UA121479C2 - Генетично модифікована термофільна бактеріальна клітина geobacillus thermoglucosidasius, яка продукує (s)-молочну кислоту, та спосіб одержання енантіомерно чистої (s)-молочної кислоти - Google Patents
Генетично модифікована термофільна бактеріальна клітина geobacillus thermoglucosidasius, яка продукує (s)-молочну кислоту, та спосіб одержання енантіомерно чистої (s)-молочної кислоти Download PDFInfo
- Publication number
- UA121479C2 UA121479C2 UAA201700514A UAA201700514A UA121479C2 UA 121479 C2 UA121479 C2 UA 121479C2 UA A201700514 A UAA201700514 A UA A201700514A UA A201700514 A UAA201700514 A UA A201700514A UA 121479 C2 UA121479 C2 UA 121479C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- avr
- lactic acid
- rgo
- aga
- gene
- Prior art date
Links
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title description 59
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 title description 4
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 title description 4
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 title description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-REOHCLBHSA-N L-lactic acid Chemical compound C[C@H](O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-REOHCLBHSA-N 0.000 title 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 16
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 16
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims abstract description 14
- 108010083856 methylglyoxal synthase Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims description 95
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 82
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 80
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 75
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 72
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims description 40
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 34
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 claims description 32
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 20
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims description 20
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 20
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 19
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 claims description 18
- 108010008221 formate C-acetyltransferase Proteins 0.000 claims description 15
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 claims description 14
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 12
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 9
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 9
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 8
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 8
- 102100033598 Triosephosphate isomerase Human genes 0.000 claims description 7
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 101150076489 B gene Proteins 0.000 claims description 3
- 108700023175 Phosphate acetyltransferases Proteins 0.000 claims description 3
- YQNQNVDNTFHQSW-UHFFFAOYSA-N acetic acid [2-[[(5-nitro-2-thiazolyl)amino]-oxomethyl]phenyl] ester Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(=O)NC1=NC=C([N+]([O-])=O)S1 YQNQNVDNTFHQSW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 101100139916 Escherichia coli (strain K12) rarA gene Proteins 0.000 abstract 1
- 101150083023 mgsA gene Proteins 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 41
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 37
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 37
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 36
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 29
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 29
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 27
- AIJULSRZWUXGPQ-UHFFFAOYSA-N Methylglyoxal Chemical compound CC(=O)C=O AIJULSRZWUXGPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 23
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 17
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 17
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 15
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 13
- 241000894007 species Species 0.000 description 13
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 11
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 11
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 10
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 235000005583 doda Nutrition 0.000 description 6
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 6
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 6
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 4
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 238000001030 gas--liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 108010022065 Lactate racemase Proteins 0.000 description 3
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000473945 Theria <moth genus> Species 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 208000027697 autoimmune lymphoproliferative syndrome due to CTLA4 haploinsuffiency Diseases 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 3
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- AUTALUGDOGWPQH-UBLOVXTBSA-N (2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;(2r,3s,4r)-2,3,4,5-tetrahydroxypentanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O AUTALUGDOGWPQH-UBLOVXTBSA-N 0.000 description 2
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 2
- 229930189936 Glyoxalase Natural products 0.000 description 2
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- 108010065064 acetaldehyde dehydrogenase (acylating) Proteins 0.000 description 2
- RHHGBCYEBPMXAF-BLPRJPCASA-N acetaldehyde;[[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-4-hydroxy-3-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(3r)-3-hydroxy-2,2-dimethyl-4-oxo-4-[[3-oxo-3-(2-sulfanylethylamino)propyl]amino]butyl] hydrogen phosphate Chemical compound CC=O.O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RHHGBCYEBPMXAF-BLPRJPCASA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- GNGACRATGGDKBX-UHFFFAOYSA-N dihydroxyacetone phosphate Chemical compound OCC(=O)COP(O)(O)=O GNGACRATGGDKBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- QXYJCZRRLLQGCR-UHFFFAOYSA-N dioxomolybdenum Chemical compound O=[Mo]=O QXYJCZRRLLQGCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005188 flotation Methods 0.000 description 2
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N glycine betaine Chemical compound C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 i.e. Substances 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- QWDJLDTYWNBUKE-UHFFFAOYSA-L magnesium bicarbonate Chemical compound [Mg+2].OC([O-])=O.OC([O-])=O QWDJLDTYWNBUKE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000002370 magnesium bicarbonate Substances 0.000 description 2
- 229910000022 magnesium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000014824 magnesium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 2
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- VTHJTEIRLNZDEV-UHFFFAOYSA-L magnesium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Mg+2] VTHJTEIRLNZDEV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000347 magnesium hydroxide Substances 0.000 description 2
- 229910001862 magnesium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 235000021048 nutrient requirements Nutrition 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000007793 ph indicator Substances 0.000 description 2
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000011403 purification operation Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 101150006605 rpa gene Proteins 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 2
- LPEKGGXMPWTOCB-UHFFFAOYSA-N 8beta-(2,3-epoxy-2-methylbutyryloxy)-14-acetoxytithifolin Natural products COC(=O)C(C)O LPEKGGXMPWTOCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 101710134784 Agnoprotein Proteins 0.000 description 1
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical class OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 1
- 240000008100 Brassica rapa Species 0.000 description 1
- 235000000540 Brassica rapa subsp rapa Nutrition 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000034573 Channels Human genes 0.000 description 1
- GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N Chick antidermatitis factor Natural products OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000195628 Chlorophyta Species 0.000 description 1
- 244000102216 Crateva tapia Species 0.000 description 1
- 235000003495 Crateva tapia Nutrition 0.000 description 1
- 235000017788 Cydonia oblonga Nutrition 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 229930182843 D-Lactic acid Natural products 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UWTATZPHSA-N D-lactic acid Chemical compound C[C@@H](O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 101150013191 E gene Proteins 0.000 description 1
- 101100102826 Enterobacteria phage T4 rIIB gene Proteins 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 101000861519 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Probable formate transporter Proteins 0.000 description 1
- 101000634538 Homo sapiens Neuronal PAS domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100040544 Hydroxyacylglutathione hydrolase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 229910016006 MoSi Inorganic materials 0.000 description 1
- 101100498160 Mus musculus Dach1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100049053 Mus musculus Vash1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000755666 Neato Species 0.000 description 1
- 102100029052 Neuronal PAS domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100154700 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) tsi5 gene Proteins 0.000 description 1
- 229910019567 Re Re Inorganic materials 0.000 description 1
- 101100141527 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) RKM3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001411185 Sison Species 0.000 description 1
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001178076 Zaga Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 150000001447 alkali salts Chemical class 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960004050 aminobenzoic acid Drugs 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000009604 anaerobic growth Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 1
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000025938 carbohydrate utilization Effects 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- ASARMUCNOOHMLO-WLORSUFZSA-L cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2s)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O ASARMUCNOOHMLO-WLORSUFZSA-L 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical compound CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- ODQWQRRAPPTVAG-GZTJUZNOSA-N doxepin Chemical compound C1OC2=CC=CC=C2C(=C/CCN(C)C)/C2=CC=CC=C21 ODQWQRRAPPTVAG-GZTJUZNOSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000000909 electrodialysis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- HESCAJZNRMSMJG-KKQRBIROSA-N epothilone A Chemical compound C/C([C@@H]1C[C@@H]2O[C@@H]2CCC[C@@H]([C@@H]([C@@H](C)C(=O)C(C)(C)[C@@H](O)CC(=O)O1)O)C)=C\C1=CSC(C)=N1 HESCAJZNRMSMJG-KKQRBIROSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 description 1
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 description 1
- 229940063755 folic acid 0.1 mg Drugs 0.000 description 1
- 150000004674 formic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000011087 fumaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 150000004679 hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 108010025042 hydroxyacylglutathione hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000003903 lactic acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000012886 linear function Methods 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004066 metabolic change Effects 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000002736 metal compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229940057867 methyl lactate Drugs 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008723 osmotic stress Effects 0.000 description 1
- 229940055726 pantothenic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930010796 primary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 108010009004 proteose-peptone Proteins 0.000 description 1
- 108010060146 pyruvate formate-lyase activating enzyme Proteins 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 239000012808 vapor phase Substances 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/56—Lactic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
- C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
- C12Y203/01008—Phosphate acetyltransferase (2.3.1.8)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
- C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
- C12Y203/01054—Formate C-acetyltransferase (2.3.1.54), i.e. pyruvate formate-lyase or PFL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
- C12Y402/03—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on phosphates (4.2.3)
- C12Y402/03003—Methylglyoxal synthase (4.2.3.3)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Винахід стосується генетично сконструйованої грампозитивної термофільної клітини Geobacillus thermoglucosidasius, яка є факультативним анаеробом та продуцентом (S)-молочної кислоти, яка включає інактивований або делетований ендогенний ген метилгліоксалсинтази mgsA. Також винахід стосується способу одержання енантіомерно чистої (S)-молочної кислоти, який включає культивування вказаної термофільної бактеріальної клітини при використанні прийнятного, здатного до ферментації карбонвмісного субстрату та виділення (S)-молочної кислоти.
Description
Винахід стосується змінення термофільної бактеріальної клітини для продукування гомолактичної та енантіомерно чистої (5)-молочної кислоти, генетично модифікованих клітин та способу отримання енантіомерно чистої (5)-молочної кислоти.
Молочна кислота та її солі, відомі як "лактати", є конкурентоздатними продуктами, корисними у різних галузях, включаючи медицину, отримання біорозкладаних полімерів та приготування їжі. Термофільні бактерії, як-то Сеорасійй5, що є факультативними анаеробами здаються ідеальними організмами, призначеними для промислового виробництва молочної кислоти. Вони здатні до росту при температурах 37-752С з оптимальним температурним діапазоном у 55-6520 (Ма?іпа єї аї., 2001, Іпі. у). уві. Емої. Містобіо!. 51:433-446) та дозволяють здійснити промислову анаеробну ферментацію при температурах, які перевищують 502С. Ця висока температура має кілька переваг у випадку ферментації в промисловому масштабі, як-то зменшення ризику виникнення інфекцій, висока енантіомерна чистота, більш швидкі реакції, зменшення витрат на охолодження тощо. Факультативна анаеробна природа бактерій Сеобасійї дозволяє здійснити ферментацію в анаеробних умовах або принаймні в умовах низького парціального кисневого тиску, які для промислового масштабу є бажаними, оскільки вони дозволяють застосувати відносно дешеві обладнання та обробку. Крім того, потреби цих бактерій в поживних речовинах є менш вимогливими, ніж потреби таких молочнокислих бактерій, як, наприклад, Іасіорасійш5, що також дозволяє здійснити відносно недорогі промислові процеси.
Відомо, що бактерії виду СеобасіПш5, які є факультативними анаеробними мікроорганізмами утворюють молочну кислоту у разі їх зростання в анаеробних умовах або принаймні в умовах низького парціального кисневого тиску. Прикладами таких бактерій є (с. саідоїепах, а. саідохуозпуїсив, Сі. дебіїїв, Сх. Каивіорпійй5, С. радив, с. вівагоїпепторніив, с. Терідітапв, С.
Шептодепйніісапв, Сі. ептодіисовідапв, С. (Шептоіеомогапв, а. гоербії, Сх. ігорісаїїв.
Бактерії б. (Шегтодіисозізап5 можуть виробляти молочну кислоту з ксилози, арабінози, глюкози, фруктози, цукрози та целюлози (Сгееп еї аї., 2003, УМО03/008601). Найбільш прийнятні субстрати для промислового застосування містять цукрозу, глюкозу, ксилозу або арабінозу або їх суміші. Здатність до одночасного застосування глюкози та ксилози (Сгееп еї аї., 2003,
УМО03/008601) є важливою перевагою с. Шептодіисовзідапе у разі застосування здатних до
Зо ферментації цукрів, отриманих з лігноцелюлозної сировини.
Одним недоліком відомих видів Ссієорасіїйш5, які є факультативними анаеробами є те, що вони мають змішану кислотну ферментацію з утворенням молочної кислоти, етанолу, оцтової кислоти та мурашиної кислоти, як головних продуктів ферментації. У цій заявці термін "органічні кислоти" також охоплює й відповідні солі цих кислот.
Іншим недоліком є те, що більшість цих видів не утворюють енантіомерно чистої молочної кислоти. Хіральна чистота є важливим аспектом для продукування полімерів полімолочної кислоти, тому для промислового застосування важливим є отримання енантіомерно чистої (5)- молочної кислоти. Проте, на сьогоднішній день є лише обмежена інформація про енантіомерну чистоту молочної кислоти, виробленої бактеріями, які належать до виду Сеобрасійи5. Слід розуміти, що іншими позначеннями для (5)-молочної кислоти є І-молочна кислота або І(к)- молочна кислота та в цій заявці ці терміни застосовано взаємозамінно. Так саме тут взаємозамінно застосовано терміни «(К)-молочна кислота", "О-молочна кислота" та "О(-)- молочна кислота".
Рауюп й Нагпіеу виявили, що (її. 5ієагоїШепторнйи5 РІ мають змішаний профіль ферментації кислоти та виробляють (5)-молочну кислоту, оцтову кислоту та етанол у разі росту цих бактерій на глюкозі у колбах зі струшуванням та з неконтрольованим рН (Раушюп «4. Нагіеу, 1985, ЕЕМ5 Містобіо!ї. І ен. 26:333-336). Хіральну чистоту отриманого продукту вказано не було.
Пізніші дослідження показали, що Ре та їх похідні є нетиповими для бактерій а. вівагоїпепторнійше та здаються більш спорідненими до Сї. саі(доїєпах (Атапеу еї аї., 1991,
Віоїеснпої. І ей. 13:621-626; Огееп еї аї., 2001, УМО 01/49865). Отриманий низький вихід робить цей штам неприйнятним для промислового застосування.
Оаппег ейг а дослідили продукування (5)-молочної кислоти штамами бактерій свівагоїйепторнйи5 ІБАб та ІРАУ з цукрози та глюкози (Оаппег еї аї., 1998, Аррі. Віоспет.
Віоїеснпої. 70-72:895-903). Штам ІБАб виробляє значні кількості побічних продуктів, тобто етанолу, оцтової кислоти та мурашиної кислоти, тоді як штам ІБАУ9У не виробляє цих продуктів.
Хіральна чистота у разі росту бактерій на глюкозі, як було повідомлено, для штаму ІБГАб складала 99,22-99,85 до та для штаму ІБА9 складала 99.4 95 (ЮОаппег єї а!., 1998, Аррі. Віоспет.
Віоїеснпої. 70-72:895-903). Основою умов культивування було застосування збагаченого середовища, яке містило дріжджовий екстракт та казеїн-пептон, які є небажаними для бо промислового виробництва. Порівняно зі штамом ІБАб, штам БАЗУ має зменшену продуктивність у разі застосування підвищених концентрацій продукту, що робить його менш прийнятним для промислового виробництва. Крім того, штам ІБАЄ має низький вихід, що також робить його непридатним для промислового виробництва.
Као 8 Зайуапагауапа дослідили продукування молочної кислоти бактеріями
СоептоІєомогапо, але в цьому описі відсутня інформація стосовно виходу або хіральної чистоти продукту ІКао «5 Заїуапагауапа, 2009, Аррі. Віоспет. Віоїесппої. 159:464-477|.
Сгееп еї а. описали продукування (5)-молочної кислоти бактеріями С. Шептоадійсозідапе
І М-9 з хіральною чистотою 99,2 95 та виходом, який складав 0,7 г/г у колбах зі струшуванням та з неконтрольованим рН (ОСгеєп еї аї.,, 2003, УМО 03/008601). Цей низький вихід робить досліджувані бактерії неприйнятними для промислових застосувань.
Аїкіпбоп о еї а). описали продукування молочної кислоти штамом бактерій
С.лпептодіисовідапе МСІМВ 11955 з ксилози або глюкози зі значними кількостями побічних продуктів, тобто етанолу, оцтової кислоти та мурашиної кислоти (АїКіпбоп еї аіІ., 2006, УМО 2006/117536). У разі застосування глюкози вихід складав 0,64 г/г, що є дуже низьким значенням для промислового застосування. Даних про хіральну чистоту повідомлено не було.
Тапуд ег ам. описали продукування (5)-молочної кислоти штамом бактерій а.
Тептодіисозідапе МІОЕХО. У мікроаеробних умовах головним продуктом цієї реакції була молочна кислота та в значних кількостях були присутніми побічні продукти, як-то оцтова кислота, етанол та мурашина кислота. В анаеробних умовах головним продуктом була мурашина кислота, а головними побічними продуктами - молочна кислота, оцтова кислота та етанол. Описані значення виходу є дуже низькими для промислового застосування. Як було повідомлено, хіральна чистота (5)-молочної кислоти складала »9995 (Тапд єї аї., 2009,
Віотесппої. Ген. 102: 1377-1386). а. тептодіисозідап5 було описано, як термофільні бактерії, які належать до виду Васій5 (бБи?икі еї аї!., 1983, узі. Аррі. Містгобіо!. 4:487-495; Ма?іпа еї аї!., 2001, Іпі. У. Зуві. Емої. Місгобіо!. 51:433-446; Соогеміїв єї аїЇ., 2012, Іпф Бузі ЕмоїЇ. Місторіої. 62:14770-1485). Бактерії ОЦ.
Іептодіисозідапе попередньо були відомі під назвою Васійй5 ІШептоаійсозідавіив (5и2иКкі еї аї., 1983, Бузі. Аррі. Містобріо!. 4:487-495), а потім Маіпа еї аї. у 2001 р. (Маіпа еї аї., 2001, Іпі. 9.
Бузі Емої. МісторіоІ. 51:433-446) перейменували їх на с. Шегпгтодіисозідавзій5, після чого Соогеміїв єї аї. (Соогеміїв евї аї!., 2012, Іпі. Зуві. Емої. Місторіо!ї. 62:14770-1485) перейменували їх на С. Тептодійсозідап5. Типовий штам було виділено також з грунту (Зигикі еї аї., 1976, Аррі.
