KR101686899B1 - 신규한 클루이베로마이세스 막시아누스 mj1 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 내열성 및 내산성을 나타내는 신규한 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) MJ1 균주, 상기 균주 및 이의 배양물을 포함하는 젖산 생산용 조성물 및 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 젖산 생산 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 클루이베로마이세스 막시아누스 MJ1 및 이의 용도{Novel Kluyveromyces marxianus MJ1 and use thereof}

본 발명은 우수한 내열성 및 내산성을 나타내는 신규한 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) MJ1 균주, 상기 균주 및 이의 배양물을 포함하는 젖산 생산용 조성물 및 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 젖산 생산 방법에 관한 것이다.

젖산은 식품 분야, 의약분야, 화장품 분야 등 산업 분야에서 다양하게 이용되어 왔으며 최근에는 폴리젖산이 석유로부터 생산되는 플라스틱을 대체할 수 있는 생분해성 폴리머로서 기능이 입증되어 단량체로 활용되는 젖산의 수요가 크게 증가하고 있다.

폴리젖산의 단량체로 사용하기 위해서는 젖산의 광학이성질체를 선택적으로 생산할 필요가 있으며, 기존의 화학 합성 방법을 대신하여 미생물을 이용하는 방법이 선호되고 있다. 젖산을 생산하는 미생물인 락토바실러스는 이미 많은 종류가 알려져 있으나 이러한 미생물을 배양하여 젖산을 생산하면 두 가지 광학이성질체 젖산인 D-젖산 및 L-젖산이 함께 생산되는 단점이 있기 때문에 유전자 조작이 필요하고, 내산성이 약한 단점이 있다.

또한, 젖산 발효 과정에서 축적되는 젖산은 배지의 pH를 산성화시켜 균주 성장을 저해하기 때문에 지금까지 사용되는 젖산 발효에서는 중화제를 배양액에 첨가하는 방법을 사용하고 있다. 가장 널리 사용되는 CaCO₃는 젖산과 결합하여 칼슘염을 형성하며 발효 후에 침전물을 산용액으로 처리하여 젖산을 회수하는 과정에서 젖산과 동일 몰수의 석회가 형성된다. 이러한 방법은 정제 공정을 복잡하게 하고 부산물을 형성하기 때문에 젖산의 생산 단가를 높이는 요인이 된다. 이러한 문제를 극복하기 위하여 중화제를 사용하지 않고 젖산을 생산할 수 있는 내산성 균주에 대한 관심이 증가하고 있다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 내열성과 내산성이 있는 효모 균주를 확보하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 팜슬러지로부터 샘플을 채취하여 고온 내산성이 높은 효모인 클루이베로마이세스 막시아누스 (Kluyveromyces marxianus) MJ1 균주를 분리 동정하였고, 상기 균주에서 유전자 조작을 하여 젖산 생산이 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 기탁번호 KCTC18286P의 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) MJ1 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 젖산 생산용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 젖산 생산 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일구현예는 기탁번호 KCTC18286P의 내열성 및 내산성을 나타내는 신규한 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) MJ1 균주에 관한 것이다.

본 발명의 클루이베로마이세스 막시아누스 균주는 크렙트리 음성 균주의 일종이다.

크렙트리(Crabtree)란, 글루코오스 첨가에 의해 세포의 호흡이 억제되는 현상을 뜻하는 크렙트리 효과(Crabtree effect)와 같은 의미이다. 본 발명에서 용어, "크렙트리 음성 균주"는 상기 크렙트리 현상, 곧 글루코오스 첨가에 의해 세포의 호흡이 억제되는 현상이 일어나지 않는 형질을 가지는 균주를 뜻한다.

본 발명에서, "클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus)균주"는 고온에서의 성장 능력, 빠른 성장율 및 과량의 당에 노출되었을 때 에탄올을 생산하는 경향이 적은(크렙트리 음성형) 특성을 갖는 효모 균주이다.

특히, 과량의 이눌린(Inulin) 분해효소를 분비하기 때문에 이눌린을 과량 포함하고 있는 돼지감자를 영양원으로 사용할 수 있는 능력이 뛰어난 효모이다. 일반적인 효모 균주와 달리 클루이베로마이세스 막시아누스는 많은 strain이 보고되어 있으며, strain에 따라 매우 다양한 생리적 특성을 나타내는 특성이 있다. 심지어는 동일한 strain이라도 다른 연구 그룹간 상이한 결과가 보고되기도 하였다. 따라서, 본 발명에서는 요구하는 특성을 갖는 클루이베로마이세스 막시아누스의 특정 strain을 선별하는 것이 중요한 과정이다.

본 발명의 클루이베로마이세스 막시아누스 MJ1 균주는 팜부산물로부터 분리 동정한 균주로 특성분석을 통해 고온에서도 안정적으로 생장 가능한 균주이며 내산성이 높아서 pH 3이하에서도 성장이 가능한 균주임을 확인하였다.

이에, 젖산 생산에 의해 배지 내의 산성이 높아지더라도 본 발명의 신규 균주의 성장에는 무리가 없으므로, 중화제 첨가 없이 젖산을 지속적으로 생산할 수 있어, 정제 공정이 간편하게 진행될 수 있다. 본 발명자들은 상기와 같은 효과를 확인하여, 젖산 생산 균주로서 클루이베로마이세스 막시아누스 MJ1 균주를 제공하기에 이르렀다.

상기 균주에 대하여 염기서열을 분석하여 비교한 결과 클루이베로마이세스 막시아누스와 99.2%의 상동성을 나타내었으므로 클루이베로마이세스 막시아누스 MJ1으로 명명하였으며, 이의 ITS1, 5.8S rRNA, ITS2, 28S rRNA 염기서열(서열번호 1)은 NCBI의 GeneBank에 등록번호 KM008607로 등록하였다.

또한, 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 2014년 6월 11일자로 기탁하고, 수탁번호 KCTC18286P를 부여받았다.

구체적으로, 본 발명의 클루이베로마이세스 막시아누스 MJ1 균주는 오로티딘 5인산 탈탄산효소의 활성이 추가로 불활성화된 균주일 수 있다. 오로티딘 5인산 탈탄산효소의 활성이 추가로 불활성화된 균주는 기탁번호 KCTC18287P로 기탁된 균주일 수 있다.

본 발명의 용어, "오로티딘 5인산 탈탄산효소 (orotidine 5-phosphate decarboxylase, URA3)"는 우라실 생합성에 관여하는 효소이다. URA3 유전자가 결실된 균주는 우라실 영양요구성 균주이며 이 균주에서는 URA3 유전자를 영양요구성 선별표지유전자로 사용이 가능하기 때문에 본 발명의 한 실시예에서는 클루이베로마이세스 막시아누스 MJ1에 존재하는 오로티딘 5인산 탈탄산효소 유전자 (URA3)가 결실된 균주(수탁번호 KCTC18287P)를 제작하였다(실시예 4). 이와 같은 균주는 간편하게 유전자 도입 또는 결손의 선별을 우라실을 이용하여 간편히 할 수 있다.

또한 구체적으로, 본 발명의 클루이베로마이세스 막시아누스 MJ1 균주는 균주는 피루베이트 탈탄산 효소(Pyruvate Decarboxylase) 활성이 추가로 불활성화된 것일 수 있다. 그 예로 기탁번호 KCTC18288P로 기탁된 균주일 수 있으나, 모균주인 클루이베로마이세스 막시아누스 MJ1 균주에서 피루베이트 탈탄산 효소의 활성이 불활성화되어 젖산을 생산할 수 있는 균주이면 제한없이 포함될 수 있다.

