CN102686718B - 产生有机酸的大肠杆菌菌株的代谢进化 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物的代谢进化，其中所述微生物之前已被优化为用于在发酵条件下使用己糖作为基本无机培养基中的唯一碳源，以商业显著的量产生有机酸。作为这种代谢进化的结果，所述微生物获得了利用衍生自纤维素物质的戊糖用于其生长的能力，同时保留原初的生长动力学、有机酸产生速率和利用己糖作为碳源的能力。本发明还公开了所述微生物中赋予在产生商业显著量的有机酸中同时利用己糖和戊糖的能力的遗传改变。

Description

产生有机酸的大肠杆菌菌株的代谢进化

相关申请的交互引用

本申请要求2009年11月18日提交的美国临时申请系列号61/281,483的优先权。

政府资助

本发明在美国政府资助下在美国能源部以授予号DE-EE0002878/001所授予的合同下产生。美国政府享有本发明中的某些权利。

背景技术

一份名为“来自生物量的增加高级价值的化学品”的2004年美国能源部报告已经确定了12种可以从可再生原料产生的结构单元化学品。这12种结构单元化学品是1，4-二酸(琥珀酸、延胡索酸和马来酸)、2，5-呋喃二羧酸、3-羟基丙酸、天冬氨酸、葡糖二酸、谷氨酸、衣康酸、乙酰丙酸、3-羟基丁内酯、甘油、山梨醇和木糖醇/阿拉伯糖醇。

结构单元化学品是带多个官能团的分子，它们拥有被转化成有用分子新家族的潜力。这12种结构单元可以随后转换成许多高价值的基于生物的化学品或材料。

许多源自生物发酵过程的天然代谢物(如二羧酸、氨基酸和二醇)具有适于聚合物聚合和化学合成的官能团。近年来，已经通过遗传操作显著地提高了微生物产生适于工业用途的单体化学化合物的效率。然而，通过生物发酵过程产生工业化学品的成本仍是非常高的。目前用于产生工业化学品的生物发酵过程使用纯化的糖如葡萄糖和玉米淀粉作为碳源并且因而增加了用于产生工业化学品的发酵过程的成本。

可以通过使用木素纤维素生物量作为发酵过程中的碳源，大幅度降低用于产生工业化学品的发酵过程的成本。木素纤维素生物量可以从许多来源获得，这包括农业残留物、食品加工废弃物、木材和来自造纸和纸浆工业的废弃物。生物量由大约40-50％己糖(具有6个碳原子的糖)和10-30％戊糖(具有5个碳原子的糖)组成。己糖在本领域中称作C6糖。戊糖在本领域中称作C5糖。当水解时，木素纤维素的材料产生包含葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖的糖混合物。然而，已经以纯葡萄糖作为生长和代谢的碳源时开发了许多用于产生工业化学品的发酵方法。例如，美国专利号7,223,567中所述的大肠杆菌菌株使用补充有葡萄糖作为碳源的丰富培养基。由Jantama等人(2008a；2008b)描述并且在公开的PCT专利申请号WO/2008/021141A2和WO2010/115067A2中公开的用于产生琥珀酸的大肠杆菌菌株KJ122可以在基本培养基上生长，但是仍需要葡萄糖或另一种糖作为碳源。如果可以在源自木素纤维素水解的糖混合物中培育能够以高效率产生工业化学品的这些生物，这将是理想的。本发明人已经发现了使得已经优化以产生特定工业化学品的微生物能够利用源自木素纤维素原料水解的C5糖和C6糖混合物的方法。

微生物同时利用多种糖的能力受某些生物化学调节系统的存在限制。微生物细胞内部的这些生物化学调节系统具有遗传基础。已经进行了通过遗传操作克服这些调节物系统的努力。

在许多情况下，工业微生物在含有葡萄糖或蔗糖作为碳源的培养基中生长。葡萄糖在生长培养基中的存在抑制了其他糖在大肠杆菌(E.coli)和其他工业微生物物种中的利用。仅在生长培养基中的葡萄糖已经充分耗尽后，这些微生物才开始消费其他糖如木糖(一种戊糖)。与工业微生物中碳利用相关的这种现象称作分解代谢物阻遏或双峰生长。在以商业规模生产工业化学品期间，通过减轻分解代谢物阻遏而使微生物共利用(co-utilize)不同糖如C5糖和C6糖的方法对降低由发酵产生的工业化学品的成本将是关键性的。

微生物通过一套位于细胞质膜中的转运蛋白摄取糖。微生物糖转运蛋白分属三个主要类型。细菌中的最大一组糖转运蛋白称作ATP结合盒(ABC)转运蛋白。如名称所暗示的那样，ABC转运蛋白需要1分子ATP分子用于转运每个糖分子至细菌细胞中。XylFGH是用于转运木糖(一种戊糖)至细胞中的ABC转运蛋白。AraFGH是用于转运阿拉伯糖(另一种戊糖)的ABC转运蛋白。

第二类型的细菌糖转运蛋白划归为主要易化因子超家族(MFS)。在MFS糖转运蛋白内部，确认了两种不同类别的转运蛋白。MFS包括H⁺-关联的共运输蛋白、Na⁺-关联的共运输蛋白-反向转运蛋白和单向转运蛋白。单向转运蛋白是用于糖转运的简单易化因子并且不需要一分子ATP用于转运每个糖分子至细胞中。运动发酵单胞菌(Zymononas mobilis)中的跨膜蛋白Glf是易化因子的实例。H⁺-共运输蛋白需要细胞外质子用于转运每个糖分子至细胞中。大肠杆菌中的GalP蛋白是一种用于转运半乳糖(己糖)至细胞中的共运输蛋白。GalP是表征十分充分的共运输蛋白，具有12个跨膜环。还报道GalP具有跨细胞膜转运葡萄糖的能力。AraE是用于跨细胞膜转运阿拉伯糖的质子关联共运输蛋白。类似地，XylE蛋白是用于转运木糖的质子关联共运输蛋白。

主要负责摄入己糖如葡萄糖的第三种糖转运蛋白称作磷酸烯醇丙酮酸：碳水化合物磷酸转移酶系统(PTS)。作为其他两个糖转运系统与PTS区分的手段，将其他两个糖转运系统(ABC转运蛋白和MFS转运蛋白的成员)称作非PTS糖转运蛋白。受PTS催化的磷酸基团从磷酸烯醇丙酮酸(PEP)中转移驱动了葡萄糖和其他糖的转运和磷酸化并且导致磷酸化糖和丙酮酸在细胞内部形成。PTS产生的丙酮酸在葡萄糖是唯一碳源的需氧培养条件下显然不再循环成PEP。实际上，丙酮酸以三羧酸循环形式氧化成二氧化碳。因而，为转运每个单分子葡萄糖，消耗一分子的PEP。就细胞生物能学而言，借助PTS的糖转运是一个能量密集过程。因此，在厌氧生长的细胞中，在细胞内部需要保留磷酸烯醇丙酮酸含量以生产工业有用化学品的情况下，想要的是将PTS替换为不需要一分子PEP以转运每分子糖至细胞中的其他非PTS糖转运蛋白。

PTS由名为E1和HPr的两种胞质组分和膜结合组分EII组成。大肠杆菌含有至少15种不同的EII复合物。每种EII组分对一种待转运的糖类型是特异的并且含有两个疏水性整合膜结构域(C和D)和两个亲水结构域(A和B)。这四个结构域一起负责糖分子的转运和磷酸化。EI蛋白转移来自PEP的磷酸基团至HPr蛋白。EII蛋白转移来自磷酸化HPr蛋白的磷酸基团至糖分子。

EI由ptsI基因编码。HPr由ptsH基因编码。肠细菌的葡萄糖特异性EII复合体由两种不同蛋白质即由基因crr编码的EIIA^Glc和由基因ptsG编码的膜结合蛋白EIICB^Glc组成。可以通过突变编码与PTS相关的蛋白质的这些基因之一，从而抑制PTS介导的糖转运。PTS由备选性磷酸烯醇丙酮酸非依赖性摄入和磷酸化活性(非PTS)的功能性替换已经导致来自葡萄糖的产物产率和几个类型代谢物的生产率显著改善。

随着PTS介导的葡萄糖摄入下降，可以激活用于葡萄糖摄入的其他系统以确保细胞内部用于产生工业有用化学品的葡萄糖持续可获得。例如，已经显示编码葡萄糖通透酶(一种葡萄糖单向转运蛋白)的glf基因顶替了PTS介导的葡萄糖摄入的损失。类似地，galP和glk基因的过量表达据报道增强大肠杆菌pts^-菌株中的葡萄糖摄入和磷酸化。GalP是一种用于摄入半乳糖(一种己糖)的共运输蛋白。已经报道GalP在pts^-菌株中转运葡萄糖。GalP介导葡萄糖摄入的意义由以下事实支持：发现pts^-突变体中galP基因的失活阻止在葡萄糖上的生长(Yi等人，2003)。在不存在PTS的情况下，需要Glk以实现葡萄糖分子在其可以进行糖酵解之间的磷酸化。GalP蛋白在pts^-菌株中的表达可以通过在组成型启动子下表达galP基因或通过在编码galP基因阻抑物的基因如galS和galR中突变减轻对galP基因表达的阻遏来实现。

除了减少在转运糖进入细胞时所发生的能量成本之外，导入突变至编码与PTS相关的蛋白质的基因中预期减轻分解代谢物阻遏，这转而将允许同时转运和利用培养基中存在的全部糖，包括戊糖和己糖。

Hernandez-Montalvo等人(2001)研究了缺少用于转运葡萄糖的PTS的大肠杆菌菌株对包含葡萄糖、阿拉伯糖和木糖的糖混合物的利用。pts^-突变体能够如其野生型亲本菌株那样迅速地通过非PTS机制摄入糖。在补充有葡萄糖-木糖或葡萄糖-阿拉伯糖混合物的基本培养基中培育的培养物中，葡萄糖阻遏野生型菌株中的阿拉伯糖或木糖利用。在相同的培养条件下，pts^-突变体共代谢葡萄糖和阿拉伯糖。然而，葡萄糖仍对木糖消耗产生部分阻遏作用。在采用葡萄糖-阿拉伯糖-木糖三重混合物培育的培养物中，野生型菌株依次利用葡萄糖、阿拉伯糖和最后利用木糖。相反，pts^-菌株共代谢葡萄糖和阿拉伯糖，而木糖在葡萄糖-阿拉伯糖耗竭后利用。作为共代谢葡萄糖-阿拉伯糖的结果，pts^-菌株消耗培养基中所含的糖总量比野生型菌株快16％。

具有共代谢葡萄糖和木糖的能力的pts^-突变体菌株导致培养基中糖的消耗速率进一步提高，这导致生产率提高。因而本领域中需要可以共代谢葡萄糖和木糖的微生物，原因是这两种代表粗制纤维素水解产物中存在的优势糖。另外，已经报道，消除ptsG基因功能可以降低经代谢工程化以产生有机酸的微生物的生长速率(Sanchez等人，2005)。因此存在额外需要以实现同时使用多种糖的能力而不损害生长速率和商业上重要的化学品和化学中间体的生产速率。

本发明的目的是同时使用多种糖对能够产生高水平工业化学品的微生物进行代谢进化，而不降低生产率。本发明人已经令人惊讶地鉴定了通过代谢进化法制备同时消耗多种糖的微生物的方法。这种代谢进化方法允细胞获得利用多种糖的能力，而不影响它的任何原有特征如快速生长和以商业显著的量产生特定工业化学品的能力。

本发明人也已经为所述微生物同时利用葡萄糖和木糖的能力鉴定了新的遗传基础。使用全基因组测序法来鉴定赋予所述微生物在产生有机酸时同时利用多种糖的能力的遗传修饰。

在本发明之前，人们怀疑是否可以通过简单的遗传操作实现同时利用己糖和戊糖的能力。与分子遗传学相关的本发明提供了以下潜力：实现高效代谢全部类型的生物量衍生糖的能力。本发明首次提供用于实现葡萄糖和木糖同时摄入的遗传方法，其中所述的葡萄糖和木糖同时摄入不需要与磷酸烯醇丙酮酸支出偶联。

