CN106536543B - 产生(s)-乳酸的嗜热细菌的遗传修饰 - Google Patents

产生(s)-乳酸的嗜热细菌的遗传修饰 Download PDF

Info

Publication number
CN106536543B
CN106536543B CN201580039353.5A CN201580039353A CN106536543B CN 106536543 B CN106536543 B CN 106536543B CN 201580039353 A CN201580039353 A CN 201580039353A CN 106536543 B CN106536543 B CN 106536543B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ala
leu
lys
glu
ile
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201580039353.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106536543A (zh
Inventor
R·范科拉南伯格
A·福尔霍夫
M·P·马歇尔森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Purac Biochem BV
Original Assignee
Purac Biochem BV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Purac Biochem BV filed Critical Purac Biochem BV
Publication of CN106536543A publication Critical patent/CN106536543A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106536543B publication Critical patent/CN106536543B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/56—Lactic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01008—Phosphate acetyltransferase (2.3.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01054—Formate C-acetyltransferase (2.3.1.54), i.e. pyruvate formate-lyase or PFL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/03—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on phosphates (4.2.3)
    • C12Y402/03003—Methylglyoxal synthase (4.2.3.3)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及兼性厌氧并且产生(S)‑乳酸的遗传工程化的嗜热细菌细胞，其包含内源性甲基乙二醛合成酶基因mgsA的失活或缺失。

