PT115777B

PT115777B - Processo para a produção de 2-feniletanol por uma estirpe selecionada de acinetobacter soli e utilização do mesmo

Info

Publication number: PT115777B
Application number: PT11577719A
Authority: PT
Inventors: Maria Sobreira Vieira Peixe Luísa; Maria Fortio Mourato Teixeira Grosso Ledo Filipa; Da Ascensão Carvalho Fernandes Miranda Reis Maria; Andreia Vieira Torres Cristiana
Original assignee: Univ Do Porto; Univ Nova De Lisboa
Priority date: 2019-09-12
Filing date: 2019-09-12
Publication date: 2021-10-07
Also published as: WO2021048645A1; EP4028535A1; PT115777A

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE A UM PROCESSO DE PRODUÇÃO NATURAL DE 2-PE USANDO A BACTÉRIA ACINETOBACTER SOLI. PARA ESSE FIM, ESTIRPES DE A. SOLI SELECIONADAS A PARTIR DE ISOLADOS AMBIENTAIS FORAM CULTIVADAS NUM BIORREATOR SOB CONDIÇÕES MÉDIAS DE FERMENTAÇÃO. A ESTIRPE DE A. SOLI ANG 344B (NÚMERO DE ACESSO 1593) É PARTICULARMENTE CAPAZ DE MELHORAR A PRODUÇÃO DE 2-PE RESULTANDO EM ALTOS RENDIMENTOS DO REFERIDO COMPOSTO. ESTE COMPOSTO É RESPONSÁVEL PELO AROMA DE ROSAS COM ALTO PREÇO COMERCIAL EM COMPARAÇÃO AO COMPOSTO PRODUZIDO SINTETICAMENTE. PODE SER UTILIZADO NOS SETORES ALIMENTAR, COSMÉTICO E FARMACÊUTICO, COMO POTENCIADOR ORGANOLÉPTICO, AGENTE ANTIBACTERIANO E ANTIFÚNGICO. ALÉM DISSO, O 2-PE TAMBÉM É UM ÁLCOOL VALIOSO QUE PODE SER USADO COMO BIOCOMBUSTÍVEL DA PRÓXIMA GERAÇÃO E COMO MATÉRIA-PRIMA PARA OS SEUS DERIVADOS NAS INDÚSTRIAS FARMACÊUTICA E QUÍMICA FINA. PORTANTO, A PRESENTE INVENÇÃO ENCONTRA-SE NO CAMPO DA MICROBIOLOGIA, QUÍMICA E BIOTECNOLOGIA E TEM APLICAÇÃO NAS INDÚSTRIAS ALIMENTAR, COSMÉTICA, FARMACÊUTICA E DOS COMBUSTÍVEIS.

Description

DESCRIÇÃO

Processo para a produção de 2-feniletanol por uma estirpe selecionada de Acinetobacter soli e utilização da mesma

Domínio técnico da invenção

A presente invenção refere-se a um processo para a produção de 2-feniletanol (2-PE) e o seu correspondente acetato (2-PEA) por um micro-organismo de Acinetobacter soli cultivado em meio de baixo custo e condições médias de fermentação.

Este processo resulta em altos rendimentos dos referidos compostos que podem ser usados nos setores alimentar, cosmético e farmacêutico como potenciador organoléptico, agente antibacteriano e antifúngico. Além disso, o 2-PE também é um álcool valioso para biocombustivel da próxima geração e é usado como matéria-prima para os seus derivados nas indústrias farmacêutica e química fina.

A presente invenção também se refere a uma estirpe de Acinetobacter soli que foi selecionada a partir de isolados ambientais. Essa estirpe é útil na produção de 2-PE e 2-PEA, tendo sido depositada de acordo com os regulamentos do Tratado de Budapeste, recebendo o Número de Referência de Identificação ANG 344B fornecido pelo Depositante e o Número de Acesso 1593 fornecido pela IDA, Universidade da Letónia (MSCL).