发明简述

我们已经出乎意料地发现，可以将经遗传修饰和经优化用于在含有葡萄糖作为碳源的基本生长培养基中通过发酵过程产生商业显著量的有机酸的微生物进一步代谢进化以同时利用多种糖作为碳源，同时维持原来的优化的有机酸生产率。

本发明的目的是提供用于赋予通过发酵过程产生有机酸的微生物以下能力的方法，其中所述能力是同时使用多种类型的糖分子作为其生长和有机酸生产的碳源。本发明的另一个目的是提供使用粗制纤维素水解产物，产生高产量有机酸的发酵方法。

本发明的特征是利用代谢进化过程以使经遗传修饰和经优化用于从葡萄糖产生有机酸的微生物能够获得同时利用己糖和戊糖的能力。

在本发明的一个实施方案中，对能够在以葡萄糖作为碳源的培养基中产生有机酸的大肠杆菌细菌代谢进化以使用额外类型的糖作为碳源，同时维持相同的有机酸生产率并且保留利用葡萄糖作为碳源的能力。

在优选的实施方案中，本发明提供了能够在基本生长培养基中产生有机酸、同时利用多于一种类型的糖的大肠杆菌细菌。

在又一个优选的实施方案中，本发明提供了能够在使用植物水解产物(包括木素纤维素水解产物)作为碳源的基本生长培养基中产生有机酸的大肠杆菌细菌。

在本发明的又一个优选的实施方案中，提供了同时利用葡萄糖和木糖产生琥珀酸的大肠杆菌细菌。

在本发明的又一个优选的实施方案中，提供了在使用植物水解产物(包括木素纤维素水解产物)的基本生长培养基中产生琥珀酸的大肠杆菌细菌。

本发明特别地用于通过使用木素纤维素物质的生物发酵过程，以非常有成本效益的方式产生高度纯化的有机酸。

在又一个实施方案中，本发明提供了用于制备微生物的方法，其中除了降低编码与PTS糖转运蛋白相关的蛋白质的基因的活性外，还通过突变编码非PTS转运蛋白的基因，使所述微生物同时利用多种糖。

在一个更优选的实施方案中，提供了具有降低活性的PTS糖转运蛋白和突变形式的半乳糖共运输蛋白的微生物。

本发明的额外优点将从后续描述中变得容易理解。

附图简述

图1.在补充有8％木糖的无机培养基中大肠杆菌KJ122菌株的发酵曲线。发酵实施总计168小时时间。以实心圆圈所示的木糖利用在96小时左右开始，伴随以空心圆圈所示在550nm处光密度增加所度量的细菌细胞密度的增加。以实心方块所示的琥珀酸浓度的增加在96小时左右出现。另外，本图中显示在168小时发酵过程期间在培养基中乙酸、丙酮酸和苹果酸的浓度变化。

图2.在补充有8％木糖的无机培养基中适应于代谢木糖的大肠杆菌KJ122菌株的发酵曲线。发酵实施总计168小时时间。以实心圆圈所示的木糖利用在72小时左右开始，伴随以空心圆圈所示在550nm处光密度增加所度量的细菌细胞密度的增加。以实心方块所示的琥珀酸浓度的增加在72小时左右出现。另外，本图中显示在168小时发酵过程期间在培养基中乙酸、丙酮酸和苹果酸的浓度变化。

图3.在补充有8％木糖的无机培养基中大肠杆菌TG400菌株的发酵曲线。将发酵曲线监测120小时时间。以实心圆圈所示的木糖利用在30小时左右开始，伴随以空心圆圈所示在550nm处光密度增加所度量的细菌细胞密度的增加。以实心方块所示的琥珀酸浓度的增加在30小时左右出现。另外，本图中显示在120小时发酵过程期间在培养基中乙酸、丙酮酸和苹果酸的浓度变化。

图4.由大肠杆菌KJ122和TG400菌株进行的混合糖发酵的曲线。将发酵监测总计144小时时间。发酵培养基含有葡萄糖和木糖。由葡萄糖浓度下降所示的葡萄糖利用由空心正方形显示。由木糖浓度下降所示的木糖利用由实心圆圈显示。发酵培养基中琥珀酸浓度的增加由实心正方形显示。在144小时发酵过程期间如550nm处光密度所度量的细胞密度变化由空心圆圈显示。另外，本图中显示在144小时发酵过程期间乙酸、丙酮酸和苹果酸的浓度变化。

图5.由大肠杆菌TG400菌株进行的补充有2.5％(w/v)玉米浆的脱毒浓缩蔗渣C5水解产物发酵的曲线。发酵实施168小时时间。由木糖浓度下降所度量的木糖利用由实心圆圈显示。发酵培养基中琥珀酸浓度的增加由实心正方形显示。另外，本图中显示在168小时发酵过程期间在培养基中丙酮酸、乙酸、苹果酸和乳酸的浓度变化。

图6.在含有葡萄糖和木糖的培养基中大肠杆菌WG37菌株的发酵曲线。发酵实施120小时时间。由培养基中葡萄糖浓度下降所度量的葡萄糖利用以空心正方形显示。由培养基中木糖浓度下降所度量的木糖利用以实心圆圈显示。在120小时发酵过程期间如550nm处光密度所度量的细菌细胞密度变化由空心圆圈显示。琥珀酸浓度的增加以实心正方形显示。另外，本图中显示在120小时发酵过程期间在培养基中乙酸、丙酮酸和苹果酸的浓度变化。

图7.并列比较在含有4％木糖和7％葡萄糖的生长培养基中细菌TG400、WG37和KJ122菌株进行的琥珀酸生产。发酵实施120小时时间。监测采用大肠杆菌TG400(实心圆圈)、KJ122(实心三角形)和WG37(倒三角形)菌株时发酵培养基中琥珀酸浓度的增加，监测120小时时间。

图8.并列比较在仅含有10％木糖的生长培养基中细菌TG400、WG37和KJ122菌株进行的琥珀酸生产。发酵实施120小时时间。监测采用大肠杆菌TG400(实心圆圈)、KJ122(倒三角形)和WG37(三角形)菌株时发酵培养基中琥珀酸浓度的增加，监测120小时时间。

图9.并列比较在仅含有10％葡萄糖的生长培养基中细菌TG400、WG37和KJ122菌株进行的琥珀酸生产。发酵实施120小时时间。监测采用大肠杆菌TG400(实心圆圈)、KJ122(三角形)和WG37(倒三角形)菌株时发酵培养基中琥珀酸浓度的增加，监测120小时时间。

图10.在含有木糖作为唯一碳源的生长培养基中大肠杆菌KJ122和SI014菌株的生长曲线。根据600nm处的光密度监测细菌生长总计97小时时间。KJ122菌株(实心圆圈)仅显示非常慢的生长。另一方面，SI014菌株(实心正方形)在27小时内显示快速生长，随后细胞密度缓慢下降。

图11.在含有木糖作为唯一碳源的培养基中大肠杆菌KJ122和SI014菌株的木糖利用和琥珀酸生产的曲线。根据培养基中木糖浓度下降测量木糖利用，测量97小时时间，与KJ122菌株(实心圆圈)的木糖利用相比时，SI014菌株(实心正方形)的木糖利用快得多。类似地，与KJ122菌株(空心圆圈)的琥珀酸生产相比时，S1014菌株(空心正方形)的琥珀酸生产快得多。

优选实施方案的详述

本发明提供了用于从重组微生物发酵碳化合物以商业显著的量产生有机酸的方法。更具体地，本发明提供了适于通过发酵过程产生有机酸的微生物。本发明的微生物拥有在发酵过程中利用多种糖以产生商业显著量的有机酸的能力。

本发明中公开了适于通过发酵过程产生琥珀酸的微生物。虽然本发明提供了用于通过遗传修饰的细菌菌株从碳化合物以商业显著的量产生琥珀酸的方法，但是本发明的教授内容同等地适用于工业产生许多的其他化学品。

出于描述本发明的目的，应当使用以下定义。

利用本发明，可以制造许多工业有用的化学品。此类化学品的实例包括但不限于乙醇、丁醇、乳酸盐、琥珀酸盐、延胡索酸盐、苹果酸盐、苏氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸。由于有机酸可以作为游离酸和作为盐(例如，但不限于钠、钾、镁、钙、铵盐、氯化物、硫酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐等)存在，化学名称如琥珀酸、延胡索酸、苹果酸、天冬氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸应当意图包括游离酸及其任何盐。类似地，任何盐如琥珀酸盐、延胡索酸盐、苹果酸盐、天冬氨酸盐等也应当意图包括游离酸。

本发明将特定的遗传修饰技术与代谢进化过程组合，以获得在缺氧生长条件下在具有碳水化合物底物的无机盐培养基中显示琥珀酸生产高产量、滴度和体积生产率的菌株。

如本发明中所用，术语“滴度”意指发酵液中特定化合物的摩尔浓度。因而在本发明用于产生琥珀酸的发酵过程中，琥珀酸滴度100mM将意指发酵液在测量时含有每升发酵液100毫摩尔琥珀酸。

如本发明中所用，术语“产量”指在发酵过程期间每摩尔消耗的原料所产生的特定化合物的摩尔数。因而在利用葡萄糖作为原料产生琥珀酸的发酵过程中，术语“产量”指每摩尔消耗的葡萄糖所产生的琥珀酸的摩尔数。

如本发明中所用，术语“体积生产率”指每单位体积每单位时间以克计产生的特定化合物的量。因而，琥珀酸的体积生产率值0.9g L^-1h^-1将意指在1小时生长期间在1升发酵液中积累0.9克琥珀酸。

如本发明中所用，术语“基因”包括基因的可读框以及上游和下游调节序列。上游调节区也称作基因的启动子区。下游调节区也称作终止子序列区。

短语“功能上相似的”广义地意指来自任何生物的任何野生型或突变DNA序列、基因、酶、蛋白质，其具有与通过本文中公开的方法在相同或不同生物中找到的任何野生型或突变DNA序列、基因、酶、蛋白质等同或相似的生物学功能。功能相似性不需要要求序列同源性。等位基因是特定基因的DNA序列的两种或多种形式中的一种。每个基因具有不同的等位基因。与具有突变的相应基因相比较时，没有任何突变的基因称作野生型等位基因。

同源物是与从共同祖先DNA序列遗传的第二基因相关的基因。术语“同源物”可以适用于因物种形成事件而分离的基因之间的关系或适用于因遗传重复事件而分离的基因之间的关系。直向同源物是不同物种中通过物种形成从共同祖先基因进化而来的基因。正常情况下，直向同源物在进化的过程中保留相同功能。直向同源物的鉴定对于新测序基因组中基因功能的可靠预测是重要的。物种形成是新物种的起源，其中所述新物种能够从产生所述新物种的物种中以新方式生存。作为该过程的部分，它也已经获得一些与亲本物种遗传交换的屏障。旁系同源物是因基因组内部重复而相关的基因。直向同源物在进化的过程中保留相同功能，而旁系同源物演化出新功能，即便这些新功能与原始功能相关。

具有“改变的活性”的基因或蛋白质广义地定义为，与相关的野生型基因或蛋白质相比时在可度量属性方面产生可度量差异的基因或蛋白质。改变的活性可能以一般方式通过增加或减少含有改变的基因或蛋白质的菌株的生长速率或琥珀酸产生效率而自我表现。其他可度量属性包括但不限于酶活性、酶的底物特异性、酶的动力学参数如底物亲和力或速率、酶稳定性、酶的调节性能、基因表达水平、多种条件下对基因表达的调节等。