Description

产生(S)-乳酸的嗜热细菌的遗传修饰
本发明涉及修饰用于同型乳酸(homolactic)和对映体纯(enantiopure)(S)-乳酸生产的嗜热细菌细胞、遗传修饰的细胞和生产对映体纯(S)-乳酸的方法。
乳酸及其盐(称为乳酸盐)是可用于各种领域(包括医药、生物可降解聚合物和食品加工)的商业上可行的产品。兼性厌氧的嗜热细菌(例如土芽孢杆菌属(Geobacillus))似乎是乳酸工业制造的理想生物体。它们能够在37-75℃的温度下生长，最佳温度为55-65℃(Nazina等人,2001,Int.J.Syst.Evol.Microbiol.51:433-446)，并且允许在高于50℃的温度下的厌氧工业发酵。当工业规模发酵时，该高温具有几个优点：较小的感染风险和因此更高的对映体纯度，更快的反应，更低的冷却成本等。土芽孢杆菌的兼性厌氧性质允许在厌氧条件下或至少在低的氧分压下发酵，其对于工业规模是期望的，因为其允许相对便宜的设备和加工。此外，这些细菌的营养需求比也允许相对便宜的工业过程的乳酸菌(诸如乳杆菌属(Lactobacillus)物种)的营养需求要求更低。
当在厌氧条件下或至少在低氧分压下生长时，已知兼性厌氧的土芽孢杆菌属物种产生乳酸。实例是热坚土芽孢杆菌(G.caldotenax)，G.caldoxylosilyticus，G.debilis，嗜热土芽孢杆菌(G.kaustophilus)，苍白土芽孢杆菌(G.pallidus)，嗜热脂肪土芽孢杆菌(G.stearothermophilus)，G.tepidimans，热反硝化土芽孢杆菌(G.thermodenitrificans)，热葡糖苷酶土芽孢杆菌(G.thermoglucosidans)，喜热土芽孢杆菌(G.thermoleovorans)，G.toebii，热带土芽孢杆菌(G.tropicalis)。
热葡糖苷酶土芽孢杆菌可从木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、果糖、蔗糖和纤维二糖产生乳酸(Green等人，2003，WO03/008601)。对于工业应用，含有蔗糖、葡萄糖、木糖或阿拉伯糖或其混合物的原料是最相关的。同时利用葡萄糖和木糖的能力(Green等人，2003，WO03/008601)是热葡糖苷酶土芽孢杆菌在使用来源于木质纤维素原料的可发酵糖时的重要优点。
已知的兼性厌氧的土芽孢杆菌属物种的一个缺点是它们具有混合酸发酵的事实，产生乳酸、乙醇、乙酸和甲酸作为主要发酵产物。在本申请中，术语有机酸还意在也包括其相应的盐。
另一个缺点是大多数物种不产生对映体纯的乳酸。手性纯度是制备聚乳酸聚合物的重要方面。因此，必要的是生产对映体纯的(S)-乳酸用于商业应用。然而，迄今为止关于由土芽孢杆菌属物种产生的乳酸的对映体纯度的信息有限。应当理解，(S)-乳酸的其它术语是L-乳酸或L(+)-乳酸。在本申请中，这些术语可互换使用。类似地，术语(R)-乳酸、D-乳酸和D(-)-乳酸可互换使用。
Payton&Hartley显示嗜热脂肪土芽孢杆菌PSII当在非pH受控的摇瓶条件下在葡萄糖上生长时具有产生(S)-乳酸、乙酸和乙醇的混合酸发酵特征(Payton&Hartley,1985,FEMS Microbiol.Lett.26:333-336)。没有提及手性纯度。后来的研究表明，PSII及其衍生体对嗜热脂肪芽孢杆菌是非典型的，并且似乎与热坚土芽孢杆菌更密切相关(Amartey等人,1991,Biotechnol.Lett.13:621-626；Green等人,2001,WO 01/49865)。低产率使得该菌株不适合工业应用。
Danner等人显示嗜热脂肪土芽孢杆菌IFA6和IFA9从蔗糖和葡萄糖产生(S)-乳酸(Danner等人,1998,Appl.Biochem.Biotechnol.70-72:895-903)。菌株IFA6从葡萄糖产生显著量的乙醇、乙酸和甲酸副产物，而菌株IFA9不产生。当在葡萄糖上生长时，报道了IFA6的99.22-99.85％和IFA9的99.4％的手性纯度(Danner等人,1998,Appl.Biochem.Biotechnol.70-72:895-903)。培养条件基于使用含有酵母提取物和酪蛋白胨的丰富培养基，其不是工业生产所需要的。与菌株IFA6相比，菌株IFA9在较高产物浓度下具有降低的生产力，从而使其不太适合工业生产。此外，菌株IFA6具有低产率，使其也不适合工业生产。
Rao&Satyanarayana显示用喜热土芽孢杆菌产生乳酸，但未评论产率和手性纯度(Rao&Satyanarayana,2009,Appl.Biochem.Biotechnol.159:464-477)。
Green等人公开了在非pH受控的摇瓶条件下用热葡糖苷酶土芽孢杆菌LN-9产生(S)-乳酸，手性纯度为99.2％和产率为0.7g/g(Green等人，2003，WO 03/008601)。低产率使其不适合工业应用。
Atkinson等人显示用热葡糖苷酶土芽孢杆菌NCIMB 11955从木糖或葡萄糖产生乳酸，具有显著量的乙醇、乙酸和甲酸副产物(Atkinson等人,2006,WO 2006/117536)。葡萄糖的产率为0.64g/g，其对于工业应用而言太低。没有公开手性纯度。
Tang等人证明用热葡糖苷酶土芽孢杆菌M10EXG产生(S)-乳酸。在微需氧条件下，乳酸是主要产物，其中乙酸、乙醇和甲酸是显著的副产物。在厌氧条件下，甲酸是主要产物，其中乳酸、乙酸和乙醇为主要副产物。所描述的产率对于工业应用来说太低。据报道，(S)-乳酸的手性纯度>99％(Tang等人,2009,Biotechnol.Lett.102:1377-1386)。
热葡糖苷酶土芽孢杆菌被描述为嗜热芽孢杆菌属(Bacillus)物种(Suzuki等人,1983,Syst.Appl.Microbiol.4:487-495；Nazina等人,2001,Int.J.Syst.Evol.Microbiol.51:433-446；Coorevits等人,2012,Int.Syst.Evol.Microbiol.62:14770-1485)。热葡糖苷酶土芽孢杆菌先前已知为热葡糖苷酶芽孢杆菌(Bacillus thermoglucosidasius)(Suzuki等人,1983,Syst.Appl.Microbiol.4:487-495)，其由Nazina等人于2001年重命名为热葡糖苷酶土芽孢杆菌(G.thermoglucosidasius)(Nazina等人,2001,Int.J.Syst.Evol.Microbiol.51:433-446)，并且后来由Coorevits等人重命名为热葡糖苷酶土芽孢杆菌(G.thermoglucosidans)(Coorevits等人,2012,Int.Syst.Evol.Microbiol.62:14770-1485)。从土壤中分离该类型的菌株(Suzuki等人,1976,Appl.Environ.Microbiol.31:807-812)。尽管最初报道为严格需氧的，但后来的研究报道兼性厌氧生长和(S)-乳酸生产(Green等人,2003,WO 03/008601；Fong等人,2006,Extremophiles 10:363-372)。温度范围为42至69℃，最佳为62℃(Suzuki等人,1983,Syst.Appl.Microbiol.4:487-495)。已经报道了用于乙醇生产的热葡糖苷酶土芽孢杆菌菌株的遗传修饰(Green等人,2001,WO 01/49865；Atkinson等人,2008,WO08/038019)。这包括用于热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542T的遗传工具和破坏L-乳酸脱氢酶(ldh)基因的方法的描述(Atkinson等人,2006,WO2006/117536和2008,WO2008/038019)。已报道了热葡糖苷酶土芽孢杆菌M10EXG的在木糖和葡萄糖上生长的细胞的代谢途径和通量(Tang等人2009,Biotechnol.Lett.102:1377-1386)。
在我们的实验室中，我们观察到由热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM2542产生的酸的手性纯度可以取决于培养基组成和/或糖源而变化。我们已经看到89％至>99％的(S)-乳酸手性纯度。然而，为了底物选择和培养基组成的灵活性，需要在所有工业相关条件下产生对映纯的(S)-乳酸的衍生体。
从上述可以得出结论，已知的土芽孢杆菌菌株具有混合酸发酵，并且不显示同型乳酸和对映体纯的乳酸产生。
显然需要能够使用对于工业应用具有吸引人的特征(例如低营养需要，广泛的糖消耗能力，生产碳水解酶的能力，高生长速率，高生产力，抗渗透胁迫和遗传可及性)的用于同型乳酸和对映体纯乳酸的生产的细菌菌株(例如土芽孢杆菌属菌株)。
本发明的一个目的是产生兼性厌氧的并通过同型乳酸发酵产生(S)-乳酸的嗜热细菌细胞。
本发明的另一个目的是产生兼性厌氧的并产生对映体纯的(S)-乳酸的嗜热细菌细胞。
在使用兼性厌氧的土芽孢杆菌属物种的乳酸生产中的(S)-乳酸产率和手性纯度可以取决于菌株和培养条件而变化。因此，需要改进的土芽孢杆菌，其被修饰以以同型乳酸方式产生手性纯的(S)-乳酸。
在文献中描述了可在乳酸生产中导致手性杂质的几种选择。(R)-乳酸可以通过D-乳酸脱氢酶的活性由丙酮酸盐形成，其可以通过乳酸消旋酶的活性由(S)-乳酸形成，或者其可以通过甲基乙二醛途径形成。
甲基乙二醛合成酶(E.C.4.2.99.11)在甲基乙二醛旁路的第一步中催化磷酸二羟丙酮转化为甲基乙二醛和正磷酸。接下来，甲基乙二醛可以通过两种不同的途径转化为(S)-或(R)-乳酸。因此，甲基乙二醛旁路可能是对于产生(S)-和(R)-乳酸的手性污染的来源。在大肠杆菌中，编码甲基乙二醛合成酶的mgsA基因的破坏改善了产生(S)-和(R)-乳酸的手性纯度(Grabar等人,2006,Biotechnol.Lett.28:1527-1535)在革兰氏阴性嗜温细菌大肠杆菌中，编码甲基乙二醛合成酶的mgsA基因的破坏改善了对于产生(S)-和(R)-乳酸的手性纯度(Grabar等人,2006,Biotechnol.Lett.28:1527-1535)。在革兰氏阳性菌中，对甲基乙二醛途径的活性知之甚少。在嗜温的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中，mgsA基因在与编码芽孢杆菌硫醇(bacillithiol)生物合成中的前两种酶的基因一起的操纵子中编码(Gaballa等人,2010,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 107:6482-6486；Helmann,2011,Antioxidants&Redox signaling 15:123-133)。最近，Chandrangsu等人已经证明芽孢杆菌硫醇参与甲基乙二醛解毒(Chandrangsu等人,2014,Mol.Microbiol.91:706-715)。芽孢杆菌硫醇依赖性甲基乙二醛途径利用乙二醛酶I(GlxA)和乙二醛酶II(FlxB)将甲基乙二醛转化为(R)-乳酸(Chandrangsu等人，2014)。此外，甲基乙二醛可以通过YdeA、YraA和YfkM(预测的乙二醛酶III的同源物)的活性转化为(R)-乳酸(Chandrangsu等人,2014,Mol.Microbiol.91:706-715)。
从热葡糖苷酶土芽孢杆菌的基因组序列，我们可以检索预测的D-乳酸脱氢酶基因，但没有明显的乳酸消旋酶基因。对于枯草芽孢杆菌中表征的甲基乙二醛至(R)-乳酸的转化的两种途径(Chandrangsu等人,2014,Mol.Microbiol.91:706-715)，热葡糖苷酶土芽孢杆菌中最接近的同源物具有非常低的氨基酸序列同一性(对于YwbC为46％；对于YurT为34％；对于YdeA未发现同源物；对于YraA为30％；对于YfkM为35％)。相比之下，枯草芽孢杆菌MgsA具有具有72％氨基酸序列同一性的热葡糖苷酶土芽孢杆菌同源物。基于基因组信息，可以预期(R)-乳酸生产由D-乳酸脱氢酶活性引起，而不是由乳酸消旋酶或甲基乙二醛途径引起。令人惊讶的是，我们能够通过破坏预测编码甲基乙二醛合成酶的mgsA基因来消除(R)-乳酸生产。
兼性厌氧的土芽孢杆菌属物种显示以乳酸、乙醇、乙酸和甲酸作为主要产物的混合酸发酵。编码在副产物生产中的必需酶的基因的破坏是改善所需产物生产的常用方法。然而，特定基因的破坏的影响取决于宿主的总体代谢而可能具有不同的副作用。编码丙酮酸甲酸裂解酶活化酶的大肠杆菌(Escherichia coli)pflA和编码双功能乙醛-CoA/醇脱氢酶复合物的adhE的单一突变导致伴随增加的丙酮酸副产物形成的改善的乳酸生产、残余乙酸和乙醇生产以及强烈降低的生物量产率(pflA-)或以乙酸作为主要发酵产物的改善的乳酸生产(adhE-)(Zhu&Shimizu,2005,Metab.Eng.7:104-115)。在几种大肠杆菌菌株中，focA-pflAB基因座已被破坏以消除甲酸产生(Zhou等人,2003,Appl.Environ.Microbiol.69:2237-2244；Liu等人,2011,Appl.Biochem.Biotechnol.164:162-169)。最近已经显示编码甲酸盐通道蛋白的focA在培养基中的乳酸积累中的重要性(Beyer等人,2013,J.Bacteriol.195:1428-1435)，因此它将促成具有focA-pflAB缺失的大肠杆菌菌株的表型。在绿藻莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中，编码丙酮酸甲酸裂解酶和醇脱氢酶的基因的敲除改善了乳酸发酵，但也增加了细胞外丙三醇和乙酸浓度(Catalanotti等人,2012,Plant Cell24:692-707)。
在热葡糖苷酶土芽孢杆菌中，pflBA基因趋同地定向于adhE基因。由于实际原因，我们决定通过在一个修饰中删除pflBA和部分adhE来破坏pflA、pflB和adhE。令人惊讶的是，我们能够几乎消除乙醇、乙酸和甲酸副产物形成，而不影响其它副产物并且不影响乳酸发酵性能。例如，在本申请中，副产物形成几乎被消除意味着通过发酵如本文所述的基因工程化细胞，副产物(例如乙醇，乙酸和甲酸)的重量相对于乳酸总产量为不超过10％(w/w)，特别是不超过5％，4％，3％或2％(w/w)。乳酸和副产物的量可以通过本领域已知的方法测定，例如，通过气液色谱法(GLC)或高效液相色谱法(HPLC)的衍生化和分析。
孢子生成缺陷是芽孢杆菌属物种的工业应用的期望性质。根据欧洲议会和理事会2009年5月6日关于遗传修饰的微生物的有节制的使用的指令2009/41/EC，应当根据其存在的对人类健康和环境的风险来对遗传修饰的微生物的有节制的使用进行分类。芽孢杆菌属物种的具有孢子生成缺陷型表型被认为是使在环境中扩散的风险最小化的手段。已知获得孢子生成缺陷型表型的不同方法，包括选择自发的孢子生成缺陷型衍生体(Green等人，2001，WO01/49865)或孢子生成途径的定向破坏，例如通过破坏spo0A(Gonzy-Tréboul等人,1992,J.Mol.Biol.244:967-979；Atkinson等人,2010,WO2010/052499)或sigF(Fleming等人,1995,Appl.Environ.Microbiol.61:3775-3780；Wang等人,2005,J.Appl.Microbiol.98:761-767；Kovács等人,2010,Appl.Environ.Microbiol.76:4085-4088)。
因此，在第一方面，本发明公开了兼性厌氧并且产生(S)-乳酸的遗传工程化的嗜热细菌细胞，其包含内源性甲基乙二醛合成酶基因mgsA的失活或缺失。
内源性基因是存在于微生物中的基因。不言而喻的是，如本文所述的其中基因被失活或缺失的细菌需要该基因固有地存在于细菌中。在没有相反指示的情况下，在本申请中，对基因的任何提及意指内源性基因。被引入微生物中的基因不是内源性基因。
在另一方面，提供了遗传工程化的细菌细胞，其是兼性厌氧的，并且其是同型乳酸的且以对映体纯的形式产生(S)-乳酸。
在本发明中，同型乳酸发酵通过从烃源产生乳酸而形成不超过15％(w/w)、优选不超过10％(w/w)、更优选不超过5％、4％、3％或2％(w/w)的副产物(如甲酸，乙酸和乙醇)来定义。该百分比涉及副产物的总重量相对于乳酸(包括(S)-乳酸和可能存在的任何(R)-乳酸)的总重量。乳酸和乙醇、乙酸和甲酸的量可以通过本领域已知的方法测定，例如，通过气液色谱法(GLC)或高效液相色谱法(HPLC)的衍生化和分析。
在几个实施方案中，基于甲酸、乙醇或乙酸的总重量相对于所产生的乳酸的总重量，所形成的甲酸、乙醇和乙酸中的至少一种的量不超过10％(w/w)，特别是不超过6％，1％，0.25％或0.1％(w/w)。换句话说，在同型乳酸发酵中形成的甲酸的重量可以是相对于乳酸的总重量的例如不超过10％(w/w)，更特别地不超过6％，1％，0.25％或0.1％(w/w)。类似地，乙醇的量可以不超过10％，6％，1％，0.25％或0.1％(w/w)，乙酸的量可以不超过10％，6％，1％，0.25％或0.1％(w/w)。
在本说明书中，mgsA是指甲基乙二醛合成酶基因，其对于热葡糖苷酶土芽孢杆菌的序列在SEQ ID NO：23中提供。编码的氨基酸序列提供于SEQ ID NO：24中。可以通过PCR引物SEQ ID NO 11、12、15和16鉴定侧接mgsA的核苷酸区域。
在另一方面，本发明涉及遗传工程化的嗜热细菌细胞，其中除了mgsA基因之外，内源性丙酮酸甲酸裂解酶A和/或B基因也被失活或缺失。
在优选的实施方案中，丙酮酸甲酸裂解酶基因通过丙酮酸甲酸裂解酶/醇脱氢酶基因座pflBA-adhE的失活或缺失而失活。或者，丙酮酸裂解酶A和/或B基因和醇脱氢酶基因adhE可以在单独的步骤中失活或缺失。侧接pflBA-adhE的核苷酸区域可以通过SEQ ID NO19-21的PCR引物来鉴定。
在本说明书中，用pflBA意指丙酮酸甲酸裂解酶基因A和B，分别编码丙酮酸甲酸裂解酶活化酶和丙酮酸甲酸裂解酶。
plfA是指丙酮酸甲酸裂解酶A基因(编码丙酮酸甲酸裂解酶活化酶)，其对于热葡糖苷酶土芽孢杆菌的序列在SEQ ID NO：27中提供。编码的氨基酸序列提供于SEQ ID NO：28。plfB是指丙酮酸甲酸裂解酶B基因(编码丙酮酸甲酸裂解酶)，其序列提供于SEQ ID NO：25中。编码的氨基酸序列提供于SEQ ID NO：26。在本发明中，adhE是指醇脱氢酶基因E，其编码双功能乙醛-CoA/醇脱氢酶复合物，其对于热葡糖苷酶土芽孢杆菌的序列提供于SEQ IDNO：29中。编码的氨基酸序列提供于SEQ ID NO：30。
在根据本发明的另一个实施方案中，在基因工程化的细胞中，内源性磷酸转乙酰酶基因(pta)也被失活或缺失。热葡糖苷酶土芽孢杆菌的pta的核苷酸序列提供于SEQ IDNO：31。编码的氨基酸序列提供于SEQ ID NO：32。pta(其编码磷酸转乙酰酶)的失活或缺失进一步使与内源pta活性相关的残余乙酸生成最小化。所得菌株(具有失活或缺失的pta)是乙酸的营养缺陷型。因此，当将该基因工程化的细胞发酵时，乙酸必须补充到生长培养基中。
在根据本发明的另一个实施方案中，遗传工程化的嗜热细菌细胞另外通过内源性孢子生成基因的失活或缺失而成为孢子生成缺陷型。
在另一个实施方案中，失活或缺失的孢子生成基因是sigF。
sigF是指孢子生成基因，其对于热葡糖苷酶土芽孢杆菌的核苷酸序列提供于SEQID NO：33中。编码的氨基酸序列提供于SEQ ID NO：34。侧接SigF的核苷酸序列可以通过PCR引物SEQ ID NO：3-6来鉴定。
在根据本发明的另一个实施方案中，在根据本发明的细胞中产生具有至少98％，更优选至少99％，99.5％，99.8％或99.9％的对映体纯度的(S)-乳酸。
在本发明的另一个实施方案中，在细胞中，通过同源重组使基因mgsA、pflBA-adhE或sigF的一个或多个失活或缺失。
在另一个实施方案中，根据本发明的遗传工程化的嗜热细菌细胞是革兰氏阳性细菌细胞。优选地，细胞属于芽孢杆菌属。
在另一个实施方案中，根据本发明的遗传工程化的嗜热细菌细胞是革兰氏阳性细菌细胞。优选地，细胞属于土芽孢杆菌属。
在另一个实施方案中，根据本发明的遗传工程化的嗜热细菌细胞是热葡糖苷酶土芽孢杆菌。
本发明的目的之一是生产兼性厌氧的并通过同型乳酸发酵产生(S)-乳酸的土芽孢杆菌菌株。
手性纯度是生产聚乳酸聚合物的重要方面。因此，必要的是生产对映体纯的(S)-乳酸用于商业应用。
因此，在一个方面，本发明公开了通过遗传工程遗传修饰兼性厌氧和同型乳酸的中等嗜热的土芽孢杆菌物种的方法。
在一个方面，本发明的提供了生产对映体纯乳酸的方法。该方法包括以下步骤：使用合适的含可发酵碳的原料培养根据本发明的嗜热细菌细胞和分离(S)-乳酸。
在一个方面，本发明提供了生产对映体纯乳酸的方法，其中所述含碳原料包括木糖、葡萄糖或蔗糖。
培养温度优选在50℃至70℃，更优选在55℃至65℃的温度下进行。
在本发明的上下文中，基因的失活或缺失可以是编码待由细胞产生的所需多肽的基因和/或编码参与细胞的初级或次级代谢物产生的多肽的基因的修饰。原则上，这可以通过降低编码的蛋白质的细胞水平来实现。可以例如通过编码目标酶的基因的靶向失活实现细胞水平的降低。基因可以被整体去除。然而，作为替代，基因的部分缺失也可能导致编码的蛋白质的活性降低。或者或另外地，可以修饰或去除负责基因调节或表达的核苷酸序列，例如启动子增强子、翻译起始位点等。影响目标蛋白质活性的另一种方法可以是修饰转运信号(如果需要的话)或引入反义RNA。
染色体修饰是优选的，因为染色体修饰将确保基因的功能性在子代细胞上的稳定分布。染色体中所需功能的缺失可以用非同源以及同源重组进行。同源重组是优选的，因为其打开了引入、去除或同时引入和去除功能性的机会。
当意欲进行同源重组时，转化DNA还包含与待工程化的特定细胞的基因组靶序列同源的DNA序列。本领域技术人员将理解，不需要100％的同一性来获得同源重组。80％、优选90％、更优选95％、98％或99％的百分比同一性也是足够的。通常，待通过同源重组插入染色体中的感兴趣的DNA序列由具有足够长度的同源序列侧接以能够进行同源重组。这样的长度可以为至少约200bp，例如约200至约1500bp，优选约500至约1000bp。
为了本发明的目的，两个氨基酸序列之间的同一性程度是指两个序列之间相同的氨基酸的百分比。使用BLAST算法确定同一性程度，其描述于Altschul,等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。Blastp算法参数的默认设置是：10的期望阈值，3的字长，0的查询范围中的最大匹配，矩阵为BLOSUM62，11的间隙成本存在(GapCosts Existence)，和1的扩展，条件组成分数矩阵调整上的组成调整。
为了本发明的目的，两个核苷酸序列之间的同一性程度是指两个序列之间相同的核苷酸的百分比。使用BLAST算法确定同一性程度，其描述于Altschul,等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。Blastn算法参数的默认设置为：10的期望阈值，28的字长，0的查询范围中的最大匹配，1、-2的匹配/不匹配分数，线性的间隙成本。
如上所述，鉴定热葡糖苷酶土芽孢杆菌中的上述基因的序列均不需要是100％同一的，以便通过遗传工程修饰目标基因。此外，在来自其它物种的相关的嗜热细菌细胞中，基因可能偏离这些序列。然而，与这些基因同源并且具有相同功能性的热葡糖苷酶土芽孢杆菌基因序列的利用可以容易地由本领域技术人员鉴定，并且可以制备相应的引物用于在这些菌株中进行同源重组。因此，即使在某一菌株中存在与上述基因的序列的偏差，也可以容易地鉴定同源基因。其核苷酸序列可以使用本领域已知的技术确定，并且如果需要，可以将新的一组引物确定为与侧翼基因序列相同或互补。
根据本发明的细胞可以使用本领域已知的技术制备。通过电穿孔将DNA引入嗜热细菌的具体方法已由Van Kranenburg等人,2007,WO2007/085433和Cripps等人2009,Metab.Eng.11:398-408描述。
通过电穿孔转化这些芽孢杆菌属物种可以通过高电压放电通过包含兼性厌氧和同型乳酸的中等嗜热芽孢杆菌物种和具有所需功能性的合适转化DNA和/或与特定芽孢杆菌的基因组序列同源的DNA序列的悬浮液来实现。
(S)-乳酸可以通过本领域已知的方法在碳水化合物源(例如葡萄糖和/或木糖)的存在下发酵本文所述的遗传工程化的嗜热细菌细胞来获得。在发酵期间，由微生物排出的乳酸通常使用碱(例如碱金属或碱土金属的碱性盐，例如钠、钾、镁和/或钙的氢氧化物、碳酸盐和/或碳酸氢盐)中和。镁碱(例如，氢氧化镁，碳酸镁和/或碳酸氢镁)通常是优选的。因此，在几个方面，本发明特别涉及生产对映体纯(S)-乳酸的方法，所述方法包括使用合适的可发酵的含碳原料在镁碱(例如选自氢氧化镁、碳酸镁和碳酸氢镁中的至少一种)的存在下培养如本文所述的嗜热细菌细胞，和分离(S)-乳酸。
发酵后，通过已知的从水溶液中分离乳酸和/或乳酸盐的许多常规技术中的任一种将(S)-乳酸(或其盐)从发酵液中分离。在分离之前可以除去底物的颗粒或微生物(生物质)以提高分离效率。所述分离可以通过离心、过滤、絮凝、浮选或膜过滤进行。这例如从WO01/38283中已知，其中描述了通过发酵制备乳酸的连续方法。尽管在本说明书中对发酵的讨论通常是指分批过程，但是整个过程的部分或全部可以连续进行。
在从发酵液中分离(S)-乳酸(或其盐)后，可以对产物进行一个或多个纯化步骤，例如萃取、蒸馏、结晶、电渗析、过滤、用活性炭离子交换处理，等等。各种残余流可任选在处理后再循环至发酵容器或任何先前进行的纯化步骤。
实施例
材料和方法
菌株和质粒
本研究中使用的菌株和质粒列于表1中。
在需氧条件下，大肠杆菌在LB肉汤中常规培养(Sambrook&Russell,2001,Molecular Cloning,a laboratory manual.3rd edition.Cold Spring HarborLaboratory Press,New York)。当合适时，氯霉素和/或氨苄青霉素分别以20mg/L和100mg/L的浓度使用。
除非另有说明，热葡糖苷酶土芽孢杆菌在52℃、55℃或60℃在需氧条件下常规生长在TGP培养基中。TGP培养基(Taylor等人,2008,Plasmid 60:45-52)包含17g/L胰蛋白胨、3g/L大豆蛋白胨、5g/L NaCl、2.5g/L K2HPO4，pH7.0，并且在高压灭菌后加入4ml/L甘油和4g/L丙酮酸钠。对于TGP板，使用10g/L琼脂。当合适时，培养基补充氯霉素(8μg/mL)。
