KR101686900B1

KR101686900B1 - 신규한 피키아 쿠드리압즈비 ng7 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101686900B1
Application number: KR1020150088572A
Authority: KR
Inventors: 손정훈; 박현주; 이선희; 배정훈; 성봉현
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2014-06-20
Filing date: 2015-06-22
Publication date: 2016-12-16
Also published as: WO2015194921A1; CN107709540B; CN107709540A; KR20150146459A; US10443078B2; US20170349920A1

Abstract

본 발명은 내열성 및 내산성을 나타내는 신규한 피키아 쿠드리압즈비(Pichia kudriavzevii) NG7 균주, 상기 균주 및 이의 배양물을 포함하는 유기산 또는 알코올 생산용 조성물 및 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 유기산 또는 알코올 생산 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 피키아 쿠드리압즈비 NG7 균주 및 이의 용도{Novel Pichia kudriavzevii NG7 and use thereof}

유기산은 식품 분야, 의약분야, 화장품 분야 등 여러 산업 분야에서 다양하게 사용되고 있으며, 젖산이 가장 먼저 상용화된 이래(1880년), 구연산(1923년), 초산, 이타콘산, 호박산 등이 뒤를 이었다. 이들은 주로 발효나 화학합성에 의해 생산되며, 이 중 발효법에 의한 유기산의 생산은 70여 종으로, 해당경로와 구연산회로를 통해 합성된다. 상기 유기산 중 대량 생산이 되는 것은 초산, 젖산, 구연산, 주석산, 사과산 등이 있다. 특히 젖산의 경우 폴리젖산이 석유로부터 생산되는 플라스틱을 대체할 수 있는 생분해성 폴리머로서 기능이 입증되면서 단량체로 활용되는 젖산의 수요가 크게 증가하고 있다.

폴리젖산의 단량체로 사용하기 위해서는 젖산의 광학이성질체를 선택적으로 생산할 필요가 있으며, 기존의 화학합성 방법을 대신하여 미생물을 이용하는 방법이 선호되고 있다. 젖산을 생산하는 미생물인 락토바실러스는 이미 많은 종류가 알려져 있으나 이러한 미생물을 배양하여 젖산을 생산하면 두 가지 광학이성질체 젖산(D-lactate, L-lactate)이 함께 생산되는 단점이 있기 때문에 유전자 조작이 필요하고 내산성이 약한 단점이 있다.

또한, 젖산 발효 과정에서 축적되는 젖산은 배지의 pH를 산성화시켜 균주 성장을 저해하기 때문에 지금까지 사용되는 젖산 발효에서는 중화제를 배양액에 첨가하는 방법을 사용하고 있다. 가장 널리 사용되는 칼슘카포네이트는 젖산과 결합하여 칼슘염을 형성하며 발효 후에 침전물을 산용액으로 처리하여 젖산을 회수하는 과정에서 젖산과 동일 몰수의 석회가 형성된다. 이러한 방법은 정제공정을 복잡하게 하고 강산성 폐수를 발생시키고 부산물을 형성하기 때문에 젖산의 생산 단가를 높이는 요인이 된다. 이러한 문제를 극복하기 위하여 중화제 사용을 최소화할 수 있는 내산성 균주에 대한 관심이 증가하고 있다(Biotechnolbi Advances, 2013; 31:877-902). 야생형 효모는 젖산을 생산하지 못하지만 여러 가지 스트레스에 대한 내성이 박테리아에 비하여 월등히 높기 때문에 이러한 특징을 활용하여 효모에서 젖산을 생산 하고자 하는 연구가 경쟁적으로 진행되고 있다. 특히 내산성 균주의 에탄올 생산 경로를 에탄올 대신 젖산을 생산하도록 조작하여 중화제를 사용하지 않는 산성 조건에서 젖산을 생산하기 위한 연구가 여러가지 효모를 사용하여 진행되었다(Biotechnol Genet Eng Rev. 2010; 27:229-256).

이와 더불어, 녹색 연료로써 높은 잠재적 가능성을 가진 바이오 에탄올은 석유 에너지에 대한 의존도를 줄이고, 지구 온난화와 같은 심각한 환경 문제를 동시에 해결할 수 있는 대체 연료로 활용되고 있으나, 1세대 바이오 에탄올에 대한 급격한 수요 증대로 인한 옥수수, 사탕수수와 같은 농작물의 가격이 폭등하고, 이와 더불어 다른 곡물의 가격 상승을 유발하여 에너지 문제 해결을 위한 바이오 에탄올의 생산이 또 다른 식량문제를 일으키는 원인이 되고 있다.

이러한 문제점 때문에 새로운 대안으로서 이른바 2세대 바이오 연료인 셀룰로스 에탄올(cellulosic bioethanol)이 각광을 받고 있다. 셀룰로스 에탄올이란 지구상에서 가장 풍부한 유기물이자 식물 세포벽의 주요 구성 물질인 셀룰로스를 분해하여 포도당을 생산하고, 이로부터 에탄올을 제조하는 것이다. 따라서, 2세대 셀룰로스 에탄올은 현재 옥수수 녹말을 발효시켜 에탄올을 생산하는 1세대 방법과는 달리, 방치하거나 소각시켰던 옥수수의 잎, 줄기, 뿌리 등 모든 조직을 이용하여 바이오에탄올을 생산하는 방법이다. 이 방법을 이용하여 옥수수 껍질, 쌀겨, 목초, 갈채, 억새, 목제폐기물 등 모든 식물의 조직으로부터 바이오에탄올을 생산할 수 있다.

상기 2세대 바이오 연료의 원료가 되는 물질을 섬유질계 바이오매스(lignocellulosic biomass)라 하며, 이러한 섬유질계 바이오매스는 크게 셀룰로스(cellulose), 헤미셀룰로스(hemicellulose) 또는 리그닌(lignin)의 세 가지 성분으로 구성된다. 이중 헤미셀룰로스는 함량의 약 5 내지 20%의 아라비노스(arabinose)와 자일로스(xylose)를 포함하고 있다. 이처럼 헤미셀룰로스의 상당부분을 차지하고 있는 오탄당을 이용한 바이오에탄올의 생산은 현재로서는 매우 제한적으로 이루어지고 있는 실정이다.

또한, 친환경 청정 대체 에너지 중 하나인 바이오 디젤에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으나, 바이오 디젤은 글리세롤이 부산물로 생성되는 문제점이 있다. 글리세롤은 화장품, 음식제조, 석유화학 유도체의 원료로 사용될 수 있으나, 이를 당 원료로 이용할 수 있는 숙주세포가 한정적인 단점이 있었다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 내열성과 내산성이 있으면서도 다양한 당원료를 이용하여 유용 산물을 제조할 수 있는 효모 균주를 확보하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 내열성 및 내산성이 우수한 효모인 피키아 쿠드리압즈비 NG7 균주를 분리 동정하였고, 상기 균주에서 유전자 조작을 하여 유기산 및 알코올의 생산이 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 신규한 내산성 및 내열성을 가지는 피키아 쿠드리압즈비(Pichia kudriavzevii) NG7 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 유기산 또는 알코올 생산용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 유기산 또는 알코올 생산 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일구현예는 내열성 및 내산성을 나타내는 신규한 피키아 쿠드리압즈비(Pichia kudriavzevii) NG7 균주에 관한 것으로, 특히 본 발명의 균주는 기탁번호 KCTC18297P(KCTC12840BP)로 기탁된 균주일 수 있다.

본 발명에서, "피키아 쿠드리압즈비(Pichia kudriavzevii) 균주"는 자낭균에 속하는 효모의 한 종류로서, 다양한 가성균사를 형성한다. 피키아 속 효모 균주는 많은 strain이 보고되어 있으며, strain에 따라 매우 다양한 생리적 특성을 나타내는 특성이 있다. 심지어는 동일한 strain이라도 다른 연구 그룹간 상이한 결과가 보고되기도 하였다. 따라서, 본 발명에서는 요구하는 특성을 갖는 피키아 쿠드리압즈미 균주의 특정 strain을 선별하는 것이 중요한 과정이다.

본 발명의 피키아 쿠드리압즈비 NG7 균주는 포도껍질로부터 분리 동정한 균주로서, 특성분석을 통해 우수한 내열성 및 내산성을 가짐으로써 42℃와 pH 2에서도 성장이 가능한 균주임을 확인하였다. 상기 균주에 대하여 염기서열을 분석하여 비교한 결과 피키아 쿠드리압즈비와 98.7%의 상동성을 나타내었으므로 피키아 쿠드리압즈비 NG7로 명명하였으며, 이의 ITS1, 5.8S rRNA, ITS2, 28S rRNA 염기서열은 NCBI의 GeneBank에 등록번호 KM016456으로 등록하였다. 또한, 상기 균주를 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 2014년 6월 17일자로 기탁하고, 기탁번호 KCTC18297P를 부여받았다. 상기 국내특허기탁을 원균주로 하여 2015년 6월 9일자에 부다페스트 조약 하의 국제특허기탁으로 전환하여, 수탁번호 KCTC12840BP를 부여받았다.

구체적으로, 본 발명의 피키아 쿠드리압즈비 NG7 균주는 오로티딘 5인산 탈탄산효소(Orotidine 5'-phosphate decarboxylase, URA3)의 활성이 불활성화된 균주일 수 있으며, 모균주인 피키아 쿠드리압즈비 NG7 균주에서 오로티딘 5인산 탈탄산효소의 활성이 불활성화 되어 유라실 합성이 저해된 균주이면 제한없이 포함될 수 있다.

