RU2671528C2 - Генетическая модификация продуцирующих (S)-молочную кислоту термофильных бактерий - Google Patents
Генетическая модификация продуцирующих (S)-молочную кислоту термофильных бактерий Download PDFInfo
- Publication number
- RU2671528C2 RU2671528C2 RU2017102895A RU2017102895A RU2671528C2 RU 2671528 C2 RU2671528 C2 RU 2671528C2 RU 2017102895 A RU2017102895 A RU 2017102895A RU 2017102895 A RU2017102895 A RU 2017102895A RU 2671528 C2 RU2671528 C2 RU 2671528C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- lactic acid
- mass
- total mass
- acid
- ethanol
- Prior art date
Links
- JVTAAEKCZFNVCJ-REOHCLBHSA-N L-lactic acid Chemical compound C[C@H](O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-REOHCLBHSA-N 0.000 title claims abstract description 111
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title description 7
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 title description 3
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 title description 3
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 title description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 41
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 22
- 241000626621 Geobacillus Species 0.000 claims abstract description 15
- 101150083023 mgsA gene Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 101100139916 Escherichia coli (strain K12) rarA gene Proteins 0.000 claims abstract description 9
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 98
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 96
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 93
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 58
- 241000193390 Parageobacillus thermoglucosidasius Species 0.000 claims description 52
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims description 49
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims description 49
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 48
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 29
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims description 29
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 claims description 28
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 claims description 27
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 19
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 19
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 17
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 17
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 108010008221 formate C-acetyltransferase Proteins 0.000 claims description 16
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 12
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 claims description 12
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 9
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 9
- 101150067544 sigF gene Proteins 0.000 claims description 8
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 7
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 7
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 6
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 6
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 108700023175 Phosphate acetyltransferases Proteins 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 41
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 108010083856 methylglyoxal synthase Proteins 0.000 abstract description 5
- 102100033598 Triosephosphate isomerase Human genes 0.000 abstract description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 3
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 abstract 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 42
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 26
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 26
- AIJULSRZWUXGPQ-UHFFFAOYSA-N Methylglyoxal Chemical compound CC(=O)C=O AIJULSRZWUXGPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 21
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 21
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 20
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 16
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- JVTAAEKCZFNVCJ-UWTATZPHSA-N D-lactic acid Chemical compound C[C@@H](O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 12
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 101150014383 adhE gene Proteins 0.000 description 12
- 229930182843 D-Lactic acid Natural products 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 10
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 9
- 241000894007 species Species 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000001030 gas--liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 6
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 101100125751 Mus musculus Ifna6 gene Proteins 0.000 description 5
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 5
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 4
- 101100396562 Mus musculus Ifna9 gene Proteins 0.000 description 4
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 3
- 108010001539 D-lactate dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 108010022065 Lactate racemase Proteins 0.000 description 3
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- UHNHELGKNQMNGF-AOQKXWSCSA-N bacillithiol Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O UHNHELGKNQMNGF-AOQKXWSCSA-N 0.000 description 3
- 239000002585 base Substances 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-IUCAKERBSA-N 2,2-dichloro-n-[(1s,2s)-1,3-dihydroxy-1-(4-nitrophenyl)propan-2-yl]acetamide Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@@H](CO)[C@@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 102100023319 Dihydrolipoyl dehydrogenase, mitochondrial Human genes 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 2
- 241001468176 Geobacillus thermoleovorans Species 0.000 description 2
- PSJQCAMBOYBQEU-UHFFFAOYSA-N Glyoxalase I Natural products CC=CC(=O)OCC1=CC(O)C(O)C(O)C1=O PSJQCAMBOYBQEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000014017 Lactoylglutathione lyase Human genes 0.000 description 2
- 108010050765 Lactoylglutathione lyase Proteins 0.000 description 2
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- 108010065064 acetaldehyde dehydrogenase (acylating) Proteins 0.000 description 2
- RHHGBCYEBPMXAF-BLPRJPCASA-N acetaldehyde;[[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-4-hydroxy-3-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(3r)-3-hydroxy-2,2-dimethyl-4-oxo-4-[[3-oxo-3-(2-sulfanylethylamino)propyl]amino]butyl] hydrogen phosphate Chemical compound CC=O.O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RHHGBCYEBPMXAF-BLPRJPCASA-N 0.000 description 2
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- GNGACRATGGDKBX-UHFFFAOYSA-N dihydroxyacetone phosphate Chemical compound OCC(=O)COP(O)(O)=O GNGACRATGGDKBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N glycine betaine Chemical compound C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QWDJLDTYWNBUKE-UHFFFAOYSA-L magnesium bicarbonate Chemical compound [Mg+2].OC([O-])=O.OC([O-])=O QWDJLDTYWNBUKE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000002370 magnesium bicarbonate Substances 0.000 description 2
- 229910000022 magnesium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000014824 magnesium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 2
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- VTHJTEIRLNZDEV-UHFFFAOYSA-L magnesium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Mg+2] VTHJTEIRLNZDEV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000347 magnesium hydroxide Substances 0.000 description 2
- 229910001862 magnesium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 235000021048 nutrient requirements Nutrition 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- NHZMQXZHNVQTQA-UHFFFAOYSA-N pyridoxamine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CN)=C1O NHZMQXZHNVQTQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UWTATZPHSA-M (R)-lactate Chemical compound C[C@@H](O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UWTATZPHSA-M 0.000 description 1
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LPEKGGXMPWTOCB-UHFFFAOYSA-N 8beta-(2,3-epoxy-2-methylbutyryloxy)-14-acetoxytithifolin Natural products COC(=O)C(C)O LPEKGGXMPWTOCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- QMNRPYUGXITADY-HSHFZTNMSA-N CC(=O)C=O.C([C@H](O)C)(=O)O Chemical compound CC(=O)C=O.C([C@H](O)C)(=O)O QMNRPYUGXITADY-HSHFZTNMSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000034573 Channels Human genes 0.000 description 1
- GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N Chick antidermatitis factor Natural products OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000195597 Chlamydomonas reinhardtii Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 239000011665 D-biotin Substances 0.000 description 1
- 235000000638 D-biotin Nutrition 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 241000193419 Geobacillus kaustophilus Species 0.000 description 1
- 241001468175 Geobacillus thermodenitrificans Species 0.000 description 1
- 241000652008 Geobacillus tropicalis Species 0.000 description 1
- 241000522069 Gracilaria debilis Species 0.000 description 1
- 241000621271 Gymnomyces pallidus Species 0.000 description 1
- 101000861519 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Probable formate transporter Proteins 0.000 description 1
- 102100040544 Hydroxyacylglutathione hydrolase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 101100449533 Mus musculus Cxcl1 gene Proteins 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001621940 Parageobacillus caldoxylosilyticus Species 0.000 description 1
- 241001663853 Parageobacillus toebii Species 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010019653 Pwo polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101100083037 Streptococcus mutans serotype c (strain ATCC 700610 / UA159) act gene Proteins 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 150000001447 alkali salts Chemical class 0.000 description 1
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000009604 anaerobic growth Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 1
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N carbonic acid Chemical class OC(O)=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- ASARMUCNOOHMLO-WLORSUFZSA-L cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2s)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O ASARMUCNOOHMLO-WLORSUFZSA-L 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 229940022769 d- lactic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical compound CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- ODQWQRRAPPTVAG-GZTJUZNOSA-N doxepin Chemical compound C1OC2=CC=CC=C2C(=C/CCN(C)C)/C2=CC=CC=C21 ODQWQRRAPPTVAG-GZTJUZNOSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000000909 electrodialysis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 description 1
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 description 1
- 238000005188 flotation Methods 0.000 description 1
- 101150077334 focA gene Proteins 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000011087 fumaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010092127 glyoxalase III Proteins 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000004679 hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 108010025042 hydroxyacylglutathione hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000009655 industrial fermentation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000003903 lactic acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N methionine Chemical compound CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940057867 methyl lactate Drugs 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 230000008723 osmotic stress Effects 0.000 description 1
- 229940055726 pantothenic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 101150049339 pflA gene Proteins 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 101150004519 pilC gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930010796 primary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 108010009004 proteose-peptone Proteins 0.000 description 1
- FCHXJFJNDJXENQ-UHFFFAOYSA-N pyridoxal hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=NC=C(CO)C(C=O)=C1O FCHXJFJNDJXENQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000008151 pyridoxamine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011699 pyridoxamine Substances 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000010282 redox signaling Effects 0.000 description 1
- 230000029219 regulation of pH Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 101150042065 spo0A gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/56—Lactic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
- C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
- C12Y203/01008—Phosphate acetyltransferase (2.3.1.8)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
- C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
- C12Y203/01054—Formate C-acetyltransferase (2.3.1.54), i.e. pyruvate formate-lyase or PFL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
- C12Y402/03—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on phosphates (4.2.3)
- C12Y402/03003—Methylglyoxal synthase (4.2.3.3)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к полученной генно-инженерным путем термофильной бактериальной клетке, продуцирующей (S)-молочную кислоту, и способу продуцирования энантиомерно чистой (S)-молочной кислоты. Предложена полученная генно-инженерным путем термофильная бактериальная клетка, представляющая собой факультативно анаэробную, грамположительную и продуцирующую (S)-молочную кислоту клетку, принадлежащую роду Geobacillus, в которой эндогенный ген mgsA метилглиоксальсинтазы инактивирован или делетирован. Предложен также способ продуцирования энантиомерно чистой (S)-молочной кислоты, включающий культивирование указанной клетки с использованием подходящего ферментируемого углеродсодержащего источника питания и выделение (S)-молочной кислоты. Группа изобретений обеспечивает получение энантиомерно чистой (S)-молочной кислоты с чистотой не менее 99, 7%. 2 н. и 25 з.п. ф-лы, 5 табл., 2 пр.
