), soit d'une réduction en alcools supérieurs sous l'action d'une alcool déshydrogénase (ADH). L'estérification des alcools supérieurs avec l'acétyl-CoA peut générer des acétates sous l'action catalytique d'une ester synthase ou d'une alcool-O- acétyltransférase (AFT). Une deuxième voie qui a été identifiée chez les champignons filamenteux mais absente chez Saccharomyces cerevisiae est la [3-oxydation de l'a-cétoacide à chaîne ramifiée en acétyl-CoA. Dans cette voie, l'intermédiaire a-céto-acide est décarboxylé par oxydation en un acyl-CoA, par la déshydrogénase des a-cétoacides à chaîne ramifiée (BCKAD) qui est l'enzyme régulant cette voie. L'acyl-CoA produit peut être entièrement dégradée en acétyl-CoA (+ propionyl COA dans le cas de la L-leucine et de la L-isoleucine) par la voie de la [3-oxydation. Alors que les levures peuvent produire des esters éthyliques par condensation d'acyl-CoA à chaîne courte ou moyenne dérivée de la dégradation des acides gras avec de l'éthanol ou des alcools supérieurs (voir Figure 1) dans un processus appelé « alcoolyse » catalysé par une acyl-CoA:éthanol-acyltransférase, une originalité constatée chez Saprochaete suaveolens est que l'intermédiaire énoyl-CoA dérivé de l'oxydation des acides aminés peut être estérifié avec des alcools pour donner naissance à divers esters ct- insaturés. Dans l'ensemble, la combinaison de la voie d'Ehrlich (EP) et de la voie de la - oxydation des acides gras (BOP) conduit à la production d'une nouvelle variété de COV, des esters a-insaturés, qui caractérisent le bouquet aromatique des espèces de Saprochaete et de Geotrichum.
L'identification de la capacité de la souche Saprochaete suaveolens à produire des COV d'intérêt ouvre de nouvelles perspectives dans la production d'arômes naturels complexes à haute valeur ajoutée. Toutefois, les quantités produites par la souche naturelle sont très faibles, ce qui ne permet pas d'envisager une exploitation industrielle.
Les professionnels de l'agroalimentaire recherchent de nouvelles sources d'arômes naturels pour pouvoir proposer aux consommateurs des produits de qualité tant sur le plan gustatif que de la sécurité alimentaire.
Exposé de l'invention
La présente invention s'articule autour d'un concept inventif commun à savoir la mise en évidence de l'existence d'une voie de synthèse des COV basée sur 6 activités enzymatiques particulières nécessaires pour la production de COV. Cette voie découle directement de l'établissement d'un lien fonctionnel entre d'une part la capacité/incapacité de souches de microorganisme, notamment de levures, à croître sur un milieu utilisant uniquement les acides aminés branchés comme source de carbone, et d'autre part leur capacité à produire des COV.
Les inventeurs ont tout d'abord mis en œuvre une méthode de criblage originale basée sur la capacité de croissance rapide des souches sur des milieux contenant des acides aminés à chaîne ramifiée (isoleucine, valine et leucine ; souches dites « ILV+ ») comme seule source de carbone. Puis, ils ont étudié la capacité des souches ILV+ à produire des COV d'intérêt, en particulier des esters a-insaturés, afin d'identifier des souches naturelles capables de produire des molécules d'arômes d'intérêt. Douze souches produisant des esters a-insaturés ont été isolées, dont deux produisant des esters a-insaturés non produits par la souche de référence 5. suaveolens, validant l'intérêt de cette méthode de criblage.
Dans la suite logique de ces premiers travaux, les inventeurs ont cherché à augmenter la quantité de COV produite par la souche 5. suaveolens. En considérant les voies métaboliques de la voie d'Ehrlich et la voie de la [3-oxydation décrites précédemment, les inventeurs ont émis l'hypothèse selon laquelle supprimer la capacité naturelle de 5. suaveolens à se développer sur des acides aminés à chaîne ramifiée pourrait être utilisée comme une approche pour améliorer la production de COV. En l'absence de connaissance fine du génome de cette espèce dont la séquence nucléotidique brute n'a été que récemment publiée, une approche de criblage basée sur la mutagenèse aléatoire a été choisie pour cribler les mutants de 5. suaveolens incapables de croître sur des milieux comportant uniquement des acides aminés ramifiés (leucine, isoleucine et valine ; souches dites « ILV- ») comme seule source de carbone. Neuf mutants présentant ce phénotype ont été isolés et leurs COV ont été quantifiés. L'une d'entre elles s'est avérée présenter le phénotype attendu de producteur de COV plus élevé. La détermination des activités des enzymes impliquées dans le catabolisme des acides aminés à chaîne ramifiée par les voies d'Ehrlich et de la [3-oxydation a montré que l'accumulation plus élevée de COV dans ce mutant coïncidait avec une perte presque complète de l'activité de l'énoyl-CoA hydratase et une augmentation de 2 fois de I'acyl-CoA hydrolase.
Ce résultat établit que la combinaison de ces deux caractéristiques - (i) absence d'activité énoyl-CoA hydratase et (ii) activité acyl-CoA hydrolase soutenue - peut être utilisée pour préparer des souches de micro-organismes dont la capacité à produire des COV est augmentée, notamment des esters a-insaturés.
Sur la base de ce criblage, les inventeurs proposent de sélectionner des souches capables de produire des COV, en particulier des esters a-insaturés, et qui présentent un intérêt soit pour la diversité des molécules d'arômes produites, soit pour leur niveau de production. Ces souches peuvent ensuite être exploitées telles que ou modifiées génétiquement pour améliorer leurs performances de rendement.
Du fait de la connaissance des enzymes impliquées dans les voies de Ehrlich et dans la béta- oxydation des acides gras et des acides aminés, il est maintenant possible de modifier des souches de microorganisme non productrices de COV en souche capable d'en produire. Il est particulièrement intéressant de pouvoir transposer les résultats obtenus à partir de 5. suaveolens dans des microorganismes utilisés pour la bioproduction de composés d'intérêt dont la manipulation génétique est maîtrisée, tel que Saccharomyces cerevisiae.
Ainsi, l'invention concerne une souche de microorganisme génétiquement modifiée capable de produire des composés organiques volatils caractérisée en ce que : elle exprime les activités transaminase (TA), décarboxylase des céto-acides à chaîne ramifiée (BCKAD), acyl-CoA déhydrogénase (ACyD), alcool acyl transférase (AAT) et acyl CoA hydrolase (ACyH) par expression ou surexpression des gènes responsables de ces activités ; son activité enoyl-CoA hydratase (ECH) est réduite/supprimée, si une telle activité est présente dans ledit microorganisme.
L'invention concerne également le criblage de souches de levures capables de produire des COV consistant à : sélectionner, dans des isolats naturels, les souches capables de croître sur un milieu ne contenant que des acides aminés branchés (isoleucine, leucine et valine, souches « ILV+ ») comme source de carbone quantifier la production de COV dans les souches isolées sélectionner les souches capables de produire la quantité requise de COV.
Elle concerne aussi une méthode de criblage de souche de microorganisme mutée présentant une production en COV augmentée par rapport à la souche-mère de référence non mutée capable de produire des COV.
Ainsi, la présente invention concerne aussi un procédé de préparation d'une souche de microorganisme génétiquement modifiée dans laquelle la production de COV est augmentée.
Avantages de l'invention
La présente invention présente l'avantage de décrire une nouvelle méthode de criblage de souches naturellement productrices de COV d'intérêt, en particulier des esters a-insaturés aux notes aromatiques, basée sur leur capacité à croître sur un milieu ne contenant que des acides aminés branchés comme source de carbone. Cette méthode est simple et rapide.
L'invention propose également de cribler parmi des souches productrices de COV d'intérêt, des souches mutantes ayant acquis la capacité à produire des COV en plus grande quantité. Cette méthode de criblage est simple d'analyse et rapide à mettre en œuvre. Elle consiste en une mutagenèse aléatoire suivie d'une sélection sur un milieu ne contenant que des acides aminés branchés comme source de carbone. Les techniques de mutagenèse aléatoires génèrent un très grand nombre de souches portant potentiellement la mutation recherchée et nécessitent donc une méthode subséquente de criblage qui soit rapide. Or, le criblage de microorganismes pour la production de COVs est aujourd'hui essentiellement basé sur des méthodes chromatographiques qui peuvent s'avérer très chronophages lorsque le nombre de souches à analyser est élevé. Les inventeurs proposent une approche innovante basée sur un criblage physiologique établi en posant l'hypothèse que la capacité des souches à croître sur un milieu contenant les acides aminés branchés isoleucine, leucine ou valine (milieu ILV) est à l'origine d'une diminution de rendement en production de COV. Il s'agit donc de sélectionner, à partir d'une souche mère productrice de COV d'intérêt, des souches mutantes ayant perdu la capacité à croître sur milieu ILV comme seule source de carbone. Ces souches mutantes ont potentiellement augmenté leur production de COV en favorisant le flux d'acides aminés branchés vers la voie de production des arômes. La pertinence de cette approche est confirmée par les résultats expérimentaux décrits ci-après et l'identification d'une souche mutante répondant à ces critères de sélection. La présente invention décrit également une souche de levure 5. suaveolens génétiquement modifiée capable de produire des COV totaux à un niveau significativement supérieur à celui des souches actuellement disponibles (les données expérimentales montrent une augmentation d'un facteur 8 de la quantité de COV totaux). Elle permet d'envisager une production à l'échelle industrielle. Les seuils de production cible étant propres à chaque exploitation.