Portanto, a presente invenção encontra-se no campo da microbiologia, química e biotecnologia e tem aplicação nas indústrias alimentar, cosmética, farmacêutica e dos combustíveis.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO composto 2-Feniletanol (2-PE), bem como o seu correspondente acetato (2-PEA), é responsável pelo perfume das rosas e é a fragrância mais usada em perfumes e cosméticos, com um mercado mundial estimado em cerca de 10.000 t por ano, segundo dados de 2010. A maioria do 2-PE/2-PEA atualmente usado é produzido quimicamente. No entanto, a sua qualidade é bastante reduzida devido aos reagentes tóxicos usados na síntese (por exemplo, petroquímicos como benzeno, óxido de estireno ou propileno) e no processo de purificação, que podem resultar na formação de subprodutos indesejáveis que afetam as características organolépticas do 2-PE/2-PEA.

Devido a isso, ο 2-PE/2-PEA natural é preferível ao resultante da síntese química. Ο 2-PE/2-PEA natural tem um volume de mercado de 0,5-1 t por ano, sendo vendido a preços de mercado de 1000 euros por quilograma, enquanto o mesmo composto proveniente da síntese química apresenta um preço de mercado de apenas 3,5 euros por quilograma. Além disso, os consumidores também tendem a preferir aromas naturais devido à crença de que são mais saudáveis e ambientalmente amigáveis e, portanto, é importante fornecer novas fontes naturais para essa produção de compostos.

Alguns outros micro-organismos podem produzir 2-PE e acetato de 2-fenetilo (2-PEA) como resultado dos seus metabolismos naturais, que incluem as vias Shikimate e Ehrlich. Entre esses micro-organismos, podemos encontrar principalmente leveduras, como Saccharomyces cerevisiae, fungos como Aspergillus niger e bactérias como Enterobacter sp. Além disso, algumas estirpes de S. cerevisiae, Enterobacter sp. e Escherichia coli foram submetidas a modificações genéticas para produção de alto rendimento de 2-PE e 2-PEA.

No entanto, consumidores por todo o mundo também têm preocupações com o uso de organismos geneticamente modificados (OGM) e tendem a preferir produtos sem OGMs .

A presente invenção supera os problemas do estado da técnica mencionados acima, fornecendo um processo para produzir 2-PE e 2-PEA, por uma bactéria de ocorrência natural pertencente a espécies de Acinetobacter soli isoladas do ambiente e, em particular, uma estirpe especifica de A. soli para melhorar a produção dos referidos compostos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um processo para a produção de 2-feniletanol (2-PE) e acetato de 2 fenetilo (2-PEA) pela bactéria Acinetobacter soli cultivada em meio de baixo custo e condições médias de fermentação e a uma estirpe específica de A. soli.

Portanto, num aspeto, a presente invenção refere-se a uma estirpe de Acinetobacter soli ANG 344B com Número de Acesso 1593, fornecido pela IDA, Universidade da Letónia (MSCL), de acordo com a reivindicação 1.

Esta estirpe é particularmente vantajosa na produção de altos rendimentos de 2-PE e 2-PEA.

Num segundo aspeto, a presente invenção refere-se a um processo de produção de 2-PE /2-PEA usando a bactéria Acinetobacter soli, de acordo com a reivindicação 2.

Esse processo permite obter altos rendimentos de 2-PE e 2-PEA de maneira simples, natural e ecológica, sem a necessidade de usar óleos ou organismos geneticamente modificados.

DESCRIÇÃO GERAL DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um processo para a produção de 2-feniletanol (2-PE) /2-PEA por um micro-organismo do género Acinetobacter soli e a uma estirpe específica de Acinetobacter soli selecionada a partir de isolados naturais para melhorar a produção de 2-PE /2-PEA.