Description
Настоящее изобретение относится к модифицированию термофильной бактериальной клетки для гомомолочного продуцирования энантиомерно чистой (S)-молочной кислоты, к генетически модифицированной клетке и к способу продуцирования энантиомерно чистой (S)-молочной кислоты.
Молочная кислота и ее соли, известные как лактаты, являются коммерческими продуктами, полезными в различных областях, включая медицину, биоразлагаемые полимеры и пищевую промышленность. Термофильные бактерии, такие как Geobacillus, которые являются факультативными анаэробами, представляются идеальными организмами для промышленного производства молочной кислоты. Они способны расти при температурах от 37 до 75°C, с оптимумом при 55-65°C (Nazina et al., 2001, Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51:433-446), и обеспечивают возможность анаэробной промышленной ферментации при температурах выше 50°C. Такая высокая температура имеет ряд преимуществ при ферментировании в промышленном масштабе: меньший риск инфицирования и, таким образом, более высокая энантиомерная чистота, более быстрые реакции, более низкие затраты на охлаждение и так далее. Факультативно-анаэробная природа Geobacilli делает возможным ферментирование в анаэробных условиях или по меньшей мере при низком парциальном давлении кислорода, что является желательным для промышленного масштаба, поскольку это допускает возможность использования относительно недорогих оборудования и технологии. Кроме того, у этих бактерий менее жесткие требования к питательным веществам, чем у молочнокислых бактерий, таких как вид Lactobacillus, что также допускает относительно недорогие промышленные процессы.
Известно, что виды Geobacillus, которые являются факультативными анаэробами, продуцируют молочную кислоту при росте в анаэробных условиях или по меньшей мере при низком парциальном давлении кислорода. Примерами являются G. caldotenax, G. caldoxylosilyticus, G. debilis, G. kaustophilus, G. pallidus, G. stearothermophilus, G. tepidimans, G. thermodenitrificans, G. thermoglucosidans, G. thermoleovorans, G. toebii, G. tropicalis.
G. thermoglucosidans может продуцировать молочную кислоту из ксилозы, арабинозы, глюкозы, фруктозы, сахарозы и целлобиозы (Green et al., 2003, WO 03/008601). Для промышленного применения наиболее подходящим является источник питания, содержащий сахарозу, глюкозу, ксилозу или арабинозу или их смеси. Способность одновременно утилизировать глюкозу и ксилозу (Green et al., 2003, WO 03/008601) является важным преимуществом G. thermoglucosidans при использовании ферментируемых Сахаров, полученных из лигноцеллюлозного сырья.
Одним из недостатков известных видов Geobacillus, которые являются факультативными анаэробами, является тот факт, что они ферментируются с образованием смеси кислот, продуцируя молочную кислоту, этанол, уксусную кислоту и муравьиную кислоту в качестве основных продуктов ферментации. В данной заявке термин «органические кислоты» также предусматривает включение их соответствующих солей.
Другой недостаток заключается в том, что большинство видов не продуцируют энантиомерно чистую молочную кислоту. Хиральная чистота является важным аспектом для производства полимеров полимолочной кислоты. Таким образом, для промышленных применений существенным является производство энантриомерно чистой (S)-молочной кислоты. Однако на сегодняшний день доступна только ограниченная информация по энантиомерной чистоте молочной кислоты, продуцируемой видами Geobacillus. Следует иметь в виду, что другими терминами для (S)-молочной кислоты являются L-молочная кислота или L(+)-молочная кислота. В данной заявке эти термины используют взаимозаменяемо. Аналогичным образом, взаимозаменяемо используют термины (R)-молочная кислота, D-молочная кислота и D(-)-молочная кислота.
Payton & Hartley показывают, что G. stearothermophilus PSII имеет профиль ферментации с образованием смеси кислот, продуцируя (S)-молочную кислоту, уксусную кислоту и этанол при выращивании на глюкозе в условиях качалочной колбы без регулирования рН (Payton & Hartley, 1985, FEMS Microbiol. Lett. 26: 333-336). Хиральная чистота не упоминается. В более поздних исследованиях показано, что PSII и его производные являются нетипичными для G. stearothermophilus и, по-видимому, ближе связаны с G. caldotenax (Amartey et al., 1991, Biotechnol. Lett. 13: 621-626; Green et al., 2001, WO 01/49865). Низкий выход делает этот штамм непригодным для промышленного использования.
Danner et al. показывают продуцирование штаммами G. stearothermophilus IFA6 и IFA9 (S)-молочной кислоты из сахарозы и глюкозы (Danner et al., 1998, Appl. Biochem. Biotechnol. 70-72: 895-903). Штамм IFA6 продуцирует из глюкозы значительные количества этанола, уксусной кислоты и муравьиной кислоты в качестве побочных продуктов, тогда как штамм IFA9 их не продуцирует. Сообщалось о хиральной чистоте от 99,22 до 99,85% для IFA6 и 99,4% для IFA9 при их выращивании на глюкозе (Danner et al., 1998, Appl. Biochem. Biotechnol. 70-72: 895-903). Условия культивирования основывались на использовании обогащенной среды, содержащей дрожжевой экстракт и казеиновый пептон, что не является желательным для промышленного производства. По сравнению со штаммом IFA6, штамм IFA9 имеет пониженную продуктивность при более высоких концентрациях продукта, что делает его менее подходящим для промышленного производства. Кроме того, штамм IFA6 демонстрировал низкий выход, что также делает его непригодным для промышленного производства.
Rao & Satyanarayana демонстрируют продуцирование молочной кислоты бактерией G. thermoleovorans, но не комментируют ни выход, ни хиральную чистоту (Rao & Satyanarayana, 2009, Appl. Biochem. Biotechnol. 159: 464-477).
Green et al. раскрывают продуцирование (S)-молочной кислоты штаммом G. thermoglucosidans LN-9 с хиральной чистотой 99,2% и выходом 0,7 г/г в условиях качалочной колбы без регулирования рН (Green et al., 2003, WO 03/008601). Низкий выход делает его непригодным для промышленных применений.
Atkinson et al. демонстрируют продуцирование молочной кислоты штаммом G. thermoglucosidans NCIMB 11955 из ксилозы или глюкозы со значительными количествами этанола, уксусной кислоты и муравьиной кислоты в качестве побочных продуктов (Atkinson et al., 2006, WO 2006/117536). Выход на глюкозе составлял 0,64 г/г, что является слишком низким для промышленного применения. Хиральная чистота не раскрыта.
Tang et al. демонстрируют продуцирование (S)-молочной кислоты штаммом G. thermoglucosidans M10EXG. В микроаэробных условиях основным продуктом являлась молочная кислота с уксусной кислотой, этанолом и муравьиной кислотой в качестве существенных побочных продуктов. В анаэробных условиях основным продуктом являлась муравьиная кислота с молочной кислотой, уксусной кислотой и этанолом в качестве основных побочных продуктов. Описанные выходы являются слишком низкими для промышленного применения. Сообщалось, что хиральная чистота (S)-молочной кислоты составляла более 99% (Tang et al., 2009, Biotechnol. Lett. 102: 1377-1386).
G. thermoglucosidans описывают как термофильный вид Bacillus (Suzuki et al., 1983, Syst. Appl. Microbiol. 4:487-495; Nazina et al., 2001, Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51:433-446; Coorevits et al., 2012, Int. Syst. Evol. Microbiol. 62:14770-1485). Ранее G. thermoglucosidans был известен как Bacillus thermoglucosidasius (Suzuki et al., 1983, Syst. Appl. Microbiol. 4: 487-495), который был переименован как G. thermoglucosidasius группой Nazina et al. в 2001 (Nazina et al., 2001, Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51:433-446) и позднее переименован как G. thermoglucosidans группой Coorevits et al. (Coorevits et al., 2012, Int. Syst. Evol. Microbiol. 62: 14770-1485). Типовой штамм был выделен из почвы (Suzuki et al., 1976, Appl. Environ. Microbiol. 31: 807-812). Хотя первоначально он был описан как строгий аэроб, в более поздних исследованиях описывается его факультативно-анаэробный рост и продуцирование (S)-молочной кислоты (Green et al., 2003, WO 03/008601; Fong et al., 2006, Extremophiles 10:363-372). Интервал температур составляет от 42 до 69°C с оптимумом при 62°C (Suzuki et al., 1983, Syst. Appl. Microbiol. 4:487-495). Была описана генетическая модификация штаммов G. thermoglucosidans для продуцирования этанола (Green et al., 2001, WO 01/49865; Atkinson et al., 2008, WO 08/038019). Она включает описание генетических средств для G. thermoglucosidans DSM 2542т и способа нарушения гена L-лактатдегидрогеназы (Idh) (Atkinson et al., 2006, WO 2006/117536 и 2008, WO 2008/038019). Метаболические пути и потоки метаболитов для клеток, растущих на ксилозе и глюкозе, были описаны для G. thermoglucosidans M10EXG (Tang et al. 2009, Biotechnol. Lett. 102:1377-1386).
