ES2573980T3 - Materiales y métodos para la producción eficaz de ácido láctico - Google Patents

Abstract

Ácido láctico genéticamente modificado que produce E. coli, que comprende las modificaciones siguientes: a) inactivación o deleción del gen de acetato-cinasa (ackA); b) inactivación o deleción de un gen de fumarato reductasa (frdBC); c) inactivación o deleción del gen de piruvato-formato liasa (pflB); d) inactivación o deleción del gen de alcohol deshidrogenasa (adhE); y e) inactivación o deleción del gen de metilglioxal sintasa (mgsA).

Description

DESCRIPCIÓN

(SEC ID Nº: 37)

Materiales y métodos para la producción eficaz de ácido láctico

(SEC ID Nº 41)

Antecedentes de la invención 5

[0001] El ácido láctico se usa comúnmente como un aditivo alimenticio para la conservación, sabor, y acidez.

El ácido láctico también se usa en la producción de plástico biodegradable, es decir ácido poliláctico (PLA).

El uso de PLA como una alternativa renovable a los productos a base de petróleo se está extendiendo rápidamente (Agrawal, 2003). 10

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Las propiedades físicas y el índice de degradación biológica del PLA se pueden controlar mediante ka manipulación de la proporción de los sustratos quirales, el ácido D-láctico y el ácido L-láctico (Narayanan et al., 2004).

Se estima que el mercado globalde ácido láctico tiene un excedente de 100.000 toneladas por año y está previsto que aumente considerablemente en los siguiente años a medida que las nuevas fábricas de PLA se vuelven operativas. 15

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[0002] Por ejemplo, se espera que la demanda del solvente biodegradable lactato de etilo (un derivado del ácido láctico) aumentará considerablemente en un futuro cercano.

Se ha estimado que los ésteres de lactato potencialmente podrían reemplazar tanto como el 80% de las 3,8 millones de toneladas de solventes que se usan cada año en EEUU. Este solvente no es tóxico y tienen muchas aplicaciones 20 útiles, incluyendo en la fabricación electrónica, en pinturas y recubrimientos, en tejidos, limpiadores y desengrasantes, adhesivos, impresión, y destintado.

[0003] Los métodos fermentativos para la producción de ácido láctico a menudo se prefieren a la síntesis química, que produce una mezcla de isómeros D y L. 25

Los productos de fermentaciones microbiológicas dependen del organismo usado.

La fermentación microbiológica puede producir una mezcla de los dos isómeros o ácido láctico ópticamente puro en una forma esteroespecífica.

La estereoespecificidad deseada del producto depende del uso previsto.

30

[0004] Las fermentaciones bacterianas con lactobacilos son comunes para producción industrial de ácido láctico, pero estas fermentaciones raramente producen un producto ópticamente puro.

Adicionalmente, la naturaleza exigente de estas bacterias requiere que se añadan cantidades considerables de nutrientes adicionales al medio de cultivo, lo que suma costes adicionales y hace la purificación más difícil.

Además, los métodos de fermentación para producir ácido láctico son altamente ineficientes y deben ser mejorados 35 para asegurar la viabilidad económica de las expansiones de mercado previstas anteriormente mencionadas.

[0005] Las levaduras no son capaces de producir niveles apreciables de ácido láctico, aunque se han descrito cepas de Saccharomyces cerevisiae recombinantes que contienen el gen de la LDH de orígenes Lactobacillus o bovinos (Patente WO 99/14335 y Adachi et al., 1998). 40

A la vez que son capaces de producir hasta 2-4% ácido láctico de (p/v), estas cepas presentan una baja productividad y una parte significativa de la glucosa se convierte en etanol.

[0006] El hongo filamentoso Rhizopus oryzae (sin. R. Arrhizus) también se usa para la producción industrial de ácido láctico. 45

R. Oryzae es capaz de convertir aeróbicamente la glucosa, en un medio químicamente definido, en grandes cantidades de ácido L-(+)-láctico ópticamente puro.

La investigación sobre la producción de ácido láctico por Rhizopus ha continuo principalmente debido a la facilidad de purificación del producto en un medio de cultivo mínimo y a la capacidad del hongo para utilizar tanto carbohidratos complejos como azúcares de pentosa (Patente de EEUU nº 4,963,486). 50

Esto permite que el hongo sea utilizado para la conversión de biomasa agrícola de bajo valor en ácido láctico.

Desafortunadamente, la capacidad para modificar la producción de ácido láctico por modificación genética en Rhisopus y otros hongos ha sido limitada.

[0007] Se han diseñado biocatalizadores basados en Escherichia coli K-12 para la producción de D-(-)-lactato, pero 55 fueron incapaces de fermentar un 10% de glucosa o sacarosa completamente en un medio complejo o mínimo (Chang et al., 1999; Dien et al., 2001; Zhou et al., 2003; Zhu y Shimizu 2004).

[0008] Uno de los biocatalizadores de E. coli, SZ63 (pLOI3501), fue desarrollado para la fermentación de sacarosa mediante la expresión funcional de los genes cscR' cscA' cscKB' de E. coli B en un plásmido (Shukla et al. 2004). 60

Aunque fue capaz de realizar una fermentación eficaz de un 5% de glucosa o sacarosa, concentraciones de azúcar más elevadas fueron metabolizadas de forma incompleta por este biocatalizador y fue necesaria una selección antibiótica continua para el mantenimiento plasmídico.

[0009] Otros biocatalizadores derivados de la cepa B de E. coli, como por ejemplo K011 (Depósito nº ATCC 55124), 65 tienen la capacidad nativa para fermentar sacarosa (Moniruzzaman et al., 1997). Como con la cepa SZ63, las

concentraciones de azúcar más elevadas son metabolizadas de forma incompleta por este biocatalista, y es necesaria una selección antibiótica continua para el mantenimiento plasmídico.

[0010] Por consiguiente, todavía existe una necesidad de biocatalizadores de ácido láctico mejorados con mayores índices de fermentación, título de producto, y rendimientos para reducir los costes asociados a la producción de 5 base biológica de productos químicos comerciales (Arntzen et al., 1999; Chotani et al., 2000; Datta et al., 1995; Hofvendahl y Hahn-Hagerdal, 2000; y Ohara et al., 2001).

Breve resumen de la invención

10

[0011] La presente invención proporciona microorganismos nuevos tal y como se define en la reivindicación 1 anexa a esta descripción, que son útiles en la producción de ácido láctico.

Adicionalmente, la presente invención proporciona nuevos constructos para usar en la transfomación de Escherichia coli, para expresar y/o suprimir ciertos genes para producir ácido láctico cuando el organismo huésped se cultiva en un medio fermentable. 15

Por consiguiente, los materiales y métodos de la presente invención pueden utilizarse para mejorar la producción de ácido láctico en Escherichia coli, proporcionando así un suministro aumentado de ácido láctico para usar en el alimento y aplicaciones industriales.

[0012] En formas de realización determinadas, se construyen derivados de Escherichia coli etanologénica (también 20 denominada en este documento como E. coli) K011 para la producción de D-(-)-lactato.

En otras formas de realización de la invención, se modifican genéticamente E. coli conforme a la presente invención para la producción de L-(+)-lactato.

[0013] Conforme a la presente invención, los nuevos biocatalizadores basados en E. coli K011 se preparan 25 eliminando los genes que codifican vías rivales seguido de una selección basada en el crecimiento para mutantes con rendimiento mejorado para la fermentación de glucosa y/o sacarosa.

[0014] Los microbios genéticamente modificados de la invención preferiblemente contienen genes nativos para la utilización de sacarosa. 30

Determinadas cepas de E. coli genéticamente modificadas de la invención pueden fermentar un 10% de glucosa o sacarosa para producirmás de 1 mol de D-(-)-lactato/1 caldo de fermentación, con rendimientos basados en azúcar metabolizado que varían de aproximadamente un 88% a aproximadamente un 95%, dependiendo del caldo de fermentación.

Otras cepas de E. coli modificadas genéticamente de la invención pueden fermentar glucosa o sacarosa para 35 producir L-(+)-lactato.

[0015] Otras ventajas adicionales de esta invención serán aparentes con la descripción que sigue.

Breve descripción de las figuras 40

[0016]

Las figuras 1A-1F ilustran gráficamente la diferencia de actividad entre una forma de realización de la invención en comparación con la cepa SZ63.

Las figuras 2A-2D ilustran el progreso de la producción de ácido láctico de varias formas de realización de la 45 invención en condiciones de fermentación en un medio de sales minerales NBS.

Las figuras 3A-3B ilustran la capacidad de la betaína para aumentar la tolerancia al ácido y al azúcar durante la producción de ácido láctico de una forma de realización de la invención.

Las figuras 4A-4B ilustran la capacidad de una forma de realización de la invención para aclimatarse a medios minerales. 50

Las figuras 5A-5G ilustran el progreso de la producción de ácido láctico de otra forma de realización de la invención en varias condiciones de fermentación.

Breve descripción de las secuencias

55

[0017]

SEC ID Nº: 1 es la secuencia de nucleótidos para un cebador sentido para la eliminación de frdBC.

SEC ID Nº: 2 es la secuencia de nucleótidos para un cebador antisentido para la eliminación de frdBC.

SEC ID Nº: 3 es la secuencia de nucleótidos para un cebador sentido para la eliminación de adhE.

SEC ID Nº: 4 es la secuencia de nucleótidos para un cebador antisentido para la eliminación de adhE. 60

SEC ID Nº: 5 es la secuencia de nucleótidos para un cebador sentido para la eliminación de celY.

SEC ID Nº: 6 es la secuencia de nucleótidos para un cebador antisentido para la eliminación de celY.

SEC ID Nº: 7 es la secuencia de nucleótidos para un cebador sentido para la eliminación de mgsA.

SEC ID Nº: 8 es la secuencia de nucleótidos para un cebador antisentido para la eliminación de mgsA.

SEC ID Nº: 9 es la secuencia de nucleótidos para un cebador sentido para la amplificación de FRT-cat-65 sacB.

SEC ID Nº: 10 es la secuencia de nucleótidos para un cebador antisentido para la amplificación de FRT-cat-sacB.

SEC ID Nº: 11 es la secuencia de nucleótidos para un cebador sentido para la amplificación de cat-sacB con sitio Nhel 5'.

SEC ID Nº: 12 es la secuencia de nucleótidos para un cebador antisentido para la amplificación de cat-sacB 5 con sitio Nhel 5'.

SEC ID Nº: 13 es la secuencia de nucleótidos para un cebador sentido para la clonación de frdABCD.

SEC ID Nº: 14 es la secuencia de nucleótidos para un cebador antisentido para la clonación de frdABCD.

SEC ID Nº: 15 es la secuencia de nucleótidos para un cebador sentido para la clonación de ackA.

SEC ID Nº: 16 es la secuencia de nucleótidos para un cebador antisentido para la clonación de ackA. 10

SEC ID Nº: 17 es la secuencia de nucleótidos para un cebador sentido para la clonación de lacZ-cynX.

SEC ID Nº: 18 es la secuencia de nucleótidos para un cebador antisentido para la clonación de lacZ-cynX.

SEC ID Nº: 19 es la secuencia de nucleótidos para un cebador sentido para la clonación de mgsA.

SEC ID Nº: 20 es la secuencia de nucleótidos para un cebador antisentido para la clonación de mgsA.

SEC ID Nº: 21 es la secuencia de nucleótidos para un cebador sentido para la clonación de focA-pflB. 15

SEC ID Nº: 22 es la secuencia de nucleótidos para un cebador antisentido para la clonación de focA-pflB.

SEC ID Nº: 23 es la secuencia de nucleótidos para un cebador sentido para la clonación de adhE.

SEC ID Nº: 24 es la secuencia de nucleótidos para un cebador antisentido para la clonación de adhE.

SEC ID Nº: 25 es la secuencia de nucleótidos para un cebador sentido para eliminar frdBC.

SEC ID Nº: 26 es la secuencia de nucleótidos para un cebador antisentido para eliminar frdBC. 20

SEC ID Nº: 27 es la secuencia de nucleótidos para un cebador sentido para eliminar ackA.

SEC ID Nº: 28 es la secuencia de nucleótidos para un cebador antisentido para eliminar ackA.

SEC ID Nº: 29 es la secuencia de nucleótidos para un cebador antisentido lacZ con sitio NheI 5'.

SEC ID Nº: 30 es la secuencia de nucleótidos para un cebador cynX antisentido con sitio NheI 5'.

SEC ID Nº: 31 es la secuencia de nucleótidos para un cebador sentido para eliminar mgsA. 25

SEC ID Nº: 32 es la secuencia de nucleótidos para un cebador antisentido para eliminar mgsA.

SEC ID Nº: 33 es la secuencia de nucleótidos para un cebador sentido para eliminar focA-pflB.

SEC ID Nº: 34 es la secuencia de nucleótidos para un cebador antisentido para eliminar focA-pflB.

SEC ID Nº: 35 es la secuencia de nucleótidos para un cebador sentido para eliminar adhE.

SEC ID Nº: 36 es la secuencia de nucleótidos para un cebador antisentido para eliminar adhE. 30

SEC ID Nº: 37-46 representan la secuencia parcial de las regiones genéticas en las que se eliminaron cicatrices FRT. Las secuencias parciales de las regiones 5' y 3' del/de los gen(es) se muestran en negrita, la cursiva se utiliza para designar la cicatriz FRT y la región subrayada fue eliminada en la cepa TG128.

Descripción detallada de la invención 35

[0018] La presente invención proporciona microorganismos nuevos que son capaces de producir ácido láctico cuando se cultivan en una variedad de condiciones de fermentación.

La presente invención también proporciona métodos para modificar genéticamente tales microorganismos, así como métodos para producir de forma eficaz y estable ácido láctico utilizando los microbios nuevos de la invención, de 40 modo que se proporciona una producción elevada de ácido láctico a partir de productos crudos relativamente económicos tales como glucosa o sacarosa.

[0019] El término "ácido láctico" en esta solicitud se refiere al ácido 2-hidroxipropanoico ya sea en forma libre o en forma de sal. 45

A la forma de sal del ácido láctico se hace referencia como "lactato" independientemente del agente de neutralización, es decir, carbonato cálcico o hidróxido amónico.

Tal y como se hace referencia a él en este documento, el ácido láctico puede referirse a cualquiera de las formas estereoisoméricas del ácido láctico ácido (L-(+)-láctico o ácido D-(-)-láctico).

El término lactato puede referirse a cualquiera de las formas estereoisoméricas del lactato L-(+)-lactato o D-(-)-50 lactato).

La presente invención proporciona microbios que producen un único estereoisómero de ácido láctico o lactato.

El estereoisómero de ácido láctico o estereoisómero de lactato que se produce conforme a algunos aspectos de esta invención es "quiralmente puro".

