KR101347182B1

KR101347182B1 - Ｌ-젖산을 생산하는 락토바실러스 파라카제이 ｌａ１０４

Info

Publication number: KR101347182B1
Application number: KR1020110136206A
Authority: KR
Inventors: 김진철; 김진석; 최경자; 최용호; 장경수; 뉴엔마이꾸옹
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2011-12-16
Filing date: 2011-12-16
Publication date: 2014-01-06
Also published as: KR20130068815A

Abstract

본 발명은 L-젖산을 생산하는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) LA104 및 락토바실러스 파라카제이 LA104를 이용한 L-젖산의 생산방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 막걸리에서 분리된 40℃ 내지 45℃의 높은 온도, 100 내지 125 g/ℓ의 높은 염 농도, 3 및 4의 낮은 pH, 40 내지 60 g/ℓ의 높은 젖산 농도 및 150 내지 200 g/ℓ의 높은 글루코오스 농도에서 잘 자라는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) LA104 균주는 3 내지 5 g/ℓ의 낮은 농도의 효모 추출물로 고순도의 L-젖산을 생산하므로, L-젖산을 대량적으로 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

Ｌ-젖산을 생산하는 락토바실러스 파라카제이 ＬＡ１０４{Lactobacillus paracasei LA104 producing L-lactic aicd}

본 발명은 L-젖산을 생산하는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) LA104 및 락토바실러스 파라카제이 LA104를 이용한 L-젖산의 생산방법에 관한 것이다.

젖산(lactic acid, LA)은 식품 및 다른 산업에서 다양하게 적용가능한 화학물질이다. 식품, 의약, 화장품 및 직물 산업에서, 젖산은 산미료(acidulant) 및 방부제로서 사용된다. 젖산은 폴리젖산(polylactic acid, PLA), 생분해성 플라스틱 및 친환경 용매(green solvent)의 생산을 위한 중요한 중간 공급 원료가 되고 있다(Datta and Henry, 2006). 젖산은 석유화학산업에서 부산물과 같이 화학 합성 또는 미생물 발효에 의해 제조될 수 있다. 현재, 1년 마다 전 세계적으로 생산되는 전체 젖산의 90%는 젖산 발효 공정에 의해 제조되고, 잔여물은 락토니트릴(lactonitrile)의 가수분해에 의해 합성적으로 생산된다(Nolasco-Hipolito et al., 2002). 젖산의 화학 합성은 단지 라세미 혼합물 DL-LA를 제공한다. 젖산 생산을 위한 다른 가능한 화학 합성 루트(route)는 프로필렌 글리콜(propylene glycol)의 산화, 아세트알데히드(acetaldehyde) 및 일산화탄소(carbon monoxide)의 반응 및 높은 온도 및 압력에서의 물, 클로로프로피온산(chloropropionic acid)의 가수분해 및 프로필렌(propylene)의 질산 산화를 포함한다. 상기 루트는 기술적 및 경제적으로 실행가능한 공정을 이끌고 있다(Datta and Henry, 2006).

상기 발효 공정은 발효에 사용된 가공되지 않은 물질이 석유화학적인 것과 대조하여, 재생가능하기 때문에 좀 더 관계되고 있다. 또한, 발효는 종 및 기질에 따라서, DL-LA의 광학적으로 순수한 이성질체 또는 라세믹 혼합물을 생산할 수 있다. 상기 젖산의 광학적 순도는, DL-LA의 라세믹 혼합물에서 수득한 비결정성 중합체(amorphous polymer)보다 L-이성질체 또는 D-이성질체 형태 결정성 중합체(crystalline polymer)에서 생산되는 PLA가 더 안정하기 때문에 PLA의 물리적인 성질에 중요하다(Wee et al., 2006; Yanez et al., 2003). 광학적으로 순수한 L-(+) 또는 D-(-) 젖산을 생산하는 생산물 고특이성에 더하여, 젖산의 발효 생산은 화학적 합성과 비교하여 기질의 적은 비용, 낮은 생산 온도 및 낮은 에너지 소비와 같은, 몇 가지 이점을 제공한다(John et al., 2009; Wee et al., 2006). 따라서, 발효에 의한 젖산의 생산은 최근에 큰 관심을 받고 있다.

미세조류는 휘트 그라스(wheat grass) 및 버개스(bagasse)와 같은, 바이오매스(biomass)의 다른 근원과 달리 리그닌(lignin)을 포함하지 않는다. 리그닌의 제거는 대개 율속 단계(rate-limiting step)이고, 미세조류에서 이것의 제시는 비용 및 전환 공정의 어려움을 감소시킨다. 현재는, 젖산의 생산을 위한 미세조류의 전처리에 대한 문헌들이 거의 없다; 따라서, 최적의 방법은 아직 확인되지 않았다. 미세조류는 토양 없이 거의 어느 장소에서든 자라고 또한 대략 1 내지 10일의 극도로 짧은 수확 주기를 갖지만, 다른 곡물 공급 원료는 단지 1년 단위로 수확될 수 있다(Schenk et al., 2008). 특징의 조합은 젖산 생산을 위한 공급 원료로서 미세조류의 사용을 지지한다. 또한 미세조류는 성장에 이산화탄소를 요하는데, 이는 공정에 의해 만들어지는 온실 가스 배출물의 몇 가지의 잠재적 흡수를 통하여 추가적인 이점을 만드는 것이다(Harun et al., 2010).

본 발명자들은 담수 마이크로그린 조류(fresh water microgreen alga), 그물말(Hydrodictyon reticulum, HR)이 다당류(polysaccharides), 주로 글루코오스 및 만노오스(mannose)의 높은 함량을 가진다는 것을 발견하였다. 상기 조류는 나아가 젖산과 같은, 당으로부터 높게 첨가된 수준으로 화합물을 생산하기 위하여 공정될 수 있다. 이러한 전환은 구성 단량체 내로 완전히 망가져 버리게 되는 조류 물질 및 젖산에 의해 발효되는 방출된 당(released sugar) 내에 다당류를 요한다(Abdel-Rahman et al., 2011; Harun et al., 2010). 이것의 구성 단량체 내에 다당류의 전환을 위한 일반적인 방법은 산 가수분해 및 효소 가수분해이다. 효소 가수분해는 이것이 비교적 쉬운 반응 조건 때문에 보다 적은 에너지를 요할 뿐만 아니라 독성 및 부식성 화학물질의 사용을 피하므로 보통 선호된다(Xu et al., 2007). 젖산 생산을 위한 효소 가수분해 및 발효 단계는 분리된 가수분해 및 발효(separate hydrolysis and fermentation, SHF) 또는 동시 당화 및 공동발효(simultaneous saccharification and cofermentation, SSCF)에 의해 수행될 수 있다. 상기 SSCF 공정은 상기 두 개의 단계를 위한 단일 반응 관(single-reaction vessel)의 사용, 빠른 공정 시간, 감소된 가수분해의 최종산물 저해 및 증가된 생산성과 같은, SHF보다 다양한 이점을 제공한다(Anuradha et al., 1999).

바이오플라스틱(bioplastic)의 근원으로서 글루코오스를 높은 함량으로 포함하는 한천의 연구 동안, 본 발명자들은 그물말(Hydrodictyon reticulum, HR)이 47.5% 탄수화물(carbohydrate) 및 35% 글루코오스를 포함한다는 것을 밝혔다.