1. Micro-organismo Acinetobacter soli

Acinetobacter é um género de bactérias Gram-negativas pertencentes à classe mais alargada de Gammaproteobacteria, ordem Pseudomonadales e família Moraxellaceae. As espécies de Acinetobacter são negativas à oxidase, exibem motilidade espasmódica e ocorrem em pares sob ampliação. Esses microorganismos são bacilos Gram-negativos estritamente aeróbicos, não fermentativos.

género Acinetobacter é caracterizado por uma distribuição omnipresente na natureza e um metabolismo versátil refletido na sua capacidade de usar diferentes fontes de carbono para crescer, dependendo do nicho ecológico. Como resultado, estirpes de Acinetobacter foram exploradas para aplicações biotecnológicas, como a degradação de diferentes poluentes orgânicos, inorgânicos e metais pesados. Importantes produtos biológicos das estirpes de Acinetobacter também foram explorados, como polissacarídeos, poliésteres e lipases. Além disso, bioemulsificadores produzidos por diferentes estirpes de Acinetobacter já estão disponíveis comercialmente. Alguns exemplos são o emulsano produzido por Acinetobacter calcoaceticus RAG-1, A. calcoaceticus BD4 RAG-1, o biodispersan produzido por Acinetobacter calcoaceticus A2 e alasan produzido por Acinetobacter radioresistens KA53, atualmente usados na recuperação microbiológica avançada de óleo e na biodegradação de compostos tóxicos.

Ao realizar exames laboratoriais com o objetivo de detectar bactérias resistentes a antibióticos a partir de fontes ambientais, foi surpreendentemente observado um perfume de rosa num grupo de placas de ágar, onde foram cultivadas estirpes bacterianas de amostras de água de rio. Após várias etapas dos processos de isolamento e purificação, foi possível relacionar o referido perfume a uma estirpe determinada de Acinetobacter sp..

A identificação das espécies foi realizada inicialmente pelo sequenciamento parcial do gene rpoB (subunidade β da RNA polimerase). A caracterização das estirpes também envolveu o sequenciamento do genoma inteiro, que permitiu a identificação de diferentes enzimas envolvidas na via Shikimate como importantes para a produção de perfume de rosa. É de notar a singularidade desses genes entre o género Acinetobacter, isto é, não apresenta identidade a nenhum outro género bacteriano. 0 genoma mais intimamente relacionado a este é o da estirpe A. soli GFJ2 (número de acesso ao genbank NZ_CP016896.1) . No entanto, uma enzima relevante para a via Shikimate estava ausente, a saber, a transaminase de aminoácido aromático envolvida no metabolismo da fenilalanina (EC 2.6.1.57).

Estudos preliminares usando um biorreator demonstraram que o 2-PE /2-PEA foi produzido como metabolito primário, usando LPhe como principal fonte de nitrogénio.

Portanto, com o objetivo de melhorar a produção de 2-PE /2-PEA via bactérias não geneticamente manipuladas, esta estirpe especifica de Acinetobacter soli foi adicionalmente analisada e apresentou surpreendentemente o maior rendimento de produção de 2-PE/2-PEA descrito entre as bactérias do tipo selvagem.

No âmbito da presente invenção, essa estirpe foi depositada de acordo com os regulamentos do Tratado de Budapeste, tendo recebido o Número de Referência de Identificação ANG 344B fornecido pelo Depositante e o Número de Acesso 1593 fornecido pela IDA, Universidade da Letónia.

2. Cultivo de A. soli meio de cultura para o cultivo de A. soli em condições médias compreende uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogénio, que normalmente é fornecida pelo extrato de levedura, a Lfenilalanina um precursor de 2-PE /2-PEA e sais inorgânicos.

Vários tipos de fonte de carbono são adequados para o cultivo de A. soli, incluindo alimentos ou resíduos industriais ou subprodutos, como por exemplo soro de queijo, polpas de frutas ou cascas de frutas. No entanto, a fonte preferencial de carbono é a glicose, e a concentração ótima está no intervalo de 5 e 25 g/L, preferencialmente 10 e 20 g/L.

No âmbito da presente invenção, polpas de frutas ou cascas de frutas, adequadas como fonte de glicose para o cultivo de Ά. soli são o pêssego, abacaxi, maçã, uvas e banana.

Quando pêssego, abacaxi, maçã, uvas e banana estão presentes no meio de cultivo, a sua concentração pode variar para obter uma concentração de glicose entre 5 e 25 g/L de glicose, preferencialmente 10 e 20 g/L.