본 발명의 용어, "피루베이트 탈탄산 효소(Pyruvate Decarboxylase, PDC1)"는 피루베이트에 작용하여 탄산과 아세트 알데히드를 생성하는 반응(CH₃COCOOH -> CH₃CHO + CO₂)를 촉매하는 효소이다. 알코올 생성과 관련해서는 알코올 발효의 한 단계에서 필수적인 효소이다. 따라서, 본 발명에서 상기 균주에 존재하는 피루베이트 탈탄산 효소를 불활성화시켜 발효에 의한 알코올 생성이 저해된 균주를 제공할 수 있다.

구체적으로는, 상기 균주는 당이 포함된 배지에서 배양시 에탄올의 생성이 피루베이트 탈탄산 효소가 불활성화되지 않은 균주에 비해 감소되는 것인 균주일 수 있다. 또한, 상기 피루베이트 탈탄산 효소의 불활성화는 해당 효소의 유전자에 치환, 결손, 또는 부가되어 이루어지는 균주일 수 있다. 상기 피루베이트 탈탄산 효소는 이에 제한되지 않으나, 서열번호 33으로 이루어진 유전자에 의해 발현될 수 있다.

일반적으로 균주 내 유전자의 불활성화는 여러 가지 형태로 제작할 수 있다. 예를 들어, 유전자 발현의 신호 구조의 변형 또는 안티센스(antisense)-RNA 기술에 의해 유전자 발현을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 유전자 발현의 신호 구조는, 예를 들어 억제(repressor) 유전자, 활성화(activator) 유전자, 작동자(operator), 프로모터, 감쇠자(attenuator), 리보솜 결합 자리, 시작 코돈(codon) 그리고 종료자(terminator) 들이며, 이에 한정되지 않는다.

또한, 목적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 가닥과 이것과 상보적인 서열을 가지는 안티센스 가닥으로 구성되는 이중가닥 RNA(dsRNA)을 도입하여 목적 유전자 mRNA의 분해를 유도함으로써 목적 유전자의 발현을 억제하는 메커니즘인 RNA 간섭(RNA interference:RNAi) 방법을 사용할 수 있다. 또는, 단일 세포의 게놈 내에서 다른 위치로 이동할 수 있는 DNA 서열인 트랜스포존을 매개로 한 돌연변이를 일으켜 목적 유전자의 기능을 차단하여 불활성화하는 방법을 사용할 수도 있다. 유전자 단백질의 촉매 활성의 변화 또는 감소를 유도하는 돌연변이들은 당업계에 잘 알려져 있다(Qiu & Goodman, Journal of Biological Chemistry 272: pp. 8611-8617, 1997).

구체적으로는, 유전자의 불활성화는 단일 또는 복합 염기서열의 변이, 단일 또는 복합 유전자의 결손, 유전자 내에 외래 유전자의 삽입, 유전자군 전체의 결손, 유전자군의 프로모터의 억제 서열 삽입, 프로모터의 돌연변이, 유전자군의 발현 억제 조절 삽입, 유전자군의 단일 또는 복합 염기서열에 대한 RNAi 도입, 트랜스포존 매개 돌연변이 또는 이러한 변이체들의 조합 중 하나의 방법을 이용하여 수행될 수 있다.

상기에 기술한 방법들은 본 기술 분야에 통상의 사람에게 일반적으로 이해되어지며, Sambrook et al.(Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Press 2001)에서 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.

유전자의 염기 서열 중 활성 부위의 단일 또는 복합 서열을 변화하여, 유전자로부터 발현되는 단백질의 활성을 매우 낮출 수도 있고, 단일 또는 복합 유전자의 결손, 염기서열 내부에 외래 유전자인 항생제 내성 유전자나 다른 유전자를 삽입하여 완전한 단백질이 발현되지 못하게 하는 방법일 수 있다. 바람직하게는 염색체에 존재하는 유전자의 염기 서열을 모두 결손하는 방법을 사용할 수도 있다. 또는 상기 방법에 의한 변이체의 조합으로 불활성화시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 목적은 젖산을 생성하는 특성을 갖는 균주를 제공하는데 있다. 이를 위해, 상기 신규한 클루이베로마이세스 막시아누스 MJ1 균주에 피루베이트 탈탄산 효소 불활성화 및/또는 젖산 생성과 관련되는 외인성 유전자를 도입한 균주를 이용하여 젖산을 생산할 수 있다.

이에, 본 발명의 일구현예는 젖산 탈수소 효소(lactate dehydrogenase) 활성이 도입된 클루이베로마이세스 막시아누스 MJ1 균주일 수 있다. 그 예로, 기탁번호 KCTC18289P로 기탁된 균주일 수 있으나, 모균주로 사용하는 클루이베로마이세스 막시아누스 MJ1 균주에서 젖산 탈수소 효소 활성이 도입되어 젖산을 생산할 수 있는 균주이면 제한없이 포함될 수 있다.

본 발명의 용어, "외인성 유전자"는 천연형 균주에 속해 있지 않았던 핵산 서열을 일정한 목적을 위해 외부에서 도입한 경우의 해당 유전자를 뜻한다. 특히, 본 발명에서는 특정 유기산의 생성과 관련되는 유전자를 의미하며, 상기 유기산은 젖산일 수 있다.

구체적으로는, 본 발명에서는 균주의 목적이 되는 젖산은 광학이성질체인 L-젖산 혹은 D-젖산일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 D-젖산일 수 있다.

또한, 상기 젖산을 생성하기 위해 균주에 도입되는 외인성 유전자는 구체적으로는 젖산 탈수소 효소(Lactate Dehydrogenase, LDH) 활성을 갖는 유전자일 수 있다.

본 발명의 용어, "젖산 탈수소 효소(Lactate Dehydrogenase)"는 일반적으로 NAD⁺를 이용하여 L-젖산 혹은 D-젖산에서 수소를 이탈시켜 피루브산으로 만드는 효소로, 이와는 역반응인 해당의 최종단계를 촉매할 때에는 NADH를 이용하여 피루브산을 환원하여 L-젖산 혹은 D-젖산을 생성하는 효소이다. 즉, 본 발명의 젖산 탈수소 효소는 L-젖산 탈수소 효소 또는 D-젖산 탈수소 효소일 수 있으며, 구체적으로는 D-젖산 탈수소 효소일 수 있다.

상기, 젖산 탈수소 효소 활성을 갖는 유전자는 천연형 젖산 탈수소 효소뿐 아니라, 이와 최소한 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 의 상동성을 가지는 동일한 활성을 갖는 효소의 유전자를 포함할 수 있다. 천연형 젖산 탈수소 효소에 돌연변이를 유도한 변이 유전자 또한 젖산 탈수소 효소 활성을 갖는 이상, 서열에 무관하게 본 발명의 젖산 탈수소 효소에 포함될 수 있다.

상기 젖산 탈수소 효소는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank 등에서 확인할 수 있으며 이에 제한되지 않으나, 서열번호 32의 염기서열로 이루어진 유전자일 수 있다. 또한, 본 발명의 균주에서 젖산 탈수소 효소는 클루이베로마이세스 막시아누스 유래의 TEF1a 프로모터를 이용하여 발현할 수 있다.

또 다른 일구현예로서, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양물을 포함하는, 젖산 생산용 조성물에 관한 것이다.