이에 본 발명자들은 전통적인 한국 음식인 김치, 젓갈 및 막걸리로부터 L-젖산을 생산하는 세균(bacteria)을 분리하고, 그들의 생산 및 기술적 특징에 기초하여 40℃ 내지 45℃의 높은 온도, 100 내지 125 g/ℓ의 높은 염 농도, 3 및 4의 낮은 pH, 40 내지 60 g/ℓ의 높은 젖산 농도 및 150 내지 200 g/ℓ의 높은 글루코오스 농도에서 잘 자라는 최적의 L-젖산 생산자인 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) LA104 균주를 선택하여 그물말과 동시 당화 및 공동발효하여 3 내지 5 g/ℓ의 낮은 농도의 효모 추출물로 고순도의 L-젖산을 생산하는 것을 확인하였다. 그러므로, 상기 락토바실러스 파라카제이 LA104 균주는 L-젖산 생산방법에 유용하게 사용할 수 있음을 밝힘으로써, 이에 본 발명을 완성하였다.

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본 발명의 목적은 막걸리에서 분리된 L-젖산을 생산하는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) LA104 균주 및 이를 이용하여 고순도로 L-젖산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 L-젖산 생산용 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) LA104 균주를 제공한다.

아울러, 본 발명은 락토바실러스 파라카제이 LA104 균주, 그물말(Hydrodictyon reticulum)과의 조류, 당화효소 및 효모 추출물을 발효기 내에 투입 후 발효시키는 단계를 포함하는 락토바실러스 파라카제이 LA104균주를 이용한 L-젖산 생산방법을 제공한다.

본 발명의 막걸리에서 분리된 40℃ 내지 45℃의 높은 온도, 100 내지 125 g/ℓ의 높은 염 농도, 3 및 4의 낮은 pH, 40 내지 60 g/ℓ의 높은 젖산 농도 및 150 내지 200 g/ℓ의 높은 글루코오스 농도에서 잘 자라는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) LA104 균주는 3 내지 5 g/ℓ의 낮은 농도의 효모 추출물로 고순도의 L-젖산을 생산함으로써, L-젖산을 대량적으로 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 11개의 수집된 균주에 의한 글루코오스에서의 젖산의 생산에서 효모 추출물(yeast extract, YE) 농도의 영향을 나타낸 도이다.
도 2는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) LA104에 의한 그물말(Hydrodictyon reticulum)에서의 젖산의 동시 당화 및 공동발효에서 서로 다른 효소 혼합물의 영향을 나타낸 도이다.
HR: 그물말(Hydrodictyon reticulum); RS: 환원당(reducing sugar).
도 3은 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) LA104에 의한 그물말(Hydrodictyon reticulum)에서의 젖산의 동시 당화 및 공동발효에서 기질 농도의 영향을 나타낸 도이다.
HR: 그물말(Hydrodictyon reticulum); RS: 환원당(reducing sugar).
도 4는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) LA104에 의한 자 발효기(jar fermentor)를 이용한 그물말(Hydrodictyon reticulum)에서의 젖산의 동시 당화 및 공동발효를 나타낸 도이다.
HR: 그물말(Hydrodictyon reticulum); RS: 환원당(reducing sugar).
(a) 젖산 생산, 남아있는 글루코오스 및 환원당 및 생산율.
(b) 로그10(Log10)(생균수(viable cell count, c.f.u)) 및 % 젖산.
(c) 생산율, 환원당 전환 및 pH.
도 5는 동시 당화 및 공동발효(simultaneous saccharification and cofermentation, SSCF)를 통하여 젖산을 생산하는 균주에 의한 셀룰로오스 바이오매스(cellulosic biomass) 물질에서의 젖산 생산 비교를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 L-젖산 생산용 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) LA104 균주를 제공한다.

상기 균주는 구체적으로 막걸리에서 분리되고 수탁번호 KCTC11883BP이며 스트레스 조건에 대해 내성이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 스트레스 조건은 구체적으로 높은 온도, 높은 염 농도, 높은 젖산 농도, 높은 글루코오스 농도 및 낮은 pH이나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 높은 온도는 구체적으로 30℃ 내지 45℃, 상기 높은 염 농도는 50 내지 125 g/ℓ, 상기 높은 젖산 농도는 20 내지 60 g/ℓ, 상기 높은 글루코오스 농도는 100 내지 200 g/ℓ 및 상기 낮은 pH는 pH3 내지 pH6이고, 보다 구체적으로 상기 높은 온도는 40℃ 내지 45℃, 상기 높은 염 농도는 100 내지 125 g/ℓ, 상기 높은 젖산 농도는 40 내지 60 g/ℓ, 상기 높은 글루코오스 농도는 150 내지 200 g/ℓ 및 상기 낮은 pH는 pH3 및 pH4이고, 가장 구체적으로 상기 높은 온도는 45℃, 상기 높은 염 농도는 125 g/ℓ, 상기 높은 젖산 농도는 60 g/ℓ, 상기 높은 글루코오스 농도는 200 g/ℓ 및 상기 낮은 pH는 pH3이나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 균주는 구체적으로 순도 90% 이상의 고순도로 L-젖산을 생산하는 것이고, 보다 구체적으로 95%, 97%, 99% 및 99.5% 이상의 고순도로 L-젖산을 생산하는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.

이울러, 본 발명자들은 락토바실러스 파라카제이 LA104 균주, 그물말(Hydrodictyon reticulum)과의 조류, 당화효소 및 효모 추출물을 발효기 내에 투입 후 발효시키는 단계를 포함하는 락토바실러스 파라카제이 LA104균주를 이용한 L-젖산 생산방법을 제공한다.

상기 그물말과의 조류는 구체적으로 훈장말속(Pediastrum sp .), 소라스트럼속(Sorastrum sp .) 및 히드로딕티온속(Hydrodictyon sp.)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나이고, 70 내지 80 g/ℓ의 농도로 투입되는 것이고, 보다 구체적으로 80 g/ℓ이나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 당화효소는 구체적으로 셀룰라아제, β-글루코시다제, β-아가라제, β-갈락토시다제, 엔도-1,4-β-글루카나제, α-아밀라아제, β-아밀라아제, 아밀로글루코시다아제, 라미나린나아제, α-D-글루코시다아제, β-D-글루코시다아제, 수크라아제, 말타아제, 이소말타아제, 락타아제, 드리할라제 및 울바나아제로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합 분해효소인 것이고, 보다 구체적으로 셀룰라아제, β-글루코시다제, α-아밀라아제 및 아밀로글루코시다아제의 혼합효소인 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 효모 추출물은 구체적으로 3 내지 5 g/ℓ의 농도로 투입되는 것이고, 보다 구체적으로 5 g/ℓ의 농도로 투입되는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 L-젖산은 구체적으로 분리된 가수분해 및 발효(separate hydrolysis and fermentation, SHF) 또는 동시 당화 및 공동발효(simultaneous saccharification and cofermentation, SSCF)에 의해 생산될 수 있고, 보다 구체적으로 동시 당화 및 공동발효(simultaneous saccharification and cofermentation, SSCF)에 의해 생산되는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명자들은 130개의 젖산(lactic acid, LA)을 생산하는 세균성 균주(bacterial strain)의 전체를 전통적인 한국 음식의 3가지 종류에서 분리하였다. 상기 균주는 글루코오스(glucose)에서 주된 최종 산물(end product)로서 젖산을 생산하였다. 산물 특성을 기초로 분리된 균주를 세 가지 군(group)으로 분리하였다. 군 Ⅰ(31개의 균주) 및 Ⅱ(10개의 균주)는 각각, L-이성질체(이성질체) 및 D-이성질체를 90% 이상으로 생산하는 균주로 구성되어 있다. 군 Ⅲ(89개의 균주)는 DL-젖산의 라세믹 혼합물(racemic mixture)을 생산하는 균주로 구성되어 있다. 130개 분리균(isolate)의 젖산 생산 수율 및 생산된 L-이성질체(전체 젖산의 백분율로서 주어졌다)의 순도는 <표 1>에 나타내었다. 글루코오스의 대부분은 발효하는 데 사용하였다. 130개 균주 중에, 50개의 균주는 15.3 g/ℓ 젖산(산물 수율(product yield) ＞ 85%) 이상을 생산하였고, 이는 상기 균주가 유기체를 동종발효하거나 또는 조건적으로 동종발효한다는 것을 제안한다. 130개 균주 중에, 10개의 균주가 젖산의 D-이성질체를 90% 이상으로 생산한 반면, 31개의 균주는 젖산의 L-이성질체를 90% 이상으로 생산하였다. 동종발효성이 없는 또는 조건적인 동종발효성의 균주는 90% 이상으로 D-젖산의 수율을 보였다. 50개의 동종발효성 또는 조건적인 동종발효성의 균주 중, 11개의 균주는 L-젖산을 90% 이상으로 생산하였다. 상기 11개의 분리균을 앞으로의 실험을 위하여 선택하였다. 다른 80개의 균주는 동종발효성 또는 조건적인 동종발효성이 있다. 모든 D-젖산 생산자를 김치 및 젖갈에서 분리하였고 모든 D-젖산 생산자는 동종발효성 생산자이다. 11개의 분리된 균주 중, 상기 김치에서 분리된 LA41은 이것의 16S rDNA 유전자 서열에 기초하여 락토바실러스 파라플란타룸(Lactobacillus paraplantarum)으로 판정되었고, 막걸리에서 온 다른 10개의 균주는 모두 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei)로 판정되었다.