表1.本研究中使用的菌株和质粒
Figure BDA0001214387100000131
Figure BDA0001214387100000141
DNA操作技术
如Sambrook和Russell(Sambrook&Russell,2001,Molecular Cloning,alaboratory manual.3rd edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)所述进行标准DNA操作技术。
在大肠杆菌中进行pNW33N衍生物的构建。
使用Jetstar 2.0 Plasmid Maxiprep
Figure BDA0001214387100000151
(Genomed)按照制造商的说明书进行从100mL培养物的大规模大肠杆菌质粒DNA分离。使用Nucleospin Plasmid Quick
Figure BDA0001214387100000152
(Macherey-Nagel)试剂盒按照制造商的说明书进行从1mL培养物的小规模大肠杆菌质粒DNA分离。
如Sambrook和Russell(Sambrook&Russell,2001,Molecular Cloning,alaboratory manual.3rd edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)所述，使用氯化钙制备大肠杆菌感受态细胞并通过热休克转化。
根据制造商的说明书，使用高保真Pwo聚合酶(Roche)进行用于克隆目的的PCR反应。
对于菌落PCR分析，用牙签挑取菌落，并将少量细胞材料转移到PCR反应管中。通过在微波炉中在1000W孵育1分钟破坏细胞。根据制造商的推荐制备具有rTaq聚合酶(Amersham Biosciences)的50μL或25μL的PCR反应混合物，并加入到具有破碎细胞的反应管中。
热葡糖苷酶土芽孢杆菌的电穿孔
基于Cripps等人描述的方案(Cripps,等人,2009,Metab.Eng.11:398-408)，通过电穿孔转化热葡糖苷酶土芽孢杆菌。热葡糖苷酶土芽孢杆菌在55℃下生长过夜，并使用1mL接种具有挡板的250ml锥形瓶中的50ml预热的TGP培养基。将细胞在60℃(180rpm)孵育直至OD600为≈1.0。将烧瓶在冰上冷却10分钟。并通过离心(4℃)沉淀细胞。接下来，将细胞用冰冷的电穿孔缓冲液(0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％(v/v)甘油)洗涤四次。洗涤步骤的体积为50ml，25ml，10ml和10ml。将最终的沉淀物重悬于1.3ml冰冷的电穿孔缓冲液中，并将60μl等分试样的电感受态细胞储存在-80℃或直接用于电穿孔。
将60μl等分试样的电感受态细胞(解冻的)与1-2μg质粒DNA混合，随后转移至冷却的电穿孔杯(间隙宽度0.1cm)。使用Bio-Rad基因脉冲发生器电穿孔仪的电穿孔条件为2,5kV、10μF和600Ω。电穿孔后，将细胞转移到50ml塑料管中的1ml预热(52℃)TGP中，并在52℃、180rpm下恢复2小时。将恢复的细胞悬浮液沉淀，除去所有上清液但留下150μl。将沉淀重悬于剩余的上清液中。将1/10和9/10的体积铺在含有8μg/L氯霉素的TGP平板上。将平板在52℃孵育24-48小时。将出现在平板上的菌落转移到含有8μg/L氯霉素的新鲜TGP平板中，并在55℃孵育过夜。通过使用引物1和2(表2)的菌落PCR测试生长的那些菌落的质粒的存在。
整合
如先前所述(Cripps等人,2009,Metab.Eng.11:398-408)，将土芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭载体pNW33n用作热葡糖苷酶土芽孢杆菌中的整合载体。用来自甘油储备液的转化菌株接种含有8μg/mL氯霉素的20mL TGP。在55℃、180rpm下过夜生长后，将适当的稀释液铺在含有8μg/mL氯霉素的TGP平板上。然后将这些板在68℃下孵育24小时。将单菌落划线到新的平板(在52℃孵育)，并对这些菌落进行菌落PCR以鉴定具有单交换的菌落。使用合适的引物组合来鉴定通过上游或下游片段的单交换(表2；分别地用于整合pRM3的引物组合655-170和656-571，用于整合pJS43的引物组合754-170和991-571，用于整合pRM12的引物组合744-170和808-571)。接下来，使用Masterpure革兰阳性DNA纯化试剂盒(EpicentreBiotechnologies)分离阳性菌落的染色体DNA并确认菌落PCR的结果，在分离的染色体DNA上重复上述PCR。选择通过上游侧翼区的单交换和通过下游侧翼区的单交换用于第二重组步骤。
为了获得双交换，将初步整合体在不含氯霉素的TGP中传代培养几次。将适当的稀释液(10-4,10-5,10-6)铺在TGP平板上。将分离的菌落转移至具有8μg/mL氯霉素的TGP平板和不具有8μg/mL氯霉素的一个TGP平板。双交换突变体是氯霉素敏感的。使用适当的引物组合的PCR分析(表2；用于ΔsigF的引物组合655-656，用于ΔmgsA的754-991和用于ΔpflBA-adhE的744-808)用于区分野生型和缺失突变体，并验证不存在质粒。通过PCR产物的测序确认所有修饰。
Figure BDA0001214387100000161
Figure BDA0001214387100000171
发酵
TMM培养基改良自Fong等人(Fong等人，2006)并且每L含有：60g/L葡萄糖；30g/L木糖；8.37g MOPS，0.23g K2HPO4；0.51g NH4Cl；0.50g NaCl；1.47g Na2SO4；0.08g NaHCO3；0.25g KCl；1.87g MgCl2.6H2O；0.41g CaCl2.2H2O；16.0mg MnCl2.4H2O；1.0mg ZnSO4.7H2O；2.0mg H3BO3；0.1mg CuSO4.5H2O；0.1mg Na2MoO4.2H2O；1.0mg CoCl2.6H2O；7.0mgFeSO4.7H2O；0.1mg硫胺素；0.1mg核黄素；0.5mg烟酸；0.1mg泛酸；0.5mg吡哆胺，HCl；0.5mg吡哆醛，HCl；0.1mg D-生物素；0.1mg叶酸；0.1mg对氨基苯甲酸；0.1mg钴胺素。将pH调节至pH7.2。将葡萄糖、木糖、金属和维生素过滤灭菌。培养基经高压灭菌。TMM1、TMM2.5和TMM5分别补充1g/L、2.5g/L和5g/L酵母提取物(Oxoid)。
STMM培养基不同于TMM培养基的是K2HPO4(1.00g/L)、NH4Cl(2.50g/L)、NaCl(5.00g/L)和CaCl2.2H2O(50mg/L)的浓度，并补充有D,L-甲硫氨酸(68.5mg/L)和甜菜碱(0.14g/L)。
使用TMM5或STMM5中的100mL预培养物在配备有冷凝器(用大约15℃的流动自来水冷却)的0.75L Multifors发酵罐(Infors)中分别接种(10％v/v)400mL TMM1或TMM2.5、或STMM2.5或STMM5。通过加入无菌的2.5M KOH、无菌的75g/L Mg(OH)2或无菌的75g/L Ca(OH)2将pH控制在pH 7.2。温度为60℃。搅拌器速度为300rpm。
从发酵中取出样品用于测量(R)-和(S)-乳酸和可能的副产物。将样品离心，并使用Millex GP 0.22μm
Figure BDA0001214387100000181
(Millipore)通过过滤除去剩余的碎片。滤液储存在-21℃直至进一步分析。
使用Thermo CarboPac SA-10柱(Dionex)通过HPLC测量糖。使用衍生化和气液色谱(GLC)测量有机酸(乳酸，乙酸，甲酸，琥珀酸，富马酸，丙酮酸)和乙醇。(R)-和(S)-乳酸盐被甲基化为甲基乳酸盐，并通过在手性柱上的顶空分析进行测量。
实施例1
使用热葡糖苷酶土芽孢杆菌的对映体纯乳酸生产
构建整合质粒pRM3以缺失热葡糖苷酶土芽孢杆菌中的sigF基因。通过使用DSM2542的基因组DNA作为模板和使用引物组合653和654(表2)以获得上游片段以及引物651和652(表2)以获得下游片段的PCR产生sigF基因的上游和下游侧翼区。首先，将下游片段作为KpnI-SalI片段克隆到用相同的酶消化的pNW33n中。接下来，将上游片段作为SalI-HindIII片段克隆到用相同的酶消化的该构建体中，得到质粒pRM3。在大肠杆菌TG90中构建pRM3。通过DNA测序证实pRM3序列的完整性。
将质粒pRM3电穿孔至热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542。如材料和方法中所述的，选择单个转化体菌落并用于获得单交换突变体。选择两个菌落用于进一步的工作，一个具有通过上游侧翼区的单交换，一个具有通过下游侧翼区的单交换。
按照材料和方法中所述的程序获得双交换突变体。将在没有氯霉素的TGP中的单交换整合体传代培养后获得的60个菌落转移到具有和没有氯霉素的TGP平板中。十五个菌落对氯霉素敏感。12个菌落具有所需的修饰，3个菌落恢复为野生型。选择一个菌落并命名为热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542 ΔsigF。通过测序证实缺失。
表3.在葡萄糖/木糖混合物上使用热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542 ΔsigF的发酵。
表3.在葡萄糖/木糖混合物上使用热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542ΔsigF的发酵。
Figure BDA0001214387100000191
热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542 ΔsigF在使用TMM1和TMM2.5的pH受控的(KOH)发酵中评估。分析发酵。结果总结在表3中。热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542 ΔsigF同时消耗木糖和葡萄糖。所产生的(S)-乳酸的手性纯度远低于手性纯乳酸的规格。
构建质粒pJS43以缺失热葡糖苷酶土芽孢杆菌的mgsA基因(423bp)中的267bp。通过使用DSM 2542的基因组DNA作为模板和引物组合750和999以获得mgsA下游片段以及引物1000和753以获得上游mgsA片段的PCR来产生mgsA基因的上游和下游侧翼区。所得的两个PCR产物随后在重叠PCR中用作模板使用引物组合750和753以将它们融合在一起。将产物作为BamHI-PstI片段克隆到用BamHI和PstI消化的质粒pNW33n中，得到质粒pJS43。在大肠杆菌TG90中进行pJS43的构建。通过测序证实pJS43核苷酸序列的完整性。
将质粒pJS43电穿孔至热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542 ΔsigF。选择单个转化体菌落并用于获得如材料和方法中所述的单交换突变体。选择一个单交换整合体用于进一步工作。
按照材料和方法中所述的程序获得双交换突变体。将在没有氯霉素的TGP中传代培养单交换整合体后获得的60个菌落转移至具有和不具有氯霉素的TGP平板。所有菌落似乎对氯霉素敏感。分析了25个菌落。4个菌落具有所需的修饰，21个菌落恢复为野生型。选择一个菌落并命名为热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542 ΔsigF,ΔmgsA。通过测序确认缺失。
热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542 ΔsigF，ΔmgsA在pH受控的发酵(Mg(OH)2)中使用STMM2.5进行评估。分析发酵。结果总结在表4中。热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542ΔsigF，ΔmgsA同时消耗木糖和葡萄糖。所产生的(S)-乳酸的手性纯度为99.6％，其被认为是手性纯的。这些数据清楚地表明，尽管在热葡糖苷酶土芽孢杆菌中甲基乙二醛途径的表观不完整性，但mgsA的破坏导致产生手性纯(S)-乳酸的能力。
表4：在STMM5上使用热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542 ΔsigF,ΔmgsA的发酵
Figure BDA0001214387100000201
Figure BDA0001214387100000211
实施例2
使用热葡糖苷酶土芽孢杆菌的对映体纯同型乳酸产生
热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542 ΔsigF，ΔmgsA仍然产生显著量的甲酸和乙醇，而乙酸是少量副产物(表4)。尽管已知pflA和/或pflB和adhE的突变影响许多细菌中的甲酸和乙醇生产，但是破坏那些基因的副作用是不可预测的。
构建了质粒pRM12以缺失热葡糖苷酶土芽孢杆菌中的基因pflB、pflA和adhE(部分地)。通过使用DSM 2542的基因组DNA作为模板和引物组合739和805以获得上游pflBA片段以及引物806和807以获得上游adhE片段的PCR来产生pflBA的上游侧翼区和趋同取向的adhE的上游侧翼区。所得的两个PCR产物随后在重叠PCR中用作模板使用引物组合739和807以将它们融合在一起。将该产物作为BamHI-PstI片段克隆到用BamHI和PstI消化的质粒pNW33n中，得到质粒pRM12。pRM12的构建在大肠杆菌DH5α中进行。通过测序证实pRM12核苷酸序列的完整性。
将质粒pRM12电穿孔至热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542 ΔsigF，ΔmgsA。选择单个转化体菌落并用于获得如材料和方法中所述的单交换突变体。选择两个菌落用于进一步的工作，一个具有通过上游pflBA侧翼区的单交换，一个具有通过上游adhE侧翼区的单交换。
按照材料和方法中所述的程序获得双交换突变体。将在没有氯霉素的TGP中传代培养单交换整合体后获得的120个菌落转移至具有和不具有氯霉素的TGP平板。2个菌落对氯霉素敏感。一个具有所需的修饰，另一个恢复为野生型。一个菌落被命名为热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542 ΔsigF,ΔmgsA,ΔpflBA-ΔadhE。通过测序确认缺失。
表5.在STMM5上使用热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542 ΔsigF,ΔmgsA,ΔpflBA-ΔadhE的发酵
Figure BDA0001214387100000221
1接种后采样。
2n.d.＝未测定:乳酸浓度太低而不能测定手性纯度
使用含有5.0g/L酵母提取物、60g/L葡萄糖和30g/L木糖的STMM培养基在pH受控的(Ca(OH)2)发酵中评估热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542 ΔsigF，ΔmgsA，ΔpflBA-ΔadhE。在三个时间点分析发酵。结果总结在表5中。热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542 ΔsigF，ΔmgsA，ΔpflBA-ΔadhE同时消耗木糖和葡萄糖。由热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM2542 ΔsigF，ΔmgsA，ΔpflBA-ΔadhE产生的(S)-乳酸的手性纯度为99.7％或更高。乙酸和甲酸的产量为每克乳酸6.7mg。无法检测到乙醇生产。这些数据清楚地表明，丙酮酸甲酸裂解酶和醇脱氢酶复合物基因的破坏显著降低乙醇、甲酸和乙酸的产生，从而导致同型乳酸和手性纯的(S)-乳酸发酵。
序列表
<110> PURAC
PURAC BIOCHEM BV
<120> 产生(S)-乳酸的嗜热细菌的遗传修饰
<130> 22805
<150> EP 14178150.0
<151> 2014-07-23
<160> 34
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 1
tcgccttctt ctgtgtcatc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 2
ctggaggaga gcaatgaaac 20
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 3
gcgcgggtac ccagcaaacc gagcggaatc ag 32
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 4
gcgcggtcga cggatgggta ggcatccatt c 31
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 5
gcgcggtcga cgtctccctt agttacataa cgc 33
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 6
gcgcgaagct tgcttcgcag tccaatcgtc gc 32
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 7
gctaagatcg gccatacgtt aagc 24
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 8
ggagacgagc ttggcgtcct g 21
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 9
gccctcgaga gggctcgcct ttgggaag 28
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 10
gctcgttata gtcgatcggt tc 22
<210> 11
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 11
gcgcgggatc cgctttccgt ttgccatttg ccg 33
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 12
gcgcgctgca gggcaagact gacagaagag cttgg 35
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 13
cagcagtaac ggcatccgat tg 22
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 14
gcggatatga ttgaatttgt gactgcc 27
<210> 15
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 15
tatgcgacgg gcgcgtggag gaatattgtc cgc 33
<210> 16
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 16
attcctccac gcgcccgtcg catacagttc atgttg 36
<210> 17
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 17
gcgcgggatc ccccaaatgg cattaccggt gtg 33
<210> 18
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 18
tgttattgct ggcagtttcc ctcccatgca tctg 34
<210> 19
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 19
ggagggaaac tgccagcaat aacaccaaca ggctc 35
<210> 20
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence
<400> 20
gcgcgctgca gcgaaagcga acgaaattgc caac 34
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 21
gccaagatgg atatgggcgt tagc 24
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 22
ccggagatgg acggaattga ag 22
<210> 23
<211> 423
<212> DNA
<213> 热葡糖苷酶土芽孢杆菌
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(423)
<400> 23
gtg aga atc gcg ttg atc gcg cat gat aaa aag aaa gcg gat atg att 48
Val Arg Ile Ala Leu Ile Ala His Asp Lys Lys Lys Ala Asp Met Ile
1 5 10 15
gaa ttt gtg act gcc tat cag ccg att tta gaa caa cat gaa ctg tat 96
Glu Phe Val Thr Ala Tyr Gln Pro Ile Leu Glu Gln His Glu Leu Tyr
20 25 30
gcg acg ggc acg acc ggc ttg cgc att cag gaa gcg aca gga ctg ccg 144
Ala Thr Gly Thr Thr Gly Leu Arg Ile Gln Glu Ala Thr Gly Leu Pro
35 40 45
gtg cat cgc ttt caa tcg ggg cca tat ggc ggc gat caa gaa att ggt 192
Val His Arg Phe Gln Ser Gly Pro Tyr Gly Gly Asp Gln Glu Ile Gly
50 55 60
gca atg att gcc cgc aat gaa atg gat atg gtg ata ttt ttc cgc gat 240
Ala Met Ile Ala Arg Asn Glu Met Asp Met Val Ile Phe Phe Arg Asp
65 70 75 80
ccg ttg acg gca cag ccg cat gag ccg gat gtc agt gcg ctc att cgc 288
Pro Leu Thr Ala Gln Pro His Glu Pro Asp Val Ser Ala Leu Ile Arg
85 90 95
tta tgt gat gtc tat tcc gtg ccg ctt gca acc aat atg ggg acg gcg 336
Leu Cys Asp Val Tyr Ser Val Pro Leu Ala Thr Asn Met Gly Thr Ala
100 105 110
gaa att tta att aaa ggg ctg gag cgc ggc gat ttt gcg tgg agg aat 384
Glu Ile Leu Ile Lys Gly Leu Glu Arg Gly Asp Phe Ala Trp Arg Asn
115 120 125
att gtc cgc ggc cga aaa ggt gag aca aat gga ata taa 423
Ile Val Arg Gly Arg Lys Gly Glu Thr Asn Gly Ile
130 135 140
<210> 24
<211> 140
<212> PRT
<213> 热葡糖苷酶土芽孢杆菌
<400> 24
Val Arg Ile Ala Leu Ile Ala His Asp Lys Lys Lys Ala Asp Met Ile
1 5 10 15
Glu Phe Val Thr Ala Tyr Gln Pro Ile Leu Glu Gln His Glu Leu Tyr
20 25 30
Ala Thr Gly Thr Thr Gly Leu Arg Ile Gln Glu Ala Thr Gly Leu Pro
35 40 45
Val His Arg Phe Gln Ser Gly Pro Tyr Gly Gly Asp Gln Glu Ile Gly
50 55 60
Ala Met Ile Ala Arg Asn Glu Met Asp Met Val Ile Phe Phe Arg Asp
65 70 75 80
Pro Leu Thr Ala Gln Pro His Glu Pro Asp Val Ser Ala Leu Ile Arg
85 90 95
Leu Cys Asp Val Tyr Ser Val Pro Leu Ala Thr Asn Met Gly Thr Ala
100 105 110
Glu Ile Leu Ile Lys Gly Leu Glu Arg Gly Asp Phe Ala Trp Arg Asn
115 120 125
Ile Val Arg Gly Arg Lys Gly Glu Thr Asn Gly Ile
130 135 140
<210> 25
<211> 2250
<212> DNA
<213> 热葡糖苷酶土芽孢杆菌
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2250)
<400> 25
