CN107177540A - 从经基因改造的微生物生产黏康酸 - Google Patents

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Abstract

本发明处于使用生物催化剂生产可再生化学原料的领域，该生物催化剂已经经基因改造增加了其将可再生碳源转化成有用化合物的能力。更具体而言，本发明提供利用基因修饰的生物体生产黏康酸形式的可再生碳源的方法。

Description

从经基因改造的微生物生产黏康酸
本申请是申请日为2013年1月29日的、发明名称为“从经基因改造的微生物生产黏康酸”的中国专利申请201380017560.1(PCT/US2013/023690)的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2012年1月30日提交的美国临时申请系列号61/632,777的优先权益。
发明领域
本发明处于使用生物催化剂生产可再生化学原料的领域，该生物催化剂已经经基因改造增加了其将可再生碳源转化成有用化合物的能力。更具体而言，本发明提供利用基因改造的生物催化剂从可再生碳源生产黏康酸异构体的方法。
发明背景
己二酸是在尼龙66的制造中使用的大量化学品。己二酸目前是由石化产品制备，但合成并不是环境友好的(Niu等人，2002)。备选地，己二酸可以由黏康酸的三种异构体(顺，顺；顺，反；反，反)中的任一者经化学氢化作用制得。通过用微生物进行发酵从可再生资源生产黏康酸、接着氢化成己二酸将会是令人合意的，因为这样的至己二酸的途径将比传统的石化途径更加环境友好。
目前针对微生物生产黏康酸的努力可以分组到三个类别，即：(1)用于黏康酸生产的芳族降解通路，其中供给多种芳族化合物，且芳族化合物的苯环部分氧化切割而打开；(2)黏康酸盐积累(buildup)通路，其中黏康酸骨架从多种C2、C3、C4化合物或赖氨酸形成；和(3)芳族氨基酸生物合成黏康酸通路，其中黏康酸从3-脱氢莽草酸盐(3-dehydroshikimate)形成，所述3-脱氢莽草酸盐是许多生物体中芳族氨基酸生物合成通路中的中间体。
许多微生物能够利用这样的通路来降解含有苯环的芳族化合物例如苯酚、儿茶酚和苯甲酸，该通路切割芳环得到非芳族化合物的终末化合物或中间体化合物，例如顺，顺-黏康酸、或3-羧基-顺，顺-黏康酸(Niu等人，2002；Perez-Pantoja等人，2008)。过去，许多小组已经尝试开发微生物以工业水平生产顺，顺-黏康酸的能力(Mizuno等人，1988；Yoshikawa等人，1990；Choi等人，1997)。在1980年代末，美国的Celgene Corporation和日本的Mitsubishi Chemical Industries分别积极研发从甲苯和苯甲酸制造黏康酸的方法，这由该领域中多项已授权的美国专利和日本专利所证实。
多种微生物已经被报道为利用甲苯、苯甲酸、苯或儿茶酚生产顺，顺-黏康酸。例如，以儿茶酚作为碳源，利用表达catA基因的重组大肠杆菌(E.coli)细胞可以以近乎100％的摩尔转化产率实现顺，顺-黏康酸生产，所述catA基因编码作为生物催化剂负责催化儿茶酚的邻位切割的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)mt-2儿茶酚1,2-双加氧酶(Kaneko等人，2011)。利用该体系用于连续生产黏康酸的生物反应器已有过记载。
利用环状C6碳化合物进行顺，顺-黏康酸的微生物生产的此方法从未在商业上实现；然而，在理解用于微生物中的黏康酸生产的降解通路中的酶的功能作用方面有着持续的学术兴趣。
近来公开的国际专利申请(WO 2011/017560)要求保护具有黏康酸盐通路的生物催化剂和利用这些生物催化剂来生产黏康酸的方法。简而言之，这件公开的专利申请公布了四种不同的生产黏康酸的通路。第一种用于黏康酸生产的通路以琥珀酰-CoA和乙酰-CoA起始。第二种用于黏康酸生产的通路以丙酮酸和丙二酸半醛起始。第三种用于黏康酸生产的通路以丙酮酸和琥珀酸半醛起始。第四种用于黏康酸生产的通路以赖氨酸起始。在此专利申请中提出的所有这些用于黏康酸生产的通路都是基于计算机建模，而这些生物催化剂究竟能否产生为具备商业上可接受的黏康酸生产力和产率还有待观察。
利用基因改造的大肠杆菌体系的得到顺，顺-黏康酸的发酵途径已经记载于科学文献(Niu等人，2002)和专利文献(US 5,616,496；US 5,487,987；WO 2011/085311 A1)中，但现有技术方法在用于大规模商业生产从而有经济吸引力的滴度、产率和适用性方面需要实质改进。已有两例经基因改造以从葡萄糖生产顺，顺-黏康酸的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)酵母菌的报道，但公开的滴度仅为1.5mg/l和140mg/l(Weber等人，2012；Curran等人，2012)。在这些滴度下，这些酵母方法对于商业生产无一有吸引力。本发明描述了通过在用于大规模商业生产的适用性方面与领域内已知的公开方法相比有实质改进的发酵来生产顺，顺-黏康酸或顺，反-黏康酸的方法。
本文公开的本发明的目的之一是利用适用于大规模商业生产的基因改造的生物体，通过微生物发酵来生产顺，顺-黏康酸，该发酵起始于可再生的非芳族碳源例如糖或其它可源自光合作用植物的简单的碳化合物。
在2002年，Niu等人公开了这样的生产己二酸的“无苯”途径，其利用发酵方法生产顺，顺-黏康酸，然后是催化化学方法将顺，顺-黏康酸转化成己二酸。该方法获得专利权，但据本发明人所知，该方法尚未商业化(US 5,487,987；US 5,616,496)。此公开方法的发酵部分利用基因改造的大肠杆菌菌株，其最佳者命名为WN1/pWN2.248。该通路利用天然的芳族氨基酸生物合成通路(也称为“莽草酸通路”、“莽草酸盐通路”、“分支酸酯通路”、“共同芳族通路”、“中心芳族通路”，或简单地为“芳族通路”，部分示于图1中)的一部分。在此说明书中，在供给至生物体的碳源(如葡萄糖)下游的、和直接或间接通向分支酸的任何生化步骤被视为莽草酸通路的一部分，包括，例如由Glf、Glk、Zwf、TktA、TalB和Pps催化的步骤。此外，该公开的方法利用三种异源的酶，所述异源的酶经由中间体原儿茶酸和儿茶酚将3-脱氢莽草酸盐(芳族通路中的中间体)转化成顺，顺-黏康酸。改造的宿主菌株是大肠杆菌K-12的衍生物，其具有aroE353，serA::(aroB,aroZ)，lacZ::(tktA,aroZ)基因型，其中aroB编码3-脱氢奎尼酸合酶(以下称为AroB)，tktA编码转酮醇酶，且aroZ是来自肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)的编码3-脱氢莽草酸脱水酶(以下称为“AroZ”)的异源的基因。该改造的菌株含有多拷贝质粒pWN2.248，其衍生自pBR322且含有用于表达catA、catX、aroY、aroF(反馈抗性的)、serA、lacIq和氨苄青霉素抗性的基因盒。异源的基因catA和catX来自乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)且编码儿茶酚1,2-双加氧酶(以下称为“CatA”)和功能未知的可能增强CatA活性的蛋白(“CatX”)。在文献中，catX基因也称为“orf1”(Neidle和Ornston，1986)。在本专利说明书中，我们要将来自不动杆菌属(Acinetobacter)的catA加catX基因对称为“catAX.”。异源基因aroY来自肺炎克雷伯杆菌且编码原儿茶酸脱羧酶(以下称为“AroY”)。
与上述授权专利相关的较新的专利申请已经公开(WO 2011/085311 A1)。在此申请中，利用同样的上述菌株WN1/pWN2.248来生产顺，顺-黏康酸，其随后被异构化成顺，反-黏康酸。
然而，菌株WN1/pWN2.248并不能良好地适用于大规模商业生产，因此对于更加改进的方法有需求。本发明提供用于顺，顺-黏康酸的发酵生产的改进的生物催化剂。
WO 2011/085311 A1中记载的方法具有数个其它特征，这些特征使得不能实现商业大规模实施。顺，顺-黏康酸的发酵生产中使用的生物催化剂WN1/pWN2.248中所包含的aroE353突变的发挥作用以阻断碳流入莽草酸盐通路的较下部分，从而使进入得到顺，顺-黏康酸的期望通路的碳流最大化。但aroE突变是“无效”突变(使基因对于所有实际目的都失活的突变)，其具有将菌株变成芳族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)和芳族维生素或莽草酸盐通路产生的维生素样中间体(对羟基苯甲酸、对氨基苯甲酸和2,3-二羟基苯甲酸)的营养缺陷型的作用。芳族氨基酸相对昂贵，并且其需求将会对生产顺，顺-黏康酸的成本增加大量负担。因此，对于不需要向生产介质中添加这些昂贵的营养素的方法也存在需求。
与目前可得的用于生产顺，顺-黏康酸的生物催化剂相关的再一问题涉及到维持多拷贝质粒以表达一些必需基因的需求(Niu等人，2002)。多拷贝质粒经常太不稳定而不能用于大规模工业方法。而且，质粒上基因中的至少一个从启动子Ptac表达，其需要异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)或乳糖来诱导，而这两种化学品对于允许在经济上有吸引力的方法而言太过昂贵。因此，对于具有稳定整合到生产菌的染色体中的表达盒的更稳定菌株存在需求，并且对于从组成型启动子高水平表达从而减轻对用于启动子的化学诱导物的需求也存在需求。
发明概述
本发明提供从非芳族碳源开始生产顺，顺-黏康酸的基因改造的微生物。该基因改造微生物不需要包含任何外源质粒以生产黏康酸，尽管它们具有某些实现期望的表型所必需的外源或异源基因。引入到微生物中的外源基因稳定地整合到染色体DNA中。作为外源基因的此染色体DNA整合的结果，使用抗生素或其它选择性方法以维持携带外源DNA的质粒的需求全部消除。此外，使用不需要化学诱导物的强启动子来表达从碳源如葡萄糖至顺，顺-黏康酸的通路所必需的基因。
在本发明的一个实施方案中，芳族氨基酸生物合成的负调节物的活性受基因操纵。在本发明的一个方面，负调节物TyrR的活性通过控制编码TyrR蛋白的tyrR基因的表达而实质降低。在本发明的另一方面，负调节物TyrR的活性通过将来自微生物的染色体DNA的tyrR基因缺失或失活而完全消除。
在本发明的另一实施方案中，因某些代谢物引起的芳族氨基酸通路中某些酶的反馈抑制通过基因操纵而克服。在大多数野生型大肠杆菌菌株中，脱氧阿拉伯-庚酮糖酸7-磷酸(DAHP)合酶作为已知由三种不同基因即aroG、aroF和aroH编码的三种不同的异构酶出现。由该三种基因中的每种编码的蛋白受到负责芳族氨基酸生物合成的莽草酸通路的一种或多种代谢物的反馈抑制。在本发明的一个方面，野生型aroG基因被修饰的aroG基因取代，所述修饰的aroG基因编码抵抗微生物细胞中芳族氨基酸通路的一种或多种代谢物的反馈抑制的AroG蛋白。在本发明的另一方面，野生型aroF基因被这样的aroF基因取代，所述aroF基因编码抵抗微生物细胞中芳族氨基酸通路的一种或多种代谢物的反馈抑制的AroF蛋白。在本发明的另一方面，野生型aroH基因被这样的aroH基因取代，所述aroH基因编码抵抗微生物细胞中芳族氨基酸通路的一种或多种代谢物的反馈抑制的AroH蛋白。在本发明的另一实施方案中，选择用于顺，顺-黏康酸的商业生产的生物催化剂可以具有多于一种的抵抗脱氧阿拉伯-庚酮糖酸7-磷酸(DAHP)合酶的反馈的异构酶。
在本发明的另一实施方案中，通过在微生物细胞中的芳族氨基酸通路参与到碳流中的一种或多种酶的活性被增强。在本发明的一个方面，参与到芳族氨基酸通路和/或黏康酸通路的运转中的一种或多种酶的活性的增强通过基因操纵而实现。在本发明的优选实施方案中，一种或多种编码酶或蛋白AroF、AroG、AroH、AroB、TktA、TalB、AroZ、QutC、qa-4、asbF、QuiC、AroY、Rpe、Rpi、Pps、CatA和CatX或其同源物或类似物的基因的表达被增强，导致增强的所述酶的活性。Rpe是核酮糖-5-磷酸差向异构酶，Rpi是核酮糖-5-磷酸异构酶，且Pps是磷酸烯醇丙酮酸合成酶(Neidhardt和Curtiss，1996)。如果宿主菌株是酵母(如酿酒酵母)，或丝状真菌(如粗糙脉孢菌(Neurospora crassa))，数种催化莽草酸盐通路中的反应的酶可以组合成一个大蛋白或多肽，称为Aro1p，在酿酒酵母情形中由ARO1基因编码。Aro1p组合了AroB、AroD、AroE、AroK(或AroL)和AroA的功能。这样，出于本发明的目的，Aro1p和ARO1或其部分可以作为AroB、AroD、AroE、AroK和/或AroA的替代物使用、或者在AroB、AroD、AroE、AroK和/或AroA之外使用。
在本发明的另一实施方案中，细菌细胞中经由赤藓糖-4-磷酸的通量通过过表达戊糖磷酸通路的运转中的酶而增强。在本发明的一个方面，由talB或talA基因编码的转醛醇酶的超量产生被工程化。在本发明的另一方面，编码转醛醇酶和转酮醇酶的基因的表达均通过基因操纵而增强。在本发明的另一方面，编码核酮糖-5-磷酸差向异构酶和核酮糖-5-磷酸异构酶之一或二者的基因的表达通过基因操纵而增强。
在本发明的另一实施方案中，可用于芳族氨基酸通路的运作的PEP(磷酸烯醇丙酮酸)通过基因操纵而增加。在本发明的一个方面，对PEP池的竞争通过以用于葡萄糖摄取的PEP独立性体系消除和/或补偿用于葡萄糖摄取的PEP依赖性磷酸转移酶体系(PTS)而降低。在本发明的另一实施方案中，PEP的可得性通过增加编码PEP合成酶的基因如pps的表达而增加。
附图简介
图1.大肠杆菌中用于芳族氨基酸生物合成的通路。
图2.大肠杆菌中用于黏康酸生产的通路。
图3.显示用于全部黏康酸和生化中间体的HPLC分析的标准物的色谱。
图4.显示用于黏康酸异构体的HPLC分析的标准物的色谱。
图5.在用质粒pCP32AMP、pCP14和pCP54转化的大肠杆菌菌株MYR34中生产DHS的滴度。大肠杆菌的MYR34菌株具有aroE基因缺失。质粒pCP32AMP表达编码DAHP合酶的aroG基因。质粒pCP14表达编码DHQ合酶的aroB基因。质粒pCP54表达aroB和aroG基因二者。
图6.在用质粒pCP32AMP和pCP54转化的大肠杆菌菌株MYR34和MYR170中生产DHS的滴度。大肠杆菌的MYR34菌株具有aroE基因缺失。MYR170菌株具有aroE基因缺失和在宿主染色体DNA的ack基因座处整合的处于P15启动子控制下的aroB基因的第二拷贝。质粒pCP32AMP表达编码DAHP合酶的aroG基因。质粒pCP54表达aroB和aroG基因二者。