또한, 본 발명자들은 상기 11개의 균주(LA41, LA102, LA104, LA114, LA116, LA117, LA120, LA125, LA126, LA127, LA128)에 대하여 글루코오스, 젖산 및 염화나트륨의 높은 농도, 낮은 pHs 및 높은 온도에 대한 내성을 알아보기 위하여 스크리닝(screening) 하였다. 높은 농도에서 글로코오스(glucose) 내성에 대하여 스크리닝한 결과, 테스트한 모든 균주는 100 g/ℓ에서 좋은 성장을 보였다는 것을 확인하였다(표 2 참조). 이는 초기 글루코오스 농도가 100 g/ℓ보다 적을 때 상기 11개 균주 성장의 유의적 기질 저해가 없었다는 것을 나타낸다. 5개 균주는 150 g/ℓ에서 잘 성장하였고, 3개 균주는 200 g/ℓ에서 잘 성장하였다. 높은 기질 농도에서 젖산을 생산하는 것은 젖산 농도를 증가시킬 것이고 하류(downstream) 가공비를 감소시킬 것이기 때문에 바람직하다. 그러나, 젖산 생산이 높은 글루코오스 농도에서 기질 저해로 어려움이 있을 것으로 예상된다. 따라서, 향상된 젖산 발효 능력이 있는 글루코오스 내성 균주가 개발되어야만 한다. 본 발명에서 분리된 균주는 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus) ATCC 11443 (Yu et al., 2008) 및 락토바실러스 델브루에키이(Lactobacillus delbrueckii) NCIM 2365 (Anuradha et al., 1999)에서 유래된, 섞인(shuffled) 균주 F22와 같은 특징을 갖는다. 또한, 높은 온도에 대한 내성을 알아보기 위하여 스크리닝한 결과, 30 내지 40℃에서 성장한 11개 분리균 가운데, 4개 균주(LA41, LA120, LA126 및 LA127)는 42℃ 및 45℃에서 성장할 수 없었고, 오로지 하나의 균주, LA104만이 45℃에서 성장할 수 있었다는 것을 확인하였다(표 2 참조). Adnan 및 Tan (2007)은 높은 온도에서 성장하는 능력은 성장율 및 젖산 생산을 증가시킬 수 있기 때문에 바람직한 특성이라는 것을 제안하고 있을 뿐만 아니라 높은 발효 온도는 미생물 오염을 감소시킨다. 또한, 높은 젖산 농도에서의 내성을 알아보기 위하여 스크리닝한 결과, 11개 균주는 20 내지 80 g/ℓ 젖산의 농도에서 잘 성장하지 않았지만, 3개 균주(LA104, LA117 및 LA128)는 60 g/ℓ 젖산의 농도까지 성장하였다는 것을 확인하였다(표 2 참조). 또한, 낮은 pH에 대한 내성을 알아보기 위하여 스크리닝한 결과, 테스트한 모든 분리균은 pH 4에서 성장할 수 있었고, 또한 분리균의 7개는 pH 3에서 성장하였다는 것을 확인하였다(표 2 참조). LA104, LA117 및 LA128의 낮은 pH에서 성장하는 능력은 높은 젖산 농도에서 성장하는 그들의 능력 및 유리산(free acid)에서 락토바실러스 파라카제이의 높은 내성(Kashket, 1987)과 일치한다. 또한, 염화나트륨에 대한 내성을 알아보기 위하여 스크리닝한 결과, 젖산에 대한 높은 내성이 있는 3개 균주 가운데, 2개 균주(LA104 및 LA117)는 125 g/ℓ의 농도까지 염화나트륨을 견뎠다는 것을 확인하였다(표 2 참조). 이 수준은 Adnan 및 Tan (2007)에 의해 알려진 락토코쿠스 락티스(L. lactis) 및 락토바실러스 카제이(L. casei)의 내성 보다 높은 것이다.

또한, 본 발명자들은 상기 11개 균주에 의한 젖산 생산에서 효모 추출물(yeast extract, YE) 농도의 영향을 알아보기 위하여, 여러 가지 YE 농도(0, 1, 2, 3, 5 및 7 g/ℓ)를 50 g 글루코오스/ℓ를 포함하는 배지에 첨가한 결과, 젖산 농도는 YE의 첨가에 따라 증가하였다. 각각, 두 가지 균주, LA104 및 LA128은 3 g YE/ℓ의 제시에서 글루코오스의 대부분을 소비하였고, LA104 및 LA128의 젖산 수율은 각각, 99.6% 및 100%임을 확인하였다(도 2 참조). 낮은 YE 농도에서 또는 비싸지 않은 질소원(nitrogen source)과 함께한 발효를 통하여 젖산을 생산하는 능력은 산업 균주에 이상적일 수 있다. 젖산 세균(bacteria) 배양의 영양소 필요조건에 대한 다수의 연구는 다양한 복합 질소원 가운데, YE 및 펩톤(peptone)이 미생물 성장 및 젖산 생산에 가장 좋은 선택이라는 결론을 내고 있다. 생산 비용을 감소시키기 위하여, YE를 감소시키거나 또는 옥수수 침지액(corn steep liquor), 밀기울(wheat bran), 탈지 우유(skim milk), 맥아 코밍 너트(malt combing nut), 대두 가수분해물(soybean hydrolysate)과 같은, 또 다른 질소원으로 대체시켜야만 한다. 본 발명에서, 적은 양(5 g/ℓ)의 YE로도 LA104 및 LA128에 의한 젖산의 많은 생산에 충분하다는 것을 확인하였다(도 2 참조). 11개의 동종발효성 또는 조건적인 동종발효성 L-젖산 생산자 가운데, 락토바실러스 파라카제이 LA104는 낮은 pHs, 높은 온도 및 글루코오스, NaCl 및 젖산의 높은 농도에서 강한 내성을 보였다. 또한, 상기 균주는 37℃에서 순수한 L-젖산을 97% 보다 더 생산하였고 YE의 적은 양(5 g/ℓ)을 요구하였다. 상기와 같은 특징은 외부 조건이 다른 유기체에 의한 배양의 오염을 감소시킬 수 있으므로 산업적으로 유용한 젖산 생산자로서 매우 높은 가치가 있다(Adnan and Tan, 2007). 스크리닝(screening) 과정의 시리즈(series)를 통하여, 락토바실러스 파라카제이 LA104가 상기 균주의 산업적 가능성 때문에 연구에 선택되었다.