如本发明中所用，术语“突变”指对基因(包括可读框、上游调节区和下游调节区)所做的遗传修饰。基因突变导致该基因的可读框转录的上调或下调或完全抑制。通过缺失基因的整个编码区或一部分编码性核苷酸序列或通过导入移码突变、错义突变和插入或通过导入终止密码子或其组合基因实现突变。突变可以在编码直接参与生物学功能如酶反应或有机分子跨细胞膜转运的蛋白质的结构基因中出现。备选地，突变可以在编码蛋白的调节基因中出现，其中所述蛋白质控制编码直接参与生物学功能的蛋白质的基因的表达。控制其他基因表达的蛋白质称作调节蛋白并且编码这些调节蛋白的基因称作调节基因。

“突变”还应当包括DNA序列中相对于相关野生型生物的任何变化。例如，菌株KJ122中存在的突变是在DNA序列中当已突变区域的DNA序列与亲本野生型菌株大肠杆菌C(又称作ATCC 8739)的DNA序列比较时可以找到的任何变化。突变可以具有任何数目的碱基对的额外DNA的插入或具有任何数目的碱基对的DNA的缺失。一种特定类型的插入突变是基因重复。基因可以因自发突变事件而重复，其中该基因的第二副本可以毗邻于原始副本存在，或基因可以因基因工程操作而重复，其中该基因的第二副本可以位于基因组中远离原始副本的位点处。突变可以从一种碱基类型变化成另一种碱基类型，例如从腺嘌呤变化成鸟嘌呤碱基。在遗传学的术语中，突变可以是错义(其改变密码子编码的氨基酸)、无义(其改变密码子成终止密码子)、移码(其是不为3的倍数的多个碱基的插入或缺失，并且改变可读框并从该突变下游起改变所编码的氨基酸序列并且在该突变下游通常导入终止密码子)或倒位(其因DNA序列极性转换产生，而不是因缺失产生)。

“无效突变(null mutation)”是这样的突变，其赋予基本上与缺失相关基因的整个可读框相同的表型或其消除相关基因的全部可度量活性。

“突变体”是其基因组含有一个或多个突变的微生物。

如本发明中所用，术语“外源的”意图意指源自细胞外部的分子或活性被导入宿主微生物中。在外源核酸分子被导入微生物细胞中的情况下，导入的核酸可以作为独立质粒存在或可以整合至宿主染色体DNA中。编码蛋白质的外源核酸可以以具有自身调节序列如启动子和终止子序列的可表达形成导入微生物细胞中。备选地，该外源核酸分子可以整合至宿主染色体DNA中并且可以处于宿主调节序列的控制下。

术语“内源的”指存在于宿主细胞内部的分子和活性。当谈及生物合成活性使用时，术语“外源的”指导入宿主参比生物中的活性。来源可以是例如导入宿主微生物后表达所指活性的同源的或异源的编码核酸。如果从该微生物的相同物种获得编码蛋白质的核酸，则该核酸称作同源DNA。如果核酸源自不同的微生物物种，则该核酸称作异源DNA。无论DNA的性质是什么，它是否为同源的或异源的，当导入宿主细胞中时，从所导入DNA衍生的DNA以及活性称作外源的。因此，本发明编码性核酸的外源表达可以利用异源和同源编码性核酸中的任一者或两者。

“同时利用C5糖和C6糖”的细胞意指这样的细胞，其中当所述细胞在含有相当大浓度的C5糖和C6糖的培养基中培育时，所述细胞在其接种至培养基中一开始就以可度量的速率并且没有任何实质延误地消耗C5糖如木糖、阿拉伯糖、核糖等和C6糖如葡萄糖、果糖、半乳糖等。含有C5糖和C6糖的培养基可以由纯化的糖制成，或它可以衍生自生物量水解产物。

许多微生物适用于本发明，所述微生物包括大肠杆菌(Escherichiacoli)、弗氏柠檬酸细菌(Citrobactor freundii)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、浅井氏葡糖杆菌(Gluconobacter asaii)、带马瓦无色杆菌(Achromobacter delmarvae)、粘无色杆菌(Achromobacterviscosus)、乳无色杆菌(Achromobacter lacticum)、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、放射形农杆菌(Agrobacterium radiobacter)、粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)、柠檬节杆菌(Arthrobacter citreus)、肿胀节杆菌(Arthrobacter tumescens)、石蜡节杆菌(Arthrobacter paraffineus)、烃谷氨酸节杆菌(Arthrobacter hydrocarboglutamicus)、氧化节杆菌(Arthrobacter oxydans)、天牛金杆菌(Aureobacterium saperdae)、印度固氮菌(Azotobacter indicus)、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)、叉开短杆菌(Brevibacterium divaricatum)、乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)、黄短杆菌(Brevibacterium flavum)、Brevibacteriumglobosum、暗褐短杆菌(Brevibacterium fuscum)、酮戊二酸短杆菌(Brevibacterium ketoglutamicum)、Brevibacterium helcolum、极小短杆菌(Brevibacterium pusillum)、需土短杆菌(Brevibacterium testaceum)、玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)、Brevibacterium immariophilium、扩展短杆菌(Brevibacterium linens)、Brevibacterium protopharmiae、嗜乙酰棒杆菌(Corynebacterium acetophilum)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、美棒杆菌(Corynebacterium callunae)、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、醋谷棒杆菌(Corynebacteriumaceto，utamicum)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)、草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)、奇异黄杆菌(Flavobacterium peregrinum)、染色黄杆菌(Flavobacterium fucatum)、橙色黄杆菌(Flavobacterium aurantinum)、莱菌黄杆菌(Flavobacteriumrhenanum)、塞沃尼黄杆菌(Flavobacterium sewanense)、短黄杆菌(Flavobacterium breve)、脑膜脓毒性黄杆菌(Flavobacteriummeningosepticum)、微球菌属物种(Micrococcus sp.)CCM825、摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)、灰暗诺卡氏菌(Nocardia opaca)、粗糙诺卡氏菌(Nocardia rugosa)、Planococcus eucinatus、雷氏变形菌(Proteusrettgeri)、谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)、类黄假单胞菌(Pseudomonas synxantha)、氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、卵状假单胞菌(Pseudomonasovalis)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、食酸假单胞菌(Pseudomonas acidovolans)、霉味假单胞菌(Pseudomonas mucidolens)、睾丸酮假单胞菌(Pseudomonas testosteroni)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)、玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)、红球菌属物种(Rhodococcus sp.)ATCC15592、红球菌属物种ATCC 19070、脲芽孢八叠球菌(Sporosarcinaureae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、麦氏弧菌(Vibriometschnikovii)、干酪弧菌(Vibrio tyrogenes)、马杜拉放线菌(Actinomaduramadurae)、紫产色放线菌(Actinomyces violaceochromogenes)、Kitasatosporia parulosa、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、浅黄链霉菌(Streptomyces flavelus)、浅灰链霉菌(Streptomyces griseolus)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、橄榄色链霉菌(Streptomyces olivaceus)、田无链霉菌(Streptomyces tanashiensis)、弗吉尼亚链霉菌(Streptomycesvirginiae)、抗菌素链霉菌(Streptomyces antibioticus)、可可链霉菌(Streptomyces cacaoi)、淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)、绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)、杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonicida)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、解硫胺素芽孢杆菌(Bacillus thiaminolyticus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquifaciens)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、弗氏埃希氏菌(Escherichia freundii)、嗜氨微杆菌(Microbacteriumammoniaphilum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、薛氏沙门氏菌(Salmonella schottmulleri)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)或柑桔黄单胞菌(Xanthomonas citri)。最适于本发明的重组微生物源自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)。优选的微生物选自埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、普罗威登斯菌属(Providencia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、柠檬酸细菌属(Citrobacter)和沙雷菌属(Serratia)。最优选埃希氏菌属。在埃希氏菌属内部，特别优选大肠杆菌物种。

能够以显著量产生有机酸的大肠杆菌菌株是本领域熟知的。例如，美国专利申请公开号2009/0148914提供大肠杆菌菌株作为用于产生化学纯的乙酸和/或丙酮酸的生物催化剂。美国专利号7,629,162提供为产生乳酸所构建的大肠杆菌K011菌株的衍生物。在专利合作条约下公布的国际专利申请号WO 2008/115958和WO 2010/115067提供了经工程化以在含有葡萄糖作为碳源的基本无机盐培养基中以pH受控制的分批发酵法产生琥珀酸和苹果酸的微生物。

从培养物保藏中心如ATCC(美国典型培养物保藏中心)获得的野生型大肠杆菌菌株可以受到遗传修饰并且随后进行代谢进化以获得以商业显著的量产生一种或多种有机酸的能力增强的菌株。

如本文所用的术语“遗传工程的”或“基因工程的”指通过操作微生物的基因组DNA或质粒而改变微生物中一种或多种酶表达的实践。基因组操作包括改变、添加或从基因组DNA中移走特定的DNA序列。遗传操作还包括将外来DNA序列插入该微生物的基因组DNA序列中。在本发明的最优选的实施方案中，通过从该微生物的基因组DNA中移走特定的DNA序列而不导入任何外来DNA，完成遗传操作。需要使编码特定蛋白质产物的基因的表达失活的某些遗传操作要求将外来DNA序列插入微生物的基因组中。在本发明的最优选的实施方案中，最终从微生物的基因组DNA移去导入的外源DNA序列，从而该微生物在基因工程过程结束时将没有外源DNA位于其原始基因组DNA中。实现本发明优选实施方案的目标所必需要的多项技术已经在Jantama等人(Biotechnology and Bioengineering 99：1140-1153和Biotechnology and Bioengineering 101：881-893)中详细描述。公布的美国专利号7,629,162和美国专利申请2009/0148914及在专利合作条约下以国际公布号WO 2008/115958和WO 2010/115067公布的国际专利申请也描述了用于实施本发明多种实施方案的基因工程技术。出于为用于本发明的基因工程技术提供细节的目的，将这些科学发表物以及专利文献通过引用方式并入本文。

适于实施本发明的微生物可以有氧地(在氧存在下)或无氧地(在氧完全不存在下)或微量有氧地(低供氧速率)培育。备选地，适于本发明的微生物可以按双相生长方案培育，其中所述微生物起初在有氧生长条件下培育以达到某个细胞生长水平，随后，将其转移至无氧生长条件以实现以商业显著的量产生合乎需要的有机酸。为了形成产生特定有机酸的微生物，可以通过在以上段落中引用并且通过引用方式并入的科学文献及专利文献中所述的多种基因工程技术，操作参与许多微生物代谢途径(包括糖酵解途径、三羧酸循环(也称作Krebs循环或TCA循环)和乙醛酸支路)的多种酶。全部这些参考文献通过引用方式并入本专利申请。关于多种微生物代谢途径的细节可以在标准生物化学教材如Lehninger的Principles ofBiochemistry和Lubert Stryer的Biochemistry中找到。

根据优选的有机酸的类型，对代谢途径进行遗传工程，从而微生物产生我们所选的特定有机酸。所述微生物能够合成许多有机酸，这包括乳酸、乙酸和琥珀酸。在利用已知基因工程技术可以操作的在微生物发酵途径中有活性的酶的名单包括但不限于异柠檬酸合成酶(aceA)、苹果酸合酶(aceB)、乙醛酸支路操纵子(aceBAK)、乙酸激酶-磷酸转乙酰酶(ackA-pta)；顺乌头酸水化酶1和2(acnA和acnB)；乙酰辅酶A合成酶(acs)；醇脱氢酶(adhE)；柠檬酸合酶(citZ)；延胡索酸还原酶(frd)；乳酸脱氢酶(ldh)；苹果酸脱氢酶(mdh)；aceBAK操纵子阻抑物(iclR)；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(pepC)；丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)；丙酮酸氧化酶(poxB)和丙酮酸羧化酶(pyc)。除直接参与微生物代谢途径的糖酵解、三羧酸循环和乙醛酸支路的这些基因之外，也可以遗传操作参与摄入用作合成有机酸的能量来源的碳化合物的基因以增强碳摄入或以增强有机酸产生中能量利用的效率。例如，通过磷酸转移酶系统(PTS)减少葡萄糖摄入可以帮助减少在将葡萄糖摄入微生物细胞时所消耗的能量。可以引导通过操作PTS保存的能量以改善生产有机酸的效率。可以操作磷酸转移酶系统基因ptsH和ptsG以保存在葡萄糖摄入中的能量并且因而改善由微生物产生有机酸的效率。因而通过挖掘微生物代谢途径领域内可用的数据，可以缺失一组基因，从而以阻断大部分代谢途径并且将碳流引向特定有机酸的产生。

