JP7044860B2 - 遺伝子工学菌 - Google Patents
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Description
本発明では、新規の4つの酵素を共発現する大腸菌エンジニアリングバクテリア(工学菌)を構築しており、当該菌は、フェニルエタノール類化合物の生産に応用できる。本発明で選択されたL-アミノ酸酸化酵素、α-ケトン酸脱炭酸酵素、アルコール脱水素酵素は、何れも基質の特異性が劣り、活性が強い特徴を有するため、同一株のエンジニアリングバクテリアに芳香L-α-アミノ酸を採用する場合、多種類のフェニルエタノール類生成物を生産することができ、他のアミノ酸の誘導体化アルコールの生産に用いることができる。当該生産過程は簡単で、且つ、容易に原料を得ることができるため、良好な生産化将来性を有する。
アメリカ菌種保存センターからATCCのプロテウス・ミラビリスATCC29906、Cosenzaea myxofaciensATCC19692、ラクトコッカス・ラクティスATCC19435、Komagataella phaffiiATCC76273、Bacillus subtilisATCC13952、及び、Pseudomonas abietaniphilaATCC700689を購入した。Novagen会社からpRSFDuet-1プラスミド、pETDuet-1プラスミド、EscherichiacoliB21(DE3)、EscherichiacoliB21DH5αを購入した。
(1)L-アミノ酸酸化酵素の選択
L-アミノ酸酸化酵素は、細菌、真菌、哺乳動物の細胞、蛇毒、昆虫毒素及び藻類に広く存在している(L-amino acid oxidase as biocatalyst:a dream too far?Appl.Microbiol.Biotechnol.2013、97:9323-41)。L-アミノ酸酸化酵素は、αアミノ基及びCα上の水素をFAD上に転移し、ほとんどは分子酸素を利用して直接に還元型FADを酸化し、酸化型FADを再生すると共に、過酸化水素を生成しており、この過程において、過酸化水素酵素を添加して、過酸化水素の毒性を除去しなければならない。また、もう1種類のL-アミノ酸酸化酵素は、細胞膜上の電子伝達鎖に関与しており、電子は呼吸鎖を経てシトクロム酸化酵素に伝達されることにより、分子酸素が過酸化水素を生成せず、水に還元される。このような酵素類は、主にプロテウス属(Proteus sp.)、プロビデンシア属(Providencia sp.)、モルガネラ属(Morganella sp.)等の細菌に存在している(Crystal structure of a membrane-bound 1-amino acid deaminase from Proteus vulgaris.J.Struct.Biol.2016、195:306-15)。本発明では、2種の過酸化水素を生成しないL-アミノ酸酸化酵素を選択し、プロテウス・ミラビリスATCC29906、及び、Cosenzaea myxofaciensATCC19692からそれぞれL-アミノ酸酸化酵素の遺伝子pmaao及びcmaaoをクローンしており、そのヌクレオチド配列のNCBIのアクセッション番号はNZ_GG668576 REGION:1350390..1351805及びLXEN01000066 REGION:20563..21963であり、そのアミノ酸配列は、それぞれWP_004244224.1及びOAT30925.1で示しており、これらの酵素は何れも基質が広くて活性が強いという特徴を有している。
文献に基づいて選択された細菌由来の、芳香族ケト酸に対して強い活性を有するα-ケト酸脱炭酸酵素は、他の特許で選択された酵母または植物由来の酵素に比べて、より良く大腸菌で発現する特性を有している。本発明は、それぞれ、プロテウス・ミラビリスATCC29906及びラクトコッカス・ラクティスATCC19435からα-ケトン酸脱炭酸酵素の遺伝子pmkdc及びllkdcをクローンしており、そのアミノ酸配列は、NCBIのアクセッション番号がWP_004247067.1、WP_025016816.1の配列であり、そのヌクレオチド配列はNCBIのアクセッション番号がNZ_GG668593 REGION:50463..52112、NZ_LKLC01000008 REGION:208327..209973の配列である。