В своей лаборатории авторы наблюдали, что хиральная чистота кислоты, продуцируемой штаммом G. thermoglucosidans DSM 2542, может варьировать в зависимости от состава среды и/или источника сахаров. Авторами была обнаружена хиральная чистота (S)-молочной кислоты от 89 до более 99%.
Однако для гибкости при выборе субстрата и состава среды существует потребность в производном, которое продуцирует энантриомерно чистую (S)-молочную кислоту при всех подходящих промышленных условиях.
Из вышеизложенного можно сделать вывод, что известные штаммы Geobacillus ферментируются с образованием смеси кислот и не демонстрируют гомомолочного продуцирования энантиомерно чистой молочной кислоты.
Существует очевидная потребность в возможности использовать для гомомолочного продуцирования энантиомерно чистой молочной кислоты бактериальные штаммы (например штаммы Geobacillus), которые имеют привлекательные характеристики для промышленного применения, такие как низкие потребности в питательных веществах, широкие возможности потребления Сахаров, способность продуцировать ферменты, катализирующие гидролиз углеводов, высокая скорость роста, высокая продуктивность, устойчивость к осмотическому стрессу и генетическая доступность.
Задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы создать термофильную бактериальную клетку, которая представляет собой факультативный анаэроб и продуцирует (S)-молочную кислоту посредством гомомолочной ферментации.
Задача настоящего изобретения также заключается в том, чтобы создать термофильную бактериальную клетку, которая представляет собой факультативный анаэроб и продуцирует энантиомерно чистую (S)-молочную кислоту.
Выход и хиральная чистота (S)-молочной кислоты в производстве молочной кислоты посредством видов Geobacillus, которые представляют собой факультативные анаэробы, могут варьировать в зависимости от штамма и условий культивирования. Таким образом, существует потребность в улучшенном Geobacillus, который модифицирован для продуцирования хирально чистой (S)-молочной кислоты по гомомолочному типу.
Существует несколько возможностей, которые могут иметь результатом образование хиральной примеси, как описано в литературе. (R)-молочная кислота может быть образована из пирувата под действием D-лактатдегидрогеназы, она может быть образована из (S)-молочной кислоты под действием лактатрацемазы, либо она может быть образована посредством метилглиоксального метаболического пути.
Метилглиоксальсинтаза (Е.С.4.2.99.11) катализирует превращение дигидроксиацетон-фосфата в метилглиоксаль и ортофосфат на первой стадии метилглиоксального шунта. Затем метилглиоксаль может быть превращен посредством двух различных метаболических путей в (S)- или (R)-молочную кислоту. Таким образом, метилглиоксальный шунт может представлять собой источник хирального загрязнения при продуцировании как (S)-, так и (R)-молочной кислоты. У Escherichia coli нарушение гена mgsA, кодирующего метилглиоксальсинтазу, улучшало хиральную чистоту продуцирования как (S)-, так и (R)-молочной кислоты (Grabar et al., 2006, Biotechnol. Lett. 28: 1527-1535). У грамположительных бактерий мало известно об активности метилглиоксального метаболического пути. У мезофильной Bacillus subtilis ген mgsA располагается в опероне вместе с генами, кодирующими первые два фермента в биосинтезе бациллитиола (Gaballa et al., 2010, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107: 6482-6486; Helmann, 2011, Antioxidants & Redox signaling 15: 123-133). Недавно Chandrangsu et al. продемонстрировали, что бациллитиол вовлечен в детоксикацию метилглиоксаля (Chandrangsu et al., 2014, Mol. Microbiol. 91: 706-715). В зависящем от бациллитиола метилглиоксальном метаболическом пути для превращения метилглиоксаля в (R)-молочную кислоту задействованы глиоксалаза I (GlxA) и глиоксалаза II (FlxB) (Chandrangsu et al., 2014). Кроме того, метилглиоксаль может быть превращен в (R)-молочную кислоту под действием YdeA, YraA и YfkM, предсказанных гомологов глиоксалазы III (Chandrangsu et al., 2014, Mol. Microbiol. 91: 706-715).
В последовательности генома G. thermoglucosidans авторы смогли обнаружить предсказанный ген D-лактатдегидрогеназы, но не очевидный ген лактатрацемазы. Для обоих метаболических путей превращения метилглиоксаля в (R)-молочную кислоту, как определено у В. subtilis (Chandrangsu et al., 2014, Mol. Microbiol. 91: 706-715), ближайшие гомологи у G. thermoglucosidans имеют очень низкую идентичность аминокислотных последовательностей (46% для YwbC; 34% для YurT; для YdeA гомолог не обнаружен; 30% для YraA; и 35% для YfkM). Напротив, MgsA В. subtilis имеет гомолог G. thermoglucosidans с идентичностью аминокислотных последовательностей 72%. Основываясь на информации о геноме, можно было бы ожидать, что продуцирование (R)-молочной кислоты вызывается активностью D-лактатдегидрогеназы, а не лактатрацемазы или метилглиоксального пути. Неожиданно авторы смогли нарушить продуцирование (R)-лактата путем нарушения гена mgsA, предсказанного как кодирующего метилглиоксальсинтазу.
Виды Geobacillus, которые являются факультативными анаэробами, демонстируют ферментации с образованием смеси кислот с молочной кислотой, этанолом, уксусной кислотой и муравьиной кислотой в качестве основных продуктов. Нарушение генов, кодирующих незаменимые ферменты в продуцировании побочных продуктов, является общим подходом для улучшения продуцирования целевого продукта. Однако эффекты нарушения конкретного гена могут иметь различные побочные эффекты в зависимости от полного метаболизма хозяина. Одиночные мутации в pfIA Escherichia coli, кодирующем фермент, активирующий пируват-формиат-лиазу, и adhE, кодирующем бифункциональный комплекс ацетальдегид-СоА/алкогольдегидрогеназа, имеют результатом улучшенное продуцирование молочной кислоты с сопутствующим повышенным образованием побочного продукта пирувата, остаточное продуцирование уксусной кислоты и этанола и сильно сниженный выход биомассы (pflA - ), либо улучшенное продуцирование молочной кислоты с уксусной кислотой в качестве основного продукта ферментации (adhE - ) (Zhu & Shimizu, 2005, Metab. Eng. 7: 104-115). В некоторых штаммах Е. coli был нарушен локус focA-pflAB для исключения продуцирования муравьиной кислоты (Zhou et al., 2003, Appl. Environ. Microbiol. 69: 2237-2244; Liu et al., 2011, Appl. Biochem. Biotechnol. 164: 162-169). Недавно была продемонстрирована важность focA, кодирующего белок формиатного канала, в накоплении молочной кислоты в среде (Beyer et al., 2013, J. Bacteriol. 195: 1428-1435), поэтому это будет вносить вклад в фенотипы штаммов Е. coli, имеющих делеции focA-pflAB. У зеленых водорослей Chlamydomonas reinhardtii нокауты генов, кодирующих пируват-формиат-лиазу и алкогольдегидрогеназу, улучшали ферментирование молочной кислоты, но также повышали внеклеточные концентрации глицерина и уксусной кислоты (Catalanotti et al., 2012, Plant Cell 24: 692-707).
У G. thermoglucosidans гены pflBA ориентированы конвергентно к гену adhE. По практическим соображениям авторы решили нарушать pfIA, pfIB и adhE посредством делеции pflBA и части adhE в ходе одной модификации. Неожиданно авторы смогли почти устранить образование побочных продуктов в виде этанола, уксусной кислоты и муравьиной кислоты, не воздействуя на другие побочные продукты и не воздействуя на ход ферментирования молочной кислоты. Например, в настоящей заявке то, что образование побочного продукта почти устранено, означает, что в результате ферментирования полученной методами генной инженерии клетки, как раскрыто в данном описании, количество по массе побочных продуктов (таких как этанол, уксусная кислота и муравьиная кислота) по отношению к общему количеству продуцированной молочной кислоты составляет не более 10% (масс/масс.) и, в частности, не более 5%, 4%, 3% или 2% (масс/масс). Количество молочной кислоты и побочных продуктов может быть определено способами, известными в данной области техники, например путем дериватизации и анализа посредством газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ) или высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Дефектная споруляция является желательным свойством для промышленного применения видов Bacillus. Согласно директиве 2009/41/ЕС Европейского парламента и Совета ЕС от 6 мая 2009 г. по ограничению использования генетически модифицированных микроорганизмов, ограниченное использование генетически модифицированных микроорганизмов следует классифицировать в зависимости от риска, который они представляют для здоровья человека и для окружающей среды. Наличие фенотипа с дефектной споруляцией для видов Bacillus представляется средством минимизации риска их распространения в окружающей среде. Известны различные способы получения фенотипов с дефектной споруляцией, включая селекцию спонтанных производных с дефектной споруляцией (Green et al., 2001, WO01/ 49865) или направленное нарушение пути споруляции, например посредством нарушения spo0A (Gonzy- et al., 1992, J. Mol. Biol. 244: 967-979; Atkinson et al., 2010, WO 2010/052499) или sigF (Fleming et al., 1995, Appl. Environ. Microbiol. 61: 3775-3780; Wang et al., 2005, J. Appl. Microbiol. 98: 761-767; et al., 2010, Appl. Environ. Microbiol. 76: 4085-4088).
Таким образом, в первом аспекте настоящего изобретения раскрывается полученная генно-инженерным путем термофильная бактериальная клетка, которая является факультативным анаэробом и продуцирует (S)-молочную кислоту, в которой эндогенный ген метилглиоксальсинтазы mgsA инактивирован или делетирован.