除了中心代谢途径和糖摄入机制之外，也可以操作细菌细胞内部的羧化酶以改善有机酸的发酵生产。羧化酶在发酵生产中的作用是目前充分建立的。至少4个不同类型的羧化酶已知在细菌细胞内部是有功能的。磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPcase或PPC)羧化磷酸烯醇丙酮酸，导致草酰乙酸的形成。苹果酸酶羧化了丙酮酸，导致苹果酸的形成，并且需要还原型辅因子如NADH或NADPH。称作丙酮酸羧化酶(PYC)的第三种羧化酶羧化丙酮酸以产生草酰乙酸。称作磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK)的第四种羧化酶将磷酸烯醇丙酮酸羧化成草酰乙酸，伴随从磷酸烯醇丙酮酸分子羧化所产生的每分子草酰乙酸，产生一分子ATP。也可以在具有同时利用己糖和戊糖的能力的细菌菌株中适当地操作这些羧化酶中的任一种酶以改善工业有用化学品的发酵生产。

可以遗传操作磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(pck)以改善进入三羧酸循环的碳流。改善pck活性的优点存在于以下事实中：这种酶在将磷酸烯醇丙酮酸羧化成草酰乙酸的同时，导致每产生一分子草酰乙酸，产生一分子ATP。ATP产量的增加将提高细胞的生长速率。

可以通过正向影响pck基因转录的任何突变，实现招募天然pck用于琥珀酸的发酵生产。可以通过在多拷贝质粒中用天然启动子或已知增加基因表达的任何其他启动子序列表达pck基因，实现PCK活性水平的增加。增加pck基因在细胞内部表达的另一种方式是利用转座子整合pck基因的额外副本。在本发明的另一个实施方案中，pck基因的天然启动子可以由已知增强活性水平的一些其他启动子元件替换。也可以通过该基因启动子区中的突变或通过遗传操作已知与pck基因启动子区相互作用的调节元件，实现pck基因增加的表达。编码pck基因的调节蛋白的基因可以按某种方式突变或缺失或过量表达以增加pck基因的表达。单点突变(在相对于pck基因的ATG起始密码子-64位置处G至A转变)可以增加的pck基因的转录，伴随磷酸烯醇丙酮酸羧激酶酶活性的相应增加。也可以通过遗传操作编码已知调节pck基因表达的蛋白质的基因，实现pck基因表达的类似增加。

通过遗传工程化的微生物产生有机酸可以通过利用本领域熟知的适宜技术证实和定量。例如，HPLC技术可以用来测量由所选择克隆产生的有机酸的量。HPLC技术还帮助确定由所选择克隆产生的有机酸的纯度。

本发明的微生物可以在微生物学领域熟知的许多不同培养基中培育。例如，在含有1％(w/v)胰蛋白胨、0.5％(w/v)酵母提取物和0.5％(w/v)NaCl的Luria-Bertani(LB)培养基中培育大肠杆菌的野生型和突变体菌株。为了利用涉及遗传修饰微生物作为生物催化剂的发酵方法商业化生产有机酸，优选补充有碳源的基本无机盐培养基。与丰富培养基如LB培养基相反，基本无机盐培养基的使用降低以商业规模生产有机酸的成本。适于本发明的基本无机培养基包括NBS培养基(Causey等人，2007)和AM1培养基(Martinez等人，2007)。NBS培养基含有1mM甜菜碱、25.72mM KH₂PO₄、28.71mM K₂HPO₄、26.50mM(NH₄)₂HPO₄、1mM MgSO₄.7H₂O、0.1mMCaCl_2.2H₂0、0.15mM盐酸硫胺素、5.92μM FeCl_3.6H₂0、0.84μMCoCl₂.6H2O、0.59μM CuCl₂.2H₂O、1.47μM ZnCl₂、0.83μMNa₂MoO₄.2H₂O和0.81μM H₃BO₃。AM1培养基含有1mM甜菜碱、19.92mM(NH₄)₂HPO₄、7.56mM NH₄H₂PO₄、1.5mM MgSO₄.7H2O、1.0mM甜菜碱-KCl、8.88μM FeCl_3.6H₂0、1.26μM CoCl₂.6H₂O、0.88μMCuCl₂.2H₂O、2.20μM ZnCl₂、1.24μM Na₂MoO₄2H₂O、1.21μM H₃BO₃和2.50μM MnCl₂.4H₂O。

由于有机酸在生长培养基中的积累倾向于降低培养基的pH，故根据需要添加适宜的中和剂至培养基是必需的。可以利用pH探头连续监测培养容器的pH，并且可以添加适宜的碱以维持生长培养基的pH在中性pH附近。适于维持微生物培养物的pH的碱包括NaOH、KOH、NH₄HCO₃、Na₂CO₃、NaHCO₃、K2CO₃和(NH₄)₂CO₃。可以单独或组合地使用适合此目的的碱。

用于微生物生长的无机培养基补充有碳源。在本发明中有用的碳源包括但不限于戊糖如木糖和己糖如葡萄糖、果糖和半乳糖。也可以通过提供不同糖的组合如葡萄糖和木糖的组合满足碳源需要。碳源也可以衍生自淀粉或木素纤维素水解。可以通过使用本领域熟知的热化学转化过程或酶促方法，实现复杂糖如淀粉和木素纤维素的水解。用于利用微生物发酵工业生产有机酸的优选碳源是从农业或林业废弃物水解衍生的木素纤维素水解产物。木素纤维素水解产物可以进一步分级以产生己糖富化和戊糖富化的级分，并且这些级分可以充当利用微生物发酵商业化生产有机酸的碳源。木素纤维素水解产物可以进一步脱毒以除去发现高于某些浓度时对许多微生物有毒的某些化学品，如糠醛。

从基因工程获得的微生物菌株具有用于产生有机酸的期望基因型。然而，对于利用这些遗传修饰微生物作为生物催化剂以通过大规模发酵过程商业化生产有机酸，它们在基本无机盐培养基中的生长速率或它们以所要求的速率产生特定有机酸的能力以或它们耐受源自木素纤维素水解产物的碳源中某些化学品的能力可能是不适合的。随后通过代谢适应或进化，对从基因缺失获得的遗传修饰微生物菌株选择最有代表性的克隆。在代谢进化期间，将选择的培养物反复转移至新鲜基本培养基中持续某个时间段，以获得其中一个或多个在选择期间出现的自发突变产生以下表型的克隆：显示快速细胞生长、快速消耗不同碳源、能够同时利用多种糖、能够耐受碳源中有毒化学品和合乎需要的有机酸的高生产量和生产率，但是其他有机酸的产量低。在代谢进化期间，注意力放在选择具有合乎需要的表型的克隆方面。经遗传修饰以产生特定有机酸的微生物可能没有商业上有吸引力的生长速率，并且因此可能不显示出这种特定有机酸的期望产量。可以随后进行代谢进化以演化出这样的菌株，其显示显著的生长，伴随产生这种特定有机酸的速率增加。因代谢进化产生的以下克隆不是合乎需要的克隆，所述克隆在补充有碳源的无机培养基中显示极好的生长速率，但是在合乎需要的有机酸的产量方面未改进。

在本发明的优选实施方案中使用大肠杆菌KJ122菌株。通过包括基因工程和代谢进化法组合的多个阶段，从野生型大肠杆菌C菌株衍生出KJ122。使用基因工程技术，从亲本大肠杆菌C菌株ATCC 8739的染色体DNA中缺失12个不同基因，包括乳酸脱氢酶(ldhA)、醇脱氢酶(adhE)、甲酸转运蛋白(focA)、乙酸激酶(ackA)、丙酮酸-甲酸裂解酶(pflB)、甲基乙二醛合酶(msgA)、丙酮酸氧化酶(poxB)、具有乙酸激酶活性的丙酸激酶(tdcD)、α-酮丁酸甲酸裂解酶(tdcE)、柠檬酸裂合酶(citF)、天冬氨酸氨基转移酶(aspC)和苹果酸酶(sfcA)。对大肠杆菌C菌株ATCC 8739所做的产生KJ122菌株的遗传操作已经由Jantama等人(2008a，2008b)中详细描述。

在利用选择压力以迫使该生物获得所需表型的代谢进化过程期间，两种可能的变化可能出现。该生物可以仅自身适应于选择压力并且显示改变的表型。备选地，该生物可能在选择压力下经历某些遗传改变并且永久地显示改变的表型。当仅存在适应作用并且不存在遗传改变时，一旦选择压力减轻，则该生物回复成其原始表型。这些生物称作“适应型”生物。“适应型”微生物必须经历选择压力下新的另一个轮代谢进化以显示改变的表型。另一方面，当存在伴随的遗传改变时，改变的表型将持续存在，甚至不存在选择压力时也是如此。伴有某种遗传改变的代谢进化是合乎需要的。可以通过在无任何选择压力情况下在原始生长培养基中培育微生物持续一些时间，随后将其转移至存在选择压力下的新鲜培养基，从而轻易地鉴定在代谢进化期间获得稳定遗传改变的微生物。如果这些生物能够在无任何延迟期情况下显示良好的生长和期望的表型，则认为该生物已经在代谢进化期间获得改变的基因型。

可以通过将该生物的染色体DNA测序并且将序列数据与亲本菌株的序列数据比较，确定在代谢进化期间所获得的遗传改变的基础。可以通过沿用本领域熟知的技术，获得基因组序列数据。因而，从大肠杆菌菌株ATCC 8739获得的亲本菌株KJ122可以经历代谢进化以获得具有合乎需要的新表型的菌株。可以对代谢进化的新菌株连同亲本菌株KJ122的基因组测序，并且可以鉴定代谢进化的菌株中引起表型改变的突变。

如本发明中所定义，术语“突变”包括基因内部核苷酸序列的任何变化。基因内部的核苷酸变化可以是导致一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基替换的三联密码子内部的单核苷酸变化。备选地，在基因的可读框内部的核苷酸变化可以包括可读框的一部分或整个可读框的缺失。可读框内部的核苷酸变化也可以包括导入终止密码子，并且因而该可读框编码截短的蛋白质，而不是全长的蛋白质。如本发明中所用，术语“突变”还包括可读框上游或下游的核苷酸序列变化。可读框上游和下游的区域含有几个调节性核苷酸序列并且参与由该可读框编码的蛋白质的表达。出现在这些调节区内的突变可以改变基因表达，从而导致基因功能的上调或下调。另一种可能性是核苷酸插入或缺失，导致移码突变。

基于从本发明获得的知识，可以在已经被遗传工程化以利用葡萄糖作为碳源生产一种或多种工业化学品的任何细菌菌株中实施导致同时利用戊糖和己糖的遗传修饰。备选地，可以在任何野生型细菌菌株中实施对于同时利用己糖和戊糖所需要的遗传修饰，并且如此修饰以同时利用己糖和戊糖的野生型细菌菌株可以进一步经历遗传修饰以形成适于以商业规模生产工业化学品的微生物。

实验部分

总体评价

菌株和接种物制备：本发明中使用KJ122(大肠杆菌C，ΔldhA，ΔadhE，ΔackA，ΔfocA-pflB，ΔmgsA，ΔpoxB，ΔtdcDE，ΔcitF，ΔaspC，ΔsfcA)。通过如Jantama等人(2008a；2008b)和在专利合作条约下以国际公开号WO 2008/115958和WO 2010/115067公开的国际专利申请中描述的遗传修饰，从大肠杆菌C(ATCC 8739)菌株衍生KJ122。全部这些文献通过引用方式并入本文。