La frase "quiralmente puro" indica que no hay contaminación detectable de una forma estereoisomérica de ácido 55 láctico o lactato con la otra forma estereoisomérica (la pureza quiral del estereoisómero específico es al menos, mayor de (o mayor de o igual a) 99,9%). Los microorganismos genéticamente modificados que se describen aquí a los que se les ha eliminado o desactivado la vía metilglioxal (mgsA) son capaces de producir ácido D-(-)-láctico o ácido L-(+)-láctico "quiralmente puro".

60

[0020] Para ciertas formas de realización de la invención, el ácido L-(+)-láctico se produce utilizando los microbios moidificados genéticamente de la invención.

En otras formas de realización de la invención, el ácido D-(-)-láctico se produce utilizando los microbios modificados genéticamente de la invención.

65

[0021] En una forma de realización, la invención usa Escherichia coli (o E. coli) como un biocatalizador para la

conversión mejorada de glucosa y/o sacarosa en ácido láctico.

Conforme a la presente invención, el metabolismo de un microorganismo se puede modificar por introducción y expresión de varios genes.

Conforme a la presente invención, varios plásmidos nuevos se pueden introducir en E. coli de modo que el microorganismo transformado pueda producir grandes cantidades de ácido láctico en varias condiciones de 5 fermentación.

Las E. coli recombinantes de la invención preferiblemente están modificadas de modo que el ácido láctico se produce de forma estable con un rendimiento elevado cuando se cultiva en un medio que comprende glucosa y/o sacarosa.

10

[0022] Huéspedes de E. coli que contienen los plásmidos de la presente invención fueron depositados en la Agricultural Research Service Culture Collection (Colección de cultivos del servicio de investigación agrícola de EEUU) , 1815 N. University Street, Peoria, Ilinois, 61604 E.E.U.U.. Los números de registro y fechas de depósito son los siguientes:

15

Cultivo

Número de registro Fecha de depósito

SZ132

NRRL B-30861 3 de agosto de 2005

SZ186

NRRL B-30862 3 de agosto de 2005

SZ194

NRRL B-30863 3 de agosto de 2005

TG103

NRRL B-30864 9 de agosto de 2005

TG102

NRRL B-30921 5 de mayo de 2006

TG105

NRRL B-30922 5 de mayo de 2006

TG106

NRRL B-30923 5 de mayo de 2006

TG107

NRRL B-30924 5 de mayo de 2006

TG108

NRRL B-30925 5 de mayo de 2006

TG112

NRRL B-30926 5 de mayo de 2006

TG113

NRRL B-30927 5 de mayo de 2006

TG114

NRRL B-30928 5 de mayo de 2006

TG128

NRRL B-30962 25 de julio de 2006

TG129

NRRL B-30963 25 de julio de 2006

TG130

NRRL B-30964 25 de julio de 2006

[0023] Los cultivos en cuestión han sido depositados en condiciones que aseguran que el acceso a los cultivos estará disponible durante el tiempo en que esta solicitud de patente esté pendiente a quien determine el comisario de patentes y marcas registradas que está autorizado a ello según 37 CFR 1.14 (artículo 1.14 del título 37 del código de reglamentos federales de EE.UU. o Code of Federal Regulations) y 35 USC 122 (artículo 122 del título 25 del 20 Código de EE.UU. o US Code).

Los depósitos están disponibles según requieran las leyes de patentes extranjeras en países donde se presenten solicitudes homólogas a la presente solicitud, o derivadas.

Sin embargo, se debe entender que la disponibilidad de los depósitos no constituye una licencia para poner en práctica la presente invención en derogación de los derechos de patente concedidos por acción gubernamental. 25

[0024] Además, los presentes depósitos de cultivos serán almacenados y puestos a disposición del público en conformidad con las disposiciones del Tratado de Budapest para el depósito de microorganismos, es decir, serán almacenados con todas las precauciones necesarias para mantenerlos viables y no contaminados durante un periodo de al menos cinco años después de la solicitud más reciente de suministro de una muestra de los depósitos 30 y, en cualquier caso, durante un periodo de al menos 30 (treinta) años después de la fecha de depósito o durante la vida ejecutable de cualquier patente que pueda incluir la divulgación de los cultivos.

El depositante reconoce el deber de reemplazar los depósitos en caso de que el depósito no poder proporcionar una muestra cuando se solicite, debido al estado de los depósitos.

Toda restricción acerca de la disponibilidad al público de los presentes depósitos de cultivos será eliminada 35 irrevocablemente al concederse una patente que los divulgue.

[0025] Una forma de realización de la presente invención proporciona una cepa de E. coli B ("SZ132"; Nº de depósito: NRRL B-30861) que está modificada genéticamente para mejorar el crecimiento celular y la producción de lactato en varios medios. 40

En una forma de realización, la cepa SZ132 se puede construir para producir D-lactato (ácido láctico) a través de los pasos siguientes:

(a) construir la cepa LY52 de E. coli K011 integrando los genes casAB de Klebsiella oxytoca (nº de depósito ATCC 68564) para la utilización de celobiosa detrás del codón de terminación de lacY e integrando la endoglucanasa que codifica el gen ceIY de Erwinia chysanthem (nº de depósito ATCC 55124) en el gen frdA 45 (Ohta et al., 1991; Moniruzzaman et al., 1997; Zhou e Ingram, 1999);

(b) transducir secuencialmente en LY52 de determinadas mutaciones en E. coli K-12 (cepa W3110), que fueron usadas para la construcción de la cepa SZ63 (Zhou et al., 2003);

(c) eliminar los genes de Z. mobilis para la producción de etanol mediante transducción con P1 de la supresión de ΔfocA-pflB de la cepa SZ31 (cepa W3110); 50

(d) inactivar la producción de alcohol deshidrogenasa de E. coli nativa mediante transducción con P1 de la mutación de adhE de la cepa TC20 (Zhou et al., 2003);

(e) delecionar la acetato-cinasa (ackA) utilizando la mutación de la cepa SZ61 (cepa W3110) (Zhou et al., 2003);

(f) eliminar los genes antibióticos, que fueron usados para la selección, por recombinasa FLP (Zhou et al., 2003); y 5

(g) durante la eliminación de los genes antibióticos del paso (f), delecionar un segmento interno de casAB (o eliminación de un segmento interno del gen casAB después del paso de eliminación de genes antibióticos).

[0026] Las formas de realización relacionadas de la invención implican también la transformación de la cepa SZ132 para eliminar todos genes foráneos. 10

En una forma de realización, los genes casAB de Klebsiella oxytoca y celY de Erwinia chrysanthemi fueron eliminados de la cepa SZ132 por recombinación homóloga utilizando ADN lineal; luego, se usó recombinasa FLP para eliminar los genes antibióticos usados durante la construcción de la cepa SZ132.

La cepa resultante, SZ186 (Nº de depósito NRRL B-30862), sólo contiene genes de E. coli nativos.

15

[0027] Otra forma de realización de la presente invención proporciona una cepa de E. coli B ("TG103") que está modificada genéticamente para mejorar el crecimiento celular y la producción del isómero L de ácido láctico en varios medios.

En una forma de realización, la cepa TG103 se puede construir mediante los pasos siguientes:

(a) modificar genéticamente la cepa SZ186 utilizando métodos como los descritos en este documento; 20

(b) someter la cepa SZ186 a un cultivo en serie para seleccionar para un crecimiento aumentado y/o producción de ácido láctico aumentada, donde las cepas seleccionadas son la cepa SZ194;

(c) integrar un gen de ácido L-láctico heterólogo y marcador de canamicina en el gen ldhA nativo (D-lactato-deshidrogenasa) de SZ194 y delecionar la parte central de la región de codificación para producir TG101;

(d) eliminar genes antibióticos mediante recombinasa FLP para producir TG102 y 25

(e) someter la cepa TG102 a transferencia en serie durante varios días (por ejemplo, aproximadamente de 7 a 21 días, preferiblemente hasta 13 días), con una dilución de 1:100 de caldo de cultivo previamente inoculado cada día y seleccionae cepas que demuestren un crecimiento mejorado y/o una producción de ácido L-láctico aumentada, donde las cepas seleccionadas son TG103.

30

[0028] Según ciertas formas de realización de la presente invención, el crecimiento aumentado y la producción de ácido láctico aumentado están relacionados.

El proceso de coselección para las cepas con un crecimiento y una producción de ácido láctico mejorados se denomina "Evolución Metabólica". Algunas formas de realización determinadas de la invención también proporcionan la inactivación o deleción de ciertos genes en los organismos genéticamente modificados 35 proporcionados por esta solicitud.

En un aspecto de la invención, los genes se delecionan para inactivar la actividad deseada.

Las deleciones proporcionan una estabilidad máxima porque no hay oportunidad de que se produzca una mutación inversa para recuperar la función.

De forma alternativa, los genes se pueden inactivar por inserción de secuencias de ácidos nucleicos que 40 interrumpen la función y/o expresión del gen (por ejemplo, transducción con P1 u otros métodos conocidos en la técnica).

La inactivación o deleción de una o varias secuencias de polinucleótidos particulares como se discute en la presente solicitud también pueden denominarse "modificaciones" genéticas.

45

[0029] El vector usado para introducir genes específicos en un microorganismo huésped puede ser cualquier vector que pueda replicarse en el microorganismo huésped.

Los vectores de la presente invención pueden ser operables como vectores de clonación o vectores de expresión en la célula huésped seleccionada. Numerosos vectores resultan conocidos a profesionales expertos en la técnica, y la selección de un vector y célula huésped apropiados es cuestión de elección. 50

Los vectores pueden, por ejemplo, ser bacteriófagos, plásmidos, virus o híbridos de los mismos, tales como los descritos en Maniatis et al., 1989; Ausubel et al., 1995; Miller, J.H., 1992; Sambrook y Russell, 2001.

Además, los vectores de la invención pueden ser vectores de fusión o no.

[0030] Dentro de cada vector específico, se pueden seleccionar varios sitios para la inserción de una secuencia de 55 nucleótidos de interés.

Estos sitios son normalmente designados por la enzima de restricción o endonucleasa que los corta.

El vector se puede digerir con una enzima de restricción que coincide con la secuencia terminal del gen y las secuencias pueden ser ligadas.

El ligamiento se logra normalmente usando una ligasa tal como T4 ADN-ligasa. 60

[0031] El sitio particular elegido para la inserción del fragmento de nucleótido seleccionado en el vector para formar un vector recombinante se determina por una variedad de factores.

Éstos incluyen el tamaño y la estructura del polipéptido que se va a expresar, la susceptibilidad del polipéptido deseado a la degradación enzimática por los componentes de la célula huésped y la contaminación por sus 65 proteínas, características de expresión como la ubicación de los codones de inicio y los codones de terminación, y

otros factores reconocidos por los expertos en la técnica. Ninguno de estos factores por sí mismo controla absolutamente la elección del sitio de inserción para un polipéptido concreto.

Más bien, el sitio elegido refleja un equilibrio de estos factores, y no todos los sitios pueden ser igualmente eficaces para una proteína dada.

5

[0032] Se pueden emplear una variedad de sistemas de expresión vector-huésped al poner en práctica la presente invención.

Las cepas de bacterias, tales como E. coli, son particularmente útiles para la producción de ácido láctico en la práctica de la invención.

Sin embargo, la invención nueva aquí descrita se puede aplicar con numerosos huéspedes que serían deseables 10 para varios esquemas de producción de ácido láctico.

Las cepas huéspedes pueden ser de origen bacteriano, fúngico o levaduras.

Los factores que se pueden tener en cuenta al seleccionar las cepas huésped incluyen el rango de sustratos, vigor, tolerancia al azúcar, tolerancia a la sal, tolerancia de temperatura, tolerancia de pH, y tolerancia al lactato.

Constatar el sistema de huesped-vector más apropiado es tá dentro de los conocimientos del experto en la técnica. 15

[0033] Previamente se han descrito métodos para las deleciones cromosómicas, integración, y genes de resistencia a antibióticos desmontables (Causey et al., 2004; Datsenko y Wanner, 2000; Martinez-Morales et al., 1999; Zhou et al., 2003).

Cualquier método o combinación de tales métodos conocidos se puede emplear al poner en práctica la presente 20 invención.

[0034] Como promotor para la expresión del/de los gen(es) que se van a presentar en el microorganismo huésped (por ejemplo, genes casAB de K. oxytoca o celY de E. chrysanthemi), cuando un promotor específico para el gen funciona en células huésped, este promotor se puede usar. 25

Alternativamente, también es posible enlazar un promotor foráneo a un ADN que codifica el gen para obtener la expresión bajo el control del promotor.

Como tal promotor, cuando una bacteria de Escherichia se usa como huésped, promotor lac, promotor trp, promotor trc, promotor tac, promotor PR y promotor PL de fago lambda, promotor tet, promotor amyE, promotor spac, etc pueden ser usados. 30

Además, también es posible a usar un vector de expresión que contiene un promotor como pUC19, e insertar un fragmento de ADN, que codifica por ejemplo casAB de K. oxytoca, en el vector de modo que el fragmento se puede expresar bajo el control del promotor.

[0035] Métodos para la preparación de ADN cromosómico, PCR, la preparación de ADN plasmídico, la digestión y 35 ligamiento de ADN, la transformación, el diseño y la síntesis de oligonucleótidos usados como cebadores, etc pueden ser habituales y bien conocidos por los expertos en la técnica. Tales métodos son descritos en, por ejemplo, Seambrook, J. et al. (1989), etcétera.

[0036] El ácido láctico se puede producir permitiendo que un microorganismo transformado, como se ha descrito 40 anteriormente, convierta glucosa y/o sacarosa en ácido láctico, y recogiendo el ácido láctico producido.

En un aspecto de la invención, se puede producir ácido láctico a niveles superiores a 0,5M cuando se cultivan organismos transformados en uno o más medios de sales minerales, tales como un medio de sales minerales NBS.

[0037] Los vectores de la invención se pueden replicar autónomamente o integrar en el genoma del huésped. 45

La integración ocurre típicamente por recombinación homóloga (por ejemplo, integración de un marcador seleccionable de arginina en el gen de arginina cromosómico) o en un sitio cromosómico no relacionado con ningún gen del vector.

La integración puede ocurrir por un evento o bien único o bien doble de cruce.

También es posible que cualquier número de estos tipos de integración y de replicación ocurran en el mismo 50 microorganismo construido.

[0038] En determinadas formas de realización, el cultivo de los microorganismos modificados genéticamente de la invención se realiza en condiciones aeróbicas a lo largo de aproximadamente 0,5 a 240 horas.

La temperatura de cultivo está preferiblemente controlada en alrededor de 25°C a 45°C, y el pH está preferiblemente 55 controlado a 5-8 durante el cultivo.

El ácido inorgánico u orgánico, o sustancias alcalinas así como gas de amoníaco o similares se pueden usar para el ajuste del pH.

[0039] El microorganismo de la presente invención puede ser obtenido por transfomación de una bacteria de 60 Escherichia para expresar ciertas enzimas útiles en la producción de ácido láctico.

En una forma de realización preferida, una bacteria de Escherichia que se puede usar en la presente invención es Escherichia coli.