본 발명의 용어, "오로티딘 5인산 탈탄산효소(Orotidine 5'-phosphate decarboxylase, URA3)"는 pyrimidine ribonucleotides 생합성에 관여하는 효소이다. URA3 유전자가 결실된 균주는 유라실 영양요구성 균주이며, 이 균주에서는 URA3 유전자를 영양요구성 선별표지유전자로 사용이 가능하기 때문에 본 발명의 한 실시예에서는 피키아 쿠드리압즈비 NG7에 존재하는 오로티딘 5인산 탈탄산효소 유전자가 결실된 균주를 제작하였다(실시예 10). 이와 같은 균주는 간편하게 유전자 도입 또는 결손의 선별을 유라실을 이용하여 간편히 할 수 있다.

또한 구체적으로, 본 발명의 피키아 쿠드리압즈비 NG7 균주는 피루베이트 디카르복실라제(Pyruvate Decarboxylase)의 활성을 추가로 불활성화된 것일 수 있으나, 모균주인 피키아 쿠드리압즈비 NG7 균주에서 피루베이트 디카르복실라제의 활성이 불활성화되어 알코올 생성이 저해된 균주이면 제한없이 포함될 수 있다.

본 발명의 용어, "피루베이트 디카르복실라제(Pyruvate Decarboxylase, PDC1)"는 피루베이트에 작용하여 탄산과 아세트 알데히드를 생성하는 반응(CH₃COCOOH -> CH₃CHO + CO₂)를 촉매하는 효소이다. 알코올 생성과 관련해서는 알코올 발효의 한 단계에서 필수적인 효소이다. 따라서, 본 발명에서 상기 균주에 존재하는 피루베이트 디카르복실라제를 불활성화시켜 발효에 의한 알코올 생성이 저해된 균주를 제공할 수 있다.

구체적으로는, 상기 균주는 당이 포함된 배지에서 배양시 에탄올의 생성이 피루베이트 디카르복실라제가 불활성화되지 않은 균주에 비해 감소되는 것인 균주일 수 있다. 또한, 상기 피루베이트 디카르복실라제의 불활성화는 해당 효소의 유전자에 치환, 결손, 또는 부가되어 이루어지는 균주일 수 있다. 상기 피루베이트 디카르복실라제는 이에 제한되지 않으나, 서열번호 20으로 이루어진 유전자에 의해 발현될 수 있다.

일반적으로 균주 내 유전자의 불활성화는 여러 가지 형태로 제작할 수 있다. 예를 들어, 유전자 발현의 신호구조의 변형 또는 안티센스(antisense)-RNA 기술에 의해 유전자 발현을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 유전자 발현의 신호 구조는, 예를 들어 억제(repressor) 유전자, 활성화(activator) 유전자, 작동자(operator), 프로모터, 감쇠자(attenuator), 리보솜 결합 자리, 시작 코돈(codon) 그리고 종료자(terminator) 들이며, 이에 한정되지 않는다.

또한, 목적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 가닥과 이것과 상보적인 서열을 가지는 안티센스 가닥으로 구성되는 이중가닥 RNA(dsRNA)을 도입하여 목적유전자 mRNA의 분해를 유도함으로서 목적유전자의 발현을 억제하는 메커니즘인 RNA 간섭(RNA interference:RNAi) 방법을 사용할 수 있다. 또는, 단일 세포의 게놈 내에서 다른 위치로 이동할 수 있는 DNA 서열인 트랜스포존을 매개로 한 돌연변이를 일으켜 목적 유전자의 기능을 차단하여 불활성화하는 방법을 사용할 수도 있다. 유전자 단백질의 촉매 활성의 변화 또는 감소를 유도하는 돌연변이들은 당업계에 잘 알려져 있다(Qiu & Goodman, Journal of Biological Chemistry 272: 8611 8617,1997).

구체적으로는, 유전자의 불활성화는 단일 또는 복합 염기서열의 변이, 단일 또는 복합 유전자의 결손, 유전자 내에 외래 유전자의 삽입, 유전자군 전체의 결손, 유전자군의 프로모터의 억제 서열 삽입, 프로모터의 돌연변이, 유전자군의 발현 억제 조절 삽입, 유전자군의 단일 또는 복합 염기서열에 대한 RNAi 도입, 트랜스포존 매개 돌연변이 또는 이러한 변이체들의 조합 중 하나의 방법을 이용하여 수행될 수 있다.

상기에 기술한 방법들은 본 기술 분야에 통상의 사람에게 일반적으로 이해되어지며, Sambrook et al.(Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Press 2001)에서 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.

유전자의 염기 서열 중 활성 부위의 단일 또는 복합 서열을 변화하여, 유전자로부터 발현되는 단백질의 활성을 매우 낮출 수도 있고, 단일 또는 복합 유전자의 결손, 염기서열 내부에 외래 유전자인 항생제 내성 유전자나 다른 유전자를 삽입하여 완전한 단백질이 발현되지 못하게 하는 방법일 수 있다. 바람직하게는 염색체에 존재하는 유전자의 염기 서열을 모두 결손하는 방법을 사용할 수도 있다. 또는 상기 방법에 의한 변이체의 조합으로 불활성화시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 목적은 유기산 또는 알코올을 생성하는 특성을 갖는 균주를 제공하는데 있다. 이를 위해, 상기 신규한 피키아 쿠드리압즈비 NG7 균주에 2 카피 중 1 카피의 PDC1 유전자를 결실시키고, 유기산 생성과 관련되는 외인성 유전자를 도입한 균주를 이용하여 유기산과 에탄올을 동시 생산할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 1 카피의 PDC1 유전자가 결실되고 젖산 탈수소 효소(Lactate Dehydrogenase, LDH) 유전자를 도입한 균주가 젖산 및 에탄올을 생산하는 것을 확인하였다(실시예 9)

또한, 본 발명의 목적은 에탄올의 생성을 최소화하고 유기산만을 고농도 생성하는 특성을 갖는 균주를 제공하는데 있다. 이를 위해, 상기 신규한 피키아 쿠드리압즈비 NG7 균주에 2 카피 PDC1 유전자를 모두 결실시키고, 유기산 생성과 관련되는 외인성 유전자를 도입한 균주를 이용하여 유기산을 생산할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 2 카피의 PDC1 유전자가 결실되고 LDH 유전자가 도입된 균주가 에탄올은 생산하지 않으면서 젖산을 생산하는 것을 확인하였다(실시예 12)

본발명의 균주는 PDC1의 활성이 불활성화되고 추가로 젖산 탈수소 효소활성이 도입된 피키아 쿠드리압즈비 NG7 균주일 수 있으며, 구체적으로 기탁번호 KCTC18300P(KCTC12841BP) 와 KCTC18394P(KCTC12842BP)로 기탁된 균주일 수 있다. 다만 본 발명의 목적상, 외인성 유전자로 젖산 탈수소 효소 외에도 유기산을 생성하는데 관여하는 효소, 인자 등을 암호화하는 유전자를 피키아 쿠드리압즈비 NG7 균주 내에 도입할 수 있으며, 도입하는 유전자의 종류에 따라 유기산의 종류를 달리하여 생산할 수 있다.

본 발명의 용어, "외인성 유전자"는 천연형 균주에 속해 있지 않았던 핵산 서열을 일정한 목적을 위해 외부에서 도입한 경우의 해당 유전자를 뜻한다. 특히, 본 발명에서는 특정 유기산의 생성과 관련되는 유전자를 의미하며, 상기 유기산은 젖산일 수 있다.

구체적으로는, 본 발명에서는 균주의 목적이 되는 유기산은 광학이성질체인 L-형 혹은 D-형일 수 있으며, 구체적으로는 L-젖산 또는 D-젖산일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 생성하고자 하는 유기산의 광학이성질체 형태에 따라 필요한 유전자를 도입하여 생성해 낼 수 있다.

구체적으로, 유기산 중 하나인 젖산을 생성하기 위해 균주에 도입되는 외인성 유전자는 젖산 탈수소 효소(Lactate Dehydrogenase, LDH) 활성을 갖는 유전자일 수 있다.

본 발명의 용어, "젖산 탈수소 효소(Lactate Dehydrogenase)"는 일반적으로 NAD⁺를 이용하여 L-젖산 혹은 D-젖산에서 수소를 이탈시켜 피루브산으로 만드는 효소로, 이와는 역반응인 해당의 최종단계를 촉매할 때에는 NADH를 이용하여 피루브산을 환원하여 L-젖산 혹은 D-젖산을 생성하는 효소이다. 즉, 본 발명의 젖산 탈수소 효소는 L-젖산 탈수소 효소 또는 D-젖산 탈수소 효소일 수 있으며, 구체적으로는 D-젖산 탈수소 효소일 수 있다.

상기 젖산 탈수소 효소 활성을 갖는 유전자는 천연형 젖산 탈수소 효소뿐 아니라, 이와 최소한 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 의 상동성을 가지는 동일한 활성을 갖는 효소의 유전자를 포함할 수 있다. 천연형 젖산 탈수소 효소에 돌연변이를 유도한 변이 유전자 또한 젖산 탈수소 효소 활성을 갖는 이상, 서열에 무관하게 본 발명의 젖산 탈수소 효소에 포함될 수 있다.

상기 젖산 탈수소 효소는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank 등에서 확인할 수 있으며 이에 제한되지 않으나, 서열번호 19의 염기서열로 이루어진 유전자일 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 균주는 피루베이트 디카르복실라제의 활성이 내재적 활성보다 약화되고 젖산 탈수소 효소 활성이 추가로 도입된 것일 수 있다. 상기 내재적 활성 약화는 천연형 균주에 내재적으로 존재하는 2 카피의 피루베이트 디카르복실라제 유전자 중 하나를 불활성화 시키는 것일 수 있고, 더 나아가 상기 피루베이트 디카르복실라제 유전자 중 하나를 젖산 탈수소 효소로 치환하는 것일 수 있다. 본 발명의 균주는, 더욱 구체적으로, 기탁번호 KCTC18300P일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 구체적으로, 본 발명의 균주는 피루베이트 디카르복실라제의 활성이 불활성화되고 젖산 탈수소 효소 활성이 추가로 도입된 것일 수 있다. 천연형 균주에 존재하는 2 카피의 피루베이트 디카르복실라제 유전자를 모두 불활성화시킴으로써 본 발명의 균주의 피루베이트 디카르복실라제의 활성이 불활성화될 수 있고, 더 나아가 상기 피루베이트 디카르복실라제 유전자를 젖산 탈수소 효소로 치환하여 피루베이트 디카르복실라제를 불활성화 시키는 것일 수 있다. 본 발명의 균주는, 더욱 구체적으로, 기탁번호 KCTC18394P일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 피루베이트 디카르복실라제의 활성 약화는 변형되지 않은 균주에 비해, 피루베이트 디카르복실라제의 활성이 감소된 것을 의미하고, 활성이 제거된 경우도 포함한다. 상기 피루베이트 디카르복실라제 활성을 약화시키는 방법은 당해 분야에서 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하다.