大肠杆菌菌株KJ122能够在AM1无机培养基中在72小时内发酵10％葡萄糖以产生88g/L琥珀酸(相对于碱添加而归一化)。AM1培养基含有2.63g/L(NH₄)₂HPO₄、0.87g/L NH₄H₂PO₄、1.5mM MgSO₄、1.0mM甜菜碱和1.5ml/L痕量元素。将痕量元素制备为1000X母液并且含有以下组分：1.6g/L FeCl₃、0.2g/L CoCl₂.6H₂O、0.1g/L CuCl₂、0.2g/L ZnCl₂.4H₂O、0.2g/L NaMoO₄、0.05g/L H₃BO₃和0.33g/L MnCl₂.4H₂O。发酵液的pH用1：4(6N KOH：3M K₂CO₃)(1.2N KOH，2.4M K₂CO₃)维持在7.0。

在一些实验中，添加玉米浆。它是来自玉米湿磨工业的副产物。与酵母提取物和蛋白胨相比时，玉米浆是廉价的维生素和痕量元素源。

发酵：通过将经过遗传工程化以产生琥珀酸并且贮存在-80℃冰箱中的大肠杆菌菌株的甘油贮藏物在新鲜NBS-2％木糖平板上划线，启动发酵。在16小时(37℃)后，将细胞从该平板刮下并且直接接种至发酵容器中。该发酵容器具有350ml的工作体积。所述第一次发酵称作“种子”培养物，并且不用来积累数据。全部发酵中的培养基是常规AM1培养基，该培养基补充有0.03M KHCO₃、1mM甜菜碱和8％木糖(除非另外指出并非如此)并且用1.2N KOH和2.4M K₂CO₃组成的碱中和。将发酵容器维持在pH 7.0，37℃，伴以150转/分钟搅拌。在24小时后，使用种子培养物来接种新培养(分批实验或“转移(transfer)”)至起始OD₅₅₀为0.05。除每日转移例外，全部实验均一式三份实施。C5/C6共发酵实验包含4％木糖、7％葡萄糖、0.5％阿拉伯糖、0.4％半乳糖和0.3％甘露糖(纯的糖)，并且用在木糖作为唯一碳源和0.08％糠醛上生长的培养物接种。C5/C6共发酵还用8％木糖和1％葡萄糖的混合物实施。这些实验在不添加抑制剂，伴有1％乙酸或伴有0.1％糠醛情况下一式三份实施。

细胞生长：通过使用Thermo Electronic Spectronic 20分光光度计测量550nm处的光密度(OD₅₅₀)，估计细胞质量。

有机酸和糖分析：通过HPLC测量多种有机酸和糖的浓度。在配有BioRad Aminex HPX-87H柱的Agilent 1200HPLC装置上分析在发酵液中存在的琥珀酸和其他有机酸。使用BioRad Microguard阳离子H⁺作为保护柱。在0.008N硫酸中制备HPLC分析用标准物。HPLC柱温维持在50℃。使用0.008N浓度的硫酸作为流速0.6ml/分钟的流动相。通过测量其在210nm处的吸收，进行多种组分的定量。

代谢进化：来自pH受控发酵的细胞以24小时一系列地转移以通过基于生长的选择作用刺激代谢进化。将大约1/100新培养基体积的接种物直接添加于预温的新鲜培养基至初始OD₅₅₀为0.05。分离具有改进发酵特征的克隆。应用代谢进化策略以改善木糖发酵。

蔗渣的制备：甘蔗蔗渣从位于佛罗里达州的制糖厂获得，它是通常用于燃烧获得能量的废弃产物。使用这种废弃产物作为使用稀酸预处理而制备半纤维素和纤维素级分的原料。

将甘蔗蔗渣干燥至湿度含量约10％并且利用刀式粉碎机粉碎。将材料在蒸汽反应器(Zipperclave & Parr)中用稀硫酸在温和温度处理。稀酸预处理的常见预处理条件是0.1-3％酸浓度，100-200℃温度和在反应器中1-30分钟停留时间。实现最大木糖产量同时糖降解最小的最佳反应器条件是0.5％酸浓度，160℃温度和在反应器中10分钟的停留时间。

PCR和DNA测序：使用一套两条galP特异性引物BY38和BY39(表1)以从大肠杆菌TG400、KJ122和WG37菌株获得galP基因。利用标准操作方案，使用来自New England Biolabs的2phusion HF主混合物试剂盒，实施PCR。将PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶上电泳以确定来自这些不同大肠杆菌菌株的PCR产物的大小。通过在美国马萨诸塞州波士顿的Tufts DNA测序核心设施，利用Sanger法，对PCR产物也进行了测序。利用Vector NTI软件程序，分析序列数据。

大肠杆菌WG37菌株的构建：通过缺失galP基因的整个编码区，从KJ122菌株衍生出大肠杆菌WG37菌株。在包括同源重组的两个步骤中缺失galP基因。在第一阶段，galP基因序列被含有抗生素标记和sacB基因序列的盒替换。在具有抗生素的LB平板上选择重组体。在第二阶段，将抗生素盒从染色体DNA中移去并且在含有蔗糖的培养基上选择重组体。高度富化在含有蔗糖的平板上生长的菌落，以丢失sacB盒。

在大肠杆菌WG37菌株的构建中，使用引物51a和51b(表1)和XmnI消化的pGW162质粒作为模板，通过PCR扩增kan盒。将kan-sacB盒的DNA片段导入大肠杆菌KJ122菌株中。在第一步骤中，在具有卡那霉素的LB平板上选择转化体，并且使用引物49a、49b(表1)，通过PCR证实。该菌株命名为WG35。使用引物49a、49b(表1)，将galP基因和附近的300bp区域扩增并且克隆至pGEMT easy载体以产生质粒pGW180。该质粒DNA的稀释制备物充当模板以使用引物50a、50b(表1)进行由内向外扩增。所得到的片段自我连接以构建质粒pGW181。在pGW181(表1)中，galP基因缺失。采用引物49a、49b和质粒pGW181作为模板，通过PCR扩增含有galP缺失的DNA片段。将PCR产物引入WG35中，并且在具有10％蔗糖的LB平板上选择转化体。对所得到的克隆检验卡那霉素抗性的丢失。最终的galP缺失菌株命名为WG37，并且使用引物49a和49b(表1)，通过PCR证实这个具体基因缺失。

实施例1C5利用

大肠杆菌菌株KJ122(大肠杆菌C，ΔldhA，ΔadhE，ΔackA，ΔfocA-pflB，ΔmgsA，ΔpoxB，ΔtdcDE，ΔcitF，ΔaspC，ΔsfcA)能够依赖葡萄糖、木糖和阿拉伯糖有氧生长。本发明的目的是在含有己糖和其他戊糖的培养基中微量有氧地培育大肠杆菌KJ122菌株和选择能够同时利用两种类型糖的生物。

通过在补充有2％木糖的NBS无机培养基平板上有氧培育，实施针对C5利用的初始筛选。平板在37℃孵育过夜。将木糖平板上出现的菌落在新鲜平板上连续三次划线。在具有2％木糖的固体NBS无机培养基上第三次转移结束时，将来自该平板的细胞刮下并且直接接种至发酵烧瓶，其含有补充有0.03M KHCO₃、1mM甜菜碱和8％木糖的AM1无机培养基。发酵培养基用1.2N KOH和2.4M K₂CO₃组成的碱中和以在37℃维持pH为7.0。采用以150转/分钟速度运行的磁力搅拌棒搅拌培养物。培育液体培养物，持续初始的时间24小时，并且用作种子培养物以创建初始OD₅₅₀为0.05的新培养物。

这种在具有木糖的AM1无机培养基中的培养物显示出初始72小时延迟相，在此期间没有观察到KJ122的生长。在这个初始延迟期结束时，KJ122菌株开始显示生长。随着如550nm处OD的增加所度量的细菌细胞生长，存在培养基中木糖的浓度下降，伴随生长培养基中琥珀酸的浓度成正比地增加。

在含有木糖的培养基中216小时生长期结束时，制备这种培养物的甘油贮藏物并且贮存在-80℃。使用在216小时生长期结束时的新鲜培养物或在216小时生长期结束时所制备的培养物的甘油贮藏物来接种具有AM1无机培养基的新发酵容器，所述AM1无机培养基补充有8％木糖。无论接种物的来源是什么，无论它是否来自新鲜培养物或甘油贮藏物，在第二发酵容器中的培养物在没有任何延迟期的情况下生长。在没有任何延迟期的情况下，伴随细菌生长还产生琥珀酸。因而，在具有2％木糖的固体无机培养基上培育三轮，接着进行216小时时间的单次生长循环，这产生能够在含有木糖的培养基上微量有氧生长的KJ122“适应型菌株”。

实施例2KJ122的代谢进化

在本发明的另一个实施方案中，KJ122菌株经历代谢进化。在补充有木糖的液体AM1培养基中微量有氧生长的KJ122培养物每隔24小时转移至含有8％木糖的新鲜液体AM1培养基，持续2周时间。在这些多次转移结束时，将KJ122菌株转移至具有AM1培养基的新发酵罐，所述AM1培养基补充有8％木糖。监测KJ122在所述发酵罐中的无氧生长速率以及琥珀酸产生和木糖利用动力学。发酵罐中的琥珀酸产生在没有任何延迟期的情况下立即开始并且还产生了更高的终末滴度，并且将这个菌株称作“代谢进化菌株”。在我们的菌株保藏中心中，这个代谢进化菌株已经命名为TG400。

为了确定KJ122“适应型菌株”和“代谢进化的”TG400菌株对于其改变的表型是否具有任何遗传基础，实施以下实验。将未修饰的KJ122菌株、“KJ122适应型菌株”和“代谢进化的”TG400菌株划线到含有2％葡萄糖的新鲜无机培养基平板上。将所产生的菌落划线到具有2％葡萄糖的新鲜平板上。基于每日进行这种划线连续11日。在第11日结束时，将培养物划线到含有木糖的琼脂平板上。在木糖平板上生长的菌落再次划线到含有木糖的新鲜平板上。此后，在含有木糖的第二平板上生长的菌落转移至液体培养。监测生长速率、琥珀酸产生动力学和培养基中木糖浓度下降的速率。

如图1、2和3中所示的结果表明，在原始KJ122菌株中以及在KJ122“适应型”菌株中，通过生长培养基中木糖消失所监测的木糖利用均显示96小时延迟期。在代谢进化的TG400菌株的情况下，培养基中的大部分木糖在头96小时内耗尽。此外，对于TG400，琥珀酸产生没有显示任何延迟期。类似地，对于TG400，细胞生长没有显示延迟期，而KJ122“适应型菌株”和原始KJ122菌株显示约72小时的初始延迟相(图1和2)。这些观察结果清楚地确立，代谢进化的TG400菌株已经在代谢进化期间获得木糖利用的稳定基因型，并且这种能力不丢失，甚至当该菌株在木糖不存在的情况下培育几代时也是如此。另一方面，在含有葡萄糖的培养基中在木糖不存在的情况下培育几代时，适应于在仅含有木糖的培养基中生长的KJ122菌株丢失其利用木糖的能力。在木糖不存在的情况下培育的这种KJ122“适应型菌株”需要额外的96小时以再次自我调整以使用木糖作为碳源。因而，KJ122“适应型菌株”没有在其于含有木糖的培养基中适应96小时期间获得任何遗传修饰。