Fontes de nitrogénio adequadas para o cultivo de A. soli incluem sais de amónio, como cloreto de amónio, sulfato de amónio ou ureia. Uma fonte preferida de nitrogénio é fornecida pelo extrato de levedura com uma variável de concentração na faixa de 0,4 e 2,0 g/L.

A L-fenilalanina é preferencialmente adicionada como precursora do 2-PE /2-PEA, mais preferencialmente com uma concentração mínima de 0,5 g/L. O tempo de conversão foi de 326 horas.

3. 3. 2-Feniletanol

O álcool fenetílico, ou 2-feniletanol, é um composto álcool primário de fórmula I (C6H5CH2CH2) com um grupo fenetilo ligado a OH.

Fórmula I

É um líquido incolor levemente solúvel em água (2 mL/100 mL de H2O) , mas miscível com a maioria dos solventes orgânicos. Ocorre amplamente na natureza, sendo encontrado numa variedade de óleos essenciais, como o extrato de rosa, cravo, jacinto, pinheiro Aleppo, flor de laranjeira, ylang-ylang, gerânio, neroli e champaca, sendo assim frequentemente utilizado como fragrância em perfumes e cosméticos.

Vários micro-organismos, tais como a levedura e bactérias, são capazes de produzir 2-PE e acetato de 2-feniletilo (2-PEA) como resultado dos seus metabolismos naturais, embora A. soli nunca tenha sido descrita como um deles.

2. Processo para a produção de 2-PE /2-PEA processo da presente invenção compreende a produção de 2feniletanol e de acetato de 2-fenil etilo (2-PEA) por cultivo da estirpe de Acinetobacter soli ANG 344B em meios de cultura convencionais, como descrito acima, ou noutros meios de cultura compreendendo resíduos ou subprodutos alimentares e industriais, como, por exemplo, soro de queijo, frutas polpas ou cascas de frutas como fonte de glicose, como estratégia para reduzir os custos de produção de 2-PE /2-PEA e, paralelamente, valorizar os componentes do desperdício de alimentos.

cultivo em biorreator é iniciado pela inoculação do microorganismo selecionado no meio nutritivo aquoso. A aeração é uma condição preferida, em particular aeração com ar comprimido. 0 volume do inoculo deve estar dentro do intervalo de 5 a 20% do volume total do meio de reação.

A temperatura é controlada entre 20°C e 40°C, preferencialmente no intervalo de 25°C e 35°C, e o valor do pH é controlado entre 5,0 e 9,0, preferencialmente entre 6,5 e 7,5.

A taxa de fluxo de ar pode ser mantida entre 0,5 e 2 vvm (volume de gás por volume de reator) . A concentração de oxigénio dissolvido é controlada pela variação automática da velocidade de agitação entre 100 e 2000 rpm, preferencialmente entre 300 e 1000 rpm.

A produção de compostos aromáticos é concomitante com o crescimento celular, quando o crescimento celular diminui ou termina devido, por exemplo, à limitação de nitrogénio, a produção de 2-feniletanol também para.

A síntese dos compostos aromáticos da invenção pode ser realizada num lote, lote alimentado, lote repetido ou num processo contínuo. Esses modos alternativos de operação em biorreator permitem otimizar o processo, uma vez que a nova preparação de inoculo e biorreator é eliminada.

O 2-feniletanol é extraído do caldo de fermentação pelos métodos convencionais existentes na técnica, nomeadamente pervaporação e destilação a vácuo.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Cultivo de Acinetobacter soli (ANG344B) em meio de cultura convencional

Uma cultura de Acinetobacter soli (ANG344B) foi inoculada em 2 L de meio de cultura com a composição descrita na Tabela 1. 0 biorreator (BioStat B-Plus, Sartorius) foi operado sob condições controladas: temperatura a 30°C; pH 7,00 ± 0,05 com adição automática de NaOH 5M e HC1 2M e aeração constante de 1 vvm. O oxigénio dissolvido diminuiu gradualmente de 99% para 30% durante as primeiras 6 h e foi controlado a 30% pelo controlo automático da velocidade de agitação entre 300 e 1000 rpm.