アルコール脱水素酵素は各種類の細菌に広く存在し、報告によると、大腸菌自体にも多種の基質が広いアルコール脱水素酵素が含まれているため(Production of aromatic compounds by metabolically engineered Escherichia coli with an expanded shikimate pathway、Appl.Environ.Microbiol.2012 78(17)、6203-6216)、直接にEscherichiacoliBL21(DE3)から、2つのアルコール脱水素酵素の遺伝子ecadh1及びecadh2をクローンすることができる。前記アルコール脱水素酵素は、そのアミノ酸配列がNCBIのアクセッション番号WP_001318460.1、WP_000692754.1の配列であり、そのヌクレオチド配列がNCBIのアクセッション番号NC_012892 REGION:4406777..4407796、NC_012892 REGION:312506..313555の配列であり、従って、アルコール脱水素酵素の大腸菌における過剰発現をより有利にする。
生物の変換反応において、アルコール脱水素酵素はNADH及び/またはNADPHを補酵素とする必要があり、本発明では、Komagataella phaffiiATCC76273からギ酸脱水素酵素の遺伝子kpfdhを得ており、Bacillus subtilisATCC13952からグルコース脱水素酵素の遺伝子bsgdhを得ており、Pseudomonas abietaniphilaATCC700689から亜リン酸脱水素酵素の遺伝子papdhを得ている。そのアミノ酸配列は、NCBIのアクセッション番号がAOA63544.1、WP_013351020.1、または、WP_003118429.1の配列であり、そのヌクレオチド配列は、NCBIのアクセッション番号がCP014710 REGION:1836993..1838090、NZ_CP009748 REGION:386154..38693、NZ_FNCO01000027 REGION:29475..30485の配列である。
上記で選択されたL-アミノ酸酸化酵素、α-ケトン酸脱炭酸酵素、アルコール脱水素酵素、NDA(P)を還元する酵素中の、各々の種類で何れか1つの酵素を選択し、4つの酵素を組合せて共発現させる。現在、大腸菌の多遺伝子の共発現には、様々な方法(大腸菌多遺伝子の共発現策略、中国生物工学雑誌、2012、32(4):117-122)があり、本発明では、pRSFDuet-1及びpETDuet-1の二重プラスミドを採用してpRSFDuet-1に組み込んだL-アミノ酸酸化酵素の遺伝子、及び、α-ケトン酸脱炭酸酵素の遺伝子、pETDuet-1に組み込んだアルコール脱水素酵素の遺伝子、及びNAD(P)を還元する酵素の遺伝子という4つの遺伝子を共発現させている。
共発現組換えプラスミドを得た後、2種のプラスミドを大腸菌Escherichia coliB21に形質転換し、アンピシリン(Ampicllin)及びカナマイシン(kanamycin)添加シャーレによるスクリーニングにより陽性形質転換体(transformant)を得、即ち、組換え大腸菌を得る。
細胞の準備:典型的な組換え大腸菌の培養、及び、誘導発現の方法に応じて、組換え大腸菌を体積比で2%の量でLB発酵培地(ペプトン10g/L、酵母粉5g/L、NaCl10g/L)に導入し、細胞のOD600が0.6~0.8に達した後、最後の濃度が0.4mMになるようにIPTGを添加し、20℃で8h誘導発現の培養を行う。誘導発現が終了した後、20℃、8000rpm、20分、遠心分離し細胞を収集する。