Otras divulgaciones incluyen, pero de forma no limitativa, Gluconobacter oxydans, Gluconobacter asaii, Achromobacter delmarvae, Achromobacter viscosus, Achromobacter lacticum, Agrobacterium tumefaciens, 65 Agrobacterium radiobacter, Alcaligenes faecalis, Arthrobacter citreus, Arthrobacter tumescens, Arthrobacter

paraffineus, Arthrobacter hydrocarboglutamicus, Arthrobacter oxydans, Aureobacterium saperdae, Azotobacter indicus, Brevibacterium ammoniagenes, divaricatum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium globosum, Brevibacterium fuscum, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium helcolum, Brevibacterium pusillum, Brevibacterium testaceum, Brevibacterium roseum, Brevibacterium immariophilium, Brevibacterium linens, Brevibacterium protopharmiae, Corynebacterium acetophilum, Corynebacterium glutamicum, 5 Corynebacterium callunae, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Enterobacter aerogenes, Erwinia amylovora, Erwinia carotovora, Erwinia herbicola, Erwinia chrysanthemi, Flavobacterium peregrinum, Flavobacterium fucatum, Flavobacterium aurantinum, Flavobacterium rhenanum, Flavobacterium sewanense, Flavobacterium breve, Flavobacterium meningosepticum, la especie de Micrococcus CCM825, Morganella morganii, Nocardia opaca, Nocardia rugosa, Planococcus eucinatus, Proteus rettgeri, Propionibacterium 10 shermanii, Pseudomonas synxantha, Pseudomonas azotoformans, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas ovalis, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas acidovolans, Pseudomonas mucidolens, Pseudomonas testosteroni, Pseudomonas aeruginosa, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus rhodochrous, la especie de Rhodococcus ATCC 15592, la especie de Rhodococcus ATCC 19070, Sporosarcina ureae, Staphylococcus aureus, Vibrio metschnikovii, Vibrio tyrogenes, Actinomadura madurae, Actinomyces violaceochromogenes, Kitasatosporia parulosa, 15 Streptomyces coelicolor, Streptomyces flavelus, Streptomyces griseolus, Streptomyces lividans, Streptomyces olivaceus, Streptomyces tanashiensis, Streptomyces virginiae, Streptomyces antibioticus, Streptomyces cacaoi, Streptomyces lavendulae, Streptomyces viridochromogenes, Aeromonas salmonicida, Bacillus pumilus, Bacillus circulans, Bacillus thiaminolyticus, Escherichia freundii, Microbacterium ammoniaphilum, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium, Salmonella schottmulleri, Xanthomonas citri, etcétera. 20

[0040] El ácido láctico se puede producir en una mezcla de reacción al ponerse en contacto con un cultivo que contiene microorganismos transformados preparados conforme a la presente invención con sacarosa y/o glucosa.

En otras formas de realización de la invención, las células se separan y se recogen de un cultivo de microorganismos transformados; células de microorganismos transformados procesadas sometidas a un tratamiento 25 de acetona o liofilización; un extracto libre de células preparado de tales células de microorganismos transformados o células procesadas; fracciones tales como fracciones de membrana divididas de tal extracto libre de células; o materiales inmovilizados se pueden producir inmovilizando células de microorganismos transformados, células procesadas, extracto y fracciones libres de células, cualquiera de ellos puesto en contacto de forma independiente o en combinación con sacarosa y/o glucosa para producir ácido láctico. 30

El microorganismo puede consistir en un tipo de microorganismo, o se puede usar como una mezcla arbitraria de dos o más tipos de microorganismos.

[0041] Los parámetros de fermentación son dependientes del tipo de organismo huésped usado para la producción de la enzima recombinante. 35

El medio de cultivo puede ser mínimo/definido o completo/complejo.

Las fuentes de carbono fermentables podrían incluir azúcares de hexosa y pentosa, almidón, celulosa, xilano, oligosacáridos, y combinaciones de los mismos.

Una forma de medios de cultivo que se pueden usar conforme a la presente invención incluye caldo de Luria-Bertani (LB) modificado (con 10 g de triptona Difco, 5 g de extracto de levadura Difco, y 5 g de cloruro sódico por litro) como 40 lo describe Miller J.H. (1992).

En otras formas de realización de la invención, los cultivos de cepas construidos de la invención se pueden cultivar en un medio de sales minerales NBS (como descrito por Causey et al., 2004) y suplementado con 2% a 20% (p/v) de azúcar o bien 5% o 10% de azúcar (glucosa o sacarosa).

Los microorganismos se pueden cultivar en o sobre un medio de sales minerales NBS. 45

El medio de sales minerales NBS comprende, consiste esencialmente en, o consiste en los componentes siguientes (por litro): 3,5 g de KH2PO4; 5,0 g de K2HPO4; 3,5 g de (NH4)2HPO4; 0,25 g de MgSO4·7 H2O; 15 mg de CaCl2·2 H2O; 0,5 mg de tiamina; y 1 ml de caldo de metales traza, glucosa (por ejemplo, 2% en placas o 3% en el caldo), y 1,5% de agar (para placas).

El caldo de metales traza se prepara en 0,1 M de HCl y comprende, consiste esencialmente en o consiste en (por 50 litro): 1,6 g de FeCl3; 0,2 g de CoCl2·6 H2O; 0,1 g de CuCl2; 0,2 g de ZnCl2·4 H2O; 0,2 g de NaMoO4; 0,05 g de H3BO3. Se puede añadir ácido 4-Morfolinopropanesulfónico (0,1 M, pH 7,1) tanto a medios líquidos como a sólidos (esterilizados por filtro) cuando se necesite para el control del pH (y está opcionalmente incluido en el medio usado para fermentaciones de 10 litros).

El medio mínimo también puede ser preparado usando succinato (1 g·liter-1) como única fuente de carbono (sustrato 55 no fermentable) y se puede añadir como un suplemento al medio mínimo de glucosa cuando se necesite.

En determinadas formas de realización, se pueden incluir antibióticos como se necesite para la construcción de la cepa.

[0042] El crecimiento y la producción del lactato se pueden realizar en fermentaciones por lotes normales, 60 fermentaciones por lotes alimentados o fermentaciones continuas.

En determinadas formas de realización, es deseable realizar fermentaciones en condiciones de oxígeno reducido o condiciones anaeróbicas para ciertos huéspedes.

En otras formas de realización, la producción de lactato se puede realizar con oxígeno; y, opcionalmente con el uso de fermentadores de levantamiento por aire o equivalentes. 65

[0043] El pH de la fermentación debería ser lo suficientemente alto suficiente para permitir el cultivo y la producción de lactato por el huésped.

El ajuste del pH del caldo de fermentación se puede realizar utilizando agentes de neutralizado tales como carbonato cálcico o hidróxidos.

Alternativamente, el ácido láctico se puede eliminar continuamente durante la fermentación utilizando métodos tales 5 como la tecnología de membrana, la electrodiálisis, extracción con solvente, y las resinas absorbentes.

La selección e incorporación de cualquiera de los métodos fermentativos anteriores depende en gran medida de la cepa huésped y del proceso terminal preferido.

[0044] Varias divulgaciones incluyen: 10

1. Una cepa de E. coli genéticamente modificada que comprende las siguientes modificaciones genéticas a la cepa KO11 de E. coli (ATCC 55124): a) inserción del gen casAB de Klebsiella oxytoca detrás del codón de terminación de lacY; b) integración del gen celY de Erwinia chrysanthemi en el gen frdA; c) inactivación o deleción de focA-Z. Mobilis pdc-adhB-pflB; d) inactivación o deleción del gen de alcohol deshidrogenasa de E. 15 coli nativo; y e) inactivación o deleción del gen de acetato-cinasa (ackA) ;

2. La cepa de E. coli genéticamente modificada según la forma de realización 1, donde dicha cepa de E. coli genéticamente modificada comprende además genes de resistencia a antibióticos inactivados o delecionados;

3. La cepa de E. coli genéticamente modificada según la forma de realización 1, donde el gen casAB de Klebsiella oxytoca y el gen celY de Erwinia chrysanthemi son inactivados o delecionados en dicha cepa de E. coli 20 genéticamente modificada después de la inserción;

4. La cepa de E. coli genéticamente modificada según la forma de realización 2, donde el gen casAB de Klebsiella oxytoca y el gen celY de Erwinia chrysanthemi son inactivados o eliminados en dicha cepa de E. coli genéticamente modificada después de la inserción;

5. La cepa de E. coli genéticamente modificada según la forma de realización 2, donde dicha cepa de E. coli 25 genéticamente modificada es metabólicamente desarrollada;

6. La cepa de E. coli genéticamente modificada según la forma de realización 1 o la forma de realización 3, donde dicha cepa de E. coli genéticamente modificada es metabólicamente desarrollada;

7. La cepa de E. coli genéticamente modificada según la forma de realización 4, donde dicha cepa de E. coli genéticamente modificada es metabólicamente desarrollada; 30

8. La cepa de E. coli genéticamente modificada según las formas de realización 1, 2, 3, 4, 5, 6, o 7, donde los genes antibióticos se eliminan con recombinasa FLP;

9. La cepa de E. coli genéticamente modificada según la forma de realización 7, donde dicha cepa de E. coli genéticamente modificada es SZ186;

10. La cepa de E. coli genéticamente modificada según la forma de realización 5, donde dicha cepa de E. coli 35 genéticamente modificada es SZ132;

11. La cepa de E. coli genéticamente modificada según la forma de realización 1, 2, 3, 4 o 5, donde el gen mgsA de dicha cepa es inactivad o delecionado en dicha cepa de E. coli genéticamente modificada;

12. Una cepa de E. coli genéticamente modificada que comprende la cepa de E. coli SZ194 (NRRL B30863) donde el gen mgsA ha sido inactivado o delecionado; 40

13. La cepa de E. coli genéticamente modificada según la forma de realización 12, donde dicha cepa de E. coli genéticamente modificada es metabólicamente desarrollada;

14. La cepa de E. coli genéticamente modificada según la forma de realización 13, donde dicha cepa de E. coli genéticamente modificada es TG112, TG113 o TG114;

15. La cepa de E. coli genéticamente modificada según la forma de realización 11 o 12, donde dicha cepa de E. 45 coli genéticamente modificada comprende además un gen de ldhA nativo inactivado o eliminado y un gen insertado recombinantemente que codifica heterólogo de recombinación de deshidrogenasa de L-lactato;

16. La cepa de E. coli genéticamente modificada según la forma de realización 15, donde dicho gen de deshidrogenasa de L-lactato heterólogo es un gen ldhL (por ejemplo, un gen ldhL obtenido de P. acidilactici);

17. La cepa de E. coli genéticamente modificada según la forma de realización 15 o la forma de realización 16, 50 donde dicha cepa es metabólicamente desarrollada;

18. Una cepa de E. coli genéticamente modificada seleccionada de TG112, TG113 o TG114, SZ194, SZ132, SZ186, o TG103;

19. Un método de cultivo o desarrolo de una cepa de E. coli genéticamente modificada que comprende inocular un medio de cultivo con una o varias cepas de E. coli genéticamente modificadas según cualquier forma de 55 realización 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 y cultivar o desarrollar dicha cepa de E. coli genéticamente modificada;

20. Un método para producir D-(-)-lactato o ácido D-(-)-láctico que comprende cultivar una o varias cepas de E. coli genéticamente modificadas según cualquiera de formas de realización 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, o 14 en condiciones que permiten la producción de ácido D-(-)-láctico y opcionalmente neutralizar el ácido D-(-)-60 láctico para formar D-(-)-lactato;

21. El método según la forma de realización 20, donde dicha(s) una o varias cepas de E. coli genéticamente modificadas es/son seleccionada(s) de TG 112, TG 113, TG114 o SZ 194;

22. Un método para producir L-(+)-lactato o L-(+)-ácido láctico que comprende cultivar una o varias cepas de E. coli genéticamente modificada(s) según cualquiera de las formas de realización 15, 16 o 17 bajo condiciones que 65 permiten la producción de L-(+)-ácido láctico y opcionalmente neutralizar el L-(+)-ácido láctico para formar L-(+)-

lactato;

23. El método según la forma de realización 22, donde dicha(s) una o varias cepas de E. coli genéticamente modificadaa es TG103, TG105, TG106, TG107, o TG108;

24. El método según cualquiera de las formas de realización 19, 20, 21, 22, o 23, donde dicha cepa de E. coli genéticamente modificada se cultiva en un medio de sales minerales; 5

25. El método según la forma de realización 24, donde el medio de sales minerales comprende entre 2% y 20% (p/v) de un azúcar;

26. El método según la forma de realización 25, donde el medio de sales minerales contiene 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5%, 10%, 10.5%, 11%, 11.5%, 12%, 12.5%, 13%, 13.5%, 14%, 14.5%, 15%, 15.5%, 16%, 16.5%, 17%, 17.5%, 18%, 18.5%, 19%, 19.5% o 20% (p/v) de un 10 azúcar;

27. El método según la forma de realización 25 o 26, donde el azúcar es glucosa o sacarosa o una combinación de glucosa y sacarosa;

28. El método según la forma de realización 20, donde una cepa de E. coli genéticamente modificada como se expone en la forma de realización 11 se cultiva bajo condiciones que permiten la producción de D-(-)-lactato o 15 ácido D-(-)-láctico quiralmente puro;

29. El método según la forma de realización 22, donde una cepa de E. coli genéticamente modificada como se expone en la forma de realización 15, 16 o 17 se cultiva bajo condiciones que permiten la producción de L-(+)-lactato o L-(+)-ácido láctico quiralmente puro;

30. El método según la forma de realización 21, donde dicho método produce D-(-)-lactato o ácido D-(-)-láctico 20 quiralmente puro;

31. El método según la forma de realización 23, donde dicho método produce L-(+)-lactato o L-(+)-ácido láctico quiralmente puro;

32. El método según la forma de realización 28, 29, 30 o 31, que comprende además la etapa de purificación del lactato uiralmente puro (L-(+)-lactato o D-(-)-lactato); 25

33. El método según cualquier forma de realización 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 o 32, donde el lactato (por ejemplo, el L-(+)-lactato o D-(-)-lactato) se produce a concentraciones de al menos 0,5M

34. El método según la forma de realización 33, donde el medio de cultivo es un medio de sales minerales químicamente definido, tal como un medio de sales minerales NBS;

35. El método según la forma de realización 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 o 34, donde el 30 rendimiento del ácido láctico (ácido L-(+)-láctico o ácido D-(-)-láctico) es al menos o mayor de (o mayor de o igual a) 90%;

36. El método según la forma de realización 36, donde el rendimiento es al menos 90%, 90.5%, 91%, 91.5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, o 99%;

37. El método según forma de realización 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 o 36, donde no hay contaminación detectable 35 de una forma estereoisomérica de ácido láctico o lactato con la otra forma estereoisomérica (por ejemplo, la pureza quiral del estereoisómero específico es al menos, mayor de (o mayor de o igual a) 99.9%); o

38. Una composición que comprende una o varias cepas de E. coli genéticamente modificadas según cualquiera de las formas de realización 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 y un medio.