Эндогенные гены представляют собой гены, которые присутствуют в микроорганизме. Совершенно очевидно, что у бактерии, как она раскрыта в данном описании изобретения, в которой ген инактивирован или делетирован, этот ген изначально должен присутствовать. В отсутствие указания об обратном, в настоящей заявке любая ссылка на ген означает эндогенный ген. Гены, которые введены в микроорганизм, не являются эндогенными генами.
В другом аспекте предложена полученная генно-инженерным путем бактериальная клетка, представляющая собой факультативный анаэроб, которая является гомомолочной и продуцирует (S)-молочную кислоту в энантиомерно чистой форме.
В настоящем изобретении гомомолочную ферментацию определяют как продуцирование молочной кислоты из источников углеводов с образованием не более 15% (масс/масс), предпочтительно не более 10% (масс/масс), и более предпочтительно не более 5%, 4%, 3% или 2% (масс/масс.) побочных продуктов, таких как муравьиная кислота, уксусная кислота и этанол. Это процентное содержание относится к общей массе побочных продуктов относительно общей массы молочной кислоты (включая (S)-молочную кислоту и любую (R)-молочную кислоту, которая может присутствовать). Количество молочной кислоты и этанола, уксусной кислоты и муравьиной кислоты может быть определено способами, известными в данной области техники, например дериватизацией и анализом посредством газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ) или высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
В некоторых воплощениях образовавшееся количество по меньшей мере одного из муравьиной кислоты, этанола и уксусной кислоты составляет не более 10% (масс/масс), исходя из общей массы муравьиной кислоты, этанола или уксусной кислоты, относительно общей массы продуцированной молочной кислоты, в частности, не более 6%, 1%, 0,25% или 0,1% (масс/масс). Другими словами, количество муравьиной кислоты, образовавшейся в ходе гомомолочного ферментирования, может составлять, например, не более 10% (масс/масс.) и, более конкретно, не более 6%, 1%, 0,25% или 0,1% (масс/масс.) относительно общего количества по массе молочной кислоты. Аналогичным образом, количество этанола может составлять не более 10%, 6%, 1%, 0,25% или 0,1% (масс/масс), и количество уксусной кислоты может составлять не более 10%, 6%, 1%, 0,25% или 0,1% (масс/масс).
В данном описании изобретения mgsA относится к гену метилглиоксальсинтазы, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 23 для Geobacillus thermoglucosidans. Кодируемая аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO:24. Нуклеотидные области, фланкирующие mgsA, могут быть идентифицированы посредством PCR (полимеразная цепная реакция) праймеров с SEQ ID NO: 11, 12, 15 и 16.
Другой аспект изобретения относится к полученной генно-инженерным путем термофильной бактериальной клетке, где в дополнение к гену mgsA также инактивирован или делетирован эндогенный ген А и/или В пируват-формиат-лиазы.
В предпочтительном воплощении ген пируват-формиат-лиазы инактивирован посредством инактивации или делеции локуса пируват-формиат-лиаза/алкогольдегидрогеназа pflBA-adhE. Альтернативно ген А и/или В пируватлиазы и гены adhE алкогольдегидрогеназы могут быть инактивированы или делетированы на раздельных стадиях. Нуклеотидные области, фланкирующие pflBA-adhE, могут быть идентифицированы посредством PCR праймеров с SEQ ID NO: 19-21.
В данном описании изобретения как pflBA обозначают гены А и В пируват-формиатлиазы, кодирующие фермент, активирующий пируват-формиат-лиазу, и пируват-формиат-лиазу, соответственно.
plfA относится к гену А пируват-формиат-лиазы (кодирующему фермент, активирующий пируват-формиат-лиазу), последовательность которого для Geobacillus thermoglucosidans представлена в SEQ ID NO: 27. Кодируемая аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO: 28. plfB относится к гену В пируват-формиат-лиазы (кодирующему пируват-формиат-лиазу), последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 25. Кодируемая аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO: 26. В настоящем изобретении adhE относится к гену Е алкогольдегидрогеназы, кодирующему бифункциональный комплекс ацетальдегид-СоА/алкогольдегидрогеназа, последовательность которого для Geobacillus thermoglucosidans представлена в SEQ ID NO: 29. Кодируемая аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO: 30.
В еще одном воплощении согласно настоящему изобретению в полученной генно-инженерным путем клетке также инактивирован или делетирован эндогенный ген фосфотрансацетилазы (pta). Нуклеотидная последовательность pta для Geobacillus thermoglucosidans представлена в SEQ ID NO. 31. Кодируемая аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO. 32. Инактивация или делеция pta (который кодирует фосфотрансацетилазу) дополнительно минимизирует остаточное продуцирование ацетата, ассоциированное с активностью эндогенного pta. Полученный штамм (с инактивированным или делетированным pta) является ауксотрофным по уксусной кислоте. Соответственно, при ферментировании этой полученной генно-инженерным путем клетки в питательную среду следует добавлять уксусную кислоту.
В еще одном воплощении согласно настоящему изобретению полученная генно-инженерным путем термофильная бактериальная клетка дополнительно является дефектной по споруляции за счет инактивации или делеции эндогенного гена споруляции.
В другом воплощении инактивированный или делетированный ген споруляции представляет собой sigF.
sigF относится к гену споруляции, нуклеотидная последовательность которого для Geobacillus thermoglucosidans представлена в SEQ ID NO: 33. Кодируемая аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO: 34. Нуклеотидные последовательности, фланкирующие SigF, могут быть идентифицированы посредством PCR праймеров с SEQ ID NO: 3-6.
В другом воплощении согласно настоящему изобретению (S)-молочная кислота продуцируется в клетке по изобретению с энантиомерной чистотой по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99%, 99,5%, 99,8% или 99,9%.
В еще одном воплощении настоящего изобретении в клетке один или более генов mgsA, pflBA-adhE или sigF инактивированы или делетированы посредством гомологичной рекомбинации.
В еще одном воплощении полученная генно-инженерным путем термофильная бактериальная клетка по настоящему изобретению представляет собой грамположительную бактериальную клетку. Предпочтительно клетка принадлежит к роду Bacillus.
В еще одном воплощении полученная генно-инженерным путем термофильная бактериальная клетка по настоящему изобретению представляет собой грамположительную бактериальную клетку. Предпочтительно клетка принадлежит к роду Geobacillus.
В еще одном воплощении полученная генно-инженерным путем термофильная бактериальная клетка по настоящему изобретению представляет собой Geobacillus thermoglucosidans.
Задача настоящего изобретения также заключается в создании штамма Geobacillus, который представляет собой факультативный анаэроб и продуцирует (S)-молочную кислоту посредством гомомолочного ферментирования.
Хиральная чистота является важным аспектом для производства полимеров полимолочной кислоты. Поэтому необходимо продуцирование энантиомерно чистой (S)-молочной кислоты для промышленных применений.
Таким образом, в одном аспекте настоящего изобретения раскрыт способ генетического модифицирования средствами генной инженерии умеренно термофильных видов Geobacillus, которые являются факультативными анаэробами и гомомолочными.
В другом аспекте изобретения предложен способ продуцирования энантиомерно чистой молочной кислоты. Способ включает стадии культивирования термофильной бактериальной клетки по настоящему изобретению с использованием подходящего ферментируемого углеродсодержащего источника питания и выделения (S)-молочной кислоты.
В одном аспекте изобретения предложен способ продуцирования энантиомерно чистой молочной кислоты, где углеродсодержащий источник питания содержит ксилозу, глюкозу или сахарозу.
Культивирование предпочтительно осуществляют при температуре от 50°C до 70°C, более предпочтительно от 55 до 65°C.
В контексте изобретения инактивация или делеция гена может представлять собой модификацию гена, кодирующего целевой полипептид, подлежащий продуцированию клеткой, и/или гена, кодирующего полипептид, вовлеченный в продуцирование клеткой первичного или вторичного метаболита. В принципе это может быть осуществлено посредством снижения клеточных уровней кодируемого белка. Снижение клеточных уровней может быть осуществлено, например, посредством направленной инактивации гена, кодирующего представляющий интерес фермент. Ген может быть удален полностью. Однако, в качестве альтернативы, к снижению активности кодируемого белка также может приводить делеция части гена. Альтернативно или дополнительно, могут быть модифицированы или удалены нуклеотидные последовательности, ответственные за регуляцию или экспрессию генов, такие как промоторы, энхансеры, сайты инициации трансляции и тому подобные. Другим путем влияния на активность представляющего интерес белка может быть, при необходимости, модификация транспортных сигналов, или введение антисмысловой РНК.
Предпочтительной является хромосомная модификация, поскольку она гарантирует стабильное распределение функциональности гена во всех клетках-потомках. Делеция целевой функциональности в хромосоме может быть осуществлена посредством негомологичной, а также гомологичной рекомбинации. Гомологичная рекомбинация является предпочтительной, поскольку она открывает возможность вводить, удалять или одновременно вводить и удалять функциональность.
