FR3127500A1 - Souche de microorganisme genetiquement amelioree capable de produire de plus grandes quantites de composes organiques volatils d’interet et methode de criblage pour obtenir de telles souches - Google Patents

Abstract

L’invention se rapporte au domaine des arômes naturels utilisés dans le domaine de l’agroalimentaire. Plus particulièrement, l’invention concerne une souche de microorganisme génétiquement modifié capable de produire de plus grandes quantités de composés organiques volatils d’intérêt, notamment des esters α-insaturés. Elle concerne également une méthode de criblage permettant de sélectionner de telles souches, et un procédé de préparation d’une souche génétiquement modifiée pour produire des quantités satisfaisantes de composés organiques volatiles (COV).

Description

SOUCHE DE MICROORGANISME GENETIQUEMENT AMELIOREE CAPABLE DE PRODUIRE DE PLUS GRANDES QUANTITES DE COMPOSES ORGANIQUES VOLATILS D’INTERET ET METHODE DE CRIBLAGE POUR OBTENIR DE TELLES SOUCHES

L’invention se rapporte au domaine des arômes naturels utilisés dans le domaine de l’agroalimentaire. Plus particulièrement, l’invention concerne une souche de microorganisme génétiquement modifiée capable de produire de plus grandes quantités de composés organiques volatils d’intérêt, notamment des esters α-insaturés. Elle concerne également une méthode de criblage permettant de sélectionner de telles souches, et un procédé de préparation d’une souche génétiquement modifiée pour produire des quantités satisfaisantes de composés organiques volatiles (COV), définis comme des composés organiques de masses moléculaires inférieures à 400 Da.

Domaine de l’invention

La perception des arômes résulte d'un mélange complexe de composés organiques volatils (COV) qui sont des composés organiques de faible poids moléculaire (<400 Da), dans des proportions définies, qui confèrent l'originalité du goût des aliments. Jusqu'à présent, certains de ces composés aromatiques, comme le 2-phényléthanol qui donne l'odeur de rose, sont synthétisés chimiquement en raison de leur faible coût de production. Cependant, certains des arômes synthétisés chimiquement peuvent être modifiés lors de l'intégration des voies métaboliques humaines et être impliqués dans des maladies chroniques telles que les allergies, la diarrhée ou le cancer. Ces effets secondaires potentiels ainsi que la non-durabilité des processus chimiques ont suscité des inquiétudes chez les consommateurs qui deviennent progressivement plus conscients des risques associés à ces composés synthétiques, ainsi que des problèmes de durabilité des procédés et de sécurité alimentaire. L'extraction directe d'arômes naturels à partir de fruits ou de plantes pourrait répondre à la demande des consommateurs. Cependant, la production de ces arômes à partir de leur source naturelle dépend des conditions météorologiques de la saison, nécessite de grandes surfaces de terre en raison de leur faible concentration en plantes, ce qui peut réduire l'espace pour d'autres cultures destinées à l’alimentation. En outre, l'utilisation de solvants d’origine pétrolière est souvent nécessaire pour extraire ces arômes, ce qui peut porter atteinte à la qualification « naturelle » de ces produits.

Pour surmonter ces limitations, la production d'arômes par activité microbienne est une solution prometteuse, compte tenu du fait que les cultures microbiennes sont réalisées dans des bioréacteurs contrôlés et indépendamment de la saison. Cependant, cette approche microbienne présente d'importants goulots d'étranglement. Si certains systèmes microbiens produisent naturellement des arômes d'intérêt, c'est généralement à un faible rendement, un faible titre et une faible productivité, ce qui entraîne un coût de production élevé. Ce défi peut maintenant être relevé grâce aux outils et techniques bien maîtrisés d'ingénierie métabolique. De plus, tous les systèmes microbiens ne disposent pas des voies métaboliques permettant de produire des arômes. Pour résoudre ce problème, la ou les voies métaboliques qui permettent de produire ces produits spécifiques peuvent être modifiées ou reconstruites dans un microorganisme industriellement tel queS. cerevisiaeouE.colien appliquant des outils de biologie systémique et synthétique. Comme cette solution peut poser des problèmes d’acceptation sociétale du fait que le produit serait réalisé par des organismes génétiquement modifiés, une alternative à cette solution serait donc de rechercher, dans les écosystèmes encore largement inexplorés, de nouveaux micro-organismes capables de produire des composés aromatisants en quantité et en diversité.

À cet égard, les levures non conventionnelles présentent des capacités intéressantes de production d'arômes, commePichia kluyveri, Torulaspora delbrueckii, Candida stellate,Hanseniaspora delbrueckii, qui ont été signalées comme produisant des quantités élevées de plusieurs composés d’arômes comme le 2-phényléthanol, l'octanoate d'éthyle, l'acide butanoïque ou les esters phénoliques. Dans un travail précédent, les inventeurs ont isolé à partir de fruits du dragon de l'île de la Réunion, une souche de levure filamenteuse produisant des arômes, identifiée comme étantSaprochaete suaveolens. Cette espèce de levure produit des composés organiques volatils (COV) très diversifiés, parmi lesquels de nombreux esters α-insaturés (tiglate d'isobutyle, tiglate d'isoamyle, tiglate de butyle, tiglate d'éthyle, 2-méthylpropanoate d'éthyle, 3-méthylbut-2-énoate d'éthyle, but-2-énoate d'éthyle) que l'on trouve rarement dans le bouquet aromatique d'autres espèces deSaccharomycesetnon-Saccharomyces. Les inventeurs ont également démontré que la production de ces esters α-insaturés parS. suaveolensprovient du catabolisme des acides aminés à chaîne ramifiée par la voie de la β-oxydation (BOP). Une représentation simplifiée des voies métaboliques de ces acides aminés ramifiés est présentée dans la . Brièvement, ces acides aminés ramifiés sont d'abord convertis en leur α-cétoacide ramifié correspondant dans une réaction catalysée par une transaminase (TA). Ensuite, chez lesespèces Saccharomycesetnon-Saccharomyces, l’α-cétoacide entre dans la voie d'Ehrlich (EP) qui implique une décarboxylation suivie soit d'une oxydation pour produire des acides carboxyliques sous l’action d’une aldéhyde déshydrogénase (AlDH), soit d'une réduction en alcools supérieurs sous l'action d'une alcool déshydrogénase (ADH). L'estérification des alcools supérieurs avec l'acétyl-CoA peut générer des acétates sous l’action catalytique d’une ester synthase ou d’une alcool-O-acétyltransférase (AFT). Une deuxième voie qui a été identifiée chez les champignons filamenteux mais absente chezSaccharomyces cerevisiaeest la β-oxydation de l'α-cétoacide à chaîne ramifiée en acétyl-CoA. Dans cette voie, l'intermédiaire α-céto-acide est décarboxylé par oxydation en un acyl-CoA, par la déshydrogénase des α-cétoacides à chaîne ramifiée (BCKAD) qui est l'enzyme régulant cette voie. L'acyl-CoA produit peut être entièrement dégradée en acétyl-CoA (+ propionyl COA dans le cas de la L-leucine et de la L-isoleucine) par la voie de la β-oxydation. Alors que les levures peuvent produire des esters éthyliques par condensation d'acyl-CoA à chaîne courte ou moyenne dérivée de la dégradation des acides gras avec de l'éthanol ou des alcools supérieurs (voir ) dans un processus appelé « alcoolyse » catalysé par une acyl-CoA:éthanol-acyltransférase, une originalité constatée chezSaprochaete suaveolensest que l'intermédiaire énoyl-CoA dérivé de l'oxydation des acides aminés peut être estérifié avec des alcools pour donner naissance à divers esters α-insaturés. Dans l'ensemble, la combinaison de la voie d'Ehrlich (EP) et de la voie de la β-oxydation des acides gras (BOP) conduit à la production d'une nouvelle variété de COV, des esters α-insaturés, qui caractérisent le bouquet aromatique des espèces de Saprochaete et de Geotrichum.

L’identification de la capacité de la soucheSaprochaete suaveolensà produire des COV d’intérêt ouvre de nouvelles perspectives dans la production d’arômes naturels complexes à haute valeur ajoutée. Toutefois, les quantités produites par la souche naturelle sont très faibles, ce qui ne permet pas d’envisager une exploitation industrielle.

Les professionnels de l’agroalimentaire recherchent de nouvelles sources d’arômes naturels pour pouvoir proposer aux consommateurs des produits de qualité tant sur le plan gustatif que de la sécurité alimentaire.

La présente invention s’articule autour d’un concept inventif commun à savoir la mise en évidence de l’existence d’un lien fonctionnel entre d’une part la capacité/incapacité de souches de microorganisme, notamment de levures, à croître sur un milieu utilisant uniquement les acides aminés branchés comme source de carbone, et d’autre part leur capacité à produire des esters α-insaturés.

Sur cette base, les inventeurs ont tout d’abord mis en œuvre une méthode de criblage originale basée sur la capacité de croissance rapide des souches sur des milieux contenant au des acides aminés à chaîne ramifiée (isoleucine, valine et leucine ; souches dites « ILV+ ») comme seule source de carbone. Puis, ils ont étudié la capacité des souches ILV+ à produire des esters α-insaturés afin d’identifier des souches naturelles capables de produire des molécules d’arômes d’intérêt. Douze souches produisant des esters α-insaturés ont été isolées, dont deux produisant des esters α-insaturés non produits par la souche de référenceS. suaveolens, validant l’intérêt de cette méthode de criblage.