40

[0045] A continuación aparecen ejemplos que ilustran procedimientos para poner en práctica la invención.

Estos ejemplos no deberían ser interpretado como limitativos.

Todos los porcentajes son en peso y todas proporciones de mezcla de solvente son en volumen a menos que se especifique de otro modo.

45

Ejemplo 1

Preparación y análisis de las cepas de e. Coli sz132 y sz186

[0046] Las cepas de E. coli usadas en este ejemplo se enumeran en la Tabla 1. 50

La cepa SZ63 es un derivado de E. coli K-12 (ATCC 27325).

KO11 (ATCC 55124) es un derivado de E. coli B (ATCC 11303) que contiene los genes de producción de etanol de Zymomonas mobilis integrados en el gen pflB.

55

Tabla 1. Cepas de E. coli

Cepas

Características pertinentes Fuentes

DH5α

ΔlacZ M15 recA Invitrogen

S17-1

thi pro recA hsdR RP4-2-tet::Mu aphA::Tn7 λpir Simon et al. 1983

TC20

ΔadhE::FRT-tet-FRT Zhou et al. 2003

SZ31

W3110, Δ(focA-pflB)::FRT-kan-FRT Zhou et al. 2003

SZ61

W3110, ΔackA::FRT-tet-FRT Zhou et a/. 2003

SZ63

W3110, ΔfocA-pflB::FRT Δfrd ΔadhE::FRT ΔackA::FRT Zhou et al. 2003

NC3

E. coli B/r, hsdR Dien et al. 2001

KO11

pflB::Z. mobilis pdc adhB cat, Δfrd Ohta et al. 1991

LY52

KO11, frdA::K. oxytoca casAB, lacY::E. chrysanthemi celY Este ejemplo

SZ132

LY52, Δ(focA-pdc-adhB-pflB) ΔadhE::FRT ΔackA::FRT, ΔcasA Este ejemplo

SZ186

SZ132, ΔK. oxytoca casAB ΔE. chrysanthemi celY Este ejemplo

[0047] Se cultivaron cultivos a 37°C en caldo modificado Luria-Bertani (LB) (por litro: 10 g de triptona de Difco, 5 g de extracto de levadura de Difco, 5 g de cloruro sódico) o en el medio de sales minerales NBS suplementado con 5% o 10% de azúcar (glucosa o sacarosa).

5

[0048] Se usaron métodos estándar para la construcción plasmídica.

Los métodos para las deleciones cromosómicas, integración, y genes de resistencia a antibióticos desmontables han sido previamente descritos.

Las cepas de E. coli DH5α y S17-1 fueron usadas como huéspedes para la construcción plasmídica.

La cepa NC3 fue usada como huésped intermedio para minimizar los problemas asociados a las enzimas de 10 restricción durante transducción con P1 de cepas K-12 a cepas B (Dien et al., 2001).

[0049] Se prepararon cultivos de siembra como se describió previamente en Shukla it et al. (2004) y Zhou et al., (2003) y se usaron para inocular cubas de fermentación pequeñas (350 ml de volumen de trabajo, 35°C, 150 r.p.m. de agitación). 15

El caldo fue mantenido a pH 7,0 mediante la adición automática de 6 N de hidróxido de potasio.

Los datos representados en gráfico representan un promedio de 2 o más réplicas.

Las barras que notan el error típico del medio se incluyen para promedios de 3 o más fermentaciones.

La productividad volumétrica máxima para el lactato se estimó a partir de la región más inclinada de cada gráfico.

Ninguno de los antibióticos fueron incluidos durante el cultivo de cultivos de siembra o en los caldos de 20 fermentación.

[0050] La masa celular fue estimada por medición de ladensidad óptica a 550 nm (330 mg de peso/l de célula en seco a 1,0 OD550nm).

La producción de ácido orgánico total (principalmente de lactato) fue medida por consumo de base (hidróxido de 25 potasio).

Los productos ácidos fueron analizados al final de la fermentación por cromatografía en fase líquida de alta eficacia.

El etanol fue medido por cromatografía de gases.

Construcción de la cepa SZ132 30

[0051] La cepa LY52 fue construida a partir de KO11 integrando los genes casAB de Klebsiella oxytoca (Moniruzzaman et al. 1997) para la utilización de celobiosa detrás del codón de terminación de lacY e integrando el gen celY que codifica la endoglucanasa de Erwinia chrysanthemi (Zhou e Ingram, 1999) en el gen frdA.

Las mutaciones previamente caracterizadas en E. coli K-12 (cepa W3110) usadas para construcción de SZ63 (Zhou 35 et al., 2003) para la producción de lactato fueron consecutivamente transducidas en LY52.

Los genes de Z. mobilis para la producción de etanol fueron eliminados por transducción con P1 de la deleción de ΔfocA-pflB de SZ31.

La alcohol deshidrogenasa de E. coli nativa fue inactivada por transducción con P1 de la mutación adhE de TC20.

La acetato-cinasa (ackA) fue eliminada utilizando la mutación en SZ61. 40

Los genes antibióticos usados para la selección fueron eliminados por recombinasa FLP (Zhou et al., 2003).

Durante la eliminación de los genes antibióticos con recombinasa FLP, un segmento interno de casAB fue también eliminado.

El análisis de secuencias de casAB y promotores reveló la presencia de regiones del ADN muy similares al sitio de reconocimiento para la recombinasa FLP y se presume que son responsables de esta deleción. 45

[0052] La cepa resultante fue aclimatada a medios mínimos mediante subcultivo secuencial con un inóculo de 1%.

Tanto el cultivo celular como la producción de lactato mejoraron durante estas transferencias.

El caldo de la transferencia última fue estriado en medio sólido para el aislamiento de clones.

Se seleccionó uno y se designó SZ132. 50

Construcción de la cepa SZ186

[0053] Se construyó otro derivado de SZ132 del que se eliminaron todos los genes formáneos.

Los genes casAB de K. oxytoca y celY de E. chrysanthemi fueron eliminados por recombinación homóloga usando 55 ADN lineal.

Se usó recombinasa FLP para eliminar los genes antibióticos usados durante las construcciones.

La cepa resultante, SZ186, contiene sólo genes de E. coli nativos.

Análisis de la producción de ácido láctico 60

[0054] Se construyeron mutaciones genéticas análogas en derivados de E. coli K-12 y E. coli B para producir SZ63 (Zhou et al., 2003) y SZ132, respectivamente.

SZ132 fue superior s SZ63 en cuanto al cultivo celular y la producción de lactato (isómero D) (ver figura 1A).

En el medio rico, SZ132 completó la fermentación de 10% de glucosa en 48 h para producir más de 1 mol de lactato/1 de caldo de fermentación, dos veces más que lo señalado previamente para cepas basadas en E. coli K-12.

Las fermentaciones con SZ63 y 10% de glucosa se estancaron después de 72 h y produjeron sólo 840 mmoles de lactato/1 de caldo después 120 h. en medios ricos, la producción de lactato fue más alta para SZ132 (95%) que para 5 la cepa de K-12 SZ63 (88%).

La productividad volumétrica máxima para SZ132 fue de 75 mmoles/1 h, 76% superior a la de SZ63 (tabla 2).

Tabla 2. Resumen de fermentaciones de ácido láctico

Cepas de E. coli

Sustrato Ácido láctico producido Co-productos producidos (mM)

Concentración (mM)

Concentración ajustada de base (mM) Rendi-miento (%) Succinato Acetato Etanol

SZ132

NBS 10%Glu 556.01 ± 0.54 614.09 ± 0.54 91 32.11 ± 1.49 13.95 ± 0.57 ≤ 1

SZ132

NBS 10%Glu + Betaína 792.23 ± 8.67 930.30 ± 8.67 86 78.92 ± 2.45 11.56 ± 0.75 ≤ 1

SZ132

NBS 10%Suc 556.88 ± 33.21 609.78 ± 33.21 92 2.79 ± 0.02 ≤ 1 ≤ 1

SZ132

NBS 10%Suc + Betaína 889.06 ± 157.53 1045.95 ± 157.53 88 38.00 ± 7.33 12.24 ± 3.72 ≤ 1

SZ186

NBS 10%Glu 600.41 ± 2.67 670.31 ± 2.94 99 ≤ 1 ≤ 1 ≤ 1

SZ186

NBS 10%Glu + Betaína 658.75 ± 21.37 744.39 ± 24.15 98 ≤ 1 ≤ 1 ≤ 1

SZ186

NBS 10%Suc 573.27 ± 21.98 635.76 ± 24.38 95 ≤ 1 ≤ 1 ≤ 1

SZ186

NBS 10%Glu + Betaína 638.41 ± 33.59 718.06 ± 38.19 96 ≤ 1 ≤ 1 ≤ 1

SZ194 (Nº depósito. NRRL B-30863)

NBS 10%Glu + Betaína 717.60 + 51.51 823.85 + 65.48 96 ≤ 1 ≤ 1 ≤ 1

SZ194

LB pH6.5 10%Glu + Betaína 607.52 + 6.17 676.77 + 6.87 92 ≤ 1 ≤ 1 ≤ 1

SZ194

LB pH7.0 10%Glu + Betaína 714.06 + 7.38 813.35 + 9.61 95 ≤ 1 ≤ 1 ≤ 1

SZ194

LB pH7.5 10%Glu + Betaína 913.16 + 25.73 1070.19 + 27.57 97 ≤ 1 ≤ 1 ≤ 1

SZ194

LB pH8.0 10%Glu + Betaína 903.22 + 21.51 1060.38 + 25.26 96 ≤ 1 ≤ 1 ≤ 1

SZ194

NBS pH7.5 10%glu + betaína 864.31 + 4.93 1019.89 + 5.81 95 ≤ 1 ≤ 1 ≤ 1

SZ194

NBS pH7.5 12%glu + betaína 1012.18 + 27.41 1227.60 + 31.16 95 ≤ 1 ≤ 1 ≤ 1

SZ194

NBS pH7.5 14%glu + betaína 1001.08 + 9.48 1217.02 + 13.51 95 ≤ 1 ≤ 1 ≤ 1

SZ194

NBS pH7.5 6+3+3%glu + betaína 1003.65 + 12.74 1216.45 + 16.48 93 ≤ 1 ≤ 1 ≤ 1

[0055] En un medio de sales minerales NBS que contenía 5% de glucosa, el rendimiento celular y la productividad volumétrica para SZ132 fueron dos veces mayores que los de SZ63 (ver figura 1B).

La cepa SZ132 completó la fermentación de 5% de glucosa en 36 h, menos de 1/4 del tiempo requerido para la SZ63.

Bajo estas condiciones, el rendimiento celular y la productividad volumétrica para las fermentaciones con sales 5 minerales NBS fueron sólo de un 25-35% de aquellas con medio rico y 10% de glucosa.

[0056] Ni la cepa SZ132 ni la SZ63 completaron la fermentación de 10% de glucosa en el medio de sales minerales NBS en 144 h (ver figura 1C).

La producción de lactato para ambas cepas fue de más de 90% basada en azúcar metabolizado. 10

Con un medio de sales minerales NBS que contenía un 10% deglucosa, el rendimiento celular (0,83 g/l), la producción de lactato (700 mmoles/1 de caldo de fermentación), y la productividad volumétrica (11,2 mmoles de lactato/1 h) para SZ132 fueron aproximadamente dos veces superiores a las de SZ63.

Con un medio de sales minerales NBS y un 10% de glucosa, productividad volumétrica para SZ132 fue de menos del 20% de la observada en el medio rico. 15

[0057] La sacarosa fue fermentada más lentamente que la glucosa en el medio rico y en el medio de sales minerales NBS.

Estudios precedentes han demostrado que SZ63 (pLOI3501) requirió 36 h para completar la fermentación de 5% de sacarosa en el medio rico pero fue incapaz de completar la fermentación de 10% de sacarosa en este medio. 20

SZ132 completó la fermentación de 10% de sacarosa en el medio rico en 120 h y produjo más de 1 mol lactato/l de caldo de fermentación (ver figura 1D), casi dos veces más de lo que se había observado previamente para SZ63 que contenía el plásmido de sacarosa.

[0058] La productividad volumétrica para SZ132 en el medio de sales minerales NBS con 10% de sacarosa (9,3 25 mmoles/1 h) fue 1/3 de la observada en el medio rico con sacarosa, menos de 1/8 de la observada en el medio rico con 10% de glucosa (tabla 2).

Aunque un 5% de sacarosa fue fermentado totalmente en el medio de sales minerales NBS en 72 h (ver figura 1E), el 10% de sacarosa no se metabolizó completamente en este medio ni siquiera con tiempos de incubación extendidos. 30

Basándose en el azúcar metabolizado, las producciones de sacarosa oscilaron entre 86% y 93% en ambos medios.

[0059] Estos resultados demuestran que se pueden producir niveles altos de ácidos orgánicos a partir de glucosa y/o sacarosa mediante cepas modificadas de E. coli B. La productividad volumétrica máxima fue estimada en 75 mmoles lactato/1 h en el medio rico (LB), más de 3 veces superior a con el medio de sales minerales NBS. 35

Quedan muchas oportunidades de mejora.

Los tiempos de incubación requeridos para completar el metabolismo de 10% de sacarosa fueron tres veces más largos que para 10% de glucosa en el medio complejo, y más largos todavía en el medio de sales minerales.

La reducción de los tiempos de fermentación sin la adición costosa de nutrientes complejos puede ser esencial.

La identificación de los constituyentes que aumentan el crecimiento y la productividad podrían reducir 40 sustancialmente los costes asociados a la fermentación y también ofrecer una oportunidad de reducir los gastos asociados a la purificación del lactato y al tratamiento de desechos.

[0060] Las figuras 2-5 ilustran el progreso en la producción de ácido láctico (isómero D) mediante varias formas de realización, es decir SZ132, SZ186, y SZ194 (Nº de depósito NRRL B-30863) de la invención bajo varias 45 condiciones de fermentación en el medio de sales minerales NBS.

Ejemplo 2

Preparación de la cepa de E. Coli sz194 50

[0061] Las cepas y plásmidos usados en la preparación de la cepa SZ194 se enumeran en la tabla 3. Los cultivos fueron desarrollados a 37°C en caldo de Luria modificado (por litro: 10 g de triptona de Difco, 5 g de extracto de levadura de Difco, 5 g de cloruro sódico) (Miller, J.H. 1992 A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 55 N.Y.) o en un medio de sales minerales NBS (Causey, T.B. et al. 2004, "Engineering Escherichia coli for efficient conversion of glucosa to pyruvate," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:2235-2240) suplementado con 1 mM de betaína y 2% -14% de (p/v) de azúcar (glucosa o sacarosa).