Когда планируется гомологичная рекомбинация, трансформирующая ДНК дополнительно содержит последовательность ДНК, которая является гомологичной геномной целевой последовательности конкретной клетки, подлежащей конструированию. Специалисту будет понятно, что для получения гомологичной рекомбинации не требуется 100% идентичности. Также будет достаточным процент идентичности 80%, предпочтительно 90%, более предпочтительно 95%, 98% или 99%. Как правило, представляющая интерес последовательность ДНК для вставки в хромосому посредством гомологичной рекомбинации фланкируется гомологичными последовательностями с длиной, достаточной для осуществления гомологичной рекомбинации. Такая длина может составлять по меньшей мере примерно 200 п.о., например от примерно 200 до примерно 1500 п.о., предпочтительно от примерно 500 до примерно 1000 п.о.
Для цели настоящего изобретения степень идентичности между двумя аминокислотными последовательностями относится к проценту аминокислот, которые являются идентичными между двумя последовательностями. Степень идентичности определяют, используя алгоритм BLAST, который описан в Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). Программное обеспечение для выполнения анализов BLAST является доступным от Национального центра биотехнологической информации (http://мacc.ww.ncbi.nlm.nih.gov/). Стандартные настройки для параметров алгоритма Blastp представляют собой: порог ожидания 10, длина «слова» 3, максимальные совпадения в диапазоне запроса 0, матрица BLOSUM62, штраф на пропуск 11 и штраф на длину пропуска 1, Compositional adjustments at Conditional compositional score matrix adjustment.
Для цели настоящего изобретения степень идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями относится к проценту нуклеотидов, которые являются идентичными между двумя последовательностями. Степень идентичности определяют, используя алгоритм BLAST, который описан в Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). Компьютерная программа для выполнения анализов BLAST является доступным от Национального центра биотехнологической информации (http://мacc.ww.ncbi.nlm.nih.gov/). Стандартные настройки для параметров алгоритма Blastp представляют собой: порог ожидания 10, длина «слова» 28, максимальные совпадения в диапазоне запроса 0, мера совпадения/несовпадения 1, -2, штраф за пропуск at Linear.
Как упоминается выше, ни одной из последовательностей, идентифицирующих указанные выше гены в Geobacillus thermoglucosidans, не требуется 100% идентичности для того, чтобы модифицировать представляющий интерес ген посредством генной инженерии. Кроме того, в родственных термофильных бактериальных клетках из других видов гены могут отличаться от этих последовательностей. Однако, при использовании гена Geobacillus thermoglucosidans последовательности, гомологичные этим генам, которые имеют аналогичную функциональность, легко могут быть идентифицированы специалистом в данной области техники и соответствующие праймеры могут быть получены для осуществления гомологичной рекомбинации в этих штаммах. Таким образом, даже если в конкретном штамме существуют отклонения от последовательностей указанных выше идентифицированных генов, гомологичные гены легко могут быть идентифицированы. Их нуклеотидные последовательности могут быть определены с применением технологий, известных в данной области техники, и, при необходимости, может быть определен новый набор праймеров, идентичных или комплементарных последовательностям, фланкирующим ген.
Клетки по настоящему изобретению могут быть получены, используя технологии, известные в данной области техники. В частности, способы введения ДНК в термофильные бактерии посредством электропорации были описаны Van Kranenburg et al., 2007, WO 2007/085433 и Cripps et al. 2009, Metab. Eng. 11:398-408.
Трансформация этих видов Bacillus электропорацией может быть достигнута посредством пропускания высоковольтного разряда через суспензию, содержащую умеренно термофильный вид Bacillus, который является факультативным анаэробным и гомомолочным, и подходящую трансформирующую ДНК, содержащую желаемую функциональность, и/или последовательности ДНК, гомологичные геномным последовательностям конкретных Bacilli.
(S)-Молочная кислота может быть получена ферментированием полученной генно-инженерным путем термофильной бактериальной клетки, как она раскрыта в данном описании, в присутствии источника углевода (например глюкозы и/или ксилозы) посредством способов, известных в данной области техники. Во время ферментирования молочную кислоту, выделяемую микроорганизмами, обычно нейтрализуют, используя основание, например основные соли щелочных или щелочно-земельных металлов, такие как гидроксиды, карбонаты и/или гидрокарбонаты натрия, калия, магния и/или кальция. В общем предпочтительными являются магниевые основания, например гидроксид магния, карбонат магния и/или гидрокарбонат магния. Таким образом, в некоторых аспектах настоящее изобретение относится, в частности, к способу продуцирования энантиомерно чистой (S)-молочной кислоты, где указанный способ включает культивирование термофильной бактериальной клетки, как она определена в данном описании изобретения, в присутствии магниевого основания (например по меньшей мере одного, выбранного из гидроксида магния, карбоната магния и гидрокарбоната магния), используя подходящий ферментируемый углеродсодержащий источник питания, и выделение (S)-молочной кислоты.
После ферментирования (S)-молочную кислоту (или ее соль) отделяют от ферментационного бульона посредством любого из многих общепринятых известных способов выделения молочной кислоты и/или лактата из водных растворов. Для повышения эффективности выделения перед его началом могут быть удалены частицы субстрата или микроорганизмы (биомасса).
Указанное выделение можно проводить посредством центрифугирования, фильтрования, флокуляции, флотации или мембранного фильтрования. Оно раскрыто, например, в WO 01/38283, где описан непрерывный процесс получения молочной кислоты посредством ферментирования. Хотя обсуждение ферментирования в данном описании изобретения в общем относится к периодическому процессу, части процесса или весь процесс в целом можно осуществлять непрерывно.
После выделения (S)-молочной кислоты (или ее соли) из ферментационного бульона продукт может быть подвергнут одной или более стадиям очистки, такой как экстрагирование, дистилляция, кристаллизация, электродиализ, фильтрование, обработка активированным углем, ионный обмен и так далее. Различные остаточные потоки могут быть использованы повторно, возможно после обработки, в ферментационном сосуде или на любой ранее выполняемой стадии очистки.
Примеры
Материалы и методы
Штаммы и плазмиды
Штаммы и плазмиды, использованные в данном исследовании, перечислены в Таблице 1.
Escherichia coli культивировали обычным образом в бульоне LB (Sambrook & Russell, 2001, Molecular Cloning, a laboratory manual. 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) при 37°C в аэробных условиях. При необходимости использовали хлорамфеникол и/или ампициллин в концентрациях 20 мг/л и 100 мг/л, соответственно.
G. thermoglucosidans выращивали обычным образом в среде TGP при 52°C, 55°C или 60°C в аэробных условиях, если не указано иначе. Среда TGP (Taylor et al., 2008, Plasmid 60: 45-52) содержала 17 г/л триптона, 3 г/л соевого пептона, 5 г/л NaCl, 2,5 г/л K2HPO4 при рН 7,0 и добавки 4 мл/л глицерина и 4 г/л пирувата натрия после автоклавирования. Для чашек с TGP использовали 10 г/л агара. При необходимости среду дополняли хлорамфениколом (8 мкг/мл).
Методы ДНК манипулирования
Стандартные процедуры манипулирования с ДНК выполняли, как описано у Sambrook and Russell (Sambrook & Russell, 2001, Molecular Cloning, a laboratory manual. 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York).
Конструирование производных pNW33N осуществляли в E.coli.
Крупномасштабное выделение плазмидной ДНК Е. coli из 100 мл культуры выполняли, используя Jetstar 2.0 Plasmid Maxiprep Kit® (Genomed), следуя инструкциям изготовителя. Маломасштабное выделение плазмидной ДНК Е. coli из 1 мл культуры выполняли, используя набор Nucleospin Plasmid Quick Pure® (Macherey-Nagel), следуя инструкциям изготовителя.
Компетентные клетки Е. coli получали, используя хлорид кальция, и трансформировали тепловым шоком, как описано в Sambrook and Russell (Sambrook & Russell, 2001, Molecular Cloning, a laboratory manual. 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York).
Полимеразные цепные реакции (PCR) для целей клонирования выполняли с высокоточной полимеразой Pwo (Roche), следуя инструкциям изготовителя.
Для PCR-анализа колоний колонии протыкали зубочисткой и небольшое количество клеточного материала переносили в пробирку для PCR-реакции. Клетки разрушали путем инкубирования в течение 1 минуты при 1000 Вт в микроволновой печи. Смеси для PCR-реакции 50 мкл или 25 мкл с полимеразой rTaq (Amersham Biosciences) получали, как рекомендовано изготовителем, и добавляли в реакционные пробирки с разрушенными клетками.
Электропорация G. thermoglucosidans
G. thermoglucosidans трансформировали путем электропорации на основе протокола, описанного Cripps et al. (Cripps, et al., 2009, Metab. Eng. 11:398-408). G. thermoglucosidans выращивали в течение ночи при 55°C и 1 мл использовали для инокулирования в 50 мл предварительно нагретой среды TGP в 250 мл конической колбе с лопастной мешалкой. Клетки инкубировали при 60°C (180 об./мин) до ОП600 приблизительно 1,0. Колбу охлаждали на льду в течение 10 мин и клетки осаждали путем центрифугирования (4°C). Затем клетки промывали четыре раза охлажденным на льду буфером для электропорации (0,5 М сорбит, 0,5 М маннит, 10% (об./об.) глицерин). Объемы со стадий промывания составляли 50 мл, 25 мл, 10 мл и 10 мл. Конечный осадок ресуспендировали в 1,3 мл охлажденного на льду буфера для электропорации и аликвоты по 60 мкл электрокомпетентных клеток хранили при -80°C или использовали непосредственно для электропорации.
