CN102803470A - 针对生产琥珀酸路径的工程方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及利用可再生生物原料有效生产琥珀酸和/或其它产物的生物催化剂。所述生物催化剂作为基因修饰和代谢进化共同结果，所述催化剂从糖类原料中，高效用于与生长关联的琥珀酸和/或其它产物的生产。更具体地说，本发明某些生物催化剂，于无机盐培养基中，在简单控制pH、分批发酵过程中，高效价和高产率地生产琥珀酸，所述培养基没有添加任何外源基因物质。本发明基因修饰涉及与除琥珀酸生产路线外的NADH氧化可供选择路线的消除偶联的能量保存策略。所述生物催化剂包含葡萄糖抑制的糖异生磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(pck)，所述羧激酶通过基因修饰和一个基因失活的磷酸转移酶系统而解除抑制。依据琥珀酸生产效率，本发明生物催化剂与产琥珀酸瘤胃细菌功能性相当，所述瘤胃细菌如产琥珀酸放线杆菌和产琥珀酸厌氧螺菌，不同点在于生物催化剂能在含糖类来源的无机盐培养基中高效生产琥珀酸，相反，瘤胃细菌要求在天然培养基中生产琥珀酸。

Description

针对生产琥珀酸路径的工程方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年4月2日提交的美国临时申请61/166,093的优先权。本申请也是2009年2月3日提交的美国申请12/529,826的附加部分，所述美国申请12/529,826是2009年3月19日提交的PCT/US2008/057439的美国国家阶段申请，该申请要求2007年3月20日申请的美国临时申请60/895,806的权益，上述每一个公开文本的整体以引用方式并入本发明，包括所有图示、表格和氨基酸或核酸序列。
政府支持
本发明是在美国能源部授予的基金号USDOE-DE FG02-96ER20222的基金以及美国能源部协同美国农业部一起授予的基金号USDA & DOE Biomass RDI DE FG36-04GO14019的基金支持下完成的。美国政府对本发明享有一定的权利。
背景技术
本发明涉及使用微生物催化剂由可再生生物原料生产琥珀酸的领域。本发明公开了对生物催化剂的基因修饰，所述基因修饰有助于实现高效率生产琥珀酸。更具体地说，本发明提供了基因修饰的生物催化剂，所述催化剂适用于由可再生原料生产商业上有效量的琥珀酸。
一份美国能源部2004年题为“Top value added chemicals from biomass”的报道识别了12种可由可再生原料制备的砌块化学品。这12种糖基合成砌块是1，4-二元酸(琥珀酸、反丁烯二酸和顺丁烯二酸)、2，5-呋喃二羧酸、3-羟基丙酸、天冬氨酸、葡糖二酸、谷氨酸、衣康酸、乙酰丙酸、3-羟基丁内酯、甘油、山梨醇、和木糖醇/阿拉伯糖醇。在石油价格上涨的情况下，这些来自可再生原料的砌块化学品的发酵产品将越来越具有竞争力。
这些砌块化学品是含多功能基团的分子，有望成为一类新的有用分子家族。这12种砌块化学品随后能被转化为许多高价值生物基化学品或材料。例如，琥珀酸盐能够作为底物转化成塑料、溶剂和其他通常由石油制备的化学品((Lee等人，2004；Lee等人，2005；McKinlay等人，2007；Wendisch等人，2006；Zeikus等人，1999)。许多细菌已被描述为具有生产琥珀酸盐的天然能力，所述琥珀酸盐是作为一种主要的发酵产品(如表1所示)。然而，从这些天然发生的产琥珀酸微生物制备琥珀酸的过程复杂，并需要昂贵的生长培养基和较长的培养时间。
先前各种基因方法已被用于设计产琥珀酸大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)菌株，获得了不同程度的成功(如表1所示)。在大多数研究中，获得的效价较低并且需要天然培养基组分，例如酵母提取物或玉米浆。大肠杆菌菌株NZN111生产108mM琥珀酸盐，摩尔产率是每摩尔代谢葡萄糖生成0.98mol琥珀酸盐(Chatterjee等人，2001；Millard等人，1996；Stols和Donnelly，1997)。这种菌株的设计方法是：使两种基因(pflB编码丙酮酸甲酸裂解酶和ldhA编码乳酸脱氢酶)失活，并从多拷贝质粒过量表达两种大肠杆菌基因(苹果酸脱氢酶基因(mdh)和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc))。大肠杆菌菌株HL27659k的设计方法是：使琥珀酸脱氢酶(sdhAB)、磷酸转乙酰酶(pta)、乙酸激酶(ackA)、丙酮酸盐氧化酶(poxB)、葡萄糖转运蛋白(ptsG)和异柠檬酸裂解酶抑制剂(iclR)发生突变。这种菌株生成效价低于100mM的琥珀酸盐，且要求氧限制发酵条件(Cox等人，2006；Lin等人，2005a，2005b，2005c；Yun等人，2005)。新陈代谢的计算机模拟分析被用于设计基因敲除以在大肠杆菌中创造一条类似于曼海姆产琥珀酸菌(Mannheimia succiniciproducens)中的天然琥珀酸路径的路径(Lee等人，2005and 2006)。然而，所合成的菌株生成非常少的琥珀酸盐。Andersson等人(2007)报道由仅含天然基因的工程大肠杆菌获得了最高水平的琥珀酸盐产品(339mM)。
其他研究者致力于研究另一些方法表达大肠杆菌中的异源性基因。菜豆根瘤菌(Rhizobium eteloti)丙酮酸羧化酶(pyc)从多拷贝质粒中过量表达，引导碳流向琥珀酸盐(Gokarn等人，2000；Vemuri等人，2002a，2002b)。菌株SBS550MG通过使异柠檬酸裂解酶(iclR)、乙醇脱氢酶(adhE)、乳酸脱氢酶(ldhA)和乙酸激酶(ackA)失活，并从多拷贝质粒中过量表达枯草芽孢杆菌citZ(柠檬酸盐合成酶)和菜豆根瘤菌丙酮酸羧化酶(R.etli pyc)而被构建(Sanchez等人，2005a)。利用该菌株，由葡萄糖生成160mM琥珀酸盐，摩尔产率为1.6。
还有更多复杂的过程被研究用于琥珀酸盐生产(表1所示)。许多方法包括一个有氧生长期和随后的一个厌氧生产期。厌氧期通常需供给二氧化碳、氢气或以上两种(Andersson等人，2007；Sanchez等人，2005a和2005b；Sanchez等人，2006；US 5,869,301；Vemuri等人，2002a和2002b)。在最近一个使用天然琥珀酸盐生产原料的研究中，产琥珀酸厌氧螺旋菌(A.succiniciproducens)、电透析、CO2鼓泡、细胞再生和分批给料相结合，用葡萄糖生产琥珀酸盐，获得了高产率、效价和产量(Meynial-Salles等人，2007)。
目前为止，大多数大肠杆菌的科学知识是来自于在天然培养基(例如LB培养基)而非在无机盐培养基中的研究，在这些研究中使用低浓度的糖底物(典型地0.2％w/v；11mM)而非此处报道的研究中所用的5％(w/v)葡萄糖(278mM)和10％(w/v)葡萄糖(555mM)。生产商业上有效水平的产品需要使用大量的糖。先前的研究者已经描述了许多大肠杆菌派生物的构建，用于在天然培养基中生产琥珀酸盐(表1所示)。使用天然培养基，基于主要路径的合理设计在代谢工程的学术证明上已经相当地成功。然而，天然营养物在生产细菌发酵产品中的使用，增加了材料成本、提纯成本，以及与废物处理相关的成本。使用不含天然培养基成分的无机盐培养基在节约成本方面更加可取。
E.coli C在含葡萄糖的NBS无机盐培养基中生长良好，生成的发酵产物为乳酸盐、乙酸盐、乙醇和琥珀酸盐的混合物(见图1A，表4)。与其他关于大肠杆菌的研究(见表1)相比，此处报道的研究主要集中于菌株的培育，所述菌株能够使用无机盐培养基将高水平的糖转化成琥珀酸盐，以减少材料、琥珀酸盐纯化和废物处理的成本。
本发明的一个方面提供了多种大肠杆菌菌株，所述菌株在无机盐培养基中在简单的、pH控制的、分批的发酵过程中生成高效价和产率的琥珀酸盐，而无需异源基因或质粒。发明人意外地识别了一些目标基因，这些目标基因在为了实现高效率生产琥珀酸而进行的对生物催化剂的基因操作中是有用的。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种获得生物催化剂的方法，该生物催化剂用于由生物原料制备琥珀酸。所述方法兼有合理的基因操作和代谢进化过程。
在获得用于由生物原料生产琥珀酸的生物催化剂的过程中，使用一种合理的设计，所述设计来源于我们现有的关于微生物代谢路径的知识，使一组细菌染色体内的基因失活，随后进行代谢进化过程以筛选具有所希望表型的菌株。
本发明的一个方面，细菌染色体内基因的突变是在不引入任何外源基因材料的条件下完成的。
本发明另一个方面，内源基因的突变是通过在内源基因的开放阅读框引入点突变或引入终止密码子完成的。
本发明的另一个方面，内源基因的整个开放阅读框被从染色体DNA中删除。
在本发明某些优选实施方式中，某些内源基因的表达显著增强。在本发明的一个方面，内源基因的转录通过在内源基因的启动子区域引入某些突变而得到增强。在本发明的其他方面，内源基因的转录水平通过解除目标基因的阻遏调控而得到提高。
在本发明的某一方面，为了筛选含有突变基因的细菌菌株，所述突变基因具有所希望的表型，可以引入外源核苷酸序列使目标基因失活。本发明最优选的方面，引入微生物基因组的外源核苷酸序列，随后以无缝方式被消除，没有留下任何残余外源核苷酸序列。
合理的基因操作可以是通过单阶段或多阶段完成，其中单阶段基因改变是一次性完成。由基因操作获得的微生物菌株可以进行代谢进化以提高所希望获得的有机酸的产率、效价和体积产量。在本发明最优选的方面，合理的基因操作是分阶段完成，且在基因操作的各阶段之间进行代谢进化过程。
本发明的一种实施方式中，在代谢进化过程中发生的自发突变通过对染色体DNA适当区域进行测序而被识别。在本发明另一种实施方式中，代谢进化过程中发生的突变通过测定可疑酶(suspect enzyme)的活性而被识别。
在本发明的一种实施方式中，在合理设计的基础上，通过一种或多种突变使一种或多种基因失活，所述的基因编码已知在发酵路径中发挥作用的蛋白质。
在本发明的另一个方面中，除了使编码直接参与到发酵路径的蛋白质的基因失活之外，还使与编码在发酵路径中发挥作用的蛋白质的基因功能相似的基因失活。
在本发明一种实施方式中，对在三羧酸(TCA)循环中起作用的基因进行基因操作，以增加碳向琥珀酸生产的流动。在本发明的一个方面，通过TCA循环的还原臂(reductive arm)的碳流增加。在本发明的另一个方面，对通过TCA循环的氧化臂(oxidative arm)的碳流进行基因操作。在本发明的另一个方面，通过对与TCA循环紧密相连的乙醛酸支路路径进行基因操纵，增加流向琥珀酸的碳流。
在本发明的另一种实施方式中，在细胞内从TCA流向其他代谢路径的碳流被阻断，以使细胞内的碳池漏向琥珀酸生产。
在本发明的另一种实施方式中，通过对细胞内一种或更多种羧化酶(carboxylating enzymes)的基因操作使得进入TCA循环的碳流增加。在本发明的一个方面，一种或更多种羧化酶的表达通过对启动子区域的基因操作或解除对基因表达的阻遏而得以实现。
在本发明的另一种实施方式中，细胞内的磷酸烯醇式丙酮酸池，通过改变那些参与到需要磷酸烯醇式丙酮酸的碳摄取路径的基因而得到保存。在本发明的一个方面，使用于碳摄取的磷酸转移酶系统失活，目的是保存TCA循环运行可获得的磷酸烯醇式丙酮酸。
本发明列举了一些可进行基因操作以增加琥珀酸生产的目标物。本发明所描述的所有这些各种各样的目标物可以进行基因操作以改进琥珀酸生产。在本发明最优选的实施方式中，最小数量的目标物被选择进行基因操纵，以实现所希望的琥珀酸生产速度。
在本发明的优选实施方式中，能够高效价、产率和体积生产量地生产琥珀酸的生物催化剂被选出。在本发明最优选的方面，优选的生物催化剂能够每消耗1mol碳源至少生产1.0mol琥珀酸。
在本发明另一种最优选实施方式中，生物催化剂在代谢进化过程中被选出，它能够在无机盐培养基中每消耗1mol碳源至少生产1.0mol琥珀酸，且将琥珀酸生产与微生物生长结合。
在本发明另一种实施方式中，生物催化剂能够使用甘油作为原料生产琥珀酸。
本发明的其他优势，将在接下来的详细描述和提供的实施例中变得显而易见。
附图说明
图1A-1B：葡萄糖发酵生产琥珀酸盐。图1A显示大肠杆菌中葡萄糖发酵的标准路径。所述路径根据Unden和Kleefeld(2004)重新绘制。粗体箭头代表主要的发酵路径。叉代表基因删除，所述基因删除在本研究中用以设计KJ012(ldhA，adhE，ackA)。基因和酶：ldhA，乳酸脱氢酶；pflB，丙酮酸甲酸裂解酶；focA，甲酸转运蛋白；pta，磷酸转乙酰酶；ackA，乙酸激酶；adhE，乙醇脱氢酶；ppc，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；pdh，丙酮酸脱氢酶复合物；gltA，柠檬酸合成酶；mdh，苹果酸脱氢酶；fumA、fumB和fumC，延胡索酸酶同工酶；frdABCD，延胡索酸还原酶；fdh，甲酸脱氢酶；icd，异柠檬酸脱氢酶；acs，乙酰辅酶A合成酶；mgsA，丙酮醛合成酶；poxB，丙酮酸氧化酶；aldA，乙醛脱氢酶；以及aldB，乙醛脱氢酶。图1B显示了大肠杆菌的工程菌株中ATP生产和生长与琥珀酸生产的结合，其用于葡萄糖发酵的标准路径。实线箭头连接NADH池。点线箭头连接NAD+池。在厌氧条件下的糖酵解过程中，生长有必要与ATP生产和NADH的氧化结合。
图2A-2D：大肠杆菌生产琥珀酸的潜在羧化路径。编码关键羧化酶的基因用粗体显示。图2A显示磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧化酶(PPC)催化的反应。PPC酶催化的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的羧化反应不产生ATP。这被认为是葡萄糖发酵过程中大肠杆菌生产琥珀酸盐的主要路线。图2B显示了NADH依赖性苹果酸酶。能量在丙酮酸激酶(pykA或pykF)作用下在由ADP和PEP生成ATP的过程中被储存。苹果酸酶(sfcA)催化与NADH关联的还原羧化反应以生产苹果酸。图2C显示NADPH依赖性苹果酸酶。能量在丙酮酸激酶(pykA或pykF)作用下在由ADP和PEP生成ATP的过程中被储存。苹果酸酶(maeB)催化与NADPH关联的还原羧化反应以生产苹果酸。图2D显示被PEP羧激酶(PCK)催化的反应。能量通过生成ATP而被储存，所述ATP的生成发生在PEP羧化生产草酰乙酸的过程中。
图3A-3C：KJ012代谢进化生产KJ017，KJ032，和KJ060过程中的生长。菌株KJ012在NBS培养基上被连续转接，所述NBS培养基包含5％(w/v)(图3A)和10％(w/v)(图3B)葡萄糖，分别生产KJ017。在删除focA和pflB后，合成的菌株(KJ032)首先在添加有乙酸盐的培养基上传代培养(图3C)。在进一步转接生产KJ060的过程中，乙酸盐水平下降，随后去除。间断线作为对照，代表KJ017在不加乙酸盐条件下的发酵情况。符号：●＝OD550nm光密度。
图4A-4F：在产琥珀酸菌株的代谢进化过程中，发酵产品的总结。培养物如文中所述添加乙酸钠。黑箭头代表如文中所述的发酵条件的转换。KJ032代谢进化过程没有检测到甲酸，仅检测到少量乳酸。KJ070和KJ072代谢进化过程没有检测到甲酸和乳酸。KJ012到KJ017的代谢进化，分别在含5％w/v葡萄糖的培养基(图4A)和含10％w/v葡萄糖的培养基(图4B)中进行。KJ032到KJ060的代谢进化，分别在含5％w/v葡萄糖的培养基(图4C)和含10％w/v葡萄糖的培养基(图4D)中进行。KJ070到KJ071的代谢进化在含10％w/v葡萄糖的培养基中进行(图4E)。KJ072到KJ073的代谢进化在含10％w/v葡萄糖的培养基中进行(图4F)。图4A-4F符号：■，琥珀酸；□，甲酸；△，乙酸；▲，苹果酸；◆，乳酸；和
Figure BDA0000115712200000051
丙酮酸。
图5：E.coli C的基因操作和代谢进化步骤总结示意图，所述的E.coli C作为生物催化剂用于生产琥珀酸盐。所述过程代表261步连续的转接，提供了超过2000代基于生长的选择。克隆从每种培养方法的终培养物中被分离，并被指定菌株名字，见表4。
图6：6-磷酸-葡萄糖发酵的标准路径及其关联路径，显示了经设计用于琥珀酸生产的构建物中已经被慎重删除的基因。实线箭头代表主要的发酵路径。虚线箭头代表丙酮酸氧化生成乙酸的微好氧路径。点线箭头显示包含乙醛酸支路的路径，所述路径通常在有氧代谢中起作用。加框的叉表示三种起始基因的删除(ldhA，adhE，ackA)，这些基因用于构建KJ012和KJ017。普通的叉标记其他基因，这些基因在KJ017派生物的构建过程中被删除，所述KJ017派生物为：KJ032(ldhA，adhE，ackA，focA，pflB)，和KJ070(ldhA，adhE，ackA，focA，pflB，mgsA)，及KJ072(ldhA，adhE，ackA，focA，pflB，mgsA，poxB)。基因和酶：ldhA，乳酸脱氢酶；focA，甲酸转运蛋白；pflB，丙酮酸甲酸裂解酶；pta，磷酸转乙酰酶；ackA，乙酸激酶；adhE，乙醇脱氢酶；ppc，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；pdh，丙酮酸脱氢酶复合物；gltA，柠檬酸合成酶；mdh，苹果酸脱氢酶；fumA，fumB，and fumC，延胡索酸酶同工酶；frdABCD，延胡索酸还原酶；fdh，甲酸脱氢酶；mgsA，丙酮醛合成酶；gloAB，乙二醛酶I和II；poxB，丙酮酸氧化酶；aceA，异柠檬酸裂解酶；aceB，苹果酸合成酶；acnAB，顺乌头酸酶；和acs，乙酰辅酶A合成酶。
图7A-7C：由E.coli C派生物在含有10％葡萄糖(w/v)的无机盐培养基中生产琥珀酸和苹果酸。图7A显示在AM1培养基中由KJ060生产琥珀酸。图7B显示在AM1培养基中由KJ073生产琥珀酸。图7C显示在NBS培养基中由KJ071生产苹果酸。发酵接种量以细胞干重(DCW)计为33mg l-1。图7A-7C符号：○，葡萄糖；●，琥珀酸；■，苹果酸；△，细胞量。
图8：构建质粒pLOI4162涉及的步骤。与pEL04和pLOI4152相关的短实线箭头代表引物，所述引物用于DNA扩增。
图9：在KJ073中由6-磷酸-葡萄糖生产琥珀酸。用于编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pck基因以反向型显示，所述的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶在本研究中是参与琥珀酸生产的主要羧化酶。实线箭头表示预期会在葡萄糖厌氧发酵过程中起作用的反应。加框的叉代表用于构建产琥珀酸的初始菌株KJ017(ldhA，adhE，ackA)的关键删除。虚线代表丙酮酸利用PoxB氧化为乙酸，这是一个典型的仅在微好氧条件下起作用的过程。点线表示主要与有氧代谢有关的反应。基因和酶：ldhA，乳酸脱氢酶；fflB，丙酮酸甲酸裂解酶；focA，甲酸转运蛋白；pta，磷酸转乙酰酶；ackA，乙酸激酶；adhE，乙醇脱氢酶；pck，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；pdh，丙酮酸脱氢酶复合物；gltA，柠檬酸合成酶；mdh，苹果酸脱氢酶；fumA，fumB，and fumC，延胡索酸同工酶A，B，C；frdABCD，延胡索酸还原酶ABCD；fdh，甲酸脱氢酶；icd，异柠檬酸脱氢酶；acs，乙酰辅酶A合成酶；mgsA，丙酮醛合成酶；poxB，丙酮酸氧化酶；aldA，乙醛脱氢酶A；和aldB，乙醛脱氢酶B。tdcE基因(丙酮酸甲酸裂解酶，与pflB同源)和tcdD基因(丙酸激酶，与ackA同源)显示在括号中，且通常在苏氨酸降解过程中被表达。
图10：代谢的展开部分，说明其他基因的路径，这些基因已被删除(实线叉)。KJ073发酵的主要产物(加框的)是琥珀酸和乙酸。基因和酶：citDEF，柠檬酸裂解酶；gltA，柠檬酸合成酶；aspC，天冬氨酸转氨酶；pck，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；sfcA，NAD+-苹果酸酶；fumA & fumB，延胡索酸酶；frdABCD，延胡索酸还原酶；pykA & pykF，丙酮酸激酶；tdcE，丙酮酸甲酸裂解酶(pflB的同源基因)；pta，磷酸转乙酰酶；tcdD，乙酸激酶(ackA的同源基因).
图11：在经设计用于琥珀酸生产的大肠杆菌菌株中的葡萄糖发酵。5个实心五角星表示已经被阻断的代谢步骤，所述的阻断是通过构建基因删除实现的。2个空心五角星表示已经被阻断的代谢步骤，所述的阻断是通过代谢进化过程中获得的突变而实现的。点线箭头表示生产琥珀酸的突变体(KJ060和KJ073)没有功能活性或者只有微弱的功能活性。垂直方向的粗体箭头表示KJ060和KJ073中生产琥珀酸盐的主要路径。所述路径功能上相当于生产琥珀酸的瘤胃细菌的路径。galP和pck两种基因在菌株培育过程中通过转录激活。在基于生长的选择过程中，获得ptsI中的一个缺失(空心五角星)，使得用于摄取和磷酸化的天然葡萄糖磷酸转移酶系统失活。GalP随后被发现充当葡萄糖的主要的转运蛋白，随之进行葡萄糖激酶(glk)作用下的ATP依赖性磷酸化作用。
图12A-12C：多种产琥珀酸工程菌株的转录丰度比较。图12A显示大肠杆菌ATCC8739，KJ012，KJ017，KJ060，KJ071和KJ073菌株中基因pck，ppc，sfcA和maeB的转录相对丰度。图12B显示大肠杆菌的ATCC8739，KJ012，KJ017，KJ060，KJ071和KJ073菌株中与葡萄糖利用相关的基因的转录相对丰度，所述的与葡萄糖利用相关的基因名为cyaA，crp，ptsG，galP和glk。图12C显示大肠杆菌ATCC8739，KJ012，KJ017，KJ060，KJ071和KJ073菌株中ptsI和crr基因的转录相对丰度。
图13：使用混合酸发酵路径的大肠杆菌厌氧代谢路径(Bock & Sawers，1996)。天然混合酸路径用黑箭头显示。另外的用于葡萄糖摄取、羧化和乙酰辅酶A合成的反应如点线箭头所示。粗体点线箭头表示用于在大肠杆菌突变体中生产琥珀酸的新的代谢步骤。通过基因删除或点突变而阻断的反应用一个X标记。pck*表示一种新的突变，所述突变解除了对磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的阻遏，增强了活性并且允许所述磷酸烯醇丙酮酸羧激酶充当草酰乙酸生产的主要路线。在本图中丙酮酸(加框的)出现在两个位置，但作为单一的细胞内的池体存在。
图14.：在野生型大肠杆菌中，普遍公认的甘油代谢路径与混合酸发酵(厌氧)结合。这些路径是以EcoSal中的最新进展、Ecocyc中可获得的数据和主要文献的回顾的结合为基础(Bachler等人，2005；Berman和Lin，1971；Bock和Sawers，1996；Erni等人，2006；Gutknecht等人，2001；Jin等人，1983；Keseler等人，2005；Lin，1996；Tang等人，1982)。粗体箭头表示通常被认为在甘油代谢和混合酸发酵中占优势的路径。细线箭头显示一条被认为在野生型大肠杆菌中是隐秘的和非功能性的路径(Jin等人，1983；Tang等人，1982)，所述路径涉及二羟基丙酮作为中间体。这条路径被认为仅在突变体中起作用，所述突变体中glpK是失活的(Jin等人，1983；Tang等人，1982)。细线箭头还显示glpD，所述脱氢酶被认为在有氧代谢过程中起作用，作为glpABC(厌氧代谢)的一种替代。缩略词：DHA，二羟基丙酮；DHAP，3-磷酸-二羟基丙酮；PEP，磷酸烯醇式丙酮酸盐；G3P，3-磷酸-甘油；GA3P，3-磷酸-甘油醛。PEP被加框，表示一种共用池。
图15：新的大肠杆菌路径，用于在无机盐培养基中由甘油厌氧生产琥珀酸。粗体箭头表示在含有三个核心突变的菌株(例如XZ721)中甘油厌氧代谢生产琥珀酸的主要路径。点线箭头显示被pflB和ptsI中的突变阻断的路径。在这条路径中，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的突变活化(pck*)允许所述酶充当生产草酰乙酸的主要羧化步骤。不同于另一种可供选择的羧化酶——磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)，PCK储存能量以生产额外的ATP用于生物合成。
具体实施方式
本发明使用的术语“效价(titer)”是指发酵液中特定化合物的体积摩尔浓度。因此，本发明琥珀酸生产的发酵过程中，琥珀酸效价100mM是指测量时每升发酵液中含有100毫摩尔琥珀酸。
本发明使用的术语“产率”是指发酵过程中，每消耗1mol原料生产的特定化合物的摩尔量。因此，在以葡萄糖作为原料生产琥珀酸的发酵过程中，术语产率是指每消耗1mol葡萄糖生成的琥珀酸的摩尔量。
本发明使用的术语“体积产量”是指单位时间单位体积生产的特定化合物的克数。因此，琥珀酸体积产量为0.9gL-1h-1，表示在1升发酵液中在1小时生长时间内累积得到0.9g琥珀酸。
本发明使用的术语“效价”、“产率”和“体积产量”还包括“标准效价”、“标准产率”和“标准体积产量”。在标准效价、标准产率和标准体积产量的测定中，中和试剂的体积也需加以考虑，所述中和试剂被加入发酵容器中以维持生长培养基的pH值。
此处所用的术语“基因工程”或“基因修饰”是指通过操作微生物的染色体DNA改变微生物中一种或多种酶的表达的实践。
本发明提供了一种利用基因修饰细菌菌株(GMBS)由碳化合物生产商业上有效量的琥珀酸的方法。本发明公开了适合于通过发酵过程生产琥珀酸的微生物。
本发明使用的术语“基因”包括基因的开放阅读框以及上游和下游调控序列。上游调控区域也被称为基因的启动子区域。下游调控区域也被称为终止子序列区域。
本发明使用的术语“突变”是指对基因进行基因修饰，所述基因包括开放阅读框、上游调控区域和下游调控区域。基因突变的结果为基因开放阅读框转录的上调或下调或完全抑制。基因突变通过下列方法实现：删除基因的整个编码区域或部分编码核苷酸序列，或者引入移码突变、错义突变和插入点，或者引入终止密码子，或者上述方式的组合。
本发明使用的术语“外源”是指来自细胞外部的分子或活性被引入宿主微生物有机体。就被引入微生物细胞的外源核酸分子而言，引入的核酸可以以独立的质粒或以整合到宿主染色体DNA中的形式存在。编码蛋白的外源核酸可以携带其自身的调控序列(例如启动子和终止子序列)以一种可被表达的形式被引入微生物细胞。另一种方法是，所述外源核酸分子可以整合到宿主染色体DNA中，且可以受宿主调控序列的控制。
术语“内源”是指存在于宿主细胞内的分子和活性。当被视为一种生物合成活性使用时，术语“内源”是指一种被引入宿主涉及有机体(host reference organism)的活性。来源可以是，例如同源或异源编码核酸，所述的同源或异源编码核酸在引入宿主微生物有机体后表达相关的活性。如果编码蛋白的核酸是从同种微生物有机体获得，那么就被称为同源DNA。如果核酸来自不同的微生物物种，那么称为异源DNA。不考虑DNA的本质，不管是同源还是异源，当DNA被引入宿主细胞时，所述DNA以及来自于该DNA的活性被视为外源。因此，本发明编码核酸的外源表达可以利用异源和同源编码核酸中的一种或两种。
本发明提供GMBS，当所述GMBS在无机盐培养基中在发酵条件下生长以生产琥珀酸时，获得了令人印象深刻的效价、高产率和显著的体积产量，所述无机盐培养基含有在发酵过程中作为底物的碳源。本发明的微生物能够用于单一步骤的生产过程，所述生产过程使用各种糖，例如己糖、戊糖、二糖和其他碳化合物，例如甘油。
在本发明中，独特而有利的基因突变的组合被用于引导碳流向琥珀酸生产。另外，琥珀酸生产与微生物的生长相结合，所述微生物生长转而与细胞的ATP水平和氧化还原平衡相联系。
术语“氧化还原平衡”是指细胞维持合适的NADH与NAD+的比例的能力。也就是说，细胞能够使NADH氧化，使得在厌氧发酵生长过程中有足够的NAD+来使糖类底物氧化。在厌氧生长过程中，NAD+池能够通过NADH的氧化磷酸化再生。然而，在厌氧生长条件下，NAD+池的再生只有依靠操作碳流通过细胞内各种能够使NADH氧化的代谢路径而实现。
在本发明的一种实施方式中，基因修饰仅涉及微生物天然基因组内的基因操作。在所述的实施方式中，用作琥珀酸生产的生物催化剂的细菌菌株中没有引入外源基因材料，例如带抗生素抗性基因的质粒，或任何其它编码某些酶蛋白的外源核酸序列。