그 방법의 예는, 상기 효소의 활성이 제거된 경우를 포함하여 상기 효소의 활성이 감소되도록 돌연변이된 유전자로, 염색체상의 상기 효소를 암호화하는 유전자를 대체하는 방법, 상기 효소를 암호화하는 염색체 상의 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법, 상기 효소를 암호화하는 유전자의 발현 조절 서열을 활성이 약한 서열로 교체하는 방법, 상기 효소를 암호화하는 염색체상의 유전자를 결손시키는 방법 및 상기 염색체 상의 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하여 상기 mRNA로부터 단백질로의 번역을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 도입하는 방법 등이 있으며, 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 기술된 방법은 다른 효소의 활성의 약화시에도 동일하게 적용할 수 있다. 본 발명에서는 염색체상의 피루베이트 디카르복실라제를 암호화하는 유전자를 대체하는 방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또 다른 일 구현예로서, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양물을 포함하는, 유기산 또는 알코올 생산용 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 균주는 탄소원으로 글리세롤을 이용할 수 있다.

상기 균주에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명의 용어 "배양물"은 본 발명의 피키아 쿠드리압즈비 NG7 균주가 시험관 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 상기 균주를 일정기간 배양하여 얻는, 배양된 균주, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 배지를 의미하나, 균주 배양 후 균주를 제거한 배양액도 포함한다. 상기 피키아 쿠드리압즈비 NG7 균주는 당류를 이용하는 유기산 생산능 및 알코올 생산능을 나타낼 수 있으며, 구체적으로 젖산 생산능 및 에탄올 생산능을 가지는 균주이므로, 상기 균주 또는 이의 배양물 유기산 또는 알코올을 생성하기 위한 유기산 생산용 조성물로 이용될 수 있다. 구체적으로 상기 유기산은 젖산일 수 있으며, 상기 알코올은 에탄올일 수 있다.

최근, 다당류를 에탄올로 발효하는 2세대 바이오 에탄올이 주목받고 있으며, 2세대 바이오 에탄올은 다당류를 에탄올로 발효가능한 단당류 또는 이당류 등으로 당화시키는 과정을 필요로 한다. 이러한 당화과정은 효소 또는 산을 이용하여 수행될 수 있다.

상기 효소 당화는 셀룰라아제 등의 섬유질 분해효소를 이용하여 바이오매스의 탄수화물을 단당류로 분해하는 과정으로 효소 자체가 생물학적 촉매이며 반응온도가 상대적으로 낮고 폐기물이 거의 나오지 않아 친환경적이며 낮은 에너지를 필요로 한다는 장점이 있다. 반면, 높은 효소 가격으로 인한 비용문제 및 반응시간이 길다는 단점이 있다. 또한 효소활성이 다양한 요소에 의해 제한될 수 있다는 것 또한 단점으로 지적되고 있다.

한편, 산 당화는 산과 고온을 이용한 가수분해를 통해 바이오매스의 탄수화물을 단당류로 분해하는 과정으로 주고 저렴한 황산 등을 이용한다. 따라서, 반응시간이 짧고 비용이 저렴하다는 것이 장점이나, 산을 이용하므로 중화과정이 필요하고 그 과정에서 폐기물(침전)이 생성되며, 고온의 산성조건에서 당분해산물이 생성되어 이후 발효공정을 저해하는 요소로 작용할 수 있고 분해가 더욱 진행되면 포름산, 포름알데히드 등의 원치 않는 부산물이 생성될 수 있다는 단점이 있다.

따라서, 현재로서는 효소를 이용한 당화과정이 바람직한 공정으로 인식되고 있어 널리 연구되고 있다. 이와 같은 효소를 이용한 당화과정은 반응조건은 비교적 온화하므로 하나의 반응기에서 당화와 발효공정을 동시에 수행하는 통합적 단일 생물공정을 가능하게 할 수 있다. 이러한 통합적 단일 생물공정을 수행하면 발효 가능한 단당류 등이 생성됨과 동시에 발효되어 소비되므로 당화와 발효를 별도로 수행할 때 효소 당화과정에서 생성물인 단당류 등이 축적되어 농도가 높아짐으로써 반응이 종결되는 단점을 자연스럽게 해결할 수 있고 나아가 지속적인 효소 당화과정이 진행되므로 적은 양의 효소로 높은 당화효율을 얻을 수 있으므로 비용 또한 절감할 수 있다는 장점이 있다. 그러나, 효소 당화과정의 반응조건이 온화하다고는 하지만 최적의 효소활성을 나타내기 위해서는 다소 높은 온도(약 40℃)로 반응기 내의 온도를 유지할 필요가 있다. 따라서, 이러한 통합적 단일 생물공정에 의한 2세대 바이오 에탄올의 생산을 위해서는 고온에서 안정적으로 생장가능하며 동시에 에탄올 발효능을 갖는 균주의 발굴이 필수적이다.

본 발명의 일 실시예에서는 NG7 균주의 경우, pH 2.0 조건에서도 성장이 이루어지고, 젖산 및 에탄올 생성이 이루어지는 것을 확인하여 우수한 내산성을 가짐을 확인하였으며(도 8), 온도별 성장곡선, 젖산 생산량 및 에탄올 생산량을 측정하여 고온인 42℃에서도 성장이 이루어지며, 젖산 및 에탄올의 생산이 활발히 이루어짐을 확인하였다(도 9).

이로부터, 본 발명의 신규한 피키아 쿠드리압즈비 NG7 균주는 우수한 내산성과 내열성을 나타낼 뿐 아니라, 젖산 생산량 및 에탄올 생산량 역시 우수하여 산업적으로 활용가능성이 높은 것을 확인할 수 있었다(도 11).

본 발명의 균주는 일반적으로 알려진 당류 및 글리세롤 뿐 아니라 바이오디젤 생산시 발생되는 폐글리세롤도 탄소원으로 사용하여 성장할 수 있으며, 이를 이용하여 유기산 및/또는 알코올을 생산할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서는 NG7 균주의 경우 바이오디젤 생산시 발생되는 글리세롤을 탄소원으로 이용하는 경우에도 성장이 우수한 것을 확인하였다(도 7).

본 발명에서 용어, "폐글리세롤" 이란 바이오 연료 또는 바람직하게는 바이오디젤의 생산 시 부산물로 형성되는 것을 의미하며, 생산되는 바이오디젤 100 ㎏ 당 약 10 ㎏의 폐글리세롤이 부산물로 생성된다. 상기 폐글리세롤은 글리세롤 외에 불순물로는 지방산염(비누), 퍼록사이드를 비롯한 다양한 염류(K, Na 또는 Cl) 및 메탄올 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

나아가, 본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명 균주의 젖산 탈수소 효소의 활성을 측정하였으며, 표 9에 나타난 바와 같이, 피키아 쿠드리압즈비 NG7 균주의 젖산 탈수소 효소의 활성이 다른 양성 대조군에 비해 현저히 우수한 것을 확인할 수 있었다.

또 다른 일구현예로서, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 유기산 또는 알코올 생산 방법에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명의 유기산 또는 알코올 생산 방법은, 상기의 균주 중에서 알코올류의 생산에 관여하는 2 카피의 유전자 중 1 카피의 유전자를 결실시킴으로써 알코올 생성 경로가 일부 봉쇄되고, 성장능이 유지되면서 유기산 생산능 및 알코올 생산능이 높게 유지되는 형질전환 균주를 배양하는 단계를 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 유기산 생산 방법은, 상기의 균주 중에서 알코올류의 생산에 관여하는 2 카피의 유전자를 모두 결실시킴으로써 알코올 생성 경로가 완전히 봉쇄되고, 성장능이 유지되면서 유기산 생산능이 높게 도입된 형질전환 균주를 배양하는 단계를 포함할 수 있다.

구체적으로, 상기 유기산은 젖산일 수 있으며, 상기 알코올은 에탄올일 수 있고, 알코올류의 생산에 관여하는 유전자는 피루베이트 디카르복실라제(Pyruvate Decarboxylase, PDC1) 유전자일 수 있다.

일반적으로 PDC1 유전자가 모두 결실되어 알코올생산 경로가 완전하게 봉쇄된 효모는 성장능이 매우 감소하기 때문에 유기산 생산에 적합하지 않지만 본 발명의 균주는 알코올 생산 경로를 완전히 봉쇄하여도 유기산 생산에 효과적으로 적용할 수 있음을 확인하였다(실시예 12).

본 발명에서 상기 균주의 배양은 널리 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있고, 배양 온도, 배양 시간 및 배지의 pH 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다. 적절한 배양 방법으로는 유가식 배양(fed-batch culture), 회분식 배양(batch culture) 및 연속식 배양(continuous culture) 등이 가능하며, 바람직하게는 회분식 배양이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 본 발명의 유기산 또는 알코올 제조 방법은 중화제를 첨가하지 않는 조건에서 수행되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 pH를 조절하지 않는 조건 하에서도 본 발명의 균주가 높은 LDH 활성을 보이며 젖산을 생산하는 것을 확인하였다(실시예 12 내지 13).