Tabla 3. Cepas y plásmidos de E. coli

Cepas

Características pertinentes Fuentes

SZ132

Δ(focA-Z. mobilis pdc-adhB-pflB) adhE::FRT Δack::FRTΔfrd,frdA::E. chrysanthemi celY lacY::K. oxytoca casAB Zhou et al. (2005)

SZ136

SZ132, seleccionado para crecimiento y fermentación rápidos en 10% de sucrosa Este ejemplo

SZ162

SZ136, ΔfrdBC::FRT Δ adhE::FRT Este ejemplo

SZ186

SZ162, Δ casAB::FRT Δ celY::FRT Este ejemplo

SZ186

SZ186, seleccionado para crecimiento y fermentación rápidos en 10% de sucrosa Este ejemplo

Cepas

Características pertinentes Fuentes

pKD46

Bla γ β exo (Recombinasa roja), replicón pSC101 dependiente de la temperatura Datsenko and Wanner (2000)

pFT-A

Bla flp ), replicón pSC101 dependiente de la temperatura Posfai et al. (1997)

pLOI2511

colE1, FRT-kan-FRT, bla

pLOI3924

colE1, bla kan lacY'-FRT-Kan-FRT-lacYA

[0062] Se usaron métodos estándar para la amplificación de ADN, la digestión enzimática, la purificación y la construcción plasmídica (Miller et al., 1992; Sambrook y Russell, 2001).

Previamente se han descrito métodos para la deleción e integración de genes cromosómicos (Causey et al., 2004; Datsenko and Wanner, 2000; Martinez-Morales et al., 1999; Zhou et al., 2003a). 5

[0063] pLOI3924 plasmídico fue construido para facilitar la deleción de los genes casAB mediante la clonación de genes lacY y lacA que usan "ORFmers" (Sigma-Genosis,The Woodlands, TX), y la inserción del casette FRT-kan-FRT (digestión SmaI) de pLOI2511 entre el sitio NdeI en el carboxiterminal de lacY y el N-terminal ATG de lacA.

El fragmento amplificado (ORFmer directo para lacY; ORFmer inverso para lacA) de este plásmido fue usado para la 10 integración cromosómica y la deleción de los genes casAB.

Los cebadores híbridos usados para las deleciones de gen adicionales y la secuencia contenida correspondientes a aproximadamente 45 pares de bases del principio o del extremo del gen objetivo más 20 par de bases de secuencia de ADN correspondientes al casette de canamicina flanqueada por FRT son descritos en la tabla 4.

15

Tabla 4. Cebadores

Cebador

SEC ID Nº: Secuencia

Cebador sentido para deleción de frdBC

1

Cebador antisentido para deleción de frdBC

2

Cebador sentido para deleción de adhE

3

Cebador antisentido para deleción de adhE

4

Cebador sentido para deleción de celY

5

Cebador antisentido para deleción de celY

6

[0064] A menos que se especifique lo contrario, se usó un medio de sales minerales NBS (Causey et al., 2004) que contenía 1 mM de betaína y 10% de azúcar (glucosa o sacarosa) en todas las fermentaciones (pH 7.0).

Se prepararon cultivos de siembra como se describe previamente (Zhou et al., 2003) y se usaron para inocular cubas de fermentación de 500 ml (350 ml de volumen de trabajo, 35°C, 150 r.p.m. de agitación) a una densidad 20 inicial de 33 mg de peso seco celular (cdw) 1-1.

Donde se indica, también se añadió betaína (1 mM).

El PH del caldo fue mantenido por adición automática de 6 N de hidróxido de potasio.

Un total de un 12% (p/v) de glucosa fue usado en las fermentaciones de flujo continuo (6% + 3% + 3%) de la siguiente manera: 308 ml de medio NBS con 21 gramos de glucosa. 25

Después de 24 h y 48 h, 21 ml de 50% de glucosa fueron lentamente adicionados en cada vaso.

[0065] Células de fermentaciones controladas por pH fueron transferidas en serie en diferentes periodos (24 o 48 h) para facilitar la evolución metabólica a través de la selección basada en el crecimiento.

Los cultivos consecutivamente transferidos fueron inoculados a una densidad inicial de 33 mg de cdw 1-1. 30

Los clones aislados al final de las selecciones fueron asignados nuevas designaciones de cepa.

[0066] La masa celular fue estimada mediante medición de la densidad óptica a 550 nm utilizando un espectrofotómetro Spectronic 70 de Bausch & Lomb.

La producción total de ácido orgánico (principalmente lactato) fue estimada por consumo de base (hidróxido de 5 potasio) para el mantenimiento del pH.

Los productos ácidos y la pureza quiral fueron analizados al final de la fermentación por cromatografía en fase líquida de alta eficacia (Zhou et al., 2003a).

Los datos mostrados en forma de gráfico representan un promedio de 2 o más réplicas.

Las barras que notan la desviación típica se incluyen para promedios de 3 o más fermentaciones. 10

Análisis de la producción de ácido láctico

[0067] La betaína, un osmolito de protección, fue altamente beneficiosa para el cultivo celular y la producción de lactato por SZ132 en un medio de sales minerales que contenía altas concentraciones de azúcar, supuestamente 15 debido a la segmentación de carbono insuficiente en la biosíntesis de osmolitos nativos tales como glutamato y trehalosa (Purvis et al., 2005).

Las transferencias en serie de SZ132 fueron llevadas a cabo en el medio de sales minerales con 10% de sacarosa para seleccionar cepas con un rendimiento equivalente en ausencia de betaína (Figuras 6A y 6B).

La producción de energía para el cultivo en la cepa SZ32 depende de flujo glicolítico con lactato como la vía 20 dominante para la oxidación de NADH, proporcionando una selección basada en el crecimiento.

El cultivo y la producción de ácido (consumo de base) mejoró de forma constante durante las transferencias en serie.

En las transferencias finales, sacarosa al 10% fue fermentada por completo sin betaína adicionada.

Un clon fue aislado de este cultivo y fue designado cepa SZ136.

Esta cepa produjo dos veces el rendimiento celular de la progenitora, SZ132, y títulos 3 veces más altos de lactato 25 después de 96 h (figura 6).

Sin embargo, SZ136 también produjo niveles más altos de succinato y etanol que SZ132 (tabla 5), reduciendo la producción de lactato (basada en azúcar metabolizado).

Tabla 5. Productos de fermentaciones de glucosa

Cepa

Condicionesa Lactato Co-productos (mmol 1-1)

mmol 1-1

Rendimiento (%)b Succinato Acetato Etanol

SZ132

NBS + betaína 930 ± 9 86 79 ± 2 12 ± 1 < 1

SZ136

NBS 739 67 126 8 115

SZ162

NBS 660 ± 27 96 < 1 < 1 < 1

SZ186

NBS 670 ± 3 99 < 1 < 1 < 1

SZ186

NBS + betaína 744 ± 24 98 < 1 < 1 < 1

SZ194

NBS + betaína 824 ± 65 96 < 1 < 1 < 1

SZ194

Caldo de Luria pH 6.5 677 + 7 92 < 1 < 1 1

SZ194

Caldo de Luria pH 7.0 813 ± 10 95 < 1 < 1 < 1

SZ194

Caldo de Luria pH 7.5 1070 ± 28 97 < 1 < 1 < 1

SZ194

Caldo de Luria pH 8.0 1060 ± 25 96 < 1 < 1 < 1

SZ194

NBS, pH 7.5 + betaína 1020 ± 6 95 < 1 < 1 < 1

SZ194

NBS pH7.5 12% glucosa + betaína 1228 ± 31 95 < 1 < 1 < 1

SZ194

NBS, pH 7.5 14% glucosa + betaína 1217 ± 14 95 < 1 < 1 < 1

SZ194

NBS, pH7.5 glucosa (6+3+3%) + betaína 1216 ± 17 93 < 1 < 1 < 1

a medio de sales minerales NBS con 10% de glucosa (pH 7.0) a menos que se especifique lo contrario. Donde se indique, también se añadió 1 mM de betaína. b Los rendimientos se basan en azúcar metabolizado que asume un rendimiento teórico máximo de 2 moles de lactato por mol de hexosa (conversión a mismo peso).

30

[0068] Las mejoras en el crecimiento de SZ132 en 10% (p/v) de sacarosa parecen haber ido acompañadas por mutaciones que mejoraron el crecimiento pero que también restauraron parcialmente la función de genes mutados para las vías de co-producto.

La mutación de fumarato reductasa en la cepa SZ132 está mal caracterizado y fue originalmente obtenida como una deleción de Tn5 (Ohta et al., 1991), seguida de una inserción de celY entre frdA y frdB (Zhou et al., 2005). 35

El gen de alcohol deshidrogenasa fue interrumpido por inserción de un marcador antibiótico con sitios de FRT flanqueantes.

Luego se usó flipasa para eliminar el gen antibiótico dejando solo una región FRT.

La posterior deleción de regiones de codificación para frdBC y adhE para producir SZ162 eliminó ambos co-productos pero también redujo el crecimiento y el título final del lactato debido a la utilización de azúcar incompleta 40 (tabla 5).

También se hicieron deleciones adicionales en esta cepa para eliminar los genes foráneos que habían sido previamente integrados para la utilización de celulosa (Zhou et al., 2005): casAB (gen transportador de celobiosa) de Klebsiella oxytoca y (endoglucanasa) celY de Erwinia chrysanthemi.

La cepa resultante, SZ186, produjo niveles insignificantes de co-productos pero no logró utilizar completamente un 10% de azúcar en un medio de sales minerales con o sin betaína (Figura 7A; tabla 5). 5

Sin embargo, los rendimientos basados en azúcar metabolizado fueron altos (96%-99%) para tanto SZ162 como SZ186.

[0069] Las deleciones en SZ136 que eliminaron vías de co-producto (SZ186) también redujeron el rendimiento celular casi la mitad, afectando negativamente a la segmentación de carbono en biosíntesis. 10

Se usó evolución metabólica para co-seleccionar un derivado de SZ186 con crecimiento y rendimiento de fermentación mejorados en presencia de 1 mM de betaína y 10% de glucosa (figura 7A y 7B).

El rendimiento celular y la producción de ácido orgánico aumentaron al mismo tiempo durante las etapas de selección iniciales.

Un único clon fue aislado del último enriquecimiento y designado SZ194. 15

[0070] La cepa SZ194 creció más rápidamente que SZ186 y alcanzó un rendimiento celular más alto.

Concentraciones de lactato de hasta 900 mM fueron producidas por SZ194 en algunas fermentaciones, consistentemente superiores a las de SZ186 (tabla 5).

Ambas cepas produjeron lactato a partir de glucosa a rendimientos teóricos cerca de co-productos mínimos. 20

Con ambas cepas, sin embargo, el azúcar permaneció sin usar a pH 7.0 incluso después de una incubación prolongada.

A pH 7.0, los 800-900 mM de lactato producido del 10% (p/v) de glucosa está bastante por encima de la concentración de lactato máxima necesitada para inhibir el crecimiento a pH 7.0 y también puede inhibir el posterior metabolismo de la glucosa. 25

[0071] Se exploraron dos factores como posible causa para la fermentación incompleta de 10% (p/v) de azúcar por SZ194: un defecto nutricional desconocido y la tolerancia al lactato.

El reemplazo del medio de sales minerales que contenía 1 mM de betaína con caldo de Luria (medio rico) a pH 7.0 apenas tuvo efecto en el rendimiento del lactato (tabla 5) o en la producción de lactato (tabla 6). 30

La toxicidad de lactato fue evaluada por comparación del efecto de pH en la fermentación (tabla 5).

La toxicidad de ácidos orgánicos débiles tales como el lactato está relacionada en parte con la acción de desacoplamiento de la forma neutral conjugada (Warnecke et al., 2005), que a su vez está inversamente relacionada con el pH.

Una tendencia similar fue observada para la fermentación. 35

En caldo de Luria, los títulos de lactato finales fueron mínimos a pH 6.5 y máximos a pH 7.5 y pH 8.0.

Los cambios en el pH tuvieron menos efecto en el rendimiento celular.

A pH 7.5,10% (p/v) se fermentó glucosa completamente en 72 h usando caldo de Luria.

Tabla 6. Comparación de la productividad de lactato

Cepa

Condiciones de fermentación a Título de lactato (mmol 1-1) Rendimiento celular (gl-1) Productividad volumétricab (mmol l-1h-1) Productividad específicab (mmol g-1h-1) Productividad volumétricab (gl-1h-1)

SZ132

pH 7.0 930 2.07 24.6 11.9 2.21

SZ194

pH 7.0 824 1.73 18.5 10.7 1.67

SZ194

pH 7.5 1020 1.67 23.8 14.2 2.14

SZ194

Caldo de Luria, pH 7.5 sin betaína añadida 1070 1.75 24.7 14.1 2.22

a sales Minerales (NBS) con 10% (p/v) de glucosa y 1 mM de betaína, a menos que se especifique lo contrario. b valores calculados según el promedio para el periodo de 24-h más productivo.

40

[0072] El beneficio de este aumento en el pH fue confirmado en el medio de sales minerales con 1 mM de betaína (Figura 8; Tabla 5).

A pH 7.5, se fermentaron 10% y 12% (p/v) de glucosa completamente, producciendo más de 1 mol de lactato 1-1 con sólo cantidades residuales de co-productos (Figura 3A).

Los rendimientos de producto de 0,95 g de lactato por g de glucosa representan un 95% del rendimiento teórico 45 máximo basado en azúcar total añadido a la fermentación.

La adición de niveles más altos de azúcar no aumentó más los títulos de lactato finales.

Títulos finales similares se observaron durante experimentos con lotes alimentados (figura 8B) y no aumentaron cuando se añadió azúcar adicional.

Los títulos de lactato finales de aproximadamente 1,0-1,2 M parecen representar un límite superior para el 50 metabolismo de azúcar a pH 7.5 por SZ194 (tabla 5).

[0073] Es interesante destacar que el pH 7.5, el pH óptimo para la fermentación, es muy próximo al observado para

el citoplasma de E. coli (Axe et al., 1995; Warnecke et al., 2005).

Aunque no se ha identificado ningún gen transportador de lactato en E. coli, diferentes estudios han proporcionado prubas de su presencia en bacterias de E. coli y de ácido láctico (Axe et al., 1995; Konings, 2002; Poolman, 2002).

Se cree que estos transportadores son simportadores de lactato/H+, actividades que pueden aumentar en eficiencia con aumentos en el pH externo. 5

Según el "energy recycling model" (Michels et al., 1979), el flujo de salida mediado por portador de productos finales metabólicos tales como el lactato puede llevar a la generación de un gradiente de protones electroquímico a través de la membrana y contribuir a la producción de ATP.

Se estima que el flujo de salida de lactato en bacterias de ácido láctico contribuye un 30% de la energía celular total (van Maris et al., 2004a). 10

Ya que E. coli SZ194 y las bacterias del ácido láctico metabolizan la glucosa por vías similares, es posible que ATP adicional se produzca por flujo de salida de lactato en E. coli.

[0074] La pureza quiral del lactato producido por SZ194 fue examinada y se decubrió que era superior que 95% de d-lactato. 15

Aunque es buena, esta pureza quiral es inferior a la de la cepa progenitora, SZ132 (99.5% de d-lactato) (Zhou et al., 2005).