图7.在仅用质粒pMG37或用pMG37和pCP32AMP质粒二者转化的大肠杆菌菌株MYR34和MYR170中生产顺，顺-黏康酸的滴度。大肠杆菌MYR34菌株具有aroE基因缺失。MYR170菌株具有aroE基因缺失和在宿主染色体DNA的ack基因座处整合的处于P15启动子控制下的aroB基因的第二拷贝。质粒pCP32AMP表达编码DAHP合酶的aroG基因。质粒pMG37表达编码在黏康酸通路中起作用的蛋白的aroZ、aroY和catAX基因。
图8.在仅用表达aroG基因的质粒(pCP32AMP)或同时表达aroG和tktA基因的质粒(pCP50)转化的大肠杆菌MYR170菌株中生产DHS的滴度。MYR170菌株具有aroE基因缺失和在宿主染色体DNA的ack基因座处整合的处于P15启动子控制下的aroB基因的第二拷贝。
图9.来自用质粒pCP32AMP和pCP50转化的大肠杆菌MYR34和MYR170菌株的DHS产率。DHS产率计算为每克消耗的葡萄糖所产生的DHS克数。质粒pCP32AMP表达aroG基因，而pCP50表达aroG和tktA。细菌菌株MYR34具有aroE基因缺失。大肠杆菌MYR170菌株衍生自MYR34且具有在染色体DNA上的ack基因座处整合的额外的aroB基因。
图10.来自用质粒pCP32AMP和pCP50转化的大肠杆菌MYR170和MYR261菌株的DHS滴度。质粒pCP32AMP表达aroG基因，而pCP50表达aroB和tktA基因。MYR170菌株具有aroE基因缺失和在宿主染色体DNA的ack基因座处整合的处于P15启动子控制下的aroB基因的第二拷贝。大肠杆菌MYR261菌株衍生自大肠杆菌MYR170菌株。大肠杆菌MYR261菌株具有在染色体DNA的poxB基因座处整合的tktA基因的第二拷贝及其天然启动子。
图11.大肠杆菌菌株MYR170、MYR261和MYR305中的黏康酸和乙酸生产，这些菌株转化有表达编码莽草酸生物合成通路中的DAHP合酶的aroG的质粒pCP32AMP和表达编码在黏康酸通路中起作用的蛋白的aroZ、aroY和catAX基因的质粒pMG37。MYR170菌株具有aroE基因缺失和在宿主染色体DNA中ack基因座处插入的处于P15启动子控制下的aroB基因的额外拷贝。MYR261和MYR305是MYR170菌株的衍生物。MYR261具有在宿主染色体DNA上的poxB基因座处整合的tktA基因的额外拷贝，而MYR305在宿主染色体DNA上的poxB基因座处具有缺失
图12.由大肠杆菌菌株MYR34产生的内源性DHS向黏康酸的转化。大肠杆菌MYR34菌株在编码莽草酸脱氢酶的aroE基因中具有缺失。因此，存在DHS的积累。当MYR34菌株用表达在黏康酸通路中起作用的蛋白的编码基因aroZ、aroY和catAX的质粒转化时，DHS转化成黏康酸。然而，当用无任何外源基因的空质粒载体(pCL1921)转化MYR34菌株时，没有出现DHS转化成黏康酸。
图13.aroZ同源物将DHS转入黏康酸通路中的能力的比较。将三种不同的aroZ同源物，即来自不动杆菌属物种ADP1的quiC、来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的asbF和来自粗糙脉孢菌的qa-4克隆到还分别自P15和λPR启动子表达catAX和aroY基因的低拷贝质粒中P26启动子下。通过转化使这三种不同的质粒构建体在MYR34中表达，并测量所产生的黏康酸的量。
图14.将单拷贝的catAX、aroY和quiC染色体整合到大肠杆菌MYR170菌株(ΔaroE,Δack::P15-aroB)中，产生MYR352(SEQ ID No.41)。还用携带黏康酸通路运作所需的所有基因的低拷贝质粒pMG37转化MYR170，得到MYR219菌株。用YEp24(中拷贝的空载体)或pCP32AMP(中拷贝的aroG表达质粒)或pCP50(中拷贝aroG和tktA表达质粒)转化MYR352和MYR219，并使用HPLC方法对产生的PCA、儿茶酚和黏康酸的量进行定量。
图15.通过增加catAX的表达来去除MYR352中的儿茶酚积累。对MYR352转化仅表达aroY的质粒(pMG27)或仅表达quiC的质粒(pMG39)或表达所有三种黏康酸通路基因即catAX、aroY和quiC的质粒(pMG37)或仅表达黏康酸通路中的两种基因即catAX和aroY的质粒(pMG33)。仅catAX的过表达足以防止儿茶酚积累。
图16.利用不同体系输入葡萄糖的菌株的生长。ptsHI和galP(MYR31)的缺失导致在基本葡萄糖培养基中生长不足，而安置glf和glk基因(MYR217)挽回生长。对照菌株MYR34是ΔaroE，否则则是野生型。向培养基中添加三种芳族氨基酸和三种芳族维生素以允许营养缺陷型菌株的生长。
图17.大肠杆菌MYR34和MYR217菌株中的DHS生产。当用导致DHS生产的质粒转化时，利用glf-glk用于葡萄糖输入的MYR217较之利用磷酸转移酶体系(PTS)的MYR34的转化子产生更高滴度的DHS。
图18.在7升发酵罐中以大肠杆菌MYR428菌株进行的黏康酸生产。对用质粒pCP32AMP和pMG37转化具有ΔaroEΔackA::P15-aroBΔpoxB::tktA基因型的大肠杆菌MYR261菌株以产生大肠杆菌MYR428菌株。
优选实施方式详述
如本专利申请中所用，短语“例如”或“如”意指对于当下主题存在多于一种的方法、途径、方案或物质组成，且给出的实例并不意在局限于该实例。
术语“异源的”是指并非在生物体中天然或原生发现、但可以通过基因改造如通过转化、交配或转导而引入到生物体中的基因或蛋白。异源基因可以整合(插入)到染色体中或包含于质粒上。术语“外源的”是指出于提高、降低或消除活性的目的通过基因改造如通过转化、交配、转导或突变已经引入到生物体中或在生物体中改变的基因或蛋白。外源基因或蛋白可以是异源的，或者其可以是对于宿主生物体为原生但通过一种或多种方法例如突变、缺失、改变启动子、改变终止子、重复或者在染色体或质粒中插入一个或多个额外拷贝而改变的基因或蛋白。因此，例如，如果在染色体中在与原生位点不同的位点处插入aroB基因的第二拷贝，第二拷贝将是外源性的。
如本发明中所用的术语“微生物”包括可通过发酵方法用于顺，顺-黏康酸的商业生产的细菌、古细菌、酵母、藻类和丝状真菌。
对于命名法，基因或编码区通常以斜体的小写字母命名，例如“aroZ”，而由基因所编码的酶或蛋白可以以相同的字母命名但第一个字母大写且不斜体，例如“AroZ”或“Aro1p”，后者为在酵母中使用的用于指示酶或蛋白的惯例的实例。“p”是由所指示的基因编码的蛋白的缩写。酶或蛋白也可以用更加描述性的名称指代，例如，AroZ也可以指代3-脱氢莽草酸脱水酶。编码具有特定催化活性的酶的实例之一的基因或编码区可以因历史不同起源或因为基因来源于不同种类而具有数种不同的名称。例如，编码苏云金芽孢杆菌或炭疽杆菌(Bacillus anthracis)的3-脱氢莽草酸脱水酶的基因可命名为asbF而非aroZ，来自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的相关基因可命名为qutC，来自粗糙脉胞杆菌的相关基因可命名为qa-4，而来自贝氏不动杆菌(Acinetobacter baylyi)(也称为乙酸钙不动杆菌和不动杆菌属物种ADP1)的相关基因可命名为quiC。
“质粒”意指实质地小于染色体、与微生物的一个或多个染色体分开且独立于一个或多个染色体进行复制的环状或线性DNA分子。“质粒”可以以每细胞约一拷贝或以每细胞多于一个的拷贝存在。将质粒维持在微生物细胞中通常需要抗生素选择，但也可使用营养缺陷型互补。
如本发明中所用的术语“染色体”或“染色体DNA”在细菌细胞的环境下是实质地大于质粒且不需要任何抗生素选择的环状DNA分子。
“表达盒”意指这样的DNA序列，其可以是染色体或质粒的一部分，并且其含有至少启动子和编码酶或其它蛋白的基因或区域，从而使编码区由启动子表达，且含有该DNA序列的宿主细胞产生该酶或蛋白。“表达盒”可以是至少部分合成的或通过基因工程方法构建，从而使编码区从并非与编码区天然关联的启动子表达。任选地，“表达盒”可含有转录终止子，其可以是或者可以不是与编码区天然关联的终止子。“表达盒”可以具有针对多于一个蛋白的编码区，在这种情况下其可称为操纵子或合成操纵子。
基因或编码区的“过表达”意指致使在相同或相似的生长条件下由该基因或编码区编码的酶或蛋白以高于宿主微生物野生型形式中所见水平的水平在宿主微生物中产生。这可以通过例如一种或多种以下方法而实现：1)安置更强的启动子，2)安置更强的核糖体结合位点，如5’-AGGAGG的DNA序列，使其位于翻译起始密码子上游约四至十个碱基的位置，3)安置终止子或更强的终止子，4)改善对编码区中一个或多个位点处的密码子的选择，5)改善mRNA稳定性，和6)提高基因的拷贝数，通过在染色体中引入多个拷贝或是在多拷贝质粒上放置盒。由过表达的基因产生的酶或蛋白被称为“超量产生的”。“过表达的”基因或“超量产生的”蛋白可以是对于宿主微生物原生的基因或蛋白，或者其可以是已通过基因工程方法从不同的生物体移植到宿主微生物中的基因或蛋白，在这种情况下酶或蛋白以及编码该酶或蛋白的基因或编码区被称为“外来的”或“异源的”。外来的或异源的基因和蛋白按定义是过表达和超量产生的，因为它们在未经改造的宿主生物体中不存在。
第一基因、DNA序列或蛋白的“同源物”是执行与所述第一基因、DNA序列或蛋白相似的生物学功能，且经用于序列比较的BLAST计算机程序所测定(Altschul等人，1990；Altschul等人，1997)与所述第一基因或蛋白具有至少25％的序列同一性(当比较蛋白序列或比较从基因序列得到的蛋白序列时)，并允许缺失和插入的第二基因、DNA序列或蛋白。大肠杆菌aroG基因的同源物实例会是来自鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的aroG基因。
第一基因、DNA序列或蛋白的“类似物”是执行与所述第一基因、DNA序列或蛋白相似的生物学功能，且经用于序列比较的BLAST计算机程序所测定(Altschul等人，1990；Altschul等人，1997)与所述第一基因、DNA序列或蛋白具有少于25％的序列同一性(当比较蛋白序列或比较从基因序列得到的蛋白序列时)，并允许缺失和插入的第二基因、DNA序列或蛋白。肺炎克雷伯杆菌AroZ蛋白的类似物的实例会是来自构巢曲霉的QutC蛋白，因为两种蛋白都是催化3-脱氢莽草酸脱水酶反应的酶，但在两种酶或其各自的基因之间没有显著的序列同源性。本领域中有见解的科学家将会知晓，在许多不同的生物体中可以找到许多具有特定生物学功能的酶和蛋白，如DAHP合酶或3-脱氢莽草酸脱水酶，它们或是作为同源物或是作为类似物，并且因为这些酶或蛋白家族的成员共有相同的功能，故尽管它们可能在结构上稍有不同或实质不同，但在许多情况下，使用现有的基因改造方法，相同家族的不同成员可以用于执行相同的生物学功能。因此，例如，AroZ酶和QutC酶催化相同的反应，DHS脱水酶，这样任一者在合适的环境下都会导致顺，顺-黏康酸产生，并且选哪一个来使用最终可通过选择在相似的发酵条件下产生更高滴度的顺，顺-黏康酸的一个来作出选择。
“非芳族碳源”或“非芳族化合物”是可作为碳源和/或能量用于供养本发明的微生物的含碳化合物，其中该化合物不含有与苯相关的六元环。非芳族碳源的实例包括葡萄糖、木糖、乳糖、甘油、醋酸、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、麦芽糖或蔗糖。“芳族化合物”是含有一个或多个与苯相关的六元环的化合物。芳族化合物的实例是儿茶酚或1,2-二羟基苯。
“强组成型启动子”是这样的DNA序列，其通常位于由RNA聚合酶转录的DNA序列或基因的上游(当以习惯的5’至3’方向描述时在基因的5’侧)，并且其导致所述DNA序列或基因通过RNA聚合酶转录以容易经由任何适当的测定法步骤直接或间接检测到的水平表达。适当的测定法步骤的实例包括1)定量逆转录酶+PCR，2)对于所编码酶的酶测定法，3)考马斯蓝染色的蛋白凝胶，或4)可测量的作为所述转录的结果间接产生的代谢物的产生，且这样的可测量的转录的发生不论特定调节转录水平的蛋白、代谢物或诱导物化学品存在与否。不是“强组成型启动子”的启动子的实例是大肠杆菌的Plac启动子，因为其在没有乳糖或诱导物IPTG的情况下受阻遏物的阻遏。通过使用领域内熟知的方法，可以使用“强组成型启动子”取代原生的启动子(否则天然存在于DNA序列或基因上游的启动子)，得到如下的表达盒，所述表达盒可以置于质粒中或染色体中，且以高于原生启动子水平的水平提供期望DNA序列或基因的表达水平。强组成型启动子可以是种或属特异性的，但来自细菌的强组成型启动子常常可以在远缘相关的细菌中良好发挥功能。例如，来自枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)或来自通常在枯草芽孢杆菌上生长的噬菌体的启动子可以在大肠杆菌中良好发挥功能。“强组成型启动子”与诱导型启动子如Ptac实质地不相同，诱导型启动子已在现有技术中用于生产顺，顺-黏康酸且对于期望的功能水平通常需要昂贵的化学品或其它环境变化(Niu等人，2002)。强组成型启动子的实例是来自枯草芽孢杆菌噬菌体SP01的P15、P26，和大肠杆菌噬菌体λPR(SEQ ID No.1、2和3)。
“黏康酸通路”是指从DHS到PCA到儿茶酚到顺，顺-黏康酸的生化通路，且“黏康酸通路基因”是这样的基因，其编码催化黏康酸通路中的步骤的酶，或编码用来增强所述酶例如aroZ、aroY、catA、catX和qutC中之一者的活性的辅助功能。DHS是3-脱氢莽草酸盐的缩写，且PCA是原儿茶酸的缩写。“黏康酸质粒”是含有一种或多种黏康酸通路基因的质粒。
本发明中所用的一些基因操纵的中心围绕着如图1所示的存在于细菌细胞中的芳族氨基酸生物合成共同通路。图1所示的从DAHP合酶到分支酸合酶的芳族氨基酸生物合成共同通路也称为“莽草酸通路”。
关于微生物基因改造以生产芳族氨基酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸有着大量的已公开工作(US 4,681,852、US 4,753,883、US 6,180,373、欧洲专利申请86300748.0)。方法包括利用反馈抗性酶(AroF、AroG、PheA、TyrA)、转录阻遏(tyrR)的去调控、增加启动子强度(Ptac、Plac)和增加一个或多个基因(tktA)的拷贝数的多种组合。然而，上述方法的许多具体组合并未尝试过，或是因为存在太多的组合而难以无过度实验地进行尝试，或是因为不能洞察哪一种将是最佳组合。更重要的是，这些基因操纵组合的任一种在开发用于使用可再生的非芳族碳源来商业生产黏康酸的生物催化剂中的适用性尚不知晓。