适合本发明的重组微生物来源于一些细菌家族，优选来源于肠杆菌科家族。合适的微生物选自埃希氏杆菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、普罗维斯登菌属(Providencia)和沙雷氏菌属(Serratia)。特别优选埃希氏杆菌属。在埃希氏杆菌属中，特别优选大肠杆菌(Escherichia coli)种。大肠杆菌种中的任意一类菌株均适用于本发明，如E.coli B，E.coli C，E.coli W或诸如此类。
大肠杆菌菌株能够生产有效量的有机酸为本领域公知。例如，美国专利申请US2009/0148914提供了大肠杆菌菌株，其作为生物催化剂用于生产化学纯乙酸和/或丙酮酸。美国专利申请US2007/0037265和美国专利US7,629,162提供了E.coli K011菌株的派生物，用于生产乳酸。PCT申请WO 2008/115958提供了工程化微生物，该工程化微生物用于在基本无机盐培养基中生产琥珀酸和苹果酸，所述的基本无机盐培养基中含有葡萄糖作为pH控制的分批发酵的碳源。
本发明的一些其他实施方式中，本发明可以进行修饰的细菌包括，但不限于：氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)，浅井氏葡糖杆菌(Gluconobacter asaii)，带马瓦无色杆菌(Achromobacterdelmarvae)，粘液无色杆菌(Achromobacter viscosus)，乳无色杆菌(Achromobacter lacticum)，根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)，粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)，柠檬节杆菌(Arthrobacter citreus)，肿胀节杆菌(Arthrobacter tumescens)，石蜡节杆菌(Arthrobacter paraffineus)，裂烃谷氨酸节杆菌(Arthrobacter hydrocarboglutamicus)，氧化节杆菌(Arthrobacter oxydans)，天牛短小杆菌(Aureobacterium saperdae)，印度固氮菌(Azotobacterindicus)，产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)，叉分短杆菌(divaricatum)，乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)，黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)，球形短杆菌(Brevibacteriumglobosum)，暗褐短杆菌(Brevibacterium fuscum)，酮戊二酸短杆菌(Brevibacterium ketoglutamicum)，创伤短杆菌(Brevibacterium helcolum)，极小短杆菌(Brevibacterium pusillum)，砖红色短杆菌(Brevibacterium testaceum)，玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)，(Brevibacterium immariophilium)，扩展短杆菌(Brevibacterium linens)，(Brevibacterium protopharmiae)，嗜乙酰棒杆菌(Corynebacteriumacetophilum)，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，帚石南棒杆菌(Corynebacterium callunae)，嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)，醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)，产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，解淀粉杆菌(Erwinia amylovora)，胡萝卜软腐杆菌(Erwiniacarotovora)，草生假单胞菌(Erwinia herbicola)，菊果胶杆菌(Erwinia chrysanthemi)，奇异黄杆菌(Flavobacterium peregrinum)，(Flavobacterium fucatum)，橙黄色黄杆菌(Flavobacterium aurantinum)，莱茵黄杆菌(Flavobacterium rhenanum)，塞沃尼黄杆菌(Flavobacterium sewanense)，短黄杆菌(Flavobacterium breve)，脑膜炎黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum)，微球菌CCM825(Micrococcussp.CCM825)，摩氏摩根菌(Morganellamorganii)，灰暗诺卡氏菌(Nocardiaopaca)，粗糙诺卡氏菌(Nocardia rugosa)，(Planococcus eucinatus)，雷特洛变形杆菌(Proteus rettgeri)，谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)，产黄假单胞菌(Pseudomonas synxantha)，产氮假单胞菌(Pseudomonasazotoformans)，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，卵状假单胞菌(Pseudomonas ovalis)，施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)，食酸假单胞菌(Pseudomonas acidovolans)，霉味假单胞菌(Pseudomonas mucidolens)，睾丸酮假单胞菌(Pseudomonas testosteroni)，铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)，紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)，红球菌ATCC 15592(Rhodococcus sp.ATCC 15592)，红球菌ATCC 19070(Rhodococcus sp.ATCC 19070)，脲芽孢八叠球菌(Sporosarcina ureae)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，梅氏弧菌(Vibriometschnikovii)，干酪弧菌(Vibrio tyrogenes)，马杜拉放线菌(Actinomaduramadurae)，图列茨链霉菌(Actinomyces violaceochromogenes)，丘疹性北里孢菌(Kitasatosporia parulosa)，天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)，淡黄色链霉菌(Streptomyces flavelus)，浅灰链霉菌(Streptomyces griseolus)，变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)，橄榄色链霉菌(Streptomyces olivaceus)，田无链霉菌(Streptomycestanashiensis)，弗吉尼亚链霉菌(Streptomyces virginiae)，抗生链霉菌(Streptomyces antibioticus)，可可链霉菌(Streptomyces cacaoi)，淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)，产绿色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)，杀鲑气单孢菌(Aeromonas salmonicida)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliqyefaciens)，凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)，短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)，溶硫胺芽孢杆菌(Bacillus thiaminolyticus)，弗罗思特杆菌(Escherichia freundii)，嗜氨微杆杆菌(Microbacteriumammoniaphilum)，粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)，乙型副伤寒杆菌(Salmonella schottmulleri)，柑桔黄单孢菌(Xanthomonas citri)，等等。
适于本发明实施的微生物可以有氧生长(氧气存在条件下)，或厌氧生长(完全缺乏氧气条件下)，或微好氧生长(仅提供极小量氧气)。在本发明优选的实施方式中，被选择用于生产琥珀酸的微生物在厌氧条件下生长。可供选择地，适于本发明的微生物能够在双相生长环境下生长，即微生物先在有氧生长条件下生长至达到一定的细胞生长水平，然后转移到厌氧生长条件下生长以获得商业上有效量的琥珀酸。本发明微生物在生产琥珀酸的双相生长过程中，琥珀酸的生产和累积发生在厌氧发酵生长阶段。
本发明结合特异性的基因操作技术和代谢进化过程以获得菌株，所述菌株在厌氧条件下于含糖类底物的无机盐培养基中生产琥珀酸，显示出高产率、效价和体积产量。
通过基因操作获得的微生物菌株具有生产琥珀酸所期望的基因型。然而，所述微生物菌株在基本无机盐培养基中的生长速率或它们达到琥珀酸生产所要求的产率、效价和体积产量的能力，可能不允许我们使用这些基因修饰微生物作为生物催化剂通过大规模发酵过程来商业生产琥珀酸。因此，通过基因修饰获得的基因修饰微生物，随后在含糖类源的无机盐培养基中培养数代，以筛选具有非常高的琥珀酸产率的克隆。具有最优选表型的克隆基于生长的筛选过程被称为代谢进化。在代谢进化过程中，基因修饰菌株被重复转接至新鲜的基本培养基培养一段时间以获得克隆，其中，代谢进化过程中发生的自发突变导致获得一种克隆，所述克隆表现出快速的细胞生长能力、对于不同的碳源的快速消耗能力、同时使用多种糖的能力、耐受碳源中的有毒化学物质的能力、以及获得高产率和产量的所期望的有机酸加上低产量和低产率的其他有机酸的能力。
在代谢进化过程中，注意力放在筛选具有所期望表型的克隆。一种通过代谢进化获得的、在添加有碳源的无机盐培养基中显示出非常好的生长速率、但是在所期望的有机酸的产率上没有改进的克隆，并非一种令人满意的克隆。
在使用一定的选择压力来促使有机体获得某一所希望的表型的代谢进化过程中，两种改变可能会发生。所述有机体可能简单地使自身适应于选择压力，并表现出一种改变的表型。或者，有机体可能在选择压力下经受一些基因改变，并永久地表现改变的表型。当仅仅是一种适应而没有基因改变时，一旦选择压力被解除，那么有机体回归其原来的表型。这些有机体被称为“适应的”有机体。这些“适应的”微生物在选择压力解除后，将回归其原来的表型。所述“适应的”微生物必须在选择压力下经受另外新一轮的代谢进化循环，以表现出改变的表型。另一方面，当伴随基因改变时，即使没有选择压力，改变的表型也将继续存在。伴随一定的基因改变的代谢进化是希望获得的。在代谢进化过程中获得稳定基因改变的微生物能够很容易地通过下列方法识别：将微生物在没有任何选择压力的条件下置于原生长培养基中培养一段时间，然后将其转接到存在选择压力的新鲜培养基中。如果这些有机体能够表现出没有任何停滞期的良好生长和所期望的表型，那么该有机体被认为在代谢进化过程中获得了改变的表型。
代谢进化过程获得的基因改变的基础可以通过对有机体染色体DNA的适当区域进行测序并将序列数据与亲本菌株进行比对而确定。DNA序列数据可以利用本领域公知的技术获得。例如，代谢进化的菌株的染色体DNA的适当区域能够通过聚合酶链反应获得，且聚合酶链反应获得的产品能够通过使用适当的测序引物的方式而被测序。
从培养物保藏中心(例如ATCC，美国模式培养物集存库)获得的大肠杆菌野生型菌株能够进行基因工程设计，随后代谢进化以获得一种菌株，所述菌株具有增强的生产商业有效量的琥珀酸的能力。
基因操作能够在几个不同阶段完成，在基因操作阶段之间伴随有代谢进化。基因操作包括改变内源DNA序列或从基因组DNA中完全消除特异性DNA序列。基因操作还包括将外来DNA序列插入微生物的基因组DNA序列。本发明的某些实施方式中，基因操作通过从微生物基因组DNA中消除特异性DNA序列且不引入任何外来DNA而完成。为使编码某一特定蛋白产物的基因的表达失效，需要进行某些基因操作，这些基因操作要求将一外来DNA序列插入微生物的基因组以筛选一种具有所期望的基因修饰的克隆。例如，外源抗生素标记基因能够被用来通过插入使内源基因失活，并筛选具有所期望的基因型的克隆。在本发明的一种实施方式中，引入的外源DNA序列最终从微生物基因组DNA中被消除，使得微生物在基因操作过程的最后在其原始基因组DNA中没有外源DNA。实现本发明优选实施方式的目的所必需的各种基因工程技术已经在两种不同的科学出版物上有详细描述(Jantama等人，2008a；Jantama等人，2008b)。美国专利申请US2007/0037265和US 2009/0148914及PCT申请WO2008/115958中也描述了对本发明各种实施方式的实施有用的基因工程技术。这些科学出版物和专利文献在此处以引文的方式并入本发明，以提供对本发明有用的基因工程技术的详细资料。
为了制备能生产有效量琥珀酸的微生物，参与一些微生物代谢路径(包括糖酵解路径、三羧酸循环(也被称为柠檬酸循环或TCA循环)和乙醛酸支路)的各种酶可以使用各种基因工程技术进行操作，所述基因工程技术描述在上段以引文方式引用和并入的科学和专利文献中。关于各种微生物代谢路径的详细资料能够在标准的生物化学教科书(例如Lehninger的Principles ofBiochemistry和LubertStryer的Biochemistry)中找到。可从美国密苏里州圣路易斯的Sigma Chemical Company获得的G.Michael的生物化学路径图也提供了细菌细胞内的各种生物化学路径的详细说明。
在有氧生长过程中，微生物碳代谢涉及糖酵解、三羧酸循环和氧化磷酸化。减少的酶辅助因子(例如NADPH和NADH)通过氧化磷酸化的运行再生，所述氧化磷酸化伴随细胞生长所需的ATP生产。在本发明优选的实施方式中，在厌氧条件下生产琥珀酸，减少的辅助因子NADPH和NADH的再生通过引导碳流流入三羧酸循环及消除所有再生NADP+和NAD+的发酵路径来实现。
根据优选的有机酸的类型，代谢路径进行特异性的设计，以使微生物生产我们选择的特定有机酸。微生物能够合成多种有机酸，包括乳酸、乙酸、苹果酸、丙酮酸和琥珀酸。因此在培育一种用于琥珀酸生产的生物催化剂过程中，用于生产乙酸、乳酸、丙酮酸和甲酸的路径就被阻断，并且通过操作参与到细胞内碳代谢的一种或多种酶促进碳流流向琥珀酸生产。在微生物发酵路径中有活性的、且能够使用已知的基因工程技术进行操作的酶的列表包括，但不限于：异柠檬酸合成酶(aceA)，苹果酸合成酶(aceB)，乙醛酸支路操纵子(aceBAK)，乙酸激酶-磷酸转乙酰酶(ackA-pta)，顺乌头酸水合酶1和2(acnA和acnB)，乙酰辅酶A合成酶(acs)，柠檬酸裂解酶(citDEF)，乙醇脱氢酶(adhE)，柠檬酸合成酶(citZ)，延胡索酸还原酶(frd)，乳酸脱氢酶(ldh)，苹果酸脱氢酶(mdh)，乙醛酸循环操纵子抑制剂(iclR)，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(pepC)，丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)；丙酮酸氧化酶(poxB)；丙酮酸羧激酶(pck)；和丙酮酸羧化酶(pyc)(图1，6，和9)。
碳源的糖酵解导致生成磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)。PEP通过混合酸路径被进一步代谢。本发明所用的术语“混合酸路径”是指碳流从PEP流经三羧酸循环和各种在厌氧条件下可使用的发酵路径。厌氧条件下，至少有4种不同的用于丙酮酸代谢的发酵路径可被识别。丙酮酸可以利用NADH还原成乳酸，并由此产生NAD+以维持碳源连续代谢所需的细胞的氧化还原平衡。来源于丙酮酸的乙酰辅酶A还可以被还原生成乙醇，同时伴随NADH氧化生成NAD+。丙酮酸还可以转化为甲酸或乙酸，如图1A所示。
TCA循环中，两条不同的臂已被识别。TCA循环的一条臂被称为氧化臂，所述氧化臂包括：碳流从从草酰乙酸经过异柠檬酸流向琥珀酸，利用NADP+使异柠檬酸氧化，同时生成NADPH。TCA循环的另一条臂被称为TCA循环的还原臂，所述还原臂包括：碳流从草酰乙酸经过苹果酸和延胡索酸流向琥珀酸，NADH被氧化生成NAD+，从而帮助细胞维持氧化还原平衡。
在本发明的一种实施方式中，从PEP通过发酵路径的碳流被阻止，所述的阻止是通过使编码参与到发酵路径的酶的基因失活而实现。适合于阻断碳流通过发酵路径的酶包括ldhA，pflB，adhE，pta，ackA，和poxB。所述基因中的一种或多种的消除预期可以减少从PEP通过发酵路径的碳流。所有6种基因的失活预期可以完全阻断通过发酵路径的碳流。本发明的另一个方面，除了使参与到发酵路径的其余六个基因失活之外，还使编码丙酮醛合成酶(mgsA)的mgsA基因失活，所述丙酮醛合成酶负责丙酮醛到乳酸的转化。
本发明的另一种实施方式，除了使众所周知参与到一个或其他发酵路径的基因失活之外，还使与参与到发酵路径的基因功能相似的基因失活。含有乙酸激酶活性的丙酸激酶由tdcD基因编码，所述丙酸激酶仅用于苏氨酸的降解。然而，在含10％(w/v)葡萄糖的厌氧生长条件下，tdcD的表达能从功能上取代ackA。此外，相同操纵子中邻近的tdcE基因类似于pflB，并编码含有丙酮酸甲酸裂解酶活性的α-酮丁酸甲酸裂解酶(α-ketobutryate formate lyase)。本发明的一个方面，使tdcDE基因失活以阻止碳进入发酵路径，并确保碳流入TCA循环。
本发明另一种实施方式中，除了阻断碳流通过发酵路径外，还改变碳流在TCA循环中的流动，以使碳流直接流向琥珀酸生产。本发明的一个方面，TCA循环中碳流的操作是通过上调一种或多种基因的表达而实现。本发明的另一个方面，可以使在TCA循环中起作用的一种或多种基因失活，以增加流向琥珀酸的碳流。
本发明优选的一个方面，编码苹果酸脱氢酶的基因mdh被上调，以提高苹果酸到延胡索酸和琥珀酸的转化。碳流从草酰乙酸经过苹果酸和延胡索酸到琥珀酸的流动被称为TCA循环的还原臂。碳通过所述TCA循环的还原臂从草酰乙酸到琥珀酸的流动，每产生1mol琥珀酸将消耗2mol NADH，从而帮助维持细胞在厌氧条件下的氧化还原平衡。换句话说，mdh的上调有助于NAD+的再生，所述NAD+是维持细胞氧化还原平衡所必需的。mdh基因表达的上调能够通过下列方法实现：用其他强启动子序列替换mdh基因的天然启动子，或者使mdh基因的启动子区域突变，以使mdh基因的转录增强。另外，额外的mdh基因的拷贝也能被加入菌株中。本发明一种优选的实施方式，mdh基因表达的上调是通过对其启动子区域进行基因操作实现的。
在TCA循环的通常操作中，通过TCA循环的氧化臂的运行生产琥珀酸。所述氧化臂是指碳流从草酰乙酸经过柠檬酸、顺乌头酸、异柠檬酸、-酮戊二酸和琥珀酰辅酶A到琥珀酸的流动。琥珀酸还能通过乙醛酸支路的运行生产。在乙醛酸支路运行过程中，在异柠檬酸裂解酶作用下，由异柠檬酸生成琥珀酸和乙醛酸。通过TCA循环氧化臂的运行或乙醛酸支路的运行而生产得到的琥珀酸，能够在琥珀酸脱氢酶(sdh)的作用下，生成延胡索酸，然后生成苹果酸。因此，本发明另一种实施方式中，使用基因失活的方法以防止琥珀酸的脱氢作用，达到增加细胞内琥珀酸生产的目的。
本发明的另一个方面，可以对通过乙醛酸支路的碳流进行操作，以增加琥珀酸生产。异柠檬酸裂解酶催化异柠檬酸裂解生成乙醛酸和琥珀酸。异柠檬酸裂解酶由aceBAK操纵子编码。异柠檬酸裂解酶活性被iclR基因抑制。换句话说，iclR基因的表达阻碍了乙醛酸支路的运行。本发明的一个方面，除了使参与到发酵代谢的基因失活外，还使iclR基因失活。
本发明的另一种实施方式中，除了通过基因操作阻止发酵路径的运作和增加TCA循环内流向琥珀酸生产的碳流外，还可以通过基因方法阻断碳流从TCA循环向外流向其他代谢路径，以增加琥珀酸生产。例如，可以阻断碳流从TCA循环进入氨基酸代谢，以增加流向琥珀酸的碳流。天冬氨酸转氨酶基因(aspC)在天冬氨酸的合成中，从谷氨酸转移氨基至草酰乙酸，由此促进碳从TCA循环向外流动。本发明的一个方面，接着使aspC基因失活以阻断碳从TCA循环向外流动，目的是增加从草酰乙酸经过TCA循环的氧化或还原臂流向琥珀酸生产的碳流。
另一种碳从TCA循环向外的流动发生于苹果酸。苹果酸酶(sfcA)作用下的苹果酸的脱羧反应导致生成丙酮酸。本发明的一个方面，使编码苹果酸酶的sfcA基因失活以减少碳从TCA循环向外流动。本发明另一个方面，使aspC和sfcA基因两者都失活，以阻止碳从TCA循环向外流动，从而提高琥珀酸累积。
本发明的另一个方面，通过使柠檬酸裂解酶基因(citDEF)失活而阻止碳从TCA循环向外流动，所述柠檬酸裂解酶负责使柠檬酸裂解为草酰乙酸和乙酸。
除了发现使参与到发酵路径的基因和与它们功能上相似的基因失活，阻止碳从TCA循环外流以及调控TCA循环内碳流向琥珀酸能够提高微生物发酵中琥珀酸产率外，本发明还意外地发现通过对微生物细胞内的羧化酶的基因操作可以进一步提高琥珀酸产率。代谢进化过程中发生的改变通过基因和酶分析进行表征，本发明的发明人意外发现细胞内的羧化酶可以成为另外一个基因操作的目标，以实现琥珀酸产率的提高。
糖酵解中间产物磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸能被羧化，以增加流进TCA循环的碳流。正常条件下，碳进入TCA循环是在柠檬酸合成酶作用下完成的，所述柠檬酸合成酶连接乙酰辅酶A(来自丙酮酸)和草酰乙酸(TCA循环的一个中间产物)生成柠檬酸。通过提高存在于细胞内的一种或多种羧化酶的效率，羧化磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸生成草酰乙酸是可能的，所述草酰乙酸是TCA循环的一个中间产物(图2)。通过羧化反应生成的草酰乙酸能进一步通过TCA循环的还原臂被还原生成琥珀酸。
本发明提供了一种对细胞内羧化酶进行操作以在厌氧发酵生长过程中提高琥珀酸产率的方法。本领域技术人员公知，通过从外源引入丙酮酸羧化酶(pyc)，丙酮酸可以羧化生成草酰乙酸。非常适于基因操作的微生物菌株(如大肠杆菌)不含pyc基因。来源于其他细菌种类(如菜豆根瘤菌(Rhizopium elti)和双歧乳酸杆菌(Lactobacillus lacti))的pyc基因能够被引入基因修饰的大肠杆菌菌株，以促进琥珀酸生产。
已知大肠杆菌内有4种不同的内源羧化酶。所述羧化酶中的两种负责羧化磷酸烯醇式丙酮酸，另外两种酶负责羧化丙酮酸，所述丙酮酸是在丙酮酸激酶的作用下由磷酸烯醇式丙酮酸生成。所述的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)使磷酸烯醇式丙酮酸羧化生成草酰乙酸，所述的草酰乙酸能进入TCA循环的还原臂以生产琥珀酸。第二种羧化酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(ppk)也能使磷酸烯醇式丙酮酸羧化生成草酰乙酸，但它通常催化逆反应，因所述酶在葡萄糖存在时不表达。另外两种羧化酶被命名为NADH-苹果酸酶(maeB)和NADPH-苹果酸酶(maeA/sfcA)，所述两种酶能够使丙酮酸羧化生成苹果酸。所述maeB和sfcA酶羧化丙酮酸，所述丙酮酸是在丙酮酸激酶作用下由磷酸烯醇式丙酮酸生成。
存在于细胞内的四种羧化酶中的任意一种都能进行基因修饰以增加酶活，从而增加从糖酵解循环中间体流入TCA循环的碳流。大肠杆菌中存在的四种天然羧化酶中，PPC催化的反应有强大的优势。在这个反应中，PEP随着无机磷酸盐的释放失去所含的能量。另外3种名为pck，maeA和sfcA(maeB)的羧化酶，不被期望在以葡萄糖为底物的发酵生长过程中起作用，因为这三种羧化酶被葡萄糖抑制。所述三种羧化酶被认为在逆反应中在糖异生过程中起作用，那时细胞中发生有机酸的氧化代谢。
本发明中，发明人意外地发现糖异生的PEP羧激酶(PCK)能进行基因修饰，以增加碳流入TCA循环。使用pck作为大肠杆菌中琥珀酸生产的主要路径是出人意料的，并与目前对于pck的功能的理解相反。先前的研究已经表明增强大肠杆菌和产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus.succinogenes)的pck的表达对琥珀酸生产没有影响(Kim等人，2004；Millard等人，1996)。一个近期的研究已经证明大肠杆菌pck的表达增强对于在基本培养基中的生长是不利的，会降低生长速率、葡萄糖代谢速率和琥珀酸产率(Kwon等人，2008)。增强pck活性的优势在于，这种酶在使磷酸烯醇式丙酮酸羧化生成草酰乙酸的同时，每生成1mol草酰乙酸就会产生1molATP。ATP产率的提高将会提高细胞的生长速率。
磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶在本发明构建的许多大肠杆菌菌株中的活性的对比分析已经揭示，代谢进化过程中PCK酶活性的增强是源于pck基因转录活性的增强。在那些显示与细胞生长相结合的琥珀酸生产增加的菌株中，pck的转录丰度提高。事实上，本发明的结果已经在pck转录水平的提高与PCK酶活性和与生长相结合的琥珀酸生产的提高之间建立了正相关关系。
天然糖异生的pck在琥珀酸发酵生产中的使用可以通过任意对于pck基因的转录具有积极作用的突变实现。PCK活性水平的提高可以通过在多拷贝质粒中表达pck基因而实现，所述多拷贝质粒含有天然启动子或已知能够提高基因表达的任意其他启动子序列。提高细胞内pck基因表达的另一种方法是利用转座子整合pck基因的额外多个拷贝。本发明另一种实施方式中，pck基因天然启动子可以被其他一些已知能够增强活性水平的启动子元素替换。增强pck基因的表达还能通过基因的启动子区域的突变或对调控元素进行基因操作来实现，所述调控元素已知能与pck基因的启动子区域相互作用。编码pck基因的调控蛋白的基因能以某种方式被突变或删除或过量表达，以增强pck基因的表达。本发明结果已经表明，单点突变(相对于pck基因的ATG启动密码子-64位点处G被A置换)能够增加pck基因的转录，同时伴随着磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶酶活的相应增强。类似的pck基因表达的增强还能通过对编码蛋白质的基因进行基因操作而实现，所述蛋白质为已知能调控pck基因的表达的蛋白质。例如，Cra蛋白已经显示能活化pck基因在大肠杆菌中的表达(Saier和Ramseier，196)。类似地，csrA体系(包含csrA，csrB，csrC，csrD，uvrY或barA)也被报道通过改变mRNA稳定性可用于调控pck以及参与到葡萄糖代谢的其他基因的水平(Babitzke和Romeo，2007；Pernestig等人，2003；Suzuki K等人，2002)。
本发明另一种用于增加厌氧发酵过程中与生长相结合的琥珀酸生产的基因方法，与通过生物催化剂进行的糖摄取中消耗的能量的储存有关。
微生物通过位于细胞质膜上的一组转运蛋白摄取糖(Jojima等人，2010)。微生物的糖转运蛋白分为三个主要类别。细菌内最大的糖转运蛋白类别是ATP结合盒(ABC)转运蛋白。顾名思义，ABC转运蛋白每转运1摩尔糖进入细菌细胞就需要消耗1摩尔ATP。XylFGH是一种ABC转运蛋白，用于转运木糖(一种戊糖)到细胞内。AraFGH是一种ABC转运蛋白，用于转运阿拉伯糖，即另外一种戊糖。