全細胞の変換システム:異なる基質の溶解性に応じて、基質の濃度を0.5~20g/Lに制御し、且つ、構築された異なるプラスミドの性質に応じて、濃度が1~20g/Lになるように水素供与体を添加し、pHは4.0~8.0の間に調整し、新鮮な湿菌体の量は10~200g/Lである。その後、15~40℃で、0.5~48時間変換を行う。変換が終了した後、液体クロマトグラフィーにより収量と光学活性を測定する。構築された4つの酵素の共発現プラスミドに、グルコース脱水素酵素が含まれている場合、水素供与体はグルコースである。構築された4つの酵素の共発現プラスミドに、ギ酸脱水素酵素が含まれている場合、水素供与体はギ酸ナトリウムである。構築された4つの酵素の共発現プラスミドに、亜リン酸脱水素酵素が含まれている場合、水素供与体は亜リン酸である。
全細胞の変換システムにおける基質は以下、L-フェニルアラニン、L-チロシン、L-ドーパ中の1つである。
これらの基質は、相応する全細胞の変換を経て、対応的に2-フェニルエタノール、チロソール、ヒドロキシチロソールを生成することができる。
定量分析:変換液はPerkinElmer Series200高速液体クロマトグラフを用いて検出分析し、クロマトグラフ条件は、移動相がメタノール-0.1%ギ酸水(40:60)であり、漢邦MegresC18クロマトカラム(4.6×250mm、5μm)を採用し、流速が1ml/min、カラム温度が30℃、注入量が20μl、検出波長が210nmである。
4つの遺伝子の共発現システムの構築。
(1)プライマー設計
PCR増幅に用いられるプライマーを設計する。
(2)PCR増幅
メーカーが提供した取扱説明書に従って、Genomic DNAPurification Kit(Takara)を用いて対数増殖期にある菌株のゲノムDNAを抽出し、表1のプライマーを用いて、各々に対応する菌株からPCR増幅を行う。増幅システムは、PrimeSTARHS DNA ポリメラーゼ(2.55U/μL)0.5μL、10×Prime STAR Buffer 10μL、dNTP Mixture(各2.5mM)4μL、テンプレートDNA1μL、上流プライマー(20μM)1μL、下流プライマー(20μM)1μL、50μLになるまでddH2Oを補足する。増幅プログラムは、94℃で10分、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で2分、合計30回循環し、72℃で10分間置く。PCRの生成物は華大に送って遺伝子配列を測定した。
後に、それぞれ、プロテウス・ミラビリスATCC29906、Cosenzaea myxofaciensATCCからL-アミノ酸酸化酵素の遺伝子pmaao、cmaaoをクローンしており、プロテウス・ミラビリスATCC29906、ラクトコッカス・ラクティスATCC19435からそれぞれα-ケトン酸脱炭酸酵素の遺伝子pmkdc、llkdcを得ており、Escherichiacoli菌株BL21からアルコール脱水素酵素の遺伝子ecadh1、ecadh2を得ており、Komagataella phaffiiATCC7627、Bacillus subtilisATCC13952、Pseudomonas abietaniphila ATCC 70068から、それぞれNAD(P)を還元する酵素の遺伝子kpfdh、bsgdh、papdhを得た。
(3)pRSFDuet-1及びpETDuet-1シングル遺伝子プラスミドの構築
pRSFDuet-1及びpETDuet-1ベクタープラスミド及びステップ(2)のcmaao、pmaao、ecadh1、ecadh2のPCR生成物は、37℃の水浴で1時間制限酵素で二重消化した。消化システムは、10×cut buffer5μL、DNA10μL、制限酵素SacI及び制限酵素HindIIIはそれぞれ1μL、無菌水33μLであった。