또한, 본 발명자들은 락토바실러스 파라카제이 LA104에 의한 그물말(Hydrodictyon reticulum , HR)로부터 젖산의 동시 당화 및 공동발효(simultaneous saccharification and cofermentation, SSCF)에서 효소 혼합물의 영향을 알아보기 위하여 6가지 다른 효소 조건 및 농도: S1, S2, S3, S4, S5 및 S6로 평가한 결과, HR 물질에서 전체 RS 및 글루코오스의 비율은 각각, 47.5% 및 35%이다. HR에서 상기 젖산 농도 및 RS 전환(48 시간 후 HR에서 100 × g 젖산/g 전체 RS)을 제시하였다(도 2 참조). 상기 SSCF 과정에서, 가장 많은 젖산 생산 및 RS 전환 수율은 S1 및 S2를 사용하였을 때 수득하였다. 상기 두 가지를 처리하는 것에서, 젖산 농도는 동일하였다(S1 및 S2에 대하여 각각, 36 시간 후 36.43 및 36.42 g/ℓ 또는 48 시간 후 37.76 및 37.73 g/ℓ)(도 2 참조). 이는 α- 아밀라아제(amylase)가 SSCF에서 효율적이지 않고 HR 물질에서 RS의 대부분이 48 시간 후 99% 이상의 RS 전환과 함께 젖산을 방출하고 전환하였다(S1의 99.38% 및 S2의 99.3%)는 것을 나타내었다. S3 내지 S6과 함께 젖산 내로 RS 전환은 S1 및 S2으로 했을 경우보다 적었다; 젖산 내로 RS 전환은 51.4% 내지 94.78%의 범위에 있다. L-젖산의 가격 및 생산을 고려하면, 상기 S2 효소 혼합물을 SSCF 과정을 위한 가장 좋은 효소 조성물 및 농도로서 선택하였다.

또한, 본 발명자들은 락토바실러스 파라카제이 LA104에 의한 그물말(Hydrodictyon reticulum , HR)로부터 젖산의 동시 당화 및 공동발효(simultaneous saccharification and cofermentation, SSCF)에서 기질 농도의 영향을 알아보기 위하여, S2 효소 혼합물을 이용하여 조사하였다. 그 결과, 젖산 농도 및 수율은 반대의 변동 경향을 보였다; 기질 농도가 증가함에 따라, 상기 젖산 농도도 증가하였지만(26.53 내지 49.04 g/ℓ), 상기 생산 수율은, RS 전환 수율 및 건조된 물질 전환 수율과 마찬가지로 감소하였다(도 3 참조). 이는 효소 활성에 대하여 자유 젖산(free LA) 및 젖산 칼슘의 최종 산물 되먹임 억제(feedback inhibition) 때문일 수도 있다(Yoon, 1997). 상기와 같은 결과는 기질에서 당질(carbohydrates)의 전체 양이 제시되는 것에 의해 설명할 수 있다. 기질의 더 높은 농도는 효소에 의해 분해될 수 있는 더 많은 발효성 당(fermentable sugar)과 함께 더 많은 당질을 생산한다. 그러나, 이는 가수분해 단계가 기질의 점도가 증가하기 때문에 기질 양이 건조 무게의 10% (w/w)를 초과하였을 때 효율적이지 않다는 것을 보고하고 있다. 높은 점도는 불용성 물질 함유량을 증가시키고, 따라서, 효소에 의한 기질 가수분해의 효율성을 감소시킨다(Rosgaard et al., 2007). 발효성 당의 최적 방출에 요구되는 짧은 시간은 오염 및 최종 산물 저해 효과를 제거하는데, 이는 경제적으로 효율적인 공정을 만드는 것이다. 따라서, 젖산 농도 및 생산 수율을 고려하면, 최적 기질 농도는 80 g/ℓ이다.

또한, 본 발명자들은 YE, 펩톤 및 무기염을 포함하는, 질소원은 락토바실러스(Lactobacillus)의 성장에서 매우 중요하므로, 락토바실러스 파라카제이 LA104에 의한 그물말(Hydrodictyon reticulum, HR)로부터 젖산의 동시 당화 및 공동발효(simultaneous saccharification and cofermentation, SSCF)에서 질소원 및 무기염(mineral salt)의 영향을 알아보았다. 그 결과, 락토바실러스 파라카제이 LA104에 의한 HR로부터의 젖산 형성은 펩톤 농도에 상관없이, 리터(liter) 당 0.2 g MgSO₄7H₂O, 1.5 g KH₂PO₄, 1.5 g K₂HPO₄, 1.5 g 초산 나트륨(sodium acetate) 및 0.05 g MnSO₄.4H₂O로 구성되어 있는 무기염을 보충하였을 때 5 g/ℓ까지 YE 증가와 함께 증가하였지만, YE의 농도가 5 g/ℓ 이상으로 높아졌을 때, 젖산의 생산은 증가하지 않았다. 또한, 5 g YE/ℓ ＋ 무기염 및 5 g YE ＋ 0.05 g MnSO₄ 사이에서 HR로부터 젖산의 SSCF에서 유의적으로 다른 점은 없었다; 35.52 g/ℓ 및 36.18 g/ℓ 젖산은 각각, 80 g HR/ℓ을 포함하는 두 가지 배양에서 생산되었다(표 3 참조). 따라서, HR로부터 젖산의 SSCF에서, MnSO₄는 세포 성장에 가장 중요한 염분이고, SSCF를 위한 최적의 질소원은 5 g/ℓ YE이다. 탄소원(carbon source)으로서 다양한 단당류 및 이당류를 이용한 LA104에 의한 젖산 생산을 조사하였다(데이터는 보이지 않았음). 그 가운데 14개의 다른 당을 실험하였고, 락토바실러스 파라카제이 LA104는 D-(+)-글루코오스, D-(+)-소르비톨(sorbitol), D-(+)-갈락토오스(galactose), D-(+)-만노오스(mannose), D-(-)-프록토오스(fructose), D-(-)-마니톨(mannitol), 자당(saccharose), D-(+)-셀로비오스(cellobiose) 및 D-(+)-말토오스(maltose)를 발효시켰다. LA104에 의해 소모된 상기 모든 당은 육탄당(six-carbon sugar) 또는 이당류이다. 그 가운데 이당류 및 육탄당을 실험하였고, α-락토오스(lactose) 및 L-(+)-람노오스(rhamnose)는 상기 균주에 의해 소모되지 않았다. D-(+)-아라비톨(arabitol), D-(-)-아라비노오스(arabinose) 및 D-(+)-자일로스(xylose)와 같은, 다섯 개의 탄소 원자를 포함하는 오탄당 단당류의 어떤 것도 균주 LA104에 의해 젖산을 전환하지 못했다. 상기와 같은 결과는 옥수수 침지액에서 분리된 락토바실러스 속. B6-4 NRRL B30568(Eddington et al., 2007) 및 케냐에서 전통적인 발효 우유인, 마사이에서 분리된 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum)(Mathara et al., 2004)의 결과와 동일하다. 따라서, 상기와 같은 결과는 LA104가 다양한 육탄당 단당류 및 몇 개의 이당류에서 젖산을 생산할 수 있다는 것을 나타낸다. 표 3은 상기 LA104 균주가 젖산을 생산하기 위하여, 글루코오스, 만노오스, 프록토오스 및 마니톨과 같은, HR 물질로부터 방출된 모든 RS의 대부분을 소모할 수 있다는 것을 보였다(표 3 참조).