细菌糖转运蛋白的第二种类型被归类在主要易化子超家族(MFS)下面。MFS糖转运蛋白中，两种不同类别的转运蛋白已得到确认。MFS包括H+-同向共转运蛋白(H+-linked symporters)，Na+-同向共转运蛋白-逆向转运蛋白(Na+-linked symporters-antiporters)和单向转运蛋白(uniporters)。单向转运蛋白是一类简单的糖转运的辅助者，它们每转运1摩尔糖进入细胞，需要1摩尔ATP。大肠杆菌内的跨膜蛋白Glf是单向转运蛋白的一个例子。H+-同向共转运蛋白每转运1摩尔糖进入细胞，需要1个质子和1摩尔ATP。大肠杆菌内的GalP蛋白是一种同向转运蛋白，用于转运半乳糖(一种己糖)进入细胞。GalP含12个跨膜螺旋，是一种非常好的特征性同向转运蛋白。据报道，GalP还能够转运葡萄糖穿过细胞膜。AraE是一种H+-同向共转运蛋白，用于转运阿拉伯糖穿过细胞膜。类似地，XylE蛋白是一种用于转运木糖的H+-同向共转运蛋白。
第三类糖转运蛋白主要负责己糖(如葡萄糖)的摄取，所述第三类糖转运蛋白被称为磷酸烯醇式丙酮酸：糖类磷酸转移酶系统(PTS)。PTS催化下磷酸烯醇式丙酮酸的磷酰基的转移，促使葡萄糖转运和磷酸化，导致细胞内6-磷酸-葡萄糖和丙酮酸的形成。在有氧培养条件下，PTS生产的丙酮酸明显不能再生为PEP，在该情况下葡萄糖是唯一的碳源。相反，丙酮酸经三羧酸循环被氧化生成二氧化碳。因此，每转运1分子的葡萄糖，要消耗1分子的PEP。根据细胞内生物能量学，凭借PTS进行的糖转运是一个能量密集过程。因此，在厌氧生长的细胞内，在需要保存细胞内的磷酸烯醇式丙酮酸含量用于生产工业上有用的化学品的情况下，期望能够用其他糖转运蛋白替代PTS，所述的糖转运蛋白每转运1摩尔糖至细胞内，不需要消耗1摩尔PEP。
除了这些直接参与到微生物代谢路径的糖酵解、三羧酸循环和乙醛酸循环的基因外，还可以对参与到碳化合物的摄取的基因进行基因操作以增加碳摄取或提高有机酸生产中的能量利用效率，所述的碳化合物作为一种琥珀酸合成的能量来源是有用的。例如，消除通过磷酸转移酶系统(PTS)完成的葡萄糖摄取，有助于减少微生物细胞摄取葡萄糖的能量消耗。通过对PTS进行操作节约的能量能被引导用于提高有机酸生产效率。磷酸转移酶系统基因ptsH和ptsG可进行操作以节约葡萄糖摄取的能量，从而提高微生物生产琥珀酸的效率。因此，通过挖掘微生物代谢路径领域可获得的数据，可以删除一组基因以阻断大部分代谢路径，并引导碳流向琥珀酸生产，实现高效生产琥珀酸。
PTS是由两种名为E1和HPr的细胞质成分和一种膜结合成分EII组成。大肠杆菌至少包含15种不同的EII复合物。每种EII成分都对应特定的一种被转运的糖类型，所述EII成分包含两个疏水性整合膜区域(C和D)和两个亲水性区域(A和B)。所述四个区域一起负责糖分子的转运和磷酸化。EI蛋白将磷酸基团从PEP转移到HPr蛋白。EII蛋白将磷酸基团从磷酸化的HPr蛋白转移到糖分子。
EI由ptsI基因编码。HPr由ptsH基因编码。肠道细菌的葡萄糖特异性EII复合物包含两种不同的蛋白，即基因crr编码的EIIAGlc和基因ptsG编码的膜相关蛋白EIICBGlc。PTS介导的糖转运可以通过删除其中一个编码与PTS相关的蛋白的基因而得到抑制。PTS的功能性替换是实现由葡萄糖生成的产物产率和几类代谢产物的产量的显著提高的基因方法之一，所述PTS的功能性替换是代之以不依赖于磷酸烯醇式丙酮酸的摄取和磷酸化活动。
随着PTS介导的葡萄糖摄取被抑制，其他葡萄糖摄取系统可以被活化以确保细胞内可以持续获得葡萄糖用于生产工业上有用的化学品。例如，编码葡萄糖透性酶(一种葡萄糖单向转运蛋白)的glf基因，已被用于代替PTS介导的葡萄糖摄取的损失。类似地，galP和glk的过量表达被报道用于提高大肠杆菌的pts-菌株内的葡萄糖摄取和磷酸化。GalP是一种用于半乳糖(一种己糖)摄取的同向转运蛋白。据报道，GalP在pts-菌株内转运葡萄糖。GalP介导的葡萄糖摄取的重要性已被下列事实所证明：pts-突变体内的galP基因的失活被发现是致死的(Yi等人，2003)。在葡萄糖能够进入糖酵解之前，需要Glk完成葡萄糖分子的磷酸化。GalP蛋白在pts-菌株中的表达，能通过在组成型启动子作用下表达一种外源基因或通过解除对galP基因表达的阻遏作用来实现，所述的解除对galP基因表达的阻遏作用是通过编码galP基因的阻遏蛋白(例如galS和galR)的基因的突变实现的。
如上所述，使用生物催化剂的琥珀酸生产，依靠伴随着代谢进化的基因操作来实现。发生在代谢进化过程的基因改变可通过生物化学和基因分析识别。本发明意外地发现，存在于细胞内的磷酸转移酶系统和羧化酶的基因发生的突变可以积极地促成琥珀酸生产的增加。这些新发现的基因操作的目标能够与糖酵解、三羧酸和发酵路径的其他目标以不同的方式结合，以生成能高效率生产琥珀酸的生物催化剂。令人高度期待的是识别一组最小数目的目标基因用于基因操作，从而获得生产琥珀酸的最优菌株。
本发明还提供了提高甘油在琥珀酸生产中的利用的基因方法。甘油摄取是由glpF基因编码的蛋白介导的。一旦进入细胞，甘油被gldA基因编码的蛋白氧化生成二羟基丙酮(DHA)。DHA被由dhaKLM操纵子编码的蛋白磷酸化生成二羟基丙酮磷酸(DHAP)。DHA在dhaKLM编码的蛋白作用下磷酸化生成DHAP的反应依赖于磷酸烯醇式丙酮酸池的可利用性。由于DHA的磷酸化需要PEP，因此它耗尽了可用于PCK的PEP，所述PCK引导碳从PEP流入TCA循环以确保实现琥珀酸高产率所需的适当的氧化还原平衡。本发明意外地发现，阻止甘油流经细菌细胞内的gldA和dhaKLM路径可以提高以甘油作为碳源的琥珀酸的产率，所述细菌细胞具有增强的PCK酶活。本发明还意外地发现，通过阻止碳流经细菌细胞内的发酵路径可以进一步提高以甘油作为碳源的琥珀酸的产率，所述的细菌细胞具有增强的PCK酶活并删除了gldA基因和dhaKLM操纵子。
下列实施例用于对本发明进行举例说明。这些实施例并非用来限制本发明的范围。工业微生物学领域的技术人员在不违背本发明的精神的基础上，有能力采用一些不同的实施方式来实施本发明。
实验部分
基因标记
菌株，培养基及生长条件
E。coli C(ATCC 8739)新的派生物利用独特的基因缺失组合及以生长为基础的筛选进行培育用于琥珀酸生产。本发明培育的大肠杆菌各种菌株已被美国农业研究菌种保藏中心(ARS Culture Collection)保藏，保藏编号如表2所示。
本发明的微生物有机体能在许多不同的微生物领域熟知的培养基中生长。例如，大肠杆菌的野生型和突变菌株能在Luria-Bertani(LB)培养基中生长，所述LB培养基含有1％(w/v)胰蛋白胨、0.5％(w/v)酵母提取物和0.5％(w/v)NaCl。利用发酵过程以基因修饰微生物作为生物催化剂商业化生产有机酸，优选使用添加有碳源的基本无机盐培养基。使用基本无机盐培养基，相比于丰富培养基，如LB培养基，降低了商业规模生产有机酸的成本。
适于本发明的基本无机盐培养基包括新生牛血清(NBS)培养基(Causey等人，2007)和AMI培养基(Martinez等人，2007)。所述NBS培养基包含1mM甜菜碱，25.72mM KH2PO4，28.71mM K2HPO4，26.50mM(NH4)2HPO4，1mM MgSO4·7H2O，0.1mM CaCl2·2H2O，0.15mM硫胺素HCl，5.92MFeCl36H2O，0.84M COCl2·6H2O，0.59M CuCl2·2H2O，1.47M ZnCl2，0.83M Na2MoO4 2H2O，和0.81M H3BO3。所述AM1培养基包含1mM甜菜碱，19.92mM(NH4)2HPO4，7.56mM NH4H2PO4，1.5mM MgSO4·7H2O，1.0mM甜菜碱-KCl，8.88M FeCl36H2O，1，26M COCl2·6H2O，0.88M CuCl2·2H2O，2.20M ZnCl2，1.24M Na2MoO42H2O，1.21M H3BO3和2，50M MnCl24H2O。微量元素配制成1000X贮存液，包含下列组分：1.6g/L FeCl3，0.2g/L CoCl2·6H2O，0.1g/L CuCl2，0.2g/L ZnCl2·4H2O，0.2g/LNaMoO4，0.05g/L H3BO3，和0.33g/L MnCl2·4H2O。
用于微生物生产有机酸的无机盐培养基添加有碳源。在本发明中有用的碳源包括但不限于戊糖(如木糖)，己糖(如葡萄糖，果糖和半乳糖)及甘油。所述的碳源还可以是不同糖的组合，例如葡萄糖和木糖的组合。所述的碳源还能由淀粉或木质纤维素水解得到。复合糖类(如淀粉和木质纤维素)的水解可以通过本领域公知的热化学转化过程或酶催化方法实现。用于利用微生物发酵工业化生产有机酸的碳源优选来自农业或林业废料水解得到的木质纤维素水解产物。木质纤维素水解产物可以被进一步分解生成富集己糖的部分和富集戊糖的部分，这些部分可作为利用微生物发酵过程工业化生产有机酸的碳源。所述的木质纤维素水解产物可以进一步进行解毒，以除去某些化合物(例如糠醛)，这些化合物被发现当其达到一定浓度以上时会使多种微生物有机体中毒。
本发明使用的细菌菌株，质粒和引物列在表3，7，9，14和15，并在以下说明书适当的位置有详细说明。在菌株构建过程中，培养物在30，37或39℃下，于LB培养基(10g·l-1 Difco胰蛋白胨，5g·l-1 Difco酵母提取物和5g·l-1NaCl)中有氧生长，所述LB培养基含有2％(w/v)葡萄糖或5％(w/v)阿拉伯糖。为琥珀酸生产培育的最终菌株中不存在编码抗生素抗性的基因，质粒或外源基因。然而，在构建不同菌株的初期，使用各种抗生素抗性标记。抗生素筛选过程需要添加抗生素，例如氨苄青霉素(50mg·l-1)，卡那霉素(50mg·l-1)，或氯霉素(40mg·l-1)。
发酵
种子培养和发酵在37℃，100rpm条件下，在NBS或AM1无机盐培养基上生长，所述培养基包含葡萄糖，100mM KHCO3和1mM甜菜碱HCl。在一些实施方式中，使用了玉米浆。所述玉米浆是玉米湿磨工业的副产物。与酵母提取物和蛋白胨相比，玉米浆是维生素和微量元素的廉价原料。
用于发酵生产琥珀酸的菌株在37℃、无抗生素条件下于NBS无机盐培养基中生长(Causey等人，2004)，所述NBS无机盐培养基添加有10％(w/v)葡萄糖和100mM碳酸氢钾，另有规定的除外。通过转接新鲜克隆至250ml烧瓶(100ml NBS培养基，2％葡萄糖)培养用于发酵的预接种物(Pre-inocula)。16h(37℃，120rpm)后，所述培养物被稀释到一个含有300mlNBS培养基(10％葡萄糖，100mM碳酸氢钾)的小发酵容器中，以提供细胞浓度(以细胞干重计)为0.033g·l-1的接种物。
由于有机酸在生长培养基中的累积会降低培养基pH，因此有必要根据需要添加合适的中和试剂到培养基中。培养容器内的pH可以使用pH探针连续监控，并添加适当的碱以维持生长培养基的pH大约在中性pH。适于维持微生物培养基pH的碱包括，但不限于：NaOH，KOH，NH4SO4，Na2CO3，NaHCO3，和NH4CO3。适于所述目的的碱可以单独使用或组合使用。
在某些实验中，发酵通过添加包含额外的CO2的碱(1.2M氢氧化钾中含2.4M碳酸钾)自动维持pH 7.0。随后，通过添加3M K2CO3和6N KOH 1∶1的混合物维持pH。发酵容器被密封，除了用于样品取出的16号针孔。在生长过程中，通过添加碳酸氢盐确保CO2气氛以快速实现厌氧环境。
基因方法
抗生素抗性基因的染色体删除、整合和消除(removal)的方法，先前已有文献描述(Datsenko和Wanner，2000；Grabar等人，2006；Posfai等人，1997；Zhou等人，2006)。
在本发明使用的细菌菌株的构建中，如先前所述(Jantama等人，2008a，2008b；Zhang等人，2007)，染色体基因被无缝删除，没有留下外源DNA片段。Red重组酶技术(Gene Bridges GmbH，德累斯顿，德国)被用于促进染色体整合。构建过程中使用的质粒和引物列在表3，7，9，14，和15。用于菌株KJ012，KJ017，KJ032，KJ060，KJ070，KJ071，KJ072，KJ073，和SZ204构建的质粒和引物的总结见表3。正义引物(sense primers)含有与每个目标基因的N-端相一致的序列(粗体字形)，所述序列后跟随着与FRT-kan-FRT基因盒(cassette)相一致的20bp(下划线)。反义引物(Anti-senseprimers)包含与每个目标基因的C-端相一致的序列(粗体字形)，所述序列后跟随着与基因盒相一致的20bp(下划线)。扩增DNA片段通过电穿孔进入携带Red重组酶(pKD46)的大肠杆菌菌株。在生成的重组体中，FRT-kan-FRT基因盒通过同源重组(同源双交换事件)替换目标基因的删除区域。随后利用质粒pFT-A，从含FLP重组酶的染色体中切除抗性基因(FRT-kan-FRT)，留下含FRT位点的序列特异性扩增区域(scar)。染色体删除和整合通过测定抗生素标记，PCR分析及发酵产物分析进行证实。P1噬菌体介导的普遍性转导(Miller，1992)被用于将ΔfocA-pflB::FRT-kan-FRT突变从SZ204菌株转移至KJ017菌株以生产KJ032。
adhE，ldhA，和focA-pflB区域中FRT标记的删除
从adhE，ldhA和focA-pflB位点删除序列基因及消除FRT标记的策略在先前已有描述(Datsenko和Wanner，2000；Grabar等人，2006；Jantama等人，2008b；Zhang等人，2007)。质粒pLOI4151被用作cat-sacB基因盒的来源，而Red重组酶(pKD46)被用于促进双交换、同源重组等事件。氯霉素抗性被用于对整合的筛选。在蔗糖存在下的生长被用于对sacB的损失进行筛选。使用这种方法，构建连续缺失以生产消除了全部FRT位点的KJ079的派生物。从adhE，ldhA和focA-pflB位点消除FRT标记所用的引物和质粒列在表3。
为了消除ΔadhE区域的FRT位点，设计针对ΔadhE::FRT目标区域的混合引物(hybrid primers)(WMadhEA/C)，所述混合引物包含与ΔadhE::FRT位点的5’和3’区域同源的大约50bp，以及与来自于pLOI4151的cat-sacB基因盒相一致的20bp。所述引物被用于以pLOI4151作为模板的cat-sacB基因盒的PCR扩增。生成的PCR产物通过一个双交换、同源重组事件结合对氯霉素抗性的筛选用cat-sacB基因盒替换ΔadhE区域中的FRT位点，从而获得TG200。
利用上/下游adhE引物，从E.coli C扩增出adhE基因和周围序列。包含ychE’-adhE-ychG’(3.44kb)的PCR产物被克隆至pCR2.1-TOPO，生成pLOI4413。以pLOI4413作为模板，另一组引物(IO-adhE上/下游)及Pfu聚合酶被用于扩增反向(inside-out)产物，以得到一种平端(blunt-ended)产物，所述平端产物中adhE序列的2.6kb内部片段被删除。反向PCR产物经过激酶处理和自连接(self-ligated)生成pLOI4419。pLOI4419扩增(上/下游adhE引物)得到的PCR产物，通过另一个双交换、同源重组事件结合对sacB损失的蔗糖筛选，以所希望的染色体序列替换TG200中的cat-sacB基因盒。生成的菌株命名为TG201(KJ079中的FRT被从ΔadhE区域消除)。
消除ΔldhA和Δ(focA-pflB)区域中的FRT位点的方法类似于删除adhE::FRT位点的方法。另外的用于消除ΔldhA中的FRT位点的引物组(ldhAA/C和IO-ldhA上/下游)，连同相应的质粒(pLOI4430和pLOI4432)列在表7。TG202菌株是通过用pLOI4151(WMldhAA/C引物)的PCR产物替换TG201中的ΔldhA区域而获得。TG202中的cat-sacB基因盒被pLOI4432的PCR产物(ldhAA/C引物)所替换，结合对于sacB损失的蔗糖筛选来生产TG203。
用来消除Δ(focA-pflB)中的FRT位点的引物组(上游focA/MidpflA和IO-ycaOup/IO-midpflA下游)和相应的质粒(pLOI4415和pLOI4421)列在表7。菌株TG204是通过用pLOI4151的PCR产物(WMpflBA/C引物)替换TG203中的Δ(focA-pflB)区域而获得。TG204中的cat-sacB基因盒被pLOI4421的PCR产物(上游focA/MidpflA引物)替换，结合对于sacB损失的蔗糖筛选而获得KJ091。KJ091是KJ073的派生物，KJ091中的所有FRT位点被从染色体的ΔadhE，ΔldhA和ΔfocA-pflB区域消除。
ackA区域中FRT位点的消除及citF，sfcA，和pta-ackA基因缺失的构建
为了消除KJ073的ackA区域中的FRT位点，按照下述方法构建质粒，所述的质粒含有发生了所希望的突变的序列。E.coli C基因组DNA作为模板被用于ackA的PCR扩增，所述的PCR扩增以JMackAF1/R1为引物，所述的JMackAF1/R1引物与ackA基因的上游和下游的大约200bp结合。线性产物被克隆至pCR2.1-TOPO(Invitrogen，Carlsbad，CA)，生成pLOI4158。随后，质粒pLOI4158作为模板与JMackA上游1/下游1引物及Pfu聚合酶一起被用于反向PCR以生产平端产物，所述平端产物缺少一个808-bp的ackA内部片段。然后，侧翼为PacI的(PacI-flanked)cat-sacB基因盒(来自pLOI4162的SmaI/SfoI片段)被连入平端PCR产物以获得pLOI4159。质粒pLOI4159被用作PCR扩增(JMackAF1/R1引物)的模板。所述PCR产物通过双交换同源重组结合对氯霉素抗性的筛选被用于替换KJ073的ackA区域中FRT位点。克隆产物被命名为KJ076。
质粒pLOI4159也用PacI进行酶切以消除cat-sacB基因盒，并自连接以获得pLOI4160，保留了18-bp的翻译终止序列。质粒pLOI4160被用作PCR模板(JMackAF1/R1引物)。所述扩增片段通过双交换同源重组结合对sacB损失的筛选，被用于替换KJ076中的cat-sacB基因盒。通过高温生长消除pKD46后，获得的菌株被命名为KJ079。在KJ079菌株中，缺失区域已被18-bp的翻译终止序列替换。
上述用于从ackA区域区域消除FRT位点的策略被用于构建citF，sfcA和pta-ackA的序列缺失，以及用18-bp的翻译终止序列替换缺失区域。另外的用于构建citF缺失的引物组(citF上游/下游和citF2/3)连同相应的质粒(pLOI4629，pLOI4630，和pLOI4631)列在表7。生成的菌株被命名为KJ104。
从菌株KJ104和KJ110中删除sfcA基因，分别获得命名为KJ119和KJ122的菌株。另外的用于构建sfcA缺失的引物组(sfcA上游/下游和sfcA1/2)连同相应的质粒(pLOI4283，pLOI4284，和d pLOI4285)列在表7。
KJ122中的ackA-pta操纵子(包含合成翻译终止序列)被删除，获得菌株KJ134。另外的用于构建ackA-pta操纵子缺失的引物组(ackA上游/pta下游和ackA2/pta2)连同相应的质粒(pLOI4710，pLOI4711，和pLOI4712)列在表7。菌株KJ134不包含任何FRT位点或外源基因。
含有一个用于无标记基因缺失的cat-sacB基因盒的pLOI4162的构建
为便于染色体DNA的序列删除，构建了质粒pLOI4162(图8)，所述质粒包含一个可消除的cat-sacB基因盒，并且非必需地包含一个18-bp的合成DNA片段，所述合成DNA片段在所有阅读框内含有终止密码子。所述质粒由合成序列以及质粒pLOI2228(Martinez-Morales等人，1999)、pLOI2511(Underwood等人，2002)和pEL04(Lee等人，2001；Thomason等人，2005)的几部分组成。利用pEL04作为模板，用JMpEL04F1/R1引物进行反向PCR，以消除cat和sacB基因之间不需要的SmaI和BamHI位点。扩增产物经BglII剪切(在两种引物内)，并自连接以获得pLOI4152。质粒pLOI4131是通过将来自pLOI2228的FRT-cat-FRT片段(经过Klenow处理的(Klenow-treated)BanI，ClaI)连入pLOI2511的兼容位点(经过Klenow处理的(Klenow-treated)NheI，ClaI)而构建的。质粒pLOI4131随后经EcoRI剪切，并自连接以消除FRT-cat-FRT片段获得pLOI4145，保留了单一的KasI和XmaI位点。多聚接头片段(SfPBXPS)通过互补寡核苷酸(SfPBXPSsense和SfPBXPScomp)的退火作用制备。在经KasI和XmaI双酶切后，这个片段被连入pLOI4145的相应位点以获得pLOI4153。在pLOI4152中利用JMcatsacB上游3/下游3引物组通过PCR扩增出修饰的cat-sacB基因盒。在经BamHI和XhoI双酶切后，这个基因盒被连入pLOI4153的相应位点以获得pLOI4146。为了创建一个在所有6个阅读框内含有终止密码子的18-bp区域(5’GCCTAATTAATTAATCCC3’)(SEQ ID NO：1)，pLOI4146经PacI酶切和自连接获得pLOI4154(未显示)，消除了cat-sacB基因盒。利用诱变引物(JM4161sense/comp)和线性质粒扩增，将两个额外的碱基(T和A)插入到pLOI4154的SfoI和PacI位点之间，获得pLOI4161。最终，含有cat-sacB基因盒的pLOI4146的PacI酶切片段被连入pLOI4161的PacI-酶切位点，以获得pLOI4162(基因库号EU531506)。
mgsA和poxB基因的删除
一种修饰方法被开发用于删除E.coli染色体基因，所述修饰方法使用两步同源重组过程(Thomason等人，2005)。使用这种方法，在基因删除后，没有抗性基因或序列特异性扩增区域(scar)序列留在染色体上。第一步重组中，部分目标基因被包含一个氯霉素抗性基因(cat)和一个果聚糖蔗糖酶基因(sacB)的DNA盒替换。第二步重组中，cat-sacB基因盒被遗漏了删除区域的天然序列替换。含sacB基因的细胞在蔗糖存在下的培养过程中会累积果聚糖，并被杀死。存活的重组体中cat-sacB基因盒的缺失被高度强化。
一种基因盒被构建用以便于基因删除。利用JMcatsacB引物组(表3)通过PCR从pEL04扩增出cat-sacB区域(Lee等人，2001；Thomason等人，2005)，经NheI酶切，并连入pLOI3421的相应位点，以获得pLOI4151。利用pLOI4151(模板)和cat-上游2/sacB-下游2引物组(EcoRV位点包含在每个引物中)，通过PCR扩增出cat-sacB基因盒，经EcoRV酶切，并用于后续的连接。
利用引物组mgsA-上游/下游扩增出mgsA基因和邻近的500bp区域(yccT’-mgsA-helD’，1435bp)，并将其克隆至pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen)以获得质粒pLOI4228。这种质粒的1000倍稀释制剂被用作反向扩增的模板，所述反向扩增使用mgsA-1/2引物组(两种引物都包含mgsA基因并朝向外面)。合成的包含复制子的4958bp片段被连到从pLOI4151扩增、经EcoRV酶切切割的cat-sacB基因盒，以获得pLOI4229。所述4958bp片段还被用于构建另一种质粒，pLOI4230(磷酸化和自连接)。pLOI4230中，mgsA的中心区域是缺失的(yccT’-mgsA’-mgsA”-hel)。
pLOI4229和pLOI4230经XmnI酶切(在载体内)后，各自用作扩增模板，利用mgsA-上游/下游引物组生产线性DNA片段，所述线性DNA片段分别用于整合步骤I (yccT’-mgsA’-cat-sacB-mgsA”-helD’)和步骤II(yccT’-mgsA’-mgsA”-helD’)。步骤I片段通过电穿孔进入含有pKD46(Red重组酶)的KJ060后，在30℃培养2h以允许表达和分离，然后在平板上(30℃，18h)应用氯霉素(40mg l-1)和氨苄青霉素(20mgl-1)抗性筛选重组体。三种克隆被选择，在含氨苄青霉素和5％w/v阿拉伯糖的LB培养基中生长，并为电穿孔做准备。在步骤II片段通过电穿孔进入细胞后，细胞在37℃培养4h，然后转移至含有100ml改良的LB培养基(加入100mM MOPS缓冲液，并省略NaCl)的250ml容器中，所述改良的LB培养基含10％蔗糖。过夜培养(37℃)后，克隆在改良的LB平板上(不含NaCl；加入100mM MOPS)进行筛选(39℃，16h)，所述改良的LB平板中含6％蔗糖。合成的克隆用氨苄青霉素和氯霉素抗性的缺失进行测试。所述构建经PCR分析得到进一步证实。一种缺少mgsA基因的克隆被选择，并命名为KJ070。
从KJ071中删除poxB基因的方法类似于删除mgsA基因所用的方法。另外的用于构建poxB缺失的引物组(poxB-上游/下游和poxB-1/2)连同相应的质粒(pLOI4274，pLOI4275，和pLOI4276)列在表3。合成的菌株被命名为KJ072。
tdcDE，和aspC中基因缺失的构建
利用tdcDE上/下引物扩增出tdcDE基因及邻近的1000bp区域(tdcG’-tdcFED-tdcC’，5325bp)，并将其克隆至pCR2.1-TOPO载体，以生产质粒pLOI4515。所述质粒DNA的1000倍稀释制剂被用作模板，利用tdcDEF7/R7引物(两种引物都包含tdcDE并朝向外面)进行反向扩增。合成的包含复制子的6861bp片段被连入从pLOI4162扩增的(JMcatsacB上游3/下游3引物)、经SmaI/SfoI酶切的cat-sacB基因盒，以生产pLOI4516。6861bp片段还被用于构建另一种质粒pLOI4517(经激酶处理，自连接)，所述pLOI4517包含tcdD和tdcE的缺失。从pLOI4516和pLOI4517扩增(tdcDE上游/下游引物)得到的PCR片段被用于替换KJ091中的tdcDE区域。合成的克隆用氨苄青霉素和氯霉素抗性的缺失进行测试。
从KJ104中删除aspC基因的方法类似于删除tdcDE基因所用的方法。另外的用于构建aspC缺失的引物组(aspC上游/下游和aspC1/2)连同相应的质粒(pLOI4280，pLOI4281，和pLOI4282)列在表7。合成的菌株被命名为KJ110。不管是KJ098还是KJ110在各自的缺失区域(tdcDE和aspC)均不包含任何间插序列。
gldA和dhaKLM中基因缺失的构建
利用上述基因方法，从大肠杆菌菌株XZ632获得大肠杆菌菌株XZ464，XZ465，和XZ466。大肠杆菌菌株XZ464，XZ465，XZ466和XZ632的相关特征见表15。
实时RT-PCR分析
先前，实时PT-PCR已被用于测量信使RNA水平(Jarboe等人，2008)。细胞在含5％或10％葡萄糖的NBS培养基中生长，并在对数生长中期通过在干冰/乙醇浴中涡旋收集，然后离心分离并在-80℃下于RNALater(Qiagen，Valencia CA)中储存直至纯化。RNA利用RNeasy Mini塔器(Qiagen)进行纯化，然后经DNaseI(Invitrogen)酶切。使用50ng总RNA为模板，利用反转录酶Superscript II(Invitrogen，CarlsbadCA)进行反转录。使用SYBR Green RT-PCR mix(Bio-Rad，Hercules CA)在Bio-Rad iCycler中进行实时PCR。在反转录缺失的情况下，通过运行RT-PCR检测RNA的基因组DNA污染。使用基因组DNA作为标准评估转录丰度，且表达水平通过birA基因标准化，所述birA基因是一种转录抑制剂(Jarboe等人，2008)。用于pck和birA的RT-PCR引物列在表3。
pck区域的测序
为了了解KJ073的pck基因中是否存在任何突变，通过PfuUltra High Fidelity DNA Polymerase(Stratagene；Wilmington，DE)扩增出KJ012和KJ073中的pck基因的编码区域和启动子区域(在编码区域前大约800bp)。使用引物组pck-F/R扩增出经过转录终止子的所述的编码区域(表9)。使用引物组pck-2/3扩增出所述的启动子区域。DNA测序由佛罗里达大学Interdisciplinary Center for Biotechnology Research提供(使用Applied Biosystems autosequencers)。