본 발명의 다른 실시예에서는 상기 균주를 이용하여 중화제를 최소한으로사용하는 조건 하에서 유가식 배양을 통해 젖산을 생산할 수 있는 것을 확인하였다(실시예 17).

사용되는 배양 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 충족시켜야 한다. 다양한 미생물에 대한 배양 배지는 공지되어 있다(예를 들면, "Manual of Methods for General Bacteriology" from American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)). 배지 내 탄소 공급원은 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 이용할 수 있다.

본 발명에서 상기 균주는 포도당 및/또는 글리세롤을 영양원으로 하는 배지에서 배양할 수 있으며, 저가로 대량공급이 가능한 바이오매스 유래의 다양한 당질을 영양원으로 이용하여 배양할 수 있으며, 바이오디젤 생산시 생성되는 부산물인 폐글리세롤을 영양원으로 이용할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 유기산 또는 알코올 제조 방법은 글리세롤을 포함하는 배지에서 상기 균주를 배양하는 것일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 글리세롤의 양과 포도당의 소모량 및 젖산 생산량이 비례하는 것을 확인하였다(실시예 15). 특히, 포도당만을 포함하는 경우보다, 포도당과 글리세롤을 같이 첨가하였을 때, 포도당 자체 소모량이 증가하며 젖산 생산량이 40% 가량 현저히 증가함을 확인하였다.

상기 배양 배지를 이루는 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 질소 공급원은 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄)을 이용할 수 있으며, 이들 물질 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 인 공급원으로서 인산이수소칼륨 또는, 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨 함유 염을 이용할 수 있다. 또한, 배양 배지는 성장에 필수적인 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철)을 함유할 수 있으며, 최종적으로, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장-촉진 물질을 상기 언급한 물질 외에 사용할 수 있다. 적합한 전구체를 상기 배양 배지에 추가로 가할 수 있다. 상기 공급 물질은 배양물에 한번에 모두 가하거나, 배양중 적절하게 공급할 수 있다.

본 발명의 신규한 피키아 쿠드리압즈비 NG7 균주는 우수한 내열성 및 내산성을 나타내어, 젖산 생산에 있어서 중화제를 사용하지 않는 조건 또는 중화제의 사용을 최소화하는 조건에서 효율적인 젖산의 생산이 가능하도록 하였다.

도 1은 포도껍질에서 분리된 효모들의 pH에 따른 성장곡선을 나타낸 것이다.
도 2는 복숭아껍질에서 분리된 효모들의 pH에 따른 성장곡선을 나타낸 것이다.
도 3은 팜슬러지에서 분리된 효모들의 pH에 따른 성장곡선을 나타낸 것이다.
도 4는 팜슬러지 퇴비에서 분리된 효모들의 pH에 따른 성장곡선을 나타낸 것이다.
도 5는 0, 4, 5 및 6% 젖산이 포함된 YPD 액체배지에서의 성장곡선을 나타낸 것이다.
도 6은 30, 37, 42 및 50℃에서 배양하여 온도에 따른 성장곡선을 나타낸 것이다.
도 7은 신규 효모 2-2, NG1 및 NG7 균주의 글리세롤이 포함된 배지에서의 성장 여부를 나타낸 것이다.
도 8은 신규 효모 2-2, NG1 및 NG7 균주와 효모 사카로마이세스 세레비지에(SC)와 클루베로마이세스 막시아누스(KM)의 pH에 따른 세포성장 및 에탄올 생성능을 비교한 그래프이다.
도 9는 신규 효모 2-2, NG1 및 NG7 균주와 효모 사카로마이세스 세레비지에(SC)와 클루베로마이세스 막시아누스(KM)의 온도에 따른 세포성장 및 에탄올 생성능을 비교한 그래프이다.
도 10은 NG7 균주의 PDC1 유전자 결실 및 D형 젖산 생성 효소 유전자 삽입 을 위한 모식도이며 삽입 후 PCR 반응을 통해 유전자의 결실 및 도입을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 1카피 PDC1 유전자 결실 및 LDH 유전자가 도입된 형질전환 NG7 균주(NG7/D-LDH-1 및 2)와 동일한 유전자 결실 및 LDH 유전자가 도입된 효모 사카로마이세스 세리비지에 균주(CEN.PK/D-LDH)의 성장곡선, 포도당 소비량, 젖산 생산능 및 에탄올 생산능을 비교한 그래프이다.
도 12는 NG7 균주의 URA3 유전자 1카피를 불활성화 시키기 위한 모식도이며 형질전환체의 유전자 도입을 확인하기 위한 PCR 반응 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 NG7 균주의 2 번째 URA3 유전자를 불활성화 시키기 위한 모식도이며 형질전환체의 유전자 결실을 확인하기 위한 PCR 반응 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 URA3 선별마커를 이용하여 D-LDH 유전자를 PDC1 유전자 위치에 삽입 후 각 번호에 해당하는 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 PDC1 유전자가 모두다 결실된 NG7Δpdc1/D-LDH 균주를 중화제 사용 없이 배양하여 포도당 소비량, 젖산 생산능 및 에탄올 생산능을 확인한 그래프를 나타낸 것이다.
도 16는 PDC1 유전자가 모두다 결실된 NG7Δpdc1/D-LDH 균주의 배양시 배양기 rpm이 젖산 생산에 미치는 영향을 확인한 그래프이다.
도 17는 NG7Δpdc1/D-LDH 균주의 초기 접종량을 증가시켰을 경우 배양기 rpm이 젖산 생산에 미치는 영향을 확인한 그래프이다.
도 18은 NG7Δpdc1/D-LDH 균주를 pH 중화제(CaCO₃)를 농도별(0~3%)로 첨가하여 배양하면서 젖산 생산을 확인한 그래프이다.
도 19는 NG7Δpdc1/D-LDH 균주를 pH 중화제(CaCO₃)를 3%와 5%를 사용하여 배양하면서 포도당 소모량과 젖산 생산량을 확인한 그래프이다.
도 20은 NG7Δpdc1/D-LDH 균주를 pH 조절 조건의 유가식 배양을 통해 포도당 소모량과 젖산 생산량을 확인한 그래프이다.
도 21은 NG7Δpdc1/D-LDH 균주를 중화제 최소 사용 조건에서 유가식 배양을 통해 포도당 소모량과 젖산 생산량을 확인한 그래프이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 신규 내산성 효모 탐색을 위한 효모의 분리

신규 내산성 효모의 탐색을 위하여, 다양한 샘플(대전광역시 한국생명공학연구원 내의 토양, 포도 껍질, 복숭아 껍질, 팜부산물 및 팜부산물퇴비 등)을 채취하였다. 채취한 샘플 10g을 40㎖의 멸균 증류수에 넣고, 한 시간 동안 보텍스(vortex)를 이용하여 섞어주었다. 이 후 상등액을 단계적으로 희석하고 박테리아의 성장을 저해하기 위하여 항생제를 포함하는 효모용 고체배지 YMPS(0.3% 효모 추출물, 0.3% 맥아 추출물, 0.5% 펩톤, 1% 포도당, 50㎎/L 페니실린 및 50㎎/L 스트렙토마이신)에 도말하여 30℃에서 48시간 동안 배양 한 뒤, 곰팡이 포자 형태가 아닌 효모 형태의 콜로니를 생성하는 균주를 확보하였다.

분리된 균주들의 종 분석을 위하여, 각각의 균주들을 3㎖ YMPS 액체배지에서 30℃, 180rpm으로 48시간 동안 진탕 배양 한 후에, 원심분리하여 세포만을 회수한 후, DNA 추출 미니 키트(i-genomic BYF DNA Extaction Mini Kit, iNtRON Biotechnology Inc., Sungnam, Korea)를 사용하여 게놈성 DNA(genomic DNA)를 추출하였다. 상기 추출된 DNA에서 진핵세포 미생물의 진화 계통연구에 가장 유용한 분자 마커로 이용되고 있는 ITS1, 5.8S rRNA, ITS2, 28S rRNA 염기서열을 분석하기 위하여 논문에서 밝혀진 프라이머인 ITS1 (서열번호 1)과 LR3R (서열번호 2)을 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 통해 유전자 증폭하였다. 또한 박테리아의 여부를 알아보기 위하여 박테리아의 16S rRNA gene을 분석하기 위한 프라이머로 27F(서열번호 3) 와 1492R(서열번호 4)을 사용하였다. 위의 염기서열을 증폭하기 위한 반응조성은 주형 DNA 1㎕, 10pmol ITS1 1.5㎕, 10pmol LR3R 1.5㎕, EX taq buffer (Takara) 5㎕, 2.5 mM dNTP 4㎕, 증류수 36.5㎕, EX taq DNA polymerase (Takara) 0.5㎕ 이며, PCR 조건은 95℃ 5분 반응 후, 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분 30초로 30 사이클 반응하고, 72℃에서 10분간 추가 반응하는 반응 조건을 사용하였다.

상기 PCR 반응 후 얻어진 반응액을 PCR 정제 키트(solgent PCT purification kit, 솔젠트사, 한국)를 사용하여 PCR 산물을 정제한 후 제노텍사에 의뢰하여 염기 서열을 분석하였다. 분석한 염기 서열은 균주 동정을 위하여 National Center for Biotechnology Information (NCBI)에서 제공하는 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 프로그램을 이용하여 염기 서열을 비교하였다.

그 결과, 다양한 효모 균주들이 분리되었으며, 많은 종들이 에탄올 발효를 하는 종임을 알 수 있었다(표 1). 또한, 표 1에서 G-1, G-2, G-3, 1-2, 2-2등은 와인 공정이나 치즈 발효 등에서 많이 활용하는 효모임을 알 수 있었다. 이들의 ribosomal DNA 염기 서열의 상동성은 매우 유사한 종부터 동떨어진 종까지 다양하게 분리된 것을 확인할 수 있었다.