상기 균주에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명의 용어 "배양물"은 본 발명의 클루이베로마이세스 막시아누스 MJ1균주가 시험관 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 상기 균주를 일정기간 배양하여 얻는, 배양된 균주, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 배지를 의미하나, 균주 배양 후 균주를 제거한 배양액도 포함한다. 상기 클루이베로마이세스 막시아누스 MJ1 균주는 당류를 이용하는 젖산 생산능을 가지는 균주이므로, 상기 균주 또는 이의 배양물은 당류로부터 젖산을 생성하기 위한 젖산 생산용 조성물로 이용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명의 균주가 당류에 속하는 글루코스를 소모하여 생산되는 젖산을 측정하였으며, 표 3에 나타난 바와 같이, 클루이베로마이세스 막시아누스 MJ1 균주의 수율은 51.6%로서, 기존의 클루이베로마이세스 막시아누스 균주에 비해 우수함을 확인하였다.

또한, pH 2.0 조건에서도 성장이 이루어지는 것을 확인하여 우수한 내산성을 가짐을 확인하였으며(도 3), 온도별 젖산 생산량을 측정하여 40℃에서도 젖산 생산이 활발히 이루어져, 종래의 클루이베로마이세스 막시아누스 균주의 젖산 생산량(g/L)의 2배 이상의 생산량을 나타내는 것을 확인하였다(표 4).

이로부터, 본 발명의 신규한 클루이베로마이세스 막시아누스 MJ1 균주는 우수한 내산성과 내열성을 나타낼 뿐 아니라, 젖산 생산량 역시 우수하여 중화제를 사용하지 않고도 젖산을 생산할 수 있음을 알 수 있었다.

또 다른 일구현예로서, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 젖산 생산 방법에 관한 것이다.

본 발명의 젖산 생산 방법은, 내산성이 있는 상기 균주를 배양하는 것이므로, 기존의 젖산 생산 방법과는 달리 pH를 조절하지 않는 조건하에서 수행할 수 있다.

본 발명의 실시예에서는, pH를 조절하지 않는 조건하에서, 본 발명의 균주가 종래 균주보다 젖산 생산의 수율이 높은 것을 확인하였다. 이로부터, 본 발명의 상기 균주를 이용하면, 중화제를 첨가하지 않고 젖산을 생산할 수 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명의 젖산 생산 방법은, 상기의 균주 중에서 에탄올 생성 경로가 봉쇄되고, 성장능이 유지되면서 젖산의 생산능이 높게 유지되는 형질전환 균주를 배양하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에서는, 배양시 교반 속도를 다르게 하여 젖산을 수득한 결과, 본 발명의 균주가 교반 속도가 높을수록 세포 성장이 증가하고 젖산 수율도 높은 것을 확인하여 기존 균주와 달리 세포 성장과 동시에 젖산 생산이 가능한 균주임을 확인하였다.

기존의 균주는 호기성 조건에서 배양하면 균체의 성장은 빠르나, 젖산의 생산량이 낮아지고, 혐기성 조건에서 배양하면 균체의 성장이 낮은 반면, 젖산의 생산량이 높아지므로, 균체의 배양과 젖산의 전환을 구별하여 2단계 배양을 하였다.

더 나아가, 본 발명의 젖산 생산 방법은 1 내지 20, 바람직하게는 5 내지 15의 OD₆₀₀ 값인 초기 균체 농도, 1 내지 10, 바람직하게는 2 내지 7%의 글루코스 농도, 및 50 내지 200 rpm, 바람직하게는 80 내지 170 rpm의 교반 속도 하에서 젖산을 생산하는 방법이다.

구체적으로, 본 발명의 실시예 9 및 10에서는, 상기 균주를 이용한 젖산 생산을 위한 2단계 배양의 최적 조건을 확인한 결과, OD₆₀₀ 7의 초기 세포농도, 5%의 글루코스 농도, 및 160 rpm의 교반 속도임을 확인하였다.

그러나, 내산성이 있는 본 발명의 균주는 균주 배양 단계와 젖산 전환 단계를 구별하지 않고, 1단계 배양으로 젖산을 생산할 수 있어 기존의 젖산 생산 방법 보다 경제적이고 효율적이다.

따라서, 본 발명의 젖산 생산 방법은, 균주 배양 단계와 젖산 전환 단계를 구별하지 않는 방법일 수 있다.

본 발명의 젖산 생산 방법은 1단계 배양의 조건으로서, 150 rpm 내지 250 rpm, 바람직하게는 160 rpm 내지 250 rpm의 교반 속도 및 30 내지 40 ℃, 바람직하게는 33 내지 38℃의 배양 온도에서 젖산을 생산하는 방법일 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 실시예 11 및 12에서는 200 rpm 및 35 ℃가 상기 1단계 배양의 최적의 조건임을 확인하였다.

본 발명에서 상기 균주의 배양은 널리 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있고, 배양 온도, 배양 시간 및 배지의 pH 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다. 적절한 배양 방법으로는 유가식 배양(fed-batch culture), 회분식 배양(batch culture) 및 연속식 배양(cintinuous culture) 등이 가능하며, 바람직하게는 회분식 배양이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 실시예 13에서는 유가식 발효를 통해 젖산을 생산하였다. 유가식 발효한 결과, pH 3.0 및 3.5의 조건하에서 젖산 수율이 각각 47.5% 및 50.1%임을 확인하였으며, 동일한 조건의 회분식 발효에서도 젖산을 생산하는 것을 확인하였다(실시예 14).

사용되는 배양 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 충족시켜야 한다. 다양한 미생물에 대한 배양 배지는 공지되어 있다(예를 들면, "Manual of Methods for General Bacteriology" from American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)). 배지 내 탄소 공급원은 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 이용할 수 있다.

본 발명에서 상기 균주는 글루코스를 영양원으로 하는 배지에서 배양할 수있으며, 저가로 대량공급이 가능한 바이오매스인 돼지감자 분말을 영양원으로 이용하여 배양할 수 있다. 본 발명의 용어, "돼지감자 분말 배지"는 일체의 전처리를 하지 않고 돼지감자 분말만을 포함하는 영양 배지이다. 완전 배지이기 때문에 선별을 위한 배지로는 사용될 수는 없다.

상기 배양 배지를 이루는 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 질소 공급원은 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄)을 이용할 수 있으며, 이들 물질 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 인 공급원으로서 인산이수소칼륨 또는, 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨 함유 염을 이용할 수 있다. 또한, 배양 배지는 성장에 필수적인 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철)을 함유할 수 있으며, 최종적으로, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장-촉진 물질을 상기 언급한 물질 외에 사용할 수 있다. 적합한 전구체를 상기 배양 배지에 추가로 가할 수 있다. 상기 공급 물질은 배양물에 한번에 모두 가하거나, 배양중 적절하게 공급할 수 있다.

구체적으로는 상기 생산되는 젖산은 광학이성질체인 L-젖산과 D-젖산일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 D-젖산일 수 있다. 이는 도입하는 젖산 탈수소 효소의 종류에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 신규한 클루이베로마이세스 막시아누스 MJ1 균주는 우수한 내열성 및 내산성을 나타내어, 젖산 생산에 있어서 중화제를 별도로 처리하지 않고, 고온에서도 젖산의 합성이 가능할 수 있도록 하여 효율적인 젖산의 생산이 가능하도록 하였다.