Enfin la présente invention fournit une méthode de préparation d'un microorganisme capable de produire des COV, notamment des esters a-insaturés, consistant à : réduire ou éliminer l'activité de I'enoyl-CoA hydratase, si cette activité est présente dans le microorganisme ciblé, et à augmenter l'activité de I'acyl-CoA hydrolase si elle est présente ou à l'apporter si elle n'est pas présente dans le microorganisme ciblé. Cette méthode est applicable à un grand nombre de cellules, en particulier aux cellules validées pour la production industrielle, telles que 5. cerevisae.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Un premier objet de l'invention concerne une souche de microorganisme génétiquement modifiée capable de produire des composés organiques volatils caractérisée en ce que : elle exprime les activités transaminase (TA), décarboxylase des céto-acides à chaîne ramifiée (BCKAD), Acyl-Coa déhydrogenase (ACyD), alcool acyl transférase (AAT) et acyl CoA hydrolase (ACyH) par expression ou surexpression des gènes responsables de ces activités ; son activité enoyl-CoA hydratase (ECH) est réduite/supprimée, si une telle activité est présente dans ledit microorganisme.
La préparation d'une telle souche est possible du fait que les voies de synthèse des COV ont été identifiées par les inventeurs, de sorte que les gènes dont l'expression doit être présente/augmentée et ceux dont l'expression doit être diminuée/supprimer sont ici définis. L'homme du métier dispose des bases de données pour identifier les séquences des gènes pouvant être modifiés et des méthodes de biologie molécule et cellulaire pour mettre en œuvre la présente invention.
Par « microorganisme » au sens de l'invention, on entend au sens de l'invention de préférence une levure, une bactérie ou un champignon. Des exemples particuliers sont 5. suaveolens, S. cerevisae, E. coli, Aspergillus sp.
Les niveaux de production à atteindre dépendent du COV recherché. Pour un microorganisme qui ne produit pas naturellement de COV, l'invention est mise en œuvre dès que celui-ci est capable de produire des COV. Pour un microorganisme qui produit naturellement des COV, l'invention permet une augmentation du niveau de production total des COV d'un facteur 1,5 ou plus. A titre indicatif, les souches selon l'invention produisent au moins 1000 mg/L de COV totaux, et de manière préférée au moins 1500 mg/L, encore plus préférée au moins 2000 mg/L d'espace de tête après 48h de croissance. Plus particulièrement, les souches selon l'invention produisent au moins 400 mg/L d'esters alpha-insaturés, et de manière préférée au moins 800 mg/L, encore plus préférée au moins 1000 mg/L d'espace de tête après 48h de croissance. Les COV étant des composés par nature « volatils », ils se retrouvent après production dans la phase gazeuse se situant au-dessus du milieu de culture que l'on appelle « espace de tête » ; leur récupération et leur quantification peut se faire à partir de cette phase gazeuse, ou d'autres techniques comme la distillation.
Ces quantités produites par les souches modifiées sont à considérer en comparaison avec les quantités produites par les mêmes souches non modifiées. A titre d'exemple, la souche M10 décrite dans la partie expérimentale produit 1800 mg/L de COV totaux contre 231 mg/L pour la souche sauvage.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le microorganisme est une souche de 5. suaveolens capable de produire des COV et qui a été génétiquement modifiée afin d'augmenter cette production, dans laquelle on a augmenté l'activité de l'acyl CoA hydrolase et réduit/supprimé l'activité de I'enoyl-CoA hydratase. Une telle souche produit plus de COV totaux après modification génétique ; de préférence, elle produit 1,5 fois, 2 fois, 5 fois, 10 fois plus de COV que la souche naturelle.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les COV produits ou dont la production est augmentée sont des esters alpha-insaturés. Ces composés sont des composés ayant des propriétés aromatiques particulièrement intéressantes.
Par « esters a-insaturés », on entend en particulier le tiglate d'isobutyle, le tiglate d'isoamyle et le tiglate d'éthyle.
Dans un premier mode de réalisation, une souche selon l'invention est une souche génétiquement modifiée obtenue à partir d'une souche initiale (avant modification génétique) produisant un niveau basal d'esters a-insaturés et dans laquelle les modifications génétiques consistent en une réduction de l'activité de l'enzyme enoyl-CoA hydratase et une augmentation de l'activité acyl-CoA hydrolase par rapport à la souche initiale. Une telle souche peut être une souche de levure Saprochaete suaveolens.
A titre d'exemple, une souche de microorganisme selon ce mode de réalisation peut être une souche dans laquelle l'activité de l'enzyme enoyl-CoA hydratase est réduite et l'activité de l'enzyme acyl-CoA hydrolase est augmentée d'au moins 50% par rapport à l'activité de la souche initiale. Dans un second mode de réalisation, une souche selon l'invention est une souche génétiquement modifiée obtenue à partir d'une souche initiale (avant modification génétique) ne produisant pas d'esters a-insaturés et dans laquelle les modifications génétiques consistent en (i) une expression ou surexpression des activités transaminase (TA), décarboxylase des céto-acides à chaîne ramifiée (BCKAD), Acyl-CoA déhydrogénase (ACyD), alcool acyl transférase (AAT) et acyl CoA hydrolase (ACyH) (par expression ou surexpression des gènes responsables de ces activités) et (ii) une réduction ou élimination de l'activité de l'enzyme enoyl-CoA hydratase (ECH) si elle existe. Une telle souche peut être 5. cerevisiae ou Escherichia coli.
Un deuxième objet de l'invention concerne une méthode de criblage de souches de microorganisme capables de produire des COV consistant à : isoler dans des milieux naturels, les souches capables de croître sur des milieux de culture contenant au moins un acide aminé branché (isoleucine, leucine ou valine) comme seule source de carbone quantifier la production d'esters a-insaturés dans les souches isolées sélectionner les souches capables de produire la quantité requise d'esters a-insaturés.
Cette méthode peut être utilisée soit pour sélectionner directement des souches produisant des COV, notamment des esters a-insaturés (par exemple au moins 400 mg/L d'espace de tête d'esters a-insaturés), soit pour sélectionner des souches produisant des COV d'intérêt à un niveau inférieur à un niveau cible d'intérêt (par exemple inférieur à 400 mg/L d'esters a- insaturés en espace de tête) et pouvant être modifiées pour augmenter cette production.
Ainsi, cette méthode de criblage peut être intégrée en tant que première étape aux méthodes décrites ci-après.
Les milieux naturels dans lesquels sont recherchées les souches peuvent être des échantillons de sols, des flores microbiennes végétales ou tout autre milieu naturel susceptible de contenir des microorganismes.
Un troisième objet de l'invention concerne une méthode de criblage de souche de microorganisme mutée présentant une production en COV augmentée par rapport à la souche mère de référence non mutée capable de produire des COV, comprenant les étapes de : a. Mutagénèse aléatoire par irradiations UV d'isolats de souches de microorganisme « souches mère » sur milieu contenant du glucose comme seule source de carbone b. Transfert de chacune des souches irradiées de sorte à obtenir quatre séries de souches identiques c. Transfert sur milieu de culture en parallèle desdites quatre séries de souches irradiées, o ladite première série de souches sur un milieu contenant du glucose (milieu glucose) comme seule source de carbone o ladite deuxième série sur un milieu contenant de l'isoleucine comme seule source de carbone o ladite troisième série sur un milieu contenant de la leucine comme seule source de carbone o ladite quatrième un milieu contenant de la valine comme seule source de carbone d. Identification des mutants se développant sur milieu glucose mais incapables de croître sur les milieux contenant uniquement de l'isoleucine de la leucine ou de la valine comme seule source de carbone, parmi les souches initialement irradiées de criblage e. Quantification de la production de COV de chacune des souches correspondantes aux souches incapables de croître sur milieu contenant uniquement de l'isoleucine de la leucine ou de la valine comme seule source de carbone f. Sélection des souches incapables de croître sur milieu contenant uniquement de l'isoleucine de la leucine ou de la valine comme seule source de carbone, qui produisent une plus grande quantité de COV que la souche mère.
De manière préférée, la quantification de la production des COV se fait par chromatographie, en particulier chromatographie gazeuse. Cette analyse peut être à la fois quantitative mais aussi qualitative quant aux COV produits.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les souches sélectionnées produisent au moins 400 mg/L d'esters a-insaturés en espace de tête. Une augmentation de production peut également s'évaluer par comparaison avec le niveau de production de la souche avant mutagenèse, et être appliquée aux COV en général ou aux esters a-insaturés, ou à un ester a- insaturé particulier tel que le tiglate d'éthyle.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les souches mères de référence non mutées capables de produire des esters a-insaturés sont sélectionnées par la méthode de criblage de souches à partir d'isolats naturels telle que décrites précédemment.
Un quatrième objet de l'invention concerne un procédé de préparation d'une souche de microorganisme génétiquement modifiée dans laquelle la production de COV est augmentée consistant à : a. Disposer d'une souche produisant un niveau basal d'esters a-insaturés b. Réduire l'activité enoyl-CoA hydratase c. Augmenter l'activité acyl-coA hydrolase d. Quantifier les COV produits pour sélectionner les souches d'intérêt