Dans la suite logique de ces premiers travaux, les inventeurs ont cherché à augmenter la quantité d’esters α-insaturés produite par la soucheS. suaveolens.En considérant les voies métaboliques de la voie d’Ehrlich et la voie de la β-oxydation décrites précédemment, les inventeurs ont émis l’hypothèse selon laquelle l'incapacité deS. suaveolensà se développer sur des acides aminés à chaîne ramifiée pourrait être utilisée comme une approche pour améliorer la production de COV. En l’absence de connaissance fine du génome de cette espèce dont la séquence nucléotidique brute n’a été que récemment publiée, une approche de criblage basée sur la mutagenèse aléatoire a été choisie pour cribler les mutants deS. suaveolensincapables de croître sur des milieux comportant uniquement des acides aminés ramifiés (leucine, isoleucine et valine, ILV) comme seule source de carbone. Neuf mutants présentant ce phénotype ont été isolés et leurs COV ont été quantifiés. L'une d'entre elles s'est avérée présenter le phénotype attendu de producteur de COV plus élevé. La détermination des activités des enzymes impliquées dans le catabolisme des acides aminés à chaîne ramifiée par les voies d'Ehrlich et de la β-oxydation a montré que l'accumulation plus élevée de COV dans ce mutant coïncidait avec une perte presque complète de l'activité de l'énoyl-CoA hydratase et une augmentation de 2 fois de l'acyl-CoA hydrolase.

Ce résultat établit que la combinaison de ces deux caractéristiques – (i) absence d’activité énoyl-CoA hydratase et (ii) activité acyl-CoA hydrolase soutenue - peut être utilisée pour préparer des souches de micro-organismes capables d’augmenter leur production en esters α-insaturés.

Par ces deux méthodes de criblage, les inventeurs proposent de sélectionner des souches capables de produire des esters α-insaturés et qui présentent un intérêt soit pour la diversité des molécules d’arômes produites, soit pour leur niveau de production. Ces souches peuvent ensuite être exploitées telles que ou modifiées génétiquement pour améliorer leurs performances de rendement.

L’invention concerne en particulier une souche de microorganisme capable de produire au moins 400 mg/L d’esters alpha-insaturés

Elle concerne également le criblage de souches de levures capables de produire des esters α-insaturés consistant à :

- sélectionner, dans des isolats naturels, les souches capables de croître sur un milieu ne contenant que des acides aminés branchés (isoleucine, leucine et valine) comme source de carbone

- quantifier la production d’esters α-insaturés dans les souches isolées

- sélectionner les souches capables de produire la quantité requise d’esters α-insaturés.

Elle concerne aussi une méthode de criblage de souche de microorganisme obtenues par mutagenèse UV deS. suaveolensprésentant une production en esters α-insaturés augmentée par rapport à la souche mère de référence non mutée, comprenant les étapes de :

- Mutagénèse aléatoire par irradiations UV d’isolats de la « souche mère » contenant du glucose comme source de carbone

- Transfert des isolats sur :

o un milieu contenant du glucose (milieu glucose) comme seule source de carbone

o un milieu contenant de l’isoleucine comme seule source de carbone

o un milieu contenant de la leucine comme seule source de carbone

o un milieu contenant de la valine comme seule source de carbone

- Identification des mutants se développant sur milieu glucose mais incapables de croître sur milieu contenant de l’isoleucine, de la leucine ou de la valine comme seule source de carbone, parmi les souches initialement irradiées

- Quantification de la production d’esters α-insaturés de chacune des souches correspondantes aux souches incapables de croître sur milieu contenant de l’isoleucine, de la leucine ou de la valine

- Sélection des souches incapables de croître sur milieu contenant de l’isoleucine, de la leucine ou de la valine qui produisent une plus grande quantité d’esters α -insaturés que la souche mère.

Ainsi, la présente invention concerne aussi un procédé de préparation d’une souche de microorganisme génétiquement modifiée capable de produire au moins 400 mg/L d’esters α -insaturés consistant à :

1. Disposer d’une souche produisant un niveau basal d’esters α-insaturé
2. Réduire l’activité enoyl-CoA hydratase
3. Augmenter l’activité acyl-CoA hydratase,

les étapes b. et c. pouvant être réalisées par mutagénèse du(des) gène(s) codant pour ces enzymes.

Enfin, elle concerne un procédé de préparation d’une souche de microorganisme génétiquement modifiée capable de produire au moins 400 mg/L d’esters α-insaturés consistant à :

1. Disposer d’une souche ne produisant pas d’esters α -insaturé
2. Réduire l’activité enoyl-CoA hydratase si elle est présente dans ladite souche
3. Augmenter l’activité acyl-CoA hydratase si elle présente, ou apporter une activité acyl-CoA hydratase si elle est absente,

les étapes b. et c. pouvant être réalisées par mutagénèse du(des) gène(s) codant pour ces enzymes.

Avantages de l’invention

La présente invention présente l’avantage de décrire une nouvelle méthode de criblage de souches naturellement productrices de COV d’intérêt, en particulier des esters α-insaturés aux notes aromatiques, basée sur leur capacité à croître sur un milieu ne contenant que des acides aminés branchés comme source de carbone. Cette méthode est simple et rapide.

L’invention propose également de cribler parmi des souches productrices de COV d’intérêt, des souches mutantes ayant acquis la capacité à produire des COV en plus grande quantité. Cette méthode de criblage est simple d’analyse et rapide à mettre en œuvre. Elle consiste en une mutagenèse aléatoire suivie d’une sélection sur un milieu ne contenant que des acides aminés branchés comme source de carbone. Les techniques de mutagenèse aléatoires génèrent un très grand nombre de souches portant potentiellement la mutation recherchée et nécessitent donc une méthode subséquente de criblage qui soit rapide. Or, le criblage de microorganismes pour la production de COVs est aujourd’hui essentiellement basé sur des méthodes chromatographiques qui peuvent s’avérer très chronophages lorsque le nombre de souches à analyser est élevé. Les inventeurs proposent une approche innovante basée sur un criblage physiologique établi en posant l’hypothèse que la capacité des souches à croître sur un milieu contenant les acides aminés branchés isoleucine, leucine ou valine (milieu ILV) est à l’origine d’une diminution de rendement en production de COV. Il s’agit donc de sélectionner, à partir d’une souche mère productrice de COV d’intérêt, des souches mutantes ayant perdu la capacité à croître sur milieu ILV comme seule source de carbone. Ces souches mutantes ont potentiellement augmenté leur production de COV en favorisant le flux d’acides aminés branchés vers la voie de production des arômes. La pertinence de cette approche est confirmée par les résultats expérimentaux décrits ci-après et l’identification d’une souche mutante répondant à ces critères de sélection.

La présente invention décrit également une souche de levureS. suaveolensgénétiquement modifiée capable de produire au moins 400 mg/L d’esters α-insaturés. Ce niveau de production est significativement supérieur à celui des souches actuellement disponibles. Elle permet d’envisager une production à l’échelle industrielle. Les seuils de production cible étant propres à chaque exploitation.

Enfin la présente invention fournit une méthode de préparation d’un microorganisme capable de produire des COV, notamment des esters α-insaturés, consistant à : réduire ou éliminer l’activité enoyl-CoA hydratase si cette activité est présente dans le microorganisme ciblé et à augmenter l’activité de l’enzyme acyl-coA hydratase si elle est présente ou à l’apporter si elle n’est pas présente dans le microorganisme ciblé. Cette méthode est applicable à un grand nombre de cellules, en particulier aux cellules validées pour la production industrielle, telles queS. cerevisae.

DESCRIPTION DES FIGURES

: Schéma simplifié du catabolisme des acides aminés à chaîne ramifiée impliquant la voie d'Ehrlich (EP) et la voie de la β-oxydation (BOP) chezSaprochaete suaveolens.

Abréviation : TA= transaminase, BCKAD : cétoacide déshydrogénase à chaîne ramifiée ; ADH : alcool déshydrogénase ; DC : décarboxylase ; ACyD : acyl-CoA déshydrogénase dépendante du FAD ; ACyH : acyl-CoA hydrolase ; ECH : énoyl-CoA hydratase ; ACyDH : -acyl-CoA déshydrogénase dépendante du NAD, -KT : -céto acyl-CoA thiolase ; AAT : alcool acyl transférase.

: Courbe représentative des scores de PC2 par rapport à PC1 selon la production d'arômes des souches et leurs origines L'analyse des composantes a été réalisée à l'aide du logiciel XLStat Applied Sensory (2020.1.3). Le groupe 1 comprenait S13, S18, S21, S37, S38, S70, S74, S82, S84, S105 et S106. Le groupe 2 était composé uniquement de S88. Le groupe 3 comprenait S3, S12, S64, S68, S75 et S91. Le groupe 4 comprenait S27, S99 et S100.