atg aaa caa gcc act gtt gta ttg gac cct tgg cgc aat ttt aaa ggg 48
Met Lys Gln Ala Thr Val Val Leu Asp Pro Trp Arg Asn Phe Lys Gly
1 5 10 15
tca aaa tgg aaa aaa tcg att gac gtc cgt gat ttt att tta aac aat 96
Ser Lys Trp Lys Lys Ser Ile Asp Val Arg Asp Phe Ile Leu Asn Asn
20 25 30
gta acc gtt tac tac ggg gat gaa tca ttc cta gaa ggg cct aca gaa 144
Val Thr Val Tyr Tyr Gly Asp Glu Ser Phe Leu Glu Gly Pro Thr Glu
35 40 45
gca acg aaa aaa cta tgg gaa caa gtg atg gaa ttg tcg aaa caa gaa 192
Ala Thr Lys Lys Leu Trp Glu Gln Val Met Glu Leu Ser Lys Gln Glu
50 55 60
cgc gaa aaa ggc ggc gtc ctt gat atg gac aca tcg att gtt tcg acc 240
Arg Glu Lys Gly Gly Val Leu Asp Met Asp Thr Ser Ile Val Ser Thr
65 70 75 80
atc act tcc cac gga cca ggt tat tta aac aaa gac ttg gaa aaa atc 288
Ile Thr Ser His Gly Pro Gly Tyr Leu Asn Lys Asp Leu Glu Lys Ile
85 90 95
gta ggt ttt caa aca gat aaa ccg ttt aag cgt gca tta atg ccg ttt 336
Val Gly Phe Gln Thr Asp Lys Pro Phe Lys Arg Ala Leu Met Pro Phe
100 105 110
ggc ggc att cgc atg gcg caa caa tca tgc gaa gca tac ggt tac aaa 384
Gly Gly Ile Arg Met Ala Gln Gln Ser Cys Glu Ala Tyr Gly Tyr Lys
115 120 125
gta agc gac gaa gtg aaa aaa atc ttt acg gaa tac cgg aaa aca cac 432
Val Ser Asp Glu Val Lys Lys Ile Phe Thr Glu Tyr Arg Lys Thr His
130 135 140
aac caa ggt gtg ttt gac gtt tac acc gac gag atg aga tta gcg cgc 480
Asn Gln Gly Val Phe Asp Val Tyr Thr Asp Glu Met Arg Leu Ala Arg
145 150 155 160
aaa gca gga atc atc acc ggc ctt cct gat gcg tac gga cgc ggc cgt 528
Lys Ala Gly Ile Ile Thr Gly Leu Pro Asp Ala Tyr Gly Arg Gly Arg
165 170 175
atc atc ggc gac tat cgt cgc gtc gcg tta tac ggt gtc gat cgt ttg 576
Ile Ile Gly Asp Tyr Arg Arg Val Ala Leu Tyr Gly Val Asp Arg Leu
180 185 190
atc gaa gaa aaa caa aaa gat ttg aaa aac act ggc gca aga acg atg 624
Ile Glu Glu Lys Gln Lys Asp Leu Lys Asn Thr Gly Ala Arg Thr Met
195 200 205
acc gaa gac att atc cgt ctt cgc gaa gaa att tca gag caa att cgc 672
Thr Glu Asp Ile Ile Arg Leu Arg Glu Glu Ile Ser Glu Gln Ile Arg
210 215 220
gca tta aac gag tta aaa caa atg gcg tta agc tat gga tat gat att 720
Ala Leu Asn Glu Leu Lys Gln Met Ala Leu Ser Tyr Gly Tyr Asp Ile
225 230 235 240
tcc aaa ccg gca cgg aac gca cat gaa gca ttc caa tgg ctc tat ttc 768
Ser Lys Pro Ala Arg Asn Ala His Glu Ala Phe Gln Trp Leu Tyr Phe
245 250 255
gct tat ctt gct gct att aaa gaa caa aac ggc gcg gcg atg agc tta 816
Ala Tyr Leu Ala Ala Ile Lys Glu Gln Asn Gly Ala Ala Met Ser Leu
260 265 270
ggg cgc gtt tcc acc ttc ttg gat att tat atc gag cgc gac ttt gca 864
Gly Arg Val Ser Thr Phe Leu Asp Ile Tyr Ile Glu Arg Asp Phe Ala
275 280 285
gaa ggc aca tta acg gaa aaa gaa gcg caa gaa ctt gtc gac cat ttt 912
Glu Gly Thr Leu Thr Glu Lys Glu Ala Gln Glu Leu Val Asp His Phe
290 295 300
gtg atg aaa ttg cgc ctt gtc aaa ttt gcc aga acg ccg gaa tat aac 960
Val Met Lys Leu Arg Leu Val Lys Phe Ala Arg Thr Pro Glu Tyr Asn
305 310 315 320
gaa ctg ttt agc gga gac ccg aca tgg gtt acc gaa tcg atc ggc gga 1008
Glu Leu Phe Ser Gly Asp Pro Thr Trp Val Thr Glu Ser Ile Gly Gly
325 330 335
att gcc att gat ggc cgt ccg tta gtg aca aag aac tcg ttc cgt ttc 1056
Ile Ala Ile Asp Gly Arg Pro Leu Val Thr Lys Asn Ser Phe Arg Phe
340 345 350
ctt cat acg tta gat aac tta gga cct gcg cca gag cca aac tta aca 1104
Leu His Thr Leu Asp Asn Leu Gly Pro Ala Pro Glu Pro Asn Leu Thr
355 360 365
gta ctt tgg tcg aaa caa ttg ccg gaa gca ttc aaa gag tat tgc gcg 1152
Val Leu Trp Ser Lys Gln Leu Pro Glu Ala Phe Lys Glu Tyr Cys Ala
370 375 380
aaa atg tcg atc aaa aca agc tcg att caa tat gaa aat gac gac tta 1200
Lys Met Ser Ile Lys Thr Ser Ser Ile Gln Tyr Glu Asn Asp Asp Leu
385 390 395 400
atg cgc gtc gaa ttt ggc gat gat tac gga att gct tgc tgc gta tca 1248
Met Arg Val Glu Phe Gly Asp Asp Tyr Gly Ile Ala Cys Cys Val Ser
405 410 415
gcg atg cga atc ggc aaa caa atg caa ttt ttc gga gcg cgc gcc aac 1296
Ala Met Arg Ile Gly Lys Gln Met Gln Phe Phe Gly Ala Arg Ala Asn
420 425 430
ctc gcc aaa gca ttg tta tat gcg att aac ggc ggc gtc gat gaa aaa 1344
Leu Ala Lys Ala Leu Leu Tyr Ala Ile Asn Gly Gly Val Asp Glu Lys
435 440 445
ttg aaa atc caa gtt ggc cct gaa ttt gcg ccg att acc tcc gaa tat 1392
Leu Lys Ile Gln Val Gly Pro Glu Phe Ala Pro Ile Thr Ser Glu Tyr
450 455 460
tta aat tat gat gaa gtg atg cat aaa ttc gat caa gtg ctt gaa tgg 1440
Leu Asn Tyr Asp Glu Val Met His Lys Phe Asp Gln Val Leu Glu Trp
465 470 475 480
ctt gcc gaa ctt tat att aac aca ctg aat gtc atc cat tac atg cac 1488
Leu Ala Glu Leu Tyr Ile Asn Thr Leu Asn Val Ile His Tyr Met His
485 490 495
gac aaa tat tgt tat gaa cgc att gaa atg gcg ctt cac gat act cac 1536
Asp Lys Tyr Cys Tyr Glu Arg Ile Glu Met Ala Leu His Asp Thr His
500 505 510
gtt tta cgc aca atg gcc act ggc att gcc gga ttg tca gtt gtc gtc 1584
Val Leu Arg Thr Met Ala Thr Gly Ile Ala Gly Leu Ser Val Val Val
515 520 525
gat tcg tta agc gcg atc aaa tat gca aaa gtc aaa ccg atc cgc gat 1632
Asp Ser Leu Ser Ala Ile Lys Tyr Ala Lys Val Lys Pro Ile Arg Asp
530 535 540
gaa aac ggc att gct gtt gat ttt gaa atg gaa ggc gac ttc ccg aaa 1680
Glu Asn Gly Ile Ala Val Asp Phe Glu Met Glu Gly Asp Phe Pro Lys
545 550 555 560
tac gga aat aac gat gat cgc gtc gac caa att gcc gtt gat tta gtc 1728
Tyr Gly Asn Asn Asp Asp Arg Val Asp Gln Ile Ala Val Asp Leu Val
565 570 575
gaa cgt ttt atg acg aaa ttg aaa aaa cat aaa aca tat cgc gat tcg 1776
Glu Arg Phe Met Thr Lys Leu Lys Lys His Lys Thr Tyr Arg Asp Ser
580 585 590
aaa cat acg cta tct att tta aca att acg tct aac gtt gta tac ggg 1824
Lys His Thr Leu Ser Ile Leu Thr Ile Thr Ser Asn Val Val Tyr Gly
595 600 605
aaa aag acc gga aat aca cca gat ggc cgc cgc gct ggc gaa ccg ttt 1872
Lys Lys Thr Gly Asn Thr Pro Asp Gly Arg Arg Ala Gly Glu Pro Phe
610 615 620
gcc cca gga gca aac ccg ttg cac ggc cgt gac acg aaa gga gcg ctc 1920
Ala Pro Gly Ala Asn Pro Leu His Gly Arg Asp Thr Lys Gly Ala Leu
625 630 635 640
gct tcg cta agc tct gtc gcg aaa tta cca tat gaa cat gca tta gat 1968
Ala Ser Leu Ser Ser Val Ala Lys Leu Pro Tyr Glu His Ala Leu Asp
645 650 655
ggc att tcg aat acg ttc tcg atc gtg ccg aaa gcg tta gga aaa gag 2016
Gly Ile Ser Asn Thr Phe Ser Ile Val Pro Lys Ala Leu Gly Lys Glu
660 665 670
gaa gga gac cgt gtc cgc aac ctt gtc gcc gtt tta gac gga tac atg 2064
Glu Gly Asp Arg Val Arg Asn Leu Val Ala Val Leu Asp Gly Tyr Met
675 680 685
gaa aaa ggc ggg cat cat ctc aac att aac gtg ttg aac cgc gaa aca 2112
Glu Lys Gly Gly His His Leu Asn Ile Asn Val Leu Asn Arg Glu Thr
690 695 700
ttg tta gat gcg atg gaa cat cca gaa aaa tat ccg caa tta acg att 2160
Leu Leu Asp Ala Met Glu His Pro Glu Lys Tyr Pro Gln Leu Thr Ile
705 710 715 720
cgc gtt tct gga tat gcc gtc aac ttc ata aaa tta acg cgc gaa caa 2208
Arg Val Ser Gly Tyr Ala Val Asn Phe Ile Lys Leu Thr Arg Glu Gln
725 730 735
caa atc gat gtc att aac cgc acg ttc cac gaa acg atg taa 2250
Gln Ile Asp Val Ile Asn Arg Thr Phe His Glu Thr Met
740 745
<210> 26
<211> 749
<212> PRT
<213> 热葡糖苷酶土芽孢杆菌
<400> 26
Met Lys Gln Ala Thr Val Val Leu Asp Pro Trp Arg Asn Phe Lys Gly
1 5 10 15
Ser Lys Trp Lys Lys Ser Ile Asp Val Arg Asp Phe Ile Leu Asn Asn
20 25 30
Val Thr Val Tyr Tyr Gly Asp Glu Ser Phe Leu Glu Gly Pro Thr Glu
35 40 45
Ala Thr Lys Lys Leu Trp Glu Gln Val Met Glu Leu Ser Lys Gln Glu
50 55 60
Arg Glu Lys Gly Gly Val Leu Asp Met Asp Thr Ser Ile Val Ser Thr
65 70 75 80
Ile Thr Ser His Gly Pro Gly Tyr Leu Asn Lys Asp Leu Glu Lys Ile
85 90 95
Val Gly Phe Gln Thr Asp Lys Pro Phe Lys Arg Ala Leu Met Pro Phe
100 105 110
Gly Gly Ile Arg Met Ala Gln Gln Ser Cys Glu Ala Tyr Gly Tyr Lys
115 120 125
Val Ser Asp Glu Val Lys Lys Ile Phe Thr Glu Tyr Arg Lys Thr His
130 135 140
Asn Gln Gly Val Phe Asp Val Tyr Thr Asp Glu Met Arg Leu Ala Arg
145 150 155 160
Lys Ala Gly Ile Ile Thr Gly Leu Pro Asp Ala Tyr Gly Arg Gly Arg
165 170 175
Ile Ile Gly Asp Tyr Arg Arg Val Ala Leu Tyr Gly Val Asp Arg Leu
180 185 190
Ile Glu Glu Lys Gln Lys Asp Leu Lys Asn Thr Gly Ala Arg Thr Met
195 200 205
Thr Glu Asp Ile Ile Arg Leu Arg Glu Glu Ile Ser Glu Gln Ile Arg
210 215 220
Ala Leu Asn Glu Leu Lys Gln Met Ala Leu Ser Tyr Gly Tyr Asp Ile
225 230 235 240
Ser Lys Pro Ala Arg Asn Ala His Glu Ala Phe Gln Trp Leu Tyr Phe
245 250 255
Ala Tyr Leu Ala Ala Ile Lys Glu Gln Asn Gly Ala Ala Met Ser Leu
260 265 270
Gly Arg Val Ser Thr Phe Leu Asp Ile Tyr Ile Glu Arg Asp Phe Ala
275 280 285
Glu Gly Thr Leu Thr Glu Lys Glu Ala Gln Glu Leu Val Asp His Phe
290 295 300
Val Met Lys Leu Arg Leu Val Lys Phe Ala Arg Thr Pro Glu Tyr Asn
305 310 315 320
Glu Leu Phe Ser Gly Asp Pro Thr Trp Val Thr Glu Ser Ile Gly Gly
325 330 335
Ile Ala Ile Asp Gly Arg Pro Leu Val Thr Lys Asn Ser Phe Arg Phe
340 345 350
Leu His Thr Leu Asp Asn Leu Gly Pro Ala Pro Glu Pro Asn Leu Thr
355 360 365
Val Leu Trp Ser Lys Gln Leu Pro Glu Ala Phe Lys Glu Tyr Cys Ala
370 375 380
Lys Met Ser Ile Lys Thr Ser Ser Ile Gln Tyr Glu Asn Asp Asp Leu
385 390 395 400
Met Arg Val Glu Phe Gly Asp Asp Tyr Gly Ile Ala Cys Cys Val Ser
405 410 415
Ala Met Arg Ile Gly Lys Gln Met Gln Phe Phe Gly Ala Arg Ala Asn
420 425 430
Leu Ala Lys Ala Leu Leu Tyr Ala Ile Asn Gly Gly Val Asp Glu Lys
435 440 445
Leu Lys Ile Gln Val Gly Pro Glu Phe Ala Pro Ile Thr Ser Glu Tyr
450 455 460
Leu Asn Tyr Asp Glu Val Met His Lys Phe Asp Gln Val Leu Glu Trp
465 470 475 480
Leu Ala Glu Leu Tyr Ile Asn Thr Leu Asn Val Ile His Tyr Met His
485 490 495
Asp Lys Tyr Cys Tyr Glu Arg Ile Glu Met Ala Leu His Asp Thr His
500 505 510
Val Leu Arg Thr Met Ala Thr Gly Ile Ala Gly Leu Ser Val Val Val
515 520 525
Asp Ser Leu Ser Ala Ile Lys Tyr Ala Lys Val Lys Pro Ile Arg Asp
530 535 540
Glu Asn Gly Ile Ala Val Asp Phe Glu Met Glu Gly Asp Phe Pro Lys
545 550 555 560
Tyr Gly Asn Asn Asp Asp Arg Val Asp Gln Ile Ala Val Asp Leu Val
565 570 575
Glu Arg Phe Met Thr Lys Leu Lys Lys His Lys Thr Tyr Arg Asp Ser
580 585 590
Lys His Thr Leu Ser Ile Leu Thr Ile Thr Ser Asn Val Val Tyr Gly
595 600 605
Lys Lys Thr Gly Asn Thr Pro Asp Gly Arg Arg Ala Gly Glu Pro Phe
610 615 620
Ala Pro Gly Ala Asn Pro Leu His Gly Arg Asp Thr Lys Gly Ala Leu
625 630 635 640
Ala Ser Leu Ser Ser Val Ala Lys Leu Pro Tyr Glu His Ala Leu Asp
645 650 655
Gly Ile Ser Asn Thr Phe Ser Ile Val Pro Lys Ala Leu Gly Lys Glu
660 665 670
Glu Gly Asp Arg Val Arg Asn Leu Val Ala Val Leu Asp Gly Tyr Met
675 680 685
Glu Lys Gly Gly His His Leu Asn Ile Asn Val Leu Asn Arg Glu Thr
690 695 700
Leu Leu Asp Ala Met Glu His Pro Glu Lys Tyr Pro Gln Leu Thr Ile
705 710 715 720
Arg Val Ser Gly Tyr Ala Val Asn Phe Ile Lys Leu Thr Arg Glu Gln
725 730 735
Gln Ile Asp Val Ile Asn Arg Thr Phe His Glu Thr Met
740 745
<210> 27
<211> 750
<212> DNA
<213> 热葡糖苷酶土芽孢杆菌
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(750)
<400> 27
atg aaa gga ttt att cat tcc atc gaa tca tgc ggc acc gtc gac ggg 48
Met Lys Gly Phe Ile His Ser Ile Glu Ser Cys Gly Thr Val Asp Gly
1 5 10 15
ccg ggc ctt cgc tat gtc atc ttt aca caa ggc tgt gtg ctg cgc tgc 96
Pro Gly Leu Arg Tyr Val Ile Phe Thr Gln Gly Cys Val Leu Arg Cys
20 25 30
caa tat tgc cat aac gcc gat acg tgg gaa att gga aaa gga aaa gaa 144
Gln Tyr Cys His Asn Ala Asp Thr Trp Glu Ile Gly Lys Gly Lys Glu
35 40 45
atg act gtg gaa gaa atc atc gat gac gtg aaa aca tac ttg ccg ttt 192
Met Thr Val Glu Glu Ile Ile Asp Asp Val Lys Thr Tyr Leu Pro Phe
50 55 60
atc aac gct tcc aat ggc gga att acc gtc agc ggc gga gag cct ttg 240
Ile Asn Ala Ser Asn Gly Gly Ile Thr Val Ser Gly Gly Glu Pro Leu
65 70 75 80
tta caa atc gat ttt tta att gaa tta ttt aaa gca tgc aaa aaa ctg 288
Leu Gln Ile Asp Phe Leu Ile Glu Leu Phe Lys Ala Cys Lys Lys Leu
85 90 95
ggc att cat acc gcg atc gat tca tcg gga gga tgc tac acg acg gaa 336
Gly Ile His Thr Ala Ile Asp Ser Ser Gly Gly Cys Tyr Thr Thr Glu