Епмігоп. Містобріої!. 31:807-812). Хоча спочатку було повідомлено, що він є виключно аеробним, у наступних дослідженнях було описано його факультативне анаєробне зростання та продукування (5)-молочної кислоти (Сгееп еї аїі., 2003, УМО 03/008601; Ропд еї аї., 2006,
Ехігтеторпіез 10:363-372) при температурі 42-69 "С з оптимальною температурою 62 "С (5и2иКі еї а!., 1983, Бузі. Аррі. Місгобіо!. 4:487-495). Також було повідомлено про генетичну модифікацію штамів Сї. Шептодіисозічапе для продукування етанолу (Стеєп еї аї., 2001, МО 01/49865;
АїКіпзоп еї аї!., 2008, УУМО08/038019), до якої було додано опис механізмів цієї модифікації для штаму бактерій С. Шептодіисовідапе О5М 25427 та спосіб блокування експресії гена І- лактатдегідрогенази (ЧИ) (АїКіп5оп еї аї., 2006, УМО2006/117536 та 2008, УМО2008/038019).
Також було описано метаболічні шляхи та змінення клітинного росту на ксилозі та глюкозі для
С. Шептодійсовідапе МІОЕХа (Тапо еї аї. 2009, Віоїесппої. Гей. 102:1377-1386).
У власній лабораторії винахідники зробили спостереження, що хіральна чистота кислоти, утвореної бактеріями С. Шептодіисовзідапх ОМ 2542 може змінюватися в залежності від складу середовища та/або джерела цукру та виявили показники хіральної чистоти (5)-молочної кислоти в межах 89 95 та »99 95. Однак, для гнучкості у виборі субстрату та складу середовища залишалося потреба в отриманні похідної, здатної виробляти енантіомерно чисту (5)-молочну кислоту у всіх відповідних промислових умовах.
З вищесказаного можна зробити висновок, що відомі штами С1єорасіи5 мають змішану кислотну ферментацію та не виявляють продукування гомолактичної та енантіомерно чистої молочної кислоти.
Існує чітка потреба у застосуванні бактеріальних штамів (наприклад, штамів сеобасіїйи5), призначених для продукування гомолактичної та енантіомерно чистої молочної кислоти, які будуть мати привабливі характеристики для промислового втілення, як-то низьку потребу у поживних речовинах, розширені можливості щодо споживання цукру, можливість виробляти карбогідролітичні ферменти, високу швидкість росту, високу продуктивність, стійкість до осмотичного стресу та генетичну доступність.
Однією метою винаходу є отримання термофільних бактеріальних клітин, які є факультативними анаеробними бактеріями та які виробляють (5)-молочну кислоту шляхом бо гомолактичної ферментації.
Іншою метою винаходу є отримання термофільних бактеріальних клітин, які є факультативними анаеробними бактеріями та які виробляють енантіомерно чисту (5)-молочну кислоту.
Вихід (5)-молочної кислоти та хіральна чистота молочної кислоти, виробленої бактеріями виду Сеобасійи5, які є факультативними анаеробами може змінюватися в залежності від штаму та культуральних умов. Отже, існує потреба в отриманні покращених бактерій Сеобрасіишв, модифікованих для продукування гомолактичної та хірально чистої (5)-молочної кислоти.
Як описано в науковій літературі, існує кілька параметрів, які можуть призвести до порушення хіральної чистоти. (В)-молочну кислоту може бути отримано з пірувату за рахунок активності Ю-лактатдегідрогенази, також її може бути отримано з (5)-молочної кислоти за рахунок активності лактат-рацемази або її може бути отримано шляхом метилгліоксалевого шунту.
На першому етапі метилгліоксалевого шунту метилгліоксаль-синтаза (Е.С. 4,2.99.11) каталізує перетворення дигідроксиацетон-фосфату на метилгліоксаль та ортофосфат. Потім метилгліоксаль може бути перетворено двома різними шляхами на (5)- або (В)-молочну кислоту. Отже, метилгліоксалевий шунт може бути джерелом хірального забруднення для утворення як (5)-, так і (В)- молочної кислоти. Порушення роботи гена тд5А, який кодує метилгліоксаль-синтазу у ЕзсПпегіспіа соїї призводить до покращення хіральної чистоти для утворення як (5)-, так і (В)- молочної кислоти (Сгабаг еї а!., 2006, Віоїесппої. Гей. 28:1527-1535).
У грам-позитивних бактерій про цю активність метилгліоксалевого шунту є мало інформації. У мезофільних бактерій Васійй5 5иЇИБійвз ген тдуд5А розташовано в опероні разом з генами, які кодують перші два ферменти біосинтезу бацилтіолу (сабаїйа еї аї!., 2010, Ргос.Маї). Асад. 5сі.
БА 107:6482-6486; НеІтапп, 2011, Апійохідапіз 5 Недох відпаїйпуд 15:1123-133). Нещодавно
Спапагапудзи еї а). довели, що бацилтіол залучено до детоксифікації метилгліоксалю (Спапагапози єї аї., 2014, Мої. Містобріо!. 91:706-715). Бацилтіол-залежний метилгліоксалевий шлях полягає у застосуванні гліоксалази | (СІХА) та гліоксалази ІІ (РІХВ) для перетворення метилгліоксалю на (Н)-молочну кислоту (Спапагапдзи еї аї., 2014). Крім того, метилгліоксаль може бути перетворено на (АВ)-молочну кислоту за рахунок активності УаеА, УгаА, та МКМ, які є передбаченими гомологами гліоксалази ПІ (Спапагаподзи еї аї!., 2014, Мої. Місгобіої. 91:706-715).
Винахідники зазначили, що з геномної послідовності (1. Шептодіисобзідап5 можливо отримати ген передбаченої О-лактатдегідрогенази, а не ген виявленої лактат - рацемази. Для обох шляхів перетворення метилгліоксаля на (А2)-молочну кислоту, як було зазначено для В. 5,ибБійв (Спапагапудзи єї аїЇ. 2014, Мої. МісгобіоІ. 91:706-715) найближчі гомологи у а.
ІШептодіисозідап5 мали дуже низьку тотожність амінокислотної послідовності (46 956 для м/с; 34 95 для Ми; гомологів УаеА знайдено не було; 30 95 для УгтаА; та 35 95 для МКМ). На відміну від цього, фермент метилгліоксаль-синтаза (Мо5А) В. зиИбБійб має гомолог у бактерій а.
Шептодіисозідапе з 72 950 тотожністю амінокислотної послідовності. На основі геномної інформації можна було б очікувати, що продукування (В)-молочної кислоти викликано саме активністю Ю-лактатдегідрогенази, а не активністю лактат-рацемази або з допомогою метилгліоксалевого шляху перетворення. Проте несподівано винахідники отримали можливість скасувати продукування (Н)-лактату шляхом інактивації гена тозА, який, як очікується, кодує метилгліоксаль-синтазу.
Бактерії виду Сеорасійй5, які є факультативними анаеробними мікроорганізмами відрізняються змішаними кислотними ферментативними процесами, головними продуктами яких є молочна кислота, етанол, оцтова кислота та мурашина кислота. Інактивації генів, що кодують ферменти, потрібні для отримання побічних продуктів є загальноприйнятним підходом для покращення продукування бажаного продукту. Однак, наслідками інактивації певного гена можуть бути різні побічні дії в залежності від загального метаболізму хазяїна. Одиничні мутації гена рПА ЕзспПегіспіа соїї, який кодує фермент активування піруват-формат ліази, а також гена аднпЕ, який кодує біфункціональний комплекс дегідрогенази ацетальдегід-СоА/спирту, призводять до збільшення продукування молочної кислоти разом із супутнім збільшенням утворення піруватного побічного продукту, залишкової оцтової кислоти та етанолу та до сильного зменшення виходу біомаси (ріїАуУ або до покращення продукування молочної кислоти з оцтовою кислотою, як головним продуктом ферментації (аанєЕ (пи в ЗНіті2и, 2005, Меїаб.
Епоа. 7:104-115)3. У деяких штамах БЕ. соїї інактивація локусу ТосА-РПАВ призводить до припинення продукування мурашиної кислоти (2пои еї аї., 2003, Аррі. Епмігоп. Місгобіої. 69:2237- 2244; іш еї аї.,, 2011, Аррі. Віоспет. Віоїесппої. 164:162-169)3. Нещодавно було доведено важливість локусу ТосСА, який кодує форматний канальний білок, для накопичення молочної кислоти у середовищі (Веуєег еї аї., 2013, 9. Васіегіо!Ї. 195:1428-1435), отже це буде впливати на бо фенотипи штамів Е. соїї з делеціями ТосА-ріАВ. Випадки інактивації генів зелених водоростей
СНіатудотопаз геїіпНагаїйї, які кодують піруват-формат ліазу та алкоголь-дегідрогеназу хоча й покращують ферментацію молочної кислоти, але й також призводять до зростання концентрацій позаклітинного гліцерину та оцтової кислоти (Саїаіапоці еї аї.,, 2012, Ріапі Сеї 24:692-707).
Гени рВА у бактерій С. Тептодійсозідапе є конвергентно орієнтованими до гену аднЕ. З практичної точки зору, в одній модифікації винахідники вирішили інактивувати гени рА, ріїВ та аанЕ шляхом делеції генів ріВА та частини гена адпЕ. Неочікувано це призвело до майже повного скасування утворення таких побічних продуктів, як-то етанолу, оцтової кислоти та мурашиної кислоти без впливу на інші побічні продукти та на ефективність ферментації молочної кислоти. Наприклад, в цій заявці під майже повним скасуванням утворення побічного продукту мається на увазі те, що внаслідок ферментації у модифікованих генно-інженерним шляхом (як тут описано) клітинах, отримують не більше ніж 10 95 (маса/маса) побічних продуктів (як-то етанол, оцтова кислота та мурашина кислота) від загальної маси виробленої молочної кислоти, та зокрема не більш, ніж 5 Об, 4 У», З Уо або 2 95 (маса/маса). Кількість молочної кислоти та побічних продуктів може бути визначено із застосуванням відомих у цій галузі способів, наприклад, дериватизації та хроматографічного аналізу із застосуванням газово-рідкісної хроматографії (І С) або ВЕРХ-хроматографії (НРІ С).
Бажаною властивістю для промислового застосування виду Васіїйш5 є відсутність спороутворення. Відповідно до Директиви 2009/41/ЄС Європейського парламенту та Ради
Європи від б травня 2009 р. стосовно обмеженого застосування генетично модифікованих мікроорганізмів, випадки обмеженого застосування генетично модифікованих мікроорганізмів повинні бути класифікованими по відношенню до ризику, який вони можуть становити для здоров'я людини та навколишнього середовища. Отримання фенотипу Васіїйш5 з нестачею спороутворення може розглядатися, як засіб мінімізації ризику розповсюдження цих бактерій в навколишньому середовищі. Для отримання фенотипів з нестачею спороутворення відомо застосування різних способів, включаючи відбір похідних дикого типу з нестачею спороутворенням (Сгееп еї аїЇ., 2001, УУО01/49865) або безпосередню інактивацію шляху спороутворення, наприклад, шляхом інактивації білка зробА (Сопоу-Тгероці еї аї., 1992, 9. Мої.
ВіоІ. 244:967-979; АїКіпзоп еї аї., 2010, М/О2010/052499) або відЕ (Ріетіпу еї а!., 1995, Аррі.
Зо Епмігоп. Містобіо!. 61:3775-3780; УМапо еї аї!., 2005, У. Аррі. Місторіо!. 98:761-767; Комасз еї аї., 2010, Аррі. Епмігоп. Містобвіо!. 76:4085-4088).
Отже, у першому аспекті, винахід стосується створених з допомогою генної інженерії термофільних бактеріальних клітин, які є факультативними анаеробними мікроорганізмами та виробляють (5)-молочну кислоту, причому їх ген ендогенної метилгліоксаль-синтази тод5А або інактивовано або усунуто шляхом делеції.
Ендогенні гени є генами, які є присутніми у мікроорганізмі. Само собою зрозуміло, що бактерія, як тут описано, в якій цей ген було інактивовано або вилучено потребує спочатку присутності цього гена. Якщо в цій заявці не вказано іншого, то будь-яке посилання на ген означає ендогенний ген. Гени, які вводять в мікроорганізм не є ендогенними генами.
У іншому аспекті передбачено створену з допомогою генної інженерії бактеріальну клітину, яка є факультативним анаеробом мікроорганізмом та продуцентом, що є гомолактичним, (5)- молочної кислоти в енантіомерно чистій формі.
Гомолактичну ферментацію за винаходом визначено, як продукування молочної кислоти з вуглеводних джерел з утворенням побічних продуктів, як-то мурашиної кислоти, оцтової кислоти та етанолу, отримана кількість яких не більш, ніж 15 95 (маса/маса), переважно не більш, ніж 10 95 (маса/маса) та більш переважно не більш, ніж 5 95, 4 95, З У5 або 2 95 (маса/маса). Ця кількість стосується відношення загальної маси побічних продуктів до загальної маси молочної кислоти (включаючи (5)-молочну кислоту та можливість присутності будь-якої (К)-молочної кислоти). Кількість молочної кислоти та етанолу, оцтової кислоти та мурашиної кислоти може бути визначено із застосуванням відомих в цій галузі способів, наприклад, дериватизації та хроматографічного аналізу із застосуванням газово-рідкісної хроматографії (5І С) або ВЕРХ- хроматографії (НРІ С).
У деяких втіленнях отримана кількість принаймні одного побічного продукту, як-то мурашиної кислоти, етанолу та оцтової кислоти складає не більш, ніж 10 95 (маса/маса) від загальної маси мурашиної кислоти, етанолу або оцтової кислоти у порівнянні з загальною масою виробленої молочної кислоти, зокрема не більш, ніж б 95, 195, 0,25 95 або 01 95 (маса/маса). Іншими словами, кількість мурашиної кислоти, отриманої під час гомолактичної ферментації може складати, наприклад, не більш, ніж 10 95 (маса/маса) та переважніше не більш, ніж 6 95, 1 95, 0,25 90 або 0,1 95 (маса/маса) від загальної маси молочної кислоти. Так 60 само кількість етанолу може складати не більш, ніж 1095, бо, 195, 0,25595 або 0,1 95
(маса/маса), та кількість оцтової кислоти може складати не більш, ніж 10 95, б У, 1 95, 0,25 96 або 0,1 95 (маса/маса).
У цій заявці скороченням тдз5зА позначено ген метилгліоксаль-синтази, послідовність якого для Сеобрасійи5 (егтодіисозідап5 надано у 5ЕО ІЮ Мо 23. Кодуючу амінокислотну послідовність надано у 5ЕБЕО ІЮ Мо 24. Суміжні з то5А нуклеотидні ділянки може бути визначено із застосуванням ПЛР - праймерів 5ЕО 1 МоМо 11, 12, 15 та 16.
У іншому аспекті винахід стосується створеної з допомогою генної інженерії термофільної бактеріальної клітини, в якій, на додачу до гена тод5А також здатна на інактивації або делецію гена ендогенної піруват-формат ліази А та/або В.
У бажаному втіленні активність гена піруват-формат ліази усувають шляхом інактивації або делеції локусу піруват-формат ліази/алкоголь-дегідрогенази ріїВА-аднЕ. Як варіант, ген піруват- ліази А та/або ген В та гени алкоголь-дегідрогенази адпЕ може бути інактивовано або видалено в результаті окремих операцій. Нуклеотидні ділянки, які оточують рІВА-аапЕ може бути визначено із застосуванням ПЛР - праймерів ЗЕО 1Ю МоМо 19-21.
У цій заявці скороченням ріїВвА позначено гени піруват-формат ліази А та В, які кодують, відповідно, фермент активації піруват-формат ліази та піруват-формат ліазу. рІГА має відношення до гена піруват-формат ліази А (який кодує фермент активації піруват- формат ліази), послідовність якого для Сеобасіїйй5 (егтодіисозізап5 надано у 5ЕО ІЮО Мо 27.
Закодовану амінокислотну послідовність наведено у 5ЕО ІЮ Мо 28. ріїв має відношення до гена піруват-формат ліази В (який кодує піруват-формат ліазу), послідовність якого надано у 5ЕО ІЮ
Мо 25. Закодовану амінокислотну послідовність наведено у 5ЕО ІО Мо 26. Скороченням анЕ у винаході позначено ген алкоголь-дегідрогенази Е, який кодує біфункціональний комплекс ацетальдегід-СоА/алкоголь-дегідрогенази, послідовність якого для Сеобраснив
ІШептодіисозічапе надано у 5ЕО ІЮО Ме 29. Закодовану амінокислотну послідовність цього комплексу наведено у 5ЕО ІЮ Мо 30.
У іншому втіленні винаходу у клітині, яку було створено з допомогою генної інженерії також здатна на інактивацію або делецію гена ендогенної фосфотрансацетилази ген (ріа).
Нуклеотидну послідовність ріа для бЗеобрасійи5 (тептодіисо5ічап5 наведено у ЗЕО ІЮ Мо 31 та відповідну закодовану амінокислотну послідовність наведено у 5ЕО ІЮО Мо 32. Інактивація або
Зо делеція гена ріа (який кодує фосфотрансацетилазу) додатково мінімізує залишкове продукування ацетату, яке пов'язують з ендогенною активністю ріа. Отриманий штам (з інактивованим або видаленим геном ріа) є ауксотрофним для оцтової кислоти та, відповідно, у разі ферментації ця створена з допомогою генної інженерії клітина потребує додавання оцтової кислоти до ростового середовища.
У іншому втіленні винаходу шляхом інактивації або делеції гена ендогенного спороутворення додатково досягають нестачі спороутворення, створеної з допомогою генної інженерії клітини термофільних бактерій.
У іншому втіленні цим інактивованим або видаленим геном спороутворення є ген 5ідк. 5ідЕ має відношення до гена спороутворення, нуклеотидну послідовність якого для
Сеорасійи5 ІПептодіисозідап5е наведено у 5БО ІЮО Ме 33. Закодовану амінокислотну послідовність наведено у 5ЕО ІЮ Мо 34. Нуклеотидні ділянки, які оточують 5ідЕ може бути визначено із застосуванням ПЛР - праймерів 5ЕО ІЮ МоМо 3-6.
У іншому втіленні винаходу вироблена у клітинах за винаходом (5)-молочна кислота має принаймні 98 95, більш переважно принаймні 99 95, 99,5 95, 99,8 95 або 99,9 95 енантіомерної чистоти.
У іншому втіленні винаходу один або більше генів Ітод5А, рИїВА-адпЕ або 5ідЕ у зазначеній клітині інактивовано або вилучено шляхом гомологічної рекомбінації.