Les étapes b. et c. peuvent être réalisées par mutagénèse du(des) gène(s) codant pour ces enzymes. Un cinquième objet de l'invention concerne un procédé de préparation d'une souche de microorganisme génétiquement modifiée capable de produire des COV consistant à : a. Disposer d'une souche ne produisant pas de COV b. Introduire une ou plusieurs cassettes d'expression géniques contenant les gènes responsables de l'expression des enzymes transaminase (TA), décarboxylase des céto-acides à chaîne ramifiée (BCKAD), acyl-CoA déhydrogenase (ACyD), alcool acyl transférase (AAT) et acyl CoA hydrolase. c. Réduire ou supprimer l'activité enoyl-CoA hydratase par mutagenèse, si une telle activité est présente dans ledit microorganisme d. Quantifier les COV produits pour sélectionner les souches d'intérêt.
Les étapes b. et c. peuvent être réalisées par mutagénèse du(des) gène(s) codant pour ces enzymes.
Dans les procédés de préparation décrits précédemment, la réduction de l'activité enoyl-CoA hydratase (ECH) peut être obtenue par mutation ou délétion du gène responsable de l'activité ECH ou d'un gène régulateur de l'expression du gène ECH.
De même, l'augmentation des activités transaminase (TA), décarboxylase des céto-acides à chaîne ramifiée (BCKAD), acyl-CoA déhydrogénase (ACyD), alcool acyl transférase (AAT) et acyl-CoA hydrolase (ACyH) peut être obtenue par ajout d'un ou plusieurs copies du gène ACyH ou de la modification du système de régulation de son expression (promoteur, enhancer, protéines régulatrices...).
Ces deux modifications sont, de préférence, obtenues par mutagénèse du(des) gène(s) codant pour ces enzymes.
La présente invention sera mieux comprise à la lecture des exemples qui suivent, fournis à titre d'illustration et ne devant en aucun cas être considérés comme limitant la portée de la présente invention.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 : Schéma simplifié du catabolisme des acides aminés à chaîne ramifiée impliquant la voie d'Ehrlich (EP) et la voie de la [3-oxydation (BOP) chez Saprochaete suaveolens.
Abréviation : TA : transaminase ; BCKAD : cétoacide déshydrogénase à chaîne ramifiée ; ADH : alcool déshydrogénase ; DC : décarboxylase ; ACyD : acyl-CoA déshydrogénase dépendante du FAD ; ACyH : acyl-CoA hydrolase ; ECH : énoyl-CoA hydratase ; ACyDH : -acyl-CoA déshydrogénase dépendante du NAD, KT : -céto acyl-CoA thiolase ; AAT : alcool acyl transférase ; ACyH : acyl-CoA hydrolase. Figure 2 : Courbe représentative des scores de PC2 par rapport à PCI selon la production d'arômes des souches et leurs origines L'analyse des composantes a été réalisée à l'aide du logiciel XLStat Applied Sensory (2020.1.3). Le groupe 1 comprenait S13, S18, S21, S37, S38, S70, S74, S82, S84, S105 et S106. Le groupe 2 était composé uniquement de S88. Le groupe 3 comprenait S3, S12, S64, S68, S75 et S91. Le groupe 4 comprenait S27, S99 et S100.
Figure 3 : Analyse de regroupement des souches isolées produisant des COV. Les souches ont été regroupées sur la base de leur production d'arômes et de leur origine en utilisant la méthode de Ward et en utilisant le logiciel XL Stat Applied Sensory (2020.1.3). La troncature automatique (ligne pointillée) a permis d'identifier quatre groupes cohérents de souches. La plupart des souches ont été classées dans le groupe 1 (11 souches) et le groupe 3 (6 souches). Le groupe 4 comprenait trois souches. La souche S88 s'est retrouvée seule dans le groupe 2. Le dendrogramme est plus aplati pour le groupe 4, ce qui suggère que ce groupe de souches est plus homogène que les deux autres groupes.
Figure 4 : Taux de survie de 5. suaveolens en fonction du temps d'exposition aux UV. Les valeurs sont celles de huit expériences indépendantes, la valeur standard étant présentée sous forme de barre verticale.
Figure 5 : COV totaux déterminés par chromatographie en phase gazeuse couplée à un détecteur de spectre de masse (HS-SPME-GC/MS) produits par la souche sauvage de Saprochaete suaveolens et 9 mutants ILV- isolés. Les données présentées sont la moyenne ± SD de trois cultures indépendantes.
Figure 6 : Analyse en composantes principales (ACP) des COV produits par la souche sauvage de Saprochaete suaveolens sauvage et ses 9 mutants ILV- générés par irradiations UV.
Figure 7 : Représentation par carte en mode code couleur des COV déterminés dans le type sauvage et dans 9 mutants ILV- de 5. suaveolens obtenus par mutagenèse UV. Les données sont représentées sous forme de ratio de la valeur des COV dans le mutant par rapport au type sauvage. Les COV ont été classés comme provenant principalement de la voie d'Ehrlich (EP), des intermédiaires acyl-COA ou enoyl-COA de la voie d'oxydation.
PARTIE EXPERIMENTALE
EXEMPLE 1 : Criblage de la biodiversité des levures provenant des fèces d'animaux sauvages d'Afrique du Sud pour la production d'esters a-insaturés volatils
I. Matériels et méthodes Matériaux biologiques
Le type sauvage Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 112-2N (van Dijken) étal., 2000) a été utilisé dans cette étude. Une souche de Saprochaete suaveolens (anciennement Geotrichum fragrans) précédemment isolée de fruits de Pitaya (Hylecereus polyrhisus) à l'île de la Réunion, en France (Grondin et al., 2015a) a également été utilisée.
Des fèces fraîches d'animaux sauvages ont été collectées de manière aseptique dans différents endroits des zoos, des réserves et des parcs nationaux d'Afrique du Sud. La collecte a été effectuée en conditions stériles et les échantillons ont ensuite été conservés à 4°C jusqu'à leur utilisation. En outre, des échantillons lyophilisés de fèces d'animaux sauvages ont été obtenus par un donateur anonyme. Un total de 118 échantillons a été étudié.
Isolement et sélection des souches de levure ILV+.
Pour les échantillons sur écouvillon, les écouvillons étaient ajoutés directement à 10 ml de solution de Ringer stérile. Pour les échantillons en tube, 1 g de fèces a été pesé au préalable et dissous dans la solution de Ringer. Des dilutions en série ont ensuite été préparées et 100 pL de chaque dilution ont été étalés à la surface d'un milieu agar Yeast-Peptone-Dextrose (Biolab diagnostics LTD, Afrique du Sud) complété par 0,1 g.L 1 de chloramphénicol (EMDQ. Millipore Corp. Billerica, MA USA) (YPD-chloramphénicol) pour favoriser la croissance et la sélection des levures. Les boîtes de Pétri ont ensuite été incubées à 30°C pendant 48 heures jusqu'à ce que les colonies cellulaires soient complètement formées. Les colonies ont ensuite été isolées en répétant la sous-culture sur milieu gélosé YPD-chloramphénicol et conservées à 4°C. Pour les échantillons lyophilisés, 1 g de fèces a été remis en suspension dans 10 ml de bouillon nutritif stérile (Merck, Afrique du Sud) et mélangé au vortex avant d'être incubé à 25°C pendant 5 jours avant d'être ensemencé sur un milieu YPD-chloramphénicol.
La sélection des souches capables de se développer sur des milieux contenant uniquement des acides aminés à chaîne ramifiée (isoleucine, leucine et valine) comme seule source de carbone (souches ILV+) a été effectuée comme suit. 5 ml de bouillon YPD ont été inoculés avec chaque souche isolée et la culture a été incubée pendant la nuit à 30°C sous agitation. Après centrifugation de la culture (13 000 rpm, 5min), le culot cellulaire a été lavé deux fois avec 5 mL d'eau physiologique stérile et remis en suspension dans 10 mL d'eau physiologique stérile. Ensuite, une culture de 106 cellules. mL 1 a été préparée dans de l'eau physiologique stérile et des cultures de 105 et 104 cellules. mL 1 ont été préparées par dilution en série. 5pL de chaque suspension ont été déposés deux fois sur un milieu YNB (base levure - azote) complété par lg.L 1 d'isoleucine, leucine ou valine ou par 2 g. L 1 de glucose (YNB-lle, YNB-Leu, YNB-Val, YNB- Glc respectivement). Les souches 5. suaveolens et 5. cerevisiae ont été préparées selon le même protocole et ont été utilisées comme témoins positifs et négatifs, respectivement. Les boîtes de Pétri ont ensuite été incubées pendant 48 heures à 30°C avant lecture.
Analyse qualitative et semi-quantitative des composés organiques volatils (COV)
Les souches ont été inoculées dans un tube à vis de 20 mL contenant 15 mL de milieu YPD- agar penché et incubées à 30°C pendant 24 heures. Ensuite, les flacons ont été scellés et incubés pendant 24 heures à 30°C. Pour l'analyse qualitative, l'espace de tête des cultures inclinées a été directement soumis à une microextraction en phase solide (HS-SPME) à l'aide d'une fibre de 2 cm de long recouverte de 50/30 pm de divinylbenzène/Carboxène sur polydiméthylsiloxane lié à un noyau flexible de silice fondue (Supelco). Pour l'analyse semi- quantitative, avant la microextraction, 10 pL d'octan-l-ol (à 0,5 g.L 1 dans du dichlorométhane) ont été ajoutés dans les tubes scellés comme standard interne. La fibre a ensuite été exposée à l'espace de tête des souches pendant 15 min à 30°C et insérée dans le port d'injection à 250°C pendant 2 min. Les métabolites ont été séparés par chromatographie en phase gazeuse (GC) à l'aide d'une colonne ZB-5MSI (30m * 0,32mm * 0,25 pm d'épaisseur de film), couplée à un spectromètre de masse (Shimadzu GCMS-Q.P2010 Ultra). Le gaz vecteur (H2) a été réglé à un débit de 1,4 mL.min -1. La température de la colonne a été maintenue à 45°C pendant 2 min et a été portée à 230°C à raison de 4°C.min -1. Cette température a été maintenue pendant 5 min avant la fin. Les composés organiques volatils ont été identifiés en comparant leurs spectres de masse et leur indice de Kovats expérimental avec la base de données NIST (www.chemdata.nist.gov).
PCR en colonies