对于许多微生物特别是大肠杆菌，芳族氨基酸生物合成通路是熟知的(Neidhardt和Curtiss,1996)。在野生型细胞中，该通路受反馈抑制和转录阻遏的紧密调控。第一个关键步骤由脱氧-阿拉伯-庚酮糖酸7-磷酸(DAHP)合酶催化，对其而言存在由aroF、aroG和aroH编码的三种同工酶。三种同工酶AroF、AroG和AroH分别受芳族氨基生物合成通路的产物即酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的反馈抑制。对所有三者具有反馈抗性的突变体是已知的(Draths等人，1992；Lutke-Eversloh和Stephanopoulos,2007；Hu等人，2003；Shumilin等人，1999)。本发明的一个方面涉及利用aroF、aroG和aroH基因的反馈抗性等位基因以表达抵抗芳族氨基酸生物合成通路的产物的反馈抑制的AroF、AroG和AroH酶蛋白。芳族通路中涉及的数种操纵子的转录受tyrR基因所编码的阻遏物或trpR基因所编码的阻遏物或二者的调控(Neidhardt等人，1996)。特别重要的是当TyrR蛋白与一种或多种芳族氨基酸结合时其对aroG和aroF转录的负调节。本发明的一个方面涉及通过从宿主细菌菌株的染色体中消除tyrR或trpR基因而去除这些基因的负调节。
本发明的主题是创造具有新的基因改造元件的基因改造盒的新组合，以提高用于大规模商业生产顺，顺-黏康酸产生菌株的发酵参数和适用性。特别地，生产顺，顺-黏康酸的现有技术并未教导遗传元件的某些组合，例如但不限于，超量产生的反馈抗性的AroG、超量产生的反馈抗性的AroF、过表达的tktA、过表达的talA、染色体上整合的用于从强组成型启动子表达aroZ、aroY和catAX(或其类似物或同源物)的表达盒，以及渗漏aroE等位基因(我们将其定义为编码AroE酶的基因，该AroE酶对于芳族氨基酸和维生素的原养型，但不导致芳族化合物的显著分泌)的多种组合。
本文公开的菌株构建体的所有具体实例衍生自野生型大肠杆菌C菌株(ATCC8739)或大肠杆菌K-12菌株(YMC9或MM294)，但本文公开的遗传元件可以组装到任何其它合适的大肠杆菌菌株中，且本文公开的表达盒或遗传元件的适当类似物和同源物可以组装到任何其它的合适微生物中，如可通过发酵方法用于商业生产顺，顺-黏康酸的其它种类的细菌、古生菌、酵母、藻类和丝状真菌。
在大肠杆菌中，自葡萄糖的芳族氨基酸生物合成通路起始于戊糖磷酸通路(PPP)的非氧化分支。非氧化戊糖磷酸通路中的四种关键酶是转酮醇酶、转醛醇酶、核酮糖-5-磷酸差向异构酶和核酮糖-5-磷酸异构酶。这些酶催化导致从己糖或戊糖糖类形成赤藓糖-4-磷酸(E4P)的反应。为提高大肠杆菌中E4P的可得性，可以过表达编码转酮醇酶的tktA基因(Niu等人，2002)。类似地，还预期过表达转醛醇酶基因在一些情况中提高E4P的可得性(Bongaerts等人，2001)。在本发明的另一方面，通过导致转酮醇酶和转醛醇酶的酶活性增加的基因操纵来增强转酮醇酶和转醛醇酶基因的表达。在本发明的另一方面，通过超量产生核酮糖-5-磷酸差向异构酶和核酮糖-5-磷酸异构酶来提高经由PPP的非氧化分支的通量。
共同芳族氨基酸通路中的第一关键步骤和最紧密调节的反应是经DAHP合酶(由aroG、aroF和aroH编码)的磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和E4P的缩合以产生脱氧阿拉伯-庚酮糖酸7-磷酸(DAHP)。大肠杆菌消耗的D-葡萄糖部分通过PPP且部分通过糖酵解被带入芳族生物合成。当通过用提高拷贝数而使表达增强的质粒转化来扩增转酮醇酶(tktA)和DAHP合酶(aroG)的同工酶时，进入芳族通路的葡萄糖流大大提高(Niu等人，2002)。在本发明的优选方面，出于扩大转酮醇酶和DAHP合酶的酶活性的目的，将外源aroG和tktA基因整合到染色体DNA中。
在本发明的另一实施方案中，通过增加DAHP合成可用的PEP来提高微生物细胞中经由PEP的通量。许多菌属细胞在利用磷酸转移酶体系(PTS)的跨细胞膜葡萄糖转运中消耗PEP，其中对于每分子跨细菌外膜转运的葡萄糖消耗一个PEP分子。通过用非PEP依赖性的(PEP独立的)葡萄糖摄取机制取代或补偿PEP依赖性的PTS，可以增加微生物细胞内芳族氨基酸生物合成通路可用的PEP池的大小。例如，用于糖摄取的PTS体系可以由基于GalP的糖摄取体系或基于Glf/Glk蛋白的糖转运体体系进行取代或补偿(Chandran等人，2003；Yi等人，2003)。在本发明的优选方面，除了出于保存微生物细胞内的PEP池的目的将用于糖摄取的PTS体系缺失外，还出于保存微生物细胞内的ATP的目的将基于GalP的糖摄取体系失活。在PTS体系和基于Gal-P的糖摄取体系(ΔPTS/ΔgalP)的运作都有缺陷的微生物细胞中，可通过引入编码Glf的外源基因，或编码Glf(葡萄糖易化扩散蛋白)和Glk(葡糖激酶)蛋白二者的外源基因来实现糖摄取。如本发明所用，术语功能性的葡萄糖易化扩散蛋白是指任何Glf蛋白以及在功能上等同于Glf且作用于通过易化扩散将糖转运到微生物细胞中的任何其它蛋白。在本发明的一个方面，将编码葡萄糖易化蛋白Glf的基因引入ΔPTS/ΔgalP微生物细胞中，且转运到微生物细胞中的葡萄糖通过内源葡萄糖激酶而磷酸化。在本发明的另一方面，将编码Glf和Glk蛋白二者的基因引入到ΔPTS/ΔgalP微生物细胞中。在本发明的优选方面，引入到微生物细胞中的外源glf和glk基因被整合到宿主染色体DNA中。
在本发明的另一实施方案中，当生长用的碳源和能量需要糖异生(例如如果碳源是醋酸盐或琥珀酸盐)时，可通过提高细胞内已存在的羧化酶(例如PEP羧化激酶，其由大肠杆菌中的pck编码)的活性或通过引入外源的羧化酶而增加PEP池。在优选的实施方案中，引入的编码羧化酶的外源基因稳定整合到宿主染色体中。编码羧化酶的基因可以源自多种多样的微生物种类。编码羧化酶的基因还可经历基因操纵，从而使得用于顺，顺-黏康酸生产的生物催化剂内的羧化酶表达显著增加。
在本发明的另一实施方案中，通过降低或消除利用PEP作为底物的丙酮酸激酶如PykA和PykF的活性而增加微生物细胞内的PEP池。
从DAHP，芳族氨基酸通路经由多个中间体至分支酸(CHA)，其是三种芳族氨基酸即L-酪氨酸(L-Tyr)、L-苯丙氨酸(L-Phe)和L-色氨酸(L-Trp)的生物合成的分支点。
在共同芳族氨基酸通路的初始阶段，3-脱氢奎尼酸(DHQ)合酶(AroB)从DAHP移除磷酸基，导致DHQ的形成。酶DHQ脱水酶(AroD)从DHQ中移除水分子，导致3-脱氢莽草酸盐(DHS)的形成，其随后被莽草酸脱氢酶(AroE)还原成莽草酸盐(SHK)。莽草酸激酶I/II(AroK，AroL)将莽草酸盐磷酸化成莽草酸3-磷酸(S3P)。S3P与PEP进行缩合，导致5烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP)的形成。EPSP的形成由EPSP合酶(AroA)介导。EPSP的磷酸基由分支酸合酶(AroC)移除，导致分支酸(CHA)的形成。
如图2中所示，芳族氨基酸通路可以因aroE基因突变在3-脱氢莽草酸盐(DHS)转化成莽草酸盐(SHK)的水平被阻断，导致DHS的积累(Niu等人，2002)。引入外源aroZ基因起到将DHS转化成原儿茶酸(PCA)的作用。PCA随后通过由AroY酶介导的脱羧反应转化成儿茶酚。儿茶酚通过catA基因产物的作用最终转化成顺-顺黏康酸(ccMuA)。ccMuA可以受马来酰乙酰乙酸异构酶的作用而产生反-反黏康酸(ttMuA)。从DHS到ccMuA和ttMuA的生物合成通路被称为黏康酸通路。负责将DHS转化成ccMuA的三种不同基因可以从多种微生物种类获得并引入到选择用于黏康酸生产的微生物如大肠杆菌中。在本发明的优选实施方案中，编码黏康酸通路所涉及蛋白的外源基因被整合到宿主染色体DNA中。
在将芳族氨基酸通路重定向到顺，顺-黏康酸生产的过程中，aroE基因突变是关键性的。aroE基因可以完全失活，导致芳族氨基酸生物合成的完全阻断，如使用描述用于黏康酸生产的大肠杆菌WN1/pWN2.248菌株所进行的(Niu等人，2002)。采用WN1/pWN2.248大肠杆菌菌株和相关菌株的重大缺点在于，由于aroE基因完全失活，该菌株成为上述的芳族酸如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸以及芳族维生素或维生素类化合物的营养缺陷型。结果，在其生长以生产顺，顺-黏康酸的过程中，该菌株需要外源添加这六种化合物(或共同中间体，如莽草酸盐)，由此使得利用该菌株进行的顺，顺-黏康酸商业生产的成本实质增加。克服对芳族氨基酸的外部来源的这种依赖性的新方法是使用具有aroE渗漏突变的菌株。渗漏aroE突变体将允许有限的碳流向莽草酸，同时积累显著量的DHS，其随后可用于经由AroZ酶的作用转化成PCA。由此，使用aroE的渗漏突变体形式将消除对外源芳族氨基酸的依赖性，同时仍然将碳流转向顺，顺-黏康酸。
用于合成DHS转化成顺，顺-黏康酸所必需的AroZ、AroY和CatA蛋白的编码基因可以源自许多微生物种类。在一个实施方案中，这些外源基因整合到正在开发的生物催化剂的宿主染色体中。在优选的实施方案中，这些外源基因在生物催化剂内的表达由组成型启动子驱动而不需要任何诱导物。
中间体原儿茶酸的生物合成需要3-脱氢莽草酸脱水酶(AroZ；EC4.2.1.118)这种酶。在本说明书中，“AroZ”应指任何催化3-脱氢莽草酸脱水酶反应的酶。在现有技术中，该酶从肺炎克雷伯杆菌菌株A170-40(ATCC25597)的aroZ基因表达(Niu等人，2002；Draths和Frost，1995)。然而，AroZ的比活在生物体之间广泛变化，从0.1至261微摩尔/min/mg(Wheeler等人，1996；Fox等人，2008；Pfleger等人，2008)，因此，通过从比肺炎克雷伯杆菌具有更高的比活的生物体，例如贝氏不动杆菌、构巢曲霉(Wheeler等人,1996)(现在也称为构巢裸胞壳(Emericella nidulans))、或粗糙脉孢菌(Rutledge，1984；Stroman等人，1978)、或鹅柄孢壳菌(Podospora anserina，也称为Podospora pauciseta)(Hansen等人，2009)表达aroZ基因，其也称为asbF(Fox等人,2008；Pfleger等人,2008)、qutC(Wheeler等人,1996)、qa-4(Rutledge,1984)和quiC，可以具有显著的改进。
作为一个特别的实例，来自粗糙脉孢菌的编码3-脱氢莽草酸脱水酶的qa-4基因的编码序列可以通过数种已知方法中的任一者获得，例如全基因DNA合成、cDNA克隆或通过基因组DNA克隆与PCR或合成DNA接头合成的组合。由于qa-4基因中没有内含子，可以通过PCR从基因组DNA获得编码区(Rutledge,1984)。qa-4酶的蛋白序列(SEQ ID No.4)和原生基因的DNA序列(SEQ ID No.5)是已知的。
备选地，可以从构巢曲霉针对3-脱氢莽草酸脱水酶构建表达盒。来自构巢曲霉的QutC酶的编码序列可以通过数种已知方法中的任一者获得，例如全基因DNA合成、cDNA克隆或通过基因组DNA克隆与PCR或合成DNA接头合成的组合。QutC的蛋白序列(SEQ ID No.6)和不含内含子的原生基因的DNA序列是已知的(SEQ ID No.7；GenBank检索号M77665.1)。表达盒可以通过DNA合成，或通过基因组克隆与PCR的组合得到，从而使QutC酶能在大肠杆菌中准确产生。通过在大肠杆菌中从强组成型启动子表达QutC的编码序列，可以从整合到染色体中的一个或两个拷贝的基因获得充分表达，省去了可能导致不稳定性的并且如现有技术中所公开的在多拷贝质粒上维持多于两个拷贝的表达盒的需求(Niu等人，2002)。上述方法通常可以用于获得编码期望的酶的DNA序列，并且该编码序列随后可用于构建设计为在大肠杆菌中或另一合适的微生物宿主生物体中发挥功能的表达盒。
AroZ的比活也可以通过利用现有技术的蛋白序列(Niu等人，2002)但构建改进的表达盒来加以改进，例如，其中在编码区之前已安置更强的启动子和/或核糖体结合位点(RBS)，如实施例4中所描述的。
来自肺炎克雷伯杆菌菌株A170-40的编码AroZ(3-脱氢莽草酸脱水酶)的aroZ基因可以按现有技术中所描述的来获得。该基因的DNA序列和周围的DNA可以通过领域内熟知的方法确定。可利用原生的DNA序列将本发明的异源基因例如aroZ建立到表达盒中，或者其可用针对预定宿主生物体密码子优化的序列合成。可以按记载的(Draths和Frost,1995)从任何其它含有活性aroZ基因的微生物克隆aroZ基因，其中所述微生物例如肺炎克雷伯杆菌菌株342、不动杆菌属物种ADP1(贝氏不动杆菌ADP1)、苏云金芽孢杆菌、构巢裸胞壳、解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、恶臭假单胞菌W619和许多其它菌。
中间体儿茶酚的生物合成需要原儿茶酸脱羧酶(AroY；EC 4.1.1.63)这种酶。在本说明书中，“AroY”应指任何催化原儿茶酸脱羧酶反应的酶。在现有技术中，该酶从在多拷贝质粒上的肺炎克雷伯杆菌菌株A170-40(ATCC25597)的aroY基因表达(Niu等人，2002)。然而，再一次地，可以通过从整合到宿主生物体的染色体中的一个或两个拷贝的表达盒产生充足的酶来获得方法改进。这可以通过从以下的生物体获得aroY基因来实现，所述生物体天然产生较之现有技术的肺炎克雷伯杆菌AroY酶具有更高比活的AroY酶，或通过提高肺炎克雷伯杆菌AroY的表达水平而实现，所述提高表达水平是通过构建例如利用强组成型启动子和/或强RBS的表达盒而进行，如以上对实施例4描述的。来自肺炎克雷伯杆菌菌株A170-40的AroY的蛋白序列在SEQ ID No.8中给出。对应的基因aroY可以如上所述进行克隆(Draths和Frost,1995)，或者基于蛋白序列，其可以用针对预定宿主生物体优化的密码子合成。
aroY基因可以从含有同源物或类似物的任何其它微生物获得，例如肺炎克雷伯杆菌菌株NCTC418(ATCC15380)、肺炎克雷伯杆菌342和Arxula adeninivorans(Sietmann等人,2010)。来自肺炎克雷伯杆菌342的aroY基因的DNA序列和周围的DNA在SEQ ID No.9中给出。