: Analyse de regroupement des souches isolées produisant des COV. Les souches ont été regroupées sur la base de leur production d'arômes et de leur origine en utilisant la méthode de Ward et en utilisant le logiciel XL Stat Applied Sensory (2020.1.3). La troncature automatique (ligne pointillée) a permis d'identifier quatre groupes cohérents de souches. La plupart des souches ont été classées dans le groupe 1 (11 souches) et le groupe 3 (6 souches). Le groupe 4 comprenait trois souches. La souche S88 s'est retrouvée seule dans le groupe 2. Le dendrogramme est plus aplati pour le groupe 4, ce qui suggère que ce groupe de souches est plus homogène que les deux autres groupes.

: Taux de survie de S. suaveolens en fonction du temps d’exposition aux UV. Les valeurs sont celles de huit expériences indépendantes, la valeur standard étant présentée sous forme de barre verticale.

: COV totaux déterminés par chromatographie en phase gazeuse couplée à un détecteur de spectre de masse (HS-SPME-GC/MS) produits par la souche sauvage deSaprochaete suaveolenset 9 mutants ILV- isolés. Les données présentées sont la moyenne ± SD de trois cultures indépendantes.

: Analyse en composantes principales (ACP) des COV produits par la souche sauvage deSaprochaete suaveolenssauvage et ses 9 mutants ILV- générés par irradiations UV.

: Représentation par carte en mode code couleur des COV déterminés dans le type sauvage et dans 9 mutantsILV -deS. suaveolensobtenus par mutagenèse UV. Les données sont représentées sous forme de ratio de la valeur des COV dans le mutant par rapport au type sauvage. Les COV ont été classés comme provenant principalement de la voie d'Ehrlich (EP), des intermédiaires acyl-COA ou enoyl-COA de la voie d'oxydation.

PARTIE EXPERIMENTALE

EXEMPLE 1 : Criblage de la biodiversité des levures provenant des fèces d'animaux sauvages d'Afrique du Sud pour la production d'esters α-insaturés volatils

1. Matériels et méthodes

Matériaux biologiques

Le type sauvageSaccharomyces cerevisiaeCEN.PK 112-2N (van Dijken)et al., 2000) a été utilisé dans cette étude. Une souche deSaprochaete suaveolens(anciennementGeotrichum fragrans) précédemment isolée de fruits de Pitaya (Hylecereus polyrhisus) à l'île de la Réunion, en France (Grondinet al., 2015a) a également été utilisée.

Des fèces fraîches d'animaux sauvages ont été collectées de manière aseptique dans différents endroits des zoos, des réserves et des parcs nationaux d'Afrique du Sud. La collecte a été effectuée en conditions stériles et les échantillons ont ensuite été conservés à 4°C jusqu'à leur utilisation. En outre, des échantillons lyophilisés de fèces d'animaux sauvages ont été obtenus par un donateur anonyme. Un total de 118 échantillons a été étudié.

Isolement et sélection des souches de levure ILV+.

Pour les échantillons sur écouvillon, les écouvillons étaient ajoutés directement à 10 ml de solution de Ringer stérile. Pour les échantillons en tube, 1 g de fèces a été pesé au préalable et dissous dans la solution de Ringer. Des dilutions en série ont ensuite été préparées et 100 µL de chaque dilution ont été étalés à la surface d'un milieu agar Yeast-Peptone-Dextrose (Biolab diagnostics LTD, Afrique du Sud) complété par 0,1 g.L^-1de chloramphénicol (EMDQ Millipore Corp. Billerica, MA USA) (YPD-chloramphénicol) pour favoriser la croissance et la sélection des levures. Les boîtes de Pétri ont ensuite été incubées à 30°C pendant 48 heures jusqu'à ce que les colonies cellulaires soient complètement formées. Les colonies ont ensuite été isolées en répétant la sous-culture sur milieu gélosé YPD-chloramphénicol et conservées à 4°C. Pour les échantillons lyophilisés, 1 g de fèces a été remis en suspension dans 10 ml de bouillon nutritif stérile (Merck, Afrique du Sud) et mélangé au vortex avant d'être incubé à 25°C pendant 5 jours avant d'être ensemencé sur un milieu YPD-chloramphénicol.

La sélection des souches capables de se développer sur des milieux contenant uniquement des acides aminés à chaîne ramifiée (isoleucine, leucine et valine) comme seule source de carbone (souches ILV+) a été effectuée comme suit. 5 ml de bouillon YPD ont été inoculés avec chaque souche isolée et la culture a été incubée pendant la nuit à 30°C sous agitation. Après centrifugation de la culture (13 000 rpm, 5min), le culot cellulaire a été lavé deux fois avec 5 mL d'eau physiologique stérile et remis en suspension dans 10 mL d'eau physiologique stérile. Ensuite, une culture de 10⁶cellules.mL^-1a été préparée dans de l'eau physiologique stérile et des cultures de 10⁵et 10⁴cellules.mL^-1ont été préparées par dilution en série. 5µL de chaque suspension ont été déposés deux fois sur un milieu YNB (base levure - azote) complété par 1g.L^-1d'isoleucine, leucine ou valine ou par 2 g. L^-1de glucose (YNB-Ile, YNB-Leu, YNB-Val_,YNB-Glc respectivement). Les souchesS. suaveolensetS. cerevisiaeont été préparées selon le même protocole et ont été utilisées comme témoins positifs et négatifs, respectivement. Les boîtes de Pétri ont ensuite été incubées pendant 48 heures à 30°C avant lecture.

Analyse qualitative et semi-quantitative des composés organiques volatils (COV)

Les souches ont été inoculées dans un tube à vis de 20 mL contenant 15 mL de milieu YPD-agar penché et incubées à 30°C pendant 24 heures. Ensuite, les flacons ont été scellés et incubés pendant 24 heures à 30°C. Pour l'analyse qualitative, l'espace de tête des cultures inclinées a été directement soumis à une microextraction en phase solide (HS-SPME) à l'aide d'une fibre de 2 cm de long recouverte de 50/30 µm de divinylbenzène/Carboxène sur polydiméthylsiloxane lié à un noyau flexible de silice fondue (Supelco). Pour l'analyse semi-quantitative, avant la microextraction, 10 µL d'octan-1-ol (à 0,5 g.L^-1dans du dichlorométhane) ont été ajoutés dans les tubes scellés comme standard interne. La fibre a ensuite été exposée à l'espace de tête des souches pendant 15 min à 30°C et insérée dans le port d’injection à 250°C pendant 2 min. Les métabolites ont été séparés par chromatographie en phase gazeuse (GC) à l'aide d'une colonne ZB-5MSI (30m * 0,32mm * 0,25 µm d'épaisseur de film), couplée à un spectromètre de masse (Shimadzu GCMS-QP2010 Ultra). Le gaz vecteur (H₂) a été réglé à un débit de 1,4 mL.min^-1. La température de la colonne a été maintenue à 45°C pendant 2 min et a été portée à 230°C à raison de 4°C.min^-1. Cette température a été maintenue pendant 5 min avant la fin. Les composés organiques volatils ont été identifiés en comparant leurs spectres de masse et leur indice de Kovats expérimental avec la base de données NIST (www.chemdata.nist.gov).

PCR en colonie

La PCR de colonie a été réalisée en utilisant des cellules fraîches comme modèle amplifiable. Les cellules ont été prélevées directement d'une colonie de levure fraîche à l'aide d'une anse de 1µL. Les cellules ont été mises en suspension dans 100µL de mélange réactionnel PCR contenant 0,5µM d'amorces ITS1 (5' TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3') ou NL1 (5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG), 0.5 µM d'amorce ITS4 (5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC 3') ou NL4 (5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG), 200 µM de chaque désoxynucléotide, 1 x de tampon et 2,5 unités d'ADN polymérase (Qiagen). Les conditions de PCR étaient les suivantes : dénaturation initiale à 95°C pendant 5 min ; 35 cycles de dénaturation à 94°C pendant 1 min, 1 min de recuit des amorces à 55,5°C pendant 1min,1 min d'extension à 72°C, et une extension finale à 72°C pendant 10min.

Les produits PCR ont été analysés par électrophorèse sur des gels d'agarose à 2%, avec un tampon TAE 1 x à 100V pendant 20 min. Les gels ont été colorés avec du Midori Green (Nippon Genetics Europe) et visualisés sous lumière UV. Les tailles ont été estimées par comparaison avec une échelle d'ADN de 1 kbp (1 kbp ladder, Gene O'ruler, ThermoFischer). L'identification des souches a été réalisée par séquençage des produits PCR obtenus par Eurofins Genomics (Allemagne). Les séquences ont été analysées en utilisant BLAST au NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).