La fuente de esta impureza quiral se desconoce.

[0075] Según la presente invención, se pueden producir títulos de lactato de más de 1 M mediante E. coli SZ194 a 20 pH 7,5 en un medio de sales minerales suplementado con 1 mM de betaína.

En este medio, la productividad de lactato y el rendimiento celular para SZ194 fueron equivalentes al del caldo de Luria (tabla 6).

El título final del lactato de 110 g 1-1 y el rendimiento (0,95 g de lactato g de glucosa-1) para la cepa SZ194 son comparables favorablemente con las bacterias de ácido láctico tales como L. helveticus (Kyla-Nikkila et al., 2000) y 25 L. delbrueckii (Demirci et al., 1992) y exceden el rendimiento de biocatalizadores previamente modificados genéticamente en medio rico o en sales minerales (Dien et al., 2001; Porro et al., 1999; Saitoh et al., 2005; van Maris et al., 2004b).

Ejemplo 3 30

Materiales y métodos

Cepas, plásmidos, medios y condiciones de cultivo

35

[0076] Las cepas, plásmidos y cebadores de E. coli utilizados en este estudio se enumeran en la tabla 7.

la cepa SZ194 fue previamente construida de un derivado de E. coli B (ATCC 11303) y sirvió como punto de partida para construcciones (véase el Ejemplo 2 y Zhou et al., 2006).

Durante las construcciones de cepas, se cultivaron cultivos aeróbicamente a 30°C, 37°C, o 39°C en caldo de Luria (por litro: 10 g de triptona de Difco, 5 g de extracto de levadura Difco y 5 g de cloruro sódico) (Miller 1992) que 40 contenía 2% (p/v) de glucosa o de arabinosa.

Ampicilina (50 mg/L), tetraciclina (12.5 o 6.25 mg/L), o canamicina (25 o 50 mg/L) fueron añadidas según fue necesario.

Para las pruebas de fermentación, se cultivaron cepas sin antibióticos a 37°C en el medio de sales minerales NBS (Causey et al., 2004) suplementado con 1 mM de betaína y 2-12% (p/v) de glucosa. 45

Un tampón de MOPS (100 mM, pH 7.4) se añadió a un medio sólido y líquido en condiciones en las que faltaba un control del pH (placas, tubos, matraces).

Métodos genéticos

50

[0077] Se siguieron protocolos de fabricantes y métodos estándar (Miler 1992, Sambrook y Russell 2001) para la purificación de ADN, (Qiagen) la digestión de endonucleasa de restricción (New England Biolabs), amplificación de ADN (Stratagene e Invitrogen) y transformación.

Se han descrito métodos para deleciones cromosómicas e integración previamente (Causey et al., 2004, Zhou et. al, 2003, Datsenko y Wanner 2000, Martinez-Morales et al., 1999). 55

Cebadores híbridos (tabla 7) que contienen homólogos de secuencia para los 50 nucleótidos del principio o del final del gen mgsA (cursiva) más 20 nucleótidos correspondientes a la secuencia del casette de canamicina flanqueado por FRT (subrayado) de pKD4 fueron usados para la deleción del gen mgsA nativo.

El plásmido pLOI2398 fue construido previamente para facilitar la integración de Pedioccoccus acidilactici ldhL en el gen cromosómico ldhA de E. coli (Zhou et al., 2003a). 60

Fermentaciones

[0078] Se cultivó un preinóculo mediante la inoculación de una colonia en un matraz de 250 ml (100 ml de medio NBS con 2% (p/v) de glucosa y 100 mM de MOPS, pH 7.4). 65

Después de 16 h (37°C, 120 r.p.m.), este preinóculo fue diluido en cubas de fermentación de 500 ml que contenían

350 ml de medios NBS (5-12% de azúcar, con o sin 1 mM de betaína) para proporcionar 33 mg de peso seco celular 1-1.

Después de 24-h (37°C, 150 r.p.m., pH controlado a 7.0), este cultivo fue usado para proporcionar un inóculo de inicio de 33 mg de peso seco celular 1-1.

Se observó una productividad volumétrica para el periodo más activo de 24-h. 5

La productividad específica fue calculada como el cociente de la productividad volumétrica dividida por la masa celular a 24 h.

Evolución metabólica

10

[0079] Las células de fermentaciones controladas por pH fueron transferidas en serie a intervalos de 24 o 48 h para facilitar la evolución metabólica a través de selección competitiva basada en el crecimiento.

En cada transferencia se diluyeron inóculos (1/100 a 1/350) en medios precalentados frescos.

A los clones aislados de estas selecciones se les asignaron nuevas designaciones de cepa.

15

Análisis

[0080] La masa celular fue estimada por medición de la densidad óptica a 550 nm utilizando un espectrofotómetro Spectronic 70 de Bausch & Lomb.

La producción de ácido orgánico total, principalmente de lactato, se estimó por el consumo de hidróxido de potasio 20 usado para mantener el pH 7.0.

Los productos ácidos y la pureza quiral fueron analizados al final de la fermentación por cromatografía en fase líquida de alta eficacia.

Las estimaciones de ácido orgánico por consumo de base fueron constantemente inferiores a las mediciones de lactato por HPLC, presuntamente debido al metabolismo mineral. 25

Resultados y discusión

Restauración de la pureza quiral para la producción de D-(-)-lactato

30

[0081] Se ha observado que la cepa SZ194 produce eficazmente D-(-)-lactato de glucosa a un 99% de pureza quiral en un medio de sales minerales (Zhou et al., 2006).

La betaína aumentó la productividad del lactato (título e índice) con concentraciones altas de azúcar pero también disminuyó la pureza quiral a un 95% (tabla 8).

Hay diferentes fuentes posibles de L-(+)-lactato en E. coli (figura 9A). 35

El L-(+)-lactato se puede producir a partir de lactaldehído, un intermediario en el catabolismo de ramnosa o fucosa (Badia et al., 1991), ambos ausentes en nuestros medios, y como un producto del bypass de metilglioxal de la glucólisis (figuras 9A y 9B).

El bypass de metilglioxal representa una vía de desbordamiento corta que es inducida por la acumulación de dihidroxiacetona fosfato durante la glucólisis rápida, y por una limitación de fosfato para síntesis de ATP. 40

Tanto la acumulación de dihidroxiacetona fosfato y la limitación de fosfato podría ser exacerbada por índices altos de flujo glucolítico.

Para probar esta hipótesis, el gen mgsA que codifica el primer paso realizado, sintasa de metilglioxal, fue eliminado.

La cepa resultante, TG112, produjo D-(-)-lactato quiralmente puro (Tablas 8 y 9, Figuras 10A y 10B).

El crecimiento y la productividad inicial aumentaron por esta deleción en comparación con SZ194. 45

Los rendimientos basados en análisis con HPLC fueron similares (tabla 8).

[0082] Otras mejoras en TG112 fueron seleccionadas por evolución metabólica durante 81 días de cultivo (figura 11).

Los cultivos de fermentación fueron transferidos en serie en medio de sales minerales con 10% (p/v) de glucosa, 50 12% (p/v) de glucosa, y 12% (p/v) de glucosa con 1 mM de betaína.

Un clon fue aislado el día 28 (TG113) y otro al final del enriquecimiento (TG 114).

La productividad (índice, título, y rendimiento) del D-(-)-lactato y el rendimiento celular mejoraron durante este proceso (figuras 10A y 10B; tabla 8 y tabla 9).

la fermentación con SZ114 fue sustancialmente completada dentro de 48 h en la mayoría de experimentos, con un 55 rendimiento final de 0,98 g de D-(-)-lactato g-1 glucosa.

Inóculos altos proporcionaron una mejora modesta en las productividades específicas y volumétricas.

Los co-productos e impurezas quirales estuvieron por debajo del umbral de detección (<0.1%) con estas cepas sin mgsA.

La producción de D-(-)-lactato por TG114 es favorable en comparación con otros biocatalizadores y ofrece una alta 60 productividad, título, rendimiento y pureza quiral con medios y condiciones de fermentación simples (tabla 10).

Producción de L-(+)-lactato quiralmente puro

[0083] La cepa de D-(-)-lactato, SZ194, fue modificada genéticamente de nuevo para producir principalmente L-(+)-65 lactato por sustitución del gen nativo ldhA que codifica una deshidrogenasa de D-(-)-lactato con el gen ldhL de P.

acidilactici que codifica L-(+)-lactato deshidrogenasa (Zhou et al., 2003a).

La cepa resultante, TG102, produjo principalmente L-(+)-lactato y fue transferida en serie en un medio mínimo con un 5% (p/v) de glucosa, 10% (p/v) de glucosa y 10% (p/v) de glucosa con 1 mM de betaína para seleccionar un crecimiento y productividad mejorados.

Después de 24 días, un clon fue seleccionado y designado TG103. 5

Aunque la productividad del lactato mejoró debido a un aumento en el flujo glucolítico (figuras 10C y 10D; tabla 9), el L-(+)-lactato fue contaminado con 5% de D-(-)-lactato (tabla 8).

Ya que el bypass de metilglioxal tiene el potencial de producir ambas formas quirales de lactato, mgsA fue identificado como la fuente más probable de impureza quiral.

La pureza quiral absoluta fue restaurada después de la deleción de mgsA. 10

La cepa resultante, TG105, produjo sólo L-(+)-lactato (figuras 10 y 10D; tabla 8).

Otras mejoras se lograron mediante coselección del crecimiento y la productividad durante transferencias en serie en el medio de sales minerales con 10%-12% (p/v) de glucosa y 1 mM de betaína (dilución de inóculo de 1:100 a 1:350).

TG106 Y TG107 fueron aisladas como cepas intermedias después de 10 y 22 transferencias, respectivamente 15 (figuras 10E y 10F).

La cepa TG108 fue aislada después de 99 días.

Todas produjeron sólo L-(+)-lactato a altos rendimientos con niveles mínimos de co-productos (tabla 8).

Las productividades volumétricas en 12% (p/v) de glucosa y el rendimiento celular aumentaron durante la selección de la cepa aunque la productividad específica se mantuvo esencialmente constante (tabla 9). 20

Pequeños aumentos en la productividad volumétrica máxima (periodo de 24-h más activo) fueron observados con inóculos más altos.

[0084] La cepa TG108 fue comparada con otros biocatalizadores para la producción de L-(+)-lactato (tabla 10).

El título y rendimiento para esta cepa fueron más altos que los observados en otros organismos. 25

Otras ventajas incluyen condiciones de fermentación y medio simples, y pureza quiral.

Conclusiones

[0085] Los títulos altos (>100 gl-1 en 48 h) de L-(+) y D-(-)-lactato quiralmente puros (> 99.9% de pureza quiral) 30 pueden ser fácilmente producidos por E. coli B recombinante en el medio de sales minerales suplementado con 1 mM de betaína.

La eliminación del bypass de metilglixal fue esencial para eliminar las impurezas en los enantiómeros D-(+) y L-(-) de lactato.

35

Ejemplo 4

Construcción de TG128 por eliminación de todo el ADN foráneo de TG114

[0086] Para facilitar la aplicación comercial de cepas de E. coli recombinante para la producción de lactato, se 40 construyó otro derivado de TG114 en el que todo el ADN foráneo que había quedado en el cromosoma durante la modificación genética precedente fue eliminado.

El ADN eliminado incluía regiones de cicatriz que contenían el sitio de diana de reconocimiento de flipasa (FRT) para la flipasa (recombinasa) usada para eliminar los marcadores antibióticos, pequeños fragmentos de ADN de Zymomonas mobilis, parte de casAB de Klebsiella oxytoca, y parte de celY de Erwinia chrysanthemi. 45

Estos segmentos de ADN foráneos fueron completamente eliminados, dejando sólo ADN cromosómico nativo cuyas regiones centrales de genes seleccionados han sido eliminadas para mejorar la producción de lactato.

Cepas, plásmidos, medios y condiciones de cultivo

50

[0087] Las cepas, plásmidos y cebadores de E. coli usados en este estudio se enumeran en la tabla 11.

La cepa TG114 fue construida previamente a partir de un derivado de E. coli B (ATCC 11303) y sirvió como punto de partida para otras construcciones (Grabar et al., 2006).

Durante las construcciones de cepas, se cultivaron cultivos aeróbicamente a 30°C, 37°C, o 39°C en caldo de Luria (por litro: 10 g de triptona de Difco, 5 g de extracto de levadura Difco y 5 g de cloruro sódico) (Miller 1992) con 2% 55 (p/v) de glucosa o arabinosa o 10% de sacarosa.

Ampicilina (50 mg/L), clorotetraciclina (10 mg/L), o cloranfenicol (40 mg/L) se añadieron según fue necesario.

[0088] Los cultivos fueron mantenidos en placas que contenían un medio de sales minerales NBS (Causey et al., 2004) suplementado con 2% (p/v) de glucosa. 60

Un tampón de MOPS (100 mM, pH 7.4) se añadió a medio sólido y líquido bajo condiciones carentes de control de pH (placas, tubos, matraces).

Para las pruebas de fermentación, se cultivaron cepas sin antibióticos a 37°C en medio de sales minerales AM1 (por litro: 2,63 g de (NH4)2HPO4, 0,87 g NH4H2PO4, 0,37 g de MgSO4·7H2O, 2,4 mg de FeCl3, 0,3 mg de CoCl2·6H2O, 0,15 mg de CuCl2, 0,3 mg de ZnCl2·4H2O, 0,3 mg de NaMoO4, 0,075 mg de H3BO3, 0,075 mg de MnCl2.4H2O2,1 mM de 65 betaína y 120 g/L de glucosa).

Métodos genéticos

[0089] Se siguieron protocolos de fabricantes y métodos estándar (Miller 1992, Sambrook y Russell 2001) para la clonación de genes (Invitrogen), la purificación de ADN (Qiagen), la digestión de endonucleasa de restricción (New 5 England Biolabs), la amplificación de ADN (Stratagene e Invitrogen) y transformación.

Métodos para realizar deleciones cromosómicas e integración se han descrito previamente (Causey et al., 2004, Zhou et. al, 2003, Datsenko y Wanner 2000, Martinez-Morales et al., 1999).

Una descripción de los plásmidos y los cebadores usados aparece en la tabla 11.

10

Construcciones de plásmidos

[0090] El plásmido pLOI4411 fue generado designando cebadores que amplificaron entre el operón frdABCD de E. coli B gADN, ' frdA frdB frdC y frdD’, y ligamiento posterior en el vector de clonación de Invitrogen, pCR2.1-TOPO (tabla 11). 15

Los plásmidos pLOI4412, pLOI4413, pLOI4415 y pLOI4416 fueron construidos con un método similar para clonar los genes nativos de interés, ackA, adhE, focA plfB y mgsA, respectivamente.

[0091] Se generaron plásmidos que codifican el bloqueo de genes continuos usando cebadores antisentido.