顺，顺-黏康酸生物合成的最后步骤需要儿茶酚1,2-双加氧酶(CatA；EC1.13.11.1)这种酶。在本说明书中，“CatA”应指任何催化儿茶酚1,2-双加氧酶反应的酶。在现有技术中，该酶从多拷贝质粒上的乙酸钙不动杆菌菌株ADP1的catA基因表达(Niu等人，2002)。来源菌株，乙酸钙不动杆菌菌株ADP1显然已重命名为不动杆菌属物种ADP1和贝氏不动杆菌ADP1(Neidle和Ornston,1986；Barbe等人,2004；de Berardinis等人,2008)。在该现有技术实例中，catA基因从Ptac启动子表达，该启动子需要乳糖或IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)作为诱导物。这些化合物对于用于商业发酵而言太过昂贵，因此再一次地，需要通过将表达盒整合到染色体中对方法进行显著改进，既为了消除对昂贵诱导物的需求，也为了产生更稳定的菌株。这可以通过构建利用强组成型启动子、强RBS、和/或更稳定的mRNA的catA基因的表达盒而实现，如以上其他实施例中所述。
来自贝氏不动杆菌ADP1的catA基因的DNA序列和周围序列在SEQ ID No.10中给出。来自相同菌株的CatA的蛋白序列在SEQ ID No.11中给出。在优选的实施方案中，catA的表达盒含有一个或两个额外的天然存在于catA下游的开放阅读框，以提高catA基因的表达水平(Schirmer和Hillen，1998)。许多其它生物体可以是catA基因的来源，例如小田假单胞菌(Pseudomonas arvilla)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)(Nakazawa等人，1967；Kojima等人，1967)、链霉菌属物种菌株2065(Streptomyces Sp.Strain 2065)(Iwagami等人，2000)、钩虫贪铜菌335T(Cupriavidus necator 335T)和许多其它菌(Perez-Pantoja等人，2008)。
为了提高朝向顺，顺-黏康酸的碳流，除了通过利用渗漏aroE突变体减小从DHS到莽草酸盐(SHK)的碳流，还有必要阻断从芳族氨基酸通路分支出的某些其它通路。一些细菌，例如不动杆菌属和假单胞杆菌属中的一些细菌，含有名为pobA的基因，其编码将DHS转化成没食子酸的对羟基苯甲酸水解酶这种酶。尽管大肠杆菌中未曾发现PobA同源物或类似物，但经改造以生产DHS的大肠杆菌菌株分泌可测量量的没食子酸(Li和Frost,1999)，因此有可能这种酶确实存在于大肠杆菌中。此外，源自DHS的PCA可以通过由pobA基因所编码的对羟基苯甲酸水解酶(PobA)酶的作用转化成没食子酸。由此产生的没食子酸可以在随后被转化成焦性没食子酸。阻断所选的生物催化剂中通向没食子酸和焦性没食子酸的碳流以提高顺，顺-黏康酸的一种方式是通过基因操纵而阻断或减小对羟基苯甲酸水解酶(PobA)蛋白的活性。相似地，DHS的前体——DHQ也可以受aroE所编码的莽草酸脱氢酶的作用，导致奎宁酸的产生。在本发明的实施方案中，对渗漏AroE突变体酶额外选择或筛选其在将DHQ转化成奎宁酸方面的失能或降低的能力。
生产反，反-黏康酸代替顺，顺-黏康酸有数个优点。在使用乙烯用于生产对苯二甲酸的狄尔斯–阿尔德反应(Diels Alder reaction)中对反，反-黏康酸的偏好高于顺，顺-黏康酸。具有经基因操纵的芳族通路的生物催化剂产生顺，顺-黏康酸，所述顺，顺-黏康酸可以在细胞外利用化学转化方法转化成反，反-黏康酸。另一方面，通过将马来酰乙酰乙酸异构酶或相似的异构酶引入到生物催化剂中，可以在细菌生物催化剂中将顺，顺-黏康酸转化成反，反-黏康酸。
本专利申请的说明书提供了与构建足以生产黏康酸的微生物菌株相关的本发明的数个不同方面。本领域技术人员能够汇编本发明的数个不同方面以构建具有极高效率的用于生产黏康酸的生物催化剂。
实验部分
总论
菌株和接种体制备：本发明中所用的细菌菌株和质粒的清单提供于表1中。本文公开的菌株构建体的所有具体实例衍生自野生型大肠杆菌C菌株(ATCC 8739)或大肠杆菌K-12菌株(YMC9或MM294)，但本文公开的遗传元件可以组装到任何其它合适的大肠杆菌菌株中，且本文公开的表达盒或遗传元件的适当类似物和同源物可以组装到任何其它的合适微生物中，如可通过发酵方法用于商业生产顺，顺-黏康酸的其它种类的细菌、古生菌、酵母、藻类和丝状真菌。
大肠杆菌C能在AM1矿物培养基中发酵10％葡萄糖。AM1培养基含有2.63g/L(NH4)2HPO4、0.87g/L NH4H2PO4、1.5mM MgSO4、1.0mM甜菜碱、和1.5ml/L痕量元素。痕量元素制备成1000X储液并且含有以下组分：1.6g/L FeCl3、0.2g/L CoCl2·6H2O、0.1g/L CuCl2、0.2g/LZnCl2·4H2O、0.2g/L NaMoO4、0.05g/L H3BO3、和0.33g/L MnCl2·4H2O。用1.0～10.0M KOH或1.0～9.0M氢氧化铵使发酵液的pH维持在7.0。
发酵：通过从经基因改造的并存储于-80℃冰箱中的大肠杆菌菌株的40％甘油储液在新鲜的NBS-2％葡萄糖(Jantama等人,2008a)平板上划线接种而开始发酵。通过在琼脂板和液体培养基中包含合适的(一种或多种)抗生素而保留质粒(如果存在的话)。氨苄青霉素(钠盐)以150mg/L使用，壮观霉素HCL以100mg/L使用，四环素HCl以15mg/l使用，且硫酸卡那霉素以50mg/l使用。在24至48小时(37℃)后，将单克隆挑选到摇瓶中25ml的相同培养基中。在于37℃200rpm震荡直至细胞生长至约1.0的OD600后，在冰上冷却培养物并添加等体积的无菌80％甘油。然后将2ml的等分物在-80℃冻存以用作发酵用的接种物。
细胞生长：通过使用Thermo Electronic Spectronic 20分光光度计测量550nm(OD550)或600nm(OD600)下的光密度来估算细胞质量。
对莽草酸通路和黏康酸通路中的中间体的分析：利用购自Sigma-Aldrich的标准物，通过HPLC和Waters Alliance仪器并监测210nm下的吸光度或45℃下的折射率来测定发酵液中所产生的全部黏康酸(包括顺，顺-黏康酸和顺,反-黏康酸以及其它生化中间体)。柱子是BioRad Aminex HPX-87H，以8mM硫酸作为流动相在0.6ml/min的流速下在50℃运行40分钟。购买的标准物(Sigma-Aldrich)的色谱图示于图3。为准备用于HPLC，将发酵样品在0.05M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中稀释10或100倍，以防止顺，顺-形式的黏康酸异构化为顺，反-形式。
为分离黏康酸的异构体，将如上制备的样品在第二HPLC体系中运行。仪器是Agilent 1200HPLC，柱子是Agilent Eclipse XDB-C18,4.6x 150mm，以用磷酸调节至pH3.0的50mM KH2PO4于30％甲醇中的流动相在30摄氏度运行。流速为1ml/min，持续4分钟，进行278nm下的吸光度检测。通过将顺，顺-黏康酸溶解于水中并允许其在室温下经历约2小时的自发的酸催化的异构化来产生顺，反-黏康酸标准物，直至HPLC峰已经完全移动至新位置。其它标准物购自Sigma-Aldrich。显示标准物的色谱图示于图4中。
用于发酵方法的黏康酸生产培养基的组成：每升的发酵培养基含有50ml/L的1MKH2PO4、10ml的200g/L柠檬酸+25g/L柠檬酸铁、1.2ml的98％硫酸和一滴Antifoam 204。将这些组分与足量的水混合以允许有添加以下其它组分的空间。在高压灭菌后，添加以下组分：10、20、30或40ml的50％葡萄糖(以得到5、10、15或20g/l终浓度)、2ml的1M MgSO4、1ml的0.1M CaCl2、10ml的1000X痕量元素(Jantama等人,2008a)、1、2、4或8ml的50g/L苯丙氨酸+50g/L酪氨酸+50g/L色氨酸(以得到0.5、0.1、0.2或0.4g/l终浓度)、10ml的1g/L对羟基苯甲酸+1g/l对氨基苯甲酸+1g/L 2,3-二羟基苯甲酸和必要时的1ml的150mg/ml氨苄青霉素(钠盐)和/或1ml的100mg/ml壮观霉素HCl。
对于补料分批发酵，给料瓶含有600g/L的无水葡萄糖和32ml/L的50g/L苯丙氨酸+50g/L酪氨酸+50g/L色氨酸。9M NH4OH用作碱以维持发酵培养基的pH。
对于摇瓶，用NBS盐(Jantama等人2008a)加0.2M MOPS缓冲液(pH 7.4)替代如上所述的高压灭菌前的混合物，但葡萄糖和其它添加物相同。
补料分批发酵在7L New Brunswick Scientific发酵罐中进行，pH、DO、温度、葡萄糖和进料速度通过DCU控制器或Biocommand软件来加以控制。温度维持在37℃，pH通过9N氨水维持在7.0，溶解氧(DO)维持在30％空气饱和同时将叶轮速度从750rpm升高至1200rpm。期望的培养基中的初始葡萄糖浓度为约5至25g/L。当葡萄糖浓度降至低于5g/L时，将葡萄糖溶液添加至发酵罐中，并通过溶解氧水平来控制葡萄糖的进料速度。总发酵时间为48小时，最终滴度为16g/L的黏康酸。
表达黏康酸通路基因的质粒的构建：将DHS转化成黏康酸所需的三种异源基因单独或组合克隆到低拷贝质粒pCL1921中(Lerner和Inouye,1990)。pCL1921的DNA序列在表3SEQ ID No.20中给出。简言之，catAX、aroY和aroZ类似物或同源物的编码序列经密码子优化用于在大肠杆菌中表达并商业合成(GeneArt,Invitrogen)。然后利用携带独特的核糖体结合位点的正向引物和携带各基因独特的终止子序列的反向引物将这些序列经PCR扩增。将所得的PCR片段经限制性酶消化并通过标准分子克隆方法克隆到独特的组成型启动子序列的下游。通过从之前描述过的来源DNA序列进行PCR扩增(美国专利申请20090191610；美国专利7244593)，之后是限制性消化和标准分子克隆，来克隆启动子序列。启动子-RBS-编码序列-终止子序列在一起组成表达盒。接着将单独的表达盒组合以产生表达一个、两个或所有三个黏康酸通路基因的质粒。
实施例1
增加aroG和aroF的表达
大肠杆菌的tyrR基因可通过数种熟知方法中的任一种来突变，例如化学或辐射诱变和筛选(例如通过PCR和DNA测序)或选择类似物抗性(例如，对4-氟酪氨酸的抗性)、转座子诱变、细菌噬菌体Mu诱变或转化。在优选的实施方案中，tyrR基因中的突变是无效突变(导致没有可检测的活性的突变)，而在更优选的实施方案中，至少部分tyrR基因缺失。这可以通过例如利用使用线性DNA分子的两步转化法(Jantama等人,2008a；Jantama等人,2008b)来实现。在第一步中，通过双重组和选择氯霉素抗性将camR、sacB盒在tyrR基因座处整合以取代大部分的或所有的tyrR开放阅读框。在第二步中，通过双重组、在丰富营养基如LB中选择对5％蔗糖的抗性将包括缺失型的tyrR基因的线性DNA整合。通过诊断性聚合酶链式反应(PCR)来鉴定和确定正确的缺失。将tyrR缺失的目的是增加aroG和aroF的表达。实现相似结果的可选方法是用强组成型启动子取代aroG和/或aroF之前的原生启动子和(如果必要的话)，添加转录终止子。关于总体如何实现的更多细节在以下实施例4中给出。
以上描述的用于克服TyrR蛋白对AroG和AroF活性的抑制的两种途径中后者是优选的，因为tyrR缺失会引起不希望的基因如aroLM的过表达(Neidhardt和Curtiss,1996)。关于总体如何实现的更多细节在以下实施例4中给出。
实施例2
反馈抗性的AroG和AroF
导致反馈抗性的AroG酶(3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶或DAHPS)的aroG基因中的突变是领域内已知的(Shumilin等人,1999；Kikuchi等人,1997；Shumilin等人,2002)。还已知的是产生、鉴定和表征这些突变的方法(Ger等人,1994,Hu等人,2003)。优选的突变是引起对苯丙氨酸抑制完全抗性的突变。可以通过数种已知方法中的任一种将任何已知的已公开的反馈抗性突变引入到染色体中或质粒上所包含的aroG基因中，其中一个方法实例是诱变PCR，其中期望的突变作为PCR引发寡核苷酸的部分被合成(Hu等人,2003)。通过DNA测序来证实突变的正确置入。来自大肠杆菌C的野生型aroG基因的序列在SEQ IDNo.18中给出。优选的突变是将AroG的氨基酸150从脯氨酸变成亮氨酸的点突变，例如通过将密码子150从CCA变成CTA(Hu等人,2003)。在更优选的实施方案中，密码子150从CCA变成CTG，其是大肠杆菌中的优选密码子。该特别的aroG等位基因是优选的，因为所编码的DAHP合酶对高达3mM的苯丙氨酸抑制完全抵抗，并且其具有与野生型酶相似的比活(Hu等人,2003)。
可以通过诱变和选择对一种或多种苯丙氨酸类似物(如β-2-噻吩丙氨酸、p-氟代苯丙氨酸、p-氯代苯丙氨酸、o-氟代苯丙氨酸和o-氯代苯丙氨酸)的抗性、接着证明导致抗性的突变与aroG基因关联，来得到另外的反馈抗性aroG等位基因(Ger等人,1994；US专利4,681,852)。与aroG的关联可以通过DNA测序或苯丙氨酸存在和不存在情况下的酶测定来直接证明(Ger等人,1994)，或通过噬菌体介导的转导和对aroG基因座处或其附近的可供阳性或阴性选择的遗传标记物的选择而间接证明(US专利4,681,852)。这样的遗传标记物可以是aroG基因自身中的缺失或点突变，或者是任何合适的紧密关联的基因(如大肠杆菌情况下的nadA)中的突变。例如，在大肠杆菌中，在诱变和选择苯丙氨酸类似物抗性后，单个突变体或突变体集合可被用作供体用于经P1介导转导至缺失所有三种DAHP合酶基因aroG、aroF和aroH的原生受体中，并选择在合适的基本培养基上的生长。然后转导子将富集(一个或多个)期望的基因中的突变。备选地，在诱变和选择类似物抗性后，单个突变体或突变体集合可被用作供体用于经P1介导转导至包含nadA基因中的无效突变的原生受体菌株中，再次选择在缺乏烟酰胺的基本培养基上的生长。另一方法是在这样的菌株背景中选择抗性突变体，所述菌株背景在aroG基因附近(如在nadA基因中)含有转座子(如Tn10)插入。从类似物抗性突变体P1转导到不包含所述转座子的菌株背景中和选择四环素或其它合适的抗生素抗性将富集期望的aroG突变。在所有这些方法中，反馈抗性最终通过酶测定和对基因的DNA测序而得以证实。我们将对反馈抑制具有抗性的aroG的等位基因称为aroG*。