100 105 110
gca tcg ttc cag caa aaa tta aat gaa tta ctt tcc tat acc gat tta 384
Ala Ser Phe Gln Gln Lys Leu Asn Glu Leu Leu Ser Tyr Thr Asp Leu
115 120 125
att ttg ctt gat tta aaa cat atc gat gag aaa aaa cac cgg aaa ctg 432
Ile Leu Leu Asp Leu Lys His Ile Asp Glu Lys Lys His Arg Lys Leu
130 135 140
aca gga aaa acc aat aaa cat att tta caa ttt gct cag ttt tta tcc 480
Thr Gly Lys Thr Asn Lys His Ile Leu Gln Phe Ala Gln Phe Leu Ser
145 150 155 160
gaa aaa aac gtt cct gtt tgg atc cgg cat gtt ctc gtt cca acc atc 528
Glu Lys Asn Val Pro Val Trp Ile Arg His Val Leu Val Pro Thr Ile
165 170 175
aca gac gac ccg aat gac ttg cgc cgt ctc gcc gct ttt att cgc aca 576
Thr Asp Asp Pro Asn Asp Leu Arg Arg Leu Ala Ala Phe Ile Arg Thr
180 185 190
tta aag aat gtg aaa aaa att gaa att ctc cca tac cat aaa tta gga 624
Leu Lys Asn Val Lys Lys Ile Glu Ile Leu Pro Tyr His Lys Leu Gly
195 200 205
gta tac aaa tgg aaa gcg ctt gga tta aaa tac cct ttg gaa gga atc 672
Val Tyr Lys Trp Lys Ala Leu Gly Leu Lys Tyr Pro Leu Glu Gly Ile
210 215 220
gag cct cct tcg gaa gaa agc gta caa atg gca cag cga att ctt aac 720
Glu Pro Pro Ser Glu Glu Ser Val Gln Met Ala Gln Arg Ile Leu Asn
225 230 235 240
gga aca gaa gat aca gta tct ctt gcg taa 750
Gly Thr Glu Asp Thr Val Ser Leu Ala
245
<210> 28
<211> 249
<212> PRT
<213> 热葡糖苷酶土芽孢杆菌
<400> 28
Met Lys Gly Phe Ile His Ser Ile Glu Ser Cys Gly Thr Val Asp Gly
1 5 10 15
Pro Gly Leu Arg Tyr Val Ile Phe Thr Gln Gly Cys Val Leu Arg Cys
20 25 30
Gln Tyr Cys His Asn Ala Asp Thr Trp Glu Ile Gly Lys Gly Lys Glu
35 40 45
Met Thr Val Glu Glu Ile Ile Asp Asp Val Lys Thr Tyr Leu Pro Phe
50 55 60
Ile Asn Ala Ser Asn Gly Gly Ile Thr Val Ser Gly Gly Glu Pro Leu
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asp Phe Leu Ile Glu Leu Phe Lys Ala Cys Lys Lys Leu
85 90 95
Gly Ile His Thr Ala Ile Asp Ser Ser Gly Gly Cys Tyr Thr Thr Glu
100 105 110
Ala Ser Phe Gln Gln Lys Leu Asn Glu Leu Leu Ser Tyr Thr Asp Leu
115 120 125
Ile Leu Leu Asp Leu Lys His Ile Asp Glu Lys Lys His Arg Lys Leu
130 135 140
Thr Gly Lys Thr Asn Lys His Ile Leu Gln Phe Ala Gln Phe Leu Ser
145 150 155 160
Glu Lys Asn Val Pro Val Trp Ile Arg His Val Leu Val Pro Thr Ile
165 170 175
Thr Asp Asp Pro Asn Asp Leu Arg Arg Leu Ala Ala Phe Ile Arg Thr
180 185 190
Leu Lys Asn Val Lys Lys Ile Glu Ile Leu Pro Tyr His Lys Leu Gly
195 200 205
Val Tyr Lys Trp Lys Ala Leu Gly Leu Lys Tyr Pro Leu Glu Gly Ile
210 215 220
Glu Pro Pro Ser Glu Glu Ser Val Gln Met Ala Gln Arg Ile Leu Asn
225 230 235 240
Gly Thr Glu Asp Thr Val Ser Leu Ala
245
<210> 29
<211> 2604
<212> DNA
<213> 热葡糖苷酶土芽孢杆菌
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2604)
<400> 29
atg gct gtg gag gag aga gtc gtc gat aaa aaa atc gaa gta gca aaa 48
Met Ala Val Glu Glu Arg Val Val Asp Lys Lys Ile Glu Val Ala Lys
1 5 10 15
atg att gat gag ctt gtc gct aat gca cag aaa gcg ttg gaa caa att 96
Met Ile Asp Glu Leu Val Ala Asn Ala Gln Lys Ala Leu Glu Gln Ile
20 25 30
cgc gct tac gat caa gaa acg atc gat cat atc gtg aaa gaa atg gcg 144
Arg Ala Tyr Asp Gln Glu Thr Ile Asp His Ile Val Lys Glu Met Ala
35 40 45
tta gcc ggg ctc gac aag cat atg gca tta gcc aag ctt gca gta gaa 192
Leu Ala Gly Leu Asp Lys His Met Ala Leu Ala Lys Leu Ala Val Glu
50 55 60
gaa aca aaa cgc ggt gta tat gaa gat aaa atc ata aaa aac ctt ttt 240
Glu Thr Lys Arg Gly Val Tyr Glu Asp Lys Ile Ile Lys Asn Leu Phe
65 70 75 80
gcg aca gaa tat ata tac cac aat att aag tat gat aaa aca gtc ggg 288
Ala Thr Glu Tyr Ile Tyr His Asn Ile Lys Tyr Asp Lys Thr Val Gly
85 90 95
att att cat gaa aat ccg cat gaa gaa att atc gaa att gct gag cct 336
Ile Ile His Glu Asn Pro His Glu Glu Ile Ile Glu Ile Ala Glu Pro
100 105 110
gtt ggt gtt att gct ggg att acg cca gtg aca aac ccg aca tcg aca 384
Val Gly Val Ile Ala Gly Ile Thr Pro Val Thr Asn Pro Thr Ser Thr
115 120 125
acg atg ttt aaa gcg tta atc tcg ata aaa aca cgc aac ccg att att 432
Thr Met Phe Lys Ala Leu Ile Ser Ile Lys Thr Arg Asn Pro Ile Ile
130 135 140
ttc gct ttc cat cca tcg gcg caa cga tgc agc agc gaa gcg gca aga 480
Phe Ala Phe His Pro Ser Ala Gln Arg Cys Ser Ser Glu Ala Ala Arg
145 150 155 160
gtg ctg cgc gat gcg gcg gtc cgg gca ggg gct cca gaa cat tgc att 528
Val Leu Arg Asp Ala Ala Val Arg Ala Gly Ala Pro Glu His Cys Ile
165 170 175
caa tgg att gaa act cct tcg ctt gat gca acc aat cag ctt atg cac 576
Gln Trp Ile Glu Thr Pro Ser Leu Asp Ala Thr Asn Gln Leu Met His
180 185 190
cat cct ggc gtt tct ctc att ttg gca act ggt ggc gcc ggc atg gtg 624
His Pro Gly Val Ser Leu Ile Leu Ala Thr Gly Gly Ala Gly Met Val
195 200 205
aaa gca gcg tac agc tct gga aaa cca gct ttg ggc gtc gga cct ggc 672
Lys Ala Ala Tyr Ser Ser Gly Lys Pro Ala Leu Gly Val Gly Pro Gly
210 215 220
aat gtg cct tgc tat att gaa aaa acg gca aac ata aaa cgg gcg gta 720
Asn Val Pro Cys Tyr Ile Glu Lys Thr Ala Asn Ile Lys Arg Ala Val
225 230 235 240
aat gac tta att tta tcg aaa acg ttt gat aac ggc atg att tgc gct 768
Asn Asp Leu Ile Leu Ser Lys Thr Phe Asp Asn Gly Met Ile Cys Ala
245 250 255
tct gaa caa gca gtc att att gat aaa gaa att tat gaa caa gta aag 816
Ser Glu Gln Ala Val Ile Ile Asp Lys Glu Ile Tyr Glu Gln Val Lys
260 265 270
aaa gaa atg ata gaa aac cat tgt tat ttc tta aat gaa gaa gaa aag 864
Lys Glu Met Ile Glu Asn His Cys Tyr Phe Leu Asn Glu Glu Glu Lys
275 280 285
aaa aaa gta gaa aaa ctc gtt atc aat gaa aat aca tgc gcc gtc aac 912
Lys Lys Val Glu Lys Leu Val Ile Asn Glu Asn Thr Cys Ala Val Asn
290 295 300
ccg gat atc gtc gga aag cca gct tat gaa att gcg aaa atg gcc ggc 960
Pro Asp Ile Val Gly Lys Pro Ala Tyr Glu Ile Ala Lys Met Ala Gly
305 310 315 320
atc gct gtg ccg gaa gac aca aaa att ctt gtt gct gag tta aaa ggg 1008
Ile Ala Val Pro Glu Asp Thr Lys Ile Leu Val Ala Glu Leu Lys Gly
325 330 335
gtc ggg cca aaa tat ccg ttg tct cgg gaa aaa tta agc cct gtc ctt 1056
Val Gly Pro Lys Tyr Pro Leu Ser Arg Glu Lys Leu Ser Pro Val Leu
340 345 350
gct tgc tat aaa gtt aac agc acg gaa gaa gga ttt aag cgc tgt gaa 1104
Ala Cys Tyr Lys Val Asn Ser Thr Glu Glu Gly Phe Lys Arg Cys Glu
355 360 365
gaa atg ctg gaa ttt ggc ggc ttg gga cat tcg gct gtc atc cat tcc 1152
Glu Met Leu Glu Phe Gly Gly Leu Gly His Ser Ala Val Ile His Ser
370 375 380
gat aat caa aac gtg gtt acc gaa ttt ggc aaa cgg atg aaa gcg gga 1200
Asp Asn Gln Asn Val Val Thr Glu Phe Gly Lys Arg Met Lys Ala Gly
385 390 395 400
cgg att atc gtt aat gcg cca tct tcg caa gga gca atc ggc gat att 1248
Arg Ile Ile Val Asn Ala Pro Ser Ser Gln Gly Ala Ile Gly Asp Ile
405 410 415
tac aat gcg tac att ccg tca tta acg ctg gga tgc ggc aca ttt ggc 1296
Tyr Asn Ala Tyr Ile Pro Ser Leu Thr Leu Gly Cys Gly Thr Phe Gly
420 425 430
gga aac tct gtt tcg aca aac gtc agt gcg att cat ctt atc aat ata 1344
Gly Asn Ser Val Ser Thr Asn Val Ser Ala Ile His Leu Ile Asn Ile
435 440 445
aaa aga atg gca aaa agg acg gta aat atg caa tgg ttt aaa gtg ccg 1392
Lys Arg Met Ala Lys Arg Thr Val Asn Met Gln Trp Phe Lys Val Pro
450 455 460
ccg aaa att tat ttc gaa aaa aat gct gta caa tac tta gcg aaa atg 1440
Pro Lys Ile Tyr Phe Glu Lys Asn Ala Val Gln Tyr Leu Ala Lys Met
465 470 475 480
ccg gat att tcc aga gct ttt atc gtc acc gac ccg gga atg gtc aag 1488
Pro Asp Ile Ser Arg Ala Phe Ile Val Thr Asp Pro Gly Met Val Lys
485 490 495
ctc gga tat gtc gat aaa gtg ctg tat tac ttg cgc aga cgc ccg gat 1536
Leu Gly Tyr Val Asp Lys Val Leu Tyr Tyr Leu Arg Arg Arg Pro Asp
500 505 510
tat gtg cat agt gaa att ttc tcc gaa gta gag cca gat cct tca att 1584
Tyr Val His Ser Glu Ile Phe Ser Glu Val Glu Pro Asp Pro Ser Ile
515 520 525
gag acg gta atg aaa ggt gtc gat atg atg aga agt ttc gag ccg gat 1632
Glu Thr Val Met Lys Gly Val Asp Met Met Arg Ser Phe Glu Pro Asp
530 535 540
gtg att atc gcg ctt gga ggc ggc tcg cca atg gat gcg gca aaa gcg 1680
Val Ile Ile Ala Leu Gly Gly Gly Ser Pro Met Asp Ala Ala Lys Ala
545 550 555 560
atg tgg ctc ttt tac gag cat ccg aca gcg gat ttc aac gca tta aaa 1728
Met Trp Leu Phe Tyr Glu His Pro Thr Ala Asp Phe Asn Ala Leu Lys
565 570 575
caa aaa ttt tta gat att cga aaa cgc gtt tat aaa tat cca aaa ctg 1776
Gln Lys Phe Leu Asp Ile Arg Lys Arg Val Tyr Lys Tyr Pro Lys Leu
580 585 590
ggc caa aaa gcg aaa ttt gtc gcc att ccg acg aca tca gga aca gga 1824
Gly Gln Lys Ala Lys Phe Val Ala Ile Pro Thr Thr Ser Gly Thr Gly
595 600 605
tcg gaa gta acg tcc ttt gcc gtc att acc gat aaa aaa acg aat ata 1872
Ser Glu Val Thr Ser Phe Ala Val Ile Thr Asp Lys Lys Thr Asn Ile
610 615 620
aaa tat ccg ttg gca gat tat gaa ttg aca ccg gac gtc gcg att gtg 1920
Lys Tyr Pro Leu Ala Asp Tyr Glu Leu Thr Pro Asp Val Ala Ile Val
625 630 635 640
gat ccg caa ttt gtc atg acc gtg cca aaa cat gtc acc gcc gat acg 1968
Asp Pro Gln Phe Val Met Thr Val Pro Lys His Val Thr Ala Asp Thr
645 650 655
gga atg gat gta ttg aca cat gcg atc gaa gcg tat gtc tcc aat atg 2016
Gly Met Asp Val Leu Thr His Ala Ile Glu Ala Tyr Val Ser Asn Met
660 665 670
gca aat gat tat acc gat ggt ctt gcc atg aaa gca atc caa ctc gta 2064
Ala Asn Asp Tyr Thr Asp Gly Leu Ala Met Lys Ala Ile Gln Leu Val
675 680 685
ttt gaa tat ttg ccg cgg gca tat caa aac gga gcg gat gag ctt gcc 2112
Phe Glu Tyr Leu Pro Arg Ala Tyr Gln Asn Gly Ala Asp Glu Leu Ala
690 695 700
cgg gag aaa atg cat aac gcc tct acg att gcg gga atg gca ttt gcc 2160
Arg Glu Lys Met His Asn Ala Ser Thr Ile Ala Gly Met Ala Phe Ala
705 710 715 720
aac gcg ttt tta ggc att aac cat agt ttg gct cat aaa ctt ggc gcg 2208
Asn Ala Phe Leu Gly Ile Asn His Ser Leu Ala His Lys Leu Gly Ala
725 730 735
gaa ttc cat att ccg cat ggg cgc gcg aat acc att ttg atg ccg cat 2256
Glu Phe His Ile Pro His Gly Arg Ala Asn Thr Ile Leu Met Pro His
740 745 750
gtc att cgc tat aac gca gcg aaa ccg aaa aaa ttt acc gca ttt ccg 2304
Val Ile Arg Tyr Asn Ala Ala Lys Pro Lys Lys Phe Thr Ala Phe Pro
755 760 765
aaa tac gaa tat ttc aaa gcg gac cag cgc tat gca gaa att gcg aga 2352
Lys Tyr Glu Tyr Phe Lys Ala Asp Gln Arg Tyr Ala Glu Ile Ala Arg
770 775 780
atg ctc ggc ttg ccg gcc cgc aca acg gaa gaa ggg gtc gaa agc ctc 2400
Met Leu Gly Leu Pro Ala Arg Thr Thr Glu Glu Gly Val Glu Ser Leu
785 790 795 800
gtt cag gcg atc att aag ctg gca aaa cag ttg gat atg ccg ctg agc 2448
Val Gln Ala Ile Ile Lys Leu Ala Lys Gln Leu Asp Met Pro Leu Ser
805 810 815
att gaa gca tgc ggc gtc agc aaa caa gaa ttt gaa agc aaa gtt gaa 2496
Ile Glu Ala Cys Gly Val Ser Lys Gln Glu Phe Glu Ser Lys Val Glu
820 825 830
aaa tta gcc gaa ttg gct ttc gaa gac caa tgt act act gct aac ccg 2544
Lys Leu Ala Glu Leu Ala Phe Glu Asp Gln Cys Thr Thr Ala Asn Pro
835 840 845
aaa ctc ccg ctt gtt agc gat tta gtt cat att tat cgc caa gcg ttt 2592
Lys Leu Pro Leu Val Ser Asp Leu Val His Ile Tyr Arg Gln Ala Phe
850 855 860
aaa gga gtt taa 2604
Lys Gly Val
865
<210> 30
<211> 867
<212> PRT
<213> 热葡糖苷酶土芽孢杆菌
<400> 30
Met Ala Val Glu Glu Arg Val Val Asp Lys Lys Ile Glu Val Ala Lys
1 5 10 15
Met Ile Asp Glu Leu Val Ala Asn Ala Gln Lys Ala Leu Glu Gln Ile
20 25 30
Arg Ala Tyr Asp Gln Glu Thr Ile Asp His Ile Val Lys Glu Met Ala
35 40 45
Leu Ala Gly Leu Asp Lys His Met Ala Leu Ala Lys Leu Ala Val Glu
50 55 60
Glu Thr Lys Arg Gly Val Tyr Glu Asp Lys Ile Ile Lys Asn Leu Phe
65 70 75 80
Ala Thr Glu Tyr Ile Tyr His Asn Ile Lys Tyr Asp Lys Thr Val Gly
85 90 95
Ile Ile His Glu Asn Pro His Glu Glu Ile Ile Glu Ile Ala Glu Pro
100 105 110
Val Gly Val Ile Ala Gly Ile Thr Pro Val Thr Asn Pro Thr Ser Thr
115 120 125
Thr Met Phe Lys Ala Leu Ile Ser Ile Lys Thr Arg Asn Pro Ile Ile
130 135 140
Phe Ala Phe His Pro Ser Ala Gln Arg Cys Ser Ser Glu Ala Ala Arg
145 150 155 160
Val Leu Arg Asp Ala Ala Val Arg Ala Gly Ala Pro Glu His Cys Ile
165 170 175
Gln Trp Ile Glu Thr Pro Ser Leu Asp Ala Thr Asn Gln Leu Met His