Analyse statistique

Les données expérimentales ont été soumises à une analyse factorielle (méthode d'analyse en composantes principales) et à une analyse en grappes (méthode de Ward) à l'aide du logiciel XLStat Applied Sensory (2020.1.3)

II - Résultats et discussion

Sélection de souches à forte capacité de production de COV

En 2015, Grondin et ses collègues ont montré que les esters α-insaturés étaient produits par S. suaveolens par estérification de l'intermédiaire énoyl-CoA de la voie de la β-oxydation des acides aminés à chaîne ramifiée (Grondinet al .,2015). Le catabolisme de l'intermédiaire énoyl-CoA par la voie de la β-oxydation conduit à la production d'acétyl-CoA qui peut ensuite être métabolisé via le cycle TCA et le shunt glycoxylique. Cette propriété spécifique du métabolisme deS. suaveolensa été utilisée comme base pour le développement d'une méthode de sélection utilisant la capacité des levures à se développer sur des milieux contenant uniquement des acides aminés à chaîne ramifiée (isoleucine, leucine et valine) comme seule source de carbone (souches ILV+). En faisant l'hypothèse que cette méthode permettrait de sélectionner des souches surproduisant des esters α-insaturés, nous avons recherché des souches ILV+ parmi les 119 souches isolées des fèces d'animaux sauvages, tout en utilisantS. suaveolensetS. cerevisiaecomme contrôle positif et négatif respectivement. De manière surprenante, nous avons constaté que 43 des 119 souches testées présentaient les critères ILV+.

Les volatilomes des souches sélectionnées, c'est-à-direles composés organiques volatils produits par toutes les souches ILV+ (43 souches isolées des fèces et le témoin positifS. suaveolensS0) ont été extraits par microextraction en phase solide de l'espace de tête, et analysés par chromatographie en phase gazeuse couplée à un détecteur de spectrométrie de masse (HS-SPME-GC/MS) après 48h de croissance sur un milieu YPD à 30°C. Parmi les 43 souches ILV+, 21 souches, à savoir S4, S17, S22, S28, S33, S40, S44, S58, S60, S62, S63, S65, S72, S78, S92, S97, S117, S121, S123, S124 et S125, n'ont produit aucun COV. Cela suggère que pour ces souches, la voie d’Ehrlich est inactive. De plus, cela démontre que l'assimilation de l'isoleucine, de la leucine et de la valine dans la voie de la β-oxydation ne peut pas être strictement liée à la production d'arômes. Un total de 50 COV différents a été détecté dans le volatilome des 22 souches restantes et deS. suaveolens. Ces COV ont été classés en quatre catégories, à savoir les acides, les alcools, les esters et les esters α-insaturés.

Analyse multivariée des isolats en fonction de leur production de composés organiques volatils.

Pour mieux visualiser le comportement des souches en ce qui concerne leur performance de production de COV (nombre de COV) une analyse en composantes principales (ACP) a été effectuée sur les 22 souches sélectionnées qui produisaient des COV (Figures 2 et 3).

Le nombre d'acides n'a été corrélé à aucun des autres paramètres, probablement parce qu'ils ne représentent qu'une petite partie des COV détectés par rapport aux autres catégories de COV. Cependant, nous avons noté une corrélation entre les autres paramètres de COV. Par exemple, le nombre total de COV était fortement corrélé avec le nombre d'esters (corrélation de Pearsonrde 0.990) et le nombre d'esters α-insaturés (r=0.938) mais il était négativement corrélé avec le nombre d'alcools (1, correspondant au 2-phényléthanol,r=-0.514), ce qui signifie que les esters et les esters α-insaturés participent significativement au nombre total de COV. Ainsi, nous avons également identifié un certain nombre d'esters et d'esters α-insaturés qui étaient fortement corrélés entre eux (r=0,903), mais ils étaient tous deux négativement liés au nombre d'alcools (r=-0,560 etr=-0,551 respectivement), ce qui signifie que les volatilomes des souches qui contenaient beaucoup d'esters (insaturés ou non), ne présentaient pas d'alcool. Nous avons finalement conclu qu'il n'y avait pas de corrélation significative entre les paramètres des COV et l'origine des souches.

Analyse des COV produits par toutes les souches productrices d'arômes

La majeure partie des COV provient du catabolisme des acides aminés. Par exemple, le 2-méthylbutanoate d'éthyle et le 3-méthylbutanoate d'éthyle sont probablement produits dans la voie d'Ehrlichviale catabolisme de l'isoleucine et de la leucine respectivement (Hazelwoodet al., 2008). De plus, le 2-méthylbut-2-énoate d'éthyle et le 3-méthylbut-2-énoate d'éthyle sont probablement aussi produits par le catabolisme de l'isoleucine et de la leucine, mais par la voie de la β-oxydation (Grondinet al., 2015). Selon la base de données des voies métaboliques KEGG (www.genome.jp), les principales voies métaboliques impliquées dans la production des autres COV détectés dans cette étude sont la voie de la β-oxydation des acides gras (hexanoate d'éthyle, octanoate d'éthyle, etc.), la voie du butanoate (acétate de butyle, butanoate de butyle, butanoate d'éthyle, etc.), la voie du propanoate (propanoate de butyle) et la voie du pentanoate (pentanoate d'éthyle). Enfin, certains esters résultent probablement de l'estérification de deux unités générées par deux voies métaboliques différentes. Par exemple, la formation du butanoate de 2-méthylbutyle est probablement générée par l'estérification du 2-méthylbutanol (synthétisé par la voie d'Ehrlich) et de l'acide butanoïque (synthétisé par la voie du butanoate).

Les esters représentent 37 des 50 COV détectés dans cette étude. Ils sont présents dans le volatilome de toutes les souches, à l'exception des souches S74 et S82 qui ne produisent que du 2-phényléthanol. Les souches S0 (S. suaveolens), S12 et S91 présentaient les plus grandes diversités d'esters dans leur volatilome. Le volatilome de S0 présentait la plus grande diversité d'esters, avec 30 composés différents de cette catégorie détectés. Parmi ceux-ci, 13 esters n'ont pas été identifiés dans les autres souches étudiées dans cette étude. Cependant, le butanoate de pentyle, qui dégage un arôme d'abricot-ananas fréquemment utilisé dans l'alimentation et la parfumerie, n'a pas été détecté dans le volatilome de S0, mais l'a été dans les souches S12 et S91. Ce résultat est intéressant car ce composé est surtout présent dans les fruits (pomme et fève de cacao) mais rarement détecté dans le volatilome des micro-organismes.

Enfin, 9 esters α-insaturés différents ont été détectés dans les souches S0 et S12 des 22 souches productrices de COV. Les 10 souches restantes ne présentaient aucun ester α-insaturé dans leur volatilome, ce qui signifie que le critère ILV+ ne peut pas être strictement lié à la production d'esters α-insaturés. Les esters α-insaturés les plus fréquemment détectés étaient le 3-méthylbut-2-énoate d'éthyle (également appelé 3-méthylcrotonate d'éthyle) et le 2-méthylbut-2-énoate d'éthyle (ou tiglate d'éthyle), produitsviala β-oxydation de la leucine et de l'isoleucine respectivement. Deux esters α-insaturés étaient produits par des souches issues de la faune sud-africaine mais pas par la souche S0. Le premier était le 3-méthylbut-2-ènoate de 3-méthylbutyle (description de l'arôme inconnue), produit uniquement par la souche S12 alors que le second était l’hex-2-ènoate d’éthyle (arôme fruité) qui était produit à la fois par les souches S12 et S91. Ces composés étant tous deux rarement décrits dans le volatilome de levure, il a été décidé d'étudier plus en détail les souches S12 provenant de fèces de chat à pieds noirs( Felis nigripes )et S91 provenant de serval( Leptailruus serval).

L'analyse semi-quantitative des COV produits par les souches S12, S91 et S0 a montré que S0 produit plus de 50 fois plus de COV que S12 et S91. Cela a mis en évidence que le métabolisme aromatique de S0 est beaucoup plus actif que celui de S12 et S91 pour la production d'alcool, d'esters et d'esters α-insaturés. D'un point de vue quantitatif, les souches S12 et S91 présentaient une production globale de COV similaire (≈4,9 mg/L) mais également en termes d'esters (≈4,0 mg/L) et d'esters α-insaturés (≈0,6 mg/L), suggérant que ces deux souches possèdent un patrimoine génétique très proche. Ceci a été confirmé par les résultats d’amplification et de séquençage de la région non-codante et variable de l’espaceur transcrit interne ribosomique (ITS) et du domaine D1/D2. En effet, les analyses et les BLAST (NCBI) des séquences des régions ITS ou D1/D2 n’ont pas permis de distinguer les souches S12 et S91 l’une de l’autre puisque ces deux souches présentaient des séquences nucléotidiques 100% identiques à celle de la soucheGalactomyces candidus(Geotrichum candidumMK381259.1).

Les données de la littérature mentionnent déjà la production d’esters α-insaturés parGalactomyces candidus(Grondin et al., 2017 ; Simon Amoikon et al., 2020) mais aucune ne rapporte la production de 3-méthylbut-2-ènoate de 3-méthylbutyle et d’hex-2-ènoate d’éthyle pour cette souche. Dans notre étude, ces composés étaient produits à des concentrations très faibles par les souches S12 et S91 (≈3 µg/L et 12 µg/L respectivement) mais la production d’hex-2-ènoate d'éthyle atteignait 110 µg/L pour la souche S91. Comme les données moléculaires n’ont pas permis de distinguer la souche S12 de la souche S91, la différence de leur volatilome respective suggère qu’ils appartiennent à des sous-espèces différentes.