菌株WM191(ΔtyrR，ΔaroF)衍生自YMC9(ATCC 33927)。利用两步基因取代法(Jantama等人,2008a)置入tyrR和aroF的完全缺失(clean deletion)，以得到菌株WM191。接着，从CAG12147(CGSC 7351,Coli Genetic Stock Center,Yale University)转导入nadA::Tn10等位基因，以得到菌株WM189(ΔtyrR,ΔaroF,nadA::Tn10)。在LB+四环素HCl(15mg/l)上进行选择。菌株RY890(ΔtyrR::kan,aroF363)通过P1转导以三步从MM294(ATCC33625)得到。供体菌依次为JW1316-1(CGSC9179,Coli Genetic Stock Center,YaleUniversity)、NK6024(CGSC 6178,Coli Genetic Stock Center,Yale University)和AB3257(CGSC 3257,Coli Genetic Stock Center,Yale University)，并且三次选择依次为LB+硫酸卡那霉素(50mg/l)、LB+盐酸四环素(15mg/l)和NBS最低限葡萄糖(Jantama等人,2008a)及硫胺素HCl(5mg/l)。
用UV光对WM189诱变至约20％存活，并铺板于含有o-氟代苯丙氨酸(1mM)、硫胺素(5mg/l)和烟酰胺(1mM)的NBS最低限葡萄糖培养基中(Jantama等人,2008a)。将从数个板各自得到的菌落收集到单独的池中，并在各个池上制备P1vir溶菌物。使用这些溶菌物在LB培养基上将WM191转导成四环素抗性(15mg/l)，并将得到的菌落复制铺板到含有1mM o-氟代苯丙氨酸、硫胺素(5mg/l)和烟酰胺(1mM)的NBS最低限葡萄糖培养基上。假定在四环素和类似物上均存活的菌落复制物在aroG中含有反馈抗性突变。从5个独立的池中选择八个单独的菌落用于DNA测序。通过聚合酶链式反应将aroG编码区扩增并测序。示于图4的结果显示，八个菌株各自在其aroG基因中包含点突变。一些等位基因与已公开的等位基因相同，但一些是新的。
使用来自以上描述的池之一的P1vir溶菌物将RY890(其具有aroG野生型等位基因)转导成四环素抗性并通过如上所述的复制铺板转导成对o-氟代苯丙氨酸(0.3mM)抗性。挑取四个克隆，命名为RY893、RY897、RY899和RY901，用于DNA测序(表4)，再次地，两个等位基因与已公开的等位基因相同，但两个是新的。与后四个菌株同基因但却含有野生型aroG基因的菌株RY890通过从CAG12147转导被构建为对照。这五株菌在摇瓶中在25ml NBS最低限葡萄糖(15g/l)+硫胺素HCl(5mg/l)和烟酰胺(1mM)中过夜生长。所得的细胞通过离心收集，重悬以用10ml水漂洗，再离心，并重悬于0.5ml的50mM磷酸钾(pH 7.0)中。重悬的细胞通过与三滴氯仿一起涡旋而裂解，并使用与文献中所描述的方法类似的方法测定粗溶菌物的DAHP合酶活性(Hu等人,2003)，有以下改动。磷酸盐缓冲液是50mM(终浓度)，pH 7.0，最终的赤藓糖-4-磷酸浓度为2mM，最终的磷酸烯醇丙酮酸浓度为5mM，孵育温度为30℃，反应在10分钟时终止。我们将1mU定义为每分钟每毫克蛋白产生1nM DAHP的活性。为测试反馈抗性，在有或没有终浓度18mM的苯丙氨酸的存在下对各个粗溶菌物进行测定。测定结果示于表5。酶显示出不同的比活和对苯丙氨酸的抗性，但所有选择的进行测试的突变体形式显著比野生型对照具有更高抗性。
将来自如上所述的RY893、RY899、RY901和RY902的aroG等位基因按如下引入黏康酸生产菌株背景中。将来自aroG*和aroGwt供体菌株的P1vir溶菌物用于将MYR219(大肠杆菌C,ΔaroE,Δack::P15-aroB,pMG37)转导成四环素HCl抗性(15mg/l)，以分别得到新菌株RY903、RY909、RY911和RY912。然后使用JW1316-1的P1vir溶菌物以引入ΔtyrR::kan等位基因，将这些菌各自转导成硫酸卡那霉素抗性(50mg/l)，，分别得到菌株RY913、RY919、RY921和RY922。始终维持壮观霉素选择以维持黏康酸质粒。所得的四株菌在37℃在摇瓶中在含有20g/l葡萄糖、0.2M MOPS缓冲液(pH 7.4)、烟酰胺(1mM)、苯丙氨酸(100mg/l)、酪氨酸(100mg/l)、色氨酸(100mg/l)、对羟基苯甲酸(1mg/l)、对氨基苯甲酸(1mg/l)、2,3-二羟基苯甲酸(1mg/l)、酚红(10mg/l)和硫酸铵(1g/l)的补充物的NBS基本培养基(Jantama等人,2008a)中生长48小时。通过针对pH 7.0标准物目视酚红颜色估计，通过按要求对摇瓶人工添加1ml的1.0M KOH等分物，将pH保持在接近7。产生的黏康酸如上所述通过HPLC进行检测，结果显示在表6中。所有三株含有反馈抗性的aroG*等位基因的菌株较之含有野生型aroG等位基因的同基因菌株产生更多的黏康酸。在本文公开的单独实验中，在多拷贝质粒pCP32AMP上含有aroG的菌株MYR205在摇瓶中产生1.5g/l黏康酸。因此，发明人已经显示，较之含有同基因的aroG质粒的菌株，ΔtyrR和单拷贝染色体aroG*的组合可以表现良好地在摇瓶中产生黏康酸。染色体等位基因相较于质粒等位基因的固有的优异遗传稳定性，加之减弱了对于为了维持质粒的选择性培养基的需求，使得本文描述的新菌株更加适合于大规模商业发酵。而且，不需要化学诱导物用于黏康酸通路基因的表达。因此，上述的本发明菌株较之全部在不理想的多拷贝质粒上包含用于过表达DAHP合酶的基因的现有技术(Niu等人,2002)而言有改进。
按与以上针对AroG描述内容相似的方式，可以在质粒上或在染色体中置入产生抵抗由酪氨酸的反馈抑制的AroF或AroH同工酶的突变。优选的突变是将AroF的氨基酸148从脯氨酸变为亮氨酸的点突变，例如通过将密码子148从CCG变为CTG(Weaver等人,1990)，得到命名为aroF*的基因。可以按与以上针对aroG*等位基因描述内容类似的方式通过对酪氨酸类似物(例如o-氟代酪氨酸、m-氟代酪氨酸、p-氟代苯丙氨酸等)的抗性来分离其它aroF*等位基因。可以通过与转座子或卡那霉素抗性插入物关联而选择、富集以及转导aroF*等位基因，例如，在诸如JW2584(CGSC 10051,Coli Genetic Stock Center,Yale University)的菌株中在紧密连接的ΔyfiR::kan中。
实施例3
从染色体DNA缺失aroE和黏康酸生产
在该实施例中研究了过表达多拷贝质粒上的aroB和aroG以及表达在黏康酸通路中有功能的蛋白的编码基因的作用。在编码莽草酸脱氢酶的aroE基因中含有缺失的菌株MYR34被用作这些研究中的亲本菌株。以与上述实施例1中所描述内容相似的方式完成aroE的染色体拷贝的缺失。当用过表达编码在莽草酸通路中有功能的DAHP合酶蛋白的aroG基因的质粒pCP32AMP转化MYR34时，DHS的积累有显著提高。当用从组成型启动子表达aroB基因的质粒转化MYR34时，没有注意到DHS积累的显著提高。然而，当用表达aroB和aroG基因二者的质粒转化大肠杆菌菌株MYR34时，相比使用仅转化有aroG的MYR34时所观察的情况，DHS的积累有增加，因此表明aroB是DHS生产中的第二瓶颈(图5)。
在图6呈现的实验中，检视了整合到宿主染色体DNA中的aroB基因的额外的拷贝的效果。在衍生自MYR34的大肠杆菌菌株MYR170中，将处于P15启动子控制下的aroB基因的额外拷贝在ack基因座处整合到宿主染色体中。当用pCP32AMP质粒转化MYR170菌株时，与用相同质粒转化MYR34菌株时所检测到的DHS积累相比，DHS积累有轻微的增加。MYR170中DHS积累的轻微增加可以归因于整合到宿主染色体DNA中的aroB基因的额外拷贝。当用表达aroB和aroG基因二者的pCP54转化MYR170菌株时，DHS积累有进一步的增加，意味着aroB是DHS生产中的第二瓶颈。
图7提供了使用大肠杆菌菌株MYR34和MYR170的黏康酸生产结果。在建立了在aroE缺失菌株MYR34和MYR170中在aroB和aroG基因的过表达下有DHS积累后，工作致力于观察编码在黏康酸生产通路中有功能的蛋白的“黏康酸通路”基因的表达是否会导致DHS转变成顺，顺-黏康酸。在这些实验中，单独用质粒pMG37或用质粒pMG37和pCP32AMP二者转化大肠杆菌菌株MYR34和MYR170。质粒pMG37表达编码在黏康酸通路中有功能的蛋白的aroZ、aroY和catAX基因。当用质粒pMG37和pCP32AMP二者转化这些细菌菌株时，与仅用pMG37质粒转化的这两种菌株中的黏康酸产量相比，MYR34和MYR170二者中的黏康酸产量增加，这提示在这些菌株中，aroB表达是顺，顺-黏康酸生产的瓶颈。
实施例4
tktA的过表达
由tktA编码的转酮醇酶是戊糖磷酸通路中的关键酶，并被认为对于黏康酸生产中的关键中间体之一——赤藓糖-4-磷酸的生产是限制性的。已知通过将基因及其原生启动子置于多拷贝质粒上来过表达编码转酮醇酶的tktA(Sprenger等人,1995,1995a)能提高进入芳族通路中的流量(Draths等人,1992)。然而，这样的质粒不稳定，并且往往需要抗生素选择以维持。现有技术中的另一方法是向宿主菌株的染色体中添加tktA基因的一个额外拷贝(Niu等人,1992)。然而，tktA的一个额外拷贝及其原生启动子并不足以用赤藓糖-4-磷酸饱和芳族通路，因为其原生启动子并非完全接近于理想。这样，该方法需要实质的改进。
可以例如，通过用强组成型启动子例如来自枯草芽孢杆菌噬菌体SPO1的P15或P26启动子(分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2)，或来自细菌噬菌体λ的PR启动子(SEQ IDNo.3)来替代染色体中的原生tktA启动子，来获得改进的tktA过表达。这通过如实施例1中描述的两步而实现，不同在于在第一步骤中使用camR,sacB盒来取代原生染色体tktA启动子。在第二步中，通过转化线性DNA并进行蔗糖抗性选择而置入强组成型启动子，所述线性DNA包含强组成型启动子，其侧翼是在强组成型启动子下游侧的tktA编码区5’端的至少50个碱基和在强组成型启动子上游侧的就在原生tktA启动子上游的同源的至少50个碱基对。自这样的表达盒的改进的表达还通过增加从表达盒转录的mRNA的稳定性而实现。mRNA稳定性的提高通过在mRNA的5’端、mRNA的3’端或两端增加茎环结构而实现。茎-环结构往往存在于mRNA的末端，其由rho-非依赖性的转录终止子自然终止，但如果不是这样，则可以通过遗传工程的公知方法(连接、PCR等)向DNA序列中添加rho-非依赖性的转录终止子。这样的终止子可以由在各重复序列中的4至20个碱基的反向重复序列组成，所述反向重复序列由3个或更多个碱基的“环”隔开，后接富含T(脱氧胸苷)的一个或多个碱基的区域。反向重复序列富含G和C(脱氧鸟苷和脱氧胞苷)。类似地，可以通过就在转录起始点的下游但在核糖体结合位点之前插入含有如上所述的茎-环但没有T-富集的区的DNA序列，将茎-环构建到mRNA的5’端中。对于此的实例结合P15启动子(SEQ ID No.1)给出。
在过表达tktA基因对经由莽草酸通路的碳流的作用的分析中，大肠杆菌菌株MYR170被用作亲本菌株。MYR170在编码莽草酸脱氢酶的aroE基因中有缺失并在ack基因座处具有aroB基因的额外拷贝。
在图8、9和10所描绘的实验中，使用两种不同质粒，即pCP32AMP和pCP50。质粒pCP32AMP仅从其原生启动子表达DAHP合酶aroG基因，质粒pCP50从其原生启动子表达转酮醇酶基因tktA连同aroG基因。用pCP32AMP和pCP50质粒单独转化具有aroE缺失和在染色体DNA的ack基因座处整合的在P15启动子控制下的aroB基因的额外拷贝的MYR170。如图8所示，与仅表达aroG基因的大肠杆菌细胞相比，aroG基因连同tktA基因的表达使DHS积累进一步增加。
图9提供了用质粒pCP32AMP或pCP50转化的两种不同菌株即MYR34、MYR170中的DHS产率的数据。具有aroE基因缺失的MYR34菌株每消耗1克葡萄糖产生0.1克DHS。当用具有aroG基因过表达的pCP32AMP质粒转化MYR34菌株时，该菌株中的DHS产率增至每消耗1克葡萄糖产生0.15克DHS。MYR170具有在ack基因座处插入的aroB基因的额外拷贝。由于存在aroB基因的该额外拷贝，用pCP32AMP转化的MYR170菌株中的DHS生产的产率稍高于用pCP32AMP转化的MYR34菌株中所观察到的DHS产率。因此，MYR170中aroB的额外拷贝的存在引起增加的经由莽草酸通路的碳流。当用表达aroG和tktA基因二者的质粒pCP50转化MYR170菌株时，观察到DHS产率的进一步提高。因此，tktA的额外拷贝的存在导致经由莽草酸通路的碳流的增加。更具体而言，存在额外的aroB和tktA基因的作用引起对DHS产率的累加效应。
图10中描绘的实验中所使用的MYR261被改造为在poxB基因座处将tktA基因的额外拷贝整合到MYR170的染色体DNA中。MYR261菌株中期望的基因取代(poxB::tktA)通过PCR验证。用pCP32AMP(aroG过表达)质粒或pCP50(aroG和tktA过表达)质粒转化MYR261。作为对照，用pCP32AMP质粒转化MYR170。如图10所示的结果所显示的，与在用相同质粒转化的MYR170菌株中所观察到的DHS生产的滴度相比，MYR261的染色体DNA中tktA基因的额外拷贝的存在增加了pCP32AMP质粒的DHS生产滴度。当用过表达转酮醇酶的质粒pCP50转化菌株时，MYR261中转酮醇酶水平的进一步增加导致DHS生产滴度的进一步提高。由poxB编码的酶PoxB，或丙酮酸氧化酶，产生乙酸盐作为反应产物。这样，如本文描述的因tktA插入引起的poxB缺失去除了乙酸盐生产的潜在活性通路。类似地，同时插入P15aroB并删除编码AckA或乙酸激酶的ackA，如在以下实施例12中所描述的，去除了通向乙酸盐的另一潜在活性通路。乙酸盐产生在发酵中通常是不合人意的(Jantama等人,2008b)。这样，这些缺失可以用于减少乙酸盐生产。