その後、酵素により消化された生成物をそれぞれ回収し、16℃の水浴で12~16時間ライゲーションさせ、pRSFDuet-1は、それぞれcmaao、pmaaoにライゲーションし、pETDuet-1は、それぞれecadh-1、ecadh2にライゲーションした。ライゲーションシステムは、10×DNA ligase buffer 2.5μL、DNA断片 8μL、キャリア DNA 2μL、T4DNA ligase 1μL、無菌水11.5μL、合計25μLであった。
その後、ライゲーションシステムに100μLのDH5αコンピテント細菌を添加し、軽くブレンディングし、30分間氷浴した。予熱した42℃の水浴に入れ、90秒間置いて熱ショック処理を行った。直ちに2分間の氷浴した。抗生物質を含まないLB培養液1mLを添加し、菌体が回復するように37℃で1時間培養した。最後に、pRSFDuet-1が、それぞれcmaao、pmaaoにライゲーションされた菌体はカナマイシンを含むLBプレートへ均一に塗布し、pETDuet-1が、それぞれecadh1、ecadh2にライゲーションされた菌体はアンピシリンを含むLBプレートへ均一に塗布した。シングルコロニーをピックアップして12時間培養し、その後、プラスミドを抽出し、制限酵素で二重消化しその正確性を検証し、同時にDNAシークエンシングを行い、その正確性を保証し、最後に正確な形質転換体を保存し、以下のプラスミド、L-アミノ酸酸化酵素の遺伝子を含むpRSFDuet-cmaao、pRSFDuet-pmaao、アルコール脱水素酵素の遺伝子を含むpETDuet-ecadh1、pETDuet-ecadh2を得た。
(4)L-アミノ酸酸化酵素の遺伝子、α-ケトン酸脱炭酸酵素の遺伝子pRSFDuet-1共発現プラスミド、及び、アルコール脱水素酵素の遺伝子、NAD(P)を還元する酵素の遺伝子pETDuet-1共発現プラスミドの構築。
消化システムは、10×cut Buffer 5μL、DNA10μL、制限酵素1及び制限酵素2それぞれ1μL、無菌水33μLであった。ステップ(3)で構築された単遺伝子プラスミド、及び、ステップ(2)におけるpmkdc、llkdc、kpfdh、bsgdh、papdhのPCR生成物を37℃の水浴で1時間制限酵素で二重消化した。
各々遺伝子の制限酵素の切断位置が異なるため、以下のような2種の情況がある。
pRSFDuet-cmaao、pRSFDuet-pmaao、pmkdc、llkdcは、EcoRV及びKpnIを用いて二重消化した。
pETDuet-ecadh1、pETDuet-ecadh2、kpfdh、bsgdh、papdhは、BglII及びXhoIを用いて二重消化した。
その後、上述の2種情況で消化された生成物をそれぞれ回収し、16℃の水浴で12~16時間ライゲーションさせ、pRSFDuet-cmaao、pRSFDuet-pmaaoは、それぞれpmkdc、llkdcにライゲーションさせ、pETDuet-ecadh1、pETDuet-ecadh2は、それぞれkpfdh、bsgdh、papdhにライゲーションさせた。ライゲーションシステムは、10×DNAligase buffer2.5μL、DNA断片8μL、キャリアDNA 2μL、T4 DNAligase 1μL、無菌水11.5μL、合計25μLであった。
その後、ライゲーションシステムに100μLの大腸菌DH5αコンピテント細菌を添加し、軽くブレンディングし、30分間氷浴した。予熱した42℃の水浴に入れ、90秒間置いて熱ショック処理を行った。直ちに2分間氷浴した。抗生物質を含まないLB培養液1mLを添加し、菌体が回復するように37℃で1時間培養した。最後に、pRSFDuet-cmaao、pRSFDuet-pmaaoが、それぞれpmkdc、llkdcにライゲーションされた菌体はカナマイシンを含むLBプレート上に均一に塗布し、pETDuet-ecadh1、pETDuet-ecadh2が、それぞれkpfdh、bsgdh、papdhにライゲーションされた菌体はアンピシリンを含むLBプレート上に均一に塗布し、シングルコロニーをピックアップして12時間培養し、その後、DNAシークエンシングを行い、その正確性を保証し、最後に正確な形質転換体を保存し、以下のプラスミド、すなわち、L-アミノ酸酸化酵素の遺伝子、α-ケトン酸脱炭酸酵素の遺伝子を含む、pRSFDuet-cmaao-pmkdc、pRSFDuet-cmaao-llkdc、pRSFDuet-pmaao-pmkdc、pRSFDuet-pmaao-llkdcと、