La PCR de colonie a été réalisée en utilisant des cellules fraîches comme modèle amplifîable. Les cellules ont été prélevées directement d'une colonie de levure fraîche à l'aide d'une anse de lpL. Les cellules ont été mises en suspension dans lOOpL de mélange réactionnel PCR contenant 0,5pM d'amorces ITS1 (5' TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3') ou NL1 (5'- GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG), 0.5 pM d'amorce ITS4 (5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC 3') ou NL4 (5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG), 200 pM de chaque désoxynucléotide, 1 x de tampon et 2,5 unités d'ADN polymérase (Qiagen). Les conditions de PCR étaient les suivantes : dénaturation initiale à 95°C pendant 5 min ; 35 cycles de dénaturation à 94°C pendant 1 min, 1 min de recuit des amorces à 55,5°C pendant 1min, 1 min d'extension à 72°C, et une extension finale à 72°C pendant 10min.
Les produits PCR ont été analysés par électrophorèse sur des gels d'agarose à 2%, avec un tampon TAE 1 x à 100V pendant 20 min. Les gels ont été colorés avec du Midori Green (Nippon Genetics Europe) et visualisés sous lumière UV. Les tailles ont été estimées par comparaison avec une échelle d'ADN de 1 kbp (1 kbp ladder, Gene O'ruler, ThermoFischer). L'identification des souches a été réalisée par séquençage des produits PCR obtenus par Eurofins Genomics (Allemagne). Les séquences ont été analysées en utilisant BLAST au NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).
Analyse statistique
Les données expérimentales ont été soumises à une analyse factorielle (méthode d'analyse en composantes principales) et à une analyse en grappes (méthode de Ward) à l'aide du logiciel XLStat Applied Sensory (2020.1.3) Il - Résultats et discussion
Sélection de souches à forte capacité de production de COV
En 2015, Grondin et ses collègues ont montré que les esters a-insaturés étaient produits par S. suaveolens par estérification de l'intermédiaire énoyl-CoA de la voie de la [3-oxydation des acides aminés à chaîne ramifiée (Grondin et al., 2015). Le catabolisme de l'intermédiaire énoyl-CoA par la voie de la [3-oxydation conduit à la production d'acétyl-CoA qui peut ensuite être métabolisé via le cycle TCA et le shunt glycoxylique. Cette propriété spécifique du métabolisme de 5. suaveolens a été utilisée comme base pour le développement d'une méthode de sélection utilisant la capacité des levures à se développer sur des milieux contenant uniquement des acides aminés à chaîne ramifiée (isoleucine, leucine et valine) comme seule source de carbone (souches ILV+). En faisant l'hypothèse que cette méthode permettrait de sélectionner des souches surproduisant des esters a-insaturés, nous avons recherché des souches ILV+ parmi les 119 souches isolées des fèces d'animaux sauvages, tout en utilisant 5. suaveolens et 5. cerevisiae comme contrôle positif et négatif respectivement. De manière surprenante, nous avons constaté que 43 des 119 souches testées présentaient les critères ILV+.
Les volatilomes des souches sélectionnées, c'est-à-dire les composés organiques volatils produits par toutes les souches ILV+ (43 souches isolées des fèces et le témoin positif 5. suaveolens S0) ont été extraits par microextraction en phase solide de l'espace de tête, et analysés par chromatographie en phase gazeuse couplée à un détecteur de spectrométrie de masse (HS-SPME-GC/MS) après 48h de croissance sur un milieu YPD à 30°C. Parmi les 43 souches ILV+, 21 souches, à savoir S4, S17, S22, S28, S33, S40, S44, S58, S60, S62, S63, S65, S72, S78, S92, S97, S117, S121, S123, S124 et S125, n'ont produit aucun COV. Cela suggère que pour ces souches, la voie d'Ehrlich est inactive. De plus, cela démontre que l'assimilation de l'isoleucine, de la leucine et de la valine dans la voie de la [3-oxydation ne peut pas être strictement liée à la production d'arômes. Un total de 50 COV différents a été détecté dans le volatilome des 22 souches restantes et de 5. suaveolens. Ces COV ont été classés en quatre catégories, à savoir les acides, les alcools, les esters et les esters a-insaturés.
Analyse multivariée des isolats en fonction de leur production de composés organiques volatils.
Pour mieux visualiser le comportement des souches en ce qui concerne leur performance de production de COV (nombre de COV) une analyse en composantes principales (ACP) a été effectuée sur les 22 souches sélectionnées qui produisaient des COV (Figures 2 et 3).
Le nombre d'acides n'a été corrélé à aucun des autres paramètres, probablement parce qu'ils ne représentent qu'une petite partie des COV détectés par rapport aux autres catégories de COV. Cependant, nous avons noté une corrélation entre les autres paramètres de COV. Par exemple, le nombre total de COV était fortement corrélé avec le nombre d'esters (corrélation de Pearson r de 0.990) et le nombre d'esters a-insaturés (r=0.938) mais il était négativement corrélé avec le nombre d'alcools (1, correspondant au 2-phényléthanol, r=-0.514), ce qui signifie que les esters et les esters a-insaturés participent significativement au nombre total de COV. Ainsi, nous avons également identifié un certain nombre d'esters et d'esters ct- insaturés qui étaient fortement corrélés entre eux (r= 0,903), mais ils étaient tous deux négativement liés au nombre d'alcools (r= -0,560 et r=-0, 551 respectivement), ce qui signifie que les volatilomes des souches qui contenaient beaucoup d'esters (insaturés ou non), ne présentaient pas d'alcool. Nous avons finalement conclu qu'il n'y avait pas de corrélation significative entre les paramètres des COV et l'origine des souches.
Analyse des COV produits par toutes les souches productrices d'arômes
La majeure partie des COV provient du catabolisme des acides aminés. Par exemple, le 2- méthylbutanoate d'éthyle et le 3-méthylbutanoate d'éthyle sont probablement produits dans la voie d'Ehrlich via le catabolisme de l'isoleucine et de la leucine respectivement (Hazelwood et al., 2008). De plus, le 2-méthylbut-2-énoate d'éthyle et le 3-méthylbut-2-énoate d'éthyle sont probablement aussi produits par le catabolisme de l'isoleucine et de la leucine, mais par la voie de la [3-oxydation (Grondin et al., 2015). Selon la base de données des voies métaboliques KEGG (www.genome.jp), les principales voies métaboliques impliquées dans la production des autres COV détectés dans cette étude sont la voie de la [3-oxydation des acides gras (hexanoate d'éthyle, octanoate d'éthyle, etc.), la voie du butanoate (acétate de butyle, butanoate de butyle, butanoate d'éthyle, etc.), la voie du propanoate (propanoate de butyle) et la voie du pentanoate (pentanoate d'éthyle). Enfin, certains esters résultent probablement de l'estérification de deux unités générées par deux voies métaboliques différentes. Par exemple, la formation du butanoate de 2-méthylbutyle est probablement générée par l'estérification du 2-méthylbutanol (synthétisé par la voie d'Ehrlich) et de l'acide butanoïque (synthétisé par la voie du butanoate).
Les esters représentent 37 des 50 COV détectés dans cette étude. Ils sont présents dans le volatilome de toutes les souches, à l'exception des souches S74 et S82 qui ne produisent que du 2-phényléthanol. Les souches S0 (5. suaveolens), S12 et S91 présentaient les plus grandes diversités d'esters dans leur volatilome. Le volatilome de S0 présentait la plus grande diversité d'esters, avec 30 composés différents de cette catégorie détectés. Parmi ceux-ci, 13 esters n'ont pas été identifiés dans les autres souches étudiées dans cette étude. Cependant, le butanoate de pentyle, qui dégage un arôme d'abricot-ananas fréquemment utilisé dans l'alimentation et la parfumerie, n'a pas été détecté dans le volatilome de S0, mais l'a été dans les souches S12 et S91. Ce résultat est intéressant car ce composé est surtout présent dans les fruits (pomme et fève de cacao) mais rarement détecté dans le volatilome des microorganismes.
Enfin, 9 esters a-insaturés différents ont été détectés dans les souches S0 et S12 des 22 souches productrices de COV. Les 10 souches restantes ne présentaient aucun ester a- insaturé dans leur volatilome, ce qui signifie que le critère ILV+ ne peut pas être strictement lié à la production d'esters a-insaturés. Les esters a-insaturés les plus fréquemment détectés étaient le 3-méthylbut-2-énoate d'éthyle (également appelé 3-méthylcrotonate d'éthyle) et le 2-méthylbut-2-énoate d'éthyle (ou tiglate d'éthyle), produits via la [3-oxydation de la leucine et de l'isoleucine respectivement. Deux esters a-insaturés étaient produits par des souches issues de la faune sud-africaine mais pas par la souche S0. Le premier était le 3-méthylbut-2- ènoate de 3-méthylbutyle (description de l'arôme inconnue), produit uniquement par la souche S12 alors que le second était l'hex-2-ènoate d'éthyle (arôme fruité) qui était produit à la fois par les souches S12 et S91. Ces composés étant tous deux rarement décrits dans le volatilome de levure, il a été décidé d'étudier plus en détail les souches S12 provenant de fèces de chat à pieds noirs (Felis nigripes) et S91 provenant de serval (Leptailruus serval).
L'analyse semi-quantitative des COV produits par les souches S12, S91 et S0 a montré que S0 produit plus de 50 fois plus de COV que S12 et S91. Cela a mis en évidence que le métabolisme aromatique de S0 est beaucoup plus actif que celui de S12 et S91 pour la production d'alcool, d'esters et d'esters a-insaturés. D'un point de vue quantitatif, les souches S12 et S91 présentaient une production globale de COV similaire (=4,9 mg/L) mais également en termes d'esters (=4,0 mg/L) et d'esters a-insaturés (=0,6 mg/L), suggérant que ces deux souches possèdent un patrimoine génétique très proche. Ceci a été confirmé par les résultats d'amplification et de séquençage de la région non-codante et variable de l'espaceur transcrit interne ribosomique (ITS) et du domaine D1/D2. En effet, les analyses et les BLAST (NCBI) des séquences des régions ITS ou D1/D2 n'ont pas permis de distinguer les souches S12 et S91 l'une de l'autre puisque ces deux souches présentaient des séquences nucléotidiques 100% identiques à celle de la souche Galactomyces Candidas (Geotrichum candidum MK381259.1).