图11提供了在用质粒pCP32AMP和pMG37转化后大肠杆菌MYR170、MYR261和MYR305菌株中的黏康酸和乙酸生产的滴度。通过从染色体DNA中缺失poxB基因从MYR170得到MYR305，而MYR261是MYR170衍生菌，其中poxB基因已经通过插入tktA基因的额外拷贝而失活。如上所述，质粒pCP32AMP表达编码在莽草酸生物合成通路中起作用的DAHP合酶蛋白的aroG基因，导致由于大肠杆菌菌株MYR170、MYR261和MYR305中aroE基因的缺失的DHS的积累。由于质粒pMG37上黏康酸通路基因即aroZ、aroY和catAX的表达，DHS被转化成顺，顺-黏康酸，如图2所示。在MYR261菌株中aroB基因和tktA基因的额外拷贝的存在下，黏康酸生产稍有增加，伴随着乙酸积累的降低。
实施例5
talA或talB的过表达
talB基因编码大肠杆菌中主要的转醛醇酶，但talA基因也编码小部分的转醛醇酶。已知转醛醇酶的过表达提高进入芳族通路的流量(Lu和Liao,1997；Sprenger,1995；Sprenger等人,1995b)。在现有技术中，这是通过在多拷贝质粒上从原生启动子过表达tal基因(现在称为talB基因)而实现的(Lu等人,1997,Sprenger等人,1995b)。然而，这样的质粒并不稳定，并且需要抗生素筛选以维持。因此，需要有改进的方法。可以例如通过用强组成型启动子例如来自枯草芽孢杆菌噬菌体SPO1的P15或P26启动子(分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2)，或来自细菌噬菌体λ的PR启动子(SEQ ID No.3)来替代染色体中的原生talB启动子来获得改进的talB表达。这通过如实施例1中描述的两步而实现，不同在于在第一步骤中使用camR,sacB盒来取代原生染色体talB启动子。在第二步中，通过用线性DNA转化并进行蔗糖抗性选择而置入强组成型启动子，所述线性DNA包含强组成型启动子，其侧翼是在强组成型启动子下游侧的talB编码区5’端的至少50个碱基和在强组成型启动子上游侧的就在原生talB启动子上游的同源的至少50个碱基对。也可以通过相似方法来过表达talA基因，但优选过表达talB基因，因为其编码主要活性(Sprenger,1995；Sprenger等人,1995b)。对于有关设计为用于过表达的表达盒的构建的更多细节，参见实施例4。
实施例6
aroZ、aroY和catAX基因的表达
为证实大肠杆菌所产生的内源性DHS转化成黏康酸，将来自不动杆菌属物种ADP1的异源基因catAX、来自肺炎克雷伯杆菌的aroY、和来自不动杆菌属物种ADP1的quiC克隆到低拷贝质粒pCL1921中强组成型启动子(分别为P15、PR和P26)下(Lerner和Inouye,1990)，以生成“黏康酸质粒”pMG37。携带空载体(pCL1921)或pMG37的MYR34衍生菌在含有2％葡萄糖的摇瓶培养基(补充有芳族氨基酸和维生素的NBS基本培养基)中在37℃生长17小时。收集上清液并通过HPLC分析。与显示DHS积累的MYR34/pCL1921成对比，MYR34/pMG37显示黏康酸的产生(图12)。从后一菌株中没有检测到显著量的DHS或中间体产物如PCA和儿茶酚，提示从pMG37表达的异源基因是有功能并且足够的。
实施例7
aroZ同源物的比较
比较三种不同的aroZ同源物和类似物(图13)将DHS转入黏康酸生产通路的能力。来自不动杆菌属物种ADP1的quiC、来自苏云金芽孢杆菌的asbF和来自粗糙脉孢菌的qa-4被报告为编码具有AroZ样活性的蛋白(Elsemore和Ornston,1995；Fox等人,1995；Rutledge,1984)。这些基因各自经密码子优化以用于在大肠杆菌中表达且通过GeneArt(Invitrogen)合成，并克隆到还分别从P15和PR启动子表达catAX和aroY基因的低拷贝“黏康酸质粒”中强组成型P26启动子下。MYR34/pCL1921、MYR34/pMG37(以quiC作为aroZ的黏康酸质粒)、MYR34/pMG47(以asbF作为aroZ的黏康酸质粒)和MYR34/pMG70(以asbF作为aroZ的黏康酸质粒)在具有含2％葡萄糖、芳族氨基酸和芳族维生素的基本培养基的摇瓶中在37℃生长48小时。收集上清液并通过HPLC分析。如所预期的，转化空载体的MYR34积累DHS且不产生黏康酸。检查的两种aroZ同源物和一种类似物在将DHS转向黏康酸生产中是有功能的，但程度不同。表达quiC基因的MYR34衍生菌最为强烈，显示近乎100％的DHS向黏康酸的转化和微乎其微的DHS存留量。表达真菌aroZ同源物qa-4的MYR34衍生菌以约80％的DHS向黏康酸的转化和20％的DHS存留紧接其后。最后，表达asbF基因的MYR34衍生菌显示仅50％的DHS向黏康酸的转化和50％的DHS存留。汇总而言，在我们的摇瓶测定条件下，与其它aroZ同源物相比，quiC基因的表达和/或活性看起来是最高的。
实施例8
catAX、aroY和quiC的染色体整合
可以通过含有仅在adhE基因座处染色体整合的从组成型启动子表达的catA-X、aroY和quiC的单拷贝的菌株来生产黏康酸。
高DHS生产菌——MYR170(ΔaroE,Δack::P15-aroB)，是用于在染色体中adhE基因座处整合黏康酸通路基因的宿主菌(SEQ ID No.41)。对所得的菌株MYR352转化质粒YEp24(中拷贝，空载体)、pCP32AMP(中拷贝，aroG从原生启动子表达)或pCP50(中拷贝，aroG和tktA从其各自的原生启动子表达)，以生成衍生菌株。后两种质粒用于增加DHS产量。菌株在37℃在如上所述的含2％葡萄糖的摇瓶培养基中生长72小时。在72小时收集上清液并通过HPLC分析。如所预期的，与空载体对照相比，转化有aroG和aroG/tktA的MYR352衍生菌显示出总产物形成的整体提高(图14)。所有的MYR352转化子生产可测量滴度的黏康酸，首次证明黏康酸可以由仅含有整合的“黏康酸通路”基因的菌株生产且不需要补料基因表达的化学诱导物。
任何这些MYR352衍生菌中产生的DHS并非全被转化成终产物黏康酸。相反，有显著量的儿茶酚积累(图14)，提示当catAX在染色体上从单拷贝表达时，其表达或活性是限制性的。由于主要的积累中间体是儿茶酚，可能在用于黏康酸合成的MYR352菌株背景中quiC和aroY基因表达和/或活性是充足的。
将MYR352衍生菌与类似的MYR219衍生菌平行比较。MYR219菌株与MYR170菌株相同，但含有表达黏康酸通路基因的低拷贝质粒pMG37。因此，MYR352与MYR219菌株的主要区别涉及到黏康酸通路基因的剂量(分别为1个拷贝vs.约5个拷贝)。与MYR352衍生菌相反，MYR219衍生菌显示出极少的儿茶酚或其它中间体的积累，并成功地生产终产物黏康酸。总的来说，这些结果表明需要提高菌株例如MYR352中的catAX活性。
实施例9
catAX的表达
MYR352菌株中儿茶酚的积累和不足的黏康酸生产是由于catAX基因产物的有限剂量和/或活性。如上所述，MYR352含有ΔaroE,Δack::P15-aroB和强组成型启动子下的染色体整合的catAX、aroY和quiC基因的单拷贝。用中拷贝的空载体对照(YEp24)或aroG/tktA表达质粒(pCP50)转化该菌株以增加进入芳族氨基酸合成通路的碳流并生产大量的DHS。转化的菌株在如上所述的补充有2％葡萄糖的摇瓶培养基中在37℃生长72小时，导致儿茶酚中间体的积累。该结果提示catAX活性在MYR352中可能不足。为验证该假设，测试一种或多种从低拷贝质粒表达的黏康酸通路基因减弱MYR352/pCP50中儿茶酚积累的能力(图15)。具体而言，还用低拷贝的空载体对照(pCL1921)或表达黏康酸生产通路的所有三种基因、两种基因或一种基因的质粒转化MYR352/pCP50。在如上所述的摇瓶实验中测定衍生菌。尽管单独增加aroY(来自pMG27)或单独增加quiC(来自pMG39)的剂量并未减少儿茶酚积累，但所有的黏康酸通路基因(来自pMG37)的表达或catAX和aroY(来自pMG33)共同的表达导致成功地将儿茶酚转化成黏康酸。此外，单独表达catAX(来自pMG31)足以生产黏康酸和防止儿茶酚积累。
实施例10
构建渗漏aroE突变
在用于生产顺，顺-黏康酸的现有技术方法中，宿主菌株含有名为aroE353的aroE基因突变，其是无效突变。结果，该菌株需要补料从莽草酸通路制备的芳族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)和芳族维生素(对羟基苯甲酸、对氨基苯甲酸，和2,3-二羟基苯甲酸)。在商业上有吸引力的方法中补料芳族氨基酸太过昂贵。这样，现有技术方法需要实质的改进。这可以通过置入渗漏aroE基因(我们会将其称为aroE*)而实现。渗漏突变通过首先产生使aroE编码序列中的一个氨基酸改变引起无效表型的错义突变而获得。这可以通过任何形式的诱变和筛选对于以上列出的六种芳族化合物的同时营养缺陷型而实现。优选方法是利用Taq DNA聚合酶，使用野生型大肠杆菌C基因组DNA作为模板，并使用与aroE编码区上游的约1000个碱基对和下游的1000个碱基对杂交的PCR寡核苷酸引物，通过易错PCR诱变来产生突变体aroE基因池。所得的线性DNA分子池用于转化产生顺，顺-黏康酸并且含有已经取代aroE编码区的整合的camR,sacB盒(对于相关实例参见实施例4)的大肠杆菌C衍生菌，并进行蔗糖抗性选择。然后对转化子筛选已经失去氯霉素抗性并且需要以上列出的六种芳族化合物的营养缺陷型。挑取数个独立的营养缺陷型并通过在没有六种芳族化合物的基本葡萄糖板上铺板约107、108、或109细胞(在基本葡萄糖培养基中漂洗)来测试可复原力(revertability)。挑取在板上产生菌落的复原体并进行顺，顺-黏康酸产生但没有实质性水平的芳族氨基酸产生的测试。在这些复原体中将有这样的菌株，所述菌株携带aroE基因中的一个或多个突变，从而使AroE酶提供充足的芳族氨基酸和维生素用于生长、但又没有这些芳族化合物的剩余。获得渗漏aroE突变体的另一方法是向顺，顺-黏康酸生产菌中置入经典的可回复的aroE突变体如aroE353和aroE24(均可从Yale University的Coli GeneticStock Center,New Haven,CT,USA得到)之一，并如上所述选择复原体。
实施例11
通过易化扩散的葡萄糖输入
芳族通路的第一个关键步骤中的底物之一是磷酸烯醇丙酮酸(PEP)。PEP也是用于通过细菌磷酸转移酶体系(PTS)输入葡萄糖和一些其它糖类的磷酸盐和能量的来源。因此，当细菌在PTS-依赖性的糖上生长时，在PTS和芳族通路之间存在对PEP的竞争。这样，可以通过删除PTS并提供可选的糖摄取通路来实现增加芳族通路流量的显著改进。该问题的一个解决方案是用大肠杆菌GalP通透酶，对于葡萄糖摄取起相当好作用的质子同向转运蛋白(US专利6,692,794)取代PTS。然而，质子同向转运蛋白仍然耗用能量以维持驱动通透酶所必需的质子梯度。这样，对于方法的进一步改进存在需求。
一些糖，例如木糖，可以由从ATP(三磷酸腺苷)的水解获得能量的转运蛋白运输。再一次地，如果可以用需要较少能量的转运蛋白来取代能量依赖性的转运蛋白，那么可以获得改进，因为ATP中固有的能量得以保存用于其它有益用途。
可以通过利用在糖输入中不耗用能量的易化扩散转运蛋白来获得显著改进(Parker等人,1995；Snoep等人,1994)。例如，由glf基因编码的来自运动发酵单孢菌(Zymomonas mobilis)的葡萄糖易化蛋白可以用于代替或额外加至3-脱氢莽草酸盐(DHS)生产菌株中的PTS(Yi等人,2003)。然而，这些菌株仍然至少部分依赖于GalP进行葡萄糖输入。由于GalP需要质子梯度形式的能量用于葡萄糖输入，有需求提高黏康酸生产菌株的葡萄糖输入效率。
用于glf加上葡糖激酶基因glk(也来自运动发酵单孢菌)的表达的盒可以与强组成型启动子如P26组装。然后可以将该盒在不妨碍期望的化合物(在这种情况下为顺，顺-黏康酸)的生产的位置处整合到宿主菌株的基因组中。大肠杆菌染色体中这样的位置的实例是苏氨酸降解操纵子，tdcABCDEFG。如果生长培养基不含苏氨酸，则不需要操纵子或该操纵子不表达，由此在该操纵子中插入表达盒不会妨碍代谢。
为实现上述的改进，利用与实施例1中所公开内容相似的方法将一个或多个编码PTS功能的基因缺失。例如可以缺失ptsH、ptsI、crr或ptsG中的一个或多个。接着缺失galP。然后可以在两步步骤中置入P26-glf,glk盒，与实施例1中所描述内容相似。在第一步中，利用源自pAC21(SEQ ID No.15)的线性DNA在tdc操纵子处整合camR,sacB盒，并进行氯霉素(30mg/l)抗性选择。在第二步骤中，利用源自pAC19(SEQ ID No.15)的线性DNA在tdc操纵子处整合P26-glf,glk盒，进行蔗糖抗性选择并进行氯霉素敏感度筛选，在这种情况下是在基本葡萄糖培养基上的改进生长。
为测试葡萄糖的易化扩散是否能替代大肠杆菌中常规的葡萄糖输入体系，从MYR34(ΔaroE)中缺失ptsHI基因和galP基因，然后利用源自pAC19(SEQ ID No.14)的线性DNA在tdc操纵子处整合P26-glf,glk盒，得到菌株MYR217。MYR217在补充有所需的三种芳族氨基酸和三种芳族维生素样化合物的基本葡萄糖培养基上生长相当好(图16)。然而，含有ptsHI和galP缺失但不含有glf,glk盒的菌株MYR31并未显示出任何可测量的生长(图16)。因此，易化扩散足以取代我们的菌株背景中的两种常规葡萄糖输入体系。
为测试易化扩散是否可用于生产源自芳族通路的化合物，用pCP54(aroG,aroB)和pCP55(aroG,aroB,tktA)转化MYR34和MYR217。对这两种菌株比较摇瓶中芳族中间体3-脱氢莽草酸盐(DHS)的生产(图17)。在pCP54或pCP55的情况下，利用易化扩散的菌株产生与利用常规葡萄糖输入体系的菌株相比同样多或更多的DHS。DHS生产是经改造的大肠杆菌菌株中黏康酸生产的良好代表，因此我们可以得出结论，葡萄糖的易化扩散对于黏康酸生产是有用的改进。
实施例12
aroB基因的过表达
据报道aroB基因的表达对于顺，顺-黏康酸生产是限速性的(Niu等人,2002)。在现有技术中，据称这是通过整合aroB基因的第二拷贝与其原生启动子而解决的。然而，这并不足以缓解aroB限制，因为aroB基因的原生启动子和核糖体结合位点还远不够理想。这样，该方法需要实质的改进。