아울러, 본 발명자들은 자 발효기(jar fermentor)에서 그물말(Hydrodictyon reticulum, HR)로부터 젖산의 동시 당화 및 공동발효(simultaneous saccharification and cofermentation, SSCF)에 대하여 알아보기 위하여, 5ℓ의 자 발효기(jar fermentor)에서 수행한 결과, 젖산의 형성은 잔여(residual) RS가 더 이상 감소되지 않는 때인 36시간에 완성되었고, 젖산의 37.11 g/ℓ가 생성되었으며, L-이성질체의 순도는 1.03 g/ℓ/시간의 생산성으로 98.3%이다. 젖산의 최대 수율은 46 g/100 g 건조(dry) HR 물질이다. SSCF에서, 글루코오스 및 RS의 최대 농도는 각각, 4 시간 후 13.7 및 15.1 g/ℓ이고, 발효 동안에 이성질체의 순도는 98%에서 95.7%로 서서히 감소하였다. LA104은 0.05 g/ℓ MnSO₄의 제시하에 97.8% (HR 에서 % g 젖산/g RS)의 RS 전환과 함께, 80 g 건조된 물질/ℓ이 사용되었을 때인 36시간 후 상기 RS의 대부분을 젖산으로 전환시켰다. 최대 생산성 비율은 12 시간일 때 2.08 g/ℓ/시간 이다(도 4 참조). 바이오매스(biomass) 증가의 적은 비용과 재생 가능한 형태에서 생물공학적인 생산물을 생산하는 이익으로서, 다양한 부산물 또는 농업 잔여물에서의 젖산 생산은 상당한 관심을 얻게 된다. 균종(fungal species) 및 젖산을 생산하는 세균(bacteria)을 포함하는, 많은 미생물이 젖산의 생산을 위하여 평가되고 있다. 곰팡이(fungal) 발효는 일반적으로 단지 단순한 배지가 L-젖산을 생산하는 데 요구되기 때문에 몇몇 이점이 있다. 그러나, 푸마르산(fumaric acid), 아세트산 및 에탄올과 같은, 부산물의 형성 때문에 높은 산소 요구량, 낮은 생산율 및 낮은 생산물 수율이 균종과 연관하여 주된 한계이다(Jonh et al. 2009; Wee et al., 2006). 도 5는 젖산을 생산하는 세균에 의한 SSCF를 통하여 셀룰로오스의 바이오매스에서 미생물 젖산 생산의 몇 가지 샘플(sample)을 보여준다. 비교적 낮은 젖산 농도 또는 낮은 생산율을 셀룰로오스(cellulose)(Yanez et al., 2003; Venkatesh, 1997), 셀룰로오스 바이오슬러지(cellulosic biosludge)(Romani et al., 2008), α-셀룰로오스(α-cellulose)(Iyer and Lee, 1999), 폐수 슬러지(wastewater sludge)(Nakasaki and Adachi, 2003), 폐기 판지(waste cardboard)(Yanez et al., 2005), 탈지 쌀겨(defatted rice bran)(Tanaka et al., 2006) 및 옥수수 대(corn stover)(Cui et al., 2011)가 SSCF를 통하여 젖산 생산에 사용되었을 때 수득되었다. 젖산의 더 높은 농도가 종이 슬러지에서 생산되었을 지라도(Budhavaram and Fan, 2009), DL-LA의 라세믹 혼합물이 생산되었고, 이는 이것의 적용 가능성을 감소시킨다. Marques et al. (2008)은 어떤 전처리도 없이 SSCF에 의해 재활용된 종이 슬러지의 짧은 섬유 셀룰로오스에서 젖산을 생산하기 위하여 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus) ATCC 7469를 사용하였고 0.97 g/g 당질의 젖산 수율 및 0.43 g/ℓ/시간의 생산율로, 2.9 g/ℓ/시간의 최대 생산성을 수득하였다. Singhvi et al. (2010)의 연구에서, 높은 생산율(1.52 g/ℓ/시간)로 73 g/ℓ의 젖산 수율을 락토코쿠스 락티스(L. lactis) 돌연변이(mutant) RM2-24를 이용하여 SSCF에 의한 젖산 생산에서 수득하였지만, 기질은 α-셀룰로오스이다. Moldes et al. (2001)은 락토바실러스 델부르키(L. delbrueckii)(NRRL-B445)에 의한 젖산을 생산하기 위한 기질로서 나무를 사용하였고 젖산의 높은 농도(108 g/ℓ) 및 0.94 g/ℓ/시간의 높은 생산율을 수득하였다. 따라서, 이러한 재생 가능한 기질과 비교하여, 본 발명은 HR이 넓은 범위에서 락토바실러스 파라카제이 LA104에 의한 SSCF를 통하여 L-젖산 생산을 위한 가능성이 있는 공급 원료(feedstock)가 될 수 있다는 것을 제안한다.

그러므로, 본 발명의 락토바실러스 파라카제이 LA104 균주는 40℃ 내지 45℃의 높은 온도, 100 내지 125 g/ℓ의 높은 염 농도, 3 및 4의 낮은 pH, 40 내지 60 g/ℓ의 높은 젖산 농도 및 150 내지 200 g/ℓ의 높은 글루코오스 농도에서 잘 자라고, 동시 당화 및 공동발효(simultaneous saccharification and cofermentation, SSCF)에서 3 내지 5 g/ℓ의 낮은 농도의 효모 추출물로 고순도의 L-젖산을 생산하므로 락토바실러스 파라카제이 LA104 균주는 L-젖산 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용을 한정하는 것은 아니다.

< 실시예 1> 젖산( lactic acid , LA )을 생산하는 세균성 균주( bacterial strain )의 분리 및 특성화

<1-1> 샘플 및 배지

배추김치, 젖갈 및 막걸리의 샘플을 한국의 다양한 지역에서 수집하였다. 상기와 같은 샘플을 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다. 그물말(Hydrodictyon reticulum, HR)을 한국화학연구원 그린화학연구본부 산업바이오화학연구센터의 온실에서 키웠다. 조류를 수돗물로 세척하고, 공기로 건조시켰고(W: 7.3%) 건조시킬 때에 4℃에서 플라스틱 가방에 보관하였고 사용할 때까지 어두운 장소에 보관하였다. 상기 물질은 1.2 % 지방, 14.2 % 단백질, 54.6 % 당질 및 10 % 탄수화물(starch)을 포함한다. 젖산의 생산에서 효모 추출물(yeast extract, YE)의 영향을, 리터 당 증류수(distilled water), 0.2 g MgSO₄, 2 g KH₂PO₄, 2 g 구연산 암모늄(ammonium citrate), 0.05 g MnSO₄, 1 g 트윈 80(Tween 80), 50 g 글루코오스/ℓ 및 20 g CaCO₃/ℓ를 포함하는 배지(배지 1)에서 평가하였다. 배지의 초기의 pH를 2 M NaOH로 6.0으로 조정하였다. SSCF에 의한 L-젖산의 생산에서 다른 효소 혼합물 및 기질 농도의 영향을 리터당 증류수, 5 g YE, 5 g 펩톤(peptone), 0.2 g MgSO₄.7H₂O, 1.5 g KH₂PO₄, 1.5 g K₂HPO₄, 1.5 g 초산 나트륨(sodium acetate) 및 0.05 g MnSO₄.4H₂O를 포함하는 배지(배지 2)에서 평가하였다. 모든 화학물질을 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 상기 MRS 배지를 Becton, Dickinson 및 Company(Sparks, USA)에서 구입하였다.