アルコール脱水素酵素の遺伝子、NAD(P)を還元する酵素の遺伝子を含む、pETDuet-ecadh1-kpfdh、pETDuet-ecadh1-bsgdh、pETDuet-ecadh1-papdh、pETDuet-ecadh2-kpfdh、pETDuet-ecadh2-bsgdh、pETDuet-ecadh2-papdhとを得た。
(5)pRSFDuet-1及び、pETDuet-1の二重プラスミドの4つ遺伝子の共発現システムの構築。
メーカーが提供した取扱説明書に従って、TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0を用いて、ステップ(4)で得たpRSFDuet-cmaao-pmkdc、pRSFDuet-cmaao-llkdc、pRSFDuet-pmaao-pmkdc、pRSFDuet-pmaao-llkdcプラスミドDNA1、及び、pETDuet-ecadh1-kpfdh、pETDuet-ecadh1-bsgdh、pETDuet-ecadh1-papdh、pETDuet-ecadh2-kpfdh、pETDuet-ecadh2-bsgdh、pETDuet-ecadh2-papdhプラスミドDNA2を抽出し、その後、上述のプラスミドDNA1及びプラスミドDNA2をそれぞれ1μL取って、100μLのE. coli(BL21)コンピテント細菌を添加し、軽くブレンディングし、30分間氷浴させた。予熱した42℃の水浴に入れ、90秒間置いて熱ショック処理を行う。直ちに2分間氷浴した。抗生物質を含まないLB培養液1mLを添加し、菌体が回復するように37℃で1時間培養した。最後に、菌体をアンピシリンとカナマイシンを含むLBプレート上に均一に塗布し、シングルコロニーをピックアップして12時間培養し、その後、さらにPCRで4つの遺伝子が成功的にE. coli(BL21)へ形質転換されたことを検証すると共に、DNAシークエンシングを行い、その正確性を保証し、菌株を保存した。
本実施例では、最終的に以下の8株のエンジニアリングバクテリア、E. coliBL21(pRSFDuet-cmaao-pmkdc、pETDuet-bsgdh-ecadh1)、E. coliBL21(pRSFDuet-pmaao-llkdc、pETDuet-bsgdh-ecadh2)、E. coliBL21(pRSFDuet-cmaao-pmkdc、pETDuet-bsgdh-ecadh2)、E. coliBL21(pRSFDuet-pmaao-pmkdc、pETDuet-papdh-ecadh1)、E. coliBL21(pRSFDuet-pmaao-pmkdc、pETDuet-kpfdh-ecadh2)、E. coliBL21(pRSFDuet-cmaao-llkdc、pETDuet-bsgdh-ecadh1)、E. coliBL21(pRSFDuet-cmaao-llkdc、pETDuet-kpfdh-ecadh2)、E. coliBL21(pRSFDuet-pmaao-llkdc、pETDuet-papdh-ecadh1)を構築し、それぞれ組換え菌の番号はA、B、C、D、E、F、G、Hである。
実施例1で獲得した遺伝子工学菌の誘導発現。
構築された遺伝子工学菌のコロニーをピックアップして10mLのLB培地(0.1g/Lのアンピシリンを含む)に接種し、37℃で12時間培養し、2%の体積割合でLB培地(1000mLの振動フラスコに200mLの培地を含み、0.1g/Lのアンピシリンを含む)に接種し、37℃で2.5時間培養し、細菌対数増殖期(OD600が0.6~0.8に達する)になると、濃度が0.4mMになるまでIPTGを添加し、20℃、200rmp条件下で8時間培養した。誘導発現が終了した後、20℃、8000rpm、20分間遠心分離し、細胞を収集した。変換に必要な菌体量に応じて、振動フラスコの数量を増加することによって、充分な菌体を獲得することができる。