Les données de la littérature mentionnent déjà la production d'esters a-insaturés par Galactomyces candidus (Grondin et al., 2017 ; Simon Amoikon et al., 2020) mais aucune ne rapporte la production de 3-méthylbut-2-ènoate de 3-méthylbutyle et d'hex-2-ènoate d'éthyle pour cette souche. Dans notre étude, ces composés étaient produits à des concentrations très faibles par les souches S12 et S91 (=3 pg/L et 12 pg/L respectivement) mais la production d'hex-2-ènoate d'éthyle atteignait 110 pg/L pour la souche S91. Comme les données moléculaires n'ont pas permis de distinguer la souche S12 de la souche S91, la différence de leur volatilome respective suggère qu'ils appartiennent à des sous-espèces différentes.
Conclusion
Ce travail visait à isoler des souches productrices d'esters a-insaturés dans les fèces de la faune sauvage d'Afrique du Sud par une stratégie basée sur le métabolisme de 5. suaveolens, pris comme modèle pour sa capacité à se développer sur des milieux contenant uniquement des acides aminés branchés comme source de carbone (ILV+) couplée à sa production d'esters a- insaturés. 12 souches productrices d'esters a-insaturés ont été isolées.
Parmi les souches isolées, deux souches, à savoir S12 et S91, toutes deux identifiées comme Galactomyces candidus (Geotrichum candidum) produisaient des esters a-insaturés, à savoir le 3-méthylbut-2-ènoate de 3-méthylbutyle et l'hex-2-ènoate d'éthyle, qui ne sont pas produits par la souche modèle de 5. suaveolens. Par conséquent, on peut conclure que la méthode de sélection des souches basée sur la recherche de phénotype ILV+ est un moyen prometteur d'isoler des souches produisant de nouveaux esters a-insaturés. EXEMPLE 2 : Criblage par mutagenèse UV et caractérisation physiologique de souches mutantes de la levure Saprochaete suaveolens ayant une plus grande capacité à produire des composés aromatiques
I - Matériel et méthodes
Souches de levure, mutagenèse UV et criblage
La souche diploïde prototrophe Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 112-2N (van Dijken et al., 2000) et une souche sauvage de Saprochaete suaveolens (anciennement Geotrichum fragrans) précédemment isolée de Pitaya (Hylecereus polyrhisus) à l'île de la Réunion, France (Grondin et al., 2015a) ont été utilisées dans cette étude. La mutagenèse UV de 5. suaveolens a été réalisée selon le protocole décrit par Winston en2008 établi pour la mutagenèse UV de la levure Saccharomyces cerevisiae, et qui a été modifié pour 5. suaveolens. Cette souche a été incubée dans 10 mL de milieu extrait de levure peptone dextrose (YPD ; 20 g.L 1 peptone, 20 g.L 1 dextrose et 10 g.L 1 extrait de levure) à 30°C pendant la nuit, recueillie et lavée deux fois avec 10 mL d'eau stérile. Un aliquot de 100 pL à 5.104 cellules. mL 1 a été étalé sur un milieu de base azote et levure (YNB) supplémenté de 2g. L 1 de glucose (YNB-GIc) avant exposition à l'irradiation UV (254 nm, 30 cm de haut) à des temps allant de 0 et 540 sec. Pour arrêter les photoréactions, les plaques ont été maintenues dans l'obscurité et incubées à 30°C pendant 15h. En utilisant la méthode de réplication, les colonies irradiées ont été répliquées sur YNB supplémenté de 1 g.L 1 d'isoleucine, de leucine ou de valine ou de 2 g.L 1 de glucose (YNB-lle, YNB-Leu, YNB-Val, YNB-GIc respectivement) et incubées pendant 5 jours à 30°C. Les colonies se développant sur YNB-GIc et non sur YNB-lle, YNB-Leu ou YNB-Val ont ensuite été repiquées sur milieu YPD gélosé. La confirmation des clones mutants sélectionnés a été réalisée par un test de croissance supplémentaire sur milieu YPD suivi de YNB-lle. Ainsi, les clones ont été suspendus dans 5 ml de YPD et incubés pendant la nuit à 30°C. La culture a ensuite été centrifugée (13 000 rpm, 5min) et remise en suspension dans 5 mL d'eau stérile. Ensuite, 5pL de 106, 105et 104 cellules. mL 1 préparées dans de l'eau stérile ont été déposées en double dans une plaque YNB-agar contenant du glucose, de la leucine, de la valine ou de l'isoleucine comme source de carbone. Les plaques ont été incubées pendant 48 heures à 30°C avant d'être lues. Cette procédure a été effectuée deux fois de plus pour assurer la stabilité de la mutation. Les souches sauvages de 5. suaveolens et 5. cerevisiae ont été utilisées comme contrôle positif et négatif, respectivement.
Analyse des composés organiques volatils (COV)
Les souches ont été ensemencées dans un flacon à sertir de 20 ml contenant 15 ml de milieu de gélose YNB supplémenté avec 2 g.L 1 de glucose et 1 g.L 1 d'isoleucine (YNB-GIc-lle) et incubées à 30°C pendant 24h. Ensuite, le flacon a été scellé et ré-incubé pendant 24 h à 30°C. Avant l'analyse, 10 pL d'octan-l-ol (à 1 g.L 1 dans du dichlorométhane) ont été ajoutés dans les flacons scellés comme standard interne. L'espace de tête des cultures inclinées a été soumis à une analyse SPME à l'aide d'une fibre de 2 cm de long recouverte de 50/30 pm de divinylbenzène/carboxène sur du polydiméthylsiloxane lié à un noyau flexible de silice fondue (Supelco). La fibre a été exposée à l'espace de tête pendant 15 minutes à 30°C et insérée dans l'orifice d'injection à 250°C pendant 2 minutes. Les métabolites ont été séparés par GC, sur une colonne ZB-5MSI (30m * 0.32mm * 0.25pm d'épaisseur de film), couplée à un spectromètre de masse (Shimadzu GCMS-Q.P2010 Ultra). Le gaz vecteur (H2) a été réglé à un débit de 2 mL.min -1. La température de la colonne a été maintenue à 40°C pendant 2 min, portée à 150°C à 10°C.min -1, puis portée à 240°C à 30°C.min 1 avant la fin. Les composés organiques volatils ont été identifiés en comparant leurs spectres de masse et leur indice de Kovats expérimental avec la base de données de NIST (www.chemdata.nist.gov).
Préparation d'extraits bruts et dosage des activités enzymatiques
Les cellules de levure ont été cultivées dans des Erlenmeyer de 250 ml contenant 50 ml de YNB-GIc ou de YNB-GIc-lle pendant 24 h à 30°C. Ensuite, l'équivalent de 100 unités DO à 600 nm de la culture a été collecté dans des tubes Falcon de 50 ml par centrifugation (2000 rpm, 4°C, 1 min). Les culots cellulaires ont été remis en suspension dans 1 ml d'eau froide, transférés dans des tubes Eppendorf, lavés une fois de plus avec de l'eau froide. Les culots obtenus après centrifugation (2 min à 10.000 rpm) ont été conservés à -20°C jusqu'à leur utilisation.
Pour 5. cerevisiae, des billes de verre (0,5 mm de diamètre) et 500 pL de tampon d'extraction (tampon phosphate de potassium 50 mM, pH 7,4 contenant 2 mM EDTA, 100 mM KCI et 1 mM DTT) ont été ajoutés au culot cellulaire. Les cellules ont été brisées dans un instrument MP BiomedicalsTM FastPrep-24TM 5G en utilisant 6 cycles de 30s à 6,5 m.s-1 et 1 min dans de la glace entre chaque cycle. Comme cette procédure n'a pas fonctionné pour 5. suaveolens, ces cellules ont été brisées à l'aide d'un Qiagen Retsh Tissue Lyser II (3 min, 30Hz) avec une bille de tungstène froide introduite dans le tube en présence de 500 pL du même tampon d'extraction que ci-dessus. Après centrifugation des tubes Eppendorf (1000 g, 5 min, 4°C), le surnageant correspondant aux extraits bruts des deux espèces de levures a été passé sur des filtres centrifuges Amicon Ultra-05 10K selon le protocole du fabricant pour éliminer les petites molécules. Les extraits filtrés ont ensuite été utilisés pour les essais enzymatiques et la détermination des protéines.
Tous les essais enzymatiques ont été réalisés à l'aide d'un spectrophotomètre UV-Visible Agilent 8453 dans des cuvettes de 1 ml de volume final avec une quantité appropriée d'extrait brut. La spécificité (ou le blanc) de la réaction enzymatique a été vérifiée en effectuant la réaction à la fois en présence du substrat sans extrait brut et en présence d'extrait brut sans substrat. Pour l'a-cétoacide déshydrogénase à chaîne ramifiée (BCKAD), la réaction correspondait à la décarboxylation oxydative de l'acide 2-oxo-4-méthylpentanoïque mesurée par la réduction du NAD+ en NADH à 340 nm. Le mélange réactionnel contenant 50 mM de tampon phosphate de potassium pH 7,4, 2 mM d'EDTA, 0,2 mM de DTT, 0,5 mM de TPP, 5 mM de MgSO4, 0,5 mM de CoA-SH et 1,5 mM de NAD+ a été initié par l'addition de 0,2 mM d'acide 2-oxo-4-méthylpentanoïque. L'activité de l'énoyl-CoA hydratase (ECH) a été déterminée selon [24] en utilisant 0,225 mM de crotonyl-CoA comme substrat. La conversion de ce substrat en 3-hydroxy-butanoyl-CoA a été mesurée à 263 nm à pH 8,0 dans 45 mM de Tris-HCI pH 8,0. L'activité décarboxylase (DC) a été déterminée en utilisant l'acide 2-oxo-4- méthylpentanoïque comme substrat dans un mélange réactionnel contenant 50 mM de Na+citrate à pH 6,2, 100 mM de KCI, 0,2 mM de DTT, 0,5 mM de TPP, 5mM de MgSO, 0,2 mM de NADH et 5 U/mL d'alcool déshydrogénase de levure. La réaction a été lancée par l'addition de 0,2 mM d'acide 2-oxo-4-méthylpentanoïque et l'oxydation du NAD+ a été suivie à 340 nm. L'alcool déshydrogénase (ADH) a été testée avec 2 mM de 2-méthylpropanal ou 100 mM d'éthanol. Dans le premier cas, la réduction de 0,2 mM de NADH en NAD+ a été suivie à 340 nm dans un mélange contenant 50 mM de tampon Na+citrate pH 6,2, 100 mM de KCI, 0,2 mM de DTT, 0,5 mM de TPP et 5 mM de MgSO4. Dans le second cas, la réaction a été réalisée dans du phosphate de potassium 50 mM pH 7,4, 100 mM KCI, 0,2 mM DTT, 0,5 mM TPP, 5 mM MgSO4 et 0,2 mM NADH. La réaction a été amorcée avec de l'éthanol 100 mM. Pour le dosage de l'activité aldéhyde déshydrogénase (AIDH), la réaction a été effectuée en présence de 50 mM de tampon Na+-citrate pH 6,2, 100 mM KCI, 0,2 mM DTT, 0,5 mM TPP, 5 mM MgSO4 et 1,5 mM NAD+. La réaction a été amorcée par l'ajout de 2 mM de 2-méthylpropanal et suivie à 340 nm par la réduction de NAD+ en NADH. L'activité de l'acyl-CoA déshydrogénase (ACyD) a été déterminée après la réduction du DCIP en DCIPH2 à 655 nm. La réaction a été réalisée dans un tampon phosphate de potassium 50 mM pH 7,4, 2 mM EDTA, 100 mM KCI, 0,1 mM FAD+, 0,5 mM DCIP et 0,2 mM DTT et a été initiée par l'addition de 0,2 mM 2-méthylbutanoyl-CoA. L'alcool acyltransférase (AAT) a été testée dans le sens hydrolytique (estérase), ce qui a été réalisé selon [25] en utilisant le butyrate de p-nitrophényle qui est hydrolysé en butyrate et p- nitrophénol, qui absorbe à 415 nm. La réaction a été réalisée dans un mélange contenant 50 mM de phosphate de potassium pH 7,4, 2 mM d'EDTA et 100 mM de KCI et a commencé par l'addition de 2 mM de butyrate de p-nitrophényle. Enfin, le dosage de l'activité acyl-CoA hydrolase (ACyH) a été effectué dans un tampon phosphate de potassium 10 mM (pH 6,5), 50 mM MgCI2 et 0,1 mM DTNB. La réaction a été lancée par l'ajout de 0,1 mM de 2- méthylbutanoyl-CoA et la libération de CoASH a été suivie à 415 nm, ce qui correspond à la production de DTNBH réduit. La concentration en protéines a été déterminée à 550 nm par la méthode Bradford [26], avec de l'albumine de sérum bovin (BSA, Sigma-Aldrich) comme standard. Tous les essais ont été réalisés en triplicata à partir de cultures indépendantes et pour chaque culture, les essais ont été réalisés en double.