Conclusion

Ce travail visait à isoler des souches productrices d'esters α-insaturés dans les fèces de la faune sauvage d'Afrique du Sud par une stratégie basée sur le métabolisme deS. suaveolens ,pris comme modèle pour sa capacité à se développer sur des milieux contenant uniquement des acides aminés branchés comme source de carbone (ILV+) couplée à sa production d'esters α-insaturés. 12 souches productrices d'esters α-insaturés ont été isolées.

Parmi les souches isolées, deux souches, à savoir S12 et S91, toutes deux identifiées commeGalactomyces candidus(Geotrichum candidum) produisaient des esters α-insaturés, à savoir le 3-méthylbut-2-ènoate de 3-méthylbutyle et l’hex-2-ènoate d’éthyle, qui ne sont pas produits par la souche modèle deS. suaveolens. Par conséquent, on peut conclure que la méthode de sélection des souches basée sur la recherche de phénotype ILV+ est un moyen prometteur d’isoler des souches produisant de nouveaux esters α-insaturés.

EXEMPLE 2 : Criblage par mutagenèse UV et caractérisation physiologique de souches mutantes de la levure Saprochaete suaveolens ayant une plus grande capacité à produire des composés aromatiques

I - Matériel et méthodes

Souches de levure, mutagenèse UV et criblage

La souche diploïde prototropheSaccharomyces cerevisiaeCEN.PK 112-2N (van Dijkenet al.,2000) et une souche sauvage deSaprochaete suaveolens(anciennementGeotrichum fragrans) précédemment isolée de Pitaya (Hylecereus polyrhisus) à l'île de la Réunion, France (Grondinet al., 2015a) ont été utilisées dans cette étude. La mutagenèse UV deS. suaveolensa été réalisée selon le protocole décrit par Winston en2008 établi pour la mutagenèse UV de la levureSaccharomyces cerevisiae, et qui a été modifié pourS. suaveolens. Cette souche a été incubée dans 10 mL de milieu extrait de levure peptone dextrose (YPD ; 20 g.L^-1peptone, 20 g.L^-1dextrose et 10 g.L^-1extrait de levure) à 30°C pendant la nuit, recueillie et lavée deux fois avec 10 mL d'eau stérile. Un aliquot de 100 µL à 5.10⁴cellules.mL^-1a été étalé sur un milieu de base azote et levure (YNB) supplémenté de 2g.L^-1de glucose (YNB-Glc) avant exposition à l'irradiation UV (254 nm, 30 cm de haut) à des temps allant de 0 et 540 sec. Pour arrêter les photoréactions, les plaques ont été maintenues dans l'obscurité et incubées à 30°C pendant 15h. En utilisant la méthode de réplication, les colonies irradiées ont été répliquées sur YNB supplémenté de 1 g.L^-1d'isoleucine, de leucine ou de valine ou de 2 g.L^-1de glucose (YNB-Ile, YNB-Leu, YNB-Val, YNB-Glc respectivement) et incubées pendant 5 jours à 30°C. Les colonies se développant sur YNB-Glc et non sur YNB-Ile, YNB-Leu ou YNB-Val ont ensuite été repiquées sur milieu YPD gélosé. La confirmation des clones mutants sélectionnés a été réalisée par un test de croissance supplémentaire sur milieu YPD suivi de YNB-Ile. Ainsi, les clones ont été suspendus dans 5 ml de YPD et incubés pendant la nuit à 30°C. La culture a ensuite été centrifugée (13 000 rpm, 5min) et remise en suspension dans 5 mL d'eau stérile. Ensuite, 5µL de 10⁶, 10⁵et 10⁴cellules.mL^-1préparées dans de l'eau stérile ont été déposées en double dans une plaque YNB-agar contenant du glucose, de la leucine, de la valine ou de l'isoleucine comme source de carbone. Les plaques ont été incubées pendant 48 heures à 30°C avant d'être lues. Cette procédure a été effectuée deux fois de plus pour assurer la stabilité de la mutation. Les souches sauvages deS. suaveolensetS. cerevisiaeont été utilisées comme contrôle positif et négatif, respectivement.

Analyse des composés organiques volatils (COV)

Les souches ont été ensemencées dans un flacon à sertir de 20 ml contenant 15 ml de milieu de gélose YNB supplémenté avec 2 g.L^-1de glucose et 1 g.L^-1d'isoleucine (YNB-Glc-Ile) et incubées à 30°C pendant 24h. Ensuite, le flacon a été scellé et ré-incubé pendant 24 h à 30°C. Avant l'analyse, 10 µL d'octan-1-ol (à 1 g.L^-1dans du dichlorométhane) ont été ajoutés dans les flacons scellés comme standard interne. L'espace de tête des cultures inclinées a été soumis à une analyse SPME à l'aide d'une fibre de 2 cm de long recouverte de 50/30 µm de divinylbenzène/carboxène sur du polydiméthylsiloxane lié à un noyau flexible de silice fondue (Supelco). La fibre a été exposée à l'espace de tête pendant 15 minutes à 30°C et insérée dans l'orifice d'injection à 250°C pendant 2 minutes. Les métabolites ont été séparés par GC, sur une colonne ZB-5MSI (30m * 0.32mm * 0.25µm d'épaisseur de film), couplée à un spectromètre de masse (Shimadzu GCMS-QP2010 Ultra). Le gaz vecteur (H₂) a été réglé à un débit de 2 mL.min^-1. La température de la colonne a été maintenue à 40°C pendant 2 min, portée à 150°C à 10°C.min^-1, puis portée à 240°C à 30°C.min^-1avant la fin. Les composés organiques volatils ont été identifiés en comparant leurs spectres de masse et leur indice de Kovats expérimental avec la base de données de NIST (www.chemdata.nist.gov).

Préparation d'extraits bruts et dosage des activités enzymatiques

Les cellules de levure ont été cultivées dans des Erlenmeyer de 250 ml contenant 50 ml de YNB-Glc ou de YNB-Glc-Ile pendant 24 h à 30°C. Ensuite, l'équivalent de 100 unités DO à 600 nm de la culture a été collecté dans des tubes Falcon de 50 ml par centrifugation (2000 rpm, 4°C, 1 min). Les culots cellulaires ont été remis en suspension dans 1 ml d'eau froide, transférés dans des tubes Eppendorf, lavés une fois de plus avec de l'eau froide. Les culots obtenus après centrifugation (2 min à 10.000 rpm) ont été conservés à -20°C jusqu'à leur utilisation.

PourS. cerevisiae, des billes de verre (0,5 mm de diamètre) et 500 µL de tampon d'extraction (tampon phosphate de potassium 50 mM, pH 7,4 contenant 2 mM EDTA, 100 mM KCl et 1 mM DTT) ont été ajoutés au culot cellulaire. Les cellules ont été brisées dans un instrument MP BiomedicalsTM FastPrep-24TM 5G en utilisant 6 cycles de 30s à 6,5 m.s-1 et 1 min dans de la glace entre chaque cycle. Comme cette procédure n'a pas fonctionné pourS. suaveolens, ces cellules ont été brisées à l'aide d'un Qiagen Retsh Tissue Lyser II (3 min, 30Hz) avec une bille de tungstène froide introduite dans le tube en présence de 500 µL du même tampon d'extraction que ci-dessus. Après centrifugation des tubes Eppendorf (1000g, 5 min, 4°C), le surnageant correspondant aux extraits bruts des deux espèces de levures a été passé sur des filtres centrifuges Amicon Ultra-05 10K selon le protocole du fabricant pour éliminer les petites molécules. Les extraits filtrés ont ensuite été utilisés pour les essais enzymatiques et la détermination des protéines.