도 1은 다양한 샘플에서 분리된 효모들을 나타낸 것이다.
도 2는 팜부산물 퇴비에서 분리된 균주들의 종 분석을 위한 PCR 반응의결과를 나타낸 것이다.
도 3은 pH 2.0, 3.0 및 6.0으로 각각 맞춰준 YPD 액체배지에서의 성장곡선을 나타낸 것이다.
도 4는 1, 2, 3, 4 및 5% 젖산이 포함된 YPD 액체배지에서의 성장곡선을 나타낸 것이다.
도 5는 Zeocin 카세트를 이용하여 URA3 유전자 2 카피의 URA3 유전자를 모두 결실시킨 것을 PCR 반응결과를 통해 확인한 것이다.
도 6은 NAT 카세트를 이용하여 URA3 유전자를 모두 결실시킨 것을 PCR 반응결과를 통해 나타낸 것이다.
도 7은 zeocin 카세트와 NAT 카세트가 삽입된 형질전환체의 Zeocin, NTC 및 Uracil 배지에서 성장여부를 확인한 것이다.
도 8은 URA3 카세트를 이용하여 PDC1 유전자를 결실시킨 것을 PCR 반응결과를 통해 확인한 것이다.
도 9는 PDC1 유전자를 결실시킨 형질전환체의 형질전환 여부를 PCR 반응결과를 통해 확인한 것이다.
도 10은 PDC1 결실 균주의 세포성장, 글루코스 소비량 및 에탄올 생산량을 그래프로 나타낸 것이다.
도 11은 SD-Ura 배지에서 선별된 형질전환체의 DNA를 분리하여 PCR을 통하여 도입된 벡터가 염색체로 도입된 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 내산성 균주인 MJ1 Δpdc1/LDH 균주 및 25571 균주의 pH 조절에 따른 세포성장 및 D-젖산 생산량을 비교한 그래프를 나타낸 것이다.
도 13은 MJ1 Δpdc1/LDH 균주 및 25571 균주의 80, 120 및 180rpm 조건에서 세포성장, 글루코스 소비량 및 D-젖산 생산량을 비교한 그래프를 나타낸 것이다.
도 14는 MJ1 Δpdc1/LDH 균주 및 25571 균주의 2.5%, 5% 글루코스 농도에서 세포성장 및 D-젖산 생산량을 비교한 그래프를 나타낸 것이다.
도 15는 MJ1 Δpdc1/LDH 균주 및 25571 균주의 30℃, 35℃ 및 40℃ 조건에서 세포성장, 글루코스 소비량 및 D-젖산 생산량을 비교한 그래프를 나타낸 것이다.
도 16은 MJ1 Δpdc1/LDH 균주 및 25571 균주의 1단계 배양조건을 이용한 젖산 생산시 교반 속도에 따른 세포성장, 글루코스 소비량 및 D-젖산 생산량을 비교한 그래프를 나타낸 것이다.
도 17은 내산성 균주인 MJ1 Δpdc1/LDH 균주의 유가식 발효를 통한 세포 성장, 글루코스 소비량 및 D-젖산 생산량을 비교한 그래프를 나타낸 것이다.
도 18은 내산성 균주인 MJ1 Δpdc1/LDH 균주의 회분 배양식 발효를 통한 세포 성장, 글루코스 소비량 및 D-젖산 생산량을 비교한 그래프를 나타낸 것이다.
도 19는 내산성 균주인 MJ1 Δpdc1/LDH 균주의 글리세롤이 포함된 배지에서의 세포 성장, 글루코스 소비량 및 D-젖산 생산량을 비교한 그래프를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 신규 내산성 효모 탐색을 위한 효모의 분리

신규 내산성 효모의 탐색을 위하여, 팜부산물, 팜슬러지 및 포도 껍질 샘플을 채취한 후 샘플 10g을 40ml의 멸균 증류수에 넣고, 한 시간 동안 볼텍스(vortex)를 이용하여 섞어주었다. 이 후 상등액을 단계희석(serial dilution) 하여 이 시료를 박테리아를 저해하기 위한 효모배지로 YMPS [1 L 당 효모 추출물 3 g, 맥아 추출물 3 g, 펩톤 5 g, 글루코스 10 g 및 항생제(페니실린, 스트렙토마이신 50 mg)] 아가(agar) 배지에 도말하여 30℃에서 48시간 동안 배양 한 뒤, 곰팡이 포자 형태가 아닌 효모 형태의 콜로니를 생성하는 균주를 확보하였다(도 1).

분리된 미생물 콜로니를 YMPS agar 배지에 다시 접종하여 순수분리 및 배양을 하였으며, 그 결과, 포도 껍질에서 7종, 팜부산물 1에서 4종, 팜부산물 2에서 2종의 효모 균주를 분리하였다.

실시예 2. 신규 미생물의 동정을 위한 유전학적 분석

상기 실시예 1에서 확보한 효모 균주들의 종 분석을 위하여, 균주들을 3 ml YMPS 액체 배지로 30℃에서 180 rpm으로 48시간 동안 진탕 배양한 후, 원심분리하여 세포만을 회수하여, i-유전체 BYF DNA 추출 미니 키트(i-genomic BYF DNA Extraction Mini Kit, iNtRON Biotechnology Inc., Sungnam, Korea)를 사용하여 유전체 DNA(genomic DNA)를 추출하였다. 상기 추출된 DNA에서 진핵세포 미생물의 진화 계통연구에 가장 유용한 분자마커로 이용되고 있는 ITS1, 5.8S rRNA, ITS2, 및 28S rRNA를 포함하는 염기서열(서열번호 1)을 분석하기 위하여 프라이머 ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'; 서열번호 2)과 LR3R(5'-GGTCCGTGTTTCAAGAC-3'; 서열번호 3)을 이용하여 PCR 기법을 이용하여 염기서열을 증폭시켰다. 또한, 박테리아 여부를 알아보기 위하여 박테리아의 16S rRNA gene을 분석하기 위한 프라이머로 27F(서열번호 4)와 1492R(서열번호 5)을 사용하였다. 위의 염기서열을 증폭하기 위한 반응조성은 주형(template) DNA 1㎕, 10pmol ITS1 1.5㎕, 10pmol LR3R 1.5㎕, EX taq buffer (Takara) 5㎕, 2.5 mM dNTP 4㎕, 증류수 36.5㎕, EX taq DNA polymerase (Takara) 0.5㎕ 이며, PCR 조건은 95℃ 5분 반응 후, 95 ℃ 30초, 55℃ 30초, 72 ℃ 1분 30초로 30 사이클 반응하고, 72℃에서 10분간 추가 반응하는 반응조건을 사용하였다.

상기 PCR 반응 후 2μl의 반응액을 취하여 아가로스 겔에서 전기영동을 이용하여 분석한 결과, 1~1.2 kb 크기의 단편이 증폭되었으며, 이로부터 분리된 모든 종이 진핵생물임을 알 수 있었다(도 2). 이를 솔젠트 PCR 정제 키트(solgent PCT purification kit)를 이용하여 PCR 산물을 정제하였다. 상기 정제된 PCR 산물의 염기서열을 분석하였다(제노텍사). 이와 같이 분석된 염기서열은 동정을 위하여 National Center for Biotechnology Information(NCBI)에서 제공하는 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 프로그램을 이용하여 공지된 염기서열들과 비교하였다.

그 결과, 다양한 효모 균주들이 분리되었으며, 많은 종들이 에탄올 발효를 하는 종임을 알 수 있었다(표 1). 또한, 표 1에서 G-1, G-2, G-3, 1-2, 2-2등은 와인공정이나 치즈 발효 등에서 많이 우점하는 효모임을 알 수 있었으며, 이들의 ribosomal DNA 염기서열의 상동성은 매우 유사한 종부터 동떨어진 종까지 다양하게 분리된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 상동성이 떨어지는 균주는 이미 밝혀지지 않은 신종일 확률이 클 것임을 예측할 수 있었다.