Аликвоту 60 мкл электрокомпетентных клеток (размороженных) смешивали с 1-2 мкг плазмидной ДНК и затем переносили в охлажденную кювету для электропорации (ширина зазора 0,1 см). Условия электропорации с использованием импульсного электропоратора Bio-Rad Gene Pulser были следующие: 2,5 кВ, 10 мкФ и 600 Ом. После электропорации клетки переносили в 1 мл предварительно нагретой (52°C) TGP в 50 мл пластиковой пробирке и восстанавливали при 52°C, 180 об./мин в течение двух часов. Восстановленную клеточную суспензию осаждали и почти 150 мкл супернатанта отбрасывали. Осадок ресуспендировали в оставшемся супернатанте. Объемы 1/10 и 9/10 высевали на чашки с TGP, содержащие 8 мкг/л хлорамфеникола. Чашки инкубировали при 52°C в течение 24-48 часов. Колонии, которые появились на чашках, переносили на чашку со свежей TGP, содержащей 8 мкг/л хлорамфеникола, и инкубировали при 55°C в течение ночи. Выросшие колонии тестировали на присутствие плазмиды посредством PCR для отбора колоний, используя праймеры 1 и 2 (Таблица 2).
Интеграция
Челночный вектор pNW33n Geobacillus-E.coli использовали в качестве вектора для интеграции в G. thermoglucosidans, как описано ранее (Cripps et al., 2009 Metab. Eng. 11: 398-408). 20 мл TGP, содержащей 8 мкг/мл хлорамфеникола, инокулировали трансформированными штаммами из исходной культуры в глицерине. После роста в течение ночи при 55°C, 180 об./мин, подходящие разбавления высевали на чашки с TGP, содержащей 8 мкг/мл хлорамфеникола. Затем эти чашки инкубировали при 68°C в течение 24 часов. Делали посев штрихом одиночных колоний на свежую чашку (инкубировали при 52°C) и проводили на этих колониях PCR для отбора колоний с идентификацией колонии посредством одиночного кроссинговера. Подходящие комбинации праймеров использовали для идентификации одиночных кроссинговеров посредством вышележащего и нижележащего фрагмента (Таблица 2; комбинации праймеров 655-170 и 656-571 для интеграции pRM3; комбинации праймеров 754-170 и 991-571 для интеграции pJS43; комбинации праймеров 744-170 и 808-571 для интеграции pRM12, соответственно). Затем выделяли хромосомную ДНК положительных колоний, используя набор для очистки ДНК грамположительных микробов Masterpure Gram Positive DNA Purification Kit (Epicentre Biotechnologies) и для подтверждения результатов PCR для отбора колоний PCR, описанную выше, повторяли на выделенной хромосомной ДНК. Одиночный кроссинговер посредством вышележащей фланкирующей области и одиночный кроссинговер посредством нижележащей фланкирующей области отбирали для второй стадии рекомбинации.
Для получения двойного кроссинговера первичные интегранты субкультивировали несколько раз в TGP без хлорамфеникола. Подходящие разведения (10-4, 10-5, 10-6) высевали на чашки с TGP. Выделенные колонии переносили на чашку с TGP с 8 мкг/мл хлорамфеникола и чашку без него. Мутанты двойного кроссинговера являются чувствительными к хлорамфениколу. PCR-анализ с использованием подходящих комбинаций праймеров (Таблица 2; комбинации праймеров 655-656 для ΔsigF, 754-991 для ΔmgsA и 744-808 для ΔpflBA-ΔadhE) использовали для отделения дикого типа от делеционных мутантов и для подтверждения отсутствия плазмиды. Все модификации подтверждали секвенированием PCR продуктов.
Ферментирование
Среда ТММ была модифицирована от Fong et al. (Fong et al., 2006) и содержала на литр: 60 г/л глюкозы; 30 г/л ксилозы; 8,37 г MOPS (3-(N-морфолино)пропансульфоновая кислота), 0,23 г K2HPO4; 0,51 г NH4Cl; 0,50 г NaCl; 1,47 г Na2SO4; 0,08 г NaHCO3; 0,25 г KCl; 1,87 г MgCl2⋅6H2O; 0,41 г CaCl2⋅2H2O; 16,0 мг MnCl2⋅4H2O; 1,0 мг ZnSO4⋅7H2O; 2,0 мг H3BO3; 0,1 мг CuSO4⋅5H2O; 0,1 мг Na2MoO4⋅2H2O; 1,0 мг CoCl2⋅6H2O; 7,0 мг FeSO4⋅7H2O; 0,1 мг тиамина; 0,1 мг рибофлавина; 0,5 мг никотиновой кислоты; 0,1 мг пантотеновой кислоты; 0,5 мг пиридоксамина, HCl; 0,5 мг пиридоксаля, HCl; 0,1 мг D-биотина; 0,1 мг фолиевой кислоты; 0,1 мг пара-аминобензойной кислоты; 0,1 мг кобаламина. рН доводили до рН 7,2. Глюкозу, ксилозу, металлы и витамины стерилизовали фильтрованием. Среду автоклавировали. ТММ1, ТММ2.5, и ТММ5 были дополнены 1 г/л, 2,5 г/л, и 5 г/л дрожжевого экстракта (Oxoid), соответственно.
Среда STMM отличалась от среды ТММ концентрациями K2HPO4 (1,00 г/л), NH4Cl (2,50 г/л), NaCl (5,00 г/л), и CaCl2⋅2H2O (50 мг/л) и была дополнена D,L-метионином (68,5 мг/л) и бетаином (0,14 г/л).
100 мл предварительной культуры в ТММ5 или STMM5 использовали для инокулирования (10% об./об.) 400 мл ТММ1, или ТММ2.5, или STMM2.5, или STMM5, соответственно, в 0,75 л ферментаторе Multifors (Infors), оборудованном холодильником (охлажденном водой из-под крана до приблизительно 15°C). рН поддерживали при рН 7,2 путем добавления стерильного 2,5 М KOH, стерильного 75 г/л Мг(ОН)2 или стерильного 75 г/л Са(ОН)2. Температура составляла 60°C.Скорость мешалки составляла 300 об/мин.
Из ферментатора отбирали образцы для измерения (R)- и (S)-молочной кислоты и возможных побочных продуктов. Образцы центрифугировали и оставшийся дебрис удаляли посредством фильтрования, используя фильтр Millex® GP 0,22 мкм (Millipore). Фильтрат хранили при -21°C до дальнейшего анализа.
Сахара измеряли посредством ВЭЖХ, используя колонку Thermo CarboPac SA-10 (Dionex). Органические кислоты (молочную кислоту, уксусную кислоту, муравьиную кислоту, янтарную кислоту, фумаровую кислоту, пировиноградную кислоту) и этанол измеряли, используя дериватизацию и газо-жидкостную хроматографию (ГЖХ). (R)- и (S)-лактаты метилировали до метил-лактата и измеряли посредством анализа свободного пространства на хиральной колонке.
Пример 1
Продуцирование энантриомерно чистой молочной кислоты
G. thermoglucosidans
Конструировали интеграционную плазмиду pRM3 для делеции гена sigF в G. thermoglucosidans. Вышележащую и нижележащую фланкирующие области гена sigF создавали посредством PCR, используя геномную ДНК из DSM 2542 в качестве матрицы и комбинации праймеров 653 и 654 (Таблица 2) для получения вышележащего фрагмента и праймеры 651 и 652 (Таблица 2) для получения нижележащего фрагмента. Сначала клонировали нижележащий фрагмент в виде фрагмента KpnI-SaII в pNW33n, обработанную теми же ферментами. Затем клонировали вышележащий фрагмент в виде фрагмента SaII-HindIII в эту конструкцию, обработанную теми же ферментами, имея результатом плазмиду pRM3. Конструирование pRM3 выполняли в Е. coli TG90. Целостность последовательности pRM3 подтверждали посредством секвенирования ДНК.
Плазмиду pRM3 электропорировали в G. thermoglucosidans DSM 2542. Выбирали одну колонию трансформанта и использовали для получения мутантов с одиночным кроссинговером, как описано в разделе «Материалы и методы». Для дальнейшей работы отбирали две колонии, одну с одиночным кроссинговером посредством вышележащей фланкирующей области и одну с одиночным кроссинговером посредством нижележащей фланкирующей области.
Мутант с двойным кроссинговером получали посредством процедуры, описанной в разделе «Материалы и методы». Шестьдесят колоний, полученных после субкультивирования интегрантов с одиночным кроссинговером в TGP без хлорамфеникола, переносили на TGP чашки с хлорамфениколом и без хлорамфеникола. Пятнадцать колоний были чувствительными к хлорамфениколу. Двенадцать колоний имели целевую модификацию и три вернулись к дикому типу. Выбрали одну колонию и обозначили ее как G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF. Делецию подтвердили секвенированием.
G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF оценивали в ходе ферментации с регулированием рН (KOH), используя ТММ1 и ТММ2.5. Ферментации анализировали. Результаты представлены в Таблице 3. G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF потреблял ксилозу и глюкозу одновременно. Хиральная чистота продуцированной (S)-молочной кислоты намного ниже технических требований для хирально чистой молочной кислоты.