Analyse statistique
Les moyennes et les écarts types (ET) ont été déterminés sur la base de fermentations triples et représentés sous forme de moyenne ± ET. Les données expérimentales ont été soumises à une analyse de variance à une voie (ANOVA) en utilisant le logiciel XLStat Applied Sensory (2020.1.3) au niveau de confiance de 95%. L'analyse en composantes principales (PCA) et l'analyse en clusters hiérarchiques (HCA) ont été appliquées pour discriminer les moyennes de la production totale de composés organiques volatils et le profil des composés volatils du type sauvage de 5. suaveolens et des mutants ILV-. L'ACP a été réalisée à l'aide du logiciel XLStat Applied Sensory (2020.1.3) et les données sont présentées sous forme de graphique biplot. Une carte thermique a été réalisée sur la base du ratio de chaque COV produit par les mutants par rapport à ceux produits par le type sauvage de 5. suaveolens en utilisant NG-CHM Builder : Interactive heatmap online software (www.build.ngchm.net).
Il - Résultats et discussion
Condition de la mutagenèse UV et stratégie de criblage
La durée d'irradiation UV adéquate pour accumuler des mutations stables non létales chez 5. cerevisiae a été décrite empiriquement comme la durée qui entraîne un taux de survie de la population allant de 70 à moins de 40%. Dans un premier temps, nous avons effectué une étude dose-réponse de l'effet irradiation par UV sur notre souche sauvage 5. suaveolens pour déterminer la durée optimale d'exposition aux UV de cette souche non-conventionnelle. Comme le montre la Figure 4, le taux de survie de la population a immédiatement chuté de 25 % après les 10 premières secondes d'irradiation et est resté à cette valeur même après 110 secondes d'irradiation. Avec un temps d'irradiation plus long, une décroissance linéaire (R2 = 0,96) de la survie de la population avec une mortalité complète après 420 s d'irradiation a clairement été observée. Une durée de 180 s d'irradiation aux UV a été choisie, ce qui correspond à environ 50 % de la survie de la population. En conséquence, 15 393 colonies ont été isolées après ce temps d'irradiation UV de 5. suaveolens sauvage sur des plaques de milieu YNB-GIc gélosé (milieu ne comportant que du glucose comme source de carbone).
Pour cribler les mutants qui ont perdu la capacité de croître sur des milieux contenant de l'isoleucine, de la leucine ou de la valine comme seule source de carbone, ces 15 000 clones irradiés ont été répliqués sur des plaques de milieu YNB-lle, YNB-Leu et YNB-Val gelosés. Seuls 10 n'ont pas pu se développer sur les trois acides aminés à chaîne ramifiée. Ces 10 clones ont ensuite été cultivés de nouveau sur YNB-GIc, et testés de nouveau pour vérifier leur croissance / absence de croissance sur un milieu YNB-Leu/ Ile/Val non perméable. Avec cette procédure, un seul des 10 clones irradiés par les UV a été perdu, laissant ainsi 9 mutants ILV- potentiellement stables, appelés mutants M2 à M10.
Analyse multivariée du type sauvage de S. suaveolens et de ses 9 mutants ILV- en fonction de leur production de COV
Les composés organiques volatils (COV) produits par le type sauvage de 5. suaveolens et les 9 mutants ILV- ont été extraits par microextraction en phase solide de l'espace puis analysés par chromatographie en phase gazeuse couplée à un détecteur de spectre de masse (HS-SPME- GC/MS) après 48h de croissance sur des tubes de gélose YNB contenant 20 g.L-1 de glucose et 1 g.L-1 d'isoleucine (YNB-GIc-lle) à 30°C. En supposant une croissance similaire des mutants et du type sauvage de 5. suaveolens sur des géloses, nous avons trouvé que les mutants M9 et MIO avaient des niveaux de production de COV totaux de 1,8 et 8 fois plus élevés respectivement que le type sauvage de 5. suaveolens, alors que les COV étaient deux fois plus bas chez les mutants M6 et M7 et plus de 4 fois plus bas chez les mutants M2 et M4 (Figure 5). Les deux mutants restants, M3 et M5, ont montré un niveau de COV à peu près similaire à celui du type sauvage.
En utilisant la liste de tous les COV identifiés et quantifiés dans le type sauvage et les 9 mutants ILV- de 5. suaveolens, une analyse en composantes principales (ACP) a été réalisée par la méthode de Pearson pour rechercher une éventuelle agrégation ou discrimination entre les mutants et le type sauvage sur la base de leur profil de production de COV. Comme le montre la figure 6, le premier axe PCI, qui représente 66,64% de la variance totale, a clairement isolé le mutant M10 d'un groupe comprenant le type sauvage et les mutants M2, 3, 4, 6, 7 et 8. Le deuxième axe (PC2), qui représente environ 10% de la variance totale, a permis de séparer le mutant M9 de la souche sauvage (WT) et du mutant M5, qui étaient à peu près regroupés dans le même groupe, indiquant que ce mutant présentait un profil de COV similaire à celui du type sauvage. D'autre part, les profils de COV des mutants M9 et M10 étaient les plus différents les uns des autres et du type sauvage, ce qui est également cohérent avec la quantité plus élevée de COVs produits par ces mutants. Comme les mutants M2, M3, M4, M6, M7 et M8 étaient regroupés et pas très éloignés de M5 et du WT, ces données suggèrent également que ces mutants ont un profil de COV très similaire entre eux et pas très différent du type sauvage. En conclusion, cette analyse ACP a montré que la mutagenèse UV a réussi à générer au moins deux mutants intéressants présentant un profil de COV très différent du type sauvage.
Analyse comparative de la production de COV entre S. suaveolens et les 9 mutants ILV-.
Comme indiqué précédemment, les COV produits par le type sauvage et les mutants de 5. suaveolens sont essentiellement des composés de types esters. Deux types d'esters ont été détectés, à savoir les esters d'acétate qui sont formés par condensation d'un alcool supérieur généralement produit dans la voie d'Ehrlich avec l'acétyl-CoA et les esters éthylique qui sont formés par condensation d'un acyl-CoA avec l'éthanol ou un autre alcool tel que le méthanol, le propanol ou le butanol [19]. Alors que ces deux types d'esters ont également été retrouvés dans les COV des mutants et du type sauvage de 5. suaveolens, d'autres types d'esters ont été identifiés. Certains d'entre eux résultent très probablement de la condensation d'un alcool dérivé du catabolisme de l'isoleucine dans la voie d'Ehrlich (c'est-à-dire le 2-méthylbutanol) avec un acyl-CoA (c'est-à-dire le propanoyl-CoA, le butanoyl-CoA), donnant lieu au butanoate de 2-méthylbutyle et au propanoate de 2-méthylbutyle. L'origine de ces acyl-CoA à chaîne courte peut provenir soit de la dégradation de la chaîne de carbone des acides gras dans le cas du butanoyl-CoA ou de l'oxydation de l'isoleucine qui conduit au propanoyl-CoA et à l'acétyl-CoA. D'autres esters peuvent être produits à partir d'un acide comme l'acide 2- méthylbutanoate qui doit être activé en tant que CoA-intermédiaire pour se condenser avec l'éthanol et donner du 2-méthylbutanoate d'éthyle. Ces esters ont été classés dans la catégorie des composés dérivant de la voie d'Ehrlich (EP) en raison des alcools supérieurs et des acides qui proviennent de cette voie. Une autre catégorie est celle des esters qui sont formés par la condensation d'un acyl-COA avec l'éthanol ou un alcool supérieur tel que l'octanol pour donner de l'acétate d'octyle, du propanoate d'octyle et du butanoate d'octyle. Nous avons attribué cette catégorie aux esters d'acyl-COA dérivant de la voie de la [3-oxydation (BOP). Enfin, un troisième groupe, vraisemblablement original pour les espèces de Saprochaete, comprenait tous les COV dont le précurseur acide est un énoyl-COA qui peut être estérifié avec de l'éthanol (c'est-à-dire le tiglate d'éthyle, but-2-énoate d'éthyle) ou avec un alcool supérieur provenant de la voie d'Ehrlich tel que le 2-méthylbutanol et le 2- méthylpropanol, pour donner du 3-méthylbutyl-2-méthylbut-2Z-énoate (angélate d'isoamyle) et du 2-méthylpropyl-2-méthylbut-2E-énoate (tiglate d'isobutyle). Nous avons classé ces esters dans la catégorie des composés dérivant de l'énoyl-CoA de la voie de la [3-oxydation (BOP-enoyl-COA). La figure 5 illustre clairement la plus grande capacité de M10 à produire des esters de ces trois catégories, avec notamment une multiplication par 5 des esters de l'EP, atteignant le niveau exceptionnel de plus de 1 g.L 1 et environ 10 fois plus d'esters des intermédiaires de l'énoyl-CoA.