분리된 미생물 콜로니를 YMPS 고체 배지에 다시 접종하여 순수 분리 및 배양을 하였으며, 그 결과, 포도 껍질에서 10종, 복숭아 껍질에서 9종, 팜부산물에서 6 종, 팜부산물 퇴비에서 12종의 효모 균주들을 분리하였다.

실시예 2. 분리된 균주들의 내산성 분석

상기 실시예 1에서 분리한 균주들 중 내산성 균주를 선별하기 위하여 pH 2.0, 3.0 및 6.0으로 맞춘 YPD(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 포도당) 액체 배지에 30℃, 180rpm에서 48시간 배양하여 성장 곡선을 분석하였다(도 1~4). 그 결과 pH 3.0과 pH 6.0에서는 모든 효모 균주의 성장은 비슷하였고, pH 2.0에서는 균주에 따른 차이를 확인할 수 있었다. 포도 껍질과 복숭아 껍질에서 분리된 효모 균주들은 대부분 pH 2.0 조건에서도 빠른 성장 능력이 있었으며 팜부산물과 팜부산물 퇴비에서 분리된 균주들의 경우 일부 균주만이 pH 2.0 조건에서 성장이 가능함을 알 수 있었다.

실시예 3. 젖산에 대한 저항성 균주 선별

상기 실시예 2에서 pH 내성(내산성)이 우수한 것으로 판단된 8종의 균주를 선별하여, 젖산에 대한 저항성을 확인하였다.

0, 4, 5 및 6% 젖산이 포함된 YPD(1% 효모 추출물, 2% 펩톤 및 2% 포도당) 액체 배지에 분리된 균주를 접종하여 30℃, 180rpm에서 48시간 동안 진탕 배양하여 시간에 따른 성장 곡선을 분석하였다.

그 결과 모든 균주가 6%의 젖산이 첨가된 배지에서도 성장을 하였고, 그 중에서도 2-2, NG1 및 NG7 균주가 다른 균주 보다 6% 젖산에 대한 저항성이 높은 것을 확인하였다(도 5). 3종의 균주 중 2-2 균주 및 NG7 균주는 ribosomal RNA 염기 서열 분석 결과에 의하면 피키아 쿠드리압즈비 균주로 분류되었으나, 상동성 면에서, 2-2 균주는 알려진 피키아 쿠드리압즈비 균주의 서열과 거의 동일한 99.8%의 상동성을 나타내었으며, NG-7 균주는 상대적으로 조금 더 낮은 상동성(98.7%)을 나타내었다.

실시예 4. 선별된 내산성 균주 중 내열성 균주의 선별

상기 실시예 3에서 젖산에 대한 저항성이 높은 균주로 선별된 2-2, NG1 및 NG7 균주의 내열성을 비교하였다.

YPD(1% 효모 추출물, 2% 펩톤 및 2% 포도당) 액체 배지에 상기 선별된 균주를 접종하고 30, 37, 42 및 50℃에서 48시간 진탕 배양하여 성장 곡선을 분석하였다. 대조군으로 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 균주와 고온에 대한 내열성 균주인 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces maxianus) 균주를 사용하였다.

그 결과 상기 분리된 3종의 균주가 30℃에서 최적 성장을 나타내었으며, 42℃에서 2-2 균주는 클루이베로마이세스 막시아누스 균주와 비슷한 성장을 보였고, 특히 NG7 균주의 경우 50℃ 에서도 성장을 나타내어, 동일한 피키아 쿠드리압즈비 균주로 분류된 2-2 균주나 고온에 대한 내열성 균주로 알려진 클루이베로마이세스 막시아누스 균주보다 온도에 대한 저항성이 높음을 확인하였다(도 6).

실시예 5. 분리된 균주들의 항생제에 대한 저항성 확인

분리된 3종의 균주를 대상으로 여러 항생제에 대한 저항성을 확인하였다. 항생제로 Zeocin(100㎍/㎖), G418(100㎍/㎖), Cycloheximide(1㎍/㎖), Aureobasidin A(0.1㎍/㎖), Nourseothricin(100㎍/㎖) 및 Hygromycin(100㎍/㎖)을 사용하였고, 각 항생제가 포함된 YPD (1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 포도당, 2% 아가(agar)) 고체 배지에 분리된 균주의 세포 배양액을 점묘(dotting)한 후 30℃에서 배양하였다. 그 결과 모든 균주가 Zeocin, G418, Cycloheximide에 대한 저항성을 가지며, Aureobasidin A, Nourseothricin과 Hygromycin에 대한 저항성이 없는 것을 확인하였다(표 2).

실시예 6. 선별된 균주들의 당 이용능 분석

선별된 2-2, NG1 및 NG7 균주의 당 이용능을 확인하기 위하여 API 키트 분석(최소 배지에 현탁한 시험균을 탄수화물이 유일한 탄소원으로 들어있는 키트의 cupules에 접종 배양한 후 시험균이 이들 당을 이용할 수 있는지 여부를 탁도 변화로써 판정하는 방법)을 수행하였다.

그 결과 세 균주 모두 이용할 수 있는 당은 포도당과 N-아세틸-D-글루코사민(N-acetyl-D-glucosamine)이며, NG7의 경우 다른 균주와 다르게 글리세롤(glycerol)도 이용 가능한 것을 확인하였다(표 3).

글리세롤의 이용 가능성을 액체 배지에서 확인하기 위해서 YPG(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 글리세롤) 액체 배지에 세 균주를 접종하여 30℃, 180rpm에서 48시간 동안 진탕 배양하였다. 대조군으로 YPD(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 포도당) 액체 배지에서의 성장을 비교하였다.

그 결과 YPD 액체 배지에서는 세 균주 모두 비슷한 성장을 나타내었고, 글리세롤이 포함된 YPG 액체 배지에서는 세 균주 모두 성장은 하지만, 다른 두 균주에 비해 NG7 균주의 성장이 우수하였으며, YPD 액체 배지에 비해서도 성장이 우수한 것을 확인하였다(도 7).

글리세롤은 바이오디젤 생산시 다량 발생되며 저렴하게 공급 가능한 탄소원이기 때문에, 글리세롤을 탄소원으로 잘 이용할 수 있는 NG7 균주는 산업균주로서 이용 가능성이 클 것으로 판단된다.

실시예 7. 선별된 균주들의 에탄올 생성능 확인

상기 실시예 6에서 선별된 3종의 균주인 2-2, NG1 및 NG7 균주의 에탄올 생성능을 확인하였다. 에탄올 발효 배지 (5% 포도당, 5g/L 펩톤, 5g/L 효모 추출물, 5g/L 인산칼륨(Potassium phosphate), 2g/L 황산암모늄(Ammonium sulfate), 0.4g/L 황산마그네슘(Magnesium sulfate))에서 배양된 균주를 5% 접종하여 pH 2.0 및 pH 6.0, 37℃ 및 42℃ 네 가지 조건에서 100rpm으로 48시간 진탕 배양하였다. 대조군으로 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 균주와 내열성 균주인 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces maxianus) 균주를 사용하였다.

그 결과 pH 2.0에서는 대조군으로 사용한 균주의 성장은 나타나지 않았으나, 2-2, NG1 및 NG7 균주는 모두 성장하였고, 약 25g/L의 에탄올이 생성되었다. 이 때 발효 속도는 NG7 균주가 가장 빠름을 확인하였다. 또한, pH 6.0에서는 NG7의 경우 9시간 대에 약 25g/L의 에탄올을 생성하였으며, 2-2, NG1 및 사카로미세스 세레비지에 균주는 12시간 대, 클루이베로마이세스 막시아누스 균주는 36시간만에 약 25g/L의 에탄올을 생성하는 것을 확인하였다(도 8). 특히, 2-2, NG1 및 NG7 균주는 pH 2.0 에서도 pH 6.0 에서와 차이 없이 성장 및 에탄올 발효가 이 이루어져, 우수한 내산성을 가짐을 알 수 있었다.

또한, 37℃에서는 2-2와 NG7 균주가 가장 잘 성장하였으며, 에탄올도 8시간 만에 약 25g/L 생성하였다. 42℃에서는 클루이베로마이세스 막시아누스 균주보다 2-2 및 NG7 균주의 성장이 더 우수하였으며, 8시간 만에 약 25g/L의 에탄올을 생성하는 것을 확인하였다. 반면, 클루이베로마이세스 막시아누스 균주는 15시간에 약 22g/L의 에탄올을 생성하였으며, 사카로마이세스 세레비지에 및 NG1 균주는 10g/L 미만의 에탄올을 생성하는 것을 확인하였다(도 9). 또한, 2-2와 NG7 균주의 경우, 42℃에서 다른 균주에 비해 현저히 우수한 성장곡선을 나타내었는바, 우수한 내열성을 가짐을 알 수 있었다(도 9).

상기 결과로부터 고온의 산성조건 하에서도 NG7 균주가 에탄올 발효능이 뛰어남을 확인할 수 있었으며, 이로부터 NG7 균주가 우수한 내열성 및 내산성을 가지는 것을 알 수 있었다.

이와 같은 NG7 균주를 신규한 유기산 또는 알코올 생산을 위한 내산성 균주로 선정하였으며 선별된 균주를 한국생명공학연구원의 생물자원센터(KCTC)에 2014년 6월 17일에 기탁하여, 기탁번호 KCTC18297P를 부여받았다. 상기 국내특허기탁을 원균주로 하여 2015년 6월 9일, 부다페스트 조약하의 국제특허기탁으로 전환하여 수탁번호 KCTC12940BP를 부여받았다.