Конструировали плазмиду pJS43 с делецией 267 п.о. гена mgsA (423 п.о.) в G. thermoglucosidans. Вышележащую и нижележащую фланкирующие области гена mgsA создавали посредством PCR, используя геномную ДНК DSM 2542 в качестве матрицы и комбинации праймеров 750 и 999 для получения нижележащего фрагмента mgsA и праймеры 1000 и 753 для получения вышележащего фрагмента mgsA. Полученные два PCR-продукта использовали потом в качестве матрицы в PCR с перекрыванием, используя комбинацию праймеров 750 и 753 для их слияния. Продукт клонировали в виде фрагмента BamHI-PstI в плазмиду pNW33n, обработанную BamHI и Pstl, имея результатом плазмиду pJS43. Конструирование pJS43 выполняли в Е. coli TG90. Целостность нуклеотидной последовательности pJS43 подтверждали секвенированием.
Плазмиду pJS43 электропорировали в G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF. Выбирали одну колонию трансформанта и использовали для получения мутантов с одиночным кроссинговером, как описано в разделе «Материалы и методы». Один интегрант с одиночным кроссинговером выбирали для дальнейшей работы.
Мутант с двойным кроссинговером получали посредством процедуры, описанной в разделе «Материалы и методы». Шестьдесят колоний, полученных после субкультивирования интегранта с одиночным кроссинговером в TGP без хлорамфеникола, переносили на TGP чашки с хлорамфениколом и без хлорамфеникола. Все колонии показывали чувствительность к хлорамфениколу. Двадцать пять колоний анализировали. Четыре колонии имели целевую модификацию, и двадцать одна вернулась к дикому типу. Отбирали одну колонию и обозначали ее как G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF, ΔmgsA. Делецию подтверждали секвенированием.
G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF, ΔmgsA оценивали в ферментации с регулируемым рН (Mg(ОН)2), используя STMM2,5. Ферментацию анализировали. Результаты представлены в Таблице 4. G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF, ΔmgsA потреблял ксилозу и глюкозу одновременно.
Хиральная чистота продуцированной (S)-молочной кислоты составляла 99,6%, что считается хирально чистой. Эти данные ясно показывают, что, несмотря на очевидную неполноту метилглиоксального пути у G. thermoglucosidans, нарушение mgsA имеет результатом способность продуцировать хирально чистую (S)-молочную кислоту.
Пример 2
Продуцирование энантриомерно чистой гомомолочной кислоты G. thermoglucosidans
G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF, ΔmgsA еще продуцировал значительные количества муравьиной кислоты и этанола, тогда как уксусная кислота представляла собой минорный побочный продукт (Таблица 4). Хотя известно, что мутации pfIA и/или pfIB и adhE влияют на продуцирование муравьиной кислоты и этанола во многих бактериях, побочные эффекты нарушения этих генов непредсказуемы.
Конструировали плазмиду pRM12 для делеции генов pfIB, pfIA и adhE (частично) в G. thermoglucosidans. Вышележащую фланкирующую область pflBA и нижележащую фланкирующую область конвергентно ориентированного adhE создавали посредством PCR, используя геномную ДНК из DSM 2542 в качестве матрицы и комбинации праймеров 739 и 805 для получения вышележащего фрагмента pflBA и праймеры 806 и 807 для получения вышележащего фрагмента adhE. Полученные два PCR-продукта затем использовали в качестве матрицы в PCR с перекрыванием, используя комбинацию праймеров 739 и 807 для их слияния. Продукт клонировали в виде фрагмента BamHI-PstI в плазмиду pNW33n, обработанную BamHI и PstI, имея результатом плазмиду pRM12. Конструирование pRM12 выполняли в Е. coli DH5a. Целостность нуклеотидной последовательности pRM12 подтверждали секвенированием.
Плазмиду pRM12 электропорировали в G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF, ΔmgsA. Выбирали одну колонию трансформанта и использовали для получения мутантов с одиночным кроссинговером, как описано в разделе «Материалы и методы». Выбирали две колонии для дальнейшей работы, одну с одиночным кроссинговером посредством вышележащей фланкирующей области pflBA и одну с одиночным кроссинговером посредством вышележащей фланкирующей области adhE.
Мутант с двойным кроссинговером получали посредством процедуры, описанной в разделе «Материалы и методы». Сто двенадцать колоний, полученных после субкультивирования интегрантов с одиночным кроссинговером в TGP без хлорамфеникола, переносили на TGP чашки с хлорамфениколом и без хлорамфеникола. Две колонии были чувствительными к хлорамфениколу. Одна имела целевую модификацию, а другая вернулась к дикому типу. Эту одну колонию обозначили как G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF, ΔmgsA, ΔpflBA-ΔadhE. Делецию подтверждали секвенированием.
1Отбор образца после инокуляции
2н.о. = не определено: концентрация молочной кислоты слишком низкая для определения хиральной чистоты
G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF, ΔmgsA, ΔpflBA-ΔadhE оценивали по ферментациям с регулированием рН (Са(ОН)2), используя среду STMM, содержащую 5,0 г/л дрожжевого экстракта, 60 г/л глюкозы и 30 г/л ксилозы. Ферментацию анализировали в трех временных точках. Результаты представлены в Таблице 5. G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF, ΔmgsA, ΔpflBA-ΔadhE потреблял ксилозу и глюкозу одновременно. Хиральная чистота (S)-молочной кислоты, продуцированной G. thermoglucosidans DSM 2542 ΔsigF, ΔmgsA, ΔpflBA-ΔadhE, составляла 99,7% или выше. Продуцирование уксусной кислоты и муравьиной кислоты составляло 6,7 мг на грамм молочной кислоты. Продуцирование этанола не могли определить. Эти данные ясно демонстрируют, что нарушения генов комплекса пируват-формиат-лиазы и алкогольдегидрогеназы значительно снижало продуцирование этанола, муравьиной кислоты и уксусной кислоты, имея результатом гомомолочную ферментацию хирально чистой (S)-молочной кислоты.
Claims (27)
1. Полученная генно-инженерным путем термофильная бактериальная клетка, представляющая собой факультативно анаэробную, грамположительную и продуцирующую (S)-молочную кислоту клетку, принадлежащую роду Geobacillus, в которой эндогенный ген mgsA метилглиоксальсинтазы инактивирован или делетирован.
2. Клетка по п.1, в которой дополнительно инактивирован или делетирован эндогенный ген А и/или В пируват-формиат-лиазы.
3. Клетка по п.1 или 2, которая дополнительно является дефектной по споруляции в результате инактивации или делеции эндогенного гена споруляции.
4. Клетка по п.3, где ген споруляции представляет собой sigF.
5. Клетка по любому из пп.2-4, где эндогенный ген А и/или В пируват-формиат-лиазы инактивирован путем инактивации или делеции локуса pflBA-adhE пируват-формиат-лиаза/алкогольдегидрогеназа.
6. Клетка по любому из пп.1-5, продуцирующая (S)-молочную кислоту с энантиомерной чистотой по меньшей мере 98%.
7. Клетка по любому из пп.1-6, где дополнительно инактивирован или делетирован эндогенный ген фосфотрансацетилазы (pta).
8. Бактериальная клетка по любому из пп.1-7, где гены инактивированы или делетированы посредством гомологичной рекомбинации.
9. Клетка по п.1, где вид Geobacillus представляет собой Geobacillus thermoglucosidans.
10. Способ продуцирования энантиомерно чистой (S)-молочной кислоты, включающий культивирование термофильной бактериальной клетки по любому из пп. 1-9 с использованием подходящего ферментируемого углеродсодержащего источника питания и выделение (S)-молочной кислоты.
11. Способ по п.10, где углеродсодержащий источник питания содержит ксилозу, глюкозу или сахарозу.
12. Способ по п.10 или 11, где культивирование осуществляют при температуре от 50°C до 70°C.
13. Способ по любому из пп.10-12, при котором образуется не более 15% (масс./масс.) побочных продуктов, исходя из общей массы побочных продуктов относительно общей массы продуцированной молочной кислоты.
14. Способ по любому из пп.10-13, где образованное количество по меньшей мере одного из муравьиной кислоты, этанола и уксусной кислоты составляет не более 10% (масс./масс), исходя из общей массы муравьиной кислоты, этанола или уксусной кислоты относительно общей массы продуцированной молочной кислоты.
15. Клетка по п.6, продуцирующая (S)-молочную кислоту с энантиомерной чистотой по меньшей мере 99%.
16. Клетка по п.6, продуцирующая (S)-молочную кислоту с энантиомерной чистотой по меньшей мере 99,5%.
17. Клетка по п.6, продуцирующая (S)-молочную кислоту с энантиомерной чистотой по меньшей мере 99,8%.
18. Клетка по п.6, продуцирующая (S)-молочную кислоту с энантиомерной чистотой по меньшей мере 99,9%.
19. Способ по п.13, при котором образуется не более 10% (масс./масс.) побочных продуктов, исходя из общей массы побочных продуктов относительно общей массы продуцированной молочной кислоты.
20. Способ по п.13, при котором образуется не более 5% (масс./масс.) побочных продуктов, исходя из общей массы побочных продуктов относительно общей массы продуцированной молочной кислоты.
21. Способ по п.13, при котором образуется не более 4% (масс./масс.) побочных продуктов, исходя из общей массы побочных продуктов относительно общей массы продуцированной молочной кислоты.
22. Способ по п.13, при котором образуется не более 3% (масс./масс.) побочных продуктов, исходя из общей массы побочных продуктов относительно общей массы продуцированной молочной кислоты.
23. Способ по п.13, при котором образуется не более 2% (масс./масс.) побочных продуктов, исходя из общей массы побочных продуктов относительно общей массы продуцированной молочной кислоты.