代谢进化
来自pH控制的发酵的细胞，在24h被连续转接，通过基于生长的筛选以促进代谢进化。将大约为新培养基体积1/100的接种物直接加入预温的、新鲜培养基中以达到初始OD550为0.05。具有改良的发酵特征的克隆被分离。代谢进化策略被应用于提高琥珀酸生产的产率。
分析
细胞生长：用Bausch & Lomb Spectronic 70分光光度计测定550nm处的光密度值(OD 1.0＝细胞干重333mg·l-1)来估算细胞量。
利用基因工程微生物生产有机酸的方法可以通过使用本领域公知的适当技术鉴定并量化。例如，HPLC技术能被用于测量由所筛选的克隆生产的有机酸的数量。HPLC技术还有助于检测由所筛选克隆生产的有机酸纯度。有机酸和糖通过使用高效液相色谱法鉴定(Grabar等人，2006；Zhang等人，2007)。
存在于发酵液中的琥珀酸和其他有机酸，用装有BioRad Aminex HPX-87H色谱柱的安捷伦1200HPLC仪器进行分析。BioRad Microguard Cation H+被用作保护柱。HPLC分析的标准样是在0.008N硫酸中配制。HPLC的柱温维持在50℃。0.008N浓度的硫酸作为流动相，流动速率0.6ml/min。各种组分的定量通过测定它们在210nm的吸收实现。
酶活测定
细胞在对数生长中期通过离心分离(8,000xg，5min，4℃)收集，用冷的100mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液洗涤，并再次悬浮在同样的缓冲液(1ml)中。在使用Fast Prep-24(MP Biomedicals，Solon，OH)进行细胞裂解后，制品经离心分离(13,000xg for 15min)变得澄清。蛋白质利用牛血清蛋白作为标准，经BCA方法(Pierce，Rockford，IL)测定。
PEP羧化酶活性根据Canovas和Kornberg(1969)所描述的方法进行测定。反应混合物包含100mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)，10mM MgCl2，1mM DTT，25mM NaHCO3，0.2mM NADH，20U苹果酸脱氢酶和粗提物。测定混合物在37℃培养15min使酶活化，然后添加10mM PEP使反应开始。
PEP羧化酶活性根据Van der Werf等人，(1997)所描述的方法进行测定。反应混合物包括100mM MES缓冲液(pH6.6)，10mM MgCl2，75mM NaHCO3，5mM MnCl2，50mM ADP，1mM DTT，0.2mM NADH，20U苹果酸脱氢酶和粗提物。添加10mM PEP使反应开始。
苹果酸酶活性(羧化方向)根据Stols和Donnelly(1997)所描述的方法进行测定。反应混合物包括100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)，25mM NaHCO3，1mM MnCl2，1mM DTT，0.2mM NADH和粗提物。通过添加25mM丙酮酸开始反应。由于乳酸脱氢酶的存在，所述测定方法不适于野生型大肠杆菌中SfcA活性的测定。
β-半乳糖苷酶活性根据Miller(1992)所描述的方法进行测定。在所有的测定中，一单位活力代表每分钟氧化或还原1nmol底物所需要的酶量。
实施例1
用于琥珀酸生产的KJ073菌株的构建
在构建用于在含5％葡萄糖的基本培养基中生产琥珀酸的菌株的过程中，要遵循合理的设计方法和代谢进化。通过考察图1所阐明的普遍接受的大肠杆菌标准发酵路径，对产琥珀酸菌株进行合理的代谢工程设计，其中在编码所有替代产物的终止步骤的基因中制造插入失活，所述的替代产物是：乳酸(ldhA)，乙醇(adhE)和乙酸(ackA)。所述的经合理设计的代谢工程产生的结果是完全出乎意料的。由ldhA，adhE和ack基因的插入失活获得的KJ012(ΔldhA::FRT ΔadhE::FRT ΔackA::FRT)菌株在厌氧条件下在含5％葡萄糖(278mM)的无机盐培养基中生产非常不好，并生成乙酸而非琥珀酸作为主要发酵产物。与合理设计的期望相反，琥珀酸成为副产物。这些突变的结果是，基于代谢葡萄糖的琥珀酸的摩尔产量没有改变。亲本和KJ012菌株在含5％葡萄糖的NBS无机盐培养基发酵过程中，每摩尔葡萄糖均产生0.2mol琥珀酸。我们确认NBS无机盐培养基包含KJ012在有氧条件下培养(有氧摇瓶培养；5％葡萄糖)时生长所需的所有无机盐营养素。有氧摇瓶培养中，KJ012细胞产率是厌氧生长过程的5倍，是厌氧生长过程E.coli C(亲本)的75％。所述结果也证实了KJ012中所有的主要生物合成路径都起作用。
当天然营养物(LB培养基)存在时，KJ012发酵生产琥珀酸相比于KJ012在无机盐培养基中增加19倍，且琥珀酸摩尔产率增加2.5倍。显然，在主要路径基础上的合理设计更适于学术证明或设计计划使用天然营养物的过程。
KJ012在无机盐培养基中在厌氧代谢过程中生长不好，琥珀酸生产不好，及乙酸生产增加的根据是未知的。这些是使用在标准路径图基础上的合理设计的代谢工程产生的出乎意料的结果。在基本培养基中，对代谢工程的合理设计显然是不可预测的。合成的菌株KJ012，生长劣于亲本，琥珀酸生产与亲本基本一样。与亲本E.coli C相比，KJ012(ΔldhA::FRT ΔadhE::FRT ΔackA::FRT)生长不好，表现出更低速的琥珀酸生产，且没有提供更好的摩尔产率(表4)。
不管这些结果，这个菌株的连续转接尝试作为一种基于下列基本原理的对于生长和琥珀酸生产改进的共同筛选方法。葡萄糖发酵生成琥珀酸的主要路径(图1A和2A)被普遍认为是使用磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)进行所述羧化步骤(Unden和Kleefeld，2004；Fraenkel 1996；Keseler等人，2005；Millard et al.，1996；Gottschalk，1985；Karp等人，2007)。羧化酶不能保存磷酸烯醇式丙酮酸中的高能磷酸，并减少可用于生长的净ATP。另外可供选择的琥珀酸生产路径能展望的是利用已知的能提高ATP产率从而增加琥珀酸生产的大肠杆菌基因谱型(图1A；图2B，2C和2D)。然而，这些可供选择路径中没有一条已经显示出在大肠杆菌的天然菌株发酵期间对于生产琥珀酸起作用。这些可供选择路径中关键酶被葡萄糖阻遏并且在糖异生过程具有正常活性。典型地，这些糖异生酶的水平的变化趋势与葡萄糖和其他代谢物的可利用性是相反的(Goldie和Sanwal，1980a；Wright和Sanwal，1969；Sanwal和Smando，1969a)，且在相反方向(去羧基)起作用(Keseler等人，2005；Oh等人，2002；Kao等人，2005；Stols和Donnelly，1997；Samuelov等人，1991；Sanwal，1970a；Delbaere等人，2004；Goldie和Sanwal，1980b；Sanwal和Smando，1969b；Sanwal 1970b)。
作为其中一条可供选择路径的关键酶，NADH-苹果酸酶(sfcA)(图2B)，已被证实能够增加大肠杆菌中琥珀酸生产，但是需要从一种质粒过量表达才能实现(Stols和Donnelly，1997)。然而，这些可供选择的途径中没有一条可被指望在大肠杆菌的天然菌株或KJ012的厌氧生长过程中在高水平的葡萄糖存在下是起作用的。伴随着生长改进筛选的KJ012的连续转接，提供了一个机会对用于琥珀酸生产的可选择路径的突变激活进行筛选(图1B)，所述的突变激活能保持氧化还原平衡并增加ATP产率。
KJ012的代谢进化的实施是通过各种机制下使用小的、pH控制的发酵罐，连续接种以改进生长。KJ012在发酵条件下被连续转接到NBS葡萄糖培养基中，转接速度在生长的条件下尽可能快(图3A；图4A；图5)。在前9次转接之间，生长较慢，需要培养4-5天，然后生长戏剧性地提高，使得转接间隔为24h。与之伴随的是乙酸生产的增加(图4A)，而琥珀酸生产几乎没有改进。在27次转接后(60天)，用1∶1的3M K2CO3和6N KOH混合物替换KOH以提供额外的二氧化碳(100mM最初加入所有NBS无机盐培养基中)。继续的转接导致琥珀酸生产的增加。在5％葡萄糖(227mM)中转接40次，然后在10％葡萄糖(555mM)另外转接40次。在10％葡萄糖转接过程中，每摩尔葡萄糖代谢生产琥珀酸的产率保持在大约0.7mol，同时乳酸、乙酸和甲酸为共同产物(表4)。这个产率比E.coli C和KJ012菌株高2倍。一种克隆被分离并命名为KJ017。对于KJ012到KJ017的生长改进的筛选同时也是对琥珀酸生产(产率，效价和摩尔产量)的改进的共筛选。
大肠杆菌利用通常被认为天然发酵路径的基于磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)的路径生产琥珀酸，磷酸烯醇式丙酮酸的能量经由生成无机磷酸盐而被浪费。通过所述路径，每生产1分子琥珀酸损失1分子ATP(图1，图6)。利用另外的可供选择的酶系统将这些能量储存在ATP中，代表了一个机会以改进细胞生长及同时增加琥珀酸生产。基于大肠杆菌中的已知基因，三种其他的用于琥珀酸生产的酶路线设想将能储存ATP从而改进生长(图1，图6)。然而，这些可供选择路线中的所有羧化步骤被认为在反方向起作用(去羧基)，主要是在生长过程中基于底物(例如有机酸)的糖异生中起作用(Keseler等人，2005；Oh等人，2002；Kao等人，2005；Stols和Donnelly，1997；Samuelov等人，1991；Sanwal，1970a；Delbaere等人，2004；Goldie和Sanwal，1980b；Sanwal和Smando，1969b；Sanwal，1970b).。为了证明为培育KJ017而进行的基于生长的筛选确实已经活化了一条或多条可供选择的路径的假设，对野生型菌株ATCC 8739、KJ012(在主要代谢路径中被删除)和代谢进化的KJ0174(表5)中的4种羧化酶的活性进行比较。PEP羧化酶活性总体上差不多低，20到30U(mg蛋白)-1。NADH-苹果酸酶活力(SfcA；羧化方向)也低，且NADPH-苹果酸酶活力(MaeB；羧化方向)无法测量。相比之下，KJ017中PEP羧激酶活性与KJ012相比增加了3倍，与假设一致，基于生长改进的筛选通过提高ATP产率增加了琥珀酸生产，这是增强琥珀酸生产的能量储存路线的表达的结果。
进一步的基于生长的筛选和另外的基因缺失被用于构建许多其他菌株，所述菌株在生长和琥珀酸生产方面具有进一步的改进(图3和图4)。
在10％(w/v)葡萄糖生长期间，多余的联产物(乙酸、甲酸和乳酸)在KJ017(ΔldhA::FRT ΔadhE::FRTΔackA::FRT)发酵中被富集，尽管删除了编码主要的乳酸脱氢酶(ldhA)和乙酸激酶(ackA)活性的基因(表4)。乳酸和乙酸的生产还能导致更高的ATP产率，ATP产率是基于生长的筛选的基础(图1A)。
从KJ017中删除编码丙酮酸甲酸裂解酶(pflB)的基因，以消除还原剂如甲酸的损失和过量的乙酰辅酶A，所述的乙酰辅酶A是乙酸的一个潜在来源。在这个操纵子中的上游甲酸转运蛋白(focA)也被删除。正如预期的，经过删除的菌株(KJ032)在缺乏乙酸情况下不能生长，这证明这是KJ017中产乙酰辅酶A的主要路线(图3C)。众所周知，pflB的缺失会引起厌氧条件下的乙酸营养缺陷型(Sawers和Bock，1988)。通过添加20mM乙酸可以修复KJ032的生长和琥珀酸生产(图3C，图4C，和图5)。作为pflB(和focA)缺失的结果，甲酸和乙酸生产大大减少。尽管这种菌株生长需要乙酸，但是发酵过程中也会产生额外的乙酸。在构建用于丙酮酸生产的E.coli K-12生物催化剂中，pflB-缺失的菌株的同样现象先前已被报道(Causey等，2004)。KJ032中乳酸水平也降低(表4；图4C)。随后的转接伴随着生长和琥珀酸生产的改进。随后的转接中，乙酸添加减少，接种物尺寸减小，葡萄糖浓度加倍(10％w/v)(图3D和4D)。在进一步转接后，省略乙酸，培育出不再是乙酸营养缺陷型的菌株，大概归因于其他基因表达的增强。然而，由于添加乙酸的去除，琥珀酸产率降低，同时苹果酸和乙酸水平增加。从最后转接物中分离的克隆被命名为KJ060(ΔldhA::FRTΔadhE::FRT ΔackA::FRTΔfocA-pflB::FRT)。所述菌株在含10％葡萄糖的NBS无机盐培养基中，每代谢1mol葡萄糖产生1mol琥珀酸。
存在于各种菌株的发酵培养基中的少量乳酸据推测是来源于丙酮醛合成酶路径(图6；Grabar等，2006)。尽管这仅代表产率的很少量损失，但通过这条路径乳酸的生产表示丙酮醛的累积，而丙酮醛是糖酵解和生长两者的抑制剂(Egyud和Szent-Gyorgyi，1966；Grabar等，2006；Hopper和Cooper，1971)。通过删除KJ060中的mgsA基因(丙酮醛合成酶)消除丙酮醛和乳酸的生产，以获得KJ070(ΔldhA::FRT ΔadhE::FRTΔackA::FRT ΔfocA-pflB::FRT ΔmgsA)。菌株KJ070先在5％(w/v)葡萄糖中传代培养(图3E，图4E，和图5)。据推测mgsA的删除提高了糖酵解速率，其通过培养基中丙酮酸的累积得到证实(表4)。糖酵解速率的提高还可能是因为草酰乙酸生产的增加而导致琥珀酸/苹果酸比率的下降，所述草酰乙酸是延胡索酸还原酶的变构抑制剂(Iverson等，2002；Sanwal，1970c)。
在第21次转接，葡萄糖加倍至10％(w/v)，并继续转接。葡萄糖水平提高和随后的转接产生新菌株，所述菌株从最后的传代培养基分离并被命名为KJ071(ΔldhA::FRT ΔadhE::FRT ΔackA::FRTΔfocA-pflB::FRT ΔmgsA)。所述菌株可能对苹果酸生产有用。
尽管葡萄糖到乙酸的转化是氧化还原中性的，碳分给乙酸还是降低了琥珀酸和苹果酸产率。在微好氧条件下的培养过程中，丙酮酸氧化酶(poxB)是乙酸和CO2的潜在来源(Causey等，2004)。尽管poxB在厌氧条件下不应该对氧化丙酮酸起作用，但其还是基因删除的目标(图6)。正如预期的，删除poxB获得KJ072(ΔldhA::FRT ΔadhE::FRT ΔackA::FRT ΔfocA-pflB::FRT ΔmgsAΔpoxB)没有减少乙酸生产，这表明在乙酸生产中涉及了另外可供选择的路径。然而，消除poxB导致发酵产物中意料外的改变，包括琥珀酸增加(表4；图4F)。这种琥珀酸生产改进的机制不清楚，但可能与丙酮酸氧化酶的其他活性有关，如丁酮生产、脱羧和聚醛(Ajl和Werkman，1948；Chang和Cronan，2000)。
菌株KJ072在AM1培养基经受进一步的40轮代谢进化，所述培养基为低盐培养基，含10％(w/v)葡萄糖(表4；图3F，图4F，和图5)。在这些转接中，生长、细胞产率和琥珀酸生产的改进是可以观察到的。苹果酸，丙酮酸和乙酸水平也得到提高。从最后的转接物中分离出克隆，并被命名为KJ073(ΔldhA::FRTΔadhE::FRT ΔackA::FRT ΔpflB::FRT ΔmgsA ΔpoxB)。
KJ073菌株保留了磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的羧化路线(表5)。所述菌株的体外活性是KJ012的45倍，是KJ017的10倍，这为能量储存与琥珀酸生产和生长之间的紧密关联提供了进一步证据，并进一步建立了用于筛选的基础。
PEP羧激酶活性的大幅增强与细胞产率和琥珀酸生产的改进密切关联(表5)。从KJ012到KJ017(代谢进化)，PEP羧激酶活性增加3.3倍，细胞产率增加4.7倍，且琥珀酸生产增加7.8倍。从KJ017到KJ060(删除pflB，跟着进行代谢进化)，PEP羧激酶活性增加11倍，细胞产率增加0.3倍，且琥珀酸生产增加1.6倍。从KJ060到KJ071(删除mgsA，跟着进行代谢进化)，PEP羧激酶活性降低92％，细胞产率降低45％，琥珀酸生产减少63％。从KJ071到KJ073(删除poxB，跟着进行代谢进化)，PEP羧激酶活性、细胞产率和琥珀酸生产保持与KJ060等同的水平。
从KJ012和KJ073克隆pck和周围区域，并测序。没有在编码区域发现变化。不存在翻译后修饰，酶的催化性能应该无变化。在pck启动子区域发现一个单一突变，在相对于翻译起始位点-64bp位点处G变为A。所述突变是在转录起始位点后面，所述的转录起始位点是在相对于翻译起始位点-139bp位点处。
先前的研究者已经注意到磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(pck)的动力学参数可能对羧化作用和琥珀酸生产有重要影响(Millard等，1996；Kim等，2004)。大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)对碳酸氢盐的Km为0.15mM(Morikawa等，1980)，是磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(pck)(13mM)的1/9倍(Krebs和Bridger，1980)。尽管利用多拷贝质粒使E.coli的pck过量表达，这使磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶活性增加了49倍，但是根据报道这对琥珀酸生产没有影响(Millard等，1996)。当来自产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶在E.coli K12中被过量表达，琥珀酸生产也没有增加(Kim等，2004)。所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶对碳酸氢盐也有高Km(30mM)(Laivenieks等，1997)。然而，当产琥珀酸厌氧螺菌pck在E.coli K12的ppc突变中被过量表达，琥珀酸生产增加5.5倍(Kim等，2004)。在KJ017及其序列派生物中，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶明显是占优势的羧化活性，即使是在功能性天然磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶存在下。
E.coli C的酶测量结果相当令人惊讶。通常被认作在天然大肠杆菌生产琥珀酸中占优势的酶(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；ppc)在生长过程中(Unden和Kleefeld，2004；Fraenkel，1996；Keseler等，2005；Millard等，1996；Gottschalk，1985；Karp等，2007)不是E.coli C活体内最活跃的酶。因此，普遍接受的作为代谢工程的合理设计和代谢通量的估计的基础的大肠杆菌代谢路径(Unden和Kleefeld，2004；Fraenkel，1996；Sanchez等，2006；Cox等，2006；Vemuri等，2002a；Wang等，2006；Sanchez等，2005ab；Gokarn等，2000；Karp等，2007)可能不能准确反映所有菌株的新陈代谢。在活体内底物饱和情况下，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶活性是最活跃的。E.coli K12中，据报道磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶两者的活性在活体内相等(140nm min-1mg-1细胞蛋白；Van der Werf等，1997)，前者作为琥珀酸生产的主要路线。
先前的研究显示，大肠杆菌中天然ppc基因的过量表达导致更高的特异性琥珀酸生产(Millard等，2000)，更高的特异性生长率，和更低的特异性乙酸生产，归因于更多的PEP的羧化补充了TCA循环中间产物(Farmer和Liao，1997)。然而，由于葡萄糖转运系统需要PEP，与同基因控制相比，ppc的过量表达使得葡萄糖摄取率降低15-40％，琥珀酸产率(每摩尔葡萄糖)也没有显著增加(Chao和Liao，1993；Gokarn等，2000)。天然磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶在增加琥珀酸产率上的失败将大部分的研究注意力转移到一种新的代谢设计上，即使来自乳酸菌杆菌(Lactobacillus lactis)或菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)的PYC(丙酮酸羧化酶)过量表达作为羧化步骤(Vemuri等，2002ab；Gokarn等，2000；Lin等，2005a，2005b，2005c)，而不是继续从事对于大肠杆菌基因的天然谱型的进一步的研究。
瘤胃细菌如产琥珀酸放线菌(Actinobacillus succinogenes)在葡萄糖发酵过程中生产琥珀酸作为主要产物，所述葡萄糖发酵利用储存能量的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶进行羧化(Kim等.，2004；McKinlay等，2005；McKinlay和Vieille，2008)。据报道，这种有机体的活性是KJ017的5倍，是KJ073经连续的基于生长的筛选(代谢进化)获得的有机体的一半。因此，通过利用代谢工程(ldhA adhE ackA)和代谢进化(基于生长的筛选用于增加ATP生产效率)的结合，此处报道的研究证实了仅使用大肠杆菌基因的天然谱型的产琥珀酸大肠杆菌菌株的培育，所述菌株类似于瘤胃有机体，例如产琥珀酸放线菌(A.succinogenes)。尽管先前报道了E.coli的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(pck)的过量表达对于不存在磷酸烯醇式丙酮酸合成酶突变情况下的琥珀酸生产是没用的(Chao和Liao，1993；Kim等，2004；Gokarn等，2000；Millard等，1996)，但KJ017和派生物已通过代谢进化利用磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶作为琥珀酸和苹果酸生产的主要路线。
图7显示了KJ060和KJ073的分批发酵，KJ060和KJ073是作为琥珀酸生产的两种最优生物催化剂。尽管在培养的最初48h内生长完成，但琥珀酸生产要继续培养96h。三分之一的琥珀酸发生在不存在细胞生长的情况下。这些菌株生成的琥珀酸，效价668-733mM，基于代谢葡萄糖的摩尔产率为1.2-1.6。在AM1培养基上的产率明显高于NBS无机盐培养基。乙酸、苹果酸和丙酮酸累积成为不被期望的联产物并减损琥珀酸的潜在产率(表4)。葡萄糖和CO2(过量)生产琥珀酸的最大理论产率是基于下列方程式的每摩尔葡萄糖生产1.71mol琥珀酸：C6H12O6+6CO2→12C4H6O4+6H2O。然而，大肠杆菌中不存在直接的琥珀酸路径能达到这个产率(图6)。
本研究主要集中于葡萄糖到琥珀酸的转化。众所周知，大肠杆菌具有天然的代谢所有己糖和戊糖的能力，所述己糖和戊糖是植物细胞壁成分(Asghari等，1996；Underwood等，2004)。大肠杆菌的一些菌株还能代谢蔗糖(Moniruzzaman等，1997)。在血清管中测试菌株KJ073对己糖和戊糖(2％糖)的利用。在所有情况下，这些糖类主要被转化为琥珀酸。菌株KJ073还代谢甘油生成琥珀酸。在2％甘油存在下的培养过程中，143mM甘油被代谢生成127mM琥珀酸，摩尔产率为0.89，或者是利用甘油作为碳源的细菌生长生产琥珀酸的最大理论产率的89％。
大肠杆菌的发酵代谢已显示出显著的适应性。派生物经基因工程和代谢进化避免了许多与天然发酵路径相关的基因的缺失并提高了流经剩余酶的通量以维持氧化还原平衡、增加ATP生产的效率及改善生长。虽然面临更多的挑战，但细胞能在无机盐培养基中平衡碳分割的同时产生适应性改变，以供给所有生物合成需要。在消除NADH氧化(乳酸脱氢酶，乙醇脱氢酶)和乙酸生产(乙酸激酶)的主要路径后，生长和ATP生产仍然与NADH氧化和苹果酸或琥珀酸的生产相联系以维持氧化还原平衡(图1B)。基于厌氧生长的筛选确保了氧化还原平衡以及对于效率提高和ATP生产速率提高的筛选，它们是生产改善的基础。这种对于氧化还原平衡和ATP生产的筛选在苹果酸作为终产物和琥珀酸作为终产物之间不能很容易地区分，因为两者的前体均是作为电子受体。
pflB的删除导致了对于乙酸的营养缺陷型需求，所述pflB是厌氧生长过程中乙酰辅酶A的主要来源(Sawers和Bock，1988)。这种需求通过代谢进化得以消除，据推测是因为通过其他路线(例如丙酮酸脱氢酶)生产乙酰辅酶A的增加(de Graef et等人，1999)。能取代这种营养缺陷型需求的乙酸或乙酰辅酶A的代谢源是未知的。poxB删除后，琥珀酸生产的增加也是出人意料的。据观察，乙酸水平几乎没有改变，这表明这种酶是乙酸的次要来源或者它被乙酸生产的其他功能性路线取代了。poxB删除后，琥珀酸仍然被作为主要的二元羧酸生成。伴随着poxB删除的代谢产物的转变是出乎意料的。
即使是使用琥珀酸生产的最优菌株KJ060和KJ073，苹果酸和乙酸仍然是大量的联产物(表4；图4D和4F)。这些联产物的消除代表着一个进一步提高产率的机会。
所有先前为琥珀酸生产培育的的工程大肠杆菌，使用天然培养基和抗性质粒来保持。在简单分批发酵中，大部分仅仅获得了低效价的琥珀酸，需要更多的复杂过程以获得高效价(表1)。其他研究者还使用了异源基因和复杂过程，所述的复杂过程包括气体(CO2，H2，O2或空气)鼓泡以及好氧和厌氧两步过程。许多基因方法被报道增加了琥珀酸生产，所述的琥珀酸生产是通过重组大肠杆菌在天然培养基中以葡萄糖为原料进行的。可以预期，过程和营养物的复杂性会增加构建、材料、纯化及废物处理的成本。包含维生素、氨基酸和其他前体大分子的天然培养基可能会掩盖代谢和生物合成中潜在的调控问题，这些调控问题是由代谢工程带来的。在我们最初的构建中，在无机盐培养基中的生长和糖代谢都很弱，但在天然培养基(LB)中很强。相比之下，菌株KJ060和KJ073使用无机盐培养基在简单分批发酵(10％糖)中产生高效价的琥珀酸(600-700mM)，所述无机盐培养基不含任何天然营养物或外源基因。
实施例2
用于琥珀酸生产的KJ134菌株的构建
如实施例1所描述，E.coli C野生型中的主要的厌氧发酵基因通过Datsenko & Wanner(2000)的策略被连续删除，所述策略为借助PCR产物和可消除的抗性标记(利用FRT识别位点和FLP重组酶)。这些构建与代谢进化(为提高ATP生产效率而进行的基于生长的筛选)相结合被用于筛选一种突变菌株，所述突变菌株利用能储存能量的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(pck)来促进生长和琥珀酸生产(图9)。生成的菌株KJ073，每mol代谢葡萄糖能产生1.2mol琥珀酸(Jantama等，2008a)，且使用的琥珀酸路径非常类似于瘤胃细菌，如产琥珀酸放线杆菌(van der Werf等，1997)和产琥珀酸厌氧螺菌(Song等，2007)。然而，用于构建这些基因缺失的方法，在每个被删除基因的区域(ackA，ldhA，adhE，ackA，focA-pflB)留下单一的82-85核酸长度的序列特异性扩增区域(scar)或FRT位点。所述FRT位点在抗性基因的消除过程中作为FLP重组酶的识别位点(Storici等，1999)。KJ073中所有外源序列使用先前所描述的方法(Grabar等，2006；Zhang等.2007；Jantama等，2008b)被连续消除，并用只含有所希望的基因缺失的天然DNA替换。生成的菌株KJ091，包含ackA，ldhA，adhE，focA-pflB，ackA，mgsA，和poxB的特异性缺失，且缺乏所有存在于KJ073菌株中的FRT位点。KJ091菌株缺乏所有外源的和合成的DNA，除了ackA内的一个18-bp翻译终止序列。由菌株KJ091生产的琥珀酸与KJ073菌株相当(表8)。KJ091菌株被作为亲本用于琥珀酸生产的进一步改进。