실시예 3. 분리된 균주들의 특성 분석

먼저 pH 별 생존 능력을 확인하기 위하여 pH 2.0, 3.0 및 6.0으로 각각 맞춰준 YPD(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 글루코스) 액체배지에 30℃에서 48시간 배양하여 성장 곡선을 분석하였다(도 3). 그 결과 모든 균주의 pH 3.0과 pH 6.0에서의 성장은 비슷하였고, 일부 G-1, G-2, 1-2 및 2-2 균주는 pH 2.0 조건에서도 성장을 하는 것을 확인하였다. 그 중에서 팜슬러지에서 분리된 클루이베로마이세스 막시아누스 균주는 기존에 실험실에서 사용하는 클루이베로마이세스 막시아누스 25571 균주에 비하여 내산성이 우수함을 확인하였으며, 이에, 젖산에 대한 저항성을 확인하였다.

1, 2, 3, 4 및 5% 젖산이 포함된 YPD (1% 효모 추출물, 2% 펩톤 및 2% 글루코스) 배지에 분리균주 PKM을 접종하여 30℃에서 48시간 배양하였다. 그 결과 25571 균주의 경우 3% 이상의 젖산 농도에서는 잘 성장하지 못하였으나 팜슬러지에서 분리된 클루이베로마이세스 막시아누스 균주의 경우 모든 농도에서 25571 보다 높은 세포성장을 보였으며 특히 4% 농도까지 성장하여 젖산에 대한 저항성이 높은 것을 확인하였다(도 4).

이에, 본 발명에서 분리동정한 신규한 균주를 클루이베로마이세스 막시아누스 MJ1으로 명명하고 젖산 생산을 위한 균주로 선정하였다.

상기와 같이 선별된 균주를 한국생명공학연구원의 생물자원센터(KCTC)에 2014년 6월 11일 기탁하여, 수탁번호 KCTC18286P를 부여받았다.

실시예 4. 클루이베로마이세스 막시아누스 MJ1의 오로티딘 5인산 탈탄산효소 (URA3) 유전자 결실 균주의 제작

MJ1 균주를 젖산 생산 균주로 제작하기 위하여 형질전환시스템을 구축하였다. 우선 선별마커로 반복사용이 가능한 URA3 유전자를 선별마커로 사용하기 위해서 우라실 영양요구성 MJ1 균주를 제작하였다. MJ1 균주는 이배체(diploid) 형태로 존재하므로 2 카피의 URA3 (orotidine 5-phosphate decarboxylase) 유전자가 존재함에 따라, 우라실 영양요구성 균주를 제작하기 위해 2 카피의 URA3 유전자를 모두 결실시켰다.

첫 번째 URA3 유전자는 항생제 표지인 zeocin 저항성 유전자를 선별표지로 사용하였고, 두 번째 URA3 유전자는 항생 펩티드 Nourseothricin에 대한 저항성 유전자(Nourseothricin acetyl transferase, NAT)를 이용하였다. 먼저 MJ1 균주의 genome DNA를 주형으로 하여 URA3 ORF의 업스트림(upstream) 300 bp의 DNA 절편을 HJ503(서열번호 6) 및 HJ504(서열번호 7) 프라이머로, 다운스트림(downstream)의 300 bp의 DNA 절편은 HJ505(서열번호 8) 및 HJ506(서열번호 9)을 이용하여 PCR을 통해 증폭하였다. 업스트림 DNA 절편과 다운스트림 DNA 절편을 항생제인 zeocin에 대한 저항성 유전자와 연결하기 위해 프라이머 HJ324 (서열번호 10) 및 HJ325 (서열번호 11)를 이용하여 zeocin 저항성 유전자를 증폭하였고, 프라이머 HJ503 및 HJ506을 이용하여 overlap extention PCR을 통해 3개의 DNA 조각을 연결하였으며, 전기영동을 통해 확인하였다(도 5).

PCR을 통해 증폭된 절편을 MJ1 균주에 형질전환하기 위해 전기천공법(electroporation)을 이용하였다. 형질전환된 세포는 100㎍/ml zeocin이 함유된 YPD 배지에 도말하여 형질전환체를 선별하였다.

형질전환 여부를 프라이머 HJ324 및 HJ507 (서열번호 12)을 이용하여 PCR을 통해 확인한 결과 zeocin 카세트는 URA3 locus에 형질전환 되었으나, 1개의 URA3 유전자가 더 남아있는 것을 확인하였다. 따라서 남아있는 URA3 유전자를 결실시키고자 zeocin 카세트에서와 동일한 과정으로 NAT 카세트를 제작하였다.

먼저 클루이베로마이세스 막시아누스 MJ1 균주 genome DNA를 주형으로 하여 MJ376 (서열번호 13) 및 MJ377 (서열번호 14) 프라이머 쌍과 MJ380 (서열번호 15) 및 MJ381 (서열번호 16) 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 통해 URA3 ORF의 업스트림과 다운스트림의 300 bp의 DNA 절편을 증폭하였다. 업스트림 DNA 절편과 다운스트림 DNA 절편을 NAT 유전자와 연결하기 위해 프라이머 MJ378 (서열번호 17) 및MJ379 (서열번호 18)를 이용하여 NAT 유전자를 증폭하였고, 프라이머 MJ376 및MJ381을 이용하여 overlap extention PCR을 통해 3개의 DNA 절편을 연결하였으며, 전기영동을 통해 확인하였다(도 6).

얻어진 PCR 절편을 zeocin 카세트가 삽입되어 있는 MJ1 균주에 전기천공법 을 이용하여 50㎍/ml NTC가 함유된 YPD 배지에 도말하여 형질전환체를 선별하였다. 형질전환 여부를 MJ386 (서열번호 19) 및 HJ507 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 통해 확인한 결과 예상되는 위치에서 PCR 절편을 확인하여 NAT 카세트가 URA3 locus에 삽입되었음을 확인하였다.

zeocin 카세트와 NAT 카세트가 삽입된 형질전환체를 우라실이 없는 최소 배지(0.67% 아미노산이 결여된 효모기질, 0.77% 우라실이 결핍된 영양보충물, 2% 글루코스)에 도말 후 배양한 결과 전혀 성장하지 못하는 것을 확인하였다. URA3 유전자가 결실되면 우라실을 합성할 수 없어 최소배지에서 성장하지 못하므로 선별된 형질전환체는 URA3 유전자가 모두 결실된 것을 확인하였다 (도 7). 또한, URA3 유전자 결실에 사용한 프라이머들은 하기 표 2에 정리하였다.

상기와 같은 방법으로 URA3 유전자를 결실시켜 제조한 균주를 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국생명공학연구원의 생물자원센터(KCTC)에 2014년 6월 11일 기탁하여, 수탁번호 KCTC18287P를 부여받았다.

실시예 5. 클루이베로마이세스 막시아누스 MJ1의 PDC1 유전자 결실 균주의 제작

에탄올 발효 경로가 봉쇄된 균주를 제작하기 위하여 MJ1 균주에 존재하는 피루베이트 탈탄산 효소 유전자 (PDC1)(서열번호 33)를 불활성화시켰다. 사카로마이세스 세레비지에와는 달리 클루이베로마이세스 막시아누스 균주는 하나의 PDC1 유전자를 가지고 있지만 이배체 형태로 존재하므로 2 카피의 PDC1 유전자를 모두 결실시켰다.

MJ1 균주의 PDC1 유전자를 결실시키기 위해 genome DNA를 주형으로 하여 PDC1 ORF의 업스트림과 다운스트림에서 각 300 bp의 DNA 절편을 MJ464 (서열번호 20) 및 MJ465 (서열번호 21)의 프라이머 쌍과 MJ466 (서열번호 22) 및 MJ467 (서열번호 23)의 프라이머 쌍으로 PCR을 통해 증폭한 후, Tc-f (서열번호 24) 및 U200r (서열번호 25)의 프라이머 쌍과 U200f (서열번호 26) 및 Tc-r (서열번호 27)의 프라이머 쌍을 이용하여 증폭된 사카로마이세스 세레비지에 URA3 DNA절편과 overlap extention PCR을 수행하였다 (도 8).