<1-2> 젖산을 생산하는 세균( bacteria )의 분리

김치 샘플을 여과액을 수득하기 위하여 네 겹의 거즈를 통하여 여과시켰고, 이것을 10^-5 내지 10^-7까지 멸균 증류수로 희석하였다. 발효된 생선 샘플의 각 2 g을 보텍스 기구(Vortex apparatus)를 이용하여 20 ㎖ 멸균 증류수와 개별적으로 혼합하였고, 네 겹의 거즈를 통하여 여과시켰고, 10^-3 내지 10^-5까지 희석하였다. 각 막걸리 샘플의 1 ㎖을 10^-5 내지 10^-8까지 멸균 증류수로 희석하였다. 각 희석물의 100 ㎕ 일정부분(aliquot)을 0.5% CaCO₃(MRS-AC)이 있는 MRS 한천(agar)을 포함하는 페트리 디쉬(petri dishes)에 도말하였다. 플레이트를 호기성 조건 아래 72 시간 동안 30℃에서 배양하였다. 클리어 존(clear zone)을 형성하는 세균 콜로니(bacterial colonies)를 그들의 다른 형태에 기초하여 분리하였고 단일 콜로니를 수득하기 위하여 새로운 MRS-AC 플레이트에 선조접종(streaking)하였다. 이에 형성된 단콜로니를 분리하였으며, 여러 번의 반복을 통하여 순수한 콜로니를 획득하였다.

그 결과, 표 1에서 보는 바와 같이 젖산을 생산하는 130개의 세균성 균주를 수득하였고 산물 특성을 기초로 분리된 균주를 세 가지 군(group)으로 분리하였다. 군 Ⅰ(31개의 균주) 및 Ⅱ(10개의 균주)는 각각, L-이성질체(isomer) 및 D-이성질체를 90% 이상으로 생산하는 균주로 구성되어 있다. 군 Ⅲ(89개의 균주)는 DL-젖산의 라세믹 혼합물(racemic mixture)을 생산하는 균주로 구성되어 있음을 확인하였다(표 1).

<1-3> 젖산 이성질체의 확인( determination )

L-젖산 및 D-글루코오스의 농도를 YSI 2700 Select Biochemistry Analyzer(YSI Incorporated, Ohio, USA)를 이용하여 측정하였고, 글루코오스에서 생산된 젖산의 D(-) 및 L(+) 이성질체의 유형 및 양을 제조사의 지침서를 따라 효소 키트(enzymatic kit)(Megazyme K-DATE 06/08, K-LATE 03/06, Megazyme International Ireland Ltd., Wicklow, Ireland)를 이용하여 MRS 액체배지에서 확인하였다. 혐기성 조건 아래서 24 시간 동안 37℃ 및 200 rpm으로 배양한 후, 배양한 액체배지를 Gyrozen 1730MR 냉장마이크로원심분리기(refrigerated microcentrifuge)(Gyrozen Co., Ltd., Daejeon, Korea)를 이용하여 10 분 동안 4℃에서 7,000 rpm으로 원심분리하였고 0.2 ㎛ 막 필터를 통하여 여과시켰다. 상기 여과액을 D- 및 L-젖산을 분석하기 위하여 50-폴드(fold)로 희석시켰다. D- 및 L-젖산의 스크리닝 결과에 기초하여, 광학적으로 순수한 이성질체를 90% 이상으로 생산하는 균주를 앞으로의 발현을 위하여 선택하였다. 만일 젖산의 생산율이 85% 이상이면 분리균을 동종발효성 또는 조건적인 동종발효성 젖산 생산자가 되었다고 여겼다(Hammes and Vogel, 1995).

그 결과, 표 1에서 보는 바와 같이 130개 균주 중에, 31개의 균주는 젖산의 L-이성질체를 90% 이상으로 생산하였다. 50개의 동종발효성 또는 조건적인 동종발효성의 균주 중, 11개의 균주는 L-젖산을 90% 이상으로 생산한 것을 확인하였다(표 1).

<1-4> 글루코오스, 젖산 및 염화나트륨의 높은 농도, 낮은 pHs 및 높은 온도에 대한 내성

본 발명에서 분리된 130개의 젖산 균주 중에서, 11개의 균주는 동종발효성이고 L-젖산을 90% 이상으로 생산하였다. 글루코오스, 젖산 및 염화나트륨의 높은 온도, 낮은 pHs 및 높은 농도에 대한 내성을 스크리닝하기 위하여, 모든 실험을 MRS 배지에서 수행하였다. OD 수준을 세포 성장의 비율을 나타내기 위하여 600nm에서 DU800 분광 광도계(spectrophotometer)(Beckman Coulter, California, United States)를 이용하여 측정하였고, 샘플을 0.3 내지 0.5의 OD를 수득하기 위하여 희석하였다. 15 ㎖ 멸균 MRS 배지를 포함하는 50 ㎖ 팔콘 튜브(Falcon tube)에서 24 시간 동안 37℃ 및 200 rpm에서 배양한 후, 각 분리주(isolate)의 전배양(pre-culture)의 100 ㎕를 멸균 기본배지의 5 ㎖를 포함하는 분리된 15 ㎖ 팔콘 튜브 내에 접종시켰다. 젖산 및 글루코오스를 분석하기 위하여, 샘플을 젖산 칼슘의 침전물을 용해시키기 위하여 10배로 희석하였고 20 분 동안 37℃에서 8,000 rpm으로 원심분리하였다. 젖산 칼슘을 5 M H₂SO₄를 이용하여 pH 2에서 젖산을 가수분해하였고, 상기 샘플을 분석을 위하여 0.3 내지 0.5 g/ℓ (L-젖산), 0.05 내지 0.3 g/ℓ (D-젖산) 및 0.1 내지 0.5 g/ℓ (글루코오스)로 희석하였다. 높은 글루코오스 농도의 내성을 100, 150 및 200 g 글루코오스/ℓ에서 평가하였다. 세포 성장의 비율에서 염화나트륨의 영향을 50, 75, 100, 125 및 150 g/ℓ의 농도에서 평가하였고, 젖산에 대한 내성을 20, 40, 60 및 80 g/ℓ에서 평가하였다. pH 내성을 초기의 pH를 조정하기 위한 2 M 황산(sulfuric acid)을 이용하여 pH 8, 7, 6, 5, 4 및 3에서 평가하였다. 배양을 24 시간 동안 37℃ 및 200 rpm에서 배양하였다.

온도 내성을 평가하기 위하여, 37, 40, 42 및 45℃의 시험 온도를 사용하였다. 균주를 24 시간 동안 30℃ 및 200 rpm에서 첫 번째로 배양한 다음 새로운 배지로 이동시켰고, 48 시간 동안 37℃ 및 200 rpm에서 배양하였다. 37℃에서 성장한 균주를 새로운 배지로 이동시킨 다음 40℃에서 배양하였다. 상기 순차 이동을 최종 배양 온도인 45℃에 도달할 때까지 지속하였다.

그 결과, 표 2에서 보는 바와 같이 테스트한 모든 균주는 100 g/ℓ의 글루코오스 농도에서 좋은 성장을 보였고 그 중 5개 균주는 150 g/ℓ글루코오스 농도에서 잘 성장하였고, 3개 균주는 200 g/ℓ글루코오스 농도에서 잘 성장하였다. 또한, 30℃ 내지 40℃에서 성장한 11개 분리균 가운데, LA41, LA120, LA126 및 LA127는 42℃ 및 45℃에서 성장할 수 없었지만, 오로지 하나의 균주, LA104만이 45℃에서 성장할 수 있었다. 또한, 11개 균주는 20 내지 80 g/ℓ 젖산의 농도에서 잘 성장하지 않았지만, 3개 균주(LA104, LA117 및 LA128)는 60 g/ℓ 젖산의 농도까지 성장하였고, 젖산에 대한 높은 내성이 있는 3개 균주(LA104, LA117 및 LA128) 가운데, LA104 및 LA117은 125 g/ℓ 젖산의 농도까지 염화나트륨(NaCl)을 견뎠다. 또한, 테스트한 모든 분리균은 pH 4에서 성장할 수 있고, 그 중 분리균의 7개(LA104, LA114, LA116, LA117, LA126, LA127 및 LA128)는 pH 3에서 성장한 것을 확인하였다(표 2).