Tous les essais enzymatiques ont été réalisés à l'aide d'un spectrophotomètre UV-Visible Agilent 8453 dans des cuvettes de 1 ml de volume final avec une quantité appropriée d'extrait brut. La spécificité (ou le blanc) de la réaction enzymatique a été vérifiée en effectuant la réaction à la fois en présence du substrat sans extrait brut et en présence d'extrait brut sans substrat. Pour l'α-cétoacide déshydrogénase à chaîne ramifiée (BCKAD), la réaction correspondait à la décarboxylation oxydative de l'acide 2-oxo-4-méthylpentanoïque mesurée par la réduction du NAD+ en NADH à 340 nm. Le mélange réactionnel contenant 50 mM de tampon phosphate de potassium pH 7,4, 2 mM d'EDTA, 0,2 mM de DTT, 0,5 mM de TPP, 5 mM de MgSO4, 0,5 mM de CoA-SH et 1,5 mM de NAD+ a été initié par l'addition de 0,2 mM d'acide 2-oxo-4-méthylpentanoïque. L'activité de l'énoyl-CoA hydratase (ECH) a été déterminée selon [24] en utilisant 0,225 mM de crotonyl-CoA comme substrat. La conversion de ce substrat en 3-hydroxy-butanoyl-CoA a été mesurée à 263 nm à pH 8,0 dans 45 mM de Tris-HCl pH 8,0. L'activité décarboxylase (DC) a été déterminée en utilisant l'acide 2-oxo-4-méthylpentanoïque comme substrat dans un mélange réactionnel contenant 50 mM de Na+citrate à pH 6,2, 100 mM de KCl, 0,2 mM de DTT, 0,5 mM de TPP, 5mM de MgSO, 0,2 mM de NADH et 5 U/mL d'alcool déshydrogénase de levure. La réaction a été lancée par l'addition de 0,2 mM d'acide 2-oxo-4-méthylpentanoïque et l'oxydation du NAD+ a été suivie à 340 nm. L'alcool déshydrogénase (ADH) a été testée avec 2 mM de 2-méthylpropanal ou 100 mM d'éthanol. Dans le premier cas, la réduction de 0,2 mM de NADH en NAD+ a été suivie à 340 nm dans un mélange contenant 50 mM de tampon Na+citrate pH 6,2, 100 mM de KCl, 0,2 mM de DTT, 0,5 mM de TPP et 5 mM de MgSO4. Dans le second cas, la réaction a été réalisée dans du phosphate de potassium 50 mM pH 7,4, 100 mM KCl, 0,2 mM DTT, 0,5 mM TPP, 5 mM MgSO4 et 0,2 mM NADH. La réaction a été amorcée avec de l'éthanol 100 mM. Pour le dosage de l'activité aldéhyde déshydrogénase (AlDH), la réaction a été effectuée en présence de 50 mM de tampon Na+-citrate pH 6,2, 100 mM KCl, 0,2 mM DTT, 0,5 mM TPP, 5 mM MgSO4 et 1,5 mM NAD+. La réaction a été amorcée par l'ajout de 2 mM de 2-méthylpropanal et suivie à 340 nm par la réduction de NAD+ en NADH. L'activité de l'acyl-CoA déshydrogénase (ACyD) a été déterminée après la réduction du DCIP en DCIPH₂à 655 nm. La réaction a été réalisée dans un tampon phosphate de potassium 50 mM pH 7,4, 2 mM EDTA, 100 mM KCl, 0,1 mM FAD+, 0,5 mM DCIP et 0,2 mM DTT et a été initiée par l'addition de 0,2 mM 2-méthylbutanoyl-CoA. L'alcool acyltransférase (AAT) a été testée dans le sens hydrolytique (estérase), ce qui a été réalisé selon [25] en utilisant le butyrate de p-nitrophényle qui est hydrolysé en butyrate et p-nitrophénol, qui absorbeà 415 nm. La réaction a été réalisée dans un mélange contenant 50 mM de phosphate de potassium pH 7,4, 2 mM d'EDTA et 100 mM de KCl et a commencé par l'addition de 2 mM de butyrate de p-nitrophényle. Enfin, le dosage de l'activité acyl-CoA hydrolase (ACyH) a été effectué dans un tampon phosphate de potassium 10 mM (pH 6,5), 50 mM MgCl2 et 0,1 mM DTNB. La réaction a été lancée par l'ajout de 0,1 mM de 2-méthylbutanoyl-CoA et la libération de CoASH a été suivie à 415 nm, ce qui correspond à la production de DTNBH réduit. La concentration en protéines a été déterminée à 550 nm par la méthode Bradford [26], avec de l'albumine de sérum bovin (BSA, Sigma-Aldrich) comme standard. Tous les essais ont été réalisés en triplicata à partir de cultures indépendantes et pour chaque culture, les essais ont été réalisés en double.

Analyse statistique

Les moyennes et les écarts types (ET) ont été déterminés sur la base de fermentations triples et représentés sous forme de moyenne ± ET. Les données expérimentales ont été soumises à une analyse de variance à une voie (ANOVA) en utilisant le logiciel XLStat Applied Sensory (2020.1.3) au niveau de confiance de 95%. L'analyse en composantes principales (PCA) et l'analyse en clusters hiérarchiques (HCA) ont été appliquées pour discriminer les moyennes de la production totale de composés organiques volatils et le profil des composés volatils du type sauvage deS. suaveolenset des mutants ILV-. L'ACP a été réalisée à l'aide du logiciel XLStat Applied Sensory (2020.1.3) et les données sont présentées sous forme de graphique biplot. Une carte thermique a été réalisée sur la base du ratio de chaque COV produit par les mutants par rapport à ceux produits par le type sauvage deS. suaveolensen utilisant NG-CHM Builder : Interactive heatmap online software (www.build.ngchm.net).

II - Résultats et discussion

Condition de la mutagenèse UV et stratégie de criblage

La durée d'irradiation UV adéquate pour accumuler des mutations stables non létales chezS. cerevisiaea été décrite empiriquement comme la durée qui entraîne un taux de survie de la population allant de 70 à moins de 40%. Dans un premier temps, nous avons effectué une étude dose-réponse de l’effet irradiation par UV sur notre souche sauvageS. suaveolenspour déterminer la durée optimale d'exposition aux UV de cette souche non-conventionnelle. Comme le montre la , le taux de survie de la population a immédiatement chuté de 25 % après les 10 premières secondes d'irradiation et est resté à cette valeur même après 110 secondes d'irradiation. Avec un temps d'irradiation plus long, une décroissance linéaire (R² = 0,96) de la survie de la population avec une mortalité complète après 420 s d'irradiation a clairement été observée. Une durée de 180 s d'irradiation aux UV a été choisie, ce qui correspond à environ 50 % de la survie de la population. En conséquence, 15 393 colonies ont été isolées après ce temps d'irradiation UV deS. suaveolenssauvage sur des plaques de milieu YNB-Glc gélosé (milieu ne comportant que du glucose comme source de carbone).

Pour cribler les mutants qui ont perdu la capacité de croître sur des milieux contenant de l'isoleucine, de la leucine ou de la valine comme seule source de carbone, ces 15 000 clones irradiés ont été répliqués sur des plaques de milieu YNB-Ile, YNB-Leu et YNB-Val gelosés. Seuls 10 n'ont pas pu se développer sur les trois acides aminés à chaîne ramifiée. Ces 10 clones ont ensuite été cultivés de nouveau sur YNB-Glc, et testés de nouveau pour vérifier leur croissance / absence de croissance sur un milieu YNB-Leu/ Ile/Val non perméable. Avec cette procédure, un seul des 10 clones irradiés par les UV a été perdu, laissant ainsi 9mutants ILV-potentiellement stables, appelés mutants M2 à M10.

Analyse multivariée du type sauvage de S. suaveolens et de ses 9 mutants ILV- en fonction de leur production de COV

Les composés organiques volatils (COV) produits par le type sauvage deS. suaveolenset les 9 mutantsILV-ont été extraits par microextraction en phase solide de l’espace puis analysés par chromatographie en phase gazeuse couplée à un détecteur de spectre de masse (HS-SPME-GC/MS) après 48h de croissance sur des tubes de gélose YNB contenant 20 g.L-1 de glucose et 1 g.L-1 d'isoleucine (YNB-Glc-Ile) à 30°C. En supposant une croissance similaire des mutants et du type sauvage deS. suaveolenssur des géloses, nous avons trouvé que les mutants M9 et M10 avaient des niveaux de production de COV totaux de 1,8 et 8 fois plus élevés respectivement que le type sauvage deS. suaveolens, alors que les COV étaient deux fois plus bas chez les mutants M6 et M7 et plus de 4 fois plus bas chez les mutants M2 et M4 ( ). Les deux mutants restants, M3 et M5, ont montré un niveau de COV à peu près similaire à celui du type sauvage.

En utilisant la liste de tous les COV identifiés et quantifiés dans le type sauvage et les 9 mutantsILV-deS. suaveolens ,une analyse en composantes principales (ACP) a été réalisée par la méthode de Pearson pour rechercher une éventuelle agrégation ou discrimination entre les mutants et le type sauvage sur la base de leur profil de production de COV. Comme le montre la , le premier axe PC1, qui représente 66,64% de la variance totale, a clairement isolé le mutant M10 d'un groupe comprenant le type sauvage et les mutants M2, 3, 4, 6, 7 et 8. Le deuxième axe (PC2), qui représente environ 10% de la variance totale, a permis de séparer le mutant M9 de la souche sauvage (WT) et du mutant M5, qui étaient à peu près regroupés dans le même groupe, indiquant que ce mutant présentait un profil de COV similaire à celui du type sauvage. D'autre part, les profils de COV des mutants M9 et M10 étaient les plus différents les uns des autres et du type sauvage, ce qui est également cohérent avec la quantité plus élevée de COVs produits par ces mutants. Comme les mutants M2, M3, M4, M6, M7 et M8 étaient regroupés et pas très éloignés de M5 et du WT, ces données suggèrent également que ces mutants ont un profil de COV très similaire entre eux et pas très différent du type sauvage. En conclusion, cette analyse ACP a montré que la mutagenèse UV a réussi à générer au moins deux mutants intéressants présentant un profil de COV très différent du type sauvage.

Analyse comparative de la production de COV entre S. suaveolens et les 9 mutants ILV-.