У іншому втіленні створена з допомогою генної інженерії клітина термофільних бактерій за винаходом є грам-позитивною бактеріальною клітиною, яка переважно належить до роду
Васійив5.
У іншому втіленні створена з допомогою генної інженерії клітина термофільних бактерій за винаходом є грам-позитивною бактеріальною клітиною, яка переважно належить до роду
Сеобасіїїи5.
У іншому втіленні створена з допомогою генної інженерії клітина термофільних бактерій за винаходом є сеобасійи5 (пегтодіисозідапв.
Однією метою винаходу є отримання штаму бактерій Сеобрасійй5, які є факультативними анаеробними мікроорганізмами та які виробляють (5)-молочну кислоту шляхом гомолактичної ферментації.
Хіральна чистота є важливим аспектом для продукування полімерів полімолочної кислоти. бо Отже, важливим є отримання енантіомерно чистої (5)-молочної кислоти для промислового застосування.
Отже, у одному аспекті, винахід стосується способу генетичної модифікації помірно термофільних бактерій виду Сеорасійй5, які є факультативними анаеробними та гомолактичними мікроорганізмами із застосуванням генної інженерії.
У іншому аспекті винахід стосується способу отримання енантіомерно чистої молочної кислоти, який полягає у застосуванні операцій культивування клітин термофільних бактерій за винаходом із застосуванням прийнятної здатної до ферментації карбоновмісного підживлення та у виділенні (5)-молочної кислоти.
У одному аспекті винахід стосується способу отримання енантіомерно чистої молочної кислоти, причому карбоновмісне підживлення також містить ксилозу, глюкозу або цукрозу.
Температура культивування переважно підтримують в межах 50"- 70"С, більш переважно в межах 55-6576.
В контексті винаходу, інактивація або делеція гена може бути модифікацією (зміненням) гена, який кодує потрібний для продукування клітиною поліпептид та/або ген, який кодує поліпептид, залучений до продукування клітиною первинного або вторинного метаболіту. В принципі це може бути здійснено шляхом зниження клітинних рівнів білка, який є продуктом цього гена. Зниження клітинних рівнів може бути ефективно досягнуто, наприклад, шляхом цільової інактивації гена, який кодує інтересуючий фермент. Також цей ген може бути повністю видалено. Крім того, як варіант, вилучення (делеція) частини цього гена може призвести до зниження активності закодованого в ньому білка. Додатково або як варіант, може бути модифіковано або вилучено нуклеотидні послідовності, які відповідають за регуляцію або експресію генів, як-то промотори, енгансери, ділянки ініціації трансляції тощо. Іншим способом впливу на активність інтересуючого білка може бути, якщо це потрібно, модифікація транспортних сигналів або введення антисенсової РНК.
Також бажаними є хромосомальні модифікації, оскільки ці модифікації будуть забезпечувати стійку передачу функціональних можливостей гена клітинам-нащадкам. Вилучення бажаної функціональності з хромосоми може бути здійснено з допомогою як негомологічної, так і гомологичной рекомбінації, хоча гомологічна рекомбінація є більш бажаною, оскільки вона відкриває можливість вводити, усувати або одночасно вводити та усувати різні функціональні
Зо властивості.
У разі можливого застосування гомологічної рекомбінації, піддана трансформації ДНК додатково містить послідовність ДНК, яка є гомологічною цільовій послідовності генома певної призначеної для перебудування клітини. Фахівцеві зрозуміло, що для досягнення гомологічної рекомбінації не потрібно 100 95 тотожності та цей відсоток тотожності буде також складати 80 95, переважно 9095, більш переважно 9595, 9895 або 9995. Звичайно інтересуюча послідовність ДНК, яку потрібно вставити у хромосому шляхом гомологічної рекомбінації є оточеною з боків гомологічними послідовностями, що мають довжину, достатню для можливості здійснення гомологічної рекомбінації. Така довжина може складати принаймні приблизно 200 пар основ, наприклад, 200-1500 пар основ, переважно 500-1000 пар основ.
Для цілей цього винаходу рівнем тотожності між двома амінокислотними послідовностями вважають відсоткову частку тотожних амінокислот між цими двома послідовностями. Цей рівень тотожності визначають із застосуванням алгоритму ВІА5Т, описаного у Ай5зоапйиї, еї аї., У. Мо).
Віої. 215: 403-410 (1990). Програмне забезпечення для здійснення аналізу ВІА5Т є загальнодоступним та його можна отримати у Національному центрі біотехнологічної інформації США (пЕр:/Лимли.пеобрі.піт.пій.дом/). Налаштування за замовчуванням для параметрів алгоритму ВГА5БТ є наступними: очікуване граничне значення - 10, довжина сегмента - 3, максимальна кількість співпадінь в межах запитання - 0, матрицею є ВІ ОБИОМб2, вартість наявності проміжків - 11 та розширення - 1, наявність композиційних коригувань при умовному коригуванню композиційної матриці внесків.
Для цілей цього винаходу рівнем тотожності між двома нуклеотидними послідовностями вважають відсоткову частку тотожних нуклеотидів між цими двома послідовностями. Цей рівень тотожності визначають із застосуванням алгоритму ВІ А5Т, описаного у АйбсПпиЇї, еї аї., у. Мої.
Віої. 215: 403-410 (1990). Програмне забезпечення для здійснення аналізу ВІА5Т є загальнодоступним та його можна отримати у Національному центрі біотехнологічної інформації США (пЕр:/Лумли.пеобрі.піт.пій.дом/). Налаштування за замовчуванням для параметрів алгоритму ВГА5БТ є наступними: очікуване граничне значення - 10, довжина сегмента - 28, максимальна кількість співпадінь в межах запитання - 0, показники співпадінь/неспівпадінь складають 1, -2, вартість проміжку обчислюють із застосуванням лінійної функції.
Як вже було згадано вище, жодна з послідовностей, яка визначає вищезазначені гени бо Сеобасіїи5 (егтодіисозідап5 не потребує 100 95 тотожності для модифікації бажаного гена генно-інженерним шляхом. Крім того, послідовність генів, які знаходяться у клітинах споріднених термофільних бактерій інших видів можуть відрізнятися від цих послідовностей.
Однак у разі застосування гена Сеорасійи5 (Ппептодіисозідап5, гомологічні цим генам послідовності та послідовності, які мають таку ж саме функціональність може легко бути визначено фахівцями в цій галузі та може бути отримано відповідні праймери для здійснення гомологічної рекомбінації в цих штамах. Отже, навіть у разі існування відхилень у послідовностях вищезазначених генів у певних штамах, гомологічні гени може легко бути визначено. Нуклеотидні послідовності цих генів може бути визначено із застосування відомих в цій галузі технологій та у разі потреби може бути визначено новий набір праймерів, які будуть тотожними або комплементарними послідовностям, які оточують ген з боків.
Клітини за винаходом може бути отримано із застосуванням відомих в цій галузі технологій.
Окремі способи введення ДНК у клітини термофільних бактерій шляхом електропорації описано у Мап Кгапеприго еї а!., 2007, УМО2007/085433 та Стгіррзо еї а. 2009, Мегаб. Епод. 11:398-408.
Трансформацію цих бактерій виду ВасіШйи5 шляхом електропорації може бути здійснено за рахунок розряду високої напруги через суспензію, яка містить помірно термофільний вид
Васійй5, які є факультативними анаеробними та гомолактичними мікроорганізмами, а також містить прийнятну для такої трансформації ДНК з бажаною функціональністю та/або послідовності ДНК, гомологічні геномним послідовностям певного виду ВасіїЇ. (55-молочну кислоту може бути отримано в результаті ферментації клітин термофільних бактерій, яких було отримано, як тут описано, з допомогою генної інженерії та у присутності джерела вуглеводів (наприклад, глюкози та/або ксилози) із застосуванням відомих у цій галузі способів. Протягом ферментації молочна кислота, яку виділяють мікроорганізми здебільшого нейтралізується з допомогою основ, наприклад, основних солей лужних або лужноземельних металів, як-то гідроксидів, карбонатів та/(або гідрокарбонатів натрію, калію, магнію, та/або кальцію. Особливо бажаним є застосування магнієвих основ, наприклад, гідроксиду магнію, карбонату магнію та/або гідрокарбонат магнію. Відповідно, певні аспекти цього винаходу особливо стосується способу отримання енантіомерно чистої (5)-молочної кислоти, який полягає у культивуванні клітин термофільних бактерій, як тут описано, в присутності магнієвої основи (наприклад, вибраної з принаймні однієї наступної основи, як-то гідроксид магнію,
Зо карбонат магнію та гідрокарбонат магнію) із застосуванням прийнятного та здатного до ферментації середовища, яке містить карбон та у виділенні (5)-молочної кислоти.
Після ферментації (5)-молочну кислоту (або її сіль) відокремлюють від ферментаційного середовища із застосуванням будь-якого з багатьох загальноприйнятних способів відокремлення молочної кислоти та/або лактату з водних розчинів. Частинки субстрату або мікроорганізми (біомаса) може бути усунуто перед цим відокремленням для покращення його ефективності. Це відокремлення може бути здійснено шляхом центрифугування, фільтрації, флокуляції, флотації або мембранної флотації. Таким відокремленням, наприклад, є описаний у
УМО 01/38283 безперервний процес отримання молочної кислоти шляхом ферментації. В той час, як обговорення ферментації в даному описі, як правило, стосується періодичного процесу, його складові частини або весь процес в цілому може бути здійснено безперервно.
Після відокремлення (5)-молочної кислоти (або її солі) з ферментаційного середовища, отриманий продукт може бути піддано однієї або кількома операціям очищення, як-то екстракції, дистиляції, кристалізації, електродіалізу, фільтрації, обробці з активованим вугіллям, іоннообмінній хроматографії тощо. Різні залишкові потоки може бути (вибірково після відповідної переробки) повторно застосовано у ферментері або у будь-якій попередній операції очищення.
Приклади.
Матеріали та способи.
Штами та плазміди.
Застосовані в цих дослідженнях штами та плазміди перелічено у Таблиці 1,
Штами Езспегіспіа соїї культивували за стандартною методикою у середовищі І В (ЗатьгоокК а ВиззеїЇ, 2001, МоїІесшіаг Сіопіпод, а Іабогаїогу тапиа! ("Лабораторний посібник з молекулярного клонування"). 3 веайіоп. Соїд ріпу Натог І арогаюгу Ргез5, Мем Хоїк) при температурі 37 "С в аеробних умовах. При необхідності було застосовано хлорамфенікол та/або аампіцилін з концентраціями, відповідно, 20 мг/ л та 100 мг/ л.
Якщо не зазначено іншого, то штами б. ІПегтодіисозічап5 підрощували за стандартною методикою у середовищі ТОР при температурі 52 "С, 55С або 60 "С в аеробних умовах.
Середовище ТОР'/(Тамуї! або еї аї., 2008, Ріазтіа 60:45-52) містило 17 г/ л триптону, З г/ л соєвого пептону, 5 г/ л Масі та 2,5 г/ л К"НРО» з рН 7,0, та після обробки в автоклаві до нього ще було бо додано 4 мл/л гліцерину та 4 г/ л Ма-пірувату. Для чашок з середовищем ТОР було застосовано
10 г/ л агару. У разі необхідності до цього середовища також додавали хлорамфенікол (8 мкг/мл).
Таблиця 1
Застосовані в цих дослідженнях штами та плазміди. штами 11111111
Сюоплоу-Тгероці, б., Кагтлуп-
Е. соїї ТС90 безплазмідний штам Сатреїі, С., 5ігадієг, Р., 1992, 9. Мої. Віої. 224:967-97 а. Тептодіисовідапе штам 0. Шептодіисозідап5, позбавлений б
ОМ 2542 Ллв5іде спороутворення ця росота
ЕТ ня 7 спороутворення, який виробляє хірально) ця робота
А5БідЕ, Дта5А чисту (5)-молочну кислоту в. Іегтодійсовідапе штам 5. Шегтодійсозідапв, позбавлений двідЕ, лтазА, ЛрВА- спороутворення, який виробляє хірально ця робота лаане чисту та гомолактичну (5)-молочн кислоту блазміди.д 17711111
В - те 0 дол . ця робота рАмМ3 розташованими в різних напрямках ділянками 0. Іпегтодійсозідапзь 5ідЕ 6,4 кб, Ст", похідна плазміди РМУМЗЗп з рі5а43 розташованими в різних напрямках ця робота ділянками 0. Іпептодіисозідап5 тоа5А 6,4 кб, Сте, похідна плазміди РМУУЗЗп з розташованими в різних напрямках рим ділянками (3. (Шептодіисозідап5 ріївВА- ця робота локус аанЕе
Способи ДНК-маніпулювання.
У цих дослідженнях було застосовано стандартні способи ДНК-маніпулювання, описані в книзі ЗатьгооК апа КизхзеїЇ (Затргоок 5 КиззеїЇ, 2001, МоїІесшаг Сіопіпд, а іабогаюгу тапиаї! ("Лабораторний посібник з молекулярного клонування"). 33 еййіоп. Соїд Єрііпду Нагог І арогайюгу
Ргез5, Мем/ МОїК).
Конструювання похідних плазміди РМУУЗЗМ було здійснено у Е. соїї.
Виділення ДНК плазміди Е. соїї у великому обсязі зі 100 мл культури було здійснено із застосуванням набору Чеїсіаг 2,0 Ріахтій Махіргер Киф (Сепотеа) згідно з інструкціями від виробника. Виділення ДНК плазміди Е. соїї у малому обсязі з 1 мл культури було здійснено із застосуванням набору Мисіеозріп Ріаєтій ОиціЇскК Риге Ф (Маспегеу-Мадеї) згідно з інструкціями від виробника.
Компетентні клітини Е. соїї було отримано із застосуванням хлориду кальцію та здійснено трансформацію тепловим шоком, як описано в книзі затбьгоокК апа Киззеї! (Затюогоок 48. Киззеї, 2001, МоїІесшіаг Сіопіпуд, а Іабогаїогу тапциа! ("Лабораторний посібник з молекулярного клонування"). З'Я еайіоп. Соїа Єргіпуд Нагбог І абогаїогу Ргев5, Мем/ МогкК).
Реакції ПЛР для цілей клонування здійснювали з допомогою високоякісної полімерази Ру/о (Коспе) згідно з інструкціями від виробника.
Для ПЛР-аналізу колоній ці колонії зібрали зубочисткою та маленьку частину клітинного матеріалу було перенесено в пробірку для ПЛР-реакції. Ці клітини було піддано руйнуванню із застосуванням 1 - хвилинного інкубування в мікрохвильовій пічці (1000 Вт). Суміші для ПЛР- реакції об'ємом 50 або 25 мкл з полімеразою гТад (Атегепат Віозсіепсе5) було отримано згідно з рекомендаціями від виробника та додано до реакційних пробірок зі зруйнованими клітинами.
Електропорація 6. (пегтодійсозідапь
Трансформацію с. (ептодіисозідап5 було здійснено шляхом електропорації на основі протоколу, наведеного у роботі Стірр5 еї аї. (Стірр5, єї аіІ., 2009, Меїар. Епд. 11:398-408). С.
ІШептодіисозідап5 підрощували протягом ночі при температурі 55 "С та 1 мл отриманої культури було застосовано для інокуляції 50 мл попередньо нагрітого середовища ТОР у а 250 мл конічній колбі з перегородками. Клітини інкубували при температурі 60 С (180 об/хв) до досягнення оптичної густини ОЮвоо «1,0, після чого колбу охолодили 10 хв. на льоду та клітини зібрали шляхом центрифугування (4 "С). Далі клітини чотири рази промили крижаним буфером для електропорації (0,5 М сорбіт, 0,5 М маніт, 10 95 (в об'ємному відношенні) гліцерин) із застосуванням, відповідно, 50 мл, 25 мл, 10 мл та 10 мл цього буферу. Отриманий кінцевий осад потім ресуспендували в 1,3 мл крижаного буферу для електропорації та аліквоти (60 мкл) електрокомпетентних клітин або зберігали при температурі -807С або безпосередньо застосували для електропорації.
Для електропорації розморожену аліквоту (60 мкл електрокомпетентних клітин змішали з 1-2 мкг плазмідної ДНК та потім перенесли до охолодженої кювети для електропорації з шириною щілини 0,1 см. У разі застосування системи електропорації Сепе Риїзег (Віо-Кай) показники цього процесу складали 2,5 кВ, 10 мкФ та 600 Ом. Після електропорації клітини перенесли у пластикову пробірку (50 мл) з 1 мл попередньо нагрітого (527"С) середовища ТОР та відновлювали протягом двох год. при температурі 52 "С та 180 об/хв. Суспензію відновлених клітин піддали осаджуванню та вилучили майже 150 мкл супернатанту. Отриманий осад піддали повторному суспендуванню в позосталому супернатанті. Кількості об'ємом 1/10 та 9/10 нанесли на чашки з середовищем ТОР, яке містило 8 мкг / л. хлорамфеніколу та отримані чашки інкубували при температурі 52"С протягом 24-48 год. Колонії, які з'явилися на чашках перенесли на чашку зі свіжим середовищем ТОР, яке містило 8 мкг / л хлорамфеніколу та інкубували ніч при температурі 55 "С. Колонії, в яких було відмічено ріст перевірили на наявність плазміди шляхом ПЛР для відбору колоній з допомогою праймерів 1 та 2 (Таблиця 2).
Інтеграція.
Як вектор для інтеграції у С. ШТептоаійсозідапе було застосовано човниковий вектор
Сеобасіїїи5-Е.соїї або плазміду РМУУЗЗп, як було попередньо описано (Стіррз еї аї!., 2009 Меїар.