Comme indiqué ci-dessus, notre stratégie de sélection de forts producteurs de COV, basée sur des mutants incapables de croître sur un milieu synthétique dans lequel l'acide aminé ramifié est la seule source de carbone, a conduit à l'isolement de deux mutants M9 et M10 qui présentaient à la fois un profil en COV différent et une quantité plus élevée de ces COV par rapport au type sauvage de 5. suaveolens. Pour mieux mettre en évidence ces différences entre les souches, la teneur de chaque COV dans les mutants a été divisée par celle du type sauvage. Ensuite, la valeur du ratio résultant a été exprimée par un code couleur allant du blanc (absence), vert (~ 1), marron (> 10) au rouge foncé (> 100), donnant lieu à une carte thermique présentée dans la Figure 7. Cette représentation a clairement renforcé notre analyse multivariée indiquant que le profil des COV du mutant M10 et, dans une moindre mesure, celui de M9, diffère de celui de la souche sauvage. En particulier, le profil des COV du mutant M10 présentait deux caractéristiques importantes. Premièrement, les niveaux de 17 des 22 COV catégorisés dans la voie EP étaient 5 à 50 fois plus élevés que dans la souche sauvage. Plus précisément, les esters produits à partir de l'alcool (2-méthylbutanol) ou de l'acide (2-méthylbutanoate) provenant du catabolisme de l'isoleucine étaient environ 10 fois plus abondants que dans le type sauvage. Ce résultat pourrait suggérer une activité accrue du catabolisme de l'isoleucine dans la voie d'Ehrlich. D'autre part, la production d'esters obtenus par condensation d'acyl-CoA avec de l'éthanol et d'énoyl-CoA avec de l'éthanol ou des alcools dérivés de l'EP (c'est-à-dire tiglate d'éthyle, tiglate de butyle, tiglate d'isobutyle, etc.) était 5 à 100 fois plus élevée dans ce mutant M10 que dans le type sauvage. De façon globale, la production d'esters a-insaturés totaux était ainsi 5 fois plus importante chez le mutant M10 que chez la souche sauvage de 5. suaveolens (Table 1).
[Table 1]
S. suaveolens Mutant M10 2-methylbut-2E-ènoate de propyle 0,1 ± 0,0 1,4 ± 1,2
2-methylbut-2E-ènoate de butyle 28,5 ± 2,2 90,6 ± 10,5
2-methylbut-2E-ènoate d'éthyle 48,4 ± 3,0 115,9 ± 30,7
But-2-ènoate d'éthyle 0,1 ± 0,1 155,8 ± 136,2
2-methylbut-2E-ènoate de 2-méthylpropyle - 37,4 ± 20,0
2-methylbut-2Z-ènoate de 2-méthylpropyle 1,1 ± 0,6 1,1 ± 0,7
2-methylbut-2E-ènoate de 3-méthylbutyle 0,2 ± 0,2
2-methylbut-2Z-ènoate de 3-methylbutyle 0,4 ± 0,5 0,6 ± 1,1
TOTAL ESTERS ALPHA-INSATURES 78,9 ± 2,4 402,8 ± 112,1
Tableau 1. Esters alpha-insaturés produits (mg/L) par la souche mère de S. suaveolens et le mutant Ml.
Ces données indiquent fortement qu'une réaction enzymatique en aval de l'oxydation de l'énoyl-COA a été altérée par la mutagenèse UV, conduisant à une plus grande disponibilité des intermédiaires acyl-CoA et énoyl-COA à estérifier avec des alcools dérivés soit du catabolisme de l'isoleucine, soit de la glycolyse (éthanol).
La perte de l'activité Enoyl-CoA hydratase dans la voie de l'oxydation peut expliquer la production plus élevée de COV chez le mutant M10.
Le fait que le mutant M10 ait présenté une augmentation de 8 fois des COV totaux et, plus spécifiquement, que les esters dérivés de la condensation de l'acyl-CoA et de l'énoyl-CoA avec des alcools aient augmenté de façon spectaculaire par rapport au type sauvage, suggère que l'activité des enzymes de l'oxydation qui catalysent les réactions en aval de l'énoyl-CoA a été modifiée. D'autre part, les niveaux plus élevés d'arômes dérivés de l'EP chez le mutant M10 peuvent également suggérer que les activités des enzymes de l'EP ont été augmentées. Pour répondre à ces questions, nous avons décidé de déterminer l'activité des enzymes clés de la voie d'Ehrlich et de la voie de la -oxydation. La voie d'Ehrlich implique une décarboxylase (DC) et une alcool déshydrogénase (ADH) pour la voie réductrice ou une aldéhyde déshydrogénase pour la voie oxydative. Le catabolisme des acides aminés ramifiés par oxydation nécessite une a-céto-déshydrogénase à chaîne ramifiée (BCKAD) qui produit un acyl-COA. Cet intermédiaire acyl-COA peut perdre le CoA par une acyl-CoA hydrolase (AcyH) pour donner l'acide correspondant, pour être réduit en énoyl-CoA par une acyl-CoA déshydrogénase (ACyD) dépendante du FAD+ ou même estérifié en esters éthyliques par une ester synthase d'acides gras à chaîne moyenne [28]. Spécifiquement chez 5. suaveolens, l'énoyl-COA peut être estérifié en esters par une alcool acétyltransférase dont la nature reste à identifier.
Les enzymes de ces deux voies métaboliques ont donc été déterminées dans les extraits bruts du type sauvage et du mutant M10 de 5. suaveolens. Dans l'ensemble, les activités enzymatiques mesurées dans les extraits bruts des souches de type sauvage et mutant de 5. suaveolens étaient très variables d'une culture à l'autre, ce qui pourrait s'expliquer par la difficulté inattendue de briser les cellules et d'obtenir une perturbation cellulaire reproductible. Cependant, l'analyse statistique des données nous permet d'être confiants quant aux différences enzymatiques, lorsqu'elles se sont produites, entre le type mutant et le type sauvage. Ainsi, l'activité DC du type sauvage de 5. suaveolens et du mutant M10 était à peu près comparable, que les levures aient été cultivées dans du glucose YNB complété ou non par 1 g.L 1 d'isoleucine. De même pour l'activité de l'ADH mesurée sur le 2 méthylpropanal qui n'a montré aucune différence significative entre les deux souches. Nous avons remarqué que l'activité aldéhyde déshydrogénase (AIDH) était 5 fois plus faible chez le mutant M10 par rapport au type sauvage et globalement cette activité enzymatique était 10 fois plus faible que celle de l'ADH bien que les données sur les niveaux de COV mesurés suggèrent une contribution similaire des parties oxydative et réductrice de la voie d'Ehrlich dans la production des esters. Cette apparente divergence peut être due au fait que la mesure enzymatique in vitro implique l'activité de l'ADH qui agit produit l'éthanol à partir de acétaldéhyde et qui n'est peut-être pas celle qui est spécifique à la voie d'Ehrlich.
En ce qui concerne les enzymes de la voie de la [3-oxydation, l'effet le plus spectaculaire a été constaté sur I'Enoyl-CoA hydratase dont l'activité chez le mutant M10 se situait dans la limite de détection de la méthode de dosage. Nous avons également constaté que l'activité de l'acyl- CoA hydrolase (ACyH) qui catalyse une réaction en amont de l'énoyl-CoA hydratase était 2 fois plus élevée que dans le type sauvage. En revanche, aucune conclusion n'a pu être donnée pour l'acyl-CoA déshydrogénase (ACyD) car l'activité de cette enzyme était 2 fois plus faible chez M10 poussant sur YNB-GIc mais 2 fois plus élevée que le type sauvage lorsque la culture était faite en YNB-GIc-lle. L'activité de la BCKAD, qui catalyse l'étape initiale de l'oxydation des acides aminés à chaîne ramifiée, a également été mesurée. On a pu constater que si cette enzyme présentait une activité similaire entre le type mutant et le type sauvage, son activité était 4 à 10 fois inférieure à celle des enzymes en aval de la voie. Ces données semblent être en accord avec les rapports précédents qui soutiennent que cette enzyme peut être limitante dans le catabolisme des acides aminés à chaîne ramifiée par la voie de la P -oxydation comme cela a été rapporté dans les cellules de mammifères. De plus, cette enzyme présente une activité au moins 4 fois plus faible que les enzymes de la voie d'Ehrlich, ce qui pourrait indiquer que les acides aminés à chaîne ramifiée seraient préférentiellement catabolisés par la voie d'Ehrlich (EP), du moins lorsque la levure est cultivée avec du glucose comme source de carbone. Enfin, comme nous ne savons pas quel type d'ester synthase est impliqué dans la formation d'esters chez 5. suaveolens, nous avons décidé de mesurer cette activité en tant qu'estérase " (EST), en supposant qu'une acyl-CoA : éthanol O-acétyltransférase, comme celle identifiée chez 5. cerevisiae, et qui possède à la fois une activité ester synthase et estérase, existe aussi chez 5. suaveolens. Comme indiqué précédemment, l'activité globale de cette estérase était similaire dans les deux souches mais était 2 fois plus élevée dans un milieu synthétique comportant du glucose et de l'isoleucine, ce qui suggère un effet positif des acides aminés ramifiés sur l'expression des gènes codant pour cette estérase. En résumé, ces analyses enzymatiques soutiennent l'idée que la production accrue de COV dans le mutant M10 de 5. suaveolens peut être expliquée par l'absence presque totale de l'activité enoyl-CoA hydratase (ECH). Cette perte d'activité ECH conduit en retour à une disponibilité accrue des précurseurs d'acyl-CoA et d'énoyl-CoA pour la synthèse des esters, et peut expliquer l'incapacité de ce mutant à se développer sur des acides aminés ramifiés.
Conclusions
La mutagenèse UV a été employée pour générer des mutants de S. suaveolens qui abritent une production plus élevée de COV à partir d'acides aminés à chaîne ramifiée. Notre sélection était basée sur l'incapacité de croître avec ces acides aminés comme seule source de carbone. Il a permis d'isoler 9 mutants, dont l'un (le mutant M10) s'est avéré présenter 8 fois plus de COV que la souche sauvage de 5. suaveolens. En déterminant les activités spécifiques d'enzymes clés impliquées dans le catabolisme de l'isoleucine, nous avons fourni la preuve que la production plus élevée de COV observée chez ce mutant de 5. suaveolens est principalement due à la perte de l'activité de l'énoyl-CoA hydratase et à une augmentation de l'activité de I'acyl-CoA hydrolase. Le séquençage des souches sauvages et mutantes permettra de confirmer si la perte de l'activité ECH est due à une mutation du gène codant pour cette enzyme ou d'un gène régulateur de ce système métabolique Néanmoins, ce travail a montré la faisabilité de l'utilisation de la stratégie de mutagenèse UV et de la sélection sur des milieux spécifiques contenant des acides aminés à chaîne ramifiée comme seule source de carbone pour améliorer de manière significative la capacité de la levure 5. suaveolens à produire des COV de valeur.