Tabela 1 - Composição do meio de cultura

Componente	Concent ração
Na₂HPO₄	4 g/L
K2HPO4	1 g/L
NaCl	0,2 g/L
MgSO₄.7H₂O	0,2 g/L
CaCl₂.H₂O	0,05 g/L
Glucose	20 g/L
Extrato de Levedura	5 g/L

Ao final de 13 horas de cultivo, o crescimento celular terminou ao se alcançar uma concentração de CDW (peso seco da célula) de 4,80 g/L. O ciclo de cultivo terminou 24 horas após o inicio da operação.

Foi obtida uma produção de 2,60 g/L de 2-feniletanol. A produtividade alcançada foi de 0,2 g/L.h e o rendimento da Lfenilalanina foi de 0,7 g/g.

Exemplo 2. Cultivo de Acinetobacter soli (ANG344B) em meio de cultura alternativo

Numa estratégia para reduzir os custos de produção de 2-PE /2PEA e, paralelamente, valorizar os componentes do desperdício de alimentos, a produção de 2-PE /2-PEA foi testada usando casca de banana para substituir a glicose no meio.

Para isso, foi preparada uma alternativa ao meio de cultura convencional, que incluía extrato de casca de banana, L-phe (5 g/L) , Na₂HPO₄ (4 g/L) , K₂HPO₄ (1 g/L) , NaCl (0,2 g/L) , MgSO4.7H2O (0,2 g/L), CaC12.H2O (0,05 g/L) e extrato de levedura (5 g/L).

O extrato de casca de banana foi obtido pelo seguinte procedimento:

- casca de banana (812,02 g) + 672 mL de água. As cascas de banana e a água foram misturadas numa misturadora e a mistura foi hidrolisada em autoclave por 40 min (121 °C, 1 bar) . Depois, a mistura foi centrifugada a 10000 rpm durante 30 min, 4 °C e o sobrenadante foi recuperado. O pH foi ajustado para 7 com NaOH (pH = 4,993) e, finalmente, filtrado com filtro de papel (20 pm).

A A. soli ANG 344B foi cultivada em 200 mL de meio de cultura a 30 °C, com agitação (200 rpm) durante 96 h. Foi utilizado um total de 2,74 g/L de L-Phe.

A produção de 2-PE atingiu um total de 1,043 g/L, com um rendimento de 0,38.

Exemplo 3. Produção de 2-PE por diferentes micro-organismos

Bactérias do tipo selvagem e modificadas foram caracterizadas em diferentes meios de cultura otimizados para aceder aos resultados da produção de 2-PE (1-6) - COMP. A Acinetobacter soli ANG344B MSCL 1593 foi cultivada nas mesmas condições dos resultados do Exemplo 1 - INV. A tabela 2 abaixo mostra os resultados obtidos em comparação com os disponíveis na literatura.

Tabela 2 - Produção de 2 PE por micro-organismos

Estirpes bacterianas	2-PE (mgL-¹)	Meio de Cultura	Referência
Enterobacter sp. CGMCC 5087 (COMP) Geneticamente manipulada Enterobacter sp. CGMCC 5087 (COMP)	70 334, 9	Meio LB	1
Brevibacterium sp. (COMP)	4-40	Meio TSB	2
Mistura de Microbacterium foliorum Proteus vulgaris, Psychrobacter sp. (COMP)	1,1	Modelo Queijo	3
E. coli modificada com genes de Pichia pastoris GS115 e Saccharomyces cerevisiae S288c (COMP)	285	Meio LB, frasco agitado	4
E. coli BW25113 expressando genes de levedura (COMP)	5320	Meio com 8,26 g L^-1 de L-Phe Rendimento=0,65 g/g	5

E. coli BL21(DE3) expressando genes de levedura (COMP)	4700	Meio com 16,5 g L^-1 de L-Phe rendimento=0,2 9 g/g	6
Acinetobacter soli ANG344B MSCL 1593 estirpe de tipo selvagem (INV)	2600	Meio simples com 3,736 g L^-1de L-Phe, Biorreator de lotes rendimento=0,70 g/g	0 nosso estudo

A Acinetobacter soli ANG344B MSCL 1593 apresentou uma concentração de produção de 2-PE maior do que a relatada na literatura para outras bactérias do tipo selvagem (Tabela 2). Por outro lado, a concentração de 2-PE alcançada (2600 mgL^-1) está no intervalo de bactérias geneticamente modificadas (285 - 5320 mgL^-1) , que foram otimizadas para aumentar bastante a produção de 2-PE, enquanto a concentração de 2-PE (resultados INV) foi alcançada em condições não otimizadas num biorreator de lotes.