Зо Епа. 11:398-408). Трансформованими штамами з гліцеринового базового розчину було інокульовано 20 мл середовища ТОР з 8 мкг/мл хлорамфеніколу. Після підрощування протягом ночі при температурі 55 "С та 180 об/хв на чашки з середовищем ТОР, яке містило 8 мкг/мл хлорамфеніколу було нанесено відповідні розведення отриманих клітин та чашки було піддано інкубуванню протягом доби при температурі 68 "С Одиничні колонії потім перенесли на чашку зі свіжим середовищем (інкубованим при температурі 52 "С) та для визначення колоній з випадками одиничного кросинговеру було здійснено реакцію ПЛР для відбору колоній. Для визначення випадків одиничного кросинговеру у фрагментах, розташованих в різних напрямках було застосовано відповідні комбінації праймерів (Таблиця 2; відповідно, комбінації праймерів 655-170 та 656-571 для інтеграції рЕМ3; комбінації праймерів 754-170 та 991-571 для інтеграції руза3; та комбінації праймерів 744-170 та 808-571 для інтеграції РКМ12). Потім з допомогою набору Мазіегриге Сгат Розййіме ОМА Ритгіїйсайоп Кії (Ерісепіге ВіосїесппоЇодіе5) було виділено хромосомну ДНК з позитивних колоній та для підтвердження результатів ПЛР для відбору колоній описану вище реакцію ПЛР повторили ще раз із застосуванням виділеної хромосомної
ДНК. Для наступної операції рекомбінації було вибрано одиничний кросинговер у прилеглій ділянці у 5' - 3 напрямку та одиничний кросинговер у прилеглій ділянці у 3" - 5" напрямку.
Для отримання подвійного кросинговеру, первинні інтегранти піддали кількаразовому пересіванню із застосуванням середовища ТОР без хлорамфеніколу з нанесенням відповідних розведень (107, 105, 106) на чашки з ТОР. Виділені колонії потім перенесли на чашки з середовищем ТОР з додаванням та без додавання 8 мкг/мл хлорамфеніколу. Мутанти з подвійним кросинговером були чутливими до хлорамфеніколу. Для усунення мутантів дикого типу від мутантів з делецією та для перевірки відсутності плазміди, під час ПЛР-аналізу було застосовано відповідні комбінації праймерів (Таблиця 2; комбінації праймерів 655-656 для
АвідЕ, 754-991 для Дтд5А та 744-808 для АріИІВА-ЛадпЕ) Наявність всіх модифікацій було підтверджено шляхом сиквенсу продуктів ПЛР.
Таблиця 2
Застосовані праймери
ЗЕО Праймер Послідовність (5-3)
ІО Мо ІО Мо 1 1 тсасстстстТатаТсСАТОС 2 2 стааАдапАпАаСААТИаАААС
З 651 ссасбсаатАСССАаСАААССаАаСацпААТСАС
А 652 ссассатосАСса,асАтТаваТАпасСАТОСАТТС 653 ссассатТсвАСаТатсТоСсСстТТАатТТАСАТААСаС б 654 ссасаАдХдастастСасСАаТсСсСААТСИСТОСаС 7 655 асСтТААпАТССасССАТАСИТТАдаС 8 656 садаАассАХастасвссаТосСта 9 170 ссостсаАдаАа,асастассттасадАа 571 астоаттТАТтАаатТосАТССВСаТТо 11 750 ссассавАтосеасттоса,атттассСАТТТаСсСс 12 753 ссасаст,асада,аааСААаАСТаАСАсаАдсвАасттас 13 754 сАдасСсАатТААСааСАТОССОАТТО 14 991 аСасАТАТаАТТаААТтТатаАСтТасс 999 тТАТОССсАСОСООаСсаеСсстасАсаААТАТТИСТОСИС 16 1000 АТССТоСАСсаССасосСатСасСАТАСАСТТСАТИаТТОа 17 739 ссабсацпАТоССССАААтТааСАТТАССИаТата 18 805 татАТТ,астааСАаТТоСсСТоССАТОаСАТСТОа 19 806 садаспсаАААСТассСАасСААТААСАССААСА,асто 807 ссасаст,асдасСспААдасСпААСпАААТТасСссСААС 21 744 ВССААдСАТасАТАТОСЯСИаТТАсС 22 808 сса,апАпАтТапАСапААТТаААС
Ферментація.
Середовище ТММ було модифіковано за Еопод еї аї. (Ропа еї аї!., 2006) та містило (на 1 л.): 5 60 г/ л глюкози; 30 г/ л ксилози; 8,37 г МОР5, 0,23 г КаНРО»4; 0,51 г МНАСІ; 0,50 г масі; 1,47 г
Ма»5О»; 0,08 г МансСО»; 0,25 г КСІ; 1,87 г МоСІ»"бНго; 0,41 г Сасі»"2Него; 16,0 мг МпсСІг4НгО; 1,0 мг 2п5027НгО; 2,0 мг НзВО»; 0,1 мг Си5О2"5ІНгО; 0,1 мг Ма"МоО2 "2 Нео; 1,0 мг СосіІ»"бНгО; 7,0 мг БебО4"7НгО; 0,1 мг тіаміну; 0,1 мг рибофлавіну; 0,5 мг нікотинової кислоти; 0,1 мг пантотенової кислоти; 0,5 мг піридоксаміну-НСЇІ; 0,5 мг піридоксалю-НСЇ; 0,1 мг О-біотину; 0,1 мг 10 фолієвої кислоти; 0,1 мг р-амінобензойної кислоти; 0,1 мг кобаломіну. рН середовища було доведено до 7,2. Глюкозу, ксилозу, сполуки металів та вітамінів було стерилізовано фільтрацією та середовище було стерилізовано в автоклаві. До середовища ТММІ, ТММ2,5 та
ТММ5 було відповідно додано 1 г/л, 2,5 г/л, та 5 г/ л дріжджового екстракту (Охоїд).
Середовище ЗТММ відрізнялося від середовища ТММ концентраціями КаНРО»х (1,00 г/л), 15 МНАСІ (2,50 г/л), Масі (5,00 г/л), та СасіІ»2НгО (50 мг/ л) та до нього було додано 0, І -метіонін (68,5 мг/ л) та бетаїн (0,14 г/л). 100 мл прекультури у ТММ5 або 5ТММ5 було застосовано для інокуляції (10 95 в об'ємному відношенні) 400 мл середовища ТММІ або ТММ2,5 або, відповідно, ЗТММ2.5 або 5ТММ5 у 0,75 л ферментері Мийог5 (Іптог5), який було обладнано конденсатором (охолодженим проточною 20 водопровідною водою при температурі приблизно 15 "С). Контроль рН на позначці 7,2 було здійснено шляхом додавання стерильного 2,5 М КОН, стерильного Ма(ОН)» (75г/ л) або стерильного Са(ОН)»: (75г/ л)у. Температура ферментації складала 60 "С. Швидкість обертів мішалки складала 300 об/хв.
Під час ферментації було здійснено відбір зразків для вимірювання (В)- та (5)-молочної кислоти та можливих побічних продуктів. Ці зразки піддали центрифугуванню та позосталий дебрис було вилучено шляхом фільтрації із застосуванням 0,22 мкм фільтру МіШех СР (Мійїроге). Фільтрат зберігали при температурі -212С до додаткового аналізу.
Вимірювання цукрів було здійснено з допомогою ВЕРХ-хроматографії із застосуванням колонки Тпегто СагроРас 5А-10 (Пбіопех). Органічні кислоти (молочну кислоту, оцтову кислоту, мурашину кислоту, бурштинову кислоту, фумарову кислоту, пировиноградну кислоту) та етанол вимірювали із застосуванням дериватизації та газово-рідкісної хроматографії (І С). (В)- та (5)- лактати було метиловано до метил-лактату та виміряно шляхом парофазного аналізу на хіральній колонці.
Приклад 1.
Продукування енантіомерно чистої молочної кислоти бактеріями Сх. ТПнептоадіисозідапв.
Для делеції гена 5ідЕ у б. Тепподіисозідап5 було побудовано інтеграційну плазміду РЕМ3.
Ділянки, які оточують ген 5ідЕ у 5'- 3' та 3 - 5 напрямках було отримано з допомогою ПЛР із застосуванням геномної ДНК ОМ 2542, як матриці та комбінації праймерів 653 та 654 (Таблиця 2) з отриманням 3 - 5 фрагменту та праймерів 651 та 652 (Таблиця 2) з отриманням 5' - 3 фрагменту. Спочатку було клоновано 5' - 3' фрагмент, як фрагмент Крпі-зЗаї! у плазміді РМУУЗЗп, яку було розщеплено тими ж саме ферментами. Потім було клоновано 3 - 5' фрагмент, як фрагмент заїІ-Ніпаці в цій конструкції, яку було розщеплено тими ж саме ферментами, які призвели до появи плазміди РЕМ3. Конструювання плазміди РКМ3 було здійснено в штамі Е. соїї ТО90. Цілісність послідовності рРЕМ3З було підтверджено з допомогою сиквенсу ДНК.
Плазміду рЕМ3 було введено у клітини (с. Шептодіисозідапе О5М 2542 шляхом електропорації. Одиничну колонію трансформантів було вибрано та застосовано для отримання мутантів з одиничним кросинговером, як описано в розділі "Матеріали та способи". Дві колонії було вибрано для подальших досліджень та одна з них містила одиничний кросинговер у 3 - 5' суміжній ділянці, а друга містила одиничний кросинговер у 5' - 3' суміжній ділянці.
Мутант з подвійним кросинговером було отримано відповідно за процедурою, описаною в розділі "Матеріали та способи". 60 колоній, отриманих після субкультивування інтегрантів з одиничним кросинговером у середовищі ТОР без хлорамфеніколу, перенесли до чашок з ТОР з додаванням та без додавання хлорамфеніколу. 50 колоній були чутливими до хлорамфеніколу. 12 колоній мали бажану модифікацію та З колонії повернулися до дикого типу. Одну колонію було вибрано та ці бактерії отримали назву С. Шептодіисозідап5 ОМ 2542 Авідг. Наявність делеції було підтверджено з допомогою сиквенсу.
Таблиця З
Результати ферментацій із застосуванням бактерій б. Іегтодійсозідап5 О5М 2542 А5іде та суміші глюкози / ксилози.
Загальна молочна Хіральна чистота
Час (год) Глюкоза (г/л) Ксилоза (г/л) кислота (г/кг) (б) молочної кислоти
Було здійснено оцінку ефективності бактерій с. (тегтодіисозідапе ЮОЗМ 2542 Ав5ідЕ у рн- контрольованій (КОН) ферментації із застосуванням середовищ ТММ! та ТММ2,5 та результати аналізу ферментацій підсумовано у Таблиці 3. Виявлено, що бактерії а.
Зо Шептодіисозідапе ОМ 2542 АвідЕ одночасно споживали ксилозу та глюкозу. Хіральна чистота отриманої (5)-молочної кислоти була значно нижчою, ніж зазначена у технічних умовах хіральна чистота молочної кислоти.
Плазміду р.)543 було побудовано для видалення 267 пар основ гена Іто5А (423 пар основ) у а. ІШептодіисовідап5. 3 - 5'та 5' - 3' ділянки, які були суміжними з геном тод5зА було отримано з допомогою ПЛР із застосуванням геномної ДНК О5М 2542, як матриці та комбінації праймерів 750 та 999 для отримання 5' - 3' фрагмента то5А та праймерів 1000 та 753 для отримання 3 - 5 фрагмента то5А. Потім отримані два ПЛР - продукти було застосовано, як матрицю для ПЛР- реакції з перекриваючимися праймерами із застосуванням комбінації праймерів 750 та 753 для їх спільного злиття. Отриманий продукт було клоновано у вигляді фрагмента ВатнНі-Реї у плазміді РМУУЗЗп, яку було розрізано рестриктазами Ватні та Рец з отриманням плазміди руУз43. Конструювання плазміди руУб543 було здійснено в штамі Е. соїї ТО90. Цілісність нуклеотидної послідовності р.)543 було підтверджено з допомогою сиквенсу.
Плазміду р.)543 було введено у клітини (1. Шептодіисовзічапе ЮОЗМ 2542 АвідЕ шляхом електропорації. Одиничну колонію трансформантів було вибрано та застосовано для отримання мутантів з одиничним кросинговером, як описано в розділі "Матеріали та способи". Один інтегрант з одиничним кросинговером було вибрано для подальших досліджень.
Мутант з подвійним кросинговером було отримано відповідно за процедурою, описаною в розділі "Матеріали та способи". 60 колоній, отриманих після субкультивування інтегрантів з одиничним кросинговером у середовищі ТОР без хлорамфеніколу, перенесли до чашок з ТОР з додаванням та без додавання хлорамфеніколу. Всі колонії були чутливими до хлорамфеніколу.
Було здійснено аналіз 25 колоній та виявлено, що 4 колонії мали бажану модифікацію, а 21 колонія повернулася до дикого типу. Одну колонію було вибрано та ці бактерії отримали назву б. ІШептодіисозідапе О5М 2542 Д5ідЕ, Дто5А. Наявність делеції було підтверджено з допомогою сиквенсу.
Оцінку бактерій б. (ептподіисозізап5 ОЗМ 2542 АвідЕ, ДтозА було здійснено з допомогою ферментації з контрольованим показником рН (Мо(ОН)г) із застосуванням середовища
ЗТММ2.5. Результати аналізу ферментації підсумовано в Таблиці 4. Було виявлено, що бактерії
С. Шептодіисозідапе ОМ 2542 ДвідЕ, АДтдб5А одночасно споживали ксилозу та глюкозу.
Хіральна чистота отриманої (5)-молочної кислоти складала 99,6 95, що вважається показником хірально чистої сполуки. Отримані дані ясно вказують на те, що незважаючи на очевидну неповноту метилгліоксалевого шляху у бактерій с. Тепптодійсозідап5, інактивація гена тд5зА призводить до здатності виробляти хірально чисту (5)-молочну кислоту.
Таблиця 4
Результати ферментації із застосуванням бактерій 0. Іпепподійсозідап5 О5М 2542 Д5ідЕ, Дто5А у середовищі ЗТММ2.5.
Загальна Хіральна чистота Оцтова | Мурашина
Глюкоза Ксилоза молочна Етанол (г/
Час (год.) (5)- кислота (Гг/ | кислота (г/ (г/кг) (г/кг) кислота Кг) (г/кг) молочна Кг) Кг) кислота (95) 24 | 116 | 604 | 49 | 996 | 07 | 29 | 26
Приклад 2.
Продукування енантіомерно чистої молочної кислоти бактеріями Сх. ТПнептоадіисозідапв.
Слід зазначити, що бактерії с. (фегптодіисозіздапе ЮОЗМ 2542 АвідЕ, Атод5зА продовжували виробляти значні кількості мурашиної кислоти та етанолу разом з продукуванням незначної кількості побічного продукту, тобто оцтової кислоти (Таблиця 4). Хоча відомо, що у багатьох бактерій мутації генів рІА та/або ріІВ та аанЕ впливають на продукування мурашиної кислоти та етанолу, побічні дії інактивації цих генів є непередбачуваними.
Плазміду рРКМ12 було побудовано для делеції генів рів, рпПА та адпЕ (частково) у бактерій б. (Шептодіисозідап5. З'- 5' ділянку, яка є суміжною з геном ріїВА та 3 - 5' ділянку, яка є суміжною з конвергентно орієнтованим геном адпЕ було отримано з допомогою ПЛР із застосуванням геномної ДНК ЮО5М 2542, як матриці та комбінації праймерів 739 та 805 для отримання 3 - 5' фрагмента ріїВА та праймерів 806 та 807 для отримання 3 - 5' фрагмента аанЕ. Потім два отримані ПЛР - продукти було застосовано, як матрицю для ПЛР-реакції з перекриваючимися праймерами із застосуванням комбінації праймерів 739 та 807 для їх
Зо спільного злиття. Отриманий продукт було клоновано у вигляді фрагмента ВатнНі-Ренц у плазміді РММУЗЗп, яку було розрізано рестриктазами Ватні та Ре з отриманням плазміди рКЕМ12. Конструювання плазміди рКЖМ12 було здійснено в штамі Е. соїї ОНба. Цілісність нуклеотидної послідовності РЕМ12 було підтверджено з допомогою сиквенсу.
Плазміду рРЕКМ12 було введено у клітини Сї. Шептодіисозідапе О5М 2542 А5ідЕ, ДтозА шляхом електропорації. Було вибрано одиничну колонію трансформантів, яку потім було застосовано для отримання мутантів з одиничним кросинговером, як описано в розділі "Матеріали та способи". Дві колонії було вибрано для подальших досліджень, в одній з яких було виявлено одиничний кросинговер у 3 - 5' ділянці, суміжній з геном ріїВА та в другій було виявлено одиничний кросинговер у 3 - 5 ділянці, суміжній з геном аднЕ.
Мутант з подвійним кросинговером було отримано відповідно за процедурою, описаною в розділі "Матеріали та способи". 120 колоній, отриманих після субкультивування інтегрантів з одиничним кросинговером у середовищі ТОР без хлорамфеніколу, перенесли до чашок з ТОР з додаванням та без додавання хлорамфеніколу. Дві колонії були чутливими до хлорамфеніколу, одна з яких мала бажану модифікацію, а друга повернулася до дикого типу. Бактерії з зазначеної першої колонії отримали назву с. Ійегтодіисозічзапе О5БМ 2542 Д5ідЕ, ДтозА,
АрИВА-даадпЕ. Наявність делеції було підтверджено з допомогою сиквенсу.
Таблиця 5
Результати ферментації із застосуванням бактерій 0. Тептподійсозічап5 О5М 2542 АДв5ідкг,
ДтозА, Ар'їВА-дайднЕ у середовищі ТММ5.
Загальна | Хіральна о
Глюкоза Ксилоза молочна чистота цтова | Мурашина Етанол!
Час (год.) кислота кислота (г/кг) (г/кг) кислота (|(5)-молочна (г/кг) (г/кг) (г/кг) (г/кг) кислота (95) 01 494 | 226 | 45 па" | «01 | 08 | 03 24 1 302 | 160 | 240 | 998 | 01 | 08 | бе 1 Відбір зразків здійснено після інокуляції. 2 п.а. - не визначено: концентрація молочної кислоти є дуже низькою для визначення хіральної чистоти.
Оцінку бактерій ЮО5М 2542 Д5ідЕ, Дто5А, ДріВвА-ДдаапЕ було здійснено з допомогою ферментації з контрольованим показником рН (Са(ОнН)г) із застосуванням середовища 5ТММ, яке містило 5,0 г/л дріжджового екстракту, 60 г/л глюкози та 30 г/л ксилози. Результати аналізу ферментації (в трьох точках часу) підсумовано в Таблиці 5. Було виявлено, що бактерії а.