可以例如通过用强组成型启动子例如来自枯草芽孢杆菌噬菌体SPO1的P15或P26启动子(分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2)，或来自细菌噬菌体λ的PR启动子(SEQ ID No.3)来替代染色体中的原生aroB启动子来获得改进的aroB过表达。这通过如实施例4中描述的两步而实现，不同在于在第一步骤中使用camR,sacB盒来取代原生染色体aroB启动子和/或核糖体结合位点。在第二步中，通过用线性DNA转化并进行蔗糖抗性选择而置入强组成型启动子，所述线性DNA包含强组成型启动子，后接核糖体结合位点和在强组成型启动子的下游侧的自aroB编码序列5’端的至少50个碱基(包括ATG起始密码子)，以及在强组成型启动子上游侧的就在原生aroB启动子上游的同源的至少50个碱基对。除了置入更强启动子外或代替置入更强启动子，利用相似方法，可以在aroB的ATG翻译起始密码子上游的约4至10个碱基对处置入更强的核糖体结合位点例如AGGAGG。这样的合成盒例如P15-aroB盒的拷贝可以在不同于原生aroB基因座的基因座处例如在ack基因座处整合到染色体中。如实施例4中同时缺失ack基因并缺失poxB基因可帮助减少发酵过程中不希望的乙酸盐形成。
实施例13
降低经由戊糖磷酸通路的氧化分支的流量
芳族通路中第一关键步骤所需的赤藓糖-4-磷酸来源于戊糖磷酸通路(PPP)的非氧化部分。存在两种不同的通路可让碳进入PPP。第一种是从葡萄糖-6-磷酸通过酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(由zwf基因编码)、6-磷酸葡糖酸内酯酶(由pgl基因编码)和6-磷酸葡糖酸脱氢酶(由gnd基因编码)，得到核酮糖-5-磷酸。在这三个步骤的最后，一个碳作为CO2损失。这种进入PPP的通路称为PPP的氧化分支。核酮糖-5-磷酸然后通过异构酶、差向异构酶、转酮醇酶和转醛醇酶的作用被转化成多种其它糖磷酸盐。这组起始于核酮糖-5-磷酸的可逆反应被称为PPP的非氧化分支。第二种碳进入PPP的通路是通过果糖-6-磷酸和甘油醛-3-磷酸(二者都来自Embden-Myerhoff通路，也称为糖酵解)，它们可经转醛醇酶和转酮醇酶组合和重排而得到多种其它糖磷酸盐，其中之一是赤藓糖-4-磷酸。如果碳是通过该第二途径进入PPP，则没有CO2损失。为了提高自葡萄糖的顺，顺-黏康酸产率，通过阻断PPP的氧化分支从而使所有进入PPP的碳必须经历自果糖-6-磷酸和甘油醛-3-磷酸的非氧化途径，可以防止CO2损失。利用与实施例1所公开的用于缺失tyrR基因的内容相似的两步法，通过缺失zwf基因来完成PPP氧化分支的阻断。
实施例14
增加通向芳族通路和经由PEP通向芳族通路的流量
理想的是确保PEP不是顺，顺-黏康酸通路上的限速中间体。这是例如，通过增加丙酮酸通过酶PEP合成酶向PEP的再循环而实现的，这是通过如以上在其它实施例中所描述的整合pps基因的过表达盒而实现的。另一方法是限制丙酮酸激酶的PEP消耗，丙酮酸激酶在大肠杆菌中由pykA和pykF基因编码。在这种情况下，方法是降低(一种或多种)酶的活性。这是通过缺失一种或多种编码丙酮酸激酶的基因(如实施例1中对于tyrR所描述的)，或降低这些基因中的一种或多种的表达强度，如通过突变启动子、核糖体结合位点或编码序列从而使丙酮酸激酶活性的水平降低而实现的。例如，大肠杆菌pykA基因之前的RBS是5’CGGAGTATTACATG。ATG翻译起始密码子加下划线。该序列可以突变成CaGAGTATTACATG、CaaAGTATTACATG、CaatGTATTACATG、CaataTATTACATG等等，从而通过一次一个碱基变化使RBS序列变得与AGGAGG的共有RBS更加不同。然后将各个突变的形式引入到染色体中pykA基因座处，取代野生型，并测量黏康酸生产水平的改进。
实施例15
赋予蔗糖上的生长
源自大肠杆菌C的菌株不能以蔗糖作为唯一碳源生长。然而，如PCT专利申请PCT/US11/064598中(在此整体地并入本文以作参考)所公开的，它们可经基因改造而如此生长。这样，可以改造顺，顺-黏康酸生产菌株使其在蔗糖上生长，如以上提及的申请中所公开的那样。
实施例16
改进的顺，顺-黏康酸生产者
可以通过一个接一个地安置特征将实施例1-15中所描述的所有特征组合到一株大肠杆菌菌株中。所得的菌株包含改进的顺，顺-黏康酸生产者。随后可通过在与第一拷贝的位置隔开的位置，一次一个地整合各个上述过表达盒的第二拷贝，对所得菌株进行再进一步的改进。方便且安全的位置的实例是在就在rrfF(其编码核糖体RNA)的终止子下游的BsrB1限制性位点。期望的盒作为平端线性DNA连接到质粒pMH17F(SEQ ID No.17)中唯一的BsrB1位点。实例是catAX表达盒连接以得到名为pcatAX的质粒。平行地，camR,sacB盒作为平端片段连接到pMH17F中以得到pMH28F(SEQ ID No.19)。使用通过PCR或通过限制性酶切从pMH28得到的线性DNA在rrfF位点处保存camR,sacB盒。接着，利用在蔗糖上选择，使用通过PCR或通过限制性酶切从pcatAX得到的线性DNA在rrfF基因座处安置catAX盒的第二拷贝。然后将所得的菌株与祖代亲本菌株比较顺，顺-黏康酸生产，以确定catAX是限制性步骤。通过相似的方法，对来自实施例2-15的各个盒测试限速步骤。如果发现步骤是限速性的，则在染色体的另外其它合适位置处整合相关盒的一个或多个额外的拷贝，引起顺，顺-黏康酸生产的更进一步改善，而不需要质粒或可诱导的启动子。
实施例17
通过发酵生产顺，顺-黏康酸
可以通过以上实施例1-15中所公开的经基因改造的微生物来生产顺，顺-黏康酸。生长培养基可以广泛地不同，并且可以是任何支持微生物充分生长的培养基。优选的培养基是含有矿物盐和非芳族碳源例如葡萄糖、木糖、乳糖、甘油、乙酸、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、麦芽糖或蔗糖的基本培养基(关于优选基本生长培养基的实例参见上文)。对于经改造的微生物和生长培养基的各个组合，通过常规实验来确定生产顺，顺-黏康酸的合适条件，在所述常规实验中，发酵参数系统性地变化，例如温度、pH、通气速率和用于维持pH的化合物。随着顺，顺-黏康酸产生，必须向发酵罐中补料一种或多种化合物以防止pH变得太低。用来中和酸的优选化合物包括碱性盐，如铵、钠、钾、钙、镁的氧化物、氢氧化物、碳酸盐和碳酸氢盐，或者两种或更多种的这类碱盐的组合。
大肠杆菌MYR428菌株在7升发酵罐中的黏康酸生产示于图18。对具有基因型ΔaroEΔackA::P15-aroBΔpoxB::tktA的大肠杆菌MYR261菌株转化质粒pCP32AMP和pMG37以产生MYR428。MYR428在如上所述的7升发酵罐中以葡萄糖补料生长48小时。最终黏康酸滴度为16g/l(参见图18)。
在发酵完成后，通过絮凝、离心和/或过滤来移除细胞，然后通过一个或多个后续步骤例如沉淀、结晶、电渗析、层析(离子交换型、疏水亲和性、和/或基于尺寸的)、微滤、纳滤、反渗透和蒸发的组合从澄清发酵液中纯化顺，顺-黏康酸。
本发明公开了如下实施方案：
1.从非芳族碳源开始生产顺，顺-黏康酸的经基因改造的微生物，其中将所有编码在黏康酸通路中起作用的蛋白质的基因整合到所述微生物的染色体DNA中。
2.实施方案1的经基因改造的微生物，其中所述编码在黏康酸通路中起作用的蛋白质的基因选自由aroZ、qa-4、asbF、quiC、aroY、和catAX组成的组。
3.实施方案1的经基因改造的微生物生物体，其包含编码不动杆菌属(Acinetobacter)细菌的QuiC酶或所述QuiC酶的同源物的基因。
4.实施方案1的经基因改造的微生物，其包含一种或多种编码在莽草酸通路中起作用的蛋白质的外源基因。
5.实施方案4的经基因改造的微生物，其中将所述编码在莽草酸通路中起作用的蛋白质的外源基因中的一种或多种整合到所述生物体的染色体DNA中。
6.实施方案4的经基因改造的微生物，其中所述编码在莽草酸通路中起作用的蛋白质的外源基因选自由aroB、aroD、aroF、aroG、aroH、tktA、talB、rpe和rpi组成的组。
7.实施方案4的经基因改造的生物体，其中所述编码在黏康酸通路或莽草酸通路中起作用的蛋白质的基因无一从需要补料化学品用于诱导的启动子表达。
8.实施方案1的经基因改造的宿主细菌，其中芳族氨基酸生物合成的负调节蛋白的活性实质上降低或消除。
9.实施方案8的经基因改造的微生物，其中芳族氨基酸生物合成的负调节蛋白是TyrR蛋白或TyrR蛋白的同源物。
10.实施方案8的经基因改造的微生物，其中编码芳族氨基酸生物合成的负调节蛋白的基因已被突变。
11.实施方案1的经基因改造的生物体，其包含编码渗漏AroE酶的aroE基因。
12.实施方案1的经基因改造的微生物生物体，其中至少一种在莽草酸通路中有活性的酶实质上抵抗所述微生物的代谢物的抑制。
13.实施方案12的经基因改造的生物体，其包含aroG*基因，所述aroG*基因编码实质上抵抗苯丙氨酸抑制的DAHP合酶。
14.实施方案12的经基因改造的生物体，其包含编码DAHP合酶的aroG*基因，所述aroG*基因选自由aroG*20-893、aroG*20-897、aroG*20-899、aroG*20-901、aroG*111、aroG*211、aroG*212、aroG*311、aroG*312、aroG*411、aroG*412和aroG*511组成的组。
15.实施方案1的经基因改造的微生物，其中所述微生物是细菌。
16.实施方案1的经基因改造的微生物，其中所述微生物衍生自大肠杆菌(Escherichia coli)C。
17.经基因改造的细菌，其在PEP依赖性磷酸转移酶体系中有缺陷、在用于葡萄糖输入的基于GalP蛋白的体系中有缺陷，且包含编码功能性的葡萄糖易化扩散蛋白的外源基因。
18.如实施方案17中的经基因改造的细菌，其中功能性的葡萄糖易化扩散蛋白是由glf基因编码的Glf蛋白。
19.如实施方案17中的经基因改造的细菌，还包含编码葡糖激酶的外源基因。
20.如实施方案17中的经基因改造的细菌，还包含一种或多种外源基因，所述外源基因编码在从非芳族碳源开始生产顺，顺-黏康酸的黏康酸通路中起作用的蛋白质。
21.实施方案20的经基因改造的细菌，其中所述编码在黏康酸通路中起作用的蛋白质的基因选自由aroZ、qa-4、asbF、quiC、aroY和catAX组成的组。
22.如实施方案17中的经基因改造的细菌，还包含一种或多种在染色体上整合的外源基因，所述外源基因编码在莽草酸通路中起作用的蛋白质。
23.如实施方案22中的经基因改造的细菌，其中所述编码在莽草酸通路中起作用的蛋白质的外源基因选自由aroB、aroD、aroF、aroG、aroH、tktA、talB、rpe和rpi组成的组。
24.实施方案17的经基因改造的细菌，其中芳族氨基酸生物合成的负调节蛋白的活性被实质上降低或消除。
25.实施方案17的经基因改造的细菌，其中芳族氨基酸生物合成的负调节蛋白是TyrR蛋白或TyrR蛋白的同源物。
26.实施方案17的经基因改造的细菌，其中编码芳族氨基酸生物合成的负调节蛋白的基因已被缺失或突变。
27.实施方案17的经基因改造的细菌，其中至少一种在莽草酸通路中有活性的酶实质上抵抗所述微生物的代谢物的抑制。
28.实施方案17的经基因改造的细菌，其中所述微生物衍生自大肠杆菌C。
29.从非芳族碳源开始生产顺，顺-黏康酸的经基因改造的微生物，其中编码在黏康酸通路和莽草酸通路中起作用的蛋白质的外源基因不从需要补料化学品用于诱导的启动子表达。
30.如实施方案29中的经基因改造的微生物，其中所述微生物是细菌。
31.如实施方案29中的经基因改造的微生物，其中所述微生物是大肠杆菌。
32.从非芳族碳源开始产生顺，顺-黏康酸的经基因改造的微生物，所述微生物包含编码渗漏AroE酶的aroE基因。
33.如实施方案32中的经基因改造的微生物，其中所述微生物是细菌。
34.如实施方案32中的经基因改造的微生物，其中所述微生物是大肠杆菌。
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<400> 1
gctattgacg acagctatgg ttcactgtcc accaaccaaa actgtgctca gtaccgccaa 60
tatttctccc ttgaggggta caaagaggtg tccctagaag agatccacgc tgtgtaaaaa 120
ttttacaaaa aggtattgac tttccctaca gggtgtgtaa taatttaatt acaggcgggg 180
gcaaccccgc ctgtt 195
<210> 2
<211> 164
<212> DNA
<213> P26 启动子;
<400> 2
gcctacctag cttccaagaa agatatccta acagcacaag agcggaaaga tgttttgttc 60
tacatccaga acaacctctg ctaaaattcc tgaaaaattt tgcaaaaagt tgttgacttt 120
atctacaagg tgtggtataa taatcttaac aacagcagga cgct 164
<210> 3
<211> 91
<212> DNA
<213> PR 启动子;
<400> 3
acgttaaatc tatcaccgca agggataaat atctaacacc gtgcgtgttg actattttac 60
ctctggcggt gataatggtt gcatgtacaa g 91
<210> 4
<211> 359
<212> PRT
<213> 由qa-4基因编码的3-脱氢莽草酸脱水酶;
<400> 4
Met Pro Ser Lys Leu Ala Ile Ser Ser Met Ser Leu Gly Arg Cys Phe
1 5 10 15
Ala Gly His Ser Leu Asp Ser Lys Leu Asp Ala Ala Gln Arg Tyr Gly
20 25 30
Tyr Leu Gly Ile Glu Leu Phe Tyr Glu Asp Leu Val Asp Val Ala Glu
35 40 45
His Leu Ser Asn Glu Arg Pro Ser Pro Glu Gly Pro Phe Val Glu Ala
50 55 60
Gln Ile Ala Ala Ala Arg His Ile Leu Gln Met Cys Gln Ala Arg Gly
65 70 75 80
Leu Glu Val Val Cys Leu Gln Pro Phe Met His Tyr Asp Gly Leu Asn