Claims

26 REVENDICATIONS
1. Souche de microorganisme génétiquement modifiée capable de produire des composés organiques volatils caractérisée en ce que : elle exprime les activités transaminase (TA), décarboxylase des céto-acides à chaîne ramifiée (BCKAD), Acyl-Coa dehydrogenase (ACyD), alcool acyl transferase (AAT) et acyl CoA hydrolase par expression ou surexpression des gènes responsables de ces activités ; son activité enoly-CoA hydratase est réduite/supprimée, si une telle activité est présente dans ledit microorganisme.
2. Souche de microorganisme selon la revendication 1 choisie parmi les levures, les champignons ou les bactéries.
3. Souche de microorganisme selon la revendication 2 caractérisée en ce que : ladite souche est une levure Saprochete suaveolens produisant des COV les modifications génétiques consistent en une augmentation de l'activité acyl CoA hydrolase et une réduction/suppression de l'activité enoyl-CoA hydratase ladite souche produit au moins 1,5 fois plus de COV après modification génétique.
4. Souche de microorganisme selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que les COV produits sont des esters alpha-insaturés.
5. Souche de microorganisme selon la revendication 4 dans laquelle lesdits esters a- insaturés sont choisis parmi le tiglate d'isobutyle, le tiglate d'isoamyle ou le tiglate d'éthyle.
6. Méthode de criblage de souches de levures capables de produire des COV consistant à : a. isoler dans des milieux naturels, les souches capables de croître sur des milieux de culture contenant au moins un acide aminé branché (isoleucine, leucine ou valine) comme seule source de carbone b. quantifier la production de COV dans les souches isolées c. sélectionner les souches capables de produire la quantité requise de COV.
7. Méthode de criblage de souche de microorganisme mutée présentant une production en COV augmentée par rapport à la souche mère de référence non mutée capable de produire des COV, comprenant les étapes de : a. Mutagénèse aléatoire par irradiations UV d'isolats de souches de microorganisme « souches mère » sur milieu contenant du glucose comme seule source de carbone b. Transfert de chacune des souches irradiées de sorte à obtenir quatre séries de souches identiques c. Transfert sur milieu de culture en parallèle desdites quatre séries de souches irradiées, i. ladite première série de souches sur un milieu contenant du glucose (milieu glucose) comme seule source de carbone ii. ladite deuxième série sur un milieu contenant de l'isoleucine comme seule source de carbone iii. ladite troisième série sur un milieu contenant de la leucine comme seule source de carbone iv. ladite quatrième un milieu contenant de la valine comme seule source de carbone d. Identification des mutants se développant sur milieu glucose mais incapables de croître sur les milieux contenant uniquement de l'isoleucine de la leucine ou de la valine comme seule source de carbone, parmi les souches initialement irradiées de criblage e. Quantification de la production de COV de chacune des souches correspondantes aux souches incapables de croître sur milieu contenant uniquement de l'isoleucine de la leucine ou de la valine comme seule source de carbone f. Sélection des souches incapables de croître sur milieu contenant uniquement de l'isoleucine de la leucine ou de la valine comme seule source de carbone, qui produisent une plus grande quantité de COV que la souche mère. Procédé de préparation d'une souche de microorganisme génétiquement modifiée dans laquelle la production de COV est augmentée, consistant à : a. Disposer d'une souche produisant un niveau basal de COV b. Réduire/supprimer l'activité enoyl-CoA hydratase par mutagénèse dirigée c. Augmenter l'activité acyl-CoA hydrolase par expression du gène responsable de cette activité. d. Quantifier les COV produits pour sélectionner les souches d'intérêt. Procédé de préparation d'une souche de microorganisme génétiquement modifiée capable de produire des COV consistant à : a. Disposer d'une souche ne produisant pas de COV b. Introduire une ou plusieurs cassettes d'expression géniques contenant les gènes responsables de l'expression des enzymes transaminase (TA), décarboxylase des céto-acides à chaîne ramifiée (BCKAD), acyl-CoA déhydrogenase (ACyD), alcool acyl transférase (AAT) et acyl CoA hydrolase. c. Réduire ou supprimer l'activité enoyl-CoA hydratase par mutagenèse, si une telle activité est présente dans ledit microorganisme d. Quantifier les COV produits pour sélectionner les souches d'intérêt. Méthode selon l'une des revendications 6 à 9 dans laquelle l'étape de quantification des COV produits est effectuée par chromatographie.
PCT/FR2022/051807 2021-09-24 2022-09-26 Souche de microorganisme genetiquement amelioree capable de produire de plus grandes quantites de composes organiques volatils d'interet et methode de criblage pour obtenir de telles souches WO2023047070A1 (fr)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP22790338.2A EP4405471A1 (fr) 2021-09-24 2022-09-26 Souche de microorganisme genetiquement amelioree capable de produire de plus grandes quantites de composes organiques volatils d'interet et methode de criblage pour obtenir de telles souches

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR2110105A FR3127500A1 (fr) 2021-09-24 2021-09-24 Souche de microorganisme genetiquement amelioree capable de produire de plus grandes quantites de composes organiques volatils d’interet et methode de criblage pour obtenir de telles souches
FRFR2110105 2021-09-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023047070A1 true WO2023047070A1 (fr) 2023-03-30

Family

ID=80787396

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2022/051807 WO2023047070A1 (fr) 2021-09-24 2022-09-26 Souche de microorganisme genetiquement amelioree capable de produire de plus grandes quantites de composes organiques volatils d'interet et methode de criblage pour obtenir de telles souches

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP4405471A1 (fr)
FR (1) FR3127500A1 (fr)
WO (1) WO2023047070A1 (fr)

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4657862A (en) * 1984-07-31 1987-04-14 International Flavors & Fragrances Inc. Preparation of naturally-occurring C2-C5 alkyl esters of C4-C5 carboxylic acids by means of fermentation of C5-C6 amino acids in the presence of C2-C5 alcohols
US20140086878A1 (en) * 2012-09-25 2014-03-27 Marrone Bio Innovations, Inc Muscodor albus Strain Producing Volatile Organic Compounds and Methods of Use

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GRONDIN ERIC ET AL: "Flavour production by Saprochaete and Geotrichum yeasts and their close relatives", FOOD CHEMISTRY, vol. 237, 1 December 2017 (2017-12-01), NL, pages 677 - 684, XP055940350, ISSN: 0308-8146, DOI: 10.1016/j.foodchem.2017.06.009 *
GRONDIN ERIC ET AL: "Physiological and biochemical characteristics of the ethyl tiglate production pathway in the yeast Saprochaete suaveolens", YEAST (CHICHESTER, ENGLAND), 1 January 2015 (2015-01-01), England, pages 57 - 66, XP055940308, Retrieved from the Internet <URL:https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/yea.3057> [retrieved on 20220708], DOI: 10.1002/yea.3057 *
TAN MELISSA ET AL: "Selection by UV Mutagenesis and Physiological Characterization of Mutant Strains of the Yeast Saprochaete suaveolens (Former Geotrichum fragrans) with Higher Capacity to Produce Flavor Compounds", JOURNAL OF FUNGI, vol. 7, no. 12, 30 November 2021 (2021-11-30), pages 1031, XP055940355, DOI: 10.3390/jof7121031 *
YIN SHENG ET AL: "Improving 2-Phenylethanol Production via Ehrlich Pathway Using Genetic Engineered Saccharomyces cerevisiae Strains", CURRENT MICROBIOLOGY, SPRINGER-VERLAG, NEW YORK, vol. 70, no. 5, 14 February 2015 (2015-02-14), pages 762 - 767, XP035476863, ISSN: 0343-8651, [retrieved on 20150214], DOI: 10.1007/S00284-015-0785-Y *

Also Published As

Publication number Publication date
EP4405471A1 (fr) 2024-07-31
FR3127500A1 (fr) 2023-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Xu et al. Flavor mystery of Chinese traditional fermented baijiu: The great contribution of ester compounds
Carroll et al. Microbial production of scent and flavor compounds
Martin et al. De novo synthesis of benzenoid compounds by the yeast Hanseniaspora vineae increases the flavor diversity of wines
Styger et al. Wine flavor and aroma
Gigot et al. The lipoxygenase metabolic pathway in plants: potential for industrial production of natural green leaf volatiles
Marullo et al. Yeast selection for wine flavor modulation
Silva et al. Metabolic engineering of Ashbya gossypii for deciphering the de novo biosynthesis of γ-lactones
Fakas et al. Characterization of olive fruit microflora and its effect on olive oil volatile compounds biogenesis
EP1989310A2 (fr) Système d&#39;expression chez la levure pour la production de molécules aromatiques
FR3052170A1 (fr) Production de frambinone par un microorganisme fongique recombinant
EP3036316A1 (fr) Procede de production industrielle de farine de biomasse de microalgues riches en lipides sans &#34;off-notes&#34; par controle de la disponibilite en oxygene
EP2145004B1 (fr) Moyens pour réduire l&#39;accumulation d&#39;acétoïne dans des milieux de fermentation alcoolique
Sugimoto et al. Volatile profiles of members of the USDA Geneva Malus core collection: Utility in evaluation of a hypothesized biosynthetic pathway for esters derived from 2-methylbutanoate and 2-methylbutan-1-ol
CN106574269A (zh) 重组单细胞宿主中香草素产生的改良的选择性
Christen et al. Enzymes and food flavor‐A review
EP2513291B1 (fr) Nouvelles souches de levure pour la production d&#39;alcool
Endrizzi et al. Presumptive involvement of methyl ricinoleate β-oxidation in the production of γ-decalactone by the yeast Pichia guilliermondii
KR20120059825A (ko) 붉은덕다리버섯 균사체의 세포외 액체배양을 통한 천연향료 생산방법 및 그 향료
WO2023047070A1 (fr) Souche de microorganisme genetiquement amelioree capable de produire de plus grandes quantites de composes organiques volatils d&#39;interet et methode de criblage pour obtenir de telles souches
Kaspera et al. Regio-and stereoselective fungal oxyfunctionalisation of limonenes
EP1891203A1 (fr) Souches de levures saccharomyces transformees presentant une production d&#39;ethanol reduite par fermentation
Lee et al. Kinetics of volatile organic compounds during papaya juice fermentation by three commercial wine yeasts
FR2734843A1 (fr) Nouveau procede de bioconversion microbienne.
FR2831886A1 (fr) Boissons fermentees comprenant des levures transformees par le gene atf2
FR2920437A1 (fr) Procede de selection de levures oenologiques.

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22790338

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2022790338

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022790338

Country of ref document: EP

Effective date: 20240424