ІШептодіисозічапе ОМ 2542 А5ідЕ, Ато5зА, АДрИПВА-даапЕ одночасно споживали ксилозу та глюкозу. Хіральна чистота отриманої з цих бактерій (5)-молочної кислоти складала 99,7 95 або вище. Продукування етанолу виявлено не було. Отримані дані ясно вказують на те, що інактивація генів комплексу піруват-формат ліази та алкоголь-дегідрогенази значно зменшує продукування бактеріями етанолу, мурашиної кислот та оцтової кислоти та призводить до ферментації з продукуванням гомолактичної та хірально чистої (5)-молочної кислоти.
Перелік послідовностей «110» ПУРАК БІОКЕМ БА І «1205 Генетична модифікація термофільних бактерій, які виробляють (5)-молочну кислоту «1305 22805 «150» ЕР 14178150,0 «512 2014-07-23 «1505 34 «1702 Райелін мегвіюп 3.5 «10 «й112 70 «122 ДНК «2132 штучна послідовність «Вр «гр» смитетичний праймер «о» 1 ісасенсн сощсаіс 20 «1052 «112520 ках ДНК кй13» штучна послідовність «ред» «223» сивтатичний праймер кад савосада дсавіюдааас 20 «10 «211234 «Р125 ДНК «13» штучна послідовність «ред «РеЗ» синтетичний праймер
«Адм З дсасдаціас ссаусазасо дадсодаас ву 32 «21024 «11231 ки12» ДНК «2135 штучна послідовність «дод» «везе синтетичний праймер «Ох 4 усосодісаз содаюджна досвіссай с З «о Ні 5 «ех З «Та». ДНК «13» штучна поспідовність «2» «223» синтетичний праймер «00» 5 асосадієча саісісссі аойасагва сус 33 1056. «112 3 «212» ДНК каТ32 цітучна послідовність и «дад» синтетичний праймер 0056 асосовадсі юсисосад єссавіссціс де За «07 «115 24 «125 ДНК «13» штучна послідовність «род»
«ад» синтетичний праймер зевазасу десазвсозй задо 24 «10 8 «8112591 «212» ДАК ки З» штучна послідовність «Рей» «ве синтетичний праймер «во 8 озадасчавс Чодсеесї г 21 «ЙО «11» 28 «12» ДНК «2132 штучна поспідовність «200» «23» синтетичний праймер «дО» 9 чессісдаса зоацесосе Чоддавд 28 «210» 10 «віз 2 «ие ДНК «132 штучна послідовність «Ох «виде синтетичний праймер «00» 10 зесопавв дісдаїоа 22 «ВО «їх «а ДНК «1» штучна послідовність
«0 «2932 бинтетичний праймер «щЮ 11 чедсдадвіє содсПфіссцаі боссащо со Зз «210512 «211» 35
Та» ДНК «13» штучна послідовність. «рейх «УЗ» синтетичний праймер «00» 19 осдсцсюса чоадсаавцчасі дсасацавава сно Зк «0» 13 «112 22 «а» ДНК «13» штучна послідовність «ого» «фе» синтатичний праймер «400» 13 сазсацівас цасаїссові 9 22 «ЕО» 14 «ЕТ» 27 «та ДНК «213» штучна послідовністі «Ро» «без» синтетичний праймер «4005 34 псодаєноаз нозащто: васідос 2 ка 15 «112 33 «122 ДНК «213» штучна послідовність
«в «род» синтетичний пранмер «А В їаіїдсаасод осчетвдава чамтеаццс сао з3 «10» 16 «1136 «ти» ДНК «р13» штучна поспідовність «аг «рай» синтетичний праймер «ОО» 15 аНссіссво дсдсосцієд сегтасадне агно зв «й хе 33 «122 ДНК 1328 штучна послідовність «ей» «ЕЗ» бинтетичний праймер «4005 17 асассадат ссосазащао сайассоєі ча 33 «105 18 «915 ЗА «и122 ДНК «2135 штучна послідовність «во» «ей» синтетичний праймер. ка» 18
Івнаносії одсавощсе сіссаідса іс 34 «2105 19 «1135 «Й» ДНК
«13» штучна послідовність «кивох «Рез» бинтетичний праймер «4002 19 давдадцааас дссадсаа!ї васасоваса досіс ЗБ «210» 20 «р31» 34 «ей ДАК «132 штучна послідовність «2202» «Рез» синтетична послідовність «4005 20 чЧсусасіайса усцавадсоа асозавнос саас За «10 и «112 24 «В1Йк ДАК «213» штучна послідовність «ад» «воЗ» синтетичний праймер «400521 ддссазавоад аіггівочеомтадо 24. «102592 «211222 «таз ДЕ кет» штучна послідовність «ДО «РеЗ» синтетичний праймер «00» ва ссроздаюо асддаанда ад а «1023 «2112428
«12 ДНК «13» беорасіве Ппептодінсовкіапе 2502 ква бр «ро (423 «400223
Фо ада віс дод Мо віс осу сагдаєзаа зад аза дос дасаюай «8
УагАта пе Аа Ге Пе Аіа Нів Азр Гу ув Гуз Аа Або Мей це 1 В 10 15 аз НЕ 99 ас оссіз сац осо зі На даа саа сві два сідіївв 96 сіш Ре Ма! Таг Аа Гео Рг пе Се іо сю Ні іш без Ту 28 30 ддеч асо сс асо асо дос по сосай сао даа асо аса дода ба сов 14
Ага ті Оу Тв Тег і цей Ата Пеззів Ві Аа Так Оу тей Ро зд саї сос Ш саз іс зб ссвіаг дособсовісаадааан оо 195
Уві нНів:Ато Рпа Сів баг Су Рго Туг Ту. Сіу Авр Си Он Пе Су бо аса ау ай дос сос аві даа аю дат аю ою ага Ш с сосові 240
Аза Меї Пе Аа Аго Або. О1Ю Ме! Ар Меї Уа! Це Ріе РНе АгУ Авр 65 70 78 во сс йо асо дса сад сс са дад ссо дасціє зді асо сісаи сс 288
Бгто Гео Ти Айва Сп. Ро Нів Сіш Рго Аво Ма! Бег Аа ес Пе Ага 85 о 95
Чаші оагціс іа іссоюоса сносавссаві аю одсасоосо З
Гео був Авр Уа! Туг Бег Уві Рго Беш Ага Аг Авп Ме оїу ТИ Ав 100 105 ї1о ддааанНаанкавааода сю дад сасододсса Чі осзідавоагфаві 584
СІШ безе був СТУ Ге Сів Аг Сіу АзроРНе Аа Тіто Ага Ав 115 120 125 ач діє сдсодс сда яаа са дад аса заг ура аід'їаа 423
Не ма Ага су Аг ув СТУ Спи. Те Авп у Це 130 135 140 «10 24 ке115 140 «я12е білок «132» бвовастив Пептосіисовюатв: «(Оз 24
Ма Ато Це Дід бе Пе Аза Ні Авр Гу уві ув Аа Азр Мей Це 1 5 10 15 іш Рве маг Тл Аа Тук СЛ Рто Пе есть сп Ні: СІ і во ТУг 20 28 Зо
Ага Тагсоу Тит таксу ви Ага Не сив З Аа Так оу дви Ро 35 3 45
Маї Нів Ага Рне іп Бег Су Рго Туг Му Сну Авр.Сіп Со Це Су 50 5 бо
Аа Меї Не Аіа Ага Авп сЬ Меї Авб Меї Ма! Че Ре Рпе Аг Авр вк 70 5 во
Рго Сей Тиг Ав о го Ні ін Рго дер Уві бег Аа їв Це Ага 85 о 95
Геч Сув Авр Уа! ТугбБег Ма Рго ем Ав Пг Авзп Меї Сну ТНг Ада 100 105 о
Сію Пе есе був СНУ Гец С Ага су Авр.Рие Аа Тр Аго Авії 129 125
Пе Маг Ага у Ага був су Сік тег Ав Оу Пе 130 135 140 «210525 кеті» 2950 «212 ДНК «213» беораств теповіюювантв
«ав «221» СО5. «реа 13. (2250) «4005 25 зі азасазодосасічни ан зассиювсасза щазазоя 48
Ме ув Зп Аа Тіт Уа! Ма бе дар го Ттр Аг Азпорве Гуз СУ 1 5 то 15 їсазаз'ідо ааа зааісу ай пас діє сої ові анна азсваї 95
БегіузТтвіузіувбБег Не Авр Уві Ага Ар Ре Пе Гев Авп Авп 20 25 Зо діа вссоіастіясаво да сла їсанссівасвадодссіаса зай 144
Уа! тик ма! гук тук Оу Ар ЄНи Зег Рне Гей ЗМУ Рго Таг су 40 45 дса асо ааа ава са чо сова саа дід аїдоза осо заасвазав 199
Авт ув Гуз Ге Тр Су Зів Ма! Меї Сію Гео Бек ув Зп Сни 50 а 50 сосдаз аза дас пдс іс ст да ад рас асаїся ан ЯК іс ассо 940 «Аго бін був ЗУ Су МаЇ Гец Ар МегАво тик бег Пе ув Зег ТИг 65 70 76 Во ас асісссасоода сса ота Чавасваз засо оваваа ніс 995
Не Тпг Бет Нів С1уУ Рго СТУ Тугі ви Авп ув Авріени Сід ув Не бо 50 95
Чадо шва аса дає ава ссо й аад соєоса Мааю со 336
Уа! Оіу Рпествй ТА Авр Гуз Рго Рпе уз Ага Аа Гей Меї Рго РНе той 105 1ю цос дос ак сос від осо сва сазіса Юсдаа оса ас од асаза ЗВ сим сну Не Аг Ме Аба Зіп Со Зег Су СІ Айва Тут Сну Туг ув 120 125 дфа адс дає даа дію заз ааа аїс т ас дазїассодзаааасасас 432
Ма! Бег Авроіи Май ув Гу Не Ре Тв с Тут Аго ув Тк Нів ї30 135 145 зас саа дод 99 й дас ой ас асо дас дад аю зда На дсосос 480
Авп іп сту Маі ре Авр Маї. Тут Таг Азр Си Мег Ат Гец Ав Ага 145 1595 155 160 ааз са дда аїсаісвосцас с сс да дсоіасодасосоосо ев
І ув Аа Су Пе Пе Те Оу Сеу Рго Аво Аа Туг Оу Ага ЗУ Ага 165 То 175 аїб віє дос застаєсді сос іс чсо КаїасоріцісдаєсЯєна 576
Ме ле слу Авр Туг Агу Аго Ма! Ав Її ви Туг Оу Уа! Авр Аг Сей 150 185 190 ас дааз узаа ааасаз аза да! По ааазасассазсосаада асо ад 554
Пе о СО був Суп був Аврец сув Аби ТВг Оу Ав Ага Тег Меї 195 200 205 асссав ас ай аїссоі сп сосоанова аніса дво савай соб 872
ТВО Авр це НеАто цей Ага Іо а Не зег ОІц єв Не Ага 210 215 220 дса на зас да Ма заа сва від дос Ма засів доаїає давай 720
Агвієо Аза іш Сей ув Ой МЕ Аа Сец Бег Ту СПУ Туг Авр Пе 225 230 235 240 іссаза сб дса со вас оса са Заа са Не саа до сісівкНе 758
Бегі уз Рго Аза Аго Авп Аа Нів СІН Аа не и Ттріво туї РНе 245 250 255
Ясіїві ст осі осі ай заз дав сза авс зас осв осо відадс ца 816
Аа Туг Гей Аа Ага Не ув ш Сп Аєпосіу Аа Дів Меї бег Гей 260 255 270 ада сус спі асс по на да айв асдааососдасій оса 864 су Аг Ма! Зег ТигбРНе Геи Авр Пе ТугПе Со Агу Авр Рне Аїв 275 280 285 дав дос аса Ма асо удава аза дза со саа даа сі діє дассяі й У сі у те бец ТВОЇ ув СО Агахзп св ви Ма! Авр не РБе 290 295 00
Я вію азасу со сну діє аваа осо аоа асу сс ааівіаас 980
Уа мес Гуз ви Ага Ген Маіув Ре Аа Ага Твк Рго СО Туг Азії 305 310 315 320 даа сн здс ода зас сс аса о ом асо зва їсовісдодсода 1008
Сів во Ре Баг Су Авр Рго Ті То Ма! ТнгооІю Заг Це СУ СОУ 325 з30 335 ан досанцагодс сої ссо На ід аса зво аасіса сс Ис 1056
Це Аа Пе Авр'СІуУ Аг Рго ви Маї ТНе був Ап бес Рае Агу Рпє зай 345 з50 сн сабасо ца даї аас Ма ода сої ясу сса зад оса ас па аса 1104
Кеш ів Тік Сей Ар Азпі вед Сіу Ро Аа Ро Рго Ав Ге Те 355 ЗО збо ча с що їсЯ заз сза Но ссод заз дса Яс ваза дадіай юсоса 1152
Уа бе Треті ув Сіп Гео Рто 30 Аа Рие Су СИ Тут Сув Аів 370 375 380 аза зір сЗ ас аза аса зосісу ай Саа ві дазаагдасдасна 71200 ув Меї Баг Не був Тиг Бет бег Не Оп Туг Од Авп Авр Авр Сей з Зо з95 400 ад сосвісоза ж вас ові оз асодаан осі юсюсдаїса 1248
Маї Аго ма! Зі Рне Су Азр Авр о Туг Сту Не Аза Суз Суз Уа! бег 405 «10 15 зса абз суа вісдус заа саа аз саа ШІ НС одчассосососсвас Т296
Ага МегАго Не Сіу Суз бів Меї Сів РНе Ре сту Ага Ага Аза Авп 425 «50 сісосо ааадса во баїаг осо ай васодс досі овааза 134
Гец Аа Гуз Аз Гео ей Туг Ав Пе Авп Сіу Оу Уа! Ар Ов г ув 435 40 445 на ава зіссза ції дусссідаа чгоса ссд ай зссіссдаатаї 3595
Геи Сув Ме іп ма! Сіу Рео бін Ре Аза Рго Це Тиг Зег сім Туг 450 455 460
На вагів вагоуаа ою зо св аза пс да саа ую сб оааїо 71440
Гей Ап ТугАвр Си Маг Мені Муз Ре Авр Сій Ма! бецни То 465 479 75 4 сц оссдаз си а ай засаса сю ааї діє віссаітас аю сає 1488
Сец Аа сі Сей Туг Пе Авп Тв ец Авп Уа! Не Нв Туг Меє нів 485 450 495 дасаваїві ща Зав сос айва дсасисасоаасісає 1536
Авр був Тут Сув Туг Сід Ага Пе с Ме Аа Це Ніз Авр Тег Нів що БОБ 510 а на сус аса від дсс ас дус ай дссозано базис 1584
Ма! во Ат Тег МегАїа Трг Оу Пе Аа Чу ви Бег Уа! Ма! Ма! о 520 ц25 зчайісо На адс асо віс ааа а! дса зав діє зай осо ас сус да! 1532
Авр Зег Гец Бег Аа Пе ух Тут Аа Суз Ма! Сує Рго Ле Ага Авр 530 535 50
Чазавзсзасагасаи ваш дав аюоаасосцаснссодаваа 1580 сім Ави Оу Не Ав Ма! Авр Рпе БЮ Меї Сів слу Авр Ре Рго ув
ЗАВ З Бак 560 басодаанівассаравесос іс врассаа ай цесай са Чад 1798.