실시예 8. PDC1 유전자 결실 및 LDH 유전자 도입

NG7 균주의 에탄올 생합성 경로를 봉쇄하고 피루베이트를 젖산으로 전환시키기 위하여 피루베이트 디카르복실라제(PDC1) 유전자를 D-젖산 생성 효소인 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 유래의 D형 젖산 탈수소 효소(D-lactate dehydrogenase,D-LDH) 유전자(서열번호 19)로 교체하였다. NG7 유전체 DNA(genomic DNA)로부터 PDC1 ORF의 업스트림 500bp, 다운스트림 500bp 및 GAPDH 프로모터를 PCR을 통해 증폭하였고, NAT 유전자는 합성하여 증폭하였다. D-LDH 유전자는 락토바실러스 플란타룸 유래의 genomic DNA를 주형으로하여 PCR을 통해 증폭하였다. 상기 PCR 반응시 사용한 프라이머는 하기 표 4에 정리하였다.

증폭된 각 유전자를 overlap extention PCR을 통해 연결하였고, PCR 산물을 전기천공법(electroporation)을 이용하여 NG7 균주에 도입하여, 형질전환시켰다. 형질전환 된 균주를 100㎍/㎖ Nourseothricin(NTC)이 함유된 YPD 고체배지에 도말하여 형질전환체를 선별하였다. 형질전환 여부를 프라이머 13 (서열번호 17)과 프라이머 4 (서열번호 8)의 프라이머 쌍, 프라이머 7 (서열번호 11)과 프라이머 14 (서열번호 18)의 프라이머 쌍, 프라이머 13과 프라이머 8 (서열번호 12)의 프라이머 쌍, 프라이머 9 (서열번호 13)과 프라이머 14의 프라이머 쌍 및 프라이머 1 (서열번호 5)와 프라이머 12 (서열번호 16)의 프라이머 쌍의 조합으로 PCR을 통해 확인한 결과 예상되는 위치에서 밴드를 확인하였다. NG7 균주는 이배체(diploid) 이기 때문에 PDC1 유전자는 2 카피가 존재하고 있으며 그 중, 1 카피의 PDC1 유전자 위치에 NTC 유전자와 D-LDH 유전자가 함께 도입된 형질전환체 2개를 확보하였다(도 10).

상기와 같은 방법으로 PDC1 유전자 1 카피에 LDH 유전자(서열번호 19)를 도입하여 제조한 균주인 NG7/D-LDH를 한국생명공학연구원의 생물자원센터(KCTC)에 2014년 6월 17일 기탁하여, 기탁번호 KCTC18300P를 부여받았고, 이를 2015년 6월 9일 부다페스트 조약하의 국제기탁으로 전환청구하여, 기탁번호 KCTC12841BP를 부여받았다.

실시예 9. PDC1 유전자 결실 및 LDH 유전자 도입된 형질전환 균주의 젖산 생산 확인

1 카피 PDC1 유전자가 결실되고 D-LDH를 발현하는 NG7 균주(NG7/D-LDH)의 LDH의 활성을 확인하기 위하여 0.1㎖의 효소 용액을 2.7㎖의 기질용액(sodium pyruvate)과 0.1㎖의 NADH와 반응하여 340nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성 대조군으로 야생형 NG7 균주를 사용하였으며, 양성 대조군으로 D-LDH를 발현하는 재조합 균주인 사카로마이세스 세레비지에 CEN.PK/D-LDH 균주를 사용하였다.

그 결과 두 형질전환 균주, NG7/D-LDH-1 및 NG7/D-LDH-2 모두 LDH 활성이 있는 것을 확인하였다(표 5).

LDH 활성이 있는 것을 확인한 형질전환 균주 2개를 이용해서 젖산(lactic acid) 생산능을 확인하였다. YPD(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 포도당) 액체배지에서 30℃, 180rpm 조건으로 배양하여 세포를 회수한 후, O.D 10 이 되도록 10% 포도당이 포함된 YPD 액체배지에 접종하여 30℃, 80rpm 으로 84시간 동안 배양하였다. 두 형질전환 균주의 경우, 양성 대조군에 비하여 시간이 흐를수록 성장이 지속적으로 유지됨을 나타내었으며, 포도당 소비량 역시 더 많이 나타나는 것을 알 수 있었다.

또한, HPLC를 통하여 두 균주의 젖산 생산량을 확인한 결과 각각 36.2 g/L, 31.3 g/L의 젖산이 생산되었을 뿐 아니라, 32.6 g/L 및 34.2 g/L 의 에탄올도 생산되는 것을 확인하였다(표 6 및 도 11). 본 발명에서 제작된 균주는 1 카피의 PDC1 유전자가 남아있기 때문에 젖산과 유사한 양의 에탄올이 생성되고 있음에도 불구하고 pH를 조절하지 않는 조건에서 상당히 많은 양의 젖산이 생성됨을 확인하였다.

실시예 10. 유라실 ( Uracil ) 영양요구성 균주 (NG7/ Δura3 ) 제작

URA3 유전자는 선별표지 유전자이면서 동시에 5-Fluoroorotic acid(FOA)배지에서는 음성선택(negative selection)이 가능한 유전자이기 때문에 반복적으로 사용할 수 있는 장점이 있다. 이러한 특징을 활용하기 위하여 먼저 유라실(uracil) 영양요구성 NG7 균주를 제작하였다.

NG7 균주는 이배체(diploid)이기 때문에 2 copy의 URA3 유전자를 각각 불활성화 시켰다. NG7 균주는 Nourseothricin(NTC)에 대한 저항성이 없는 것을 확인하여, Nourseothricin acetyl transferase(NAT) 유전자를 선별표지로 사용하는 disruption 카세트를 제작하여 URA3 유전자의 불활성화를 시도하였다. NG7 유전체 DNA (genomic DNA)로부터 URA3 ORF의 업스트림(upstream) 500bp, 다운스트림(downstram) 500bp 및 GAPDH 프로모터를 PCR을 통해 증폭하였고, NAT 유전자는 합성하여 증폭하였다. 증폭된 각 유전자를 overlap extention PCR을 통해 연결하였고 PCR 산물을 전기천공법(electroporation)을 이용하여 NG7에 도입하여 1차 형질전환 하였다. 상기 PCR 반응시 사용한 프라이머는 하기 표 7 에 정리하였다.

상기 형질전환된 균주를 100㎍/㎖ NTC가 함유된 YPD 고체배지에 도말하여 형질전환체를 선별하였다. 형질전환 여부를 확인하기 위하여 프라이머r 15(서열번호 21)과 20(서열번호 26)를 이용하여 PCR을 통해 확인한 결과 NTC 카세트가 URA3 locus에 도입된 것을 확인할 수 있었으며, 아직 1 카피의 URA3 유전자가 남아있는 것을 확인하였다(도 12).

남아있는 URA3 유전자를 불활성화 시키기 위하여 동일한 disruption 카세트를 이용하여 1 카피 URA3 유전자가 불활성화된 NG7 균주를 형질전환하였다.

상기 형질전환된 균주는 5-FOA가 포함된 고체배지 (6.7 g/L Yeast nitrogen base without amino acid, 2% 포도당, 2% 아가(agar), 100ug/ml Uracil, 500ug/ml FOA)에 도말하여 형질전환체를 선별하였다. 형질전환 여부를 확인하기 위하여 프라이머 15와 20를 이용하여 PCR을 통해 확인한 결과 NTC 카세트가 URA3 locus에 제대로 삽입되었고, 더 이상 URA3 유전자가 존재하지 않음을 확인하였다(도 13).

실시예 11. 유라실 영양요구성 선별표지를 이용한 PDC1 유전자 2카피 결실 및 LDH 유전자 도입

상기 실시예 9에서 확인한 바와 같이 한 카피 PDC1 유전자만 결실된 균주에 LDH 유전자를 발현한 경우 젖산과 동일한 양의 에탄올이 생성되었기 때문에 젖산의 생산성을 증가시키기 위해서 두 카피 PDC1 유전자를 모두 결실시켜 에탄올 생산 경로가 완전히 봉쇄되고 젖산만을 생산하는 균주를 제작하고자 하였다.

NG7 균주의 에탄올 생합성 경로를 봉쇄하고 피루베이트를 젖산으로 전환시키기 위하여 PDC1 유전자를 D-젖산 생성 효소인 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 유래의 D형 젖산 탈수소 효소(D-lactate dehydrogenase,D-LDH) 유전자(서열번호 19)로 교체하였다.

NG7 유전체 DNA(genomic DNA)로부터 PDC1 ORF의 업스트림 500bp, 다운스트림 500bp, PDC1 터미네이터 300bp, URA 프로모터-URA ORF-URA 터미네이터 1.5kb를 PCR을 통해 증폭하였고, D-LDH 유전자는 락토바실러스 플란타룸 유래의 게놈성 DNA를 주형으로하여 PCR을 통해 증폭하였다. 상기 PCR 반응시 사용한 프라이머는 하기 표 8 에 정리하였다.

증폭된 각 유전자를 overlap extention PCR을 통해 연결하였고, PCR 산물을 전기천공법(electroporation)을 이용하여 NG7/Δura3 균주에 도입하여, 형질전환시켰다. 형질전환 된 균주를 UD 고체배지(6.7 g/L Yeast nitrogen base without amino acid, 2% 포도당, 2% 아가(agar), 5 g/L casamino acid)에 도말하여 형질전환체를 선별하였다. 형질전환 여부를 프라이머 13 (서열번호 17)과 프라이머 4 (서열번호 8)의 프라이머 쌍, 프라이머 22 (서열번호 28)과 프라이머 23 (서열번호 29)의 프라이머 쌍, 프라이머 1 (서열번호 5)와 프라이머 23 (서열번호 29)의 프라이머 쌍, 프라이머 13과 프라이머 12 (서열번호 16)의 프라이머 쌍 및 프라이머 25 (서열번호 31)와 프라이머 26 (서열번호 32)의 프라이머쌍의 조합으로 PCR을 통해 확인한 결과 예상되는 위치에서 밴드를 확인함으로써 LpLDH 유전자가 2 카피의 PDC1 유전자 위치에 각각 삽입된 형질전환체를 확보하였다 (도 14). 상기와 같은 방법으로 PDC1 유전자 2 카피에 LDH 유전자(서열번호 19)가 각각 도입된 균주(NG7Δpdc1/D-LpLDH)를 한국생명공학연구원의 생물자원센터(KCTC)에 2015년 6월 2일 기탁하여, 기탁번호 KCTC18394P 를 부여받았다. 상기 국내특허기탁을 원균주로 하여 2015년 6월 9일자에 부다페스트 조약 하의 국제특허기탁으로 전환하여, 수탁번호 KCTC12842BP를 부여받았다.