< 실시예 2> 젖산 생산에서 효모 추출물( yeast extract , YE ) 농도의 영향

젖산 생산에서 YE의 영향을 배지 1에서의 1, 2, 3, 5 및 7 g/ℓ의 YE 농도에서 평가하였다. 진탕 배양기(shaking incubator)(Shaking incubator SW-90RF, Sang Woo Scientific Corporation, Seoul, Korea)에서 24시간 동안 37℃ 및 200 rpm으로 배양한 후, 전배양의 5 ㎖를 배지를 제거하기 위하여 15분 동안 4℃에서 8,000 rpm으로 원심분리하였다. 펠릿(pellet)을 5 ㎖ 멸균 증류수에서 재부유시켰고, 같은 조건에서 다시 원심분리하고 5 ㎖ 멸균 증류수에서 재부유시켰다. 각 11개 분리균(LA41, LA102, LA104, LA114, LA116, LA117, LA120, LA125, LA126, LA127, LA128)의 세포 부유액의 100 ㎕ 일정부분(aliquot)을 10 ㎖ 배지를 포함하는 50 ㎖ 팔콘 튜브 내로 접종하였고 혐기성 조건 아래 72 시간 동안 37℃ 및 200 rpm에서 배양시켰다. 상기 실험을 중복하여 수행하였고 두 번 반복하였다.

그 결과, 도 1에서 보는 바와 같이 각각, 두 가지 균주, LA104 및 LA128은 3 g YE/ℓ의 제시에서 글루코오스의 대부분을 소비하였고, LA104 및 LA128의 젖산 수율은 각각, 99.6% 및 100% 임을 확인하였다(도 1).

< 실시예 3> 락토바실러스 파라카제이 LA104 에 의한 그물말( Hydrodictyon reticulum, HR )로부터 젖산의 동시 당화 및 공동발효( simultaneous saccharification and cofermentation , SSCF )

<3-1> 본 발명에 사용된 효소

Celluclast Conc BG를 385 FPU/g의 활성이 있는 고체 형태로 Novozymes(Bagsvaerd, Denmark)에서 구입하였고, 1 g의 분말을 5 ㎖ 1 M 구연산염 완충용액(citrate buffer)(pH 4.8)(64 FPU/㎖; E1)에 용해시켰다. 흑색국균(Aspergillus niger)으로부터의 셀로비아제(cellobiase)(C6105: E2)를 Sigma-Aldrich Co.에서 구입하였고, 이것의 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) 활성은 311 U/㎖이다. Novozymes A/S에서 생성된, 황국균 α-아밀라아제 펑가밀(Aspergillus oryzae α-amylase Fungamyl) 800 L(1,4-α-D-glucan glucanohydrolase, EC 3.2.1.1: E3)을 800 FAU/g의 활성이 있는 액체 형태로 Sigma-Aldrich Co.(생산 숫자(product number) A-8220)에서 구입하였다. Novozymes에서 생산된, 흑색국균(A. niger)에서의 아밀로글루코시다아제(amyloglucosidase)(A7095: E4)를 300 units/㎖의 활성이 있는 액체 형태로 Sigma-Aldrich Co.(product number A7095)에서 구입하였다. S1, S2, S3, S4, S5 및 S6은 각각, E1/E2/E3/E4의 2/2/2/2, 2/2/0/2, 2/0/0/2, 2/1/0/1, 2/0/0/0, 1/1/0/1(v/v/v)의 비율로 네 개의 효소를 포함하는 혼합물이다; 상기 수는 건조된 바이오매스 물질의 백분율(v/w)로서 효소의 양을 나타낸다.

<3-2> 젖산 생산에 대한 효소 혼합물 및 기질 농도의 영향 확인

락토바실러스 파라카제이 LA104를 이용하여 SSCF에 의한 HR로부터 L-젖산의 생산을 위한 최적의 효소 조성 및 양을 선택하기 위하여, 상기 실시예 <3-1>의 6개의 다른 효소 혼합물, S1 내지 S6을 테스트하였다. 건조된 HR 물질(80 g/ℓ)을 5 g YE/ℓ, 5 g 펩톤(peptone)/ℓ, 40 g CaCO₃/ℓ 및 배지 2에서 발견된 같은 무기염이 보충된 배지 내에 포함시켰다. 21분 동안 121℃에서 고압살균한 후, 상기 효소 혼합물 및 접종물(inoculum)(전배양 액체배지; 10%)을 첨가하였고 Vinyl Anaerobic Chamber(Coy Laboratory Products Inc., Michigan, United States)에서 각 15 ㎖ 배지를 포함하는 50 ㎖ Erlenmeyer 플라스크(flask)를 이용하여 염기성 조건 아래 37℃ 및 250 rpm에서 배양하였다. 샘플을 처리 후 24, 36 및 48 시간 두었고 효소 활성을 중지시키기 위하여 5분 동안 끓은 물 베스(bath)에 즉시 담갔다. 상기 실험을 두 번 중복하고 두 번 반복하였다. 최적의 기질 농도를 결정하기 위하여, 건조된 HR 물질의 네 가지 다른 농도(60, 80, 100 및 120 g/ℓ)를 상기 기재된 배지에 첨가하였다. S2 효소 혼합물을 상기 실험에 사용하였다. 샘플을 처리 후 24, 36 및 48 시간 두었고, 상기 실험을 두 번 중복하고 두 번 반복하였다. 배지에서 환원당(RS)의 함량을 5분 동안 100℃에서 열처리하고 20분 동안 40℃에서 10,000 rpm으로 원심분리한 후 상등액에서 2-히드록시-3,5-디나이트로벤조산(2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic acid, DSA) 방법으로 평가하였다. 글루코오스를 보정(calibration)에 사용하였다. 흡광도(absorbance)를 액체 배지의 ㎎ RS/㎖으로 변형하였다(Matrai et al., 2000). 모든 상등액을 분석 전에 Na₂CO₃으로 pH 7 및 8로 조정하였다.

그 결과, 도 2에서 보는 바와 같이 SSCF 과정에서, 가장 많은 젖산 생산 및 RS 전환 수율은 S1 및 S2를 사용하였을 때이고, S1 및 S2의 젖산 농도는 각각, 36 시간 후 36.43 및 36.42 g/ℓ, 48 시간 후 37.76 및 37.73 g/ℓ이며, RS 전환 수율은 S1는 99.38%이고 S2는 99.3%였다. 또한, S3 내지 S6과 함께 젖산 내로 RS의 전환은 S1 및 S2로 했을 경우 보다 적었으며 51.4% 내지 94.78%의 범위에 있다는 것을 확인하였다(도 2).

또한, 도 3에서 보는 바와 같이 기질 농도가 증가함에 따라, 젖산 농도는 증가하였지만(26.53 내지 49.04 g/ℓ), 상기 생산 수율은 감소하였고, 젖산 농도 및 생산 수율을 고려하면, 최적 기질 농도는 80 g/ℓ이라는 것을 확인하였다(도 3).