85 90 95
Asp Arg Ala Glu His Glu Arg Arg Leu Glu Lys Leu Ala Leu Trp Ile
100 105 110
Glu Leu Ala His Glu Leu His Thr Asp Ile Ile Gln Ile Pro Ala Asn
115 120 125
Phe Leu Pro Ala Asn Gln Val Ser Asp Asn Leu Asp Leu Ile Val Ser
130 135 140
Asp Leu Cys Lys Val Ala Asp Ile Gly Ala Gln Ala Leu Pro Pro Ile
145 150 155 160
Arg Phe Ala Tyr Glu Ser Leu Cys Trp Ser Thr Arg Val Asp Leu Trp
165 170 175
Glu Arg Cys Trp Asp Ile Val Gln Arg Val Asp Arg Pro Asn Phe Gly
180 185 190
Ile Cys Leu Asp Thr Phe Asn Ile Leu Gly Arg Ile Tyr Ala Asp Pro
195 200 205
Thr Ser Pro Ser Gly Arg Thr Pro Asn Ala Lys Glu Ala Val Arg Lys
210 215 220
Ser Ile Ala Asn Leu Val Ser Arg Val Asp Val Ser Lys Val Phe Tyr
225 230 235 240
Val Gln Val Val Asp Ala Glu Arg Leu Ser Lys Pro Leu Leu Pro Gly
245 250 255
His Pro Tyr Tyr Asn Pro Glu Gln Pro Ala Arg Met Ser Trp Ser Arg
260 265 270
Asn Cys Arg Leu Phe Tyr Gly Glu Thr Glu Tyr Gly Ala Tyr Leu Pro
275 280 285
Val Lys Glu Val Ala Arg Ala Leu Phe His Gly Ile Gly Phe Glu Gly
290 295 300
Trp Val Ser Leu Glu Leu Phe Asn Arg Arg Met Ser Glu Glu Gly Pro
305 310 315 320
Glu Val Pro Glu Glu Leu Ala Met Arg Gly Ala Ile Ser Trp Ala Lys
325 330 335
Leu Val Gln Asp Leu Arg Ile Pro Val Glu Gly Pro Leu Val Thr Met
340 345 350
Pro Arg Val Ser Ala Ser Leu
355
<210> 5
<211> 2160
<212> DNA
<213> 来自粗糙脉孢菌的qa-4基因加周围序列;
<400> 5
gaattcggga aatggaatct tacctgggaa ccgaaatcac agtccgggta ggttatagag 60
catatagtga actgtcaaag ttctagacct ggaccagcca cttggagtcg ttgttttagt 120
tatacctaca ttcactcact gttgactttc aatcatactt acttagacgg agcaacgcgc 180
cagaatccaa attgttgcat agttgcggta tcaccaagtg gcttcccata atagtttgcc 240
attcgatgag acagctaact ggaagaccgg tactcgcagg ttgcacgatt acacggaagg 300
attcggtatt ccgtgtttca tctgtcaaag tccctttcca tatgaatccg aggtactatg 360
actggatctc gatacaagct ggccagcgag gtgcctgcct tgacaggctg tcaactgcgg 420
gacggccggc taagtgttta acacgcaagg gtggaagatg tctcgtcccg tcatccaaga 480
ccgtcaacat tcgaggccat ctgatcgttg aagagatgct aaatcttgtg aaacgctcat 540
aggtcgctta ccttcggccc acccgttaat gctttattcc gctgagcaaa cttcggcttc 600
catcccgcgg ttcaccgttt acatcactta tcgttgcggt tattggccga ttcttcgcaa 660
accgaaacga tgacatcccg aatatctgca atacaccgcc acggccggcg tctttatcac 720
acctcctatg ggagacgaaa gtgccttgat acccctagtc atttgaagat tcaggatggg 780
agacggctgg ccgcttgcgg agttacgttc gagtcttggt cgcaggaacg cttgccgtat 840
tgaatgagac cccgagaagg tcaaatcaaa tcttggaaga ccccaactgc ttcctcattg 900
ccttcactcc ccatatcaat ggggcacatc ctgtgactac cttggtgctt tatttcctca 960
ccatttggcg atacaagctc aaggacaccg aggtgatata cagttcttca aggacactat 1020
ctcacctcaa tatcaagaac cagtctcatc atctcttatt tctccaggat ccccccacca 1080
acaacatcgg cttttttttt tcccctattc tcaagaccca tcaagacgct cacttcgctg 1140
agcctttcgc catgccgtca aagctagcca ttagttccat gtccctaggg cgctgctttg 1200
ccggccactc tctggacagc aagcttgatg ccgctcaacg atacggctat cttggtatcg 1260
agctttttta tgaggatctg gtcgacgttg cagagcattt gtcgaacgag cgtccctctc 1320
ccgaaggccc ttttgtcgaa gctcagatag ccgccgctcg tcatattctc cagatgtgtc 1380
aagccagggg gcttgaggtc gtctgcctcc agcctttcat gcactacgac ggccttaacg 1440
acagggcaga acatgagcgt cgtctggaga agctagcact atggattgag ctcgctcatg 1500
agcttcacac cgacatcatt cagatcccag ccaacttcct ccctgccaac caagtcagtg 1560
acaacctcga cctgattgtc tcagatcttt gcaaggtggc cgatattgga gctcaagctt 1620
tgccccctat ccgctttgcc tacgagagtc tttgctggag cacccgtgtc gacctctggg 1680
agcgctgctg ggacatcgta caacgcgttg accgccccaa ctttggcatt tgccttgaca 1740
ccttcaacat cctcggccgc atctatgccg accctacatc tcctagcggt aggacaccca 1800
acgcaaaaga ggcagtcagg aagtccatcg ccaacttggt ctcgcgcgtg gatgtctcca 1860
aagtcttcta cgtccaggtg gttgacgccg agaggctgag caagccacta ctgcccggtc 1920
acccgtatta caatccagag cagccggcga ggatgagctg gtcgcgcaat tgtagactgt 1980
tctacggcga aacagaatat ggtgcgtatc ttcccgtgaa ggaggttgct cgagcccttt 2040
tccacggcat tggtttcgag ggctgggtca gtttggagct tttcaaccgc agaatgtctg 2100
aggagggacc tgaagtgccg gaggaacttg ccatgagagg cgctatctcg tgggccaagt 2160
<210> 6
<211> 348
<212> PRT
<213> 由qutC基因编码的来自构巢曲霉的QutC;
<400> 6
Met Pro Ala Asn Leu Lys Ile Gly Ile Pro Thr Val Ser Leu Ser Lys
1 5 10 15
Pro Gly Leu His Ser Leu Asp His Lys Leu Arg Ser Ala Ala His Gly
20 25 30
Phe Ala Gly Ile Glu Leu Phe Ile Asp Asp Leu Ser His Phe Ala Ser
35 40 45
Ser Ser Phe Asn Gly Ser Leu Thr Gln Ala Ala Lys Tyr Ile Ser Ser
50 55 60
Leu Ala Lys Gln Leu Asn Leu Thr Phe Ile Cys Leu Gln Pro Phe Gly
65 70 75 80
Phe Tyr Glu Gly Leu Val Asp Thr Asn Gln Ser Thr Tyr Leu Leu Thr
85 90 95
Glu Lys Leu Pro Leu Trp Phe Ala Ile Ala Arg Ile Ile Gly Thr Asp
100 105 110
Leu Ile Gln Ile Pro Ala Asn Phe Leu Gln Asn Asp Pro Val Thr Gly
115 120 125
Ala Ala Arg Thr Ser Gly Asp Ile Arg Leu Ile Val Ser Asp Leu Gln
130 135 140
Thr Ile Ala Asp Ile Gly Val Lys Gln Gly Phe Arg Phe Val Tyr Glu
145 150 155 160
Ala Leu Cys Trp Ser Thr His Val Asp Thr Trp Glu Ala Ala Trp Asn
165 170 175
Val Val Lys Leu Val Asp Arg Glu Asn Phe Gly Ile Cys Leu Asp Ser
180 185 190
Phe Asn Thr Arg Thr Pro Leu Pro Ser Leu Gly Arg Arg Arg Met Leu
195 200 205
Ser Lys Pro Trp Pro Ser Pro Trp Arg Arg Ser Val Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Glu Asn Trp Thr Ser Gly Lys Ser Ser Thr Ser Ser Leu Ser Met
225 230 235 240
Ala Ser Gly Cys Arg Arg Arg Trp Thr Arg Ser Thr Pro Phe Met Trp
245 250 255
Arg Ala Asn Pro Arg Arg Met Ser Trp Ser Arg Asn Ala Arg Leu Phe
260 265 270
Pro Cys Glu Glu Glu Arg Gly Gly Tyr Leu Pro Val Leu Glu Ile Ala
275 280 285
Arg Ala Phe Phe Glu Ile Gly Phe Glu Gly Trp Val Ser Leu Glu Leu
290 295 300
Phe Ser Arg Thr Cys Asn Asp Pro Asp Val Asn Thr Val Gly Glu His
305 310 315 320
Ala Arg Arg Gly Met Asp Arg Arg Arg Arg Val Val Ala Ala Leu Gly
325 330 335
Leu Asp Val Glu Val Pro Ala Arg Asn Cys Glu Cys
340 345
<210> 7
<211> 3298
<212> DNA
<213> 来自构巢曲霉的qutC基因的加周围序列;
<400> 7
aagcttggtt tcaagtgatg atatatagtt atgaggatat aatatgaacc gaaagacgat 60
gtttcttgtg aatatttacg tgatagttgt ctgtctaata tggtacagca gtagaacaac 120
tacatacggt cactacttac agccctagtc attccctccc tcgattgcct accatttata 180
cactttgaac atccacaggc ttgcctccct ccatactctc cctaacagct tgaacaactc 240
tgagcgccct caccccatct tcaacgccac agccaactcc tcgctcgcca tcctcaccct 300
ttccactaac aacatcaaca aaatatcccc actgcgcatc aaacggcctc acatcagcat 360
ccttcactga aatctgctgc atcgccaact ccgtattcca gcctttctct ttcccctgtc 420
cacaagaaac atggtcatag ctccagcgcg tcatatcagg cacactgaga ctcgctctgg 480
ttccaagaat tcgataacag tcgcttgcac tcttggaagg agcgggcgga