실시예 12. pH 비조절 젖산 생산 확인

2 카피의 PDC 유전자가 결실되고 D-LDH를 발현하는 NG7 균주의 LDH의 활성을 확인하기 위하여 0.1㎖의 효소 용액을 2.7㎖의 기질용액(sodium pyruvate)과 0.1㎖의 NADH와 반응하여 340nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성 대조군으로 야생형 NG7 균주를 사용하였으며, 양성 대조군으로 D-LDH를 발현하는 재조합 균주인 사카로마이세스 세레비지에 CEN.PK/D-LDH 균주를 사용하였다.

그 결과, NG7Δpdc1/D-LpLDH 형질전환 균주에서 높은 LDH 활성을 확인하였다(표 9).

LDH 활성이 있는 것을 확인한 형질전환 균주 (NG7Δpdc1/D-LpLDH)를 이용해서 젖산(lactic acid) 생산능을 확인하였다. YPD(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 포도당) 액체 배지에서 30℃, 180 rpm 조건으로 배양하여 세포를 회수한 후, OD₆₀₀=10 이 되도록 10% 포도당이 포함된 YPD 액체 배지에 접종하여 30℃, 80 rpm 으로 96시간 동안 pH를 조절하지 않는 조건에서 배양하였다.

HPLC를 통하여 NG7Δpdc1/D-LpLDH 균주의 젖산 생산량을 확인한 결과 21.2 g/L의 젖산이 생산되었고, 36.5 g/L의 포도당을 소모하였으며, 에탄올은 생산되지 않음을 확인하였다 (표 10 및 도 15).

실시예 13. pH 비조절 및 다양한 배양조건에 따른 젖산 생산 확인

NG7Δpdc1/D-LpLDH 균주의 최적 젖산 생산 조건을 확립하기 위하여 다양한 RPM 조건과 접종 세포의 농도에 따라 확인하였다. RPM은 80, 120, 160, 180 조건에서 실험하였고, 접종 세포의 농도는 OD₆₀₀=5, 또는 10의 조건에서 실험하였다. 또한 모든 실험은 pH를 따로 조절하지 않는 조건에서 배양하였다.

먼저 접종 세포의 농도를 OD₆₀₀=5 로 맞추어 다양한 RPM에서 배양하였을 때 균주의 젖산 생산량을 확인한 결과 80rpm 에서는 17.16 g/L, 120rpm 에서는 16.99 g/L, 160rpm 에서는 20.11 g/L, 180rpm 에서는 20.06 g/L의 젖산이 생산되는 것을 확인하였다 (표 11, 도 16).

또한, 접종 세포의 농도를 OD₆₀₀=10으로 맞추어 다양한 RPM에서 배양하였을 때 균주의 젖산 생산량을 확인한 결과, 80rpm 에서는 16.14 g/L, 120rpm 에서는 18.36 g/L, 160rpm 에서는 20.01 g/L, 180rpm 에서는 19.89 g/L의 젖산이 생산되었다 (표 12, 도 17).

여러 조건에서의 결과를 종합해 보았을 때 NG7Δpdc1/D-LpLDH 균주는 접종농도나 rpm이 젖산 생산성 대한 영향이 적었지만 접종 세포의 농도를 OD₆₀₀=5로 맞추고, 160rpm에서 배양하였을 때 가장 많은 양의 젖산이 생산됨을 확인하였다.

실시예 14. pH 조절에 따른 젖산 생산 확인

배지 pH 조절이 NG7Δpdc1/D-LpLDH 균주의 젖산 생산능에 미치는 영향을 확인하기 위하여 칼슘 카보네이트(calcium carbonate)를 첨가하여 젖산 생산성을 확인하였다. 10% 포도당이 포함된 YPD 액체 배지에 칼슘 카보네이트를 1%, 2%, 3% 되도록 첨가하여 30℃, 160rpm 으로 100시간 동안 배양하였다.

그 결과, 칼슘 카보네이트를 첨가하지 않은 경우 23.83 g/L의 젖산이 생산되고, 36.89 g/L의 포도당이 소모되었다. 1%의 칼슘 카보네이트를 첨가한 경우 40.96 g/L의 젖산이 생산되고, 59.69 g/L의 포도당이 소모되었다. 2%의 칼슘 카보네이트를 첨가한 경우 57.22 g/L의 젖산이 생산되고, 85.21 g/L의 포도당이 소모되었다. 마지막으로 3%의 칼슘 카보네이트를 첨가한 경우 73.09 g/L의 젖산이 생산되고, 100 g/L의 포도당이 소모되었다 (표 13, 도 18).

추가적으로 포도당이 15% 첨가된 YPD 액체 배지에 칼슘 카보네이트를 3%, 5% 되도록 첨가하여 30℃, 160rpm 으로 100시간 동안 배양하였다. 3%의 칼슘 카보네이트를 첨가한 경우 79 g/L의 젖산이 생산되고, 85 g/L의 포도당이 소모되었다. 5%의 칼슘 카보네이트를 첨가한 경우 112 g/L의 젖산이 생산되고, 140 g/L의 포도당이 소모되었다(표 14, 도 19).

상기 실험을 통해, 칼슘 카보네이트 농도별로 첨가된 배양에서 농도가 높을수록 젖산 생산농도도 높아지는 것을 확인하였고 발효 pH의 적절한 조절을 통해 젖산 생산성을 극대화 할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 15. 글리세롤 활용 젖산 생산성 증대

NG7 균주는 다른 효모 균주와 달리 글리세롤 이용능이 매우 우수하기 때문에 글리세롤이 포함된 배지에서 젖산의 생산성을 확인하였다. NG7Δpdc1/D-LpLDH 균주를 다양한 농도의 글리세롤을 포함하는 배지에서 젖산 생산성을 비교하였다. 포도당은 5%로 조정한 YPD(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 5% 포도당) 액체 배지에 글리세롤을 0~10%가 되도록 첨가한 배지에 OD₆₀₀=5가 되도록 동일양의 균체를 접종한 후 30℃, 160rpm으로 48시간 동안 pH를 조절하지 않는 조건에서 배양하였다.

포도당과 함께 글리세롤을 첨가했을 경우 글리세롤이 탄소원으로 사용되는 양은 매우 적었지만 첨가한 글리세롤의 양과 비례하게 포도당의 소모량이 증가함에 따라 젖산의 생산량이 증가하였으며 5% 이상의 글리세롤을 첨가하였을 경우 젖산 생산량이 40%이상 증가하였다. 이러한 효과는 글리세롤이 산성 조건에서 균주의 안정성에 도움을 주거나 글리세롤의 대사가 젖산 생산에 유리하게 작용하기 때문으로 사료된다. 따라서 젖산 생산에 있어서 글리세롤을 활용하여 젖산의 생산성을 증가시킬 수 있는 능력은 젖산 생산 균주로서의 다양한 장점을 제공할 수 있다.

실시예 16. 유가식 배양을 통한 NG7Δpdc1 /D- LpLDH 균주의 젖산 생산

유가식 발효를 통해 NG7Δpdc1/D-LpLDH 균주의 젖산 생산성을 확인해 보고자 하였다. NG7Δpdc1/D-LpLDH 균주를 YPD10(3% 효모추출물, 1.5% 펩톤, 10% 포도당)에 접종하여 배양 온도는 30℃, 임펠러 회전수 500rpm의 호기성 배양조건으로 12 시간 배양한 후 다시 10%의 포도당을 공급하고 60시간 경과 후 포도당을 5% 더 공급하는 2단계 유가식 배양으로 발효를 진행하였다. 발효 전구간에 걸쳐서 NaOH를 이용하여 배양액의 pH는 6.0으로 유지하였다.

그 결과, 배양 120시간까지 젖산 생산 농도가 증가하여 약 200g/L 포도당을 소모하여 116g/L(0.57g/g)의 젖산을 생산하였다(도 20).

실시예 17. 중화제 최소 사용 조건에서 유가식 배양을 통한 젖산 생산 확인

유가식 발효시 중화제 사용을 최소화하는 산성 발효 조건에서 NG7Δpdc1/D-LpLDH 균주의 젖산 생산성을 확인해 보고자 하였다. NG7Δpdc1/D-LpLDH 균주를 글리세롤은 포함하는 YPD10(3% 효모추출물, 1.5% 펩톤, 10% 글루코스, 2% 글리세롤)에 접종하여 배양 온도는 30℃, 임펠러 회전수는 700rpm으로 조절하여 세포 성장 단계를 18 시간 거친 후, 임펠러 회전수를 400rpm으로 조절하여 혐기 조건으로 전환 하여 5시간 배양한 후 10%의 글루코스를 공급하고 발효 배지의 pH를 NaOH를 이용하여 pH 5.5으로 유지하였다. 발효 진행 중 생산되는 젖산에 의하여 자연적으로 pH가 감소하여 산성 발효가 진행될 수 있도록 35시간 이후에 더 이상 pH를 조절하지 않았다.

그 결과, pH를 조절하는 단계에서는 5g/L/hr의 높은 생산성으로 젖산이 생산되었으며 pH를 조절하지 않게 되면서 생산성은 감소하여 최종적으로 118g/L의 젖산이 생산되었다. 혐기조건에서는 균주는 성장하지 않으면서 젖산 생산은 20시간 이상 지속되었고 최종 발효 배지의 pH는 4.6이었다.