Тугочу Авп Авп Ар Ар Ага Ма Аврозіо Пе Ав УагАвр Гсез Ма 565 570 575 даз соці НЕ від асо ава й аза вав саї зва аса ві сдсовііся 1776 сін Аг Ре МеєТнг Гуз і ви ув був Нів бує ТЕГ Ту Аг Авр Зег 50 585 5БОЮ аав сві ас са 18 На аса ай асо і вас й діа вобоя 1894
Еув Нв Тиг ей зе Це ей Тег Пе стйиг бег Аби Ма! Уві! Туг ІУ 595 600 6о5 ава азд асс дода вагаса сса чаї одссоассусасіаосова сс й 1872 ув був ТА ОМ Ав ТАг РгоАво СНУ Ага Ага А у СШ Рго Ре вд 615 6520 чес сса пода дса вас сс Но сас ад со дас ас азадов осо сіє 1920
Аа рго ЗІу іа Авп Рго ГГ ву Ні ЗУ Агу Ар ТР ух Су Аа ев 525 6530 535 640
Чсинсо са вас сів осо вва а ссвів овасаі оса надаї 1958
Ага бЗегі ей бег5ег Уві Аа ув Ге Рго Тук Он Ніз Аа Гец Ав 645 850 6555
Ччосаніса аз асо нсісо асо ссо заз со ча давав ау 2016 сну Пе Зег Авп Тік Рпе Зег Не Уаї Рго ув Аа ви су був ОШ що Бо 670 даа зда дас саєдіс-сдо засос дісоссой на дасоубаїасаю 2084 сії Су Авр Аг Ма! Аго Авп во Маг Ага Уа її еоАвр у Тук Мах 57 580 585 азазазодс аа саї саї сіє зас ай аас цію йо зассосодаваса 811
Сію ув СТУ Оу Нів Ні Гей АвпПе Авп Уві бен Азп Аго Зі Тег 690 695 70
Че на заг доз аю даа саї сса даз аа їв сс са на асаай 2160
Гей іви Авр Аз Ме Си Ніз Ро і ув Туг Рго бій ви ТАг Пе 705 10 715 720 сас осі дода зі дсс дісаас с віза зав Ка асо сс два сва 2208
Ага Уа! бе СОІУ Гук Аів Ма! Авп Ре Це Бузі ви ТИг Ага іш Оп
725 730 735 сва іс заг іс ан засос асо Не сво два асо ад аа 2250 іп Пе Азр Уа! Не Авп Аго Тег Ре Нів Сім ТНг Меї до 745 «10» 28 «2115749 «віта білок «13» Сеовасійна Пептиодисовзюайв «400» 55
Мегіух сі Ав Ти Ма! Уві Сец Ар Рго Тгр'Ага Авп Ра Гук у 1 5 ю 15
Зегі уз Тр ув ув Заг Пе Авр Маї Ага Авр Рне Пе Геиу Ап Ав
Зо мастит маї Туг Ту СУ Авр Си бБег пе Ген іш у Рго ТВг они
З5 40 48
Ав Тиагі ув ув Сев Тр. сти Уві Меї Сін Сви Бег Гув іп СВ 58 БО
Ага ій був СУ СУ Уві бе Авр МегАвр Тиг Заг Пе Уа! Заг Тс б5 70 75 во
Не Тнг Заг Ні СЯу Рто Сіу Тугіец деп і у Арі ви З ув Це 85 о 95
Ма! сну Ре Тиг Авр ув Рго-Рпе Гуз Агу Аа Ге Ме Рто Ре 100 105 10 су су Ме Аго Меє Ага Сів іп. ЗегСув Си Ав Туг СУ Тут Су 115 120 125 ма ЗегАвр Сі Ма ув ув Це Рве ТНК СІЮ Тук Аго ї уз Тит. Нів
130 135 140
Авп' іп Сіу Ма! Рне Авр Уві Туг ТргАвр Сів Меї Аго їеи Аа Аго т45 150 155 160
Ї ув Ага у Не Це Тег су ГецРго Ар. Ага Туг Су Ага і Ага 765 70 175
Пе пе Су Авр о Туг Ага Ага Маг Айва Се Ту Му Ма! Авр Ага Гей 150 185 189
Пе ев був ІЗ уз Авріеч Гув'Авп Те СНУ Аа Аго Тиг Ме! 195 200 205
Тегі Авро Не Не Ага її ес Ага ЗШ Зір Не бЗег іш (іп Не Ага 210 215 220
Аа ецу Авп СОЮ Кеш | уе СО Ме! Ав ей Зег Туг Су Тут Авр.е 225 230 235 240
Бегі уз Рго Аа Ага Азп Аа Нів СІц Аа Рпе Сп Ттрви тує Рпе 245. 250 25о
Ада Тугі ви дів лів Іе ув Си сій Аби Оу Аа Аа МеїбБег Гей 260 265 270
Оу Аго Ма! Зег Тег Рпе це Авр Це Туг Пе Си Агу Аво Ре Ага 275 280 295 бі ому Тиг сей Типи Сув СТ Аа іп Си дей Уа! Авр Нів Ре 290 295 З00
Уа! Ме Цув ви Аго Се Маї був Рне Аа Аго Те Ріо ОСЬ Тут Авп 305 УЮ 315 320 іш ви пе Зег чу Авр.Рго ТНг Тор Уа! Тит ЗІн Зег Не Сіу Су 325 330 335
Пе Аза Пе Авр Су Ага Рго бе Ма ТАгі уз Авп баг Ре Ага Ре 340 345 50
Геш Ні Трвг с ец Аво Авп і ви бу Ро Дів Рго іш Рго Аве Се Тег 355 360 365
Уа бец Тр оЗег ув ій беи Рео у Ага Рне Гуз Ям Тут Сув Аа 370 375 ЗО і ує Ме заг Не уз ТВг ет зег Ле ЗИ Ту Ош Азп Авр Ар Сви зя5 зо З95 400
МегАга Уа! Сі Рбе (іх Аво Азр Тує Сіу Пе Аа Суз Суз Ма! бег доб о ях
Аа Ме Аго Пе Су Гук Зі Меєссіп Рне Ре (ЗІу Аіа Ага АіаАвп «420 428 430
Геш Аа сув Аа Це Ге Туг Аа Ме Авпо сну Сіу Ма! Авр Си Гу 435 440 445
Гей ув Не іп Ма! сіу Рг Он Рібе Аа Рго Пе Тег бег СО Туг 450 456 «60
Меч Авп Туг Азр СІ Ма! Ме Ні уз Ре Авроіи Ма ев си тр 4655 ато 475 ВО
Ген Ав Зв езо Туг ПесАвп Те Ави Ма) Пе Ніз Тут Ме! ІЧі5 85 490 495
Ар ув Туг Су Туг Сі: Аг Пе Сі Меї Ав Геи Нів Авр ТА Нів 900 505 що ма цей Ага Тиг мМеєАа тпгооу Не Аа Су ви Зег Ма! Ма! Ма 515 520 525
Авр бе Сву Бег Ав Пе ув Туг Аа був Ма! Гуз Рто Не Ага Азо 530 535 540
Сн Авп Оу Не. Ав Уві Авр Ре бід Меї Сіи Су Аво ве Рго ув 545 550 555 560
Туг у Ав Ав Авр Аво Ага Уа! Ар Ой Це Аа Уві Авріі ви Ма! що ва 575 сш Ага Ре Мет Те ув ії сш І ув Су Ніз Гуз ТАг Туг Ага АвроБаї 5ВО 585 590
Ї ув Ніх Тиг Ге бег Пе Сец Тр Не Те Бег Ази Уаї Ма Туг Су 595 БОЮ Об
Ї уз Гує Тег Бу Авп Ток Рго Авр. ЗУ Аго Ага Аа ЗУ Сів Рго Ре бо ці5 620
Ав Рго М Аа Авії Рго без Ні ОМ Ага Авр ТИ був СМУ Ага (ви 625 30 535 Б4О
Ага ЗегГец бегбег Уаї Аа Гуз бГец Рго ТукОи Нів Ага еп Авр 545 5 655 спу Пе Зег Авп о Ттг Ре Зег Не Ма! Рго Гуз Аа ви Оіу Цує ОЇ
Бо 6655 5/О
Сто СПУ Ар Аго Маї Аг Авп бе аг Ага Маг Еви Ар у Тут Меї 67 680 585 ов усу у мів Ні мед Авп Пе Авп Уа! еи Ав Аг ОТ ВЕ в9о бо та ес еи Авр Аза Ме Спи Ні Рго бій ув ТуєРго Зі без Тег Не то о 715 720
Аго Ма! Бег су Туг Аа Ма Ап Ре Не ув ви Твг Ага ів 725 7530 735 сій Пе Авр ма! Не Авпи Ат Ти Рве Нів си Тег Меї т40 745 «РО «вії» 750 «12» ДНК «213» сеобВастив іпенподціисовюапв «од» «да» СБ «га (1М750) «00527 ад авадваш ай са їсс аїсоваїсаїдсодсассоюоасоода 45
Меї ув Сіу Рне Пе Нів Бег Це Сі Зег Суз СУ ТАлг Уа Азр Су 1 5 о ї5 сс дос сн сосіасдіє ас аса саасосіді ціа сід сосідс 95
Ркго Су Цец Аг Тут Уа) Пе Ре Те Оп су Сув Уа еу Аго Суз 70 25 о саа ід с са вас дос да асо ща даа ай дов аааддаазацав 144 сп ТугСув Ні Авп Аа Авр Те Тр. СНО Пе чу ув іу ув 1 35 40 45 авдасоаюдаа аа віс аїс да засо ааааса асо сс 192
Мета ма! Стч Су Пе Пе Авр Ар Уві ув ТС Туг! ви Ре Ре 5 бо віс зас осіісс ав дос ода ай асо дісвзодсодсоча дао осі но 0240
Ме Авп Аа Бех Авп Біу біу Пе Тв уареег Оу Су Рог ви 65 то 7 во
На сва ас дагій На ай даз Ма Щ заз дса Дос зал аза сію 288 м еи біп Пе Ар Ре Сей Пес бен Ріє Суз Аа Сув (ув Сув Сей
Зо
85 во 95 час ай са асс асо аб дагіса 9 зда Зоа'дсізсасу асо аа 336
Су Не Ні Тег Апа Це АвроЗег Бег Су Лу був Тут ТА ТИС 190 105 115 дсаісо осад са заа а зві даз па скіссіаобцаїча 354
Ав бег Ре Сп Сіл уз Гев Авп ін Сеціео Зег Туг Тг Азр Цен 115 120 125 ай но сну да зва са аїс уві спад заз аза гас суд зас 432
ПеГенівц Авріеціув Ні Пе Авр сіні узі у Ні Аг Гуз вий 1530 7535 140 зса дода авза зсс засава са ай ба саа Ш осі саз Маїс 480
Тигеу уз Тр Авп Кув Нів Пе сей іп Ре Аза біп Рпе Мен бег 145 150 155 169 аа заа зас і сс ай ша віссда са он сісон оса восвіс 528
СІ ув АвИ Маї Рго Маї Тер Пе Аг Ні Май ев ма! го Тк Пе 1655 170 175 асадасдасссо ваї дас йо сос сої сісоссосі Щайсосаса 578
ТигАвр Авр. Рго Ап Азр ей Аг Аго ву Ав Авіа Рпе Не Аго Твг 180 185 150
Ма зацазаг Фо вав зав ай два ви сіб ссаассвіазанавав 624
ГеціувАви ані уз уз Пе Сни Не бе Рго Туг Ні Гуз і ец Су 195 200 205 чаїасвавідо авазса сп дана азаівсссцодааодавю 572
Маг Тугіув То ув Ада без Су ей був ТУТ Ро Сер Сі СУ Це 210 215 220 заз сс сс со заз дав адс діа саа від яса сад саай сій вас 720
Сію Рго Рго Бег іш Су бБег Ма! ій Ме Ага Зі Ак Пе Сеи Ап 225 230 235 240 доз аса чаз дасаса діа СЕ сі осо аа 750 сЯу Твг ів Авро тп Ма! Зег сен Аа і 245 «2105 28 ка» 245 «Ле» білок «213» (звобастув Інелпоуінсозианя
«00528
Мегіув Су Ре Не Нів Бе Пе ін Зег був сну Тиг Уві Авр Сиу
З 5 10 15
Рго Оу бвь Ат Туг Ма! Ше Рве тТиг опи Оу Сув Ма ви Ага був
Сів Туг був Нів Авт Аа Або ТНг Тр Сів Не Су і ув Сіу ув бій
З5 40 45
Мети ма опи іш Пе Пе Ар Авр ма! ув Те Тує Сео бго РНе
ЗО 55 БО
Ме Авп. Аа бег Авп ОМ сіу Це Тг Ма! Бег Оу су С Рго Гей 65 то 75 ВО ем Сі Пе Авр Ре ее Зі ей Бе ув Аа бує му Гув йви 85 о 95 сту в Ні Тог Аз пе Авр зег вегоу СУ був Тут Пе ТОЮ 700 105 о
Ага ЗегРне біп Ст Гуз бе Авп іш Ге еу Зег Тує Тиг Авр Се 115 150 125
Ме во ей Авр еп ув Ніз Не Ар Спи ув Був Ні Ага уві ви 130 135 14а
ТегОїу ув Тнг Ав І ув Нів Пе Гец З Ре Аа Сій Ре ви бег 145 150 ї55 150 со ув Авп Ма! Рго Ма! Ттр Не Аг Ні Майї ви МагРто Ти Не 165 170 175
Тег Аво Авр Рго Аз. Авр ви Ага Аго бец Аа Аа Рне Це Аго Тог 180 185 то іец уз Ап Ма і ув І ув Пес Неї во Рго Гуг Нв ув бе му 195 200 505 маї ТугГув тт ув Аа бе Су бе Су Тух Рго бец с у Пе 210 215 270
Сів Рго Рго Зег чи Ва Бег Ма с МегАза сіп Аг Пе Ге Авл 225 2гза 235 2Ад су Тео Авр ТНг Ма! щег Сей Ав 245 «105 29 «й» 2504 «ріг ДНК «ріЗ» Сеорастих ІНептодінсовідапе а» хай» Со5 «йод» (1).(2804) «29 віфасї дю да0 до ада діє іс Чаї вза заз віс саа іа дса заа 5 мМесАзв ма с о Аг Мага Авр бує ув Пе сти Ма! А Сує 1 5 КІ 15 відай заг дач с діє осі заїдса сад заз асо Мо баасва а 96
Ме Пе Азр Зб еи Ма! Ав Азп Аа сп 1 уз Ага Сей Сі Сіпле 25. Зо сасоснас даєсаа даа асо абс даєса асо азадаа аю осо 144
Аго Аза Тут Авр Сп Спо НЕ Не Аво Ні Не Ма! був С Ме Аа
На дсс ооо сс ас азо саєаю оса на дсс аву сп осасадаа 792 во Ам во Ав був Нів Меї Аа Ге Аїд Гуз Гбво Аа Ма! біо бо два аса аа суб да ціа а даа ові аа нс аава вані 940
ШИ СТВ ув Аго Оу Маї Тут ін Арі ув Пе Не ув Або без Рве 70 75 во 929 аса даз (аї аа ас сас аабай засів да аавзсадісвод 85
Аа Те З Тує Пе Туг Нів'Ави Це був Туг Авр був Тег ма! (3іу 85 що а ач ен са даа аз сса са два дав ан аісдва ак осіова сс 336
Це Не Нів Сіц Авп Рто Ніби сн Пе Пе іо Пе Айва Зін го оо 105 1 чоноайосіозоданасо ссаціа асяаас ссо асаїоаса 384 маг оіу Ма Це Аа ЗМ Пе Тег Руб Уві ТигАвлп Рго Тег Те 115 120 125 асо аід Ні ааа ос Ка віс со вія вав аса сус засос анай 432
ТВ МеєРне Гув Ада Сен Не Зеє Пе ув ТІК Аг Ази Рго Пе Пе 130 135 140 йсосіиссагссаіюо осо свасоадсадсвосдаазсаассазда 480
Рне-Аів Ре Ні Рго зег Ага іп Ага Сув заг Зег ів Ага Аа АТ 145 150 155 150 чо сю сос заг осо со сс сов ус уоо дсссса дав са юсай 525 ча се Агу Авр лів Аа Уві Ага Аа Су Ага Рго СТ НІі Сув Це 155 то 175
Сава да ай дав ас ссгісЯ ст аг дса асе заї са ок від сас Зв
Сп Ттр Ле сш ТА Рго Бек Севи Авр Аа ТВ Авп суп Сея Ме! нів 180 185 то са остапе чн с сс ан ноу дса всі оса оде оссуасаю бе
Нів Рі су. Маі бег бе Пе еу Ада ТВ СУ Су Ав Су Ме Уа! 195 200 205 ааа са дсоа ас адсісі ода зав боса досі По одс чі вода сс дає 579
Ї ув Аа Аа Туг Бег бе СУ Гув Рго- Ав Гео су Ма! СПУ то ЗУ є 215 220 вагою ссі де іаг айва вва асо са засавазасод осо ща 720
Авп Ма! Рго був Туг Не бід був ТАг Ага Авп Пе Сув Аго Аа. Ма 225 230 235 240 ваговс ча ан Натсо ава асо М са аасодсаюданідсасі 755 деп АБвВієн Пе тенет ув Тит РЕе Ар Аєп Су Меї Не Сув Аа 245. 250 255 іс два сва дса ці ай ай о ава даз айіяаїдаа са оіаавяа 816
Бег Сі (Зів Аа Уа Не Не Авр ув Сій Ме Туг С1о Зв Уа ув 250 205 270 зааоза ва віз даа зас сві (асп цазаг заз уааозаваз 864
Гуз ЗІн Мей Песпи Авп Ні Суз Тук Рне Гей Авп ЗІ си Он г ув 275 280 285 аааазадіядала зав сіє вс аві дав ваг аса їде дос цісває 19
Гу Гуз Маї СІн ув Ге Ма! Пе Аби о Авп тег був Ага Ма! Ап «90 295 Зо0 сео чаї аб іс оба зай оса осі аг дова вк осо ава зідоссодс 0 960
Рго Авр.Не Уа! Зіу був Рто Аа Тут ІМ Пе Ав ух Меї Аза у 305 10 315 З2О вВсасіофсосо два зчасаса вва зн сп оп ос ова авааооа 1008
Не Аа ма Рто Спи -Авр ТВ уз Не Сео Уа Аа Сі Гео був Су 325 330 335. дієдоо сса аваїаєссо Но сі сод дза аза На адс сс діє сі 1058
Уа су Ро ув Ту Ро вн Зег Ага Сію Суз Ген Зег то Ма! г ей
З40 45 350 еще 18? ааа ой вас дос асо дав оза дода Й зад ссосісі дав 1104
Аа Сув Туг ув Маї Авп баг Тіг ю Сію Сіу Рне І уз Агу Суз Сію 355 збо 365 даа аю сід дав Щ одс вдс по да са їсо де ес віс сатюс 1182 сі Мегіец бішРНне Сіу Слу бен Су Нів Зег Аа Маї Це Ніз Зег 370 375 зво да аа саа вас дію з асс даа М дос ааа со від азадсд ода 1200
Ав Авп біп Авп узі Уа Тег Осі Ре сту був Ага Мег ув Аа Су 385 50 395 400 судо ай аїс ун вагосо сса г ісо саа ба дса аїсодсдасац 1246
Акта Не Пе ві Аяп Аа Рго Бегоег іп су Ага Не СТУ Аво Не. 405 А 415 їзо аа! доб таб ай осо їса ба асо сід одатосвосасащодс 1596
Туг Авп Ага Туг Не Рго Зег ей Трг Сеч Сіу Сув'єу Тег Рне сту 420 425 430
Чоа аасісіанісо аса вас осад осо ай са сн асєсааав 1344
Оу Авп Бег Уа Беї ТА Авпо Уві Заг Аа Пе Ні Гви Пе Авп Пе
435 440 445 аза вода аж уса ава зда асу ціа засід свв до паза дію сся 1395
Гуз Аг Меї Діва ув Ага ТАг а Ав Меєсіп Тер Рне Гуз Ма! Рго 450 455 450 ссад заз айіаєне даа заз ваг цс ціа саа зснадсо зав ау 1440
Рго Гуз Пе Ту Ре С1ц ув Ави Аа Уа! Сни Туг Ге Ав ув Ме 4655 470 475 4ва со заї анй'ссаза осі ЧЕ ас ціє ассдас ссо зда вюдцісаваа тав
Рго Азо Не Зег Аго Ага Рпе Не Уа! Тит Авр Рго Сіу Меса і ув 485 490 95 сіб драаєціє дар аааз дід с і асід соасвдасоасссоцдаї 1536
Гео Су Туг Уа Авр ув Уві бе Тут Туг Ге Ага Аг Ага Рго Авр щЮ 5 вто їаг від саї вої два ай сс дав фа дад сса паї ссгісвай 1584
Тук Ма! Нів бег іш Пе Рне бег Си Уаї Спи Ро АвроРго. бе Не 515 520 525 зад асо діа ад ааа до! діє са! ау ад ада во! йсдво ссо дає 1632
Оіштег Уві Меї ув Су Уві Авр Меї Меї Аг бБег Рне ОМСРго Ар 530 535 540
Фе ач асосо ск ода дос бус со сса від о8ї9с9 9са аа9 9СУ 1580
Уа Не Пе Аа бе у Сім у бег Рго Меї Авзр. Аа Ага Сув Ав 545 530 53 ЗО а ща сій асово са сса аса усу час йсвасосаНаваа 1728
Метт еи Ре тує Сі Не Рго Тік Аіа Абр Рве Азії Ав це цу 965 оо 575 свазаа ЩЕ На дагайк сода аза сус оп ів аазівіссааааєсію 1775 сп Гуз Рне Ге Авр Пе Аг Гуз Ага Ма! Тут Гуз Ту Рго ув Гео чо 585 о ус сва вна удсо ава Щ діє дсс ай ос ас асафса зда яса ода 1924 су сів уз Аа ув Ре Ма Аа Пе Рго Тс Твг бек су Тег су 595 бо 505 їсч аа діа аса сс досі ай ассдагава ваа асо аасав 1872
Бег Сім Уа! Тиг бег Рле Аа Узі Ме Ті Авр ув ув. Тег Авп Пе о 5815 620 аватаєссо чо дса дає іа дав йо аса сс дасоісосо а ою 192О
Зб
Гуз Тує Рго без Аа Авор Туг Сів ви ТпгРго Аве ма Аа Пе ма 625 630 635 540
Чаї ссу сва ЩІ діє від асс дід оса ава сві дісассоссові асо 1968.