Se diseñaron cebadores antisentido con grupos de fosfato 5' para amplificar el plásmido entero menos la región de 20 gen que iba a ser omitida (figura 12).

Por ejemplo, pLOI4417 fue generado mediante la realización de PCR en pLOI4411 con un cebador que se alinea al extremo 3' de frdA, que se extiende en dirección ascendente, y un cebador que se alinea dentro de frdC, que se extiende en dirección descendente.

El resultante producto de PCR de 4263 pb fue tratado con la enzima de restricción DpnI para asimilar el plásmido 25 pLOI4411 nativo.

Los productos de PCR digeridos fueron posteriormente autoligados para generar el plásmido nuevo, pLOI4417.

Los plásmidos pLOI4418. pLOI4419, pLOI4421 y pLOI4422 fueron generados de una forma similar usando los sets de cebadores listados en la tabla 11.

Estos plásmidos sirvieron como un modelo de PCR para amplificar el ADN lineal que contenía la deleción deseada y 30 fueron desprovistos de toda secuencia heteróloga.

Este ADN lineal fue usado para reemplazar regiones decicatrices de FRT, ADN heterólogo, y sacB por recombinación homóloga (doble entrecruzamiento).

De esta manera, se hicieron deleciones continuas de genes seleccionados en el cromosoma.

35

Eliminación de regiones de cicatrices de FRT y ADN heterólogo de TG114

[0092] Las cicatrices de la diana de reconocimiento FLP (FRT) de ~85 pb que dejó el método de deleción en una única fase de Datsenko y Wanner (2000) fueron quitadas por un método en dos etapas.

En primer lugar, se dirigió a los sitios FRT individualmente un casette circular FRT-cat-sacB dando como resultado 40 una única integración de entrecruzamiento de este casette en una cicatriz FRT en el cromosoma (FRT-cat-sacB-FRT).

El ADN Circular con el casette cat-sacB-FRT fue construido de la siguiente manera: 1.Amplificación de PCR del casette FRT-cat-sacB que usa el plásmido pLOI4151 como modelo. El casette amplificado incluía sitios PstI flanqueantes; 2) digestión con PstI seguida por autoligamiento para producir círculos cerrados incapaces de 45 replicación autónoma. Este ADN circular fue usado para la integración. La expresión del gen CAT confirió resistencia al cloranfenicol y permitió la selección directa de células con la integración.

[0093] En el segundo paso, el gen sacB permitió una selección directa de células en las que la región de ADN que contiene sacB se ha quitado por recombinación homóloga (doble entrecruzamiento). 50

Las células que expresan sacB en presencia de 10% de sacarosa (Ausubel et al., 2005; abrigo et al., 2001) fueron matadas y lisadas por la producción intracelular de polisacárido.

Con este método, las recombinantes donde se había insertado ADN para reemplazar sacB pudieron ser seleccionados a partir de poblaciones grandes.

En este ejemplo, la integración de un fragmento de ADN lineal a través de un doble entrecruzamiento resultó en una 55 cepa de bloqueo limpia que contiene sólo ADN nativo o ADN nativo con deleciones, carente de todo ADN heterólogo.

Se usó una secuencia de ADN nativa o una secuencia nativa con una deleción génica deseada en este segundo paso para eliminar completamente regiones de cicatriz de FRT y todo el ADN heterólogo de la cepa TG114.

60

[0094] Tras la electroporación con el fragmento de ADN lineal, las células fueron incubadas con agitación a 37°C duramte 4 horas en 1 mL de medio SOC.

Después de 4 horas de cultivo, las células fueron incubadas durante 16-20 horas en 50 mLde LB sin sal (por litro: 10 g de triptona de Difco, 5 g de extracto de levadura de Difco) suplementado con 10% (p/v) de sacarosa.

Luego las células fueron puestas en placas de agar LB sin sal suplementadas con 5% de sacarosa. 65

La mayoría de las células que mantenían FRT-cat-sacB no fueron viable después de periodos prolongados en presencia de sacarosa.

Las células viables que formaron colonias fueron desprovistas de sacB, y regiones de cicatriz.

[0095] Este método fue usado secuencialmente para eliminar las 5 cicatrices FRT presentes en TG114 y para 5 restaurar el operón lac.

Los cebadores, plásmidos, y cepas usados en este proceso se resumen en la tabla 11.

Los genes casAB integrados en lacA fueron también quitados y sustituidos por secuencias de tipo salvaje en esta región que utiliza una modificación de este método en dos etapas.

Los fragmentos de celY de Erwinia chrysanthemi (y Z. ADN mobilis) integrados en frdA fueron quitados durante la 10 construcción de la deleción frdBC continua.

La cepa resultante, TG128, está desprovisto de cicatrices de FRT y contiene sólo secuencias de ADN nativo con regiones delecionadas en los genes indicados en la tabla 11.

Una comparación de la secuencia original en la región de deleciones de gen se muestra para TG114 y TG128 (tabla 12). 15

Restauración del operón lac nativo

[0096] TG114 contenía segmentos de ADN heterólogo (fragmentos de ADN de Zymononas mobilis, casAB de Klebsiella oxytoca, y parte de celY de Erwinia chrysanthemi) de construcciones previas en la región lacY, lacA 20 (Grabar et al., 2006).

Estos fueron eliminados de TG120 para producir TG122 y están ausentes en derivados posteriores de TG122.

Los cebadores para esta construcción se enumeran en la tabla 11.

Para lograr esto, la región nativa lacZ' a cynX fue amplificada de E. coli B y clonada en pCR2.1-TOPO para producir pLOI3956. 25

Para facilitar la selección de recombinantes, la región central de pLOI3956 (lacZ'-lacA') fue sustituida con un casette que contenía genes cat y sacB de la siguiente manera.

Con pLOI3956 como modelo, se usaron cebadores antisentido con sitios de NheI para amplificar lacZ', pCR2,1, y cynX (omitiendo parte de lacZ', lacY, lacA y parte de cynX').

Un segundo conjunto de cebadores que contenía sitios de NheI fue usado para amplificar un casette de cat-sacB del 30 plásmido pEL04 (originalmente conocido como pK04, Ausubel et al., 2005 and Lee et al., 2001).

Después de la digestión con NheI, estos productos PCR fueron ligados para producir pLOI3957, un derivado de pCR2.1 que contiene lacZ'-sacB-cat-cynX.

Utilizando el plásmido pLOI3957 como modelo, la región lacZ'-sacB-cat-cynX' fue amplificada por PCR e integrada en TG120 con selección para la resistencia de cloranfenicol para producir TG121. 35

Utilizando pLOI3956 como modelo, la región de tipo salvaje lacZ'-lacY lacA-cyn región fue amplificada por PCR e integrada en TG121.

Los integrantes que contenían la secuencia nativa del operón lacZYA fueron seleccionados por la ausencia de la función de sacB durante el cultivo en presencia de sacarosa.

Uno de estos fue designado TG122. 40

La cepa TG122 fue una cepa intermedia durante la construcción de TG128.

Fermentaciones

[0097] El preinóculo se cultivó por inoculación de una colonia en un matraz de 250-ml con 100 ml de de medio NBS 45 (Causey et al., 2004) con 2% (p/v) de glucosa de y 100 mM de MOPS (pH 7.4).

Después de 16 h (37°C, 120 r.p.m.), este preinóculo fue diluido en cubas de fermentación de 500-ml con 350 ml de medios de sales minerales AF1 (12% de azúcar) para proporcionar 33 mg de peso seco celular o dcw/L.

Después de 24-h (37°C, 150 r.p.m., pH controlado a 7.0), el cultivo resultante fue usado para proporcionar un inóculo inicial de 33 mg de dcw/L e incubado bajo las mismas condiciones durante 96 h. Se retiraron muestras para análisis. 50

Análisis

[0098] La masa celular se estimó por medición de la densidad óptica en 550 nm utilizando un espectrofotómetro Spectronic 70 de Bausch & Lomb. 55

La producción de ácido orgánico total, principalmente de lactato, fue estimada por consumo de hidróxido de potasio usado para mantener el pH a 7.0.

Los productos ácidos y la pureza quiral fueron analizados al final de la fermentación por cromatografía en fase líquida de alta eficacia.

Las estimaciones de ácido orgánico por consumo de base fueron constantemente inferiores a las medidas de lactato 60 por HPLC, supuestamente debido al metabolismo mineral.

Fermentación de glucosa por TG128

[0099] La cepa TG114 fue sometida a manipulación genética intensiva para eliminar cicatrices FRT y otro ADN 65 extraño.

El organismo resultante, la cepa TG128, contiene solo secuencias de ADN de tipo salvaje y nativo, y deleciones continuas de genes para eliminar productos de fermentación no deseados.

El rendimiento de fermentación de esta cepa fue esencialmente equivalente al de la cepa TG114, y el rendimiento de lactato fue de 96-98% del rendimiento teórico máximo (tabla 13).

5

Selección de mutantes termotolerantes para la producción de lactato por evolución metabólica

[0100] Se usó la evolución metabólica para seleccionar cepas capaces producir lactato de forma eficaz a temperaturas elevadas.

Células de fermentaciones controladas por pH fueron transferidas en serie a intervalos de 24 h para facilitar la 10 evolución metabólica a través de selección competitiva basada en el crecimiento.

En cada transferencia, se diluyeron inóculos (1/100 a 1/350) en medios precalentados frescos.

la temperatura de incubación fue aumentada en una fracción de un grado ya que el crecimiento permitía facilitar el aislamiento de cepas termotolerantes.

La cepa TG128 fermenta óptimamente a 37°C. 15

Se obtuvieron mutantes aumentanto progresivamente la temperatura de incubación durante transferencias sucesivas.

Con este método, se seleccionaron cepas nuevas de TG128 que ahora son capaces de fermentar eficazmente a 39°C (cepa TG129) y a 43°C (cepa TG130).

Los rendimietos para ambas cepas termotolerantes a temperatura elevada fueron equivalentes a TG114 a 37°C 20 (tabla 13).

Fermentación de glucosa por TG128

[0101] La cepa TG114 fue sometida a manipulación genética intensiva para eliminar cicatrices FRT y otro ADN 25 extraño.

El organismo resultante, la cepa TG128, contiene solo secuencias de ADN de tipo salvaje y nativo, secuencias de ADN de tipo salvaje y deleciones continuas de genes para eliminar productos de fermentación no deseados.

El rendimiento de fermentación de esta cepa fue esencialmente equivalente al de TG114, y el rendimiento de lactato fue de 96-98% del rendimiento teórico máximo (tabla 13). 30

Selección de mutantes termotolerantes para la producción de lactato

[0102] Se utilizó la evolución metabólica para seleccionar cepas capaces producir de lactato eficazmente a temperaturas elevadas. 35

Las transferencias en serie en fermentadores donde la temperatura fue aumentada una fracción de un grado permitieron el aislamiento de TG129, que fermenta óptimamente a 39°C, y TG130, que fermenta óptimamente a 43°C.

Los rendimientos para ambas a temperatura elevada fueron equivalentes a TG114 a 37°C (tabla 13).

40

Tabla 7. Cepas, plásmidos y cebadores de E. coli usados en este estudio

Plásmido o cepa

Características relevantes Fuentes

Cepas

SZ194

pflB frd adhE ackA Zhou et al. (2006)

TG102

SZ194, ΔldhA::ldhL-FRT Este estudio

TG103

Mutante de TG102 con crecimiento y actividad de ldhL mejorada Este estudio

TG105

TG103, ΔmgsA:: FRT Este estudio

TG106, TG107 y TG108

Mutantes de TG105 con crecimiento y actividad de ldhL mejorada Este estudio

TG112

SZ 194, ΔmgsA::FRT Este estudio

TG 113 y TG 114

Mutante de TG112 con crecimiento y actividad de ldhL mejorada Este estudio

Plásmidos

pKD46

bla γ β exo (recombinasa roja), replicón pSC101 dependiente de la temperatura Datsenko and Wanner (2000)

pFT-A

bla flp replicón pSC101 dependiente de la temperatura Posfai et al. (1997)

pKD4

bla kan; R6K ori; FRT-kan-FRT cassette Datsenko and Wanner (2000)

PLOI2398

kan; ldhA'-ldhL-FRT tet-FRT `ldhA; R6K ori Zhou et al. (2003)

Cebadores

Cebador sentido para la deleción de mgsA

Atgtacattatggaactgacgactcgcactttacctgcgcgg aaacatatgtgtaggctggagctgcttc (SEC ID Nº:7) Este estudio

Cebador antisentido para la deleción de mgsA

Ttacttcagacggtccgcgagataacgctgataatcgggga tcagaatatcatatgaatatcctccttag (SEC ID Nº:8) Este estudio

Tabla 8. Productos de fermentaciones de glucosa

Cepa

Condicionesa Lactate Co-productos (mmol 1-1)

mmol l-1

Rendimiento(%)b Pureza quiral (%) Succinato Acetato Etanol

SZ194

NBS, pH 7.5 +betaína 1228 ± 31 95 95 < 1 < 1 < 1

TG 102

NBS 5% glucosa 555 ± 6 99 99.5 < 1 < 1 < 1

TG102

NBS 10% glucosa 697 ± 13 96 99.5 < 1 < 1 < 1

TG102

NBS 10% glucosa + betaína 1025 ± 18 94 95 < 1 < 1 < 1

TG103

NBS 10% glucosa + betaína 1080 ± 15 95 95 < 1 < 1 < 1

TG105

NBS + betaína 969 ± 20 95 >99.9 < 1 < 1 < 1

TG106

NBS + betaína 1055 ± 19 95 >99.9 < 1 < 1 < 1

TG107

NBS + betaína 1135 ± 18 96 >99.9 < 1 < 1 < 1

TG108

NBS + betaína 1287 ± 15 98 >99.9 < 1 < 1 < 1

TG112

NBS 10% glucosa + betaína 926 ± 13 95 >99.9 < 1 < 1 < 1

TG113

NBS + betaína 1068 ± 32 95 >99.9 < 1 <1 < 1

TG114

NBS + betaína 1314 ± 48 98 >99.9 < 1 <1 < 1

a medio de sales minerales NBS que contiene un 12% (p/v) de glucosa(pH 7.0) a menos que se especifique lo contrario. Donde se indica, también se añadió 1 mM de betaína. Las cepas en negrita producen D-(-)-lactato. Las cepas subrayadas producen L-(+)-lactato. b los rendimientos se basan en azúcar metabolizado que asume un rendimiento teórico máximo de 2 moles de lactato por mol de hexosa (conversión a mismo peso).