KJ091菌株的进一步改进的第一步，注意力放在减少乙酸生产上。在E.coli的葡萄糖厌氧发酵过程中，丙酮酸甲酸裂解酶(pflB)被用作乙酰辅酶A的主要来源，乙酰辅酶A是乙酰磷酸(acetyl～P)的前体，乙酸激酶(ackA)作为从acetyl～P生产乙酸的主要路线(Karp等，2007；Kessler & Knappe，1996)。菌株KJ073和KJ091中大量乙酸作为一种发酵产物是出乎意料的，因为这些菌株包含了ackA和pflB两者的缺失(图9)。在发酵的最后残留的乙酸表示一种潜在的进一步改变新陈代谢的方向以提高琥珀酸产率的机会。
一种具有乙酸激酶(和丙酸乙酯激酶)活性的相关的酶由tdcD编码，但是所述酶仅为苏氨酸的降解而被典型地生产(Hesslinger等，1998；Reed等，2003)。如图10所示，在筛选过程中发生的突变可能已经增强了tdcD的表达。在含10％(w/v)葡萄糖的厌氧生长期间，tdcD的表达将功能性替换ackA，增加从acetyl～P到乙酸的生产。相同操纵子中的邻近的tdcE基因与pflB相似，并编码丙酮酸(和α-酮戊二酸)甲酸裂解酶活性，所述丙酮酸(和α-酮戊二酸)甲酸裂解酶活性在苏氨酸降解中被共表达(Hesslinger等，1998)。所述基因在含10％(w/v)葡萄糖的厌氧生长期间的表达增强可能会增加乙酰辅酶A(acetyl～P的直接前体)的生产，并浪费还原剂如甲酸(图10)。从KJ091中同时删除tdcD和tdcE(邻近的)以生产KJ098。与KJ091相比，KJ098中这两种基因的删除使乙酸生产减半，琥珀酸产率增加10％，证实了这种意料之外的路径在使碳流转向远离琥珀酸中的重要性。KJ098生产的丙酮酸的水平也降低了40％，而丙酮酸这种中间体当两种可供选择的丙酮酸代谢的路线(丙酮酸甲酸裂解酶(tdcD)和乙酸激酶(tdcE)活性)被消除时总是被预期其水平会提高。丙酮酸生产的显著减少是tdcD/tdcE基因缺失的意外结果。由tdcD和tdcE的同时缺失导致的丙酮酸减少和琥珀酸增加的机制尚不清楚。
尽管KJ098代表了超越KJ091的显著改进，但是丙酮酸水平的进一步降低和琥珀酸产率的进一步提高是可能的。在厌氧条件下，草酰乙酸被分解成还原产物(苹果酸)和氧化中间体(柠檬酸)(图9)。柠檬酸通过柠檬酸裂解酶(citDEF)能被重新转化为草酰乙酸和乙酸，以使细胞内草酰乙酸(OAA)池(图10)循环用于其他代谢功能(Nilekani等，1983)。大量柠檬酸裂解酶的表达与基于柠檬酸的生长有关(Lutgens和Gottschalk，1980；Kulla和Gottschalk，1977)。柠檬酸裂解酶是由三种不同的多肽链组成的多酶复合物。α或大亚单位是一种柠檬酸-ACP(酸性磷酸酶)转移酶，催化第一步。β或中间亚单位是柠檬酸-ACP裂解酶，催化第二步。γ或小亚单位作为酰基-载体蛋白起作用，且能运载辅基组分。所有3种亚单位对于要发生的反应是必需的(Quentmeier等，1987)。编码这些亚单位的一种或多种的基因的缺失，将消除柠檬酸裂解酶活性，并在琥珀酸生产过程中可能会进一步降低乙酸水平。从KJ098中删除citF基因以生产KJ104。然而，这种删除对乙酸产物或其它琥珀酸产率没有影响(表8)。由于citF的删除没有引起乙酸的任何减少，因此可以推测该中间体可以通过其他路径产生。由于未知原因，与KJ098相比，citF的删除对KJ104的生长有不利影响(细胞产率减少22％)，并且在发酵最后丙酮酸水平增加大约50％。然而，KJ104的琥珀酸产、效价、平均生产力和乙酸水平可与KJ098相比(表8)。
天冬氨酸转氨酶(aspC)是一种多功能酶，通过转氨作用催化天冬氨酸、苯丙氨酸和其它化合物的合成。在反应中，L-天冬氨酸由L-谷氨酸和草酰乙酸通过转氨作用合成，所述的草酰乙酸是一种来自PEP羧化的中间体。除作为蛋白成分外，天冬氨酸参与一些其它的生物合成路径。据估计，大约27％细胞内的氮，通过天冬氨酸流动(Reitzer，2004)。天冬氨酸生物合成和琥珀酸生产共享一个共同的草酰乙酸的细胞内池。aspC的删除将导致琥珀酸生产的增加，但是还可能产生一种营养缺陷型需求，所述需求会阻止基本无机盐培养基(如AM1培养基)中的厌氧生长。
从KJ104中删除天冬氨酸转氨酶基因(aspC)以生产KJ110。出乎意料的，与KJ104相比，aspC的删除对KJ110的琥珀酸产率或细胞产率没有影响(表8)。因此，在所述菌株中，天冬氨酸似乎没有使显著水平的草酰乙酸转移远离琥珀酸生产。可供选择的酶看来好像是可以获得的，以取代先前的天冬氨酸转氨酶催化的生物合成需求。
在KJ104和其他经过基因改造的用于琥珀酸生产的大肠杆菌菌株的发酵的最后存在大量丙酮酸(表8)。所述丙酮酸是一种不需要的产物，它代表着一个进一步提高琥珀酸产率的机会。如图10所示，所述发酵液中的高水平的丙酮酸是由苹果酸在苹果酸酶(sfcA)作用下脱羧而生成。所述苹果酸酶被认为主要在糖异生过程中起作用(Unden和Kleefeld，2004；Stols和Donnelly，1997；Oh等，2002)，而非在葡萄糖的有氧分解代谢过程中。尽管丙酮酸还原羧化形成苹果酸是热力学优选的，但是所述酶的动力学参数优选生理学条件下的脱氢作用和脱羧作用(Stols和Donnelly，1997)。这种使丙酮酸羧化的酶的过量表达先前已被用来作为构建产琥珀酸的大肠杆菌菌株的基础(Stols和Donnelly1997)。
如果苹果酸酶(sfcA)在KJ104(和相关菌株)中进行羧化作用并有助于琥珀酸生产，那么该基因的删除将有望降低琥珀酸产率并增加其他产物(如丙酮酸)的水平。可供选择地，如果苹果酸酶(sfcA)在KJ104中进行脱羧作用并将苹果酸转化为丙酮酸，那么编码该酶的基因的删除将有望增加琥珀酸产率并降低丙酮酸水平。出乎意料的，与KJ104相比，从KJ104中删除sfcA基因生成KJ119对琥珀酸生产、生长、丙酮酸水平等等(表8)没有产生可测量的影响。这些结果清楚地证明苹果酸酶(sfcA)对KJ104和相关菌株的琥珀酸生产是不重要的。这个结果与Stols和Donnelly(1997)培育的产琥珀酸菌株形成鲜明的对比，在Stols和Donnelly(1997)培育的产琥珀酸菌株中，增加苹果酸酶的生产是作为琥珀酸生产的主要路线。
尽管在KJ104中没有观察到因sfcA的删除或aspC的删除而带来显著的优势，但是为了测试将两种基因联合删除的效果进行了许多研究。通过删除KJ110的sfcA基因来生产KJ122，根据预期将看不到任何优势。然而，与亲本菌株KJ110和相关菌株(KJ104和KJ119)相比，sfcA和aspC(菌株KJ122)的联合删除导致了琥珀酸产率和效价的出人意料的增长并且乙酸少量减少(表8)。与KJ104相比，KJ122中的联合删除(aspC和sfcA)导致琥珀酸产率增加18％，琥珀酸效价增加24％，平均生产力增加24％。尽管机制尚不明确，但可能的解释是，单一突变所以无效是因为它们是通过增加流经剩余的酶(苹果酸酶或天冬氨酸转氨酶)的流量部分地进行补偿(图10)，抑制了任何潜在的优势。琥珀酸产率和效价的提高据推测是因为草酰乙酸的可利用性的增加，这就允许更大部分进行反应生成琥珀酸。苹果酸水平也保持在极其低的水平。
菌株KJ122(表8)每消耗1mol葡萄糖产生1.5mol琥珀酸，是最大理论产率的88％(1.71mol每mol葡萄糖)。为了生产所述高水平的琥珀酸且充分减少苹果酸生产，需要额外的还原剂。尽管这种额外的还原剂的来源不清楚，但是这些结果与增加流经丙酮酸脱氢酶的丙酮酸流量是一致的。这种酶被认为是在有氧代谢期间起作用(Guest等，1989)，但也有报道认为其在发酵期间起到的作用水平较低(de Graef等，1999)。
KJ122获得了极优的琥珀酸产率(1.5mol mol-1葡萄糖)及更少量的乙酸和丙酮酸。琥珀酸的最大理论产率是1.71mol mol-1葡萄糖，这些3-碳中间体代表着一个进一步提高产率的机会。据推测，丙酮酸在糖酵解中累积形成代谢溢流，且可能与乙酸累积有关。乙酰辅酶A是多种酶的一种变构调控蛋白。由于编码乙酸激酶的两种主要活性的基因(tdcD和ackA)已被删除，乙酸和乙酸激酶活性的来源不清楚(图9和图10)。假定乙酸是由乙酰化磷酸(acetyl～P)生成的，所述的乙酰化磷酸(acetyl～P)是磷酸转乙酰化酶的产物，在KJ122中构建进一步的删除使pta基因失活。生成的菌株KJ134生成接近理论水平的琥珀酸(表8)。所述菌株中，丙酮酸和乙酸的水平大大降低。体积产量也降低17％。不管发酵过程、培养基或生长条件的复杂性，菌株KJ134获得的琥珀酸产率与其他所有菌株相当或者更好。
实施例3
用于琥珀酸生产的糖异生PEP羧激酶(pck)的使用
大肠杆菌具有四种天然羧化路径的代谢潜力，所述羧化路径被用于生产琥珀酸(图2A-2D)。磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)作用下羧化生成草酰乙酸(OAA)的羧化作用被认为是E.coli中发酵生产琥珀酸的主要路径(图2A)(Fraenkel DG 1996；Unden&Kleefeld，2004；Karp等，2007)。所述反应本质上是不可逆的，原因是无机磷酸盐的释放伴随着能量损失。其他三种羧化反应通常被培养基中高浓度葡萄糖阻遏，也有报道其在逆方向的糖异生中起作用(Samuelov等，1991；Oh等，2002；Stols & Donnelly，1997)。第二种和第三种羧化路径(图2B和2C)使用NADH-苹果酸酶和NAPDH-苹果酸酶(sfcA and和maeB)，分别催化由丙酮酸到苹果酸的可逆的羧化作用。两种路径都允许在从PEP形成丙酮酸过程中，能量以ATP的形式储存。第四种路径使用PEP羧激酶(pck)催化由PEP到OAA的可逆的羧化反应，其中能量以ATP的形式储存(图2D)。尽管PEP羧激酶(PCK)典型地仅在E.coli的糖异生过程中起作用，但在产琥珀酸的瘤胃细菌中，一种类似的PEP羧激酶以非常高的水平存在，其中它是作为主要的PEP羧化活性(Vander Werf等，1997)。
大肠杆菌菌株KJ073通过两种目标基因的删除和进化进行代谢改造以获得高的生长速率和琥珀酸生成(Jantama等，2008a)。编码四种羧化酶(ppc，sfcA，maeB和pck)中的每一种的基因被分别删除，以识别工程菌株KJ073中琥珀酸生产的主要路径(表10)。天然E.coli(XZ320)中编码主要羧化步骤的ppc基因的删除不会改变琥珀酸生产。分别删除编码苹果酸酶(sfcA和maeB)的基因以获得XZ341和XZ396，对琥珀酸生产也没有影响，这与它们在糖异生中的主要作用一致。然而，删除编码PEP羧激酶的pck(XZ332)，戏剧性地减少了细胞生长、糖代谢、琥珀酸生产和琥珀酸产率。菌株XZ332中缺失突变的互补物携带有来自菌株KJ073完整pck基因(质粒pLOI4677)的，大大增加了琥珀酸生成，至接近KJ073(表10)。
同时，这些结果表明，糖异生的PEP羧激酶在代谢过程中被使用，作为KJ073中发酵生产琥珀酸的主要羧化反应。与PEP羧化酶不同(图2A)，PEP羧激酶储存能量供给额外的ATP(图2D)。由于发酵生长与ATP产生紧密关联，PEP羧激酶作用下ATP产率的增加(图2D)将在基于生长的筛选中提供竞争优势，所述基于生长的筛选发生在生成菌株KJ073的代谢进化步骤。
PEP羧激酶活性增加与pck mRNA丰度的增加相关联(表11；图12A)。当KJ073中的pck转录丰度相比于野生型有所增加时，其与增强的PEP羧激酶活性高度一致，而ppc，sfcA和maeB的转录水平基本没有变化(表11)。
对pck基因进行的测序，显示出与pck基因的编码或终止子区域与KJ073没有差别。然而，在KJ073中的pck基因上游启动子区域发现了单一位点突变(相对于ATG启动密码子在-64位点G到A的置换)(表11)。所有六种菌株被测序以识别菌株改良过程中突变的由来。尽管在KJ017中PEP羧激酶活性比在KJ012中高3倍，但是不存在G到A的突变。KJ073菌株中pck基因启动子区域的点突变被称为pck*突变(高PEP羧激酶活性)。所述pck*突变仅在表现出高PEP羧激酶活性的KJ060和KJ073菌株中存在，其在KJ071中不存在。KJ071中所述突变的缺失，伴随着只相当于KJ017相等水平的1/10的PEP羧激酶活性。
KJ017和KJ071中引入pck*点突变(G到A)，PEP羧化酶活性增加了8倍(表11)。恢复菌株KJ060和KJ073中的野生型pck基因(A到G)，分别得到菌株XZ622和XZ624。XZ622和XZ624均显示PEP羧化酶活性降低至大约1/8(表12)。结果表明，在KJ017生产KJ060的代谢进化过程中发生的PCK活性增加，归因于pck的单一核苷酸改变(相对于ATG起点-64位点的G变为A)。KJ017中这种突变的缺失也暗示，在该菌株观察到的PEP羧激酶活性起初增加到4倍，归因于其它待定义的一种或多种变化。显然，用于发酵生产琥珀酸的天然糖异生的PCK的使用是由多种突变引起的，所述多种突变影响pck基因的转录。
PEP羧激酶活力在由KJ012培育KJ017过程中增加了3倍，这种增长不是由pck基因突变引起的，可能涉及转录调控蛋白中的突变。Cra蛋白表现了对E.coli中pck表达的活化作用(Saier & Ramseier，1996)。然而，在cra基因或上游区域中没有发现突变。KJ017(XZ626)和KJ060(XZ627)中cra的缺失不影响PEP羧激酶活性(表12)。
csrA系统也被报道可以通过改变mRNA稳定性来调控pck和其他参与到葡萄糖代谢中的基因的水平(Pernestig等，2003)。然而，在所述调控系统(csrA，csrB，csrC，csrD，uvrY或barA)涉及的基因序列中没有发现突变。
大肠杆菌PEP羧激酶活性受到葡萄糖分解代谢物阻遏(Goldie 1984)。启动子中的两个Crp-结合位点已被识别(Ramseier等人，1995)，所述位点距离KJ060和KJ073中的点突变非常遥远。与分解代谢物阻遏相关的基因(cyaA，crp)和与葡萄糖摄取相关的基因(ptsH，ptsI，crr，ptsG)被测序(上游区域经过终止子)，所述的葡萄糖摄取通过磷酸转移酶系统(ptsH，ptsI，crr，ptsG)进行。在菌株KJ060，KJ071，和KJ073中仅发现一个突变，即ptsI的C-端区域的移码突变(在位点1,673的单碱基缺失)。由于KJ017不存在这种缺失，因此它不是所述菌株中PEP羧激酶活性起初增加3倍的原因(表12)。KJ017(XZ613)和KJ060(XZ615)中ptsI的缺失不影响PEP羧激酶活性。
在含5％葡萄糖和不含5％葡萄糖的LB培养基中有氧培养大肠杆菌ATCC 8739，KJ012，KJ017，和KJ060，进一步研究pck的分解代谢物阻遏中的潜在变化(表3)。PEP羧激酶活性被报道在对数生长后期最大(Goldie，1984)，且已在我们的菌株中得到证实。在ATCC 8739和代谢进化的起始菌株(KJ012)中，PEP羧激酶活性因葡萄糖的存在而受到严重阻遏(＞70％)。葡萄糖介导的阻遏通过环腺苷酸(cyclic-AMP)的添加而解除。相比之下，KJ017中的PEP羧激酶活性是KJ012中的4倍且不受葡萄糖添加的影响，这表明分解代谢物阻遏的损失。KJ060中PEP羧激酶活性在葡萄糖不存在条件下的生长期间甚至更高(是KJ017中的5倍)，当加入葡萄糖时，酶活性进一步增加。KJ060(和KJ073)中，pck的葡萄糖分解代谢物阻遏已被葡萄糖活化取代(表13)。对所述菌株中的cyaA，crp，ptsG，ptsI和crr的转录丰度进行比较(图12B和12C)。cyaA，crp，和ptsG在KJ017，KJ060，KJ071和KJ073中的转录普遍要比在KJ012和ATCC 8739中高。通过提高cyclic-AMP水平来提高这些蛋白的水平，使之能盖住分解代谢物阻遏。
这些突变体中分解代谢物阻遏的损失不会限制pck表达。ATCC 8739和KJ012在含葡萄糖的生长期间，β-半乳糖苷酶活性减半(表13)。所述活性通常被葡萄糖阻遏，但在KJ017和KJ060中相对不受影响，这与Crp-介导的葡萄糖调控的整体损失一致。
相对于葡萄糖抑制的亲本ATCC 8739，KJ012和KJ017中的crp基因的缺失降低了生成的菌株(分别为XZ642和XZ643)中PEP羧激酶活性(表13)。在所述crp-缺失的菌株中，PEP羧激酶活力不受葡萄糖或cyclic AMP添加的影响。因此，Crp可能是KJ017及其派生物中观察到的pck表达增加3倍的一种基本调节元素。Crp-介导的Pck表达增加3倍及与上游pck突变相关的表达增加10倍能够解释KJ060和KJ073培育过程中观察到的PEP羧激酶活性水平的改变。
与腺苷-3′，5′-环化一磷酸(cAMP-CRP)调控有关的其他基因也被测序(表13)，如预测的腺苷酸环化酶ygiF，Crp sxy的转录辅激活因子，cAMP磷酸二酯酶cpdA糖代谢的全局性调控因子mlc(Keseler等，2005；Cameron & Redfield，2006；Imamura等，1996；Plumbridge，2002)。然而，在这些与cAMP-CRP调控有关的基因的上游、编码或终止子区域没有发现任何突变。
基因ptsI编码PEP-蛋白磷酸转移酶，所述PEP-蛋白磷酸转移酶是磷酸烯醇式丙酮酸依赖性糖磷酸转移酶系统的基本(非糖特异性的)的组分。这种主要的糖主动转运系统催化进入的糖底物的磷酸化，同时伴随着它们横跨细胞膜的转移。PEP-蛋白磷酸转移酶从磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)转移磷酰基至磷酰基载体蛋白(HPr)(参见，例如UniProtKB，序列号P08839)。
在ptsI中发现一个移码突变(1673bp位置的单碱基对缺失)，该移码突变发生在从KJ017到KJ060的代谢进化过程中。为研究所述突变的意义，在KJ017和KJ060中删除ptsI的C端175bp，分别生成XZ613和XZ615。正如预期的，KJ060(XZ615)中ptsI的缺失对生长和PEP羧激酶活性没有影响。删除KJ017中ptsI的C端生成XZ613，导致了XZ613不能在含葡萄糖的NBS无机盐培养基上生长，这与葡萄糖主要摄取系统(PEP依赖性磷酸转移酶系统)的缺失一致。培养若干天后，XZ613的培养物开始生长，所述培养物被推测为具有活化的可供选择的葡萄糖转运系统的派生物(Karp等，2007)。
KJ060，KJ071和KJ073中发现的ptsI突变有望使葡萄糖的PEP依赖性磷酸转移酶系统失活。可供选择的葡萄糖摄取系统(例如GalP)已经显示出在pts突变中能恢复葡萄糖摄取(Wang等，2006；Yi等，2003)。与KJ012和ATCC 8739相比，所述改良菌株(图12B)中galP的表达增加了4-19倍，同时葡萄糖激酶(glk)少量增加。用一种功能性野生型基因(XZ616)替换KJ060中的突变ptsI基因是不利的，显著地减少了KJ060在NBS-葡萄糖培养基上的生长。所述不利影响可能是由PEP的消耗引起的，所述的PEP是野生型葡萄糖转运所需要的底物。功能性的PEP依赖性磷酸转移酶系统将与PEP羧激酶竞争，减少了氧化还原平衡、ATP生产和琥珀酸生产可获得的PEP池。因此，如果有现成可使用的可供选择的转运系统，例如GalP(和葡萄糖激酶)，那么葡萄糖的PEP依赖性磷酸转移酶系统的缺失可被看作菌株培育过程中的有益事件。
PEP结点中碳通量用于限制在葡萄糖厌氧发酵过程中产生的用于氧化还原平衡的琥珀酸的量(图13)。此外，这些通量必须提供足够的能量(ATP)用于生长、维持及前体的生物合成。以琥珀酸作为主要产物的瘤胃细菌，使用能储存能量的PEP羧激酶生产OAA产物(图2D)(Van der Werf等，1997；Kim等，2004)。大肠杆菌的天然菌株生产琥珀酸作为副产物，并使用PEP羧化酶(ppc)(图2A)。与PEP羧激酶不同，PEP羧化酶本质上是不可逆的，原因是能量损失与无机磷酸盐的释放相关。先前的研究表明，大肠杆菌中天然ppc基因的过量表达导致更高的特异性琥珀酸生产(Millard等，1996)，和更高的特异性生长速率，原因是PEP羧化生成草酰乙酸的增加(Farmer & Liao，1997)。然而，由于天然葡萄糖转运系统需要PEP，因此过量表达ppc也降低葡萄糖摄取速率，并没有显著增加琥珀酸产率(Chao & Liao，1993；Gokarn等，2000)。天然磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶在增加琥珀酸产率上的失败将大部分的研究注意力转移到新的代谢设计上，即使来自乳酸菌杆菌(Lactobacillus lactis)或菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)的丙酮酸羧化酶过量表达作为羧化步骤(Vemuri等，2002ab；Gokarn等，2000；Lin等，2005a，2005b，2005c)，以及使来自Actinobacillussuccinogenes的PEP羧激酶过量表达用于工业生物催化剂的开发(Kim等，2004)，而不是继续从事对于大肠杆菌基因的天然谱型的进一步的研究。
天然大肠杆菌有三种可供选择的羧化路径(图2B-2D)，所述路径典型地仅在反方向的糖异生中起作用(Samuelov等，1991；Kao等，2005；Oh等，2002；Stols & Donnelly，1997)。所有3种路径都能以ATP的形式储存来自PEP的能量。琥珀酸作为NADH氧化的独有路线，基于生长的选择(代谢进化)导致获得菌株KJ017，KJ060，KJ071，和KJ073，这些菌株在生长(细胞产率)和琥珀酸生产上都有改进。在KJ017，KJ060，KJ071，和KJ073这些菌株中，糖异生的PEP羧激酶(pck)通过转录激活被用作主要的羧化活力。PEP羧激酶作为E.coli生产琥珀酸的主要路径的应用是出人意料的。许多研究已经显示大肠杆菌pck的表达增强对琥珀酸生产没有影响(Gokarn，等，2001；Vemuri等，2002；Millard等，1996；Gokarn等，2000；Hong & Lee，2001)。最近的研究证明大肠杆菌pck的表达增强对基本培养基上的生长是有害的，降低了生长速率、葡萄糖代谢速率及琥珀酸产率(Kwon等，2008)。
pck在大肠杆菌中表达的增强导致流入4-碳中间体OAA用于琥珀酸生产(氧化还原平衡)的碳流增加，琥珀酸生产增加，且用于生长和维持的ATP净产量增加。至少有3件事情归功于pck转录的增强：1)Crp-介导的葡萄糖阻遏的缺失；2)葡萄糖激活的获得；和3)pck上游区域单碱基改变。通过提高PEP羧激酶水平、增加碳进入琥珀酸的流动以及增加代谢能量ATP的储存，上述3件事情中的任意一件都提供了通过代谢进化选择的基础。所述基因事件的联合作用，结果是在KJ060和KJ073中获得了高水平的PEP羧激酶(＞7000U(mg蛋白)-1)，所述水平与瘤胃细菌相当，所述瘤胃细菌已经进化成把生产琥珀酸作为主要发酵产物(VanderWerf等，.1997)。
菌株KJ060，KJ071，和KJ073中发现了其他的储存能量的变化，所述变化可能有助于PEP羧激酶作为发酵生产琥珀酸的主要路线的应用。PEP依赖性磷酸转移酶系统是大肠杆菌天然菌株中主要的葡萄糖摄取系统。在转运过程中，葡萄糖产生的PEP的一半被用于摄取和磷酸化，限制用于氧化还原平衡和ATP生产的代谢选项。改良的菌株在ptsI中包含一个移码突变，使得这种摄取系统失活。编码质子同向共转运蛋白的galP的表达增强直至达到20倍，所述质子同向共转运蛋白能转运葡萄糖。GalP的表达增强和天然葡糖激酶通过使用ATP而非PEP进行磷酸化作用，可以功能性取代葡萄糖磷酸转移酶系统(Wang等，2006；Yi等，2003；Flores等，2007)。这种交换涉及一种节能的提高PEP池大小的方法，所述PEP可用于羧化作用和使用琥珀酸的氧化还原平衡(图11)。所有改良菌株引导超过一半的葡萄糖碳进入4-碳产物(苹果酸加琥珀酸)，并需要超过一半的PEP用于氧化还原平衡。丙酮酸在ATP作用下能够转化为PEP，同时形成PPi和AMP，但该过程浪费能量。因此，ptsI突变和galP表达提高了葡萄糖代谢生成琥珀酸的能量效率，在代谢进化过程中提供了生长优势。
消除除琥珀酸外的其他NADH氧化路线，连同用于选择生长上的改进的代谢进化一起获得了产琥珀酸大肠杆菌菌株，所述菌株在功能上等同于产琥珀酸的瘤胃细菌，如Actinobacillus succinogenes和Mannheimia succiniciproducens(VanderWerf等，1997；Kim等，2007；Martin，1994；McKinlay等，2008)。OAA是利用储存能量的PEP羧激酶生产的。通过使用葡萄糖透性酶(和葡糖激酶)而非PEP依赖性磷酸转移酶系统摄取葡萄糖，PEP得以保存，从而消除了对于耗能再生(2-ATP当量)的需求。值得注意的是，瘤胃细菌生产其他发酵产物中，磷酸转移酶系统广泛被用于葡萄糖摄取(Martin，1994)。最有前景的生产琥珀酸的E.coli菌株，KJ060和KJ073，生成大约700mM的琥珀酸，产率为每摩尔葡萄糖产1.2mol琥珀酸(Jantama等，2008a)，与最好的天然产琥珀酸的瘤胃细菌Actinobacillus succinogenes相当(Guettler等，US5,505,004)。
能改进葡萄糖在大肠杆菌中的琥珀酸生产的能量储存策略也能被应用于解决菌株设计中的其他重要问题。由于全球性的生物柴油产品的增加，甘油正在成为一种廉价原料。与葡萄糖相比，甘油更加简化，每分子甘油能够转化为琥珀酸并维持氧化还原平衡。然而，在使用天然耗能羧化活性(即PEP羧化酶)的甘油代谢生成琥珀酸的过程中，不能生成净ATP。该问题能够通过使用节能的PEP羧激酶而得以解决，并允许每分子琥珀酸净形成1分子ATP。此外，羧化产物OAA是细胞代谢中的一种重要中间体，所述OAA是许多其他重要发酵产物的前体，如苹果酸、延胡索酸、天冬氨酸、赖氨酸、苏氨酸，蛋氨酸，除了别的之外。本领域技术人员能够领会此处解释的能量保存策略能用于开发和改进用于许多工业上的重要化学品生产的生物催化剂。
实施例4
重新设计大肠杆菌用于无机盐培养基中生产琥珀酸
本研究所使用的菌株列于表16。各种菌株的构建过程中所用的质粒和引物列在表15，所述的菌株是在本发明过程中培育的。
大肠杆菌中混合酸路径的考察表明三条主要的NADH氧化路线生成琥珀酸，乳酸和乙醇(图14)。删除基因能消除这些竞争性的NADH氧化路线，但这不足以引导碳流入琥珀酸(表16)。在NBS无机盐培养基中的发酵过程中，与亲本菌株(ATCC 8739)相比，除了adhE删除后琥珀酸有少量增长外，这些基因的单个删除降低了琥珀酸产量和产率，对细胞产率影响很小。两种可选择的NADH氧化路径(ldhA和adhE或ldhA和pflB)的删除，大大降低了在NBS无机盐培养基中的生长、琥珀酸产率和琥珀酸产量。
在LB培养基上观察到非常不同的结果(表16)。在包含ldhA(单独或结合)删除的所有菌株中，发现琥珀酸产率适度提高。此外，在双突变或三突变体中，生长减慢。这些删除都不足以重新引导大量葡萄糖碳进入琥珀酸，不管在无机盐培养基还是在天然培养基中。在大肠杆菌中天然混合酸路径的观察分析的基础上，为琥珀酸生产构建的删除菌株在天然培养基中比预期的少产，在NBS无机盐培养基中是不成功。
我们先前的研究(Jantama等，2008a；Jantama等，2008b)中发现了一个启动子突变(相对于ATG起点-64处G到A；表示为pck*)，所述突变增加了磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)活性，并增加了在多种其他突变存在下由葡萄糖到琥珀酸的生产。这是令人意外的，因为pck典型地被葡萄糖阻遏(Goldie，1984)，并显示出主要在有机酸有氧代谢过程中的糖异生中起作用(Kao等，2005；Keseler等，2005；Oh等.2002；Unden &Kleefeld，2004；Wu等，2007)。为了进一步考察这种基因，扩增得到pck基因(核糖体结合位点，编码和终止子区域)并将其克隆至pCR2.1-TOPO以生产pLOI4677，在lac启动子控制下表达pck。所述质粒被转入ATCC 8739。另外，ATCC 8739中的天然pck基因被突变pck*基因替换以构建XZ632。使用NBS无机盐培养基在两种菌株中检测葡萄糖发酵。
与包含天然pck基因的同基因菌株相比，引入pck*导致琥珀酸产率和产量的适度增加(表16)。发现在IPTG-诱导的启动子的作用下XZ632菌株和具有一个含有pck*基因的质粒的亲本菌株中的PCK活性均比在亲本菌株中增加超过7倍。依靠染色体整合，IPTG诱导启动子作用下，单拷贝pck*与含pck*基因的多拷贝质粒对PCK生产几乎一样有效。与亲本ATCC 8739菌株相比，观察到两种含提高的PCK活性的菌株在琥珀酸产率和产量上都有适度改进(表17)。然而，仅仅增加PCK活性不足以使葡萄糖碳转向琥珀酸。