Аво Ро Зі Ре уві МегТаг ма! Рто Су Нів Ма! ТИг Аа Авр Тл 645 550 555 доз аю часів на аса са? зсо вісдаа оса ві цісіссаві ад 20168 у Меї Авр Уаї бен. Ти Нв. Аа Це сш Ага Ту Ма! заг Азп Меї бо 565 вто пов ав дай іа асо а оці с осо відб ава ца іс сва сісоїа 2064
Аа Ап Або Туг ТТН Авр у Геш Аза Меє ув Аа Це І Гео Уаї щ75 680 585
Ш вдазіз но сс соз дса ні сав зо дов усу засад си дос 2112
Рие сій Туг бе Рго Ага Аа Тук сЯп Авпзіу Аа Авро и ей Аа 550 685 70 соб дафаза від сі вас оссіс асо ай бсодоа віз оса дес 02160
Ага іш Сув Меї Нів Авп. Айва Зег ТНг Пе Аа ту Меє Ав Рне Дів
ТОБ о 715 т-5-а васосо Ка сдос ай вас са во йо осі сагвааснодсосо 2508
Ав Ага Рне Гецу Сту Пе Аво Нів-бег бе) Аа Ніз уві ей Су Аа т25 730 735 два Нссмайкосо са оду сс осо засассай йо від ссоса 9255 сів Ре Ні Пе Рго МНів Сіу Ага Лів Авп ТНг Пе гео Меї Рго Нів
ТА) тав 750 яеайксосіаї аас са де ага ссо аза зав аос са ЩЕ сса 2304 ча не Аг Гуг Ав Аа Аз ув Ро ув ув Рпе нг Аа Рне Ріо т 760 755 заатасадааіїв(Нсазассдсассад сосізгодсадза ай дов ада 5352
Гуз Тут Сн. Тут Ре Гув Аа Дер Сіп Аго Тут Аа Сію Пе Аа Аг 7 78 780 атщсїс оса ссо сс сс асаастдаа два дод піс дав адссіє 25900
Ме беч СіуУ Сео Рго Аа Ага ТЕ ТАС Сів ів СУ Уа! іо бе ец 785 790 795 00
Чи сад дсо ас ай зад сід дса аза сад пор ові від сс сю вос г4а48
Ма ЗіІп Аа Пе Не І уз ви Ав уз Сіп Ге Авр МеєРю Ге Зег
ОБ 00СВто ВІВ аг два дса ще одсоісадсазасвадва аа адсавадідаа 2496
Неси Аа Сув Сіу МаїЗег ув ій СІ Рпе Сію баг Суб Маї СЮ 820 825 вза аза ча досоаав йо зс нс оаа рас сав ді астасі досі засобу 2944 ув с еш Аа Сіш і ви Ада Бе Си Авр сни був Ти ТАг Аа Азп Рто 835 ва0 45 аза сіб осу си й аодс Чаї На зі са аніаєсос са осо 2552
Гуз беш Рго Ге Маї Бег Авр.Гец Маї Нів Не Тут Ага іп Аа РБе 850 855 аво азадзованіза 2604 ув Су Маї 855 -2105 30 «11» 867 «12 білок «135 свовастив петтоціесовщатв «Ох За
Меї Аа Майї сій СЇШ Ап Маї Маі Ар уз Гуз Не ін Ма! Ав Гуз 1 5 10 15
Ме! Пе Авр. си Геш ма! Аа Авп Ав іп Гуз Ав ен Су іо Пе за
Ага Ада Туг Азр Си бів Те Не Авр Ні Пе Уві був За Меї Ав
Зо 40 45 ме Аа Су Гец Ар ув Ніз Меї Аа бе Аа бує Се Аа Ма! ОЇ що 5О си Тег гу Аг Сіу Маг Тут ОО Авр Гуз Не Не Су Авп Гейне 65 70 75 80
Аа ля си Туг Це Туг Ні Ави Не Гуз Тугс Авр ув Тиг Уа! су 85 о 95
Петче Ніз Сів Авп Рго Ні СВОЮ Це пе ОВ Пе Аа сін Ро 100 105 тю
Уаї су ма Пе Ав у Це ТВ Рго Маі Тг Ав Рго Тиг бег ТВг 120 155
Те Меї ЕвНе І ув Ав І су Пе. Зег Пе і ух Тиг Аг Авп Ро Не Не 130 135 140 вне Ав ве Нів Рго бе Аа (іп Ага Суб бет Зег СНИ Аза Аа Аг 145 150 155 180
Уа бен Агу Азр Аа Аа Маї Ага Аа Су Аа Рго СІ Нів був Не 185 170 178 сій то Не біш Те Рго Зег ей Аве Аа тн Авп Сіпі ву Ме пів 180 185 180
Нів Рго сіу Магбег Гей Пе бец Ага ТВг сіу Сіу Ав Су Ме Маї 195 290 205
І ув Аза Ав Туг Зег зег Оу Гу Рго Ада Геи Сіу Ма! Спу Рго бу 21О 215 220
Авп Ма! Рго був Туг Це Сі був ТАг Аа Авп Пе уз Аго Ага Ма! 225 230 235 240
Авп Аврівене ен зег ув ТНг Рпе Азр Ап Су Меє Пе Суз Аа 245 250 255
Зег ін іп Аа Ма! Ме Пе Ар Гуз сю Не туби Ст Ма ув 2650 288 я
Ї ув. Сі Мей Пе су Ав Ніз був Тут Ре Ге Авп Зі у и Су 215 280 285
Гуз ух Маї Сі С ув ец Маї Це Авп біс Авп Тег Суз Аа Ма Авп 290 255 зЗо0
Рго Ар Пе Ма! Су ув Рго Аа Ту Сію Пе Аа бує Меє Аза Су 05 10 ЗІ его
Пе Аа Уа то 1 Аво Тв був Пе еи Ма! Аа бі бе уз СУ 325 330 335 маг сіу Рго уз Тут Рго ез Бег Ага сіб г ув Сеи Заг Ро Ма! бе зай 348 З50
Аа був Тук уз Ма Авпозаег Те сш у Ре ув Ага буз ій 355 ЗО 365 сій Ме їео Со бпе су СУ бен слу Ні бег Ага Уа! Пе Ні бег 370 375 зво
Ар Авп бій Аби Ма! Ма! Тнг Оію Ре сСіу був Агу Ме! дув Ав су зЗ85 з9а 3а5 400
Аго Пе Не Уві Авп.Аа Рго Зег Зеї іп Су Аіа Пе Сну Ар Це 405 а10 415
Туг Ав Аа Туї Це РгоЗег Бей таг бен Су був СУ ТгеРпе Су 490 425 480
Оу Авп Бег Уа! бег ТігАвп Уа! Зег Аа Пе Віз (ви Це Авл Не 435 440 445
Гу Аг Меї Аід ії ув Ага ТТН Ма! Аби Меї Сіп То Рпед ув Ма! Ро 450 455 460
Рго бує Не Туг Ре Зо Гуз Ав Аз Уа сніп Тулі ее Аа Сує МЕЇ
455 470 47 480
Рго Авр Ме Зег Ага Аз Рне Пе Ма Тв АвроРго Сіу Меї Уві 1 ув
АВ доб 495 їви Сіу Туг Ма! Аврі ув Маре ТУг тугі ви Ага Ага Аг Рго Ар 500 5ОБ 510
ТУ Уаї Ні Бе Не РнНедег Сі Уві Є Ро Авр Ро Зег Це 515 520 595
Сі Те Ма! Ме був у маг Авр Ме МерАго Заг Ре іш Рго Авр 530 535 540
Ма! Не Пе Аіа бе СТУ Су Сіу Вег Рго Ме Авр Аа Аа І ув Аа 545 5Б5О З55 5
Метт беи Рпе Туг Си Нів Ро Тяг Аа Авр Ріє Авп Аа ви уз 570 575 біп був Ре Сец Ар Ме Ага ув Агу Ма! Тугі ув ТугбРуо уві ец 580 585 580 су біб буз Аіа Суз Ре Ма! Дів Це Рго Тиг Тиг Бег Су Тік Су 595 800 605
Бегоїв Ма! ТаеБег Ре Ага Ма! Пе Те Авр ув був Тиг Ай Не 51О0 15 529
Гуз Туг Ріо Гей Аа Авр Ту ОВ Ге Те Рго Аво Уві Аа Не Уа 625 550 635 бо
Авр.Рі бій Ре Уві Мей Та Маг Рез ув Ні Уа! ТР Ага Авр Тит 645 БО 655 сту Ме Авр Уві бе те Нів Аа Це а Аа Туг Уа! Зег Аа Меї 5ВО Бб5 5То
Аа Депп Азр Тує Тит Авр Оу Сец Аа Меї Гуз Аза Це бій Ге Ма 575 бо 535
Ра сти ТугГеи Рго Ага Ага Туг Сіп Авп ОІХ Ав Авр СИ Ге Аа 695 700
Аг Сіш (ув Меї Ніз Авп Аа Зег ТіеПе Дів Спу Меї Аа Рпе. Дів 705 710 7 тай
Авп Аа Ре Гец сту Це Авл Ніз бег і ви Аа Ні ув їви Су Аз 725 730 75 сі рве Нів Не Рго Ні сту Агу Ага Ав Твг Пе ле Мен Рго ів 740 їт45 750
Уа! Пе Агу Гуг Аво Аа Аа Був Ро Гуз Гуг Рвпе ТАг Ав Рпе Рто 755 во 755 ув Туг ід Туг РНе І ув Аа Ар Ср Ага Туг Аіа (ІС Не Ав Аг 770 775 780
Мей ви біу Сви Рго Аа Аго Тег Твг ОЇ іч Сту Ма! бів бегі ей 785 790 795 оо
Ма сів Аа Пе Не Гу Ге Ада Гуз ст і еу Авр Мег го Ге Бег воб 810 вів
Ме Сім Ага Су Сіу Уа! бет Су Сп Од Рпе Си Бег Гує Ма! С в2О 825 830 ув кеш Аа Сію Се Аа Рпе Зіш Авр Оп Суз Трг Ти Ав Аза Рго 835 840 845
Му Сео Ріо Ген Уа! Заг Ар ви Уа! Нів Пе Тук Агу іп Ав РНе 850 ВЕБ бо
ГСув Су Уа
З55 «ОЗ «в1ї5 575 «212» ДНК «2132 Сеобасійна І Пептодінсовійате «РРО» «ов СО «вд» (1)4975) «4005 31 де аусадіва на шісдасаЧазавасзазвааазіа дсодозаза 48
Уаї Бек ЗегАвр Гей Не бег Тлг І ец бу Си Муз Це Аа Су Гуз
Ї 5 10 15 саа соду заз аіс у ШЕ ссо два сра сп да сад сцени йааса 96:
Сі Аг Су Пе Ма! Ре Рго Си Су Гей Авр Си Аз Пе цен ТА 29 75 за оса чів абс соді сід дбо вас уад саа аіс біс асо сс ан бсай 144
Ав маг Зег Ага Гео Ага Ав біо п Пе Маг Тсрго Пе ма! Не дос авг оза аа усо з зад сва азадсз адс дад сн апа сідвасо 182 оіу АБ 1 іо Аа Ма! Був (ЗІй Сук Да Зег ЗШ Гео іу вч ТТН
БО 56 бо сі сбо загцієсава ас ан да сса сі садіасаода заз авщоас 20
Ге Рго Авп Ма! Сід Пе Пе Авр/Рго Нів іп Туг Оу С Меї Авро 65 7а 75 80 задсп ан осо дсайй діс аз сас сдс вва дос заз ою асдова 285 ув бецу Ма Аіа Ав Ре Ма! Сід Ага Аг уз С3у Гуз Уа! Тег о 85 8) 95 даа дсо дос сод ало сід си си дасовза аа іа б досассаю 336
Сім Аа Аа Агу Кув бе ец ен Авр Сів Авп Туг Рве СТУ Тее Меї 100 05 10 сг сютас аю ода азоа оса са ода ск оісадсодсосо са сві 384 ї ви Ма! Туг Меї Ар і ув. Ав Нів Су (ви Маї Зег Су Аа Аа Ні 115 120 125 са асп осі ов асо сі са ссі оса йо савз ай ві вав асо вва 432
Зег ТА Ага Ар Тиг аг Ага Ро Аа Сей п Не Пе ув Туз за 135 140 саа дас діє сдсава асо їса дода іа йсац аю ою соснаєчяаї 480 бів Оу Уві Аг Гу ТнеЗег Зіу Мая пе Пе Ме Уа! Ага Сіу Авр 145 150 155 тво цва зад'асощ оса цсосо віфбвасай дсссосодасадс 528 сів Суб Тує Ма! Рпе Ав Ар Сув Ага Пе Авп Не Діаз Рго Авр Ве" 165 170 175 саа да! йо ос9 даа аісосєдіє даа адсоссвасасо са зазаюд 576
Сів Авр ви Ав Сни Пе Аа Уві Сію бБег Ав Авп Те Ада уз Меї 180 185 190 не дас ай дау оса сас діду дсо від ку аде Щісо са ааадда 824 не Дер Це Сіш Рго Ага ма! Ав Месіен Зег Ре Веї Тігі ув ЗУ 195 во 295 їса оса зва ісд сся даа вс два аза фіс іс два пс у соя си 67 зег Аа ув зегРго сли По ув ма Ма В АВ Уві Ага Сем ла т15 2
Че заз дав ад со сої дас ба сію сію дас соді зав сво Не 720
Ав | ув спи Меї Ав Різ Авр Гец Майї ву Авр ЗУ Сх Ре чи Рне 225 230 245 240 дасосо оса й ей ссо їсї діс осо яаа аад ава дсо сса дагісе 758
Авр Аза Аіа Рре Уа) Рго Зег Уаі Аа | ув Гу Гув Аа Рго Авр.Зег 245 250 555 ціє ви сав буда час осо васоа Шактчсссавоссідаа дос 816
Уаі Це Сів Чу Авр Аа ап Маї Не Пе Рпе Рго бег Гец Си Аа 280 265 270
Чда аа! аїс одеса ава аїс дос сад со сс удсаасозадсо Вб
Су Ави Не у Тугі ув Пе Аа сі Ага Ге Су Ап пе ів Ага
В 290 285 діє босссу ай но саз зда сіс аа зад ссбоюавасцассюїса 912 уагом Рго Пебец Сів Су І ви Авп Гуз Рго Ма! Ап Авр Ге Вег
290 295 з00 бос пд їос азі дсо да за дід ас аво сіб аса сб ай аск осо 960
Ага БУ Суб Авп Аа СЛ Леруа ГУг уз Гео Тире пе тег Аа 305 мо 315 320 спсо сва Їсо сів'їаа 075
Ав бій Зег гей «10» 32 «115 324 «12» білок «13» Сеобастив іеттювдіисовідапе «ай» З
Ма ЗегбБегАввіви не баг Ти Це Гуз Сію був Не Аа у Гу
І! 5 10 15 сп Аго був Не Ма! Ре Рго С Оу Сево Аври Аго Пе во Тв 23 30
Ав Уа Зег Аг бецАа Ап сій Не Ма! Те бто Пе а е
ОХ Авл ою сни Аа Уа! ув СИ ув Аа Зег Зо Ге Ну ви ТАг 650
Геи Рго Авп Уа| Си Не Пе Авр/Рго Нів «ій Туг Іу сі Меї Авр 55 79 75 80
Гуз бен Уа! Аа Аа Рпе Маї СІЮ Аг Ага був Зіу Сув Ма! ТАг с 85 50 95
Сі Аіа Аа Ага був бец б еш Гей Авр Сів Авп Тут Ре іу Ти Меї 100 105 о
Гео Уві Туг Мет Аво Гуз Аа Ні Су Геи Уа Зег СПу Аа Аа Ні
115 120 125 зегтТпгАа Ар тн муа Ага Рто Аа Сей іп Ле Пе ув Ти Гу 130 135 140
Сі Оу МагАто ув Тг Бек Спіу Ма БВе Це Ме Уві Ага СЯу Авр 145 150 155 тва
Сіші уз Туб Маг Ре Аа Авр Сув Аа Пе Авп Не Аа Ріо Авр Бег 155 170 175
Сів Авр Ген Ага ОО Пе Аа ма! Сну бет дів Ази Ти Ав Суз Меї 180 185 190
РНе Авр Це СЯ Ріо Агу Ма! Ліа Ме Сец БегРпе Зег ТНК ув у 195 200 205 зегАйа ув Бе Рго Сі Тр со уз Маі Уа Сію Ага Маї Ага Сец 210 215 220
Аа уз 0 Ме Аа Рго АзрГец маг ед Ар у Сі Рне бій Рпє 295 230 235 240
Авр Дів Аз Рпе Узі Рго Вег Уві Ав був Гуз ув Аа Ріо Авр Вег 245 2590 255
Уа Че сп сіу Авр Аа Аби Ма! Ре Не Ре Рго Зег і ец СО Аа 260 285 270 слу Авп Пе Су Тус ув Пе Аа іп Ага Гей су Авп Ре Со Ав
Та 280 285
Уа су Рго Пе ен сій Сіу бец Авп ув Рго Уа! Азп Авр Гео баг 280 295 300
Ага Біу Сув Авп Ага СИ Авр Ма! Туг ув Се Тв ес Не Те Аа 305 Зо ЗВ 20 ла біп Зегієец «102 33 «2112750 «12» ДНК «13» беорасіне теподтисовідапе «290» «21» 205 «й2(1750) «4005 33 аю ваєцієаї ді: зад сода дає сад асо сію Чазза ай стоад 48
Меї Дер Уа Авр Уа! ув Ага Авр Сів Те Гев Ге суз АвроНів: ОЇ 1 5 10 15 а ава аву сі ай соб сус ос сав уво 999 сассваасад осо сос 96
Меггі уві уві во Те Аг Аго Заг и Су Авр іп Зі Ага Аг заг ува ай ваіс сза заа зас ад сс сіс Ян ща ся іс іс сад 144
Авп іш Не Пе Сип бух Авп Мет Ата бео Ма! Тр зе Уві Маг Сп що 45 оце Ку вас сус дра ас дао сс дасозі ца савайоос 192
Ага Рне Се Авп Ак Су Тут Он Рго Авр Авр бе Рае СЗіп Це пу 5О що БО юсасЗоспа сн ввастов аа ава ав на їсоаівідає дао
Сує пе епі ец ув Зег Уа! Авр уз Рре Арі ец Зег Туг Авр 65 70 75 во
Фо ваз Щ сс аса аг осо б сс а аїсаісодсова ай сад 88 маг ув Ре Зег Ти Тут Дів Уві Ро Має Не Пе у Сір Цей 85 що за оца ас сос дає дає дод асо с заг аю зоссоііосНазаз 336
Ако "Не Пе Аг Ар Авр СЛУ. ТНг Ма! і ув Ма! Зег Ага беї Гей був 100 1905 116 даз асу дує аві вав ас су заз дся зада дас 89 ск со ааа заа 384 іш Тиг су Авп і ує Не Ага і ув Ада Аго Авр и Ге бегі ув був 115 120 125 ся оса суо оса сов асо ою ас даа аісоссо іа це дажай 43и
Нів (2у Аг А го Тиг Уві Тв Сі Пе Ага Авр Тут бе 1 Ле 130 135 1240 іїсїсса два дав чі о с сс сво двадсо ай соді єссса де 480
Зег Рго бі Сі Ма Уа ей Аа бів и Аа Уа! Аго Бех Рго Ав тав 150 155 159 їсс ай сас дав. аса дід зі даа вас дасодс дасососуаісаса сіє зи бег Не Ні СчНи ТВ Ма! Тук бів Авп Авр Су Авро Рго Це ТВг і ви 185 170 175 сісдаі сазан с ові со дасдаз дсакаіда ша ааваю 576
Гецй Авр Сію Не Аа Авр. Аа Авр іш Ага Бек Тр Ре Аво Був Пе 180 185 190 оса Но аза ааа дса зі аа зад сію да дазсод азс сісаїс 654
Ав цей був був Аба Пе Со СО СецгАвр ОА ОВ Ага Се Не 195 200 205 де асо сої їаг ас ааа да саа асо сво су два дія здсаїсв 879
УВІ Тут Ів Ага Гуг Тут був Авр (3 Те ій бег Сід Уа Аа Бег 210 -х15 ей ацчачЧа доба кі саа ці сзаціаюссцісйоваавзазаа ай 720