Comme indiqué précédemment, les COV produits par le type sauvage et les mutants deS. suaveolenssont essentiellement des composés de types esters. Deux types d'esters ont été detectés, à savoir les esters d'acétate qui sont formés par condensation d'un alcool supérieur généralement produit dans la voie d’Ehrlich avec l'acétyl-CoA et les esters éthylique qui sont formés par condensation d'un acyl-CoA avec l'éthanol ou un autre alcool tel que le méthanol, le propanol ou le butanol [19]. Alors que ces deux types d'esters ont également été retrouvés dans les COV des mutants et du type sauvage deS. suaveolens, d'autres types d’esters ont été identifiés. Certains d'entre eux résultent très probablement de la condensation d'un alcool dérivé du catabolisme de l'isoleucine dans la voie d’Ehrlich (c'est-à-dire le 2-méthylbutanol) avec un acyl-CoA (c'est-à-dire le propanoyl-CoA, le butanoyl-CoA), donnant lieu au butanoate de 2-méthylbutyle et au propanoate de 2-méthylbutyle. L'origine de ces acyl-CoA à chaîne courte peut provenir soit de la dégradation de la chaîne de carbone des acides gras dans le cas du butanoyl-CoA ou de l'oxydation de l'isoleucine qui conduit au propanoyl-CoA et à l'acétyl-CoA. D'autres esters peuvent être produits à partir d'un acide comme l'acide 2-méthylbutanoate qui doit être activé en tant que CoA-intermédiaire pour se condenser avec l'éthanol et donner du 2-méthylbutanoate d'éthyle. Ces esters ont été classés dans la catégorie des composés dérivant de la voie d’Ehrlich (EP) en raison des alcools supérieurs et des acides qui proviennent de cette voie. Une autre catégorie est celle des esters qui sont formés par la condensation d'un acyl-COA avec l'éthanol ou un alcool supérieur tel que l'octanol pour donner de l'acétate d'octyle, du propanoate d'octyle et du butanoate d'octyle. Nous avons attribué cette catégorie aux esters d'acyl-COA dérivant de la voie de la β-oxydation (BOP). Enfin, un troisième groupe, vraisemblablement original pour les espèces deSaprochaete, comprenait tous les COV dont le précurseur acide est un énoyl-COA qui peut être estérifié avec de l'éthanol (c'est-à-dire le tiglate d'éthyle, but-2-énoate d'éthyle) ou avec un alcool supérieur provenant de la voie d’Ehrlich tel que le 2-méthylbutanol et le 2-méthylpropanol, pour donner du 3-méthylbutyl-2-méthylbut-2Z-énoate (angélate d'isoamyle) et du 2-méthylpropyl-2-méthylbut-2E-énoate (tiglate d'isobutyle). Nous avons classé ces esters dans la catégorie des composés dérivant de l'énoyl-CoA de la voie de la β-oxydation (BOP-enoyl-COA). La illustre clairement la plus grande capacité de M10 à produire des esters de ces trois catégories, avec notamment une multiplication par 5 des esters de l'EP, atteignant le niveau exceptionnel de plus de 1 g.L^-1et environ 10 fois plus d'esters des intermédiaires de l'énoyl-CoA.

Comme indiqué ci-dessus, notre stratégie de sélection de forts producteurs de COV, basée sur des mutants incapables de croître sur un milieu synthétique dans lequel l'acide aminé ramifié est la seule source de carbone, a conduit à l'isolement de deux mutants M9 et M10 qui présentaient à la fois un profils en COV différent et une quantité plus élevée de ces COV par rapport au type sauvage deS. suaveolens. Pour mieux mettre en évidence ces différences entre les souches, la teneur de chaque COV dans les mutants a été divisée par celle du type sauvage. Ensuite, la valeur du ratio résultant a été exprimée par un code couleur allant du blanc (absence), vert (~ 1), marron (> 10) au rouge foncé (> 100), donnant lieu à une carte thermique présentée dans la . Cette représentation a clairement renforcé notre analyse multivariée indiquant que le profil des COV du mutant M10 et, dans une moindre mesure, celui de M9, diffère de celui de la souche sauvage. En particulier, le profil des COV du mutant M10 présentait deux caractéristiques importantes. Premièrement, les niveaux de 17 des 22 COV catégorisés dans la voie EP étaient 5 à 50 fois plus élevés que dans la souche sauvage. Plus précisément, les esters produits à partir de l'alcool (2-méthylbutanol) ou de l'acide (2-méthylbutanoate) provenant du catabolisme de l'isoleucine étaient environ 10 fois plus abondants que dans le type sauvage. Ce résultat pourrait suggérer une activité accrue du catabolisme de l'isoleucine dans la voie d'Ehrlich. D'autre part, la production d'esters obtenus par condensation d'acyl-CoA avec de l'éthanol et d'énoyl-CoA avec de l'éthanol ou des alcools dérivés de l'EP (c'est-à-dire tiglate d'éthyle, tiglate de butyle, tiglate d'isobutyle, etc.) était 5 à 100 fois plus élevée dans ce mutant M10 que dans le type sauvage. De façon globale, la production d’esters α-insaturés totaux était ainsi 5 fois plus importante chez le mutant M10 que chez la souche sauvage deS. suaveolens(Table 1).

	S. suaveolens	Mutant M10
2-methylbut-2E-ènoate de propyle	0,1 ± 0,0	1,4 ± 1,2
2-methylbut-2E-ènoate de butyle	28,5 ± 2,2	90,6 ± 10,5
2-methylbut-2E-ènoate d’éthyle	48,4 ± 3,0	115,9 ± 30,7
But-2-ènoate d’éthyle	0,1 ± 0,1	155,8 ± 136,2
2-methylbut-2E-ènoate de 2-méthylpropyle	-	37,4 ± 20,0
2-methylbut-2Z-ènoate de 2-méthylpropyle	1,1 ± 0,6	1,1 ± 0,7
2-methylbut-2E-ènoate de 3-méthylbutyle	0,2 ± 0,2	-
2-methylbut-2Z-ènoate de 3-methylbutyle	0,4 ± 0,5	0,6 ± 1,1
TOTAL ESTERS ALPHA-INSATURES	78,9 ± 2,4	402,8 ± 112,1

Tableau 1. Esters alpha-insaturés produits (mg/L) par la souche mère de S. suaveolens et le mutant M1 .

Ces données indiquent fortement qu'une réaction enzymatique en aval de l'oxydation de l'énoyl-COA a été altérée par la mutagenèse UV, conduisant à une plus grande disponibilité des intermédiaires acyl-CoA et énoyl-COA à estérifier avec des alcools dérivés soit du catabolisme de l'isoleucine, soit de la glycolyse (éthanol).

La perte de l'activité Enoyl- C o A hydratase dans la voie de l'oxydation peut expliquer la production plus élevée de COV chez le mutant M10.

Le fait que le mutant M10 ait présenté une augmentation de 8 fois des COV totaux et, plus spécifiquement, que les esters dérivés de la condensation de l'acyl-CoA et de l'énoyl-CoA avec des alcools aient augmenté de façon spectaculaire par rapport au type sauvage, suggère que l'activité des enzymes de l'oxydation qui catalysent les réactions en aval de l'énoyl-CoA a été modifiée. D'autre part, les niveaux plus élevés d'arômes dérivés de l'EP chez le mutant M10 peuvent également suggérer que les activités des enzymes de l'EP ont été augmentées. Pour répondre à ces questions, nous avons décidé de déterminer l'activité des enzymes clés de la voie d'Ehrlich et de la voie de la β-oxydation. La voie d'Ehrlich implique une décarboxylase (DC) et une alcool déshydrogénase (ADH) pour la voie réductrice ou une aldéhyde déshydrogénase pour la voie oxydative. Le catabolisme des acides aminés ramifiés par oxydation nécessite une α-céto-déshydrogénase à chaîne ramifiée (BCKAD) qui produit un acyl-COA. Cet intermédiaire acyl-COA peut perdre le CoA par une acyl-CoA hydrolase (AcyH) pour donner l'acide correspondant, pour être réduit en énoyl-CoA par une acyl-CoA déshydrogénase (ACyD) dépendante du FAD+ ou même estérifié en esters éthyliques par une ester synthase d'acides gras à chaîne moyenne [28]. Spécifiquement chezS. suaveolens, l'énoyl-COA peut être estérifié en esters par une alcool acétyltransférase dont la nature reste à identifier.

Les enzymes de ces deux voies métaboliques ont donc été déterminées dans les extraits bruts du type sauvage et du mutant M10 deS. suaveolens. Dans l'ensemble, les activités enzymatiques mesurées dans les extraits bruts des souches de type sauvage et mutant deS. suaveolensétaient très variables d'une culture à l'autre, ce qui pourrait s'expliquer par la difficulté inattendue de briser les cellules et d'obtenir une perturbation cellulaire reproductible. Cependant, l'analyse statistique des données nous permet d'être confiants quant aux différences enzymatiques, lorsqu'elles se sont produites, entre le type mutant et le type sauvage. Ainsi, l'activité DC du type sauvage deS. suaveolenset du mutant M10 était à peu près comparable, que les levures aient été cultivées dans du glucose YNB complété ou non par 1 g.L^-1d'isoleucine. De même pour l'activité de l'ADH mesurée sur le 2 méthylpropanal qui n'a montré aucune différence significative entre les deux souches. Nous avons remarqué que l'activité aldéhyde déshydrogénase (AlDH) était 5 fois plus faible chez le mutant M10 par rapport au type sauvage et globalement cette activité enzymatique était 10 fois plus faible que celle de l'ADH bien que les données sur les niveaux de COV mesurés suggèrent une contribution similaire des parties oxydative et réductrice de la voie d'Ehrlich dans la production des esters. Cette apparente divergence peut être due au fait que la mesure enzymatiquein vitroimplique l'activité de l'ADH qui agit produit l’éthanol à partir de acétaldéhyde et qui n’est peut-être pas celle qui est spécifique à la voie d'Ehrlich.