Referências da Tabela 2 . Zhang H, Cao M, Jiang X, Zou H, Wang C, Xu X, Xian M. 2014. Denovo synthesis of 2-phenylethanol by Enterobacter sp. CGMCC 5087. BMC Biotechno, 14:30.

.Jollivet N, Bézenger MC, Vayssier Y et al. 1992. Production of volatile compounds in liquid cultures by six strains of coryneform bactéria. Appl Microbiol Biotechnol, 36: 790.

.Deetae P, Spinnler HE, Bonnarme P, Helinck S. 2009. Growth and aroma contribution of Microbacterium foliorum, Proteus vulgaris and Psychrobacter sp. during ripening in a cheese model médium. Appl Microbiol Biotechnol. 82(1):169-77.

.Kang Z, Zhang C, Du G, Chen J. 2014. Metabolic Engineering of Escherichia coli for Production of 2-phenylethanol from Renewable Glucose. Appl Biochem Biotechnol. 172(4):2012-21.

.Wang P, Yang X, Lin B, Huang J, Tao Y. 2017. Cofactor selfsufficient whole-cell biocatalysts for the production of 2phenylethanol. Metabolic Engineering. 44: 143-149.

. Hwang JY, Park J, Seo JH, Cha M, Cho BK, Kim J, Kim BG. 2009. Simultaneous synthesis of 2-phenylethanol and L-homophenylalanine using aromatic transaminase with yeast Ehrlich pathway. Biotechnol. Bioeng. 102 (5), 1323-1329.

Lisboa, 9 de Agosto de 2021.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Uma bactéria caracterizada por ser da espécie Acinetobacter soli, estirpe ANG 344B e ter o Número de Acesso 1593 (MSCL).
2. Uma bactéria, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por produzir 2-PE e/ou 2-PEA.
3. Um processo para a produção de 2-PE e/ou 2-PEA caracterizado por compreender um passo de cultura de uma estirpe de Acinetobacter soli ANG 344B, como descrito em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, num meio de cultura adequado.
4. Um processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o volume do inoculo de A. soli variar de 5 a 20% do volume total do meio de cultura.
5. Um processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 ou 4, caracterizado por o meio de cultura compreender Lfenilalanina, preferencialmente numa concentração superior a 0,5 g/L, mais preferencialmente numa concentração de 0,5 g/L e 10 g/L, ainda mais preferencialmente numa concentração de 0,5 e 5 g/L.
6. Um processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado por o meio de cultura compreender glicose como fonte de carbono, preferencialmente numa concentração de 5 e 25 g/L, preferencialmente 10 e 20 g/L, e extrato de levedura como fonte de nitrogénio, de preferência numa concentração de 0,4 e 2,0 g/L.
7. Um processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6, caracterizado por o meio de cultura compreender resíduos ou subprodutos alimentares e industriais como fonte de carbono.
8. Um processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado por a fonte de carbono presente no meio de cultura consistir em resíduos ou subprodutos alimentares e industriais.
9. Um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 ou 8, caracterizado por os resíduos ou subprodutos alimentares e industriais compreenderem soro de queijo, polpas de frutas e/ou cascas de frutas como fonte de carbono.
10. Um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 9, caracterizado por a bactéria Acinetobacter soli ser cultivada sob condições de aeração, preferencialmente 0,5 e 2 vvm (volume de gás por volume de reator).
11. Um processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 10, caracterizado por a bactéria Acinetobacter soli ser cultivada num processo contínuo de lotes.
12. Um processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 11, caracterizado por ο 2-PE/2-PEA obtido ser extraído por pervaporação e destilação a vácuo.

Lisboa, 9 de Agosto de 2021.