在获得利用木糖作为碳源的能力的同时，TG400仍保留其利用葡萄糖作为碳源的能力(表2)。

实施例3C5+C6共发酵

在无氧生长条件下的KJ122中，C5糖和C6糖没有被同时代谢。通常首先代谢C6糖并且在C5代谢之前显示一个延迟期。因此，重要的是确定TG400在等量C6和C5糖存在下的发酵特征。如图4中所示，TG400能够以相同速率利用葡萄糖和木糖并且没有任何延迟期的情况下产生琥珀酸。KJ122也能够利用木糖和葡萄糖。然而在KJ122菌株中，木糖利用仅在葡萄糖浓度大幅度下降后才开始。进一步如表3中所示，与KJ122利用木糖和葡萄糖相比时，基于摩尔，TG400利用木糖多于葡萄糖。

实施例4富含C5糖的脱毒蔗渣水解产物的发酵

对通过代谢进化获得的TG400菌株检验其利用源自蔗渣水解的木糖的能力。通过以下方式将浓缩的蔗渣水解产物脱毒：每公斤蔗渣水解产物在200转/分钟的回转摇床中在35℃用50克炭处理60分钟。将活性炭处理的富含C5的蔗渣调节pH，以AM1无机盐、甜菜碱和痕量元素补充并且随后过滤消毒。该水解产物主要包含8％(w/v)木糖(C5)和大约0.8％葡萄糖(C6)、0.1％半乳糖(C6)、0.1％甘露糖(C6)和0.002％阿拉伯糖(C5)。浓缩脱毒的富含C5糖的蔗渣水解产物进一步用2.5％w/v玉米浆补充并且以TG400菌株接种至初始OD₅₅₀nm为0.5。如图5中所示的结果表明，在120小时内，培养基中的全部糖均耗尽，并且存在稳定的琥珀酸产生。

实施例5大肠杆菌KJ122和TG400菌株的基因组测序

使用Illumina基因组分析仪II在美国马萨诸塞州波士顿的Tufts大学核心设施，对亲本菌株KJ122和通过代谢进化从KJ122衍生的TG400菌株的全基因组测序。该基因组分析仪II由Illumina Sequencing Technology提供。将获得的KJ122和TG400基因组数据相互比较以鉴定伴随源自KJ122的TG400代谢进化而来的遗传改变。TG400和KJ122的对比分析揭示出TG400的galP基因中的突变性改变。TG400中的galP基因在其可读框第889核苷酸位置显示点突变。在该位置的胞嘧啶核苷酸变成鸟嘌呤残基。作为这种核苷酸变化的结果，氨基酸残基甘氨酸变成天冬氨酸。在galP基因中的这种突变称作galP＊。该突变是细菌KJ122和TG400菌株之间在核苷酸水平的唯一差异。

实施例6TG400和KJ122中galP基因序列的PCR和序列分析。

已经确定在TG400菌株中的galP基因序列内存在解释其同时利用木糖和葡萄糖能力的突变，我们使用PCR技术以从KJ122和TG400获得galP基因。对从TG400获得的PCR产物以及来自KJ122的PCR产物测序。序列数据揭示了使第296位置处的甘氨酸残基变成天冬氨酸残基(Gly296至Asp)的点突变。

实施例7galP基因缺失的效果

已经确定在TG400菌株中存在解释其同时利用葡萄糖和木糖能力的galP基因突变，我们决定，确定缺失完整galP基因是否将产生与带有突变galP基因的TG400中所见那样相同的表型效果。在这些实验中，我们使用大肠杆菌KJ122作为亲本菌株。

我们从大肠杆菌KJ122菌株中缺失galP基因序列以产生称作WG37的新菌株。我们测量了在含有葡萄糖和木糖作为碳源的基本培养基中无氧培育的KJ122、TG400和WG37菌株中的生长动力学、糖利用模式和琥珀酸产生。WG37能够在96小时过程期间同时利用葡萄糖和木糖(图6)。其生长动力学以及糖利用模式与具有突变形式galP基因的TG400相似。在KJ122中，葡萄糖在72小时内彻底耗尽，而木糖利用显示24小时初始延迟。在TG400中以及在WG37中，甚至96小时生长后葡萄糖未耗尽，并且显著量的葡萄糖在96小时生长时留在培养基中。此外，在TG400和WG37中，均可以早在12小时检测到木糖利用。

图7、8和9显示平行比较本发明中所用的全部3个菌株内琥珀酸产生的动力学。在含有4％木糖和7％葡萄糖的培养基中培育时，全部菌株均显示相似的琥珀酸产生动力学，无论它们是否具有完整galP基因序列。在含有混合糖的培养基中，TG400显示略微较高的琥珀酸产生速率(图7)。

在含有木糖作为仅有碳源的培养基中，与KJ122菌株的琥珀酸产生速率相比时，TG400和WG37菌株显示出快得多的琥珀酸产生速率(图8)。

在含有葡萄糖作为仅有碳源的培养基中，与KJ122菌株的琥珀酸产生速率相比时，在galP基因序列中具有缺失的两个细菌菌株TG400和WG37显示出较慢的琥珀酸产生速率(图9)。

实施例8galP中的G297D点突变对木糖利用的影响

为了检验导致G297D(GalP蛋白中第297位置处的甘氨酸残基替换为天冬氨酸残基)的点突变对含有木糖作为唯一碳源的发酵培养基中的生长和琥珀酸产生的影响，将G297D突变导入KJ122菌株内的galP基因序列中。通过使用引物17ASPgalP(SEQ ID NO.9)和18SPgalP(SEQ ID NO.10)从TG400中PCR扩增突变galP＊基因并且随后在从温度条件型质粒pKD46表达λRed重组酶的WG35(KJ122ΔgalP::kan-sacB)内部重组，产生SI014(KJ122ΔgalP::galP＊)。然后通过在升高的温度生长移除质粒pKD46(Datsenko和Waner，2000)。

从MacConkey乳糖平板获得KJ122。从LB 2％葡萄糖平板取得SI014(KJ122galP＊)。来自该平板的刮离物用来接种25ml的LB 2％葡萄糖。培养物在37℃培育8小时，150转/分钟。这些培养物的终末OD₆₀₀对于KJ122是0.71并且对于SI014是0.58。使用5ml的每种LB葡萄糖培养物来接种含有AM110％葡萄糖培养基的300ml种子发酵罐。将这些发酵物在pH 7.0，37℃维持24小时。这些培养物的终末OD₆₀₀对于KJ122是3.82并且对于SI014是2.89。使用这些培养物来接种一式三份地含有AM110％木糖培养基的发酵罐。使用7.85ml的KJ122和使用10.38ml的SI014来接种300ml发酵物，使得靶终末OD₆₀₀是0.1。将发酵物在pH 7.0，37℃维持97小时。为进行OD₆₀₀和代谢物分析，每日取得样品。利用GraphPad Prism，将全部代谢物和生长数据作图和分析(两因素ANOVA)。

图10中显示大肠杆菌菌株SI014的生长曲线，其中所述菌株SI014在galP基因中含有导致第297位置处1个氨基酸改变的点突变。通过OD₆₀₀值，十分清楚的是，在含有木糖作为唯一碳源的培养基上，SI014菌株比KJ122生长得更快和更稠密。这两个菌株之间已知的仅有差异是galP基因中的点突变。图11显示与KJ122相比，菌株SI014的木糖消耗增加和同时琥珀酸产生增加。

已经参考优选的实施方案在上文详述了申请人的发明。熟悉以上详述内容的技末人员可以作出任何修改而不脱离后附权利要求书的精神。

＊这里提供的全部值均相对于碱添加而归一化。

＊这里提供的全部值均相对于碱添加而归一化。

^a在补充有0.03M KHCO₂、1mM甜菜碱和8％木糖的AM1无机盐培养基中一式三份进行分批发酵，除非另外指出并非如此；通过自动添加1.2N KOH和2.4M K₂CO₃，将pH控制在7.0。滴度相对于碱添加而归一化。

^b产率基于代谢的糖，假定每g木糖的琥珀酸最大理论产量是1.12g。

^c首先木糖发酵(一式两份)

^d初始糖浓度：4％木糖，7％葡萄糖，0.4％半乳糖，0.3％甘露糖，0.5％阿拉伯糖

^e来自蔗渣的浓缩脱毒的C5水解产物(见图5图注)。初始糖浓度是：56.6g/L木糖，4.5g/L葡萄糖，0.0009g/L半乳糖，2.7g/L阿拉伯糖。全部糖均耗尽。从终末乙酸中扣除来自预处理过程的初始乙酸(4.04g/L)以确定发酵期间产生的乙酸。

参考文献

为便利读者，列出全部参考资料。每份参考资料通过引用的方式完整并入。

美国专利号5,168,056

美国专利号5,169,768

美国专利号5,602,030

美国专利号6,962,794

美国专利号7,223,567

美国专利号7,371,558

美国专利号7,524,660

美国专利号7,629,162

美国专利申请公开号2004/0214294

美国专利申请公开号2007/0037265

美国专利申请公开号2008/0176302

美国专利申请公开号2009/0148914

国际专利申请公开号WO 2008/115958

国际专利申请公开号WO 2010/115067

Bertilsson，M.，Olofsson，K.，Liden，G.(2009)“Prefermentationimproves xylose utilization in simultaneous saccharification andco-fermentation of pretreated spruce(前发酵改善预处理的云杉同时糖化和共发酵中的木糖利用).”Biotechnol Biofuels 2：8(Biomed Central.2009年4月8日发表)

Biville，F.，Turlin，E.，Gasser，F.(1991)“Mutants of Escherichia coliproducing pyrroloquinoline quinine(产生吡咯并喹啉奎宁的大肠杆菌突变体).”J Gen Microbio 137：1775-1782.

Cairns，M.T.，McDonald，T.P.，Horne，P.，Henderson，P.J.(1991)“Cytochalasin B as a probe of protein structure and substrate recognitionby the Galactose/H+transporter of Escherichia coli(作为蛋白质结构的探针和大肠杆菌半乳糖/H+转运蛋白识别的底物的松胞菌素B).”J Biol Chem266：8176-8183.

Chen，R.，Yap，W.M.G.J.，Postma，P.W.，Bailey，J.E.(2000)“Comparative studies of Escherichia coli strains using different glucoseuptake systems：Metabolism and energetic(使用不同葡萄糖摄入系统的大肠杆菌菌株的对比研究：代谢与能量学).”Biotechnol Bioeng 56：583-590.

Chen，T.，Zhang，J.，Liang，L.，Yang，R.，Lin，Z.(2009)“(An in vivo，label-free quick assay for xylose transport in Escherichia coli)一种用于大肠杆菌中木糖转运的体内无标记物快速测定法.”Anal Biochem 390：63-67.

Chin，J.W.，Khankal，R.，Monroe，C.A.，Maranas，C.D.，Cirino，P.C.(2009)“Analysis of NADPH supply during xylitol production byengineered Escherichia coli(对工程化大肠杆菌产生木糖醇期间NADPH供应的分析).”Biotechnol Bioeng 102：209-220.

Cirino，J.W.，Chin，J.W.，Ingram，L.O.(2006)“EngineeringEscherichia coli for xylitol production from glucose-xylose mixtures(工程化大肠杆菌以从葡萄糖-木糖混合物生产木糖醇).”Biotechnol Bioeng 95：1167-1176.

Castro，R.，Neves，A.R.，Fonseca，L.L.Pool，W.A.，Kok，J.，Kuipers，O.P.，Santos，H.(2009)“Characterization of the individual glucose uptakesystems of Lactococcus lactis：mannose-PTS，cellobiose-PTS and the novelGlcU permease(表征乳酸乳球菌怔actococcus lactis)的各种葡萄糖摄入系统：甘露糖-PTS、纤维二糖-PTS和新GlcU通透酶).”Mol Microbio 71：795-806.

Causey，T.B.，Shamugam，K.T.，Yomano，L.P.，Ingram，L.O.(2004)“Engineering Escherichia coli for efficient conversion of glucose toDYruvate(工程化大肠杆菌以高效转化葡萄糖成丙酮酸).”Proc Natl AcadSci USA 101：2235-2240.