Ага Сву Спу Не Зег іп Ма! іп Ма! бег Аго ев Сід ув ус Це 230 2545 ай
Ча сну саз ага заду ово ада зі чага 750 во сій сів Це ув СТО Ат Ме! Дер Су 245 253 «10» 4 «2112250 «ита» біпок «р13» Зворасійне Шеподінсовічапе «00» 34
Ме! Ар Уа! Аер Уа! Гув Агу Авр Зі Ти Сец бец уз Азр Ні Оіц 1 5 то 15
Ме ув Гуз беу Пе Аг Аг Бего СіШ Оу Авр Ся Сіп Айа Аг 28 Зо
Ав си Пе Пе Сп І уз Аби МегАго Ген ма! Ттр Бег Маї Ма! дій
Ага Рее еп Аза Ага СУ Тут Си Рто Авр Авр Ге Ре Сів Ле Су 59
Суз Ме Сіу Ге Ге і уз Вег Ма Авр (ув Ре Авр Ге Бег Туг Азр б5 70 75 во
Уа ух еле Бег ТНг Туг Ав Уві Рго Меї Пе Пе сих си Це сно 85 90 55
Ага РАе Пе Аго Азр Авр су Тиг уУаі (ув Ма! ЗегАго зе Гей Сух їо0 305 110 с ТАг Оу Авт Гуз Пе Агу ув Ага Ага Аво біо ем Зег ув Гу 115 120 125
Нів Су Аг Аа Ре ТНг Маї Ти Сів Ме Ліва Авр тугі ец и Це. 130 135 140
Бе Рго Си и Маї Маі Сеч Аіа Сл СИ Аа маг Ага Бег Ро Ав 145 150 155 150
Бег Не Нів Сію Таг Ма! Туг Сі. Ап Ар СУ Авр Рго Це Тигієм 165 179 175 ви Авр Сіл Пе Аа Авр Аа Авр Св Ав Зег Тр Рпе Ар ГСув Не 180 185 80
Аа ей ув Сує Аа Пе сі и Сем Авр СІ Аго ін Ага бе в 195 900 205 маї Тут Се Ага Тут Тут ув Авр си Тит іп зег и Ма! Ла Бег о 215 8829 го ец біу Пе Бетсі Уві сіл Уа Бета бе сію буг сув Пе 225 230 235 240
Сей бів Вів е суз С Аго Ме Авр у
Claims (13)
1. Генетично сконструйована грампозитивна термофільна бактеріальна клітина СеобасшШив Іегтодіисозідавзійих, яка є факультативним анаеробом та продуцентом (5)-молочної кислоти, яка включає інактивований або делетований ендогенний ген метилгліоксалсинтази тозА.
2. Клітина за п. 71, в якій додатково ендогенний ген піруватформіатліази А та/або В є інактивованим або делетованим.
З. Клітина за п. 1 або 2, яка є дефектною за споруляцією похідною завдяки інактивації або делеції ендогенного гена споруляції.
4. Клітина за п. 3, в якій ген споруляції являє собою ген 5ідк.
5. Клітина за будь-яким з пп. 1-4, в якій ген ендогенної піруватформіатліази А та/або В є інактивованим шляхом інактивації або делеції локусу рРИВА-аанЕ піруватформіатліази/алкогольдегідрогенази.
6. Клітина за будь-яким з пп. 1-5, яка продукує (5)-молочну кислоту з енантіомерною чистотою принаймні 98 95, більш бажано принаймні 99, 99,5, 99,8 або 99,9 95.
7. Клітина за будь-яким з пп. 1-6, в якій додатково ендогенний ген фосфотрансацетилази (ра) є інактивованим або делетованим.
8. Клітина за пп. 1-7, в якій гени є інактивованими або делетованими шляхом гомологічної рекомбінації.
9. Спосіб одержання енантіомерно чистої (5)-молочної кислоти, де вказаний спосіб включає культивування термофільної бактеріальної клітини за будь-яким з пп. 1-8 при використанні прийнятного, здатного до ферментації карбонвмісного субстрату та виділення (5)-молочної кислоти.
10. Спосіб за п. 9, в якому карбонвмісний субстрат включає ксилозу, глюкозу або сахарозу.
11. Спосіб за п. 9 або 10, в якому культивування здійснюють при температурі від 50 до 70 "с.
12. Спосіб за будь-яким з пп. 9-11, в якому утворюється не більше ніж 15 95 (мас./мас.) побічних продуктів на основі загальної маси побічних продуктів на загальну масу одержаної молочної Зо кислоти, зокрема не більше ніж 10 95 (мас./мас.) або не більше ніж 5, 4, З або 2 95 (мас./мас.).
13. Спосіб за будь-яким з пп. 9-12, в якому утворена кількість принаймні одного продукту, вибраного з мурашиної кислоти, етанолу та оцтової кислоти, становить не більше ніж 10 95 (мас./мас.) на основі загальної маси мурашиної кислоти, етанолу або оцтової кислоти на загальну масу одержаної молочної кислоти, зокрема не більше ніж 6, 1, 0,25 або 0,1 95 (мас./маб.).
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP14178150.0A EP2977471A1 (en) | 2014-07-23 | 2014-07-23 | Genetic modification of (S)-lactic acid producing thermophilic bacteria |
| PCT/EP2015/065995 WO2016012298A1 (en) | 2014-07-23 | 2015-07-13 | Genetic modification of (s)-lactic acid producing thermophilic bacteria |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA121479C2 true UA121479C2 (uk) | 2020-06-10 |
Family
ID=51211698
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201700514A UA121479C2 (uk) | 2014-07-23 | 2015-07-13 | Генетично модифікована термофільна бактеріальна клітина geobacillus thermoglucosidasius, яка продукує (s)-молочну кислоту, та спосіб одержання енантіомерно чистої (s)-молочної кислоти |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10273509B2 (uk) |
| EP (2) | EP2977471A1 (uk) |
| JP (2) | JP6549214B2 (uk) |
| KR (1) | KR101999975B1 (uk) |
| CN (1) | CN106536543B (uk) |
| AU (1) | AU2015294138B2 (uk) |
| BR (1) | BR112017000940B1 (uk) |
| CA (1) | CA2955720C (uk) |
| DK (1) | DK3177741T3 (uk) |
| ES (1) | ES2924250T3 (uk) |
| HU (1) | HUE059443T2 (uk) |
| PL (1) | PL3177741T3 (uk) |
| RU (1) | RU2671528C2 (uk) |
| UA (1) | UA121479C2 (uk) |
| WO (1) | WO2016012298A1 (uk) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024126054A1 (en) | 2022-12-15 | 2024-06-20 | Feedstocksunited B.V. | Trioxane as unifying fermentation feedstock |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL1013682C2 (nl) | 1999-11-26 | 2001-05-30 | Purac Biochem Bv | Werkwijze en inrichting voor het zuiveren van een waterige oplossing van melkzuur. |
| GB0000185D0 (en) | 2000-01-06 | 2000-03-01 | Agrol Limited | Ethanol production |
| EP1391502B1 (en) | 2001-05-29 | 2012-04-25 | Kao Corporation | Host microorganisms |
| JP4336082B2 (ja) | 2001-05-29 | 2009-09-30 | 花王株式会社 | 宿主微生物 |
| GB0117551D0 (en) | 2001-07-18 | 2001-09-12 | Elsworth Biotech Ltd | Lastic acid production |
| CN100560727C (zh) * | 2003-09-30 | 2009-11-18 | 三井化学株式会社 | 用于生产d-乳酸的生物催化剂 |
| US7098009B2 (en) | 2004-03-04 | 2006-08-29 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Production of chemicals from lignocellulose, biomass or sugars |
| EP1880004A1 (en) | 2005-05-04 | 2008-01-23 | TMO Renewables Limited | Thermophilic microorganisms with inactivated lactate dehydrogenase gene (ldh) for ethanol production |
| ES2573980T3 (es) * | 2005-08-10 | 2016-06-13 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Materiales y métodos para la producción eficaz de ácido láctico |
| EP1820814B1 (de) | 2006-01-24 | 2007-08-29 | Lurgi Zimmer GmbH | Verfahren zur Veresterung von Terephthalsäure mit Butandiol, Verfahren zur Herstellung von Polybutylenterephthalat und Vorrichtung dafür |
| BRPI0717228A2 (pt) | 2006-09-28 | 2013-10-08 | Tmo Renewables Ltd | Micro-organismos termofílicos para produção de etanol |
| RU2355759C1 (ru) | 2007-08-14 | 2009-05-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АРОМАТИЧЕСКОЙ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН ydiB, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЛОЖНОГО ЭФИРА НИЗШИХ АЛКИЛОВ АЛЬФА-L-АСПАРТИЛ-L-ФЕНИЛАЛАНИНА |
| GB0820262D0 (en) | 2008-11-05 | 2008-12-10 | Tmo Renewables Ltd | Microorganisms |
| AR077204A1 (es) * | 2009-06-23 | 2011-08-10 | Verenium Corp | Bacterias etanologenicas recombinantes |
| EP2468860B1 (en) * | 2009-08-21 | 2015-11-25 | Asahi Glass Company, Limited | Transformant and process for production thereof, and process for production of lactic acid |
-
2014
- 2014-07-23 EP EP14178150.0A patent/EP2977471A1/en not_active Withdrawn
-
2015
- 2015-07-13 BR BR112017000940-4A patent/BR112017000940B1/pt active IP Right Grant
- 2015-07-13 EP EP15738320.9A patent/EP3177741B1/en active Active
- 2015-07-13 CA CA2955720A patent/CA2955720C/en active Active
- 2015-07-13 US US15/327,621 patent/US10273509B2/en active Active
- 2015-07-13 HU HUE15738320A patent/HUE059443T2/hu unknown
- 2015-07-13 JP JP2017502623A patent/JP6549214B2/ja active Active
- 2015-07-13 ES ES15738320T patent/ES2924250T3/es active Active
- 2015-07-13 KR KR1020177004576A patent/KR101999975B1/ko active IP Right Grant
- 2015-07-13 WO PCT/EP2015/065995 patent/WO2016012298A1/en active Application Filing
- 2015-07-13 UA UAA201700514A patent/UA121479C2/uk unknown
- 2015-07-13 DK DK15738320.9T patent/DK3177741T3/da active
- 2015-07-13 AU AU2015294138A patent/AU2015294138B2/en active Active
- 2015-07-13 PL PL15738320.9T patent/PL3177741T3/pl unknown
- 2015-07-13 RU RU2017102895A patent/RU2671528C2/ru active
- 2015-07-13 CN CN201580039353.5A patent/CN106536543B/zh active Active
-
2019
- 2019-02-21 JP JP2019029749A patent/JP2019088328A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR112017000940B1 (pt) | 2024-01-16 |
| CA2955720C (en) | 2019-11-05 |
| EP3177741B1 (en) | 2022-06-29 |
| US10273509B2 (en) | 2019-04-30 |
| RU2017102895A3 (uk) | 2018-08-27 |
| PL3177741T3 (pl) | 2022-10-03 |
| WO2016012298A1 (en) | 2016-01-28 |
| US20170298398A1 (en) | 2017-10-19 |
| AU2015294138B2 (en) | 2018-07-19 |
| BR112017000940A2 (pt) | 2017-11-14 |
| RU2671528C2 (ru) | 2018-11-01 |
| JP6549214B2 (ja) | 2019-07-24 |
| DK3177741T3 (da) | 2022-09-12 |
| CN106536543B (zh) | 2021-05-07 |
| KR101999975B1 (ko) | 2019-07-15 |
| AU2015294138A1 (en) | 2017-02-09 |
| JP2017521081A (ja) | 2017-08-03 |
| CN106536543A (zh) | 2017-03-22 |
| JP2019088328A (ja) | 2019-06-13 |
| ES2924250T3 (es) | 2022-10-05 |
| HUE059443T2 (hu) | 2022-11-28 |
| EP2977471A1 (en) | 2016-01-27 |
| CA2955720A1 (en) | 2016-01-28 |
| RU2017102895A (ru) | 2018-08-27 |
| KR20170028445A (ko) | 2017-03-13 |
| EP3177741A1 (en) | 2017-06-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA119985C2 (uk) | Мікроорганізм, який виробляє о-фосфосерин, та спосіб отримання о-фосфосерину або l-цистеїну з його застосуванням | |
| JP6608392B2 (ja) | ショ糖におけるファインケミカルの改善された生産のための遺伝的改変微生物 | |
| MX2015004401A (es) | Cepas de streptomyces microflavus y metodos de uso de las mismas para controlar enfermedades y plagas en plantas. | |
| EP2808394A1 (de) | Mikroorganismus und Verfahren zur fermentativen Überproduktion von Gamma-Glutamylcystein und Derivaten dieses Dipeptids | |
| AU2015294136C1 (en) | Genetically modified (R)-lactic acid producing thermophilic bacteria | |
| CN109666617A (zh) | 一种l-高丝氨酸的生产菌株及其构建方法和应用 | |
| US10287558B2 (en) | Microorganisms for succinic acid production | |
| UA121479C2 (uk) | Генетично модифікована термофільна бактеріальна клітина geobacillus thermoglucosidasius, яка продукує (s)-молочну кислоту, та спосіб одержання енантіомерно чистої (s)-молочної кислоти | |
| KR102281368B1 (ko) | 신규한 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법 | |
| JP5119435B2 (ja) | 光学純度の高いポリ−γ−グルタミン酸の製造方法 | |
| ES2702930T3 (es) | Microorganismo modificado con un comportamiento de separación de biomasa mejorado | |
| JP2017505134A (ja) | ショ糖における改善されたファインケミカルの生産のための改変微生物 | |
| WO2004053131A1 (de) | VERFAHREN ZUR FERMENTATIVEN HERSTELLUNG VON R-α-LIPONSÄURE | |
| KR102288396B1 (ko) | 신규한 혐기성 코프로포르피리노겐 ⅲ 옥시다제 변이체 및 이를 이용한 imp 생산 방법 | |
| US11512319B2 (en) | Transcription factor SugR coding gene, and use thereof in production of N-acetylglucosamine | |
| WO2016030373A1 (en) | Modified microorganism for improved production of fine chemicals on sucrose | |
| KR102525074B1 (ko) | 신규한 시트레이트 신타아제 변이체 및 이를 이용한 o-아세틸-l-호모세린 또는 l-메티오닌 생산 방법 | |
| CN103343148B (zh) | 用改变tdcD酶调控元件的细菌发酵生产L-色氨酸的方法 | |
| KR102525072B1 (ko) | 신규한 시트레이트 신타아제 변이체 및 이를 이용한 l-아미노산 생산 방법 | |
| KR102266232B1 (ko) | 신규한 폴리케타이드 신타제 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법 | |
| KR102266231B1 (ko) | 신규한 mfs 트랜스포터 변이체 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산 방법 | |
| CN107760643A (zh) | 一种提高枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法 | |
| DE102013219016A1 (de) | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Gamma-Glutamylcystein und Derivaten dieses Dipeptids |