24. Способ по п.14, где образованное количество по меньшей мере одного из муравьиной кислоты, этанола и уксусной кислоты составляет не более 6% (масс./масс.), исходя из общей массы муравьиной кислоты, этанола или уксусной кислоты относительно общей массы продуцированной молочной кислоты.
25. Способ по п.14, где образованное количество по меньшей мере одного из муравьиной кислоты, этанола и уксусной кислоты составляет не более 1% (масс./масс.), исходя из общей массы муравьиной кислоты, этанола или уксусной кислоты относительно общей массы продуцированной молочной кислоты.
26. Способ по п.14, где образованное количество по меньшей мере одного из муравьиной кислоты, этанола и уксусной кислоты составляет не более 0,25% (масс./масс.), исходя из общей массы муравьиной кислоты, этанола или уксусной кислоты относительно общей массы продуцированной молочной кислоты.
27. Способ по п.14, где образованное количество по меньшей мере одного из муравьиной кислоты, этанола и уксусной кислоты составляет не более 0,1% (масс./масс.), исходя из общей массы муравьиной кислоты, этанола или уксусной кислоты относительно общей массы продуцированной молочной кислоты.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP14178150.0A EP2977471A1 (en) | 2014-07-23 | 2014-07-23 | Genetic modification of (S)-lactic acid producing thermophilic bacteria |
EP14178150.0 | 2014-07-23 | ||
PCT/EP2015/065995 WO2016012298A1 (en) | 2014-07-23 | 2015-07-13 | Genetic modification of (s)-lactic acid producing thermophilic bacteria |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2017102895A3 RU2017102895A3 (ru) | 2018-08-27 |
RU2017102895A RU2017102895A (ru) | 2018-08-27 |
RU2671528C2 true RU2671528C2 (ru) | 2018-11-01 |
Family
ID=51211698
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017102895A RU2671528C2 (ru) | 2014-07-23 | 2015-07-13 | Генетическая модификация продуцирующих (S)-молочную кислоту термофильных бактерий |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10273509B2 (ru) |
EP (2) | EP2977471A1 (ru) |
JP (2) | JP6549214B2 (ru) |
KR (1) | KR101999975B1 (ru) |
CN (1) | CN106536543B (ru) |
AU (1) | AU2015294138B2 (ru) |
BR (1) | BR112017000940B1 (ru) |
CA (1) | CA2955720C (ru) |
DK (1) | DK3177741T3 (ru) |
ES (1) | ES2924250T3 (ru) |
HU (1) | HUE059443T2 (ru) |
PL (1) | PL3177741T3 (ru) |
RU (1) | RU2671528C2 (ru) |
UA (1) | UA121479C2 (ru) |
WO (1) | WO2016012298A1 (ru) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2024126054A1 (en) | 2022-12-15 | 2024-06-20 | Feedstocksunited B.V. | Trioxane as unifying fermentation feedstock |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050106694A1 (en) * | 2001-07-18 | 2005-05-19 | Elsworth Biotechnology Ltd. | Lactic acid production |
RU2355759C1 (ru) * | 2007-08-14 | 2009-05-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АРОМАТИЧЕСКОЙ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН ydiB, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЛОЖНОГО ЭФИРА НИЗШИХ АЛКИЛОВ АЛЬФА-L-АСПАРТИЛ-L-ФЕНИЛАЛАНИНА |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NL1013682C2 (nl) | 1999-11-26 | 2001-05-30 | Purac Biochem Bv | Werkwijze en inrichting voor het zuiveren van een waterige oplossing van melkzuur. |
GB0000185D0 (en) | 2000-01-06 | 2000-03-01 | Agrol Limited | Ethanol production |
EP1391502B1 (en) | 2001-05-29 | 2012-04-25 | Kao Corporation | Host microorganisms |
JP4336082B2 (ja) * | 2001-05-29 | 2009-09-30 | 花王株式会社 | 宿主微生物 |
CN101654666B (zh) * | 2003-09-30 | 2012-11-14 | 三井化学株式会社 | 用于生产d-乳酸的生物催化剂 |
US7098009B2 (en) | 2004-03-04 | 2006-08-29 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Production of chemicals from lignocellulose, biomass or sugars |
EA015794B1 (ru) | 2005-05-04 | 2011-12-30 | Тмо Реньюаблз Лимитед | Термофильные микроорганизмы вида geobacillus с инактивированным геном лактатдегидрогеназы (ldh) для производства этанола |
DK2305826T3 (en) * | 2005-08-10 | 2016-06-27 | Univ Florida | Materials and methods for the efficient production of lactic acid |
DE502006000079D1 (de) | 2006-01-24 | 2007-10-11 | Lurgi Zimmer Gmbh | Verfahren zur Veresterung von Terephthalsäure mit Butandiol, Verfahren zur Herstellung von Polybutylenterephthalat und Vorrichtung dafür |
EP2066783A2 (en) | 2006-09-28 | 2009-06-10 | TMO Renewables Limited | Thermophilic microorganisms for ethanol production |
GB0820262D0 (en) | 2008-11-05 | 2008-12-10 | Tmo Renewables Ltd | Microorganisms |
DK2446019T3 (da) * | 2009-06-23 | 2015-06-15 | Bp Corp North America Inc | Rekombinant ethanologen bakterie |
EP2468860B1 (en) * | 2009-08-21 | 2015-11-25 | Asahi Glass Company, Limited | Transformant and process for production thereof, and process for production of lactic acid |
-
2014
- 2014-07-23 EP EP14178150.0A patent/EP2977471A1/en not_active Withdrawn
-
2015
- 2015-07-13 WO PCT/EP2015/065995 patent/WO2016012298A1/en active Application Filing
- 2015-07-13 JP JP2017502623A patent/JP6549214B2/ja active Active
- 2015-07-13 KR KR1020177004576A patent/KR101999975B1/ko active IP Right Grant
- 2015-07-13 RU RU2017102895A patent/RU2671528C2/ru active
- 2015-07-13 US US15/327,621 patent/US10273509B2/en active Active
- 2015-07-13 PL PL15738320.9T patent/PL3177741T3/pl unknown
- 2015-07-13 UA UAA201700514A patent/UA121479C2/uk unknown
- 2015-07-13 ES ES15738320T patent/ES2924250T3/es active Active
- 2015-07-13 EP EP15738320.9A patent/EP3177741B1/en active Active
- 2015-07-13 AU AU2015294138A patent/AU2015294138B2/en active Active
- 2015-07-13 CA CA2955720A patent/CA2955720C/en active Active
- 2015-07-13 DK DK15738320.9T patent/DK3177741T3/da active
- 2015-07-13 CN CN201580039353.5A patent/CN106536543B/zh active Active
- 2015-07-13 HU HUE15738320A patent/HUE059443T2/hu unknown
- 2015-07-13 BR BR112017000940-4A patent/BR112017000940B1/pt active IP Right Grant
-
2019
- 2019-02-21 JP JP2019029749A patent/JP2019088328A/ja not_active Withdrawn
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050106694A1 (en) * | 2001-07-18 | 2005-05-19 | Elsworth Biotechnology Ltd. | Lactic acid production |
RU2355759C1 (ru) * | 2007-08-14 | 2009-05-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АРОМАТИЧЕСКОЙ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН ydiB, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЛОЖНОГО ЭФИРА НИЗШИХ АЛКИЛОВ АЛЬФА-L-АСПАРТИЛ-L-ФЕНИЛАЛАНИНА |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
MAZUMDAR S. ET AL. Efficient synthesis of L-lactic acid from glycerol by metabolically engineered Escherichia coli // Microbial Cell Factories 2013, 12:7. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2955720C (en) | 2019-11-05 |
JP6549214B2 (ja) | 2019-07-24 |
RU2017102895A3 (ru) | 2018-08-27 |
HUE059443T2 (hu) | 2022-11-28 |
CN106536543B (zh) | 2021-05-07 |
EP3177741A1 (en) | 2017-06-14 |
AU2015294138A1 (en) | 2017-02-09 |
BR112017000940B1 (pt) | 2024-01-16 |
PL3177741T3 (pl) | 2022-10-03 |
CA2955720A1 (en) | 2016-01-28 |
EP2977471A1 (en) | 2016-01-27 |
KR101999975B1 (ko) | 2019-07-15 |
US10273509B2 (en) | 2019-04-30 |
JP2017521081A (ja) | 2017-08-03 |
US20170298398A1 (en) | 2017-10-19 |
DK3177741T3 (da) | 2022-09-12 |
CN106536543A (zh) | 2017-03-22 |
RU2017102895A (ru) | 2018-08-27 |
UA121479C2 (uk) | 2020-06-10 |
WO2016012298A1 (en) | 2016-01-28 |
BR112017000940A2 (pt) | 2017-11-14 |
KR20170028445A (ko) | 2017-03-13 |
JP2019088328A (ja) | 2019-06-13 |
AU2015294138B2 (en) | 2018-07-19 |
ES2924250T3 (es) | 2022-10-05 |
EP3177741B1 (en) | 2022-06-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2016529901A (ja) | アラニンの生産向上のための改変微生物 | |
US10731186B2 (en) | Genetically modified (R)-lactic acid producing thermophilic bacteria | |
US10287558B2 (en) | Microorganisms for succinic acid production | |
US9850506B2 (en) | Modified microorganism for improved production of fine chemicals on sucrose | |
RU2671528C2 (ru) | Генетическая модификация продуцирующих (S)-молочную кислоту термофильных бактерий | |
JP7158107B2 (ja) | 有機化合物の生産方法 |