对pck*突变与其他突变的结合进行试验，可消除NADH氧化路径(表18)。多个突变对于消除NADH氧化的竞争路线和PCK活性的增加的联合作用，仍然不足以本质上使葡萄糖碳转向琥珀酸。
磷酸烯醇式丙酮酸依赖性磷酸转移酶系统是大肠杆菌中葡萄糖摄取的主要机制，及葡萄糖分解代谢物阻遏系统不可或缺的组成部分(Keseler等，2005；Postma等，1996)。如实施例3所描述，在代谢进化获得的琥珀酸生产菌株KJ060，KJ071和KJ073中发现ptsI的C端有一移码突变(在1673bp位置的单一碱基对缺失)。所述突变有望能破坏磷酸转移酶系统的功能(Postma等，1996)。在所述突变体中，葡萄糖摄取被galP(半乳糖透性酶)和glk(葡萄糖激酶)功能性取代(Hernandez-Montalvo等，2003；Keseler等，2005)。为了研究ptsI破坏作用对于琥珀酸生产的影响，删除野生型E.coli ATCC 8739的ptsI的C端175bp以获得菌株XZ650。令人意外地，由于这个突变，琥珀酸产量和产率相比于亲本降低了(表18)。
采用两种方法研究将ptsI截短和高水平的PCK结合的效果，所述的两种方法是使用pck*突变或从lac启动子(质粒pLOI4677)过量表达天然pck。在与ptsI截短的结合中，两种方法都在琥珀酸生产上获得了戏剧性增加(表18)。菌株XZ647(pck*，ΔptsI)在含5％葡萄糖的NBS无机盐培养基中产生216mmol琥珀酸，产率为每摩尔葡萄糖产0.89mol琥珀酸，比野生型E.coli ATCC 8739高3.7倍(表18)。在XZ647和XZ650(pLOI4677)中，甲酸，乙醇和少量乳酸以副产物残存。磷酸烯醇式丙酮酸依赖性磷酸转移酶系统的失活和PCK活性水平的提高这两种改变代表了在NBS无机盐培养基中使葡萄糖代谢有效转向琥珀酸生产所要求的核心改变，所述核心改变没有对与发酵氧化还原平衡直接相关的任何基因进行修饰。
进一步实验证明，磷酸转移酶系统在pck*背景下的多种突变可以增加琥珀酸。对葡萄糖的PEP依赖性磷酸转移酶系统的任意步骤的破坏都能增加碳流入琥珀酸，增加效价和产率。
PEP依赖性磷酸转移酶系统将磷酸从PEP运送到PtsI，然后到PtsH，然后到PtsG，然后到葡萄糖形成6-磷酸-葡萄糖。表19显示在含有能提高磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶水平的pck*突变的菌株中，在参与到这个磷酸传递系统的Pts基因(ptsI，ptsH或ptsG)中的任意一个基因中发生了另一种突变，所述的另一种突变导致了相似的戏剧性的转移，即碳流流入琥珀酸作为主要的发酵产物。就这点而言，整个ptsI基因的缺失或ptsI基因C端的截短都优于ptsG和ptsH缺失。ptsI基因C端的截短产生最高产率和效价的琥珀酸，稍好于ptsI的完全缺失。其他能获得不活泼基因产物的突变，如插入、删除和移码突变，都有望产生相似效果。
尽管菌株XZ647(pck*ΔptsI)生产琥珀酸作为主要发酵产物，但是也生成显著水平的不需要的联产物(乳酸，乙醇，甲酸和乙酸)(表18)。adhE(XZ723)或pflB(XZ721)的缺失消除了乙醇的生产。乙酸和甲酸生产只有通过pflB缺失才能大大减少或消除。生成的菌株(XZ721)生产出高水平的琥珀酸，每摩尔葡萄糖生成超过1.2mol的琥珀酸。
琥珀酸典型代表大肠杆菌中葡萄糖发酵的副产物。利用可供选择的NADH氧化路径，大部分的葡萄糖碳被转化为乙醇和乳酸，较少量转化为甲酸和乙酸(图14)。在超过10年的时间里，已经构建了许多大肠杆菌派生物以提高琥珀酸生产，获得了不同程度的成功(Donnelly等，U.S.Pat.No.5,770,435；Gokarn等，2000；Gokarn等，U.S.Pat.No.6,455,284；Millard等，1996；San等，U.S.Pat.No.7,223,567；Sanchez等，2005b；Sanchez等，2005a；Stols & Donnelly，1997；Vemuri等，2002a；Wu等，2007)。用于构建所述菌株的策略典型地集中在消除用于NADH氧化的竞争性路径(Donnelly等，U.S.Pat.No.5,770,435；Gokarn等，U.S.Pat.No.6,455,284；San等，U.S.Pat.No.7,223,567；Sanchez等，2005b；Sanchez等.2005a；Vemuri等.，2002a；Wu等，2007)。用于删除的目标基因的筛选主要是基于路径的考察(图14)。然而，所述策略的成功局限于天然培养基和两步过程(有氧生长阶段和随后的厌氧生产阶段)(Donnelly等，U.S 5,770,435；Gokarn等，U.S6,455,284；Millard等，1996；San等，U.S7,223,567；Sanchez等，2005b；Sanchez等，2005a；Vemuri等，2002a；Wu等，2007)。
在天然培养基中(如LB培养基)，生长需要的大部分生物合成的物质由营养物中(酵母提取物和胰蛋白胨)的中间体和砌块分子提供。在所述培养基中，基于对发酵路径的观察的基因缺失本身通常能够改进琥珀酸生产(图14和表16)。(ldhA)和包含ldhA的目标基因的所有结合的缺失，导致在LB培养基中发酵期间，每分子葡萄糖的琥珀酸产率和产量增加(表16)。
然而，在无机盐培养基如NBS或AM1培养基中，混合酸发酵路径中相同目标基因的缺失是没有帮助的。大部分的缺失对于琥珀酸产量和产率两者都是有害的。在NBS无机盐培养基中，除了adhE缺失后有少量增长外，混合酸发酵路径中单基因缺失和联合基因缺失都降低了琥珀酸产量和产率(表17)。KJ012(ATCC 8739ΔldhA ΔadhE ΔackA)是一种专利菌株的基因等价物，所述专利菌株用于在天然培养基中两步(好氧生长阶段，随后厌氧生产阶段)生产琥珀酸(San等，U.S7,223,567)，KJ012(ATCC 8739ΔldhA ΔadhEΔackA)相比于野生型亲本菌株在NBS无机盐培养基中生成的琥珀酸较少。在这些结论的基础上，我们总结出在路径观察基础上做出的对缺失的目标基因的合理选择不能可靠地实现无机盐培养基中琥珀酸生产的改进。在无机盐培养基中，碳必须在能量产生、发酵和细胞生长所需要的砌块分子的生物合成之间精确地分配。
上述结果表明本发明提供了一种构建菌株的新策略，所述菌株用于在无机盐培养基中生产琥珀酸。不需要为了引导大量葡萄糖碳流入琥珀酸而在编码大肠杆菌混合酸发酵路径(图14)的基因中发生突变。本发明中，次要路径中两种核心改变的结合导致琥珀酸产率增加4倍。所述琥珀酸生产所需要的两种核心改变为：1)表达增强的储存能量的(糖异生的)磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶，取代天然发酵磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(耗能的)；和2)可选择的透性酶，如galP和ATP依赖性磷酸化作用(glk)，取代葡萄糖磷酸烯醇式丙酮酸依赖性磷酸转移酶系统。同时，所述改变增加了用于生长的净ATP生产，增加了可用于羧化的磷酸烯醇式丙酮酸池，且增加了琥珀酸生产。
混合酸发酵路径中基因的其他突变，如pflB的缺失和其它，代表进一步适度增加琥珀酸产率和产量的机会。值得注意的是，所述乙酰辅酶A是生物合成的一种基本代谢物，它主要是由pflB在发酵生长过程中产生。据推测，所述功能在pflB突变体中被丙酮酸脱氢酶复合物(aceEF，lpd)的天然表达所取代，所述丙酮酸脱氢酶复合物是一种在氧化代谢过程中典型地用于乙酰辅酶A生产的主要路线的酶(Kim等.，2007)。用于无机盐培养基中生产琥珀酸的最优设计的大肠杆菌菌株中获得的琥珀酸路径(图14)在功能上与产琥珀酸瘤胃细菌中进化形成的天然路径相似(Kim等，2004；Lee等，2002；Lee等，2006；Samuelov等.，1991；VanderWerf等，1997)。
实施例5
甘油产琥珀酸
尽管甘油和葡萄糖氧化还原性能和转运机制不同，但我们发现能够在无机盐培养基中促使葡萄糖转化为琥珀酸的相同突变，也能被用于有效引导甘油代谢生成琥珀酸，达到甘油转化为琥珀酸的最大效率为80％(消耗每摩尔甘油产0.8mol琥珀酸)。
在研究过程中，我们发现先前被认为隐秘的gldA和PEP依赖性磷酸转移酶路径，包含一个重要的甘油分解代谢的功能性路线(图15)。在所述两种路线中，甘油通过便利的扩散进入细胞。在细胞内，部分甘油被立即磷酸化，然后氧化生成DHAP，该路径被广泛认为是大肠杆菌中甘油代谢的标准路径。我们发现至少1/3的甘油首先利用gldA还原成DHA，随后被作用于细胞质内的PEP依赖性磷酸转移酶系统(ptsH，ptsI)磷酸化生成DHAP。所述DHAP用作摄取和活化系统的中心代谢的共同进入点。
表20清楚显示了将核心突变组合用于无机盐培养基(NBS)中由甘油生产琥珀酸的有效性，所述的核心突变在由葡萄糖生产琥珀酸中被识别出，所述无机盐培养基没有添加天然营养物。尽管pflB的单独缺失会降低琥珀酸生产，使其低于野生型亲本，但是pflB缺失和pck(pck*；转录激活)中启动子突变的组合会使琥珀酸产率加倍，使其从0.25mol/mol甘油增加到0.5mol/mol甘油。随后在ptsI中增加一个突变，会进一步提高琥珀酸产率至0.8mol琥珀酸/mol甘油，为最大理论产率的80％。其他关键基因(gldA，ptsH，ptsI，dhaKL，dhaM)的缺失也获得了类似结果，所述关键基因破坏用于磷酸化的磷酸根中继系统(phosphorelay system)的使用(表20)。这些结果是出乎意料的。甘油转化的结果路径如图15所示。
图15显示了野生型大肠杆菌中普遍接受的甘油分解代谢路径(Lin，1996)与混合酸发酵路径(Bock和Sawers，1996)的结合。在所述路径中，如果琥珀酸作为生成的唯一产物，那么产生的所有ATP将被甘油磷酸化作用所消耗。没有ATP是生长可利用的。在图15的基础上，预期pflB的缺失通过增加还原剂和中间体的可用性而增加琥珀酸生产。与这种预期相对照，观察到pflB的缺失降低了琥珀酸生产(表20)。在所述路径基础上，可以预期pck基因突变的活化能通过与丙酮酸激酶竞争增加磷酸烯醇式丙酮酸流入琥珀酸，这种预期仅仅是基于本申请先前的观察，即PCK表达增强有利于糖发酵生成琥珀酸，否则将不可预期，所述pck基因通常仅在糖异生过程起作用。磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(pck)取代磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)的使用具有额外的优势，即将来自磷酸烯醇式丙酮酸的能量以额外的ATP的形式储存，所述ATP能用于生物合成。
尽管ptsI中的突变有利于碳从葡萄糖转移至琥珀酸，但是不可能预测这对于碳从甘油转移至琥珀酸有任何好处，因为经确认在野生型大肠杆菌中唯一起作用的甘油摄取系统(glpF)不涉及磷酸烯醇式丙酮酸磷酸转移酶系统(Keseler等，2005；Lin，1996.)。仅知的磷酸转移酶系统在甘油代谢中的参与是一个次要路径，所述次要路径被认为在野生型大肠杆菌中是不运行的(Jin等，1983：；Lin，1996；Tang等，1982)。所述次要路径首先利用GldA还原细胞内甘油生成二羟基丙酮(DHA)，然后使用PtsH(ptsH)和EI(ptsI)作为磷酸载体，将磷酸烯醇式丙酮酸结合到细胞内DHA的磷酸化以生产二羟基丙酮-磷酸(DHAP)。所述路径被认为仅在glpK失活的突变菌株中起作用(Gutknecht等，2001；Keseler等，2005)。与以普遍接受的甘油代谢路径为基础的所有预期相反，ptsI突变显著增加了甘油产琥珀酸的量。这些结果表明，甘油脱氢酶(gldA)和PTS磷酸根中继系统(磷酸烯醇式丙酮酸，PtsH，PtsI)对于在NBS无机盐培养基中甘油厌氧发酵的过程中甘油分解代谢生成二羟基丙酮-磷酸(DHAP)具有预料不到的重要性。在琥珀酸产率大量增加的基础上，估计所述二羟基丙酮(DHA)路径能引起至少1/3甘油通量流入糖酵解。ptsI的删除使所述路径不起作用，增加可用于琥珀酸生产的磷酸烯醇式丙酮酸产琥珀酸。同时，这三种核心突变(pck*，ptsI，pflB)有效地且意外地在无机盐培养基中厌氧发酵过程中引导碳从甘油流向琥珀酸，产率为最大理论产率的80％(图15)。此外，所述路径的使用导致ATP产量大大增长，促进生长。
Figure BDA0000115712200000411
Figure BDA0000115712200000421
a缩略词：CSL，玉米浆；YE，酵母提取物；NR，未报道.
b平均体积生产量表示在括号内[g l-1h-1]，在琥珀酸效价下方。
c摩尔产率是根据代谢葡萄糖在有氧和厌氧两种条件下生成的琥珀酸计算的。生物量主要在有氧生长过程中生成。琥珀酸主要是在厌氧培养过程产生，所述的厌氧培养过程存在CO2，H2或两者的混合。
表2保存于ARS保藏中心的细菌菌株列表
  培养物   菌株保藏号   保藏日期
  KJ012   B-50022   2007-3-15
  KJ017   B-50023   2007-3-15
  KJ032   B-50024   2007-3-15
  KJ060   B-50025   2007-3-15
  KJ070   B-50026   2007-3-15
  KJ071   B-50027   2007-3-15
  KJ072   B-50028   2007-3-15
  KJ073   B-50029   2007-3-15
  KJ091   B-50110   2008-2-20
  KJ098   B-50111   2007-3-15
  KJ104   B-50112   2007-3-15
  KJ110   B-50113   2007-3-15
  KJ119   B-50114   2007-3-15
  KJ122   B-50115   2007-3-15
  KJ134   B-50116   2007-3-15
  XZ320   NRRL B-50267   2009-3-17
  XZ332   NRRL B-50268   2009-3-17
  XZ341   NRRL B-50269   2009-3-17
  XZ396   NRRL B-50270   2009-3-17
  XZ468   NRRL B-50271   2009-3-17
  XZ469   NRRL B-50272   2009-3-17
  XZ470   NRRL B-50273   2009-3-17
  XZ613   NRRL B-50274   2009-3-17
  XZ615   NRRL B-50275   2009-3-17
  XZ616   NRRL B-50276   2009-3-17
  XZ618   NRRL B-50277   2009-3-17
  XZ620   NRRL B-50278   2009-3-17
  XZ647   NRRL B-50279   2009-3-17
  XZ721   NRRL B-50280   2009-3-17
  XZ723   NRRL B-50281   2009-3-17
Figure BDA0000115712200000441
Figure BDA0000115712200000451
Figure BDA0000115712200000461
Figure BDA0000115712200000471
Figure BDA0000115712200000481
Figure BDA0000115712200000491
a 数据来自van der Werf等，1997
b 由于乳酸脱氢酶的存在，在野生型E.coli C中不可测量。
a NBS+1mM甜菜碱：NBS培养基用甜菜碱(1mM)改良。
b 计算包括用于中和甜菜碱-HCl存储液的KOH。
c 痕量金属存储液(1000X)在120mM HCl中配制。
Figure BDA0000115712200000521
Figure BDA0000115712200000531
Figure BDA0000115712200000541
Figure BDA0000115712200000551
Figure BDA0000115712200000561
Figure BDA0000115712200000571
Figure BDA0000115712200000581
pck*表示pck的突变形式，包含在-64(ATG)处G到A的转变。
所有菌株为E.coli ATCC8739的派生物。
*所有发酵在含5％葡萄糖和100mM碳酸氢钾的NBS培养基中进行。
产率是作为每摩尔葡萄糖代谢产琥珀酸的摩尔量计算的。
Figure BDA0000115712200000601
*Pck，PEP羧激酶；Ppc，PEP羧化酶；SfcA，NADH-苹果酸酶；MaeB，NADPH-苹果酸酶；ND，未检测。
Figure BDA0000115712200000602
数据来源于Vanderwerf等，Arch Microbiol 167：332-342。
Figure BDA0000115712200000603
生长不好。
Figure BDA0000115712200000611
Figure BDA0000115712200000612
KJ017和KJ071中的pck突变(G到A)分别得到XZ618和XZ620中的pck*。
KJ060和KJ073中的pck*突变在XZ622和XZ624中被恢复到野生型(A到G，-pck+)。
§所述的缩写
Figure BDA0000115712200000614
表示一个移码突变，在C端区域的单碱基缺失。
Figure BDA0000115712200000621
*培养物在装有LB培养基的摇瓶中有氧生长。
Figure BDA0000115712200000622
活力是两次重复的平均值，以U(mg蛋白)-1表示。
Figure BDA0000115712200000623
比率是不含葡萄糖和含5％葡萄糖活性的比值。
Figure BDA0000115712200000631
Figure BDA0000115712200000641
Figure BDA0000115712200000651
*测序引物用于扩增所有基因的上游，编码和终止片段。
Figure BDA0000115712200000661
Figure BDA0000115712200000671
Figure BDA0000115712200000681
Figure BDA0000115712200000691
Figure BDA0000115712200000711
1 缩略词，pck*，表示pck的突变形式(相对于ATG起点的-64处，G变为A)。
2 pck基因(核糖体结合位点，编码和终止区域)在高拷贝质粒中过量表达。
3 PCK活性表示为nmol·min-1(mg蛋白)-1。
4 琥珀酸产率是以每摩尔葡萄糖代谢产琥珀酸的摩尔量计算。
5 发酵是在含5％葡萄糖和100mM碳酸氢钾的NBS无机盐培养基中进行(37℃，pH 7.0，150rpm)。缩略词：Suc，琥珀酸；Ace，乙酸；Mal，苹果酸；Pyr，丙酮酸；Lac，乳酸；For，甲酸；EtOH，乙醇。
Figure BDA0000115712200000721
1 缩略词，pck*，表示pck的突变形式(相对于ATG起点的-64处，G变为A)。
1 pck基因(核糖体结合位点，编码和终止区域)在高拷贝质粒中过量表达。
3 琥珀酸产率是以每摩尔葡萄糖代谢产琥珀酸的摩尔量计算。
4 发酵是在含5％葡萄糖和100mM碳酸氢钾的NBS无机盐培养基中进行(37℃，pH 7.0，150rpm)。缩略词：Suc，琥珀酸；Ace，乙酸；Mal，苹果酸；Pyr，丙酮酸；Lac，乳酸；For，甲酸；EtOH，乙醇。
Figure BDA0000115712200000731
Figure BDA0000115712200000741
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A.，Curtiss III，R.，Kaper，J.B.，Neidhardt，F.C.，T.，Rudd，K.E.，Squires，C.L.，editors，EcoSal-Escherichia coli and Salmonella：cellular and molecular biology.Available at ecosal.org.ASM Press，Washington，D.C.
(0123)van der Werf，M.J.，M.V.Guettler，M.K.Jain，and J.G.Zeikus(1997)“Environmental andphysiological factors affecting the succinate product ratio during carbohydrate fermentation by Actinobacillus sp.130Z”Arch Microbiol 167：332-342.
(0124)Vemuri，G.N.，Eiteman，M.A.，Altman，E.(2002a)“Effects of growth mode and pyruvate carboxylaseon succinic acid production by metabolically engineered strains of Escherichia coli.”Appl Environ Microbiol68：1715-1727.
(0125)Vemuri，G.N.，Eiteman，M.A.，Altman，E.(2002b)“Succinate production in dual-phase Escherichia colifermentations depends on the time of transition from aerobic to anaerobic conditions”J Ind Microbiol Biotechnol28：325-332.
(0126)Wang，Q.，Chen，X.，Yang，Y.，Zhao，X.(2006)“Genome-scale in silico aided metabolic analysis andflux comparisons of Escherichia coli to improve succinate production”Appl Microbiol Biotechnol 73：887-894.
(0127)Wang，Q.，Wu，C.，Chen，T.，Chen，X.，Zhao，X.(2006)“Expression of galactose permease and pyruvatecarboxylase in Escherichia coli ptsG mutant increases the growth rate and succinate yield under anaerobicconditions”Biotechnol Lett 28：89-93.
(0128)Wendisch，V.F.，Bott，M.，Eikmanns，B.J.(2006)“Metabolic engineering of Escherichia coli andCorynebacterium glutamicum for biotechnological production of organic acids and amino acids”Curr OpinMicrobiol 9：1-7.
(0129)Werpy，T.，and Petersen，G.(2004)“Top value added chemicals from biomass，”retrieved from the webas www1.eere.energy.gov/biomass/pdfs/35523.pdf，Washington，DC.US Department of Energy.
(0130)Wood，B.E.，Yomano，L.P.，York，S.W.，Ingram，L.O.(2005)“Development of industrial mediumrequired elimination of the 2，3-butanediol fermentation pathway to maintain ethanol yield in an ethanologenicstrain of Klebsiella oxytoca”Biotechnol Prog 21：1366-1372.
(0131)Wright，J.A.and Sanwal，B.D.(1969)“Regulatory mechanisms involving nicotinamide adeninenucleotide as allosteric effectors：Control ofphosphoenolpyruvate carboxykinase”J Biol Chem 244(7)：1838-1845.
(0132)Wu，H.，Li，Z.，Zhou，L.，Ye，Q.(2007)“Improved succinic acid production in the anaerobic cultture ofan Escherichia coli pflB ldhA double mutant as a result of enhanced anaplerotic activities in the preceding aerobicculture”Appl Environ Microbiol 73：7837-7843.
(0133)Yi，J.，Draths，K.M.，Li，K.，Frost，J.W.(2003)“Altered glucose transport and shikimate pathwayproduct yields in E.coli”Biotechnol Prog 19：1450-1459.
(0134)Yun，N.R.，San，K.Y.，Bennett，G.N.(2005)“Enhancement of lactate and succinate formation in adhEor pta-ackA mutants of NADH dehydrogenase-deficient Escherichia coli”J Appl Microbiol99：1404-1412.
(0135)Zeikus，J.G.，Jain，M.K.，Elankovan，P.(1999)“Biotechnology of succinic acid production and marketsfor derived industrial products”Appl Microbiol Biotechnol 51：545-552.
(0136)Zhang，X.，Jantama，K.，Moore，J.C.，Shanmugam，K.T.，Ingram，L.O.(2007)“Production of L-alanineby metabolically engineered Escherichia coli”Appl Microbiol Biotechnol 77：355-366.
(0137)Zhou，S.，Shanmugam，K.T.，Ingram，L.O.(2003)“Functional replacement of the Escherichia coliD-(-)-lactate dehydrogenase gene(ldhA)with the L-(+)-lactate dehydrogenase gene(ldhL)from Pediococcusacidilactici”Appl Environ Microbiol 69：2237-2244.
(0138)Zhou，S.，Grabar，T.B.，Shanmugam，K.T.，Ingram，L.O.(2006)“甜菜碱tripled the volumetricproductivity of D-(-)-lactate by Escherichia coli strain SZ132 in mineral salts medium”Biotechnol Lett28：671-676.
                         序列表
 