2개의 PCR 산물을 ura3::ZEO,NAT 균주에 도입하여 형질전환시켰으며, PDC1 locus에 상기 PCR 산물이 도입된 균주를 우라실이 없는 선택배지 (0.67% 아미노산이 결여된 효모기질, 0.77% 우라실이 결핍된 영양보충물, 2% 글루코스)에서 선별하였다. 형질전환 여부를 프라이머 MJ464 및 MJ468 (서열번호 28)을 이용하여 PCR을 통해 확인한 결과 예상되는 위치에서 PCR 절편을 확인하였다 (도 9). PDC1 유전자가 남아있는지 확인하기 위해 HJ469 (서열번호 29)와 HJ468 프라이머를 이용하여 PCR을 통해 확인한 결과 PDC1 유전자 1 카피가 결실되었음을 확인하였다.

남아있는 1 카피 PDC1 유전자 제거도 URA3를 선별마커로 사용하기 위하여 pop-out을 통해 URA3 유전자를 제거하였다. MJ1Δpdc1(1copy) 균주에 남아있는 1 카피 PDC1 유전자를 결실시키기 위하여 상기 제작된 URA3 카세트를 이용하여 동일과정으로 수행되었고 최종적으로 2 카피 PDC1 유전자가 모두 결실된 균주를 얻었다. 또한, PDC1 유전자 결실에 사용한 프라이머들은 하기 표 3에 정리하였다.

상기와 같은 방법으로 PDC1 유전자를 결실시켜 제조한 균주를 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국생명공학연구원의 생물자원센터(KCTC)에 2014년 6월 11일 기탁하여, 수탁번호 KCTC18288P를 부여받았다.

실시예 6. PDC1 결실 균주의 에탄올 발효여부 확인

에탄올 발효를 통하여 PDC1 결실 변이 균주의 에탄올 생산 여부를 확인하였다. 각 균주들을 최소 영양배지에서 24시간 전배양 후 50g/L 글루코스가 첨가된 에탄올 발효배지(0.5% 효모 추출물, 0.5% 펩톤, KH₂PO₄, 0.2% Ammonia sulfate, 0.04% MgSO₄H₂O)에서 30℃, 110 rpm으로 배양하였으며 세포성장과 생성된 에탄올을 HPLC 분석을 통해 확인하였다.

그 결과 1 카피만 결실된 pdc1 균주의 경우 피루베이트가 에탄올로 전환되는 과정을 완벽하게 봉쇄할 수 없어 야생형 균주와 큰 차이없이 에탄올이 생성되었으며, 2 카피가 모두 결실된 균주의 경우 야생형 균주에 비해 세포성장이 50% 정도 감소했지만 에탄올을 전혀 생성하지 않는 것을 확인하였다. 또한, 2 카피가 모두 결실된 균주의 경우 글루코스 소비량 역시 거의 나타나지 않음을 알 수 있었다(도 10).

균주 성장의 감소는 NAD⁺/NADH의 불균형에 의한 것으로 LDH 유전자를 발현하면 젖산 발효가 에탄올 발효를 대신하여 NAD⁺/NADH 불균형을 해소하여, pdc1 결실 균주에서 발생한 성장저하 문제는 해결할 수 있을 것으로 기대하여 이후 실험을 진행하였다.

실시예 7. 클루이베로마이세스 막시아누스 MJ1 균주에서의 D-젖산 탈수소 효소(LDH) 유전자 도입 및 발현확인

MJ1 균주에서 D-젖산 탈수소효소(LDH) 유전자를 발현하기 위해 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 유래 LDH 유전자(서열번호 32)가 도입된 발현 벡터를 제작하였다. L-LDH 유전자 대신 D-LDH 유전자를 사용한 이유는 클루이베로마이세스 막시아누스에서 D-젖산의 생산성이 L-젖산보다 낮았기 때문에 D-LDH 유전자를 우선적으로 확인하고자 하였다. LDH 유전자가 클루이베로마이세스 막시아누스 유래의 translation elongation factor (TEF) 프로모터에 의하여 발현되는 벡터이며 선별 표시 유전자로는 클루이베로마이세스 막시아누스 유래의 URA3 유전자를 포함하고 있는 integration 벡터임에 착안하여, pTEF-D-LDH 벡터를 사용하였다. 상기 벡터를 클루이베로마이세스 막시아누스 URA3 유전자에 위치하는 제한 효소인 NheⅠ으로 처리한 후 형질전환에 이용하여, 염색체상에 존재하는 클루이베로마이세스 막시아누스 URA3 유전자 위치로 도입되도록 하였다.

제조된 형질전환체를 SD-Ura 배지에서 일차 선별한 후 선별된 단일 균주의 genome DNA를 분리하여 HJ594 (서열번호 30) 및 HJ660 (서열번호 31) 프라이머를 이용하여, PCR을 통하여 도입된 벡터가 염색체로 도입되었음을 확인하였다 (도 11).

상기와 같은 방법으로 LDH 유전자 (서열번호 32)를 도입하여 제조한 균주를 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국생명공학연구원의 생물자원센터(KCTC)에 2014년 6월 11일 기탁하여, 수탁번호 KCTC18289P를 부여받았다.

실시예 8. 내산성 균주의 젖산 생산성 비교

상기 실시예 7에서 제작한 LDH 유전자가 도입된 MJ1 pdc1 결실 균주의 D-형의 젖산 생산성을 대조구인 종래의 K. marxianus 25571Δpdc1/LpLDH 균주와 비교하였다. 각 균주들을 YPD 배지에서 진탕배양하여 세포성장 단계를 거친 후 YPD10 (1% 효모추출물, 2% 펩톤, 10% 포도당)에 접종하여 35℃, 80 rpm에서 칼슘 카보네이트를 첨가하여 pH를 조절하는 조건과 pH를 조절하지 않는 조건에서 각각 배양을 수행하였다.

HPLC를 통하여 소모된 글루코스와 젖산 생산량을 확인한 결과 pH를 조절하는 조건에서는 상기 두 균주 모두 배양시간이 지남에 따라 젖산 생산량도 증가하고 있으며 25571Δpdc1/LDH 균주가 MJ1Δpdc1/LDH보다 약 3.5배 높은 젖산 생산성을 보였다.

그러나 pH를 조절하지 않는 조건에서는, 25571Δpdc1/LDH 균주의 경우 배양 48시간 이후로 젖산 생산이 감소되는 반면, 본원발명의 내산성이 강한 균주인 MJ1Δpdc1/LDH 균주는 젖산 생산으로 인해 낮아진 pH 조건에서도 젖산의 생산량이 증가하였으며 최대 6g/L가 생산되는 것을 확인하였다.

즉, pH를 조절을 하지 않은 조건에서는 25571균주보다 MJ1Δpdc1/LDH 균주가 균주의 내산성으로 인해, 산성 환경에서도 생산 효율이 우수한 것을 확인하였다(도12).