En ce qui concerne les enzymes de la voie de la β-oxydation, l'effet le plus spectaculaire a été constaté sur l'Enoyl-CoA hydratase dont l'activité chez le mutant M10 se situait dans la limite de détection de la méthode de dosage. Nous avons également constaté que l'activité de l'acyl-CoA hydrolase (ACyH) qui catalyse une réaction en amont de l'énoyl-CoA hydratase était 2 fois plus élevée que dans le type sauvage. En revanche, aucune conclusion n'a pu être donnée pour l'acyl-CoA déshydrogénase (ACyD) car l'activité de cette enzyme était 2 fois plus faible chez M10 poussant sur YNB-Glc mais 2 fois plus élevée que le type sauvage lorsque la culture était faite en YNB-Glc-Ile. L'activité de la BCKAD, qui catalyse l'étape initiale de l'oxydation des acides aminés à chaîne ramifiée, a également été mesurée. On a pu constater que si cette enzyme présentait une activité similaire entre le type mutant et le type sauvage, son activité était 4 à 10 fois inférieure à celle des enzymes en aval de la voie. Ces données semblent être en accord avec les rapports précédents qui soutiennent que cette enzyme peut être limitante dans le catabolisme des acides aminés à chaîne ramifiée par la voie de la β -oxydation comme cela a été rapporté dans les cellules de mammifères. De plus, cette enzyme présente une activité au moins 4 fois plus faible que les enzymes de la voie d'Ehrlich, ce qui pourrait indiquer que les acides aminés à chaîne ramifiée seraient préférentiellement catabolisés par la voie d'Ehrlich (EP), du moins lorsque la levure est cultivée avec du glucose comme source de carbone. Enfin, comme nous ne savons pas quel type d'ester synthase est impliqué dans la formation d'esters chezS. suave o lens, nous avons décidé de mesurer cette activité en tant qu'estérase " (EST), en supposant qu'une acyl-CoA : éthanol O-acétyltransférase, comme celle identifiée chezS. cerevisiae,et qui possède à la fois une activité ester synthase et estérase, existe aussi chezS. suave o lens. Comme indiqué précédemment, l'activité globale de cette estérase était similaire dans les deux souches mais était 2 fois plus élevée dans un milieu synthétique comportant du glucose et de l’isoleucine, ce qui suggère un effet positif des acides aminés ramifiés sur l'expression des gènes codant pour cette estérase. En résumé, ces analyses enzymatiques soutiennent l'idée que la production accrue de COV dans le mutant M10 deS. suaveolenspeut être expliquée par l'absence presque totale de l'activité enoyl-CoA hydratase (ECH). Cette perte d'activité ECH conduit en retour à une disponibilité accrue des précurseurs d'acyl-CoA et d'énoyl-CoA pour la synthèse des esters, et peut expliquer l'incapacité de ce mutant à se développer sur des acides aminés ramifiés.

Conclusions

La mutagenèse UV a été employée pour générer des mutants de S. suaveolensqui abritent une production plus élevée de COV à partir d'acides aminés à chaîne ramifiée. Notre sélection était basée sur l'incapacité de croître avec ces acides aminés comme seule source de carbone. Il a permis d'isoler 9 mutants, dont l'un (le mutant M10) s'est avéré présenter 8 fois plus de COV que la souche sauvage deS. suaveolens .En déterminant les activités spécifiques d'enzymes clés impliquées dans le catabolisme de l'isoleucine, nous avons fourni la preuve que la production plus élevée de COV observée chez ce mutant deS. suaveolensest principalement due à la perte de l'activité de l'énoyl-CoA hydratase et à une augmentation de l'activité de l'acyl-CoA hydrolase. Le séquençage des souches sauvages et mutantes permettra de confirmer si la perte de l'activité ECH est due à une mutation du gène codant pour cette enzyme ou d'un gène régulateur de ce système métabolique Néanmoins, ce travail a montré la faisabilité de l'utilisation de la stratégie de mutagenèse UV et de la sélection sur des milieux spécifiques contenant des acides aminés à chaîne ramifiée comme seule source de carbone pour améliorer de manière significative la capacité de la levureS. suaveolensà produire des COV de valeur.

Claims (12)

1. Souche de microorganisme capable de produire au moins 400 mg/L d’esters α-insaturés.
2. Souche selon la revendication 1 caractérisée en ce que :

   1. ladite souche est génétiquement modifiée
   2. la souche initiale avant modification génétique produit un niveau basal d’esters α-insaturés
   3. Les modifications génétiques consistent en une réduction de l’activité de l’enzyme enoyl-CoA hydratase et une augmentation de l’activité acyl-coA hydratase.
3. Souche selon la revendication 1, caractérisée en ce que :

   1. ladite souche est génétiquement modifiée
   2. ladite souche initiale avant modification génétique ne produit pas d’esters α -insaturés
   3. les modifications génétiques consistent en (i) une réduction de l’activité de l’enzyme enoyl-CoA hydratase si cette activité est présente dans ladite souche initiale, et (ii) une expression ou surexpression de l’activité acyl-coA hydratase selon que cette activité est absente ou présente dans la souche initiale.
4. Souche de microorganisme selon l’une des revendications 1 à 3 choisi parmi les levures, les champignons ou les bactéries.
5. Méthode de criblage de souches de microorganisme capables de produire des esters α-insaturés consistant à :

   1. isoler dans des milieux naturels, les souches capables de croître sur des milieux de culture contenant au moins un acide aminé branché (isoleucine, leucine ou valine) comme seule source de carbone
   2. quantifier la production d’esters α-insaturés dans les souches isolées
   3. sélectionner les souches capables de produire la quantité requise d’esters α-insaturés.
6. Méthode de criblage de souche de microorganisme mutée présentant une production en esters α-insaturés augmentée par rapport à la souche mère de référence non mutée capable de produire des esters α-insaturés, comprenant les étapes de :

   1. Mutagénèse aléatoire par irradiations UV d’isolats de souches de microorganisme « souches mère » sur milieu contenant du glucose comme seule source de carbone
   2. Transfert de chacune des souches irradiées de sorte à obtenir quatre séries de souches identiques
   3. Transfert sur milieu de culture en parallèle desdites quatre séries de souches irradiées,
      • ladite première série de souches sur un milieu contenant du glucose (milieu glucose) comme seule source de carbone
      • ladite deuxième série sur un milieu contenant de l’isoleucine comme seule source de carbone
      • ladite troisième série sur un milieu contenant de la leucine comme seule source de carbone
      • ladite quatrième un milieu contenant de la valine comme seule source de carbone
   4. Identification des mutants se développant sur milieu glucose mais incapables de croître sur les milieux contenant uniquement de l’isoleucine de la leucine ou de la valine comme seule source de carbone, parmi les souches initialement irradiées de criblage
   5. Quantification de la production d’esters α-insaturés de chacune des souches correspondantes aux souches incapables de croître sur milieu contenant uniquement de l’isoleucine de la leucine ou de la valine comme seule source de carbone
   6. Sélection des souches incapables de croître sur milieu contenant uniquement de l’isoleucine de la leucine ou de la valine comme seule source de carbone, qui produisent une plus grande quantité d’esters α-insaturés que la souche mère.
7. Méthode selon la revendication 1 dans laquelle l’étape de quantification des esters α-insaturés produits est effectuée par chromatographie.
8. Méthode selon l’une des revendications 1 à 3 dans laquelle lesdits esters α-insaturés sont choisis parmi le tiglate d’isobutyle, le tiglate d’isoamyle ou le tiglate d’éthyle.
9. Méthode selon l’une des revendications 1 à 4 dans laquelle les souches sélectionnées produisent moins 400mg/L d’esters α-insaturés.
10. Souche de levure/ bactérie génétiquement modifiée caractérisée en ce que l’activité de l’enzyme enoyl-CoA hydratase est réduite et l’activité de l’enzyme acyl-CoA hydratase est augmentée d’au moins 50%.
11. Procédé de préparation d’une souche de microorganisme génétiquement modifiée capable de produire au moins 400 mg/L d’esters α-insaturés consistant à :

    1. Disposer d’une souche produisant un niveau basal d’esters α-insaturé
    2. Réduire l’activité enoyl-CoA hydratase
    3. Augmenter l’activité acyl-CoA hydratase,

    les étapes b. et c. pouvant être réalisées par mutagenèse du (des) gènes codant pour ces enzymes.
12. Procédé de préparation d’une souche de microorganisme génétiquement modifiée capable de produire au moins 400 mg/L d’esters α-insaturés consistant à :

    1. Disposer d’une souche ne produisant pas d’esters α-insaturé
    2. Réduire l’activité enoyl-CoA hydratase si elle est présente dans ladite souche
    3. Augmenter l’activité acyl-CoA hydratase si elle présente ou apporter une activité acyl-CoA hydratase si elle est absente,

    les étapes b. et c. pouvant être réalisées par mutagenèse du (des) gènes codant pour ces enzymes.