<110> 佛罗里达大学研究基金会公司
      张学礼
      K·简特摩
      J·C·摩尔
      L·R·贾柏
      K·T·尚穆根
      L·O·英格拉姆
 <120> 针对生产琥珀酸路径的工程方法
 
<130>  UF.817XC1
 
<150>  US 61/166,903
<151>  2009-04-02
 
<160>  194  
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  18
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  translational stop sequence
 
<400>  1
gcctaattaa ttaatccc                                                   18
 
 
<210>  2
<211>  65
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for ldhA
 
<400>  2
atgaactcgc cgttttatag cacaaaacag tacgacaaga agtacgtgta ggctggagct     60
 
gcttc                                                                 65
 
 
<210>  3
<211>  65
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for ldhA
 
<400>  3
ttaaaccagt tcgttcgggc aggtttcgcc tttttccaga ttgctcatat gaatatcctc     60
 
cttag                                                                 65
 
 
<210>  4
<211>  65
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for adhE
 
<400>  4
atggctgtta ctaatgtcgc tgaacttaac gcactcgtag agcgtgtgta ggctggagct     60
 
gcttc                                                                 65
 
 
<210>  5
<211>  65
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for adhE
 
<400>  5
ttaagcggat tttttcgctt ttttctcagc tttagccgga gcagccatat gaatatcctc     60
 
cttag                                                                 65
 
 
<210>  6
<211>  65
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for ackA
 
<400>  6
atgtcgagta agttagtact ggttctgaac tgcggtagtt cttcagtgta ggctggagct     60
 
gcttc                                                                 65
 
 
<210>  7
<211>  65
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for ackA
 
<400>  7
tcaggcagtc aggcggctcg cgtcttgcgc gataaccagt tcttccatat gaatatcctc     60
 
cttag                                                                 65
 
 
<210>  8
<211>  65
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for focA-plfB
 
<400>  8
ttactccgta tttgcataaa aaccatgcga gttacgggcc tataagtgta ggctggagct     60
 
gcttc                                                                 65
 
 
<210>  9
<211>  65
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for focA-plfB
 
<400>  9
atagattgag tgaaggtacg agtaataacg tcctgctgct gttctcatat gaatatcctc     60
 
cttag                                                                 65
 
 
<210>  10
<211>  30
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for JMcatsacB
 
<400>  10
ttagctagca tgtgacggaa gatcacttcg                                      30
 
 
<210>  11
<211>  31
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer JMcatsacB
 
<400>  11
ccgctagcat caaagggaaa actgtccata t                                    31
 
 
<210>  12
<211>  32
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for cat-up2/sacB-down2
 
<400>  12
agagaggata tctgtgacgg aagatcactt cg                                   32
 
 
<210>  13
<211>  32
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for cat-up2/sacB-down2
 
<400>  13
agagaggata tcgaattgat ccggtggatg ac                                   32
 
 
<210>  14
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for mgsA-up/down
 
<400>  14
cagctcatca accaggtcaa                                                 20
 
 
<210>  15
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for mgsA-up/down
 
<400>  15
aaaagccgtc acgttattgg                                                 20
 
 
<210>  16
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for mgsA-1/2
 
<400>  16
agcgttatct cgcggaccgt                                                 20
 
 
<210>  17
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for mgsA-1/2
 
<400>  17
aagtgcgagt cgtcagttcc                                                 20
 
 
<210>  18
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for poxB-up/down
 
<400>  18
aagcaataac gttccggttg                                                 20
 
 
<210>  19
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for poxB-up/down
 
<400>  19
ccactttatc cagcggtagc                                                 20
 
 
<210>  20
<211>  19
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for poxB-1/2
 
<400>  20
gacgcggtga tgaagtgat                                                  19
 
 
<210>  21
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for poxB-1/2
 
<400>  21
tttggcgata taagctgcaa                                                 20
 
 
<210>  22
<211>  29
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for pck-F/R
 
<400>  22
ttggctaagg agcagtgaaa tgcgcgtta                                       29
 
 
<210>  23
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for pck-F/R
 
<400>  23
cacgacaaaa gaagggtaaa taaac                                           25
 
 
<210>  24
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for pck-2/3
 
<400>  24
ttgttaacgc gcatttcact                                                 20
 
 
<210>  25
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for pck-2/3
 
<400>  25
gcgatagcgg ctactgtcat                                                 20
 
 
<210>  26
<211>  18
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for pck (RT-PCR)
 
<400>  26
gacgatacca ctcgcgat                                                   18
 
 
<210>  27
<211>  19
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for pck (RT-PCR)
 
<400>  27
gtcgacaacg aacagacgt                                                  19
 
 
<210>  28
<211>  17
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for birA (RT-PCR)
 
<400>  28
atcgtgatgg cggaagt                                                    17
 
 
<210>  29
<211>  19
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for birA (RT-PCR)
 
<400>  29
cttgcgatcc tgcagatag                                                  19
 
 
<210>  30
<211>  32
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for JM4161 sense/comp
 
<400>  30
accgcatcag gcgcctaatt aattaatccc gg                                   32
 
 
<210>  31
<211>  32
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for JM4161 sense/comp
 
<400>  31
ccgggattaa ttaattaggc gcctgatgcg gt                                   32
 
 
<210>  32
<211>  30
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for JMpEL04F1/R1
 
<400>  32
cagcagatct aagtaaatcg cgcgggtttg                                      30
 
 
<210>  33
<211>  30
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for JMpEL04F1/R1
 
<400>  33
cagcagatct agcggctatt taacgaccct                                      30
 
 
<210>  34
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for JMackA-F1/R1
 
<400>  34
gcctgaaggc ctaagtagta                                                 20
 
 
<210>  35
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for JMackA-F1/R1
 
<400>  35
gcacgatagt cgtagtctga                                                 20
 
 
<210>  36
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Primer set for JMackA up1/down1
 
<400>  36
gttgagcgct tcgctgtgag                                                 20
 
 
<210>  37
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for JMackA up1/down1
 
<400>  37
gccgcaatgg ttcgtgaact                                                 20
 
 
<210>  38
<211>  31
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for JMcatsacB up3/down3
 
<400>  38
ctcacctcga gtgtgacgga agatcacttc g                                    31
 
 
<210>  39
<211>  34
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for JmcatsacB up3/down3
 
<400>  39
gtgcaggatc catcaaaggg aaaactgtcc atat                                 34
 
 
<210>  40
<211>  59
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for SfPBXPS sense/comp
 
<400>  40
atgtaggcgc cattaattaa tggatccact atctcgagat taattaatcc cgggactat      59
 
 
<210>  41
<211>  59
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for SfPBXPS sense/comp
 
<400>  41
atagtcccgg gattaattaa tctcgagata gtggatccat taattaatgg cgcctacat      59
 
 
<210>  42
<211>  65
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for WMadhE A/C
 
<400>  42
atggctgtta ctaatgtcgc tgaacttaac gcactcgtag agcgtcggca cgtaagaggt     60
 
tccaa                                                                 65
 
 
<210>  43
<211>  65
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for WMadhE A/C
 
<400>  43
ttaagcggat tttttcgctt ttttctcagc tttagccgga gcagcacact gcttccggta     60
 
gtcaa                                                                 65
 
 
<210>  44
<211>  64
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for WMldhA A/C
 
<400>  44
atgaaactcg ccgtttatag cacaaaacag tacgacaaga agtacggcac gtaagaggtt     60
 
ccaa                                                                  64
 
 
<210>  45
<211>  65
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for WMldhA A/C
 
<400>  45
ttaaaccagt tcgttcgggc aggtttcgcc tttttccaga ttgctacact gcttccggta     60
 
gtcaa                                                                 65
 
 
<210>  46
<211>  65
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for WMpflB A/C
 
<400>  46
ttactccgta tttgcataaa aaccatgcga gttacgggcc tataacggca cgtaagaggt     60
 
tccaa                                                                 65
 
 
<210>  47
<211>  69
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for WMpflB A/C
 
<400>  47
ttacatagat tgagtgaagg tacgagtaat aacgtcctgc tgctgttcta cactgcttcc     60
 
ggtagtcaa                                                             69
 
 
<210>  48
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for tdcDE-up/down
 
<400>  48
cgccgacaga gtaataggtt                                                 20
 
 
<210>  49
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for tdcDE-up/down
 
<400>  49
tgatgagcta cctggtatgg                                                 20
 
 
<210>  50
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for tdcDE-F7/R7
 
<400>  50
cgatgcggtg gccaattaag                                                 20
 
 
<210>  51
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for tdcDE-F7/R7
 
<400>  51
gacgacgtgc tggattacga                                                 20
 
 
<210>  52
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for citF-up2/down2
 
<400>  52
gggtattcag gcgttcgata                                                 20
 
 
<210>  53
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for citF-up2/down2
 
<400>  53
gcccgagagg atgactatgt                                                 20
 
 
<210>  54
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for citF-2/3
 
<400>  54
ggtgatcgat gttgtgcatc                                                 20
 
 
<210>  55
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for citF-2/3
 
<400>  55
cccgttcttg tcgttgagat                                                 20
 
 
<210>  56
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for IO-adhE-up/down
 
<400>  56
gctgctccgg ctaaagctga                                                 20
 
 
<210>  57
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for IO-adhE-up/down
 
<400>  57
acgctctacg agtgcgttaa                                                 20
 
 
<210>  58
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for up-focA/Mid-pflB
 
<400>  58
agatcgccag ccgctgcaat                                                 20
 
 
<210>  59
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for up-focA/Mid-pflB
 
<400>  59
aaccgttggt gtccagacag                                                 20
 
 
<210>  60
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for IO-ycaO-up/IO-midpflB-down
 
<400>  60
gcctacattg cgtaggctat                                                 20
 
 
<210>  61
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for IO-ycaO-up/IO-midpflB-down
 
<400>  61
gcagcaggac gttattactc                                                 20
 
 
<210>  62
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for ldhA-A/C
 
<400>  62
atgaaactcg ccgtttatag                                                 20
 
 
<210>  63
<211>  19
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for ldhA-A/C
 
<400>  63
ttaaaccagt tcgttgccc                                                  19
 
 
<210>  64
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for IO/ldhA-up/down
 
<400>  64
cgttcgatcc gtatccaagt                                                 20
 
 
<210>  65
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for IO-ldhA-up/down
 
<400>  65
aggctggaac tcggactact                                                 20
 
 
<210>  66
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for aspC-up/down
 
<400>  66
tccatcgctt acaccaaatc                                                 20
 
 
<210>  67
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for aspC-up/down
 
<400>  67
tgggggatga cgtgatattt                                                 20
 
 
<210>  68
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for aspC-1/2
 
<400>  68
agataacatg gctccgctgt                                                 20
 
 
<210>  69
<211>  19
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for aspC-1/2
 
<400>  69
aggagcggcg gtaatgttc                                                  19
 
 
<210>  70
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for sfcA-up/down
 
<400>  70
ctatgcttga tcggcaacct                                                 20
 
 
<210>  71
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for sfcA-up/down
 
<400>  71
acgatcgcct ggttttaatg                                                 20
 
 
<210>  72
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for sfcA-1/2
 
<400>  72
taccgccgta cctccatcta                                                 20
 
 
<210>  73
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for sfcA-1/2
 
<400>  73
cgtaagggat ataaagcgaa cg                                              22
 
 
<210>  74
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for ackA-up/pta-down
 
<400>  74
cgggacaacg ttcaaaacat                                                 20
 
 
<210>  75
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for ackA-up/pta-down
 
<400>  75
attgcccatc ttcttgttgg                                                 20
 
 
<210>  76
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for ackA-2/pta-2
 
<400>  76
aactaccgca gttcagaacc a                                               21
 
 
<210>  77
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  Primer set for ackA-2/pta-2
 
<400>  77
tctgaacacc ggtaacacca                                                 20
 
 
<210>  78
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
 
<220>
<223>  pck-Pro-up
 
<400>  78
cacggtagca acaacattgc                                                 20
 
 
<210>  79
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  pck-Pro-down
 
<400>  79
agaaagcgtc gacaacgaac                                                 20
 
 
<210>  80
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  pck-Pro-1
 
<400>  80
atgcgcgtta acaatggttt                                                 20
 
 
<210>  81
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  pck-Pro-2
 
<400>  81
atggataacg ttgaactttc                                                 20
 
 
<210>  82
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  ptsI-D-up
 
<400>  82
cgcattatgt tcccgatgat                                                 20
 