実施例2に記載の誘導発現方法に応じて、実施例1で得られた番号がA、B、C、D、E、F、G、Hの組換え菌は、それぞれ誘導発現が終了した後、菌体が収集され、100mlの反応体積の中で、異なる基質をそれぞれ全細胞に混合した後の変換情況を観察した。基質の最終の濃度は0.5g/Lで、グルコース濃度は10g/Lで、pHは8.0に調節し、重量が20g(湿重量)の新鮮な全細胞を添加し、30℃の温度で、24時間変換させた後、結果を検出したところ、各種類の基質の反応情況は、以下の表に示す通りである。
基質は、それぞれL-フェニルアラニン、L-チロシン、L-ドーパで、それぞれに対応する生成物は、2-フェニルエタノール、チロソール、ヒドロキシチロソールである。
実施例2に記載の誘導発現方法に応じて、実施例1で得られたE. coliBL21(pRSFDuet-cmaao-pmkdc、pETDuet-bsgdh-ecadh2)の誘導発現が終了した後、菌体を収集し、100mlの反応体積の中で、L-フェニルアラニンの濃度は20g/Lで、グルコースの濃度は20g/Lで、pHは8.0に調節し、重量が20g(湿重量)の新鮮な全細胞を添加し、20℃の温度で、48時間変化した後、結果を検出したところ、濃度が18g/Lの2-フェニルエタノールが生成された。
実施例2に記載の誘導発現方法に応じて、実施例1で得られたE. coliBL21(pRSFDuet-pmaao-pmkdc、pETDuet-papdh-ecadh1)の誘導発現が終了した後、菌体を収集し、100mlの反応体積の中で、L-ドーパの濃度は1g/Lで、亜リン酸の濃度は1g/Lで、pHは4.0に調節し、重量が10g(湿重量)の新鮮な全細胞を添加し、35℃の温度で、0.5時間変換した後、結果を検出したところ、濃度が52mg/Lのヒドロキシチロソールが生成された。
実施例2に記載の誘導発現方法に応じて、実施例1で得られたE. coliBL21(pRSFDuet-pmaao-pmkdc、pETDuet-kpfdh-ecadh2)の誘導発現が終了した後、菌体を収集し、100mlの反応体積の中で、L-チロシンの濃度は0.5g/Lで、ギ酸ナトリウムの濃度は20g/Lで、pHは6.0に調節し、重量が1g(湿重量)の新鮮な全細胞を添加し、30℃の温度で、12時間変換した後、結果を検出したところ、濃度が104mg/Lのチロソールが生成された。
実施例2に記載の誘導発現方法に応じて、実施例1で得られたE. coliBL21(pRSFDuet-pmaao-pmkdc、pETDuet-kpfdh-ecadh2)の誘導発現が終了した後、菌体を収集し、100mlの反応体積の中で、L-ロイシンの濃度は0.5g/Lで、ギ酸ナトリウムの濃度は1g/Lで、pHは7.0に調節し、重量が20g(湿重量)の新鮮な全細胞を添加し、30℃の温度で、48時間変換した後、結果を検出したところ、濃度が320mg/Lのイソアミルアルコールが生成された。
実施例2に記載の誘導発現方法に応じて、実施例1で得られたE. coliBL21(pRSFDuet-cmaao-llkdc、pETDuet-bsgdh-ecadh1)の誘導発現が終了した後、菌体を収集し、100mlの反応体積の中で、L-フェニルアラニンの濃度は0.5g/Lで、グルコースの濃度は1g/Lで、pHは8.0に調節し、重量が1g(湿重量)の新鮮な全細胞を添加し、40℃の温度で、36時間変換した後、結果を検出したところ、濃度が155mg/Lの2-フェニルエタノールが生成された。
実施例2に記載の誘導発現方法に応じて、実施例1で得られたE. coliBL21(pRSFDuet-cmaao-llkdc、pETDuet-kpfdh-ecadh2)の誘導発現が終了した後、菌体を収集し、100mlの反応体積の中で、L-チロシンの濃度で0.5g/L、ギ酸ナトリウムの濃度は20g/Lで、pHは5.0に調節し、重量が15g(湿重量)の新鮮な全細胞を添加し、30℃の温度で、48時間変換した後、結果を検出したところ、濃度が398mg/Lのチロソールが生成された。