실시예 9. 2단계 배양 조건을 이용한 교반 속도에 따른 젖산 생산성 확인

균주 성장단계 이후 젖산생산 전환 시 호기성 조건에서 배양을 진행 하지만 교반속도에 따라 젖산 생산에 영향을 미칠 수 있다고 판단하여 MJ1Δpdc1/LDH 균주를 50ml YPD (1% 효모추출물, 2% 펩톤, 2% 포도당)배지에 접종 후 30℃, 180rpm으로 약 15시간 세포 농도가 OD₆₀₀=7일 때까지 진탕 배양하여 균체를 회수한 후 50ml YPD10 (1% 효모추출물, 2% 펩톤, 10% 포도당)배지에 접종하고 배양온도는 35℃에서 80, 120, 160 rpm 으로 교반하면서 젖산 생산성을 확인하였다.

그 결과, MJ1Δpdc1/LDH 균주의 경우 교반 속도가 높을수록 세포성장이 증가하였고 세포성장에 비례하여 호기성 조건인 160 rpm일 때 가장 높은 젖산 생산성 (9.4g/L)을 보였다. 그러나 25571Δpdc1/LDH 균주의 경우, pH 전범위에서 MJ1Δpdc1/LDH에 비해 낮은 세포성장을 보였고 젖산 생산은 40시간 이후에 정체되는 것을 확인하였다.

따라서 MJ1 균주는 기존 균주와 달리 세포 성장과 동시에 젖산 생산이 가능한 균주임을 확인하였다 (도 13).

실시예 10. 2단계 배양 조건을 이용하여 초기 균체량과 글루코스 농도에 따른 생산성 확인

상기 실시예 9에서 확인한 최적의 교반 속도에 더하여, 젖산 생산량을 높이기 위해 초기 균체량이 중요할 것으로 판단되어 세포 배양 후 젖산 생산 전환시 균체 농도를 OD₆₀₀의 값을 7에서 12로 높여 생산성을 비교하였다. 또한, 균주가 10%의 기질을 다 이용하지 못하기 때문에 글루코스 농도를 5%와 2.5%로 줄여서 젖산 생산성을 비교하였다.

그 결과, 표 6에서 보는바와 같이 초기 접종 농도에 따른 젖산 생산성은 크게 차이를 보이지 않았으나 글루코스 농도에 따른 젖산 생산량은 차이를 보였다. 2.5% 글루코스 농도에서는 배양 120시간 동안 글루코스를 거의 다 소모하여 6 내지 7.4 g/L의 생산성을 보였지만 5% 글루코스 농도보다 생산성은 낮은 결과를 얻었다.

따라서 2단계 배양조건에서 젖산을 생산할 경우 초기 세포농도(OD₆₀₀)는 7, 5% 글루코스, 160rpm에서 실시하는 것이 젖산 생산을 위한 최적 조건임을 확인하였다(도 14).

실시예 11. 1단계 배양조건을 이용한 젖산 생산시 교반속도에 따른 생산량 비교

본원발명의 내산성 균주는 균주 배양단계와 젖산 생산 단계를 구분하지 않고 젖산 생산이 가능하기 때문에, pH를 조절하지 않으면서 젖산을 생산하는데 최적의 조건을 확인하기 위해 교반 속도를 달리하여 플라스크 배양하였다.

본원발명의 MJ1Δpdc1/LDH 균주를 YPD5 배지에 초기 세포농도가 1이 되도록 접종한 후 35℃에서 80, 160, 200 rpm으로 120시간 동안 배양하였다.

그 결과 160rpm에서 배양한 경우에 가장 높은 균체 성장을 확인하였지만 젖산 생산량은 160과 200rpm 모두 10g/L로 동일한 결과 값을 얻었다. 그러나 160rpm보다 200rpm에서 글루코스 소모가 적어 젖산 생산량은 동일하지만, 결과적으로 200 rpm에서 더 높은 수율을 얻었다(도 15).

실시예 12. 1단계 배양조건을 이용한 젖산 생산시 배양 온도에 따른 생산량 비교

균주 성장 단계와 젖산 전환 단계를 통합한 1단계 배양을 위한 최적의 생산 온도를 확인하기 위해, 내산성 균주 MJ1Δpdc1/LDH와 대조군 25571Δpdc1/LDH 균주를 YPD 배지에서 전배양 후 YPD5 (1% 효모추출물, 2% 펩톤, 5% 글루코스) 배지에 초기 접종량이 1이 되도록 하고 30℃, 35℃, 40℃에서 200 rpm으로 교반하면서 120시간 동안 배양하였다.

그 결과, 25571Δpdc1/LDH 균주의 경우 최적 생장온도인 30℃에서 가장 많은 젖산이 생산되었으나 최대 3.8g/l로 아주 낮은 생산성을 보였고, 35℃에서는 균체는 지속적으로 성장하지만 젖산을 거의 생산하지 못하는 것을 확인하였다. 즉, 25571Δpdc1/LDH는 균주 배양과 젖산 전환 단계의 구분이 필요한 것을 확인하였다.

반면, 본원발명의 MJ1Δpdc1/LDH 균주는 내열성이 있어서 30℃보다 35℃에서 젖산 생산성이 높아 고온에서도 안정적으로 생산이 가능한 것을 확인했으며 배양 120시간까지 젖산 생산량이 증가하여 최대 7.7g/l의 생산성을 확인하였다(도 16).

실시예 13. 유가식 발효를 통한 젖산 생산

유가식 발효를 통해 pH를 3.0과 3.5로 유지했을 때 젖산 생산성을 확인하였다. MJ1Δpdc1/LDH 균주를 YPD (3% 효모추출물, 1.5% 펩톤, 5% 글루코스)에 접종시켜 35℃, 800rpm, pH 6.0에서 세포성장의 단계를 거친 후, 글루코스가 모두 소모된 24시간 후 40%의 글루코스(final 5%)를 추가적으로 공급하여 이를 젖산으로 전환하는 2단계 배양으로 발효를 진행하였다.

그 결과 배양 88시간까지 젖산 생산 농도가 증가하여 pH3.0과 3.5로 조절한 조건 모두 배양 88시간에서 최대 생산량을 보였으며 이후 젖산 생산이 감소하는 것을 확인하였다.

도 17에서 보는바와 같이 pH를 3.5로 조절한 조건에서 44.7g/L 글루코스를 소모하여 22.4g/L 젖산을 생산했으며 약 50%의 전환율을 얻었고 pH를 3.0으로 조절한 조건에서는 pH가 3.0으로 유지되기 시작하는 배양 54시간 이후부터 젖산 생산 증가량이 많지 않아 pH 3.5로 조절한 조건보다 낮은 18.7g/L 젖산을 생산하였다(도 17).

실시예 14. 회분 배양식 발효를 통한 젖산 생산

MJ1Δpdc1/LDH는 균주 성장 단계와 젖산 전환 단계를 통합한 1단계 배양을 통해서도 젖산 생산이 가능하기 때문에 회분식 발효를 통해 젖산 생산을 확인해 보고자 하였다. MJ1Δpdc1/LDH 균주를 YPD10 (3% 효모추출물, 1.5% 펩톤, 10% 글루코스)에 접종하여 35℃, 400rpm, 2vvm 조건으로 114시간 동안 발효를 진행했으며 유가 배양식 발효와 동일하게 pH는 3.0과 3.5로 각각 조절하였다. pH를 3.0으로 조절한 발효에서는 배양 64시간 동안 50g/L 글루코스를 모두 소모하여 글루코스를 한번 더 공급해 주었다. 이에, pH 3.5인 조건에서는 초기 글루코스 농도를 100 g/L로 공급하였다.

pH를 3.0으로 조절 했을 때 114시간 동안 56.3g/L 글루코스를 소모하여 17.9g/L의 젖산을 생산했고 31.7%의 전환율을 보였다. 또한, pH를 3.5로 조절하여 젖산을 생산하였을 때에는, 20.8 g/L 젖산을 생산하여 최종적으로 25.5%의 전환율을 보였다 (도 18).