<3-3> 젖산 생산에서 다양한 질소원 및 무기염의 영향 확인

HR 물질에서의 젖산 생산에서 YE의 영향을 배지 2에서와 같은 무기염을 포함하는 배지에 0, 3, 및 5 g/ℓ의 농도에서 펩톤(peptone)이 보충된 3, 5, 7 및 10 g/ℓ 농도의 YE에서 테스트하였다. 초기의 물질 및 탄산 칼슘 농도는 각각, 80 및 25 g/ℓ 이다. 무기염의 영향을 어떤 다른 무기염 없이 0.05 g/ℓ MnSO₄이 있는 5 g/ℓ YE에서 평가하였다. 접종을 위한 세포 부유액을 상기 <실시예2>에 기재된 것과 같이 준비하였다. 상기 용액을 10% 수준(v/v)에서 발효 배지 내에 접종하였고, 배양을 Vinyl Anaerobic Chamber을 이용하여 혐기성 조건 아래 24 시간 동안 250 rpm에서 교반하면서 37℃에서 배양하였다. 상기 실험을 두 번 중복하고 두 번 반복하였다.

그 결과, 표 3에서 보는 바와 같이 락토바실러스 파라카제이 LA104에 의한 HR로부터의 젖산 형성은 펩톤 농도에 상관없이, 리터 당 0.2 g MgSO₄7H₂O, 1.5 g KH₂PO₄, 1.5 g K₂HPO₄, 1.5 g 초산 나트륨(sodium acetate) 및 0.05 g MnSO₄.4H₂O로 구성되어 있는 무기염을 보충하였을 때 5 g/ℓ까지 YE 증가와 함께 증가하였고, YE의 농도가 5 g/ℓ 이상으로 높아졌을 때, 젖산의 생산은 증가하지 않았다. 또한, 5 g YE/ℓ ＋ 무기염 및 5 g YE ＋ 0.05 g MnSO₄ 사이에서 HR로부터 젖산의 SSCF에서 유의적으로 다른 점은 없었다; 35.52 g/ℓ 및 36.18 g/ℓ 젖산은 각각, 80 g HR/ℓ을 포함하는 두 가지 배양에서 생산되었다. 따라서, HR로부터 젖산의 SSCF에서, MnSO₄는 세포 성장에 가장 중요한 염분이고, SSCF를 위한 최적의 질소원은 5 g/ℓ YE이라는 것을 확인하였다(표 3).

< 실시예 4> 자 발효기( jar fermentor )에서 그물말( Hydrodictyon reticulum , HR)로부터 젖산의 동시 당화 및 공동발효( simultaneous saccharification and cofermentation, SSCF )

10 g YE, 0.1 g MnSO₄ 및 50 g 탄산 칼슘(calcium carbonate)이 보충된 증류수의 1790.4 ㎖에 160 g HR 물질의 가압증기멸균된(121℃에서 21분 동안) 혼합물을 SSCF 배지에 사용하였다. 상기 SSCF 실험을 S2 효소 혼합물의 9.6 ㎖의 첨가 및 락토바실러스 파라카제이 LA104의 10% 전배양(200 ㎖)에 접종하는 것으로 시작하였다. 발효 과정을 2 ℓ의 작업량으로 5 ℓ의 자 발효기(jar fermentor)에서 수행하였다. 온도, 교반 속도 및 용해된 산소를 각각, 37℃, 600 rpm 및 0.5보다 낮은 조건으로 유지하였다. 샘플을 다양한 시간 간격으로 수집하였고, 생균수(viable cell count, c.f.u)를 MRS 한천 배지(10^-5 내지 10^-9으로 희석된)를 사용하여 희석 도말 평판 방법(dilution spread plate method)으로 확인하였다.

그 결과, 도 4에서 보는 바와 같이 젖산의 형성은 잔여(residual) RS가 더 이상 감소되지 않는 때인 36시간에 완성되었고 젖산의 37.11 g/ℓ가 생성되었으며, L-이성질체의 순도는 1.03 g/ℓ/시간의 생산성으로 98.3%이다. 젖산의 최대 수율은 46 g/100 g 건조(dry) HR 물질이다. SSCF에서, 글루코오스 및 RS의 최대 농도는 각각, 4 시간 후 13.7 및 15.1 g/ℓ이다. 발효 동안에, 상기 이성질체의 순도는 98%에서 95.7%로 서서히 감소하였다. LA104은 0.05 g/ℓ MnSO₄의 제시 하에 97.8% (HR 에서 % g 젖산/g RS)의 RS 전환과 함께, 80 g 건조된 물질/ℓ이 사용되었을 때인 36시간 후 상기 RS의 대부분을 젖산으로 전환시켰다. 최대 생산성 비율은 12 시간일 때 2.08 g/ℓ/시간이라는 것을 확인하였다(도 4).

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) LA104 균주는 식품, 의약, 화장품, 직물, 바이오플라스틱 등 매우 다양한 분야에 사용되는 L-젖산의 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

한국생명공학연구원

KCTC11883BP

20110302

Claims

수탁번호 KCTC11883BP로 기탁된 L-젖산 생산용 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) LA104 균주.
제 1항에 있어서, 상기 균주는 40 내지 45℃의 온도, 100 내지 125 g/ℓ의 염 농도, 40 내지 60 g/ℓ의 젖산 농도, 150 내지 200 g/ℓ의 글루코오스 농도, 및 pH3 내지 pH4인 pH의 스트레스 조건에 대해 내성을 갖는 것을 특징으로 하는 수탁번호 KCTC11883BP로 기탁된 L-젖산 생산용 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) LA104 균주.
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제 1항에 있어서, 상기 균주는 순도 90% 이상의 고순도로 L-젖산을 생산하는 것을 특징으로 하는 수탁번호 KCTC11883BP로 기탁된 L-젖산 생산용 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) LA104 균주.
제 1항에 있어서, 상기 균주는 막걸리에서 분리되는 것을 특징으로 하는 수탁번호 KCTC11883BP로 기탁된 L-젖산 생산용 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) LA104 균주.
수탁번호 KCTC11883BP로 기탁된 L-젖산 생산용 락토바실러스 파라카제이 LA104 균주에 글루코오스를 첨가하여 발효시키는 단계를 포함하는 락토바실러스 파라카제이 LA104 균주를 이용한 L-젖산 생산방법.
수탁번호 KCTC11883BP로 기탁된 L-젖산 생산용 락토바실러스 파라카제이 LA104 균주 및 385 FPU/g의 활성이 있는 Celluclast Conc BG 1g의 분말을 1M 구연산염 완충용액(citrate buffer, pH 4.8) 5 ㎖에 용해시킨 것이 E1, 311 U/㎖의 베타 글루코시다아제(β-glucosidase) 활성을 갖는 셀로비아제(cellobiase)가 E2, 800 FAU/g 활성이 있는 황국균 α-아밀라아제 평가밀(Aspergillus oryzae α-amylase Fungamyl) 800 L(1,4-α-D-glucan glucanohydrolase)이 E3, 및 300 units/㎖의 활성이 있는 흑색국균(A. niger)에서의 아밀로글루코시다아제(amyloglucosidase)의 액체 형태가 E4라고 하였을 때, 상기 E1, E2, E3 및 E4가 각각 2:2:2:2 및 2:2:0:2로 혼합된 S1 및 S2의 효소 혼합물 10%(v/v), 70 내지 80 g/ℓ 농도의 그물말(Hydrodictyon reticulum)과의 조류, 3 내지 5 g/ℓ 농도의 효모 추출물을 첨가하여 발효시키는 단계를 포함하는 락토바실러스 파라카제이 LA104 균주를 이용한 L-젖산 생산방법.
제 8항에 있어서, 상기 L-젖산은 동시 당화 및 공동발효에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 파라카제이 LA104균주를 이용한 L-젖산 생산방법.