Tabla 9. Productividad de lactato por E. coli B modificada genéticamente

Cepaa

Título del lactato (mmol l-1) Rendimiento celular (g l-1) Productividad volumétricaf (mmol l-1h-1) Productividad específicab (mmol g-1h-1) Productividad volumétricaf (gl-1h-1)

SZ194b

1228 1.70 23.3 13.7 2.10

TG1036e

1083 2.12 30.1 14.2 2.71

TG105e

969 1.84 21.1 11.5 1.90

TG106

1055 1.98 24.1 12.1 2.17

TG107

1135 2.21 26.7 12.1 2.40

TG108

1287 2.29 26.2 11.4 2.29

TG108c

1273 2.15 26.4 12.3 2.37

TG108d

1268 2.36 30.0 12.7 2.70

TG112e

926 1.84 20.4 11.1 1.84

TG113

1068 1.90 21.3 11.2 1.92

TG114

1314 2.31 32.2 13.9 2.88

TG114c

1204 2.05 33.9 16.6 3.05

TG114d

1202 2.16 36.1 16.7 3.25

a sales minerales NBS que contienen un 12% (p/v) de glucosa (pH 7.0), 1mM de betaína, controladas a pH 7.0 (a menos que se especifique lo contrario). Las cepas en negrita producen D-(-)-lactato. Las cepas subrayadas producen L-(+)-lactato. b pH controlado a 7.5 c 5% de inóculo. d 10% de inóculo.

e 10% de glucosa. f valores calculados según el promedio para el periodo de 24-h más productivo.

Tabla 10. Producción de lactato quiral a partir de glucosa por bacterias, levaduras y hongos

Organismos

Medios, sustratos y condiciones del proceso Lactato (gl-1) Rendi-miento (%) Productividad volumétrica (gl-1h-1) Isómero y pureza Referencia

E. coli TG 114

sales, 1mM de lote de betaína, glucosa , 120 g l-1 118 98 2.88 D-(-) >99.9% Este estudio

E. coli JP203

medio rico (LB) dos etapas, glucosa de lote alimentado, 115 g l-1 62 54 1.09 D-(-) No consta Chang et al. 1999

Mutante de Lactobacillus delbrueckii DP3

extracto de levadura, lote alimentado, glucosa, 210 gl-1 117 56 6.5 D-(-) No consta Demirci et al. 1992

Kluyveromyces marxianus CD590

medio rico (YPD), glucosa microaeróbica , 100 g l-1 81 81 1.5 D-(-) 99% Rajgarhia et al. 2004

E. coli TG108

Sales, 1mM de lote de betaína, glucosa , 120 gl-1 116 98 2.3 L-(+) >99.9% Este estudio

E. coli JP204 (pLS65)

medio rico (LB) dos etapas, glucosa de lote alimentado , 155 g l-1 47 30 0.7 L-(+) No consta Chang et al. 1999

E. coli FBR11 (pVALDH1)

Medio rico (LB), lote simple, glucosa, 100gl-1 73 73 2.3 L-(+) No consta Dien et al. 2001

Kluyveromyces lactis BM3-12D (pLAZ10)

Extracto de levadura y vitaminas lote alimentado, glucosa de aireación, 110 g l-1 60 55 No consta L-(+) No consta Bianchi et al. 2001

Kluyveromyces lactis PMI/C1 (pEPL2)

extracto de levadura y extracto soluble de maíz, lote alimentado con aireación, glucosa , 200 g 1-1 109 55 No consta L-(+) No consta Porro et al. 1999

Saccharomyces cerevisiae RWB850-2

Glucosa suplementada con vitamina y en dos fases, 18gl-1 12 67 No consta L-(+) No consta Van Maris et al. 2004b

Saccharomyces cerevisiae OC2TT165R

Extracto de levadura, azúcares de zumo de caña, 200 gl-1 122 61 No consta L-(+) 99.9% Saitoh et al. 2005

Saccharomyces cerevisiae RWB876

Glucosa de lote simple, suplementada con vitaminas, 74 gl-1 61 82 No consta L-(+) No consta Liu et al. 2005

Lactabacillus helveticus GRL89

Extracto de levadura, lactosa de lote simple, 81 gl-1 75 92 3.2 L-(+) No consta Kyla-Nikkila et al. 2000

Lactabacillus sp. NRRL B-30574

Extracto de levadura, glucosa de lote simple , 130 gl-1 103 79 No consta L-(+) 100% Eddington et al. 2004

Rhizopus oryzae ADM 34.31

glucosa de urea y de lote de elevación por aire de medio rico, 120 gl-1 109 89 1.3 L-(+) No consta Liaw 2003

5

Tabla 11. Cepas de E. coli, plásmidos y cebadores usados en este estudio

Plásmido o cepa

Características pertinentes Fuentes

TG114

ΔfocA-pflB::FRT, ΔadhE::FRT, ΔackA::FRT, frdA::E. chrysanthemi celY, ΔfrdBC::FRT, lacA:K. oxytoca cas AB, ΔmgsA::FRT Grabar, et al. 2006

TG117

TG114, ΔfrdBC::FRT-cat-sacB-FRT Este estudio

TG118

ΔfocA-pflB::FRT, ΔadhE::FRT, ΔackA::FRT, ΔfrdBC, lacA:K. oxytoca Este estudio

cas AB, ΔmgsA::FRT

TG119

TG118, ΔackA::FRT-cat-sacB-FRT Este estudio

TG120

ΔfocA-pflB::FRT, ΔadhE::FRT, ΔackA, ΔfrdBC, lacA:K. oxytoca cas AB, ΔmgsA::FRT Este estudio

TG121

TG120, ΔlacZ-cynX (lacZ'-sacB-cat-cynX') Este estudio

TG122

ΔfocA-pflB::FRT, ΔadhE::FRT, ΔackA, ΔfrdBC, ΔmgsA::FRT Este estudio

TG123

TG122, ΔmgsA::FRT-cat-sacB-FRT Este estudio

TG124

ΔfocA-pflB::FRT, ΔadhE::FRT, ΔackA, ΔfrdBC, ΔmgsA Este estudio

TG125

TG124, ΔfocA-pflB:FRT-cat-sacB-FRT Este estudio

TG126

ΔfocA-pflB, ΔadhE::FRT, ΔackA, ΔfrdBC, ΔmgsA Este estudio

TG127

TG126, ΔadhE::FRT-cat-sacB-FRT Este estudio

TG128

ΔfocA-pflB, ΔadhE, ΔackA, ΔfrdBC, ΔmgsA Este estudio

TG129

TG128, crecimiento mejorado a 39°C Este estudio

TG130

TG129, crecimiento mejorado a 43°C Este estudio

Plásmidos

pKD46

bla γ β exo (recombinasa roja), replicón pSC101 dependiente de la temperatura Datsenko and Wanner (2000)

pFT-A

bla flp replicón pSC101 dependiente de la temperatura Posfai et al. (1997)

pELO4

cat sacB

pLOI4151

FRT cat sacB Este estudio

PLOI3956

'/acZ' lacY lacA cynX' TOPO clonado Este estudio

PLOI3957

'lacZ' sacB cat cynX' Este estudio

pLOI4411

'frdA frdB frdC frdD' TOPO clonado Este estudio

pLOI4412

'ackA' TOPO clonado Este estudio

pLOI4413

ychE' adhE ychG'TOPO clonado Este estudio

pLOI4415

focA-pflB TOPO clonado Este estudio

pLOI4416

'yccT mgsA 'helD TOPO clonado Este estudio

pLOI4417

pLOI4411 ΔfrdBC Este estudio

pLOI4418

pLOI4412 ΔbackA Este estudio

pLOI4419

pLOI4413 AadhE Este estudio

pLOI4421

pLOI4415 ΔfocA-pflB Este estudio

pLOI4422

pLOI4416 ΔmgsA Este estudio

Cebadores

Cebador sentido para la amplificación de FRT-cat-sacB

tgtgctgcaaggcgattaag (SEC ID Nº:9) Este estudio

Cebador antisentido para la amplificación de FRT-cat-sacB

ttcgatcacggcacgatcat (SEC ID Nº:10) Este estudio

Cebador sentido para la amplificación de cat-sacB con sitio 5' NheI

ttagctagcatgtgacggaag (SEC ID Nº:11) Este estudio

Cebador antisentido para la amplificación de cat-sacB con sitio 5' NheI site

ccgctagcatcaaagggaaaa (SEC ID Nº:12) Este estudio

Cebador sentido para clonar frdABCD

ctggagtacagcgacgtgaagat (SEC ID Nº:13) Este estudio

Cebador antisentido para clonar frdABCD

cagaacgcgctcgtagctca (SEC ID Nº:14) Este estudio

Cebador sentido para clonar ackA

gaactgcggtagttcttcactg (SEC ID Nº:15) Este estudio

Cebador antisentido para clonar ackA

gcgtcttgcgcgataaccag (SEC ID Nº:16) Este estudio

Cebador sentido para clonar lacZ-cynX

gaagtgaccagcgaatacct (SEC ID Nº:17) Este estudio

Cebador antisentido para clonar lacZ-cynX

ggtgatgccttcggtgatta (SEC ID Nº:18) Este estudio

Cebador sentido para clonar mgsA

gctattccaccgcagtctca (SEC ID Nº:19) Este estudio

Cebador antisentido para clonar mgsA

ttatggaagaggcgctactgc (SEC ID Nº:20) Este estudio

Cebador sentido para clonar focA-pflB

agatcgccagccgctgcaat (SEC ID Nº:21) Este estudio

Cebador antisentido para clonar focA-pflB

aaccgttggtgtccagacag (SEC ID Nº:22) Este estudio

Cebador sentido para clonar adhE

ccgctgtctgataactggtc (SEC ID Nº:23) Este estudio

Cebador antisentido para clonar adhE

gcataagcggatggtcactg (SEC ID Nº:24) Este estudio

Cebador sentido para delecionar frdBC

P-gtggttgccaccatcgtaat (SEC ID Nº:25) Este estudio

Cebador antisentido para delecionar frdBC

P-cgccttctccttcttattgg (SEC ID Nº:26) Este estudio

Cebador sentido para delecionar ackA

P-ctggacgctgttgtattcactg (SEC ID Nº:27) Este estudio

Cebador antisentido para delecionar ackA

P-gttgagcgcttcgctgtgag (SEC ID Nº:28) Este estudio

lacZ cebador antisentido con sitio 5' NheI

acgctagctctgacaatggca (SEC ID Nº:29) Este estudio

cebador antisentido de cynX con sitio 5' NheI

acgctagcattgccgctgata (SEC ID Nº:30 Este estudio

Cebador sentido para delecionar mgsA

P-agcgttatctcgcggaccgt (SEC ID Nº:31) Este estudio

Cebador antisentido para delecionar mgsA

P-aagtgcgagtcgtcagttcc (SEC ID Nº:32) Este estudio

Cebador sentido para delecionar focA-pflB

P-gcagcaggacgttattactc (SEC ID Nº:33) Este estudio

Cebador antisentido para delecionar focA-pflB

P-gcctacattgcgtaggctatt (SEC ID Nº:34) Este estudio

Cebador sentido para delecionar adhE

P-gctgctccggctaaagctga (SEC ID Nº:35) Este estudio

Cebador antisentido para delecionar adhE

P-acgctctacgagtgcgttaag (SEC ID Nº:36) Este estudio

Tabla 12. Secuencia parcial de región de deleciones

Cepa / gen

Secuencia parcial a ADN extra (bp)

TG1 14 frdABC

322

TG128 frdABC

GCGAATAAGAAGGAGAAGGCG-GTGGTTGCCACCATCGTAATCCTGTT c (SEC ID Nº:38) 0

TG114 ackA

(SEC ID Nº: 39) 94

TG128 ackA

CTCACAGCGAAGCGCTCAA-CCTGGACGCTGTTGTATTCAC (SEC ID Nº:40) 0

TG114 mgsA

85

TG128 mgsA

ATGGAACTGACGACTCGCACTT-AGCGTTATCTCGCGGACCGTCTGA (SEC ID Nº:42) 0

TG114 focA-pflB

(SEC ID nº: 43) 85

TG128 focA-pflb

ATAGCCTACGCAATGTAGGC-GCAGCAGGACGTTAT (SEC ID Nº:44) 0

TG114 adhE

(SEC ID Nº 45) 84

TG128 adhE

AACGCACTCGTAGAGCGT-GCTGCTCCGGCTAAAGCTGA (SEC ID Nº:46) 0

a Se muestran en negrita las secuencias parciales de las regiones 3' y 5’ del/de los gen(es), en cursiva la cicatriz FRT y subrayada la región eliminada en la cepa TG128. b Esta región también contenía una secuencia parcial de un promotor de Z. mobilis así como una secuencia parcial dle gen celY de E. chrysanthemi. c La barra indica la región de deleción.

Tabla 13. Productos de fermentaciones de glucosa

Cepa

Condicionesa Lactato Co-productos (mmol l-1)

mmol l-1

Rendim. (%)b Pureza quiral (%) Succinato Acetato Etanol

TG114

FMS, 37°C 1314 ± 48 98 >99.9 < 1 < 1 < 1

TG128

FMS, 37°C 1157 ± 37 96 >99.9 < 1 < 1 < 1

TG128

FMS, 39°C 865 ± 12 95 >99.9 < 1 < 1 < 1

TG128

FMS, 43°C >99.9 < 1 < 1 < 1

TG129

FMS, 39°C 1063 ± 26 96 >99.9 < 1 < 1 < 1

TG129

FMS, 43°C 934 ± 18 94 >99.9 < 1 < 1 < 1

TG130

FMS, 43°C 1149 + 49 97 >99.9 < 1 < 1 < 1

aSales minerales (NBS) con 12% (p/v) de glucosa, 1 mM de betaína, controlado a pH 7.0. bRendimientos basados en azúcar metabolizado con un rendimiento teorético máximo de 2 moles de lactato por mol de hexosa (conversión a mismo peso).

[0103] Se debe entender que los ejemplos y formas de realización descritos aquí son sólo para uso ilustrativo y que 5 varias modificaciones o cambios leves de los mismos serán sugeridos a personas expertas en la técnica.

Referencias

[0104]

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Solicitud de patente publicada de EEUU Nº. 20040005677 5

Solicitud de patente publicada de EEUU Nº. 20030003553

Solicitud de patente publicada de EEUU Nº. 20050112737

10

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Claims (4)

1. REIVINDICACIONES

   1. Ácido láctico genéticamente modificado que produce E. coli, que comprende las modificaciones siguientes:

   a) inactivación o deleción del gen de acetato-cinasa (ackA);

   b) inactivación o deleción de un gen de fumarato reductasa (frdBC); 5

   c) inactivación o deleción del gen de piruvato-formato liasa (pflB);

   d) inactivación o deleción del gen de alcohol deshidrogenasa (adhE); y

   e) inactivación o deleción del gen de metilglioxal sintasa (mgsA).
2. 2. Composición que comprende un medio de cultivo y una cepa de E. coli genéticamente modificada según la 10 reivindicación 1.
3. 3. Método para producir ácido láctico quiralmente puro que comprende cultivar una cepa de E. coli genéticamente modificada según la reivindicación 1 bajo condiciones que permiten la producción de ácido láctico.

   15
4. 4. Método para producir ácido D-(-)-láctico que comprende cultivar una cepa de E. coli genéticamente modificada según la reivindicación 1 bajo condiciones que permiten la producción de ácido D-(-)-láctico.