실시예 15. 글리세롤을 이용한 MJ1Δpdc1 / LDH 균주의 젖산 생산

글리세롤이 젖산 생산에 미치는 영향을 확인해 보기 위해 MJ1Δpdc1/LDH 균주를 다양한 농도의 글리세롤을 포함하는 배지에서 1단계 배양으로 젖산 생산을 비교하였다. 4% 포도당을 함유하고 0~2% 글리세롤을 포함한 YPD(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 4% 포도당) 액체 배지에 OD₆₀₀=1이 되도록 균체를 접종한 후 35℃, 160 rpm으로 120 시간동안 pH를 조절하지 않는 조건에서 배양하였다.

그 결과, 상기 표 11에서 볼 수 있듯이, 글리세롤만 첨가하여 배양한 경우 가장 높은 세포성장을 보였으며, 첨가한 글리세롤을 배양 60 시간 안에 모두 소모하여 글리세롤을 탄소원으로 잘 이용하는 것을 확인하였다. 다만, 효모에서 글리세롤은 발효당이 아니므로 젖산은 생산되지 않았다.

그러나 포도당과 함께 글리세롤을 첨가했을 경우 글리세롤이 탄소원으로 사용되지는 않았지만 첨가해준 글리세롤 농도가 높을수록 젖산 생산량이 증가하였으며 포도당만 탄소원으로 하여 배양한 대조구보다 40% 이상 (2.2~2.8g/L) 젖산 생산량이 증가하였다(표 11, 도 19).

글리세롤이 포도당과 함께 존재하는 경우에 글리세롤을 탄소원으로 사용하지 못하는 이유는 포도당에 의한 catabolite repression 때문이며, 글리세롤의 젖산 생산 증진 효과의 이유는 명확하지 않으나 삼투 조절제로 작용하여 산성 조건에서 균주의 안정성에 도움을 주거나 고농도 젖산 생산으로 유발되는 세포내 조효소 비균형 문제를 부분적으로 해결하기 때문으로 사료된다.

상기와 같은 결과들을 종합해볼 때, 본 발명의 신규한 균주인 클루이베로마이세스 막시아누스 MJ1은 우수한 내산성 및 내열성을 나타냄으로써 피루베이트 탈탄산 효소의 불활성화 또는 D-젖산 탈수소효소(LDH) 유전자를 도입하였을 때, 우수한 젖산 생산성을 나타내는 것을 알 수 있었다.

즉, 본 발명의 신규한 클루이베로마이세스 막시아누스 MJ1 균주는 우수한 내산성 및 내열성을 가지므로, D-젖산 또는 L-젖산을 다양한 조건하의 공장 스케일에서도 생산할 수 있는 모균주임을 확인할 수 있었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국생명공학연구원 KCTC18286P 20140611 한국생명공학연구원 KCTC18287P 20140611 한국생명공학연구원 KCTC18288P 20140611 한국생명공학연구원 KCTC18289P 20140611

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Novel Kluyveromyces marxianus MJ1 and use thereof <130> KPA140623-KR-P1 <150> KR10-2014-0075459 <151> 2014-06-20 <160> 33 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1086 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence containing ITS1, 5.8S rRNA, ITS2, and 28S rRNA <400> 1 gcgcatctga aaagtcgcaa tcctcagtcc cagctggctg tattcccacg ggctataaca 60 ctctaccgaa gcagagccac attcccgagg atttatccaa ccgctaaaac tgatgctggc 120 ccagcgaaag ccgaagcaaa cgccatgtct gatcaaatgc ccttcccttt caacaatttc 180 acgtactttt tcactctctt ttcaaagttc ttttcatctt tccatcactg tacttgttcg 240 ctatcggtct ctcgccaata tttagcttta gatggaattt accacccact tagagctgca 300 ttcccaaaca actcgactcg tcgaaagcac tttacaaata actgggatcc tcgccacacg 360 ggattctcac cctctatgac gtcctgttcc aaggaacata gacaaggacc agctacaaag 420 tcgccttctt caaattacaa ctcggacgtc gaagacgcca gatttcaaat ttgagctttt 480 gccgcttcac tcgccgttac taaggcaatc ccggttggtt tcttttcctc cgcttattga 540 tatgcttaag 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600 gttatcacgt tacacgttcc tgcattgaag gataactacc acatgttgaa tgcggatgcc 660 ttcagcaaga tgaaagatgg cgcctacatc ttgaactttg ctcgtgggac actcatcgat 720 tcagaagact tgatcaaagc cttagacagt ggcaaagttg ccggtgccgc tcttgatacg 780 tatgaatacg aaactaagat cttcaacaaa gaccttgaag gtcaaacgat tgatgacaag 840 gtcttcatga acttgttcaa ccgcgacaat gttttgatta caccacatac ggctttctac 900 actgaaactg ccgttcacaa catggtgcac gtttcaatga acagtaacaa acaattcatc 960 gaaactggta aagctgatac gcaagttaag tttgactaa 999 <210> 33 <211> 1695 <212> DNA <213> Kluyveromyces marxianus MJ1 <220> <221> gene <222> (1)..(1695) <223> Pyruvate Decarboxylase <400> 33 atgtctgaaa ttactctagg tcgttacttg ttcgaaagat taaagcaagt cgaagtccaa 60 accatcttcg gtttgccagg tgacttcaac ttgtccctat tggacaagat ctacgaagtc 120 ccaggtatga gatgggctgg taacgctaac gaattgaacg ctgcttacgc tgctgatggt 180 tacgccagat taaagggtat ggcctgtgtc atcaccacct tcggtgttgg tgaattgtct 240 gccttgaacg gtattgccgg ttcttacgct gaacacgttg gtgttttgca cgttgttggt 300 gttccatcca tctcttccca agctaagcaa ttgttgttgc 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Claims (15)

1. 기탁번호 KCTC18286P의 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) MJ1 균주.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 균주는 오로티딘 5인산 탈탄산 효소(orotidine 5-phosphate decarboxylase) 활성이 추가로 불활성화된 것인 균주.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 균주는 기탁번호 KCTC18287P인, 균주.
   
4. 제2항에 있어서,
   상기 균주는 피루베이트 탈탄산 효소(Pyruvate Decarboxylase) 활성이 추가로 불활성화된 것인, 균주.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 균주는 기탁번호 KCTC18288P인, 균주.
   
6. 제4항에 있어서,
   상기 균주는 젖산 탈수소 효소(lactate dehydrogenase) 활성이 추가로 도입된, 균주.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 균주는 기탁번호 KCTC18289P인, 균주.
   
8. 제1항에 있어서, 상기 균주는 세포 성장과 동시에 젖산을 제조할 수 있는 것인, 균주.
   
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 균주 또는 이의 배양물을 포함하는, 젖산 생산용 조성물.
   
10. 제1항의 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 젖산 제조 방법.
    
11. 제10항에 있어서, 상기 균주를 배양하는 단계는 글루코스(Glucose)를 영양원으로 하는 것인, 방법.
    
12. 제10항에 있어서, 상기 젖산은 D-젖산인, 방법.
    
13. 제10항에 있어서, 상기 젖산의 제조는 중화제를 첨가하지 않는 조건하에서 수행하는 것인, 방법.
    
14. 제10항에 있어서, 상기 젖산의 제조는 글리세롤을 포함하는 조건에서 수행하는것인 방법.
    
15. 제14항에 있어서, 상기 글리세롤의 농도는 1~10% 에서 젖산을 생산하는 것인 방법.
    
    
    

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