 
<210>  83
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  ptsI-D-down
 
<400>  83
gcctttcagt tcaacggtgt                                                 20
 
 
<210>  84
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  ptsI-D-1
 
<400>  84
cggcccaatt tactgcttag                                                 20
 
 
<210>  85
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  ptsI-D-2
 
<400>  85
atccccagca acagaagtgt                                                 20
 
 
<210>  86
<211>  29
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  pck-F
 
<400>  86
ttggctaagg agcagtgaaa tgcgcgtta                                       29
 
 
<210>  87
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  pck-R
 
<400>  87
cacgacaaaa gaagggtaaa taaac                                           25
 
 
<210>  88
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  pck-2
 
<400>  88
ttgttaacgc gcatttcact                                                 20
 
 
<210>  89
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  pck-3
 
<400>  89
gcgatagcgg ctactgtcat                                                 20
 
 
<210>  90
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  sfcA-up
 
<400>  90
ctatgcttga tcggcaacct                                                 20
 
 
<210>  91
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  sfcA-down
 
<400>  91
acgatcgcct ggttttaatg                                                 20
 
 
<210>  92
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  sfcA-1
 
<400>  92
taccgccgta cctccatcta                                                 20
 
 
<210>  93
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  sfcA-2
 
<400>  93
cgtaagggat ataaagcgaa cg                                              22
 
 
<210>  94
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  ppc-up
 
<400>  94
tcaaacgatg cccaactgta                                                 20
 
 
<210>  95
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  ppc-down
 
<400>  95
tttaatccgc ttcggaaaga                                                 20
 
 
<210>  96
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  ppc-1
 
<400>  96
gtcactattg ccgggattgc                                                 20
 
 
<210>  97
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  ppc-2
 
<400>  97
caatgcggaa tattgttcgt                                                 20
 
 
<210>  98
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  pck-up
 
<400>  98
tccgggcagt agtattttgc                                                 20
 
 
<210>  99
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  pck-down
 
<400>  99
atggctggat caaagtcagc                                                 20
 
 
<210>  100
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  pck-1
 
<400>  100
cctggcgaaa ctgtttatcg                                                 20
 
 
<210>  101
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  pck-2
 
<400>  101
ttgttaacgc gcatttcact                                                 20
 
 
<210>  102
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  maeB-up
 
<400>  102
gcatcctggg gatgataatg                                                 20
 
 
<210>  103
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  maeB-down
 
<400>  103
tttcttcgcc agttcctcac                                                 20
 
 
<210>  104
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  maeB-1
 
<400>  104
aacccaaccg ctgtaatttt t                                               21
 
 
<210>  105
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  maeB-2
 
<400>  105
ctggaactgg aaattcatgg                                                 20
 
 
<210>  106
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  pck-Pro-up
 
<400>  106
cacggtagca acaacattgc                                                 20
 
 
<210>  107
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  pck-Pro-down
 
<400>  107
agaaagcgtc gacaacgaac                                                 20
 
 
<210>  108
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  pck-Pro-1
 
<400>  108
atgcgcgtta acaatggttt                                                 20
 
 
<210>  109
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  pck-Pro-2
 
<400>  109
atggataacg ttgaactttc                                                 20
 
 
<210>  110
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  ptsI-D-up
 
<400>  110
cgcattatgt tcccgatgat                                                 20
 
 
<210>  111
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  ptsI-D-down
 
<400>  111
gcctttcagt tcaacggtgt                                                 20
 
 
<210>  112
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  ptsI-D-1
 
<400>  112
cggcccaatt tactgcttag                                                 20
 
 
<210>  113
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  ptsI-D-2
 
<400>  113
atccccagca acagaagtgt                                                 20
 
 
<210>  114
<211>  29
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  pck-F
 
<400>  114
ttggctaagg agcagtgaaa tgcgcgtta                                       29
 
 
<210>  115
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  pck-R
 
<400>  115
cacgacaaaa gaagggtaaa taaac                                           25
 
 
<210>  116
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  pck-2
 
<400>  116
ttgttaacgc gcatttcact                                                 20
 
 
<210>  117
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  pck-3
 
<400>  117
gcgatagcgg ctactgtcat                                                 20
 
 
<210>  118
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  cra-up
 
<400>  118
gcggtaagct tgatgcattt                                                 20
 
 
<210>  119
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  cra-down
 
<400>  119
cttccccggt taacagtcct                                                 20
 
 
<210>  120
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  ptsHI-up1
 
<400>  120
tcatcgggtg agcgttattt                                                 20
 
 
<210>  121
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  ptsHI-down1
 
<400>  121
tgaccgtcca gcgtaatagc                                                 20
 
 
<210>  122
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  ptsHI-up2
 
<400>  122
catcctgggc ctgaagatta                                                 20
 
 
<210>  123
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  ptsHI-down2
 
<400>  123
agcaatacca tcaccaacga                                                 20
 
 
<210>  124
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  crr-up
 
<400>  124
cccgcgcatt aagaagatta                                                 20
 
 
<210>  125
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  crr-down
 
<400>  125
ctcatcagtg gcttgctgaa                                                 20
 
 
<210>  126
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  ptsG-up
 
<400>  126
gaagaactgg cgcaggtaac                                                 20
 
 
<210>  127
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  ptsG-down
 
<400>  127
aaggaaacgc cgttaatcct                                                 20
 
 
<210>  128
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  cyaA-up
 
<400>  128
tcgccatcaa cttgtctttg                                                 20
 
 
<210>  129
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  cyaA-down
 
<400>  129
aaaggcgatg agtggatttg                                                 20
 
 
<210>  130
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  crp-S-up
 
<400>  130
tgagttgccg tccattaaaa                                                 20
 
 
<210>  131
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  crp-S-down
 
<400>  131
aatcgtaatt cgccaagcat                                                 20
 
 
<210>  132
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  cpdA-S-up
 
<400>  132
gaagtgtgtt caagccagca                                                 20
 
 
<210>  133
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  cpdA-S-down
 
<400>  133
aggacaatgg attccagcag                                                 20
 
 
<210>  134
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  ygiF-S-up
 
<400>  134
atcagtgtcg ctacgcaaag                                                 20
 
 
<210>  135
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  ygiF-S-down
 
<400>  135
gctgtcctgc acaaaatcac                                                 20
 
 
<210>  136
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  sxy-S-up
 
<400>  136
tttacttgct gcggatgaga                                                 20
 
 
<210>  137
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  sxy-S-down
 
<400>  137
tatctcagcc ctcggtgctc                                                 20
 
 
<210>  138
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  csrA-up
 
<400>  138
cagcgttagc cagtgtgaaa                                                 20
 
 
<210>  139
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  csrA-down
 
<400>  139
acgcctctta cgagtgcttc                                                 20
 
 
<210>  140
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  csrB-S-up
 
<400>  140
ctgtaggaga tcgccaggaa                                                 20
 
 
<210>  141
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  csrB-S-down
 
<400>  141
tctaacaaat cgtgcattcg                                                 20
 
 
<210>  142
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  csrC-S-up
 
<400>  142
gccatacgct ttgtgagaca                                                 20
 
 
<210>  143
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  csrC-S-down
 
<400>  143
agtcacgccc aatggaatag                                                 20
 
 
<210>  144
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  csrD-S-up1
 
<400>  144
atgtgcatga tggattggaa                                                 20
 
 
<210>  145
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  csrD-S-down1
 
<400>  145
cggtatcctg accactacgc                                                 20
 
 
<210>  146
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  csrD-S-up2
 
<400>  146
gtgattttgc tgcgctgtta                                                 20
 
 
<210>  147
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  csrD-S-down2
 
<400>  147
acaaggcgca aaaatcatct                                                 20
 
 
<210>  148
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  uvrY-s-up1
 
<400>  148
cctcgtcatg ttgcaatgaa                                                 20
 
 
<210>  149
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  uvrY-s-down1
 
<400>  149
tatcatcgcg tagcaaaacg                                                 20
 
 
<210>  150
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  barA-s-up1
 
<400>  150
ttttgcttcg ctgctgtaaa                                                 20
 
 
<210>  151
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  barA-s-down1
 
<400>  151
tcaggcacgt cgcttttaat                                                 20
 
 
<210>  152
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  barA-s-up2
 
<400>  152
cgcgatcacc tgaatacgat                                                 20
 
 
<210>  153
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  barA-s-down2
 
<400>  153
ctggctggac gttcgataac                                                 20
 
 
<210>  154
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  barA-s-up3
 
<400>  154
tggcctatgt cgaaccaaac                                                 20
 
 
<210>  155
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  mlc-s-up1
 
<400>  155
ctggcaaata acccgaatgt                                                 20
 
 
<210>  156
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  mlc-s-down1
 
<400>  156
ccagggcatc tttattacgc                                                 20
 
 
<210>  157
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  mlc-s-up2
 
<400>  157
tgaaactgaa gcctggcact                                                 20
 
 
<210>  158
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  XZ-ldhA-up
 
<400>  158
gataacggag atcgggaatg                                                 20
 
 
<210>  159
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  XZ-ldhA-down
 
<400>  159
ctttggctgt cagttcacca                                                 20
 
 
<210>  160
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  XZ-ldhA-1
 
<400>  160
tctggaaaaa ggcgaaacct                                                 20
 
 
<210>  161
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  XZ-ldhA-2
 
<400>  161
tttgtgctat aaacggcgag t                                               21
 
 
<210>  162
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  PflB-up2
 
<400>  162
tgtccgagct taatgaaaag tt                                              22
 
 
<210>  163
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  PflB-down2
 
<400>  163
cgagtaataa cgtcctgctg ct                                              22
 
 
<210>  164
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  PflB-5
 
<400>  164
aaacgggtaa caccccagac                                                 20
 
 
<210>  165
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  PflB-6
 
<400>  165
cggagtgtaa acgtcgaaca                                                 20
 
 
<210>  166
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  adhE-up
 
<400>  166
catgctaatg tagccaccaa a                                               21
 
 
<210>  167
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  adhE-down
 
<400>  167
ttgcaccacc atccagataa                                                 20
 
 
<210>  168
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  adhE-1
 
<400>  168
tccggctaaa gctgagaaaa                                                 20
 
 
<210>  169
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  adhE-2
 
<400>  169
gtgcgttaag ttcagcgaca                                                 20
 
 
<210>  170
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  pck-Pro-up
 
<400>  170
cacggtagca acaacattgc                                                 20
 
 
<210>  171
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  pck-Pro-down
 
<400>  171
agaaagcgtc gacaacgaac                                                 20
 
 
<210>  172
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  pck-Pro-1
 
<400>  172
atgcgcgtta acaatggttt                                                 20
 
 
<210>  173
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  pck-Pro-2
 
<400>  173
atggataacg ttgaactttc                                                 20
 
 
<210>  174
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  pck-P-2
 
<400>  174
ttcactgctc cttagccaat                                                 20
 
 
<210>  175
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  ptsI-D-up
 
<400>  175
cgcattatgt tcccgatgat                                                 20
 
 
<210>  176
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  ptsI-D-down
 
<400>  176
gcctttcagt tcaacggtgt                                                 20
 
 
<210>  177
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  ptsI-D-1
 
<400>  177
cggcccaatt tactgcttag                                                 20
 
 
<210>  178
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  ptsI-D-2
 
<400>  178
atccccagca acagaagtgt                                                 20
 
 
<210>  179
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  ptsG-up
 
<400>  179
gaagaactgg cgcaggtaac                                                 20
 
 
<210>  180
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  ptsG-down
 
<400>  180
aaggaaacgc cgttaatcct                                                 20
 
 
<210>  181
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  ptsG-1
 
<400>  181
cctgaaaacc gagatggatg                                                 20
 
 
<210>  182
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  ptsG-2
 
<400>  182
catcagcgat ttaccgacct                                                 20
 
 
<210>  183
<211>  65
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  ptsH-D-up
 
<400>  183
atgttccagc aagaagttac cattaccgct ccgaacggtc tgcacgtgta ggctggagct     60
 
gcttc                                                                 65
 
 
<210>  184
<211>  65
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  ptsH-D-down
 
<400>  184
ttactcgagt tccgccatca gtttaaccag atgttcaacc gctttcatat gaatatcctc     60
 
cttag                                                                 65
 
 
<210>  185
<211>  65
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  ptsI-D-up
 
<400>  185
atgatttcag gcattttagc atccccgggt atcgctttcg gtaaagtgta ggctggagct     60
 
gcttc                                                                 65
 
 
<210>  186
<211>  65
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  ptsI-D-down
 
<400>  186
ttagcagatt gttttttctt caatgaactt gttaaccagc gtcatcatat gaatatcctc     60
 
cttag                                                                 65
 
 
<210>  187
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  gldA-up
 
<400>  187
tgtatatagc gccgcacaag                                                 20
 
 
<210>  188
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  gldA-down
 
<400>  188
gatggcaagg ttggtattgg                                                 20
 
 
<210>  189
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  gldA-1
 
<400>  189
accagtacgg tcagcgtttc                                                 20
 
 
<210>  190
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  gldA-2
 
<400>  190
acccggtgat tgaataatgc                                                 20
 
 
<210>  191
<211>  64
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  dhaKL-D-up
 
<400>  191
atgaaaaaat tgatcaatga tgtgcaagac gtactggacg aacaatgtag gctggagctg     60
 
cttc                                                                  64
 
 
<210>  192
<211>  65
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  dhaKL-D-down
 
<400>  192
ttactctttt gcggctaacg ccaacatttg catcataaac atcaccatat gaatatcctc     60
 
cttag                                                                 65
 
 
<210>  193
<211>  64
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  dhaM-D-up
 
<400>  193
gtgatggtaa acctggtcat agtttcacat agcagccgac tgggatgtag gctggagctg     60
 
cttc                                                                  64
 
 
<210>  194
<211>  64
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  dhaM-D-down
 
<400>  194
ttaaccctga cggttgaaac gttgcgtttt aacgtccagc gttagatatg aatatcctcc     60
 
ttag                                                                  64
 
 

Claims (44)

1.一种细菌细胞，所述细胞包含水平增高的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(pck)基因转录物，所述转录物编码活性磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)，其中所述细胞表现出PCK活性增强。
2.根据权利要求1所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞为非反刍动物细菌细胞。
3.根据权利要求1所述的细菌菌株，其中所述的细菌为：
大肠杆菌(Escherichia coli)，氧化葡萄糖杆菌(Gluconobacter oxydans)，浅井氏葡糖杆菌(Gluconobacter asaii)，带马瓦无色杆菌(Achromobacter delmarvae)，粘液无色杆菌(Achromobacter viscosus)，乳无色杆菌(Achromobacter lacticum)，根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)，粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)，柠檬节杆菌(Arthrobacter citreus)，肿胀节杆菌(Arthrobactertumescens)，石蜡节杆菌(Arthrobacter paraffineus)，裂烃谷氨酸节杆菌(Arthrobacterhydrocarboglutamicus)，氧化节杆菌(Arthrobacter oxydans)，天牛短小杆菌(Aureobacteriumsaperdae)，印度固氮菌(Azotobacter indicus)，产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)，叉分短杆菌(divaricatum)，乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)，黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)，球形短杆菌(Brevibacterium globosum)，暗褐短杆菌(Brevibacterium fuscum)，酮戊二酸短杆菌(Brevibacterium ketoglutamicum)，创伤短杆菌(Brevibacterium helcolum)，极小短杆菌(Brevibacterium pusillum)，砖红色短杆菌(Brevibacterium testaceum)，玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)，(Brevibacteriumimmariophilium)，扩展短杆菌(Brevibacterium linens)，Brevibacterium protopharmiae，嗜乙酰棒杆菌(Corynebacterium acetophilum)，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，帚石南棒杆菌(Corynebacterium callunae)，嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)，醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)，产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)，解淀粉杆菌(Erwinia amylovora)，胡萝卜软腐杆菌(Erwinia carotovora)，草生假单胞菌(Erwinia herbicola)，菊果胶杆菌(Erwinia chrysanthemi)，奇异黄杆菌(Flavobacterium peregrinum)，Flavobacterium fucatum，橙黄色黄杆菌(Flavobacteriumaurantinum)，莱茵黄杆菌(Flavobacterium rhenanum)，塞沃尼黄杆菌(Flavobacteriumsewanense)，短黄杆菌(Flavobacterium breve)，脑膜炎黄杆菌(Flavobacteriummeningosepticum)，微球菌CCM825(Micrococcus sp.CCM825)，摩氏摩根菌(Morganellamorganii)，灰暗诺卡氏菌(Nocardia opaca)，粗糙诺卡氏菌(Nocardia rugosa)，(Planococcuseucinatus)，雷特洛变形杆菌(Proteus rettgeri)，谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)，产黄假单胞菌(Pseudomonas synxantha)，产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，卵状假单胞菌(Pseudomonas ovalis)，施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)，食酸假单胞菌(Pseudomonas acidovolans)，霉味假单胞菌(Pseudomonas mucidolens)，睾丸酮假单胞菌(Pseudomonas testosteroni)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)，紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)，红球菌ATCC 15592(Rhodococcus sp.ATCC 15592)，红球菌ATCC 19070(Rhodococcus sp.ATCC 19070)，脲芽孢八叠球菌(Sporosarcina ureae)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，梅氏弧菌(Vibrio metschnikovii)，干酪弧菌(Vibriotyrogenes)，马杜拉放线菌(Actinomadura madurae)，图列茨链霉菌(Actinomycesviolaceochromogenes)，丘疹性北里孢菌(Kitasatosporia parulosa)，天蓝链霉菌(Streptomycescoelicolor)，淡黄色链霉菌(Streptomyces flavelus)，浅灰链霉菌(Streptomycesgriseolus)，变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)，橄榄色链霉菌(Streptomyces olivaceus)，田无链霉菌(Streptomyces tanashiensis)，弗吉尼亚链霉菌(Streptomyces virginiae)，抗生链霉菌(Streptomyces antibioticus)，可可链霉菌(Streptomyces cacaoi)，淡紫灰链霉菌(Streptomyceslavendulae)，产绿色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)，杀鲑气单孢菌(Aeromonassalmonicida)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliqyefaciens)，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)，溶硫胺芽孢杆菌(Bacillusthiaminoliticus)，弗罗思特杆菌(Escherichiafreundii)，嗜氨微杆杆菌(Microbacteriumammoniaphilum)，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)，乙型副伤寒杆菌(Salmonella schottmulleri)，柑桔黄单孢菌(Xanthomonascitri)。
4.根据权利要求1所述的细菌细胞，其中所述的pck转录物的水平增高是因为用pck基因的改变的调控序列替换天然调控序列，所述pck基因的改变的调控序列增强了pck转录。
5.根据权利要求4所述的细菌细胞，其中所述的调控序列是在所述pck基因的启动子区域。
6.根据权利要求1所述的细菌细胞，其中所述的pck转录物的水平增高是因为pck基因的启动子区域中的一种或多种突变。
7.根据权利要求6所述的细菌细胞，其中所述的一种或多种突变是点突变，所述的点突变包括在pck基因起始密码子的上游68位点处，用核苷酸G替换核苷酸A。
8.根据权利要求1所述的细菌细胞，其中所述的pck转录物水平的增高是因为用一个外源启动子序列替换天然启动子序列。
9.根据权利要求8所述的细菌细胞，其中所述的外源启动子是组成型启动子。
10.根据权利要求8所述的细菌细胞，其中所述的外源启动子是诱导型启动子。
11.根据权利要求8所述的细菌细胞，其中所述的诱导型启动子是lac启动子。
12.根据权利要求1所述的细菌细胞，进一步包含一种或多种基因修饰，所述的基因修饰破坏PEP依赖性磷酸转移酶系统的功能。
13.根据权利要求12所述的细菌细胞，其中所述的基因修饰是在编码PEP依赖性磷酸转移酶系统的结构组分的一种或多种基因中。
14.根据权利要求12所述的细菌细胞，其中所述的基因修饰是在编码蛋白的一种或多种基因中，所述的蛋白调控PEP依赖性磷酸转移酶系统的表达。
15.根据权利要求12所述的细菌细胞，其中所述的基因修饰是在一种或多种基因中，所述基因选自由ptsG，ptsH，ptsI，crr和crp组成的组。
16.根据权利要求1所述的细菌细胞，进一步包含：(a)一种或多种基因修饰，所述的基因修饰破坏PEP依赖性磷酸转移酶系统的功能；(b)一种或多种基因修饰，所述的基因修饰上调一种或多种编码糖转运蛋白的基因的表达。
17.根据权利要求16所述的细菌细胞，其中所述的糖转运蛋白是ATP结合盒转运蛋白的成员之一。
18.根据权利要求16所述的细菌细胞，其中所述的糖转运蛋白是主要易化子超家族的成员之一。
19.根据权利要求1所述的细菌细胞，进一步包含基因修饰，所述的基因修饰导致在一种或多种基因中的基因表达失活，所述的基因参与发酵路径。
20.根据权利要求1所述的细菌细胞，进一步包含基因修饰，所述的基因修饰导致在一种或多种基因中的基因表达失活，所述的基因选自由adhE，ldhA，focA，pflA，ack，pta，pdh，mgsA，tdcD，tdcE和poxB组成的组。
21.根据权利要求1所述的细菌细胞，进一步包含：(a)一种或多种基因修饰，所述的基因修饰破坏PEP依赖性磷酸转移酶系统的功能；(b)参与发酵路径的一种或多种基因的突变。
22.根据权利要求1所述的细菌细胞，进一步包含：(a)在一种或多种基因中的基因修饰，所述的基因选自由ptsG，ptsH，ptsI，crr和crp组成的组；(b)基因修饰，所述的基因修饰导致在一种或多种基因中的基因表达失活，所述的一种或多种基因选自由adhE，ldhA，focA，pflA，ack，pta，pdh，mgsA，tdcD，tdcE和poxB组成的组。
23.根据权利要求1所述的细菌细胞，进一步包含在一种或多种基因中的基因修饰，所述的基因与TCA循环的运行有关。
24.根据权利要求1所述的细菌细胞，进一步包含在一种或多种基因中的基因修饰，所述的基因选自由下列组分组成的组：mdh，fumA，fumB，fumC，frdABCD，acceAB，acnAB，icd，iclR，aspC，和scfA。
25.根据权利要求1所述的细菌细胞，进一步包含：(a)在一种或多种基因中的基因修饰，所述的基因选自由下列组分组成的组：ptsG，ptsH，ptsI，crr和crp；(b)基因修饰，所述的基因修饰导致一种或多种基因中的基因表达失活，所述的基因选自由下列组分组成的组：adhE，ldhA，focA，pflA，ack，pta，pdh，mgsA，tdcD，tdcE和poxB；以及(c)在一种或多种基因中的基因修饰，所述的基因选自由下列组分组成的组：mdh，fumA，fumB，fumC，frdABCD，acceAB，acnAB，icd，iclR，aspC，和scfA。
26.根据权利要求1所述的细菌菌株，进一步包含在一种或多种基因中的基因修饰，所述的基因选自由下列组分组成的组：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，NADH依赖性苹果酸酶和NADPH依赖性苹果酸酶。
27.根据权利要求1所述的细菌菌株，进一步包含一种外源丙酮酸羧化酶。
28.根据权利要求27所述的细菌菌株，其中所述的丙酮酸羧化酶来自乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)，高粱(Sorghum vulgare)或菜豆根瘤杆菌(Rhizopium etli)。
29.一种基因修饰细菌细胞，其中所述的基因修饰细菌细胞为XZ320，XZ332，XZ3431，XZ468，XZ469，XZ470，XZ613，XZ615，XZ616，XZ618，XZ620，XZ647，XZ7121，或XZ723。
30.一种大肠杆菌细菌菌株，所述菌株包含：(a)失活的ldhA；(b)失活的focA；(c)失活的pflB；(d)失活的ackA；(e)失活的mgsA；(f)失活的adhE；(g)失活的tdcD；(h)失活的tdcE；(i)失活的aspC；(j)失活的sfcA；(k)失活的ptsH；(l)失活的citD和(m)上调的pck。
31.根据权利要求29或30所述的细菌细胞，其中所述细菌菌株在含2％-20％(w/v)葡萄糖的基本盐培养基中，每摩尔葡萄糖生产至少0.1mol琥珀酸。
32.一种生产琥珀酸的方法，包括：
(a)培养如权利要求1所述的细菌菌株；
(b)供应碳源；
(c)允许所述的细菌代谢所述的碳源；并且
(d)分离琥珀酸。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述的细菌菌株在厌氧条件，有氧条件，微好氧条件或上述条件组合下培养。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述的细菌菌株在基本盐生长培养基中培养。
35.根据权利要求32所述的方法，其中所述的基本盐生长培养基包含2％-20％(w/v)碳源。
36.根据权利要求32所述的方法，其中所述的碳源为葡萄糖，果糖，木糖，阿拉伯糖，半乳糖，甘露糖，鼠李糖，蔗糖，纤维二糖，半纤维素，甘油或上述的组合。
37.根据权利要求32所述的方法，其中所述的培养为分批过程或分批补料过程。
38.根据权利要求32所述的方法，所述培养为连续过程。
39.一种根据权利要求1所述的细菌细胞，进一步包含在gldA基因中的突变。
40.一种根据权利要求1所述的细菌细胞，进一步包含在dhaKLM操纵子中的突变。
41.一种根据权利要求1所述的细菌细胞，进一步包含：(a)在gldA中的突变；和(b)在dhaKLM操纵子中的突变。
42.一种根据权利要求1所述的细菌细胞，进一步包含：(a)在gldA中的突变；(b)在dhaKLM操纵子中的突变；和(c)在编码磷酸转移酶系统中的蛋白的一种或多种基因中的突变。
43.一种根据权利要求1所述的细菌细胞，进一步包含：(a)在gldA中的突变；(b)在dhaKLM操纵子中的突变；(c)在编码磷酸转移酶系统中的蛋白的一种或多种基因中的突变；和(d)在编码参与发酵路径的的蛋白的一种或多种基因中的突变。
44.根据权利要求1-30或39-43之一的细菌细胞，其中所述pck转录是内源pck转录。
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