実施例2に記載の誘導発現方法に応じて、実施例1で得られたE. coliBL21(pRSFDuet-pmaao-llkdc、pETDuet-papdh-ecadh1)の誘導発現が終了した後、菌体を収集し、100mlの反応体積の中で、L-チロシンの濃度は0.5g/Lで、亜リン酸の濃度は5g/Lで、pHは7.0に調節し、重量が5g(湿重量)の新鮮な全細胞を添加し、25℃の温度で、6時間変換した後、結果を検出したところ、濃度が210mg/Lのチロソールが生成された。
Claims (9)
- 低コストでフェニルエタノール類化合物が生産できる大腸菌組換え菌であって、プロテウス ミラビリス(Proteus mirabilis)ATCC 29906又はコセンゼア ミクソファシエンス(Cosenzaea myxofaciens)ATCC 19692のL-アミノ酸酸化酵素、プロテウス ミラビリス(Proteus mirabilis)ATCC 29906又はラクトコッカス ラクティス(Lactococcus lactis)ATCC 19435のα-ケト酸脱炭酸酵素、エスケリキア コリ(Escherichia coli)BL21(DE3)のアルコール脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素、グルコース脱水素酵素、又は亜リン酸脱水素酵素であるNAD(P)をNAD(P)Hに還元する酵素の4つの酵素を同時に発現することを特徴とする、大腸菌組換え菌。
- 前記NAD(P)をNAD(P)Hに還元する酵素は、コマガタエラ ファフィ(Komagataella phaffii)ATCC 76273由来のギ酸脱水素酵素、バチルス サブチルス(Bacillus subtilis)ATCC 13952由来のグルコース脱水素酵素、または、シュードモナス・アビエタニフィラ(Pseudomonas abietaniphila)ATCC 700689由来の亜リン酸脱水素酵素であることを特徴とする、請求項1に記載の大腸菌組換え菌。
- 前記大腸菌組換え菌は、pRSFDuet-1及びpETDuet-1の二重プラスミドを用いて、pRSFDuet-1に組み込んだL-アミノ酸酸化酵素の遺伝子、及び、α-ケト酸脱炭酸酵素の遺伝子、pETDuet-1に組み込んだアルコール脱水素酵素の遺伝子、及び、NAD(P)を還元する酵素の遺伝子という4つの酵素をコードする遺伝子を共発現していることを特徴とする、請求項1又は2に記載の大腸菌組換え菌。
- 前記大腸菌組換え菌は、2つの共発現組換えプラスミドを宿主Escherichia coli B21に形質転換して得られることを特徴とする、請求項3に記載の大腸菌組換え菌。
- 請求項1から4のいずれか1項に記載の大腸菌組換え菌を利用することを特徴とする、フェニルエタノール類化合物を生産する方法。
- 前記フェニルエタノール類化合物は、2-フェニルエタノール、チロソール、ヒドロキシチロソール中のいずれか1つであることを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- 前記フェニルエタノール類化合物の生産用の基質は、L-フェニルアラニン、L-チロシン、L-ドーパ中の、いずれか1つまたは複数であることを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- 前記フェニルエタノール類化合物は、全細胞により変換されて生産されることを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- 全細胞変換生産システムにおいて、新鮮な細胞の湿重量が10~200g/Lで、基質の濃度が0.5~20g/Lで、水素供与体の濃度が1~20g/Lで、pHが4.0~8.0で、15~40℃で0.5~48時間反応することを特徴とする、請求項5に記載の方法。
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