180 185 190
His Pro Gly Val Ser Leu Ile Leu Ala Thr Gly Gly Ala Gly Met Val
195 200 205
Lys Ala Ala Tyr Ser Ser Gly Lys Pro Ala Leu Gly Val Gly Pro Gly
210 215 220
Asn Val Pro Cys Tyr Ile Glu Lys Thr Ala Asn Ile Lys Arg Ala Val
225 230 235 240
Asn Asp Leu Ile Leu Ser Lys Thr Phe Asp Asn Gly Met Ile Cys Ala
245 250 255
Ser Glu Gln Ala Val Ile Ile Asp Lys Glu Ile Tyr Glu Gln Val Lys
260 265 270
Lys Glu Met Ile Glu Asn His Cys Tyr Phe Leu Asn Glu Glu Glu Lys
275 280 285
Lys Lys Val Glu Lys Leu Val Ile Asn Glu Asn Thr Cys Ala Val Asn
290 295 300
Pro Asp Ile Val Gly Lys Pro Ala Tyr Glu Ile Ala Lys Met Ala Gly
305 310 315 320
Ile Ala Val Pro Glu Asp Thr Lys Ile Leu Val Ala Glu Leu Lys Gly
325 330 335
Val Gly Pro Lys Tyr Pro Leu Ser Arg Glu Lys Leu Ser Pro Val Leu
340 345 350
Ala Cys Tyr Lys Val Asn Ser Thr Glu Glu Gly Phe Lys Arg Cys Glu
355 360 365
Glu Met Leu Glu Phe Gly Gly Leu Gly His Ser Ala Val Ile His Ser
370 375 380
Asp Asn Gln Asn Val Val Thr Glu Phe Gly Lys Arg Met Lys Ala Gly
385 390 395 400
Arg Ile Ile Val Asn Ala Pro Ser Ser Gln Gly Ala Ile Gly Asp Ile
405 410 415
Tyr Asn Ala Tyr Ile Pro Ser Leu Thr Leu Gly Cys Gly Thr Phe Gly
420 425 430
Gly Asn Ser Val Ser Thr Asn Val Ser Ala Ile His Leu Ile Asn Ile
435 440 445
Lys Arg Met Ala Lys Arg Thr Val Asn Met Gln Trp Phe Lys Val Pro
450 455 460
Pro Lys Ile Tyr Phe Glu Lys Asn Ala Val Gln Tyr Leu Ala Lys Met
465 470 475 480
Pro Asp Ile Ser Arg Ala Phe Ile Val Thr Asp Pro Gly Met Val Lys
485 490 495
Leu Gly Tyr Val Asp Lys Val Leu Tyr Tyr Leu Arg Arg Arg Pro Asp
500 505 510
Tyr Val His Ser Glu Ile Phe Ser Glu Val Glu Pro Asp Pro Ser Ile
515 520 525
Glu Thr Val Met Lys Gly Val Asp Met Met Arg Ser Phe Glu Pro Asp
530 535 540
Val Ile Ile Ala Leu Gly Gly Gly Ser Pro Met Asp Ala Ala Lys Ala
545 550 555 560
Met Trp Leu Phe Tyr Glu His Pro Thr Ala Asp Phe Asn Ala Leu Lys
565 570 575
Gln Lys Phe Leu Asp Ile Arg Lys Arg Val Tyr Lys Tyr Pro Lys Leu
580 585 590
Gly Gln Lys Ala Lys Phe Val Ala Ile Pro Thr Thr Ser Gly Thr Gly
595 600 605
Ser Glu Val Thr Ser Phe Ala Val Ile Thr Asp Lys Lys Thr Asn Ile
610 615 620
Lys Tyr Pro Leu Ala Asp Tyr Glu Leu Thr Pro Asp Val Ala Ile Val
625 630 635 640
Asp Pro Gln Phe Val Met Thr Val Pro Lys His Val Thr Ala Asp Thr
645 650 655
Gly Met Asp Val Leu Thr His Ala Ile Glu Ala Tyr Val Ser Asn Met
660 665 670
Ala Asn Asp Tyr Thr Asp Gly Leu Ala Met Lys Ala Ile Gln Leu Val
675 680 685
Phe Glu Tyr Leu Pro Arg Ala Tyr Gln Asn Gly Ala Asp Glu Leu Ala
690 695 700
Arg Glu Lys Met His Asn Ala Ser Thr Ile Ala Gly Met Ala Phe Ala
705 710 715 720
Asn Ala Phe Leu Gly Ile Asn His Ser Leu Ala His Lys Leu Gly Ala
725 730 735
Glu Phe His Ile Pro His Gly Arg Ala Asn Thr Ile Leu Met Pro His
740 745 750
Val Ile Arg Tyr Asn Ala Ala Lys Pro Lys Lys Phe Thr Ala Phe Pro
755 760 765
Lys Tyr Glu Tyr Phe Lys Ala Asp Gln Arg Tyr Ala Glu Ile Ala Arg
770 775 780
Met Leu Gly Leu Pro Ala Arg Thr Thr Glu Glu Gly Val Glu Ser Leu
785 790 795 800
Val Gln Ala Ile Ile Lys Leu Ala Lys Gln Leu Asp Met Pro Leu Ser
805 810 815
Ile Glu Ala Cys Gly Val Ser Lys Gln Glu Phe Glu Ser Lys Val Glu
820 825 830
Lys Leu Ala Glu Leu Ala Phe Glu Asp Gln Cys Thr Thr Ala Asn Pro
835 840 845
Lys Leu Pro Leu Val Ser Asp Leu Val His Ile Tyr Arg Gln Ala Phe
850 855 860
Lys Gly Val
865
<210> 31
<211> 975
<212> DNA
<213> 热葡糖苷酶土芽孢杆菌
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(975)
<400> 31
gtg agc agt gat tta ttt tcg aca tta aaa gaa aaa ata gcg gga aaa 48
Val Ser Ser Asp Leu Phe Ser Thr Leu Lys Glu Lys Ile Ala Gly Lys
1 5 10 15
caa cgg aaa atc gtg ttt ccg gaa ggg ctt gat gag cgt att tta aca 96
Gln Arg Lys Ile Val Phe Pro Glu Gly Leu Asp Glu Arg Ile Leu Thr
20 25 30
gcg gta agc cgt ctg gcg aac gag caa atc gtc acg ccg att gtc att 144
Ala Val Ser Arg Leu Ala Asn Glu Gln Ile Val Thr Pro Ile Val Ile
35 40 45
ggc aat gaa gaa gcg gtt aag caa aaa gca agc gag ctt ggg ctg acg 192
Gly Asn Glu Glu Ala Val Lys Gln Lys Ala Ser Glu Leu Gly Leu Thr
50 55 60
ctt ccg aat gtc gaa atc att gat ccg cat cag tac ggg gaa atg gac 240
Leu Pro Asn Val Glu Ile Ile Asp Pro His Gln Tyr Gly Glu Met Asp
65 70 75 80
aag ctt gtt gcg gca ttt gtc gaa cgc cgc aaa ggg aaa gtg acg gaa 288
Lys Leu Val Ala Ala Phe Val Glu Arg Arg Lys Gly Lys Val Thr Glu
85 90 95
gaa gcg gcg cgg aag ctg ctt ctt gac gaa aat tat ttt ggc acc atg 336
Glu Ala Ala Arg Lys Leu Leu Leu Asp Glu Asn Tyr Phe Gly Thr Met
100 105 110
ctt gtg tac atg gat aag gcg cat ggg ctt gtc agc ggc gcg gcg cat 384
Leu Val Tyr Met Asp Lys Ala His Gly Leu Val Ser Gly Ala Ala His
115 120 125
tcg acg gct gat acg gtg cgg cct gcg ttg caa att ata aaa acg aaa 432
Ser Thr Ala Asp Thr Val Arg Pro Ala Leu Gln Ile Ile Lys Thr Lys
130 135 140
caa ggc gtc cgc aaa acg tca gga gta ttc att atg gtg cgc ggt gat 480
Gln Gly Val Arg Lys Thr Ser Gly Val Phe Ile Met Val Arg Gly Asp
145 150 155 160
gaa aag tac gtg ttt gcc gat tgc gcg atc aac att gcc ccg gac agc 528
Glu Lys Tyr Val Phe Ala Asp Cys Ala Ile Asn Ile Ala Pro Asp Ser
165 170 175
caa gat ttg gcg gaa atc gct gtc gaa agc gcc aac acg gca aaa atg 576
Gln Asp Leu Ala Glu Ile Ala Val Glu Ser Ala Asn Thr Ala Lys Met
180 185 190
ttc gac att gag ccg cgc gtg gcg atg ttg agc ttt tcg aca aaa gga 624
Phe Asp Ile Glu Pro Arg Val Ala Met Leu Ser Phe Ser Thr Lys Gly
195 200 205
tca gcg aaa tcg cca gaa acg gaa aaa gtc gtc gaa gcg gtg cgg ctt 672
Ser Ala Lys Ser Pro Glu Thr Glu Lys Val Val Glu Ala Val Arg Leu
210 215 220
gcg aaa gaa atg gcg cct gac tta gtg ctg gac ggt gag ttt cag ttc 720
Ala Lys Glu Met Ala Pro Asp Leu Val Leu Asp Gly Glu Phe Gln Phe
225 230 235 240
gac gcg gcg ttt gtt ccg tct gtc gcg aaa aag aaa gcg cca gat tcc 768
Asp Ala Ala Phe Val Pro Ser Val Ala Lys Lys Lys Ala Pro Asp Ser
245 250 255
gtc att caa gga gac gcg aac gta ttt att ttc cca agc ctt gaa gcg 816
Val Ile Gln Gly Asp Ala Asn Val Phe Ile Phe Pro Ser Leu Glu Ala
260 265 270
gga aat atc ggc tat aaa atc gcc cag cgt ctc ggc aac ttt gaa gcg 864
Gly Asn Ile Gly Tyr Lys Ile Ala Gln Arg Leu Gly Asn Phe Glu Ala
275 280 285
gtc ggc ccg att ttg caa gga ctc aat aag cct gtg aac gac ctg tca 912
Val Gly Pro Ile Leu Gln Gly Leu Asn Lys Pro Val Asn Asp Leu Ser
290 295 300
cgc ggt tgc aat gcg gaa gat gtg tac aag ctg acg ctt ata act gcg 960
Arg Gly Cys Asn Ala Glu Asp Val Tyr Lys Leu Thr Leu Ile Thr Ala
305 310 315 320
gcg caa tcg cta taa 975
Ala Gln Ser Leu
<210> 32
<211> 324
<212> PRT
<213> 热葡糖苷酶土芽孢杆菌
<400> 32
Val Ser Ser Asp Leu Phe Ser Thr Leu Lys Glu Lys Ile Ala Gly Lys
1 5 10 15
Gln Arg Lys Ile Val Phe Pro Glu Gly Leu Asp Glu Arg Ile Leu Thr
20 25 30
Ala Val Ser Arg Leu Ala Asn Glu Gln Ile Val Thr Pro Ile Val Ile
35 40 45
Gly Asn Glu Glu Ala Val Lys Gln Lys Ala Ser Glu Leu Gly Leu Thr
50 55 60
Leu Pro Asn Val Glu Ile Ile Asp Pro His Gln Tyr Gly Glu Met Asp
65 70 75 80
Lys Leu Val Ala Ala Phe Val Glu Arg Arg Lys Gly Lys Val Thr Glu
85 90 95
Glu Ala Ala Arg Lys Leu Leu Leu Asp Glu Asn Tyr Phe Gly Thr Met
100 105 110
Leu Val Tyr Met Asp Lys Ala His Gly Leu Val Ser Gly Ala Ala His
115 120 125
Ser Thr Ala Asp Thr Val Arg Pro Ala Leu Gln Ile Ile Lys Thr Lys
130 135 140
Gln Gly Val Arg Lys Thr Ser Gly Val Phe Ile Met Val Arg Gly Asp
145 150 155 160
Glu Lys Tyr Val Phe Ala Asp Cys Ala Ile Asn Ile Ala Pro Asp Ser
165 170 175
Gln Asp Leu Ala Glu Ile Ala Val Glu Ser Ala Asn Thr Ala Lys Met
180 185 190
Phe Asp Ile Glu Pro Arg Val Ala Met Leu Ser Phe Ser Thr Lys Gly
195 200 205
Ser Ala Lys Ser Pro Glu Thr Glu Lys Val Val Glu Ala Val Arg Leu
210 215 220
Ala Lys Glu Met Ala Pro Asp Leu Val Leu Asp Gly Glu Phe Gln Phe
225 230 235 240
Asp Ala Ala Phe Val Pro Ser Val Ala Lys Lys Lys Ala Pro Asp Ser
245 250 255
Val Ile Gln Gly Asp Ala Asn Val Phe Ile Phe Pro Ser Leu Glu Ala
260 265 270
Gly Asn Ile Gly Tyr Lys Ile Ala Gln Arg Leu Gly Asn Phe Glu Ala
275 280 285
Val Gly Pro Ile Leu Gln Gly Leu Asn Lys Pro Val Asn Asp Leu Ser
290 295 300
Arg Gly Cys Asn Ala Glu Asp Val Tyr Lys Leu Thr Leu Ile Thr Ala
305 310 315 320
Ala Gln Ser Leu
<210> 33
<211> 750
<212> DNA
<213> 热葡糖苷酶土芽孢杆菌
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(750)
<400> 33
atg gat gtc gat gtc aag cga gat cag acg ctg tta aaa gat cat gag 48
Met Asp Val Asp Val Lys Arg Asp Gln Thr Leu Leu Lys Asp His Glu
1 5 10 15
atg aaa aag ctt att cgc cgc agc caa gag ggg gac caa cag gcg cgc 96
Met Lys Lys Leu Ile Arg Arg Ser Gln Glu Gly Asp Gln Gln Ala Arg
20 25 30
aat gaa att atc caa aaa aac atg cgc ctc gtt tgg tcg gtc gtc cag 144
Asn Glu Ile Ile Gln Lys Asn Met Arg Leu Val Trp Ser Val Val Gln
35 40 45
cgc ttt ttg aac cgc gga tac gag ccg gac gat tta ttt caa att ggc 192
Arg Phe Leu Asn Arg Gly Tyr Glu Pro Asp Asp Leu Phe Gln Ile Gly
50 55 60
tgc atc ggc ttg ctt aaa tct gtt gat aag ttt gat ttg tcg tat gac 240
Cys Ile Gly Leu Leu Lys Ser Val Asp Lys Phe Asp Leu Ser Tyr Asp
65 70 75 80
gtg aag ttt tcc aca tat gcg gtg ccg atg atc atc ggc gaa att cag 288
Val Lys Phe Ser Thr Tyr Ala Val Pro Met Ile Ile Gly Glu Ile Gln
85 90 95
cgg ttt atc cgc gat gac ggg acg gtg aaa gtg agc cgt tcc tta aaa 336
Arg Phe Ile Arg Asp Asp Gly Thr Val Lys Val Ser Arg Ser Leu Lys
100 105 110
gaa acg ggc aat aaa atc cgg aaa gca aga gac gag ctt tcg aaa aaa 384
Glu Thr Gly Asn Lys Ile Arg Lys Ala Arg Asp Glu Leu Ser Lys Lys
115 120 125
cat gga cgg gcg cca acg gtg aca gaa atc gcc gat tat tta gaa att 432
His Gly Arg Ala Pro Thr Val Thr Glu Ile Ala Asp Tyr Leu Glu Ile
130 135 140
tct cca gaa gaa gtg gtg ctt gcc cag gaa gcc gtt cgt tcc ccg gct 480
Ser Pro Glu Glu Val Val Leu Ala Gln Glu Ala Val Arg Ser Pro Ala
145 150 155 160
tcc att cac gaa aca gtg tat gaa aac gac ggc gac ccg atc acg ctc 528
Ser Ile His Glu Thr Val Tyr Glu Asn Asp Gly Asp Pro Ile Thr Leu
165 170 175
ctc gat caa att gct gat gcc gac gaa gca tca tgg ttt gat aaa atc 576
Leu Asp Gln Ile Ala Asp Ala Asp Glu Ala Ser Trp Phe Asp Lys Ile
180 185 190
gcg ttg aaa aaa gcg att gag gag ctg gat gaa cgg gaa cgt ctc atc 624
Ala Leu Lys Lys Ala Ile Glu Glu Leu Asp Glu Arg Glu Arg Leu Ile
195 200 205
gtc tat ttg cgt tat tac aaa gat caa acc cag tcg gaa gtg gca tca 672
Val Tyr Leu Arg Tyr Tyr Lys Asp Gln Thr Gln Ser Glu Val Ala Ser
210 215 220
aga tta ggc atc tct caa gtt caa gta tcc cgt ctt gaa aaa aaa att 720
Arg Leu Gly Ile Ser Gln Val Gln Val Ser Arg Leu Glu Lys Lys Ile
225 230 235 240
tta cag caa ata aag gag aga atg gat ggg 750
Leu Gln Gln Ile Lys Glu Arg Met Asp Gly
245 250
<210> 34
<211> 250
<212> PRT
<213> 热葡糖苷酶土芽孢杆菌
<400> 34
Met Asp Val Asp Val Lys Arg Asp Gln Thr Leu Leu Lys Asp His Glu
1 5 10 15
Met Lys Lys Leu Ile Arg Arg Ser Gln Glu Gly Asp Gln Gln Ala Arg
20 25 30
Asn Glu Ile Ile Gln Lys Asn Met Arg Leu Val Trp Ser Val Val Gln
35 40 45
Arg Phe Leu Asn Arg Gly Tyr Glu Pro Asp Asp Leu Phe Gln Ile Gly
50 55 60
Cys Ile Gly Leu Leu Lys Ser Val Asp Lys Phe Asp Leu Ser Tyr Asp
65 70 75 80
Val Lys Phe Ser Thr Tyr Ala Val Pro Met Ile Ile Gly Glu Ile Gln
85 90 95
Arg Phe Ile Arg Asp Asp Gly Thr Val Lys Val Ser Arg Ser Leu Lys
100 105 110
Glu Thr Gly Asn Lys Ile Arg Lys Ala Arg Asp Glu Leu Ser Lys Lys
115 120 125
His Gly Arg Ala Pro Thr Val Thr Glu Ile Ala Asp Tyr Leu Glu Ile
130 135 140
Ser Pro Glu Glu Val Val Leu Ala Gln Glu Ala Val Arg Ser Pro Ala
145 150 155 160
Ser Ile His Glu Thr Val Tyr Glu Asn Asp Gly Asp Pro Ile Thr Leu
165 170 175
Leu Asp Gln Ile Ala Asp Ala Asp Glu Ala Ser Trp Phe Asp Lys Ile
180 185 190
Ala Leu Lys Lys Ala Ile Glu Glu Leu Asp Glu Arg Glu Arg Leu Ile
195 200 205
Val Tyr Leu Arg Tyr Tyr Lys Asp Gln Thr Gln Ser Glu Val Ala Ser
210 215 220
Arg Leu Gly Ile Ser Gln Val Gln Val Ser Arg Leu Glu Lys Lys Ile
225 230 235 240
Leu Gln Gln Ile Lys Glu Arg Met Asp Gly
245 250