De Anda，R.，Lara，A.R.，Hernandez，V.，Hernandez-Montavlo，V.，Gosset，G.，Bolivar，F.，Ramirez，O.T.(2006)“Replacement of the glucosephosphotransferase transport system by galactose permease reducesacetate accumulation and improves process performance of Escherichiacoli for recombinant protein production without impairment of growthrate(用半乳糖通透酶替换葡萄糖磷酸转移酶转运系统减少了乙酸积累并且改善大肠杆菌对重组蛋白产生的加工性能，而不损害生长速率).”MetabEng 8：281-290.

Deutscher，J.，Francke，C.，Postma，P.W.(2006)“Howphosphotransferase system-related protein phosphorylation regulatescarbohydrate metabolism in bacteria(磷酸转移酶系统相关的蛋白质磷酸化怎样调节细菌中的碳水化合物代谢).”Microbiol Mol Bio Rev70：939-1031.

Deutscher，J.(2008)“The mechanism of carbon catabolite repressionin bacteria(细菌中碳分解代谢物阻遏的机制).”Curr Opin Microbiol11：87-93.

Dien，B.S.，Nichols，N.N.，Bothast，R.J.(2002)“Fermentation of sugarmixtures using Escherichia coli catabolite repression mutants engineeredfor production of L-lactic acid(使用为产生L-乳酸所工程化的大肠杆菌分解代谢物阻遏突变体发酵糖混合物).”JInd Microbiol Biotechnol 29：221-227.

Flores，N.，Leal，L.，Sigala，J.C.，deAnda，R.，Escalante，A.，Martinez，A.，Ramirez，O.T.，Gosset，G.，Boliar，F.(2007)“Growth recovery onglucose under aerobic condition of an Escherichia coli strain carrying aphosphoenolpyruvate：carbohydrate phosphotransferase system deletion byinactivating arcA and overexpressing the genes coding for glucokinase andgalactose permease(通过失活arcA并且过量表达编码葡萄糖激酶和半乳糖通透酶的基因，携带磷酸烯醇丙酮酸：碳水化合物磷酸转移酶系统缺失的大肠杆菌菌株在需氧条件下依赖葡萄糖的生长恢复).”J Mol MicrobiolBiotechnol 13：105-116.

Gorke，B.，Stulke，J.(2008)“Carbon catabolite repression in bacteria；many ways to make the most out of nutrients(细菌中的碳分解代谢物阻遏；充分利用养分的许多途径).”Nat Rev Microbiol 6：613-624.

Henderson，P.J.F.，Giddens，R.A.，Jones-Mortimer，C.J.(1977)“Transport of galactose，glucose and their molecular analogues byEscherichia coli K12(通过大肠杆菌K12转运半乳糖、葡萄糖及其分子类似物).”Biochem J 162：309-320.

Henderson，P.J.(1990)“Proton-linked sugar transport systems inbacteria(细菌中质子关联的糖转运系统).”JBioenergy Biomem 22：525-569.

Hernandez-Montalvo，V.，Valle，F.，Bolivar，F.，Gosset，G.(2001)“Characterization of sugar mixtures utilization by an Escherichia colimutant devoid of the phosphotransferase system(借助缺少磷酸转移酶系统的大肠杆菌突变体表征糖混合物的利用).”App.Microbiol Biotechnol 57：186-191.

Ho，N.W.Y.，Chen，Z.，Brainard，A.P.(1998)“Genetically engineeredSacchromyces yeast capable of effective cofermentation of glucose andxylose(能够有效共发酵葡萄糖和木糖的遗传工程化的酵母属酵母).”AppEnviron Microbiol 64：1852-1859.

Jantama，K.，Haupt，M.J.，Svoronos，S.A.，Zhang，X.，Moore，J.C.，Shanmugham，K.T.，Ingram，L.O.(2008a)“Combining metabolicengineering and metabolic evolutions to develop nonrecombinant strains ofEscherichia coli C that produce succinate and malate(联合代谢工程和代谢进化以开发产生琥珀酸和苹果酸的大肠杆菌C非重组菌株).”BiotechnolBioeng 99：1140-1153.

Jantama，K.，Zhang，X.，Moore，J.C.，Shanmugam，K.T.，Svoronos，S.A.，Ingram，L.O.(2008b)″Eliminating side products and increasingsuccinate yields in engineered strains of Escherichia coli C(在大肠杆菌C工程化菌株中消除副产物并且增加琥珀酸产量).”Biotechnol Bioeng101：881-893.

Kasahara，T.，Kasahara，M.(2003)“Transmembrane segments 1，5，7，and 8 are required for high-affinity glucose transport by Saccharomycescerevisiae Hxt2 tranporter(酿酒酵母Hxt2转运蛋白高亲和力转运葡萄糖需要跨膜区段1、5、7和8).”Biochem J 372：247-252.

Kasahara，T.，Ishigure，M.，Kasahara，M.(2004)“Comprehensivechimeric analysis of amino acid residues critical for high affinity glucosetransport by Hxt2 of Saccharomyces cerevisiae(全面嵌合分析对酿酒酵母Hxt2高亲和力转运葡萄糖为关键的氨基酸残基).”J Biol Chem 279：30274-30278.

Kasahara，T.，Maeda，M.，Ishiguro，M.，Kasahara，M.(2007)“Identification by comprehensive chimeric analysis of a key residueresponsible for high affinity glucose transport by yeast HXT2(通过全面嵌合分析鉴定负责酵母HXT2高亲和力转运葡萄糖的关键残基).”JBiol Chem282：13146-13150.

Kasahara，T.，Ishiguro，M.，Kasahara，M.(2006)“Eight amino acidresidues in transmembrane segments of yeast glucose transporter HXt2 arerequired for high affinity transport(酵母葡萄糖转运蛋白HXt2跨膜区段中的8个氨基酸残基是高亲和力转运所需要的).”J Biol Chem 281：18532-18538.

Khankal，R.，Chin，J.W.，Cirino，P.C.(2008)“Role of xylosetransporters in xylitol production from engineered Escherichia coli(木糖转运蛋白在从工程化大肠杆菌产生木糖醇中的作用).”J Biotechnol 134：246-252.

Kilian，S.G.，Uden van，N.(1988)“Transport of xylose and glucose inthe xylose fermenting yeast Pichia stipitis(发酵木糖的毕赤酵母(Pichiastipitis)中木糖和葡萄糖的转运).”App Microbiol Biotechnol 27：545-548.

Kim，Y.，Ingram，L.O.，Shanmugam，K.T.(2007)“Construction of anEscherichia coli K-12mutant for homoethnologenic fermentation ofglucose or xylose without foreign genes(构建无外来基因的大肠杆菌K-12突变体用于葡萄糖或木糖的同时产乙醇发酵(homoethnologenicfermentation)).”Appl Environ Microbiol 73：1766-1771.

Kuyper，M.，Toirkens，M.J.，Diderich，J.A.，Winkler，A.A.，Dijke van，J.P.，Pronk，J.T.(2005)“Evolutionary engineering of mixed-sugarutilization by a xylose-fermenting Saccharomyces cerevisiae strain(借助发酵木糖的酿酒酵母菌株的混合糖利用进化工程).”FEMS Yeast Res5：925-934.

Law，C.J.，Maloney，P.C.，Wang，D.N.(2008)“Ins and outs of maj orfacilitator superfamily antiporters(主要易化因子超家族反向转运蛋白的运出和运入).”AnnuRev Microbiol 62：289-305.

Leandro，M.J.，Goncalves，P.，Spencer-Martins，I.(2006)“Twoglucose/xylose transporter genes from the yeast Candida intermedia：firstmolecule characterization of a yeast xylose-H+symporter(来自中间假丝酵母(Candida intermedia)的两个葡萄糖/木糖转运蛋白基因：酵母木糖-H+共运输蛋白(symporter)的首次分子表征).”Biochem J.395：543-549.

Leandro，M.J.，Spencer-Martins，I.，Goncalves，P.(2008)“Theexpression in Saccharomyces cerevisiae of a glucose/xylose symporter fromCandida intermedia is affected by the presence of a glucose/xylosefacilitator(来自中间假丝酵母的葡萄糖/木糖共运输蛋白在酿酒酵母中的表达受葡萄糖/木糖易化因子的存在影响).”Microbiol 154：1646-1655.

Leandro，M.J.，Fonseca，C.，Goncalves，P.(2009)“Hexose and pentosetransport in ascomycetous yeasts：an overview(子囊菌酵母中的己糖和戊糖转运：综述).”FEMS YeastRes 9：511-525.

Lengeler，J.W.，Jahreis，K.(2009)“Bacterial PEP-dependentcarbohydrate：phosphotransferase systems couple sensing and globalcontrol mechanisms(细菌PEP依赖性碳水化合物：磷酸转移酶系统耦合感知和总体控制机制).”Contrib Microbiol 16：65-87.

Lindsay，S.E.，Bothast，R.J.，Ingram，L.O.(1995)“Improved strainsof recombinant Escherichia coli for ethanol production from sugarmixtures(用于从糖混合物产生乙醇的重组大肠杆菌改良菌株).”ApplMicorbiol Biotechnol 43：70-75.

Macpherson，A.J.S.，Jones-Mortimer，M.C.，Horne，P.，Henderson，P.J.F.(1983)“Identification of the GalP galactose Transport protein ofEscherichia coli(鉴定大肠杆菌GalP半乳糖转运蛋白).”J Biol Chem 258：4390-4396.

Marsh，D.，Henderson，P.J.F.(2001)“Specific spin labeling of thesugar-H⁺symporter，GalP，in cell membranes of Escherichia coli；sitemobility and overall rotational diffusion of the protein(大肠杆菌细胞膜中糖-H+共运输蛋白GalP的特异性自旋标记：该蛋白质的位点活动性和总体转动扩散).”Biochim Biophys Acta 1510：464-473.

Martin，G.E.M.，Seamont，K.B.，Brown，F.M.，Shanahan，M.F.，Roberts，P.E.Henderson，P.J.F.(1994)“Forskolin specifically inhibits thebacterial galactose-H+transport protein，GalP(毛喉素特异性抑制细菌半乳糖-H+转运蛋白GalP).”J Biol Chem 269：24870-24877.

Martinez，A.，Grabar，T.B.，Shanmugam，K.T.，Yomano，L.P.York，S.W.，Ingram，L.O.(2007)“Low Salt medium for lactate and ethanolproduction by recombinant Escherichia coli B(用于重组大肠杆菌B产生乳酸和乙醇的低盐培养基).”Biotechnol Lett 29：397-404.

McDonald，T.P.，Walmsley，A.R.，Henderson，P.J.F.(1997)“Asparagine 394in putative helix 11 of the galactose-H+symport protein(GalP)from Escherichia coli is associated with the internal binding site forcytochalasin B and sugar(在来自大肠杆菌的半乳糖-H+共运输蛋白(GalP)的推定性螺旋11中的天冬酰胺394与松胞菌素B和糖的内部结合位点相关).”JBiol Chem 272：15189-15199.

McDonald，T.P.，Henderson，P.J.F.(2001)“Cysteine residues in theD-galactose-H+symport protein of Escherichai coli：effects of mutagenesison transport，reaction with N-ethylmaleimide and antibiotic binding(大肠杆菌D-半乳糖-H+共运输蛋白中的半胱氨酸残基：诱变对转运、与N-乙基马来酰亚胺反应和抗生素结合的影响).”Biochem J353：709-717.

Nichols，N.N.，Dien，B.S.，Bothast，R.J.(2001)“Use of cataboliterepression mutants for fermentation of sugar mixtures to ethanol(分解代谢物阻遏突变体用于发酵糖混合物成乙醇的用途).”ApplMicrobiolBiotechnol56：120-125.

Pao，S.S.，Paulsen，I.T.，Saier Jr，M.H.(1998)“Maj or facilitatorsuprefamily(主要易化因子超家族).”Microbiol Mol Bio Rev 62：1-34.