따라서 본 발명에서 제공하는 균주는 발효 중 중화제의 사용량을 조절함으로써 젖산 생산량을 극대화(118 g/L)하고 최종 발효액의 pH를 산성화하여 후단공정 비용을 줄이고 폐기물인 gypsum의 생산을 최소화할 수 있음을 확인하였다(도 21).

상기와 같은 결과들은 본원 발명에서 새롭게 분리 동정한 내산성 및 내열성을 갖는 피키아 쿠드리압즈비 NG7 균주가 다양한 당원료를 활용해 유용한 물질인 다양한 유기산 및/또는 알코올을 제조하는 생산 균주로 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국생명공학연구원

KCTC18297P

20140617

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KCTC18300P

20140617

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KCTC18394P

20150602

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KCTC12840BP

20150609

한국생명공학연구원

KCTC12841BP

20150609

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KCTC12842BP

20150609

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Novel Pichia kudriavzevii NG7 and use thereof <130> KPA140625-KR-P1 <150> KR10-2014-0075461 <151> 2014-06-20 <160> 32 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS1 primer <400> 1 tccgtaggtg aacctgcgg 19 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LR3R primer <400> 2 ggtccgtgtt tcaagac 17 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27F primer <400> 3 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1492R primer <400> 4 ggttaccttg ttacgactt 19 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 <400> 5 atttcagtgc accattttaa tttctattgc 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 <400> 6 tgcaataatt ttcatatttt tatgttttgc 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3 <400> 7 gcaaaacata aaaatatgaa aattattgca 30 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Artificial Sequence <220> <223> primer 12 <400> 16 ttaagcggct ttagagttga tttcatcaga 30 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 13 <400> 17 attgtatcct atcctattcg atcctattgt 30 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 14 <400> 18 ttgcaaagac gcaatattct ctctcccatg 30 <210> 19 <211> 999 <212> DNA <213> Lactobacillus plantarum <220> <221> gene <222> (1)..(999) <223> lactate dehydrogenase <400> 19 atgaaaatta ttgcatatgc tgtacgtgat gacgaacgtc cattcttcga tacttggatg 60 aaagaaaacc cagatgttga agttaaatta gttccagaat tacttactga agacaacgtt 120 gacttagcta aaggcttcga cggtgccgat gtataccaac aaaaggacta tactgctgaa 180 gtattgaaca agttagccga cgaaggggtt aagaacatct ctcttcgtaa cgttggtgtt 240 gataacttgg acgttcctac tgttaaagca cgtggcttaa acatttctaa cgtacctgca 300 tactcaccaa atgcgattgc tgaattatca gtaacgcaat tgatgcaatt attacgtcaa 360 accccattgt tcaataagaa gttagctaag caagacttcc gttgggcacc agatattgcc 420 aaggaattaa acaccatgac tgttggtgtt atcggtactg gtcggattgg ccgtgctgcc 480 atcgatattt tcaaaggctt cggcgctaag gttatcggtt acgatgttta ccggaatgct 540 gaacttgaaa aggaaggcat gtacgttgac accttggacg aattatacgc ccaagctgat 600 gttatcacgt tacacgttcc tgcattgaag gataactacc acatgttgaa tgcggatgcc 660 ttcagcaaga tgaaagatgg cgcctacatc ttgaactttg ctcgtgggac actcatcgat 720 tcagaagact tgatcaaagc cttagacagt ggcaaagttg ccggtgccgc tcttgatacg 780 tatgaatacg aaactaagat cttcaacaaa gaccttgaag gtcaaacgat tgatgacaag 840 gtcttcatga acttgttcaa ccgcgacaat gttttgatta caccacatac ggctttctac 900 actgaaactg ccgttcacaa catggtgcac gtttcaatga acagtaacaa acaattcatc 960 gaaactggta aagctgatac gcaagttaag tttgactaa 999 <210> 20 <211> 1689 <212> DNA <213> Pichia kudriavzevii <220> <221> gene <222> (1)..(1689) <223> Pyruvate Decarboxylase <400> 20 atgactgaca aaatctccct aggtacttat ctgtttgaaa agttaaagga agcaggctct 60 tattccatct ttggtgttcc tggtgatttc aatttggcat tgttggacca cgttaaggaa 120 gttgaaggca ttagatgggt cggtaacgct aacgagttga atgccggcta cgaagctgat 180 ggttatgcaa gaatcaatgg atttgcatcc ctaatcacca cctttggtgt cggtgaattg 240 tctgccgtca atgccattgc aggttcttat gctgaacacg tcccattgat ccatattgtt 300 ggtatgcctt ccttgtctgc tatgaagaac aacttgttgt tacaccatac cttgggtgac 360 acaagattcg acaacttcac cgaaatgtca aagaaaatca gtgcaaaggt tgagattgtt 420 tacgatttgg aatcagctcc aaaattaatt aataacttga ttgaaaccgc ttatcacaca 480 aagagaccag tctacttggg acttccttcc aactttgctg atgaattggt tccagcggca 540 ttagttaagg aaaacaagtt acatttagaa gaacctctaa acaaccccgt tgctgaagaa 600 gaattcattc ataacgttgt tgaaatggtc aagaaggcag aaaaaccaat cattctcgtt 660 gacgcttgtg ctgcaagaca taacatttct aaggaagtga gagagttggc taaattgact 720 aaattccctg tcttcaccac cccaatgggt aaatctactg ttgatgaaga tgatgaagaa 780 ttctttggct tatacttggg ttctctatct gctccagatg ttaaggacat tgttggccca 840 accgattgta tcttatcctt aggtggttta ccttctgatt tcaacaccgg ttccttctca 900 tatggttaca ctactaagaa tgtcgtttat gaaaacttga tgatgaaggg cgcagtccaa 960 agattgatca gcgaattgaa gaatattaag tattccaatg tctcaacttt atctccacca 1020 aaatctaaat ttgcttacga atctgcaaag gttgctccag aaggtatcat cactcaagat 1080 tacctgtgga agagattatc ttacttctta aagccaagag atatcattgt cactgaaact 1140 ggtacttcct cctttggtgt cttggctacc cacttaccaa gagattcaaa gtctatctcc 1200 caagtcttat ggggttccat tggtttctcc ttaccagctg cagttggtgc tgcatttgct 1260 gctgaagatg cacacaaaca aactggcgaa caagaaagaa gaactgtttt gtttattggt 1320 gatggttctt tacaattgac tgtccaatca atctcagatg ctgcaagatg gaacatcaag 1380 ccatacatct tcatcttaaa caacagaggt tacactatcg aaaagttgat ccacggtcgt 1440 catgaggact acaaccaaat tcaaccatgg gatcaccaat tgttattgaa gctctttgct 1500 gacaagaccc aatatgaaaa ccatgttgtt aaatccgcta aagacttgga cgctttgatg 1560 aaggatgaag cattcaacaa ggaagataag attagagtca ttgaattatt cttggatgaa 1620 ttcgatgctc cagaaatctt ggttgctcaa gctaaattat ctgatgaaat caactctaaa 1680 gccgcttaa 1689 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 15 <400> 21 gaggaaactt caatcgtcga agaagataag 30 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 16 <400> 22 atcgaaatct agcccccttg acaaacaaac 30 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 17 <400> 23 atcgaaatct agcccccttg acaaacaaac 30 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 18 <400> 24 atctttgtgt aagaagtcga cttatggaca 30 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 19 <400> 25 tgtccataag tcgacttctt acacaaagat 30 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 20 <400> 26 tgtccataag tcgacttctt acacaaagat 30 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 21 <400> 27 aaagatcgtt gaacagatgg attgttttag 30 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 22 <400> 28 ctaaaacaat ccatctgttc aacgatcttt 30 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 23 <400> 29 cttgggagat agactaacac ttagaatacg 30 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 24 <400> 30 cgtattctaa gtgttagtct atctcccaag 30 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 25 <400> 31 tccctaggta cttatctgtt tgaaaagtta 30 <210> 32 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 26 <400> 32 gttgatttca tcagataatt tagcttgagc 30

Claims

내산성 및 내열성을 가지는 피키아 쿠드리압즈비(Pichia kudriavzevii) NG7 균주로서,
상기 균주는 기탁번호 KCTC18297P로 기탁된 것인, 균주.
삭제
제1항에 있어서,
상기 균주는 오로티딘 5인산 탈탄산효소(Orotidine 5'-phosphate decarboxylase, URA3)의 활성이 추가로 불활성화된 것인, 균주.
제1항에 있어서,
상기 균주는 피루베이트 디카르복실라제(Pyruvate Decarboxylase)의 활성이 내재적 활성보다 약화되고 젖산 탈수소 효소(Lactate Dehydrogenase) 활성이 추가로 도입된 것인, 균주.
제4항에 있어서,
상기 균주는 기탁번호 KCTC18300P인, 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 탄소원으로 글리세롤을 사용할 수 있는, 균주.
제3항에 있어서,
상기 균주는 피루베이트 디카르복실라제 (Pyruvate Decarboxylase)의 활성이 불활성화되고 젖산 탈수소 효소(Lactate Dehydrogenase) 활성이 추가로 도입된 것인, 균주.
제7항에 있어서,
상기 균주는 기탁번호 KCTC18394P 인, 균주.
제1항, 및 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항의 균주 또는 이의 배양물을 포함하는, 유기산 또는 알코올 생산용 조성물.
제9항에 있어서, 상기 조성물은 글리세롤을 포함하는 것인, 조성물.
제9항에 있어서, 상기 유기산은 젖산인, 조성물.
제1항, 및 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항의 균주를 배지에 배양하는 단계를 포함하는, 유기산 또는 알코올 제조 방법.
제12항에 있어서, 상기 유기산은 젖산인, 방법.
제12항에 있어서, 상기 배지는 글리세롤을 포함하는 것인, 방법.
제12항에 있어서, 상기 배양은 중화제를 첨가하지 않는 조건 하에서 수행되는, 방법.