Claims (14)

1.兼性厌氧并且产生(S)-乳酸的遗传工程化的革兰氏阳性、嗜热的热葡糖苷酶土芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidans)细胞，其中所述细胞包含：
失活或缺失的内源性甲基乙二醛合成酶基因mgsA，
其中所述细胞是同型乳酸的，以对映体纯度至少98％产生(S)-乳酸。
2.权利要求1所述的细胞，其中内源性丙酮酸甲酸裂解酶A和/或B基因也被失活或缺失。
3.权利要求1或2所述的细胞，其是由于内源性孢子生成基因的失活或缺失而产生的孢子生成缺陷型衍生体。
4.权利要求3所述的细胞，其中所述内源性孢子生成基因是sigF。
5.权利要求2所述的细胞，其中所述内源性丙酮酸甲酸裂解酶A和/或B基因通过丙酮酸甲酸裂解酶/醇脱氢酶基因座pflBA-adhE的失活或缺失而失活。
6.权利要求1或2所述的细胞，其产生具有至少99％的对映体纯度的(S)-乳酸。
7.权利要求1或2所述的细胞，其中内源性磷酸转乙酰酶基因(pta)也被失活或缺失。
8.权利要求1或2所述的细菌细胞，其中所述基因通过同源重组失活或缺失。
9.一种生产对映体纯的(S)-乳酸的方法，所述方法包括使用合适的可发酵的含碳原料培养权利要求1-8中任一项所述的嗜热的热葡糖苷酶土芽孢杆菌细胞，以及分离(S)-乳酸。
10.权利要求9所述的方法，其中所述含碳原料包括木糖、葡萄糖或蔗糖。
11.权利要求9或10所述的方法，其中所述培养在50℃至70℃的温度进行。
12.权利要求9或10所述的方法，其中基于乙醇、乙酸和甲酸副产物的总重量相对于所产生的乳酸的总重量，形成不超过15％(w/w)的乙醇、乙酸和甲酸副产物。
13.权利要求9或10所述的方法，其中除了内源性mgsA基因之外，所述细胞内的内源性pflA和/或pflB基因以及内源性adhE基因也被失活或缺失，从而基于乙醇、乙酸和甲酸副产物的总重量相对于所产生的乳酸的总重量，形成不超过10％(w/w)的乙醇、乙酸和甲酸副产物。
14.权利要求9或10所述的方法，其中基于甲酸、乙醇或乙酸的总重量相对于所产生的乳酸的总重量，所形成的甲酸、乙醇和乙酸中的至少一种的量不超过10％(w/w)。
CN201580039353.5A 2014-07-23 2015-07-13 产生(s)-乳酸的嗜热细菌的遗传修饰 Active CN106536543B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14178150.0 2014-07-23
EP14178150.0A EP2977471A1 (en) 2014-07-23 2014-07-23 Genetic modification of (S)-lactic acid producing thermophilic bacteria
PCT/EP2015/065995 WO2016012298A1 (en) 2014-07-23 2015-07-13 Genetic modification of (s)-lactic acid producing thermophilic bacteria