Patching，S.G.，Henderson，P.J.，Herbert，R.B.，Middleton，D.A.(2008)“olid-state NMR spectroscopy detects interactions betweentryptophan  residues  of the E.coli sugar transporter GalP and thealpha-anomer of the D-glucose substrate(固态NMR光谱学检测大肠杆菌糖转运蛋白GalP的色氨酸残基和D-葡萄糖底物的α-异头物之间的相互作用).”JAmChem Soc 130：1236-1244.

Patching，S.G.，Psakis，G.，Baldwin，S.S.，Baldwin，J.，Henderson，P.J.，Middleton，D.A.(2008)“Relative substrate affinities of wild-type andmutant forms of the Escherichia coli sugar transporter GalP determinedby solid-state NMR(由固态NMR测定的大肠杆菌糖转运蛋白GalP野生型和突变体形式的相对底物亲和力).”Mol Membr Biol 25：474-484.

Qaidl，S.E.，Allemand，F.，Oberto，J.，Plumbridge，J.(2009)“Repression of galP，the galactose transporter in Escherichia coli，requiresthe specific regulator of N-acetylglucosamine metabolism(大肠杆菌中半乳糖转运蛋白galP的阻遏需要N-乙酰葡糖胺代谢的特异性调节物).”MolMicrobiol 71：146-157.

Runquist，D.，Fonseca，C.，Radstrom，P.，Spencer-Martins，I.，Hahn-Hagerdal，B.(2009)“Expression of the Gxf1 transporter fromCandida intermdia improves fermentation performance in recom binantxylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae(表达来自中间假丝酵母的Gxf1转运蛋白改善了利用木糖的重组酿酒酵母中的发酵性能).”Appl MicrobiolBiotechnol 82：123-130.

Saier，M.H.Jr.，Bromberg，F.G.，Roseman，S.(1973)“Cha ra cterization of constitutive galactose permease mutants inSalmonella typhimurium(表征鼠伤寒沙门氏菌中的组成型半乳糖通透酶突变体).”J Bacteriol 113：512-514.

Saloheimo，A.，Rauta，J.，Stasyk，O.V.，Sibirny，A.A.，Penttila，M.，Ruohonen，L.(2007)“采用表达异源和同源通透酶的利用木糖的酿酒酵母菌株研究木糖转运.”Appl Microbiol Biotechnol 74：1041-1052.

Sanchez，A.M.，Bennett，G.N.，San，K.Y.(2005)“Efficient succinateproduction from glucose through over expression of pyruvate carboxylasein an Escherichia coli alcohol dehydrogenase and lactate dehydrogenasemutant(通过在大肠杆菌醇脱氢酶和乳酸脱氢酶突变体中过量表达丙酮酸羧化酶从葡萄糖高效产生琥珀酸).”Biotechnol Prog 21：358-365.

Sasaki，M.，Jojima，T.，Inui，M.，Yukawa，H.(2008)“Simultaneousutilization of D-cellobiose，D-glucose，and D-xylose by recombinantCorynebacterium glutamicum under oxygen-deprived conditions(在缺氧条件下通过重组谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)同时利用D-纤维二糖、D-葡萄糖和D-木糖).”Appl Microbiol Biotechnol 81：691-699.

Sedlak，M.，Ho，N.W.(2004)“Characterization of the effectiveness ofhexose transporters for transporting xylose during glucose and xyloseco-fermentation by a recombinant Saccharomyces yeast(表征重组酵母属酵母共发酵葡萄糖和木糖期间用于转运木糖的己糖转运蛋白的有效性).”Yeast 21：671-684.

Soberon，X.，Saier Jr，M.H.(2006)“Engineering transport proteinfunction：theoretical and technical consideratios using thesugar-transporting phosphotransferase system of Escherichia coli as amodel system(工程化转运蛋白功能：使用大肠杆菌糖转运磷酸转移酶系统作为模型系统的理论和技术考虑).”J Mol Microbiol Biotechnol 11：302-307.Trinh，C.T.，Unrean，P.，Sriene，F.(2008)“(Minimal Escherichia colicell for the most efficient production of ethanol from hexoses and pentoses)用于从己糖和戊糖最高效产生乙醇的最小大肠杆菌细胞.”App EnvironMicrobiol 74：3634-3643.

Venter，H.，Ashcroft，A.E.，Keen，J.N.，Henderson，P.J.F.，Herbert，R.B.(2002)“Molecular dissection of membrane-transport proteins：massspectrometry and sequence determination of the galactose-H+symportprotein，GalP of Escherichai coli and quantitative assay of theincorporation of[ring-2-¹³C]histidine and¹⁵NH₃(膜转运蛋白的分子剖析：大肠杆菌半乳糖-H+共运输蛋白GalP的质谱和序列测定和掺入[环-2-¹³C]组氨酸和¹⁵NH₃的定量分析).”Biochem J 363：243-252.

Wahlbom，C.F.，Otero，R.C.，Zyl van，W.H.，Hahn-Hagerdal，B.，Jonsson，L.J.(2003)“Molecular analysis of a Saccharomyces cerevisaemutant with improved ability to utilize xylose shows enhanced expressionof proteins involved in transport，initial xylose metabolism，and the pentosephosphate pathway(分子分析具有改进的木糖利用能力的酿酒酵母突变体显示，参与转运、初始木糖代谢和磷酸戊糖途径的蛋白质的表达增强).”App Environ Microbiol 69：740-746.

Wang，Q.，Wu，C.，Chen，T.，Chen，X.，Zhao，X.(2006)“Expression ofgalactose permease and pyruvate carboxylase in Escherichiacoli ptsGmutant increases the growth rate and succinate yiled under anaerobicconditions(在大肠杆菌ptsG突变体中表达半乳糖通透酶和丙酮酸羧化酶增加缺氧条件下的生长速率和琥珀酸产率).”Biotechnol Lett 28：89-93.

Yi，J.，Drathas，K.M.，Frost，J.W.(2003)“Altered glucose transportand shikimate pathway product yields in E.coli(大肠杆菌中改变的葡萄糖转运和莽草酸途径产物产量).”Biotechnol Prog 19：1450-1459.

Zhang，X.，Jantama，K.，Moore，J.C.，Jarboe，L.R.，Shanmugam，K.T.，Ingram，L.O.(2009)“Metabolic evolution of energy-conservingpathways for succinate production in Escherichia coli(用于大肠杆菌中琥珀酸生产的能量保守途径的代谢进化).”Proc Natl Acad Sci USA 106：20180-20185.

Claims (26)

1.一种包含在半乳糖共运输蛋白(galP)基因中的突变的分离的大肠杆菌细菌细胞，其中所述细菌细胞包含降低PEP依赖性磷酸转移酶系统活性的至少一个突变且同时利用C5糖和C6糖以产生选自乙醇、丁醇、乳酸盐、琥珀酸盐、延胡索酸盐和苹果酸盐的工业有用的化学品，并且在galP基因中的所述突变包含用天冬氨酸残基替换在第297位置处的甘氨酸残基。

2.一种包含在galP基因中的突变的分离的大肠杆菌细菌细胞，其中所述细菌细胞包含降低PEP依赖性磷酸转移酶系统活性的至少一个突变且同时利用C5糖和C6糖以产生选自乙醇、丁醇、乳酸盐、琥珀酸盐、延胡索酸盐和苹果酸盐的工业有用的化学品，并且galP基因中的所述突变是缺失。

3.根据权利要求1所述的分离的大肠杆菌细菌细胞，还包含增加至少一个非PTS糖转运蛋白活性的至少一个突变。

4.根据权利要求3所述的分离的大肠杆菌细菌细胞，其中所述非PTS糖转运蛋白是ATP结合盒转运蛋白。

5.根据权利要求3所述的分离的大肠杆菌细菌细胞，其中所述非PTS糖转运蛋白是主要易化因子超家族的成员。

6.根据权利要求1所述的分离的大肠杆菌细菌细胞，还包含使参与发酵途径的一个或多个基因的表达失活的至少一个突变。

7.根据权利要求1所述的分离的大肠杆菌细菌细胞，还包含使与三羧酸循环有关的一个或多个基因失活的至少一个突变。

8.根据权利要求1所述的分离的大肠杆菌细菌细胞，还包含在至少一个下述基因中的突变，所述基因选自编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因、编码NADH依赖性苹果酸酶的基因和编码NADPH依赖性苹果酸酶的基因。

9.根据权利要求1所述的分离的大肠杆菌细菌菌株，还包含外源丙酮酸羧化酶。

10.根据权利要求9所述的分离的大肠杆菌细菌菌株，其中所述丙酮酸羧化酶来自乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)或高粱(Sorghum vulgare)或埃特里根瘤菌(Rhizobium etli)。

11.根据权利要求1所述的分离的大肠杆菌细菌细胞，还包含增加的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性。

12.根据权利要求11所述的分离的大肠杆菌细菌细胞，其中增加的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性水平因pck基因中的突变的引起。

13.根据权利要求12所述的分离的大肠杆菌细菌细胞，其中所述突变在所述pck基因的启动子区内。

14.一种用于微生物产生有机二羧酸的方法，包括：

a.提供具有galP基因中突变的分离的大肠杆菌细菌细胞，其中所述细菌细胞包含降低PEP依赖性磷酸转移酶系统活性的至少一个突变且同时利用C5糖和C6糖以产生选自乙醇、丁醇、乳酸盐、琥珀酸盐、延胡索酸盐和苹果酸盐的工业有用的化学品，并且在galP基因中的所述突变包含用天冬氨酸残基替换在第297位置处的甘氨酸残基；

b.在含有戊糖和己糖这两者的培养基中培养步骤(a)的细菌细胞；和

c.从培养基回收有机二羧酸。

15.根据权利要求2所述的分离的大肠杆菌细菌细胞，还包含增加至少一个非PTS糖转运蛋白活性的至少一个突变。

16.根据权利要求15所述的分离的大肠杆菌细菌细胞，其中所述非PTS糖转运蛋白是ATP结合盒转运蛋白。

17.根据权利要求15所述的分离的大肠杆菌细菌细胞，其中所述非PTS糖转运蛋白是主要易化因子超家族的成员。

18.根据权利要求2所述的分离的大肠杆菌细菌细胞，还包含使参与发酵途径的一个或多个基因的表达失活的至少一个突变。

19.根据权利要求2所述的分离的大肠杆菌细菌细胞，还包含使与三羧酸循环有关的一个或多个基因失活的至少一个突变。

20.根据权利要求2所述的分离的大肠杆菌细菌细胞，还包含在至少一个下述基因中的突变，所述基因选自编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因、编码NADH依赖性苹果酸酶的基因和编码NADPH依赖性苹果酸酶的基因。

21.根据权利要求2所述的分离的大肠杆菌细菌菌株，还包含外源丙酮酸羧化酶。

22.根据权利要求21所述的分离的大肠杆菌细菌菌株，其中所述丙酮酸羧化酶来自乳酸乳杆菌或高粱或埃特里根瘤菌。

23.根据权利要求2所述的分离的大肠杆菌细菌细胞，还包含增加的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性。

24.根据权利要求23所述的分离的大肠杆菌细菌细胞，其中增加的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性水平因pck基因中的突变的引起。

25.根据权利要求24所述的分离的大肠杆菌细菌细胞，其中所述突变在所述pck基因的启动子区内。

26.一种用于微生物产生有机二羧酸的方法，包括：

a.提供具有galP基因中突变的分离的大肠杆菌细菌细胞，其中所述细菌细胞包含降低PEP依赖性磷酸转移酶系统活性的至少一个突变且同时利用C5糖和C6糖以产生选自乙醇、丁醇、乳酸盐、琥珀酸盐、延胡索酸盐和苹果酸盐的工业有用的化学品，并且在galP基因中的所述突变是缺失；

b.在含有戊糖和己糖这两者的培养基中培养步骤(a)的细菌细胞；和

c.从培养基回收有机二羧酸。