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106536543A CN106536543A (zh) 2017-03-22
CN106536543B true CN106536543B (zh) 2021-05-07

Family

ID=51211698

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580039353.5A Active CN106536543B (zh) 2014-07-23 2015-07-13 产生(s)-乳酸的嗜热细菌的遗传修饰

Country Status (15)

Country Link
US (1) US10273509B2 (zh)
EP (2) EP2977471A1 (zh)
JP (2) JP6549214B2 (zh)
KR (1) KR101999975B1 (zh)
CN (1) CN106536543B (zh)
AU (1) AU2015294138B2 (zh)
BR (1) BR112017000940B1 (zh)
CA (1) CA2955720C (zh)
DK (1) DK3177741T3 (zh)
ES (1) ES2924250T3 (zh)
HU (1) HUE059443T2 (zh)
PL (1) PL3177741T3 (zh)
RU (1) RU2671528C2 (zh)
UA (1) UA121479C2 (zh)
WO (1) WO2016012298A1 (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003008601A2 (en) * 2001-07-18 2003-01-30 Elsworth Biotechnology Limited Lactic acid production
CN1513057A (zh) * 2001-05-29 2004-07-14 ������������ʽ���� 宿主微生物
CN101654666A (zh) * 2003-09-30 2010-02-24 三井化学株式会社 用于生产d-乳酸的生物催化剂
CN102498209A (zh) * 2009-08-21 2012-06-13 旭硝子株式会社 转化体及其制造方法以及乳酸的制造方法
CN103396974A (zh) * 2005-08-10 2013-11-20 佛罗里达大学研究基金会公司 用于高效乳酸生产的材料和方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL1013682C2 (nl) 1999-11-26 2001-05-30 Purac Biochem Bv Werkwijze en inrichting voor het zuiveren van een waterige oplossing van melkzuur.
GB0000185D0 (en) 2000-01-06 2000-03-01 Agrol Limited Ethanol production
JP4336082B2 (ja) 2001-05-29 2009-09-30 花王株式会社 宿主微生物
US7098009B2 (en) * 2004-03-04 2006-08-29 University Of Florida Research Foundation, Inc. Production of chemicals from lignocellulose, biomass or sugars
NZ563043A (en) 2005-05-04 2010-04-30 Tmo Renewables Ltd Thermophilic microorganisms with inactivated lactate dehydrogenase gene (LDH) for ethanol production
ATE371685T1 (de) 2006-01-24 2007-09-15 Lurgi Zimmer Gmbh Verfahren zur veresterung von terephthalsäure mit butandiol, verfahren zur herstellung von polybutylenterephthalat und vorrichtung dafür
BRPI0717228A2 (pt) 2006-09-28 2013-10-08 Tmo Renewables Ltd Micro-organismos termofílicos para produção de etanol
RU2355759C1 (ru) 2007-08-14 2009-05-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АРОМАТИЧЕСКОЙ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН ydiB, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЛОЖНОГО ЭФИРА НИЗШИХ АЛКИЛОВ АЛЬФА-L-АСПАРТИЛ-L-ФЕНИЛАЛАНИНА
GB0820262D0 (en) 2008-11-05 2008-12-10 Tmo Renewables Ltd Microorganisms
AR077204A1 (es) 2009-06-23 2011-08-10 Verenium Corp Bacterias etanologenicas recombinantes

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1513057A (zh) * 2001-05-29 2004-07-14 ������������ʽ���� 宿主微生物
WO2003008601A2 (en) * 2001-07-18 2003-01-30 Elsworth Biotechnology Limited Lactic acid production
CN101654666A (zh) * 2003-09-30 2010-02-24 三井化学株式会社 用于生产d-乳酸的生物催化剂
CN103396974A (zh) * 2005-08-10 2013-11-20 佛罗里达大学研究基金会公司 用于高效乳酸生产的材料和方法
CN102498209A (zh) * 2009-08-21 2012-06-13 旭硝子株式会社 转化体及其制造方法以及乳酸的制造方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Deletion of methylglyoxal synthase gene (mgsA) increased sugar co-metabolism in ethanol-producing Escherichia coli;Yomano等;《Biotechnol Lett》;20091231(第31期);第1396页右栏第2段 *
Efficient synthesis of L-lactic acid from glycerol by metabolically engineered Escherichia coli;Suman Mazumdar等;《Microbial Cell Factories》;20131231;第12卷(第7期);第3页右栏第3-4段、第4页表1 *

Also Published As

Publication number Publication date
PL3177741T3 (pl) 2022-10-03
US20170298398A1 (en) 2017-10-19
DK3177741T3 (da) 2022-09-12
JP2017521081A (ja) 2017-08-03
ES2924250T3 (es) 2022-10-05
AU2015294138A1 (en) 2017-02-09
BR112017000940A2 (pt) 2017-11-14
CN106536543A (zh) 2017-03-22
CA2955720C (en) 2019-11-05
JP2019088328A (ja) 2019-06-13
RU2017102895A (ru) 2018-08-27
RU2671528C2 (ru) 2018-11-01
RU2017102895A3 (zh) 2018-08-27
AU2015294138B2 (en) 2018-07-19
KR20170028445A (ko) 2017-03-13
JP6549214B2 (ja) 2019-07-24
EP3177741B1 (en) 2022-06-29
EP2977471A1 (en) 2016-01-27
UA121479C2 (uk) 2020-06-10
CA2955720A1 (en) 2016-01-28
HUE059443T2 (hu) 2022-11-28
US10273509B2 (en) 2019-04-30
EP3177741A1 (en) 2017-06-14
WO2016012298A1 (en) 2016-01-28
BR112017000940B1 (pt) 2024-01-16
KR101999975B1 (ko) 2019-07-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106574236B (zh) 遗传修饰的产生(r)-乳酸的嗜热细菌
US10287558B2 (en) Microorganisms for succinic acid production
EP3102674B1 (en) Modified microorganism with improved biomass separation behaviour
CN106536543B (zh) 产生(s)-乳酸的嗜热细菌的遗传修饰
JP7158107B2 (ja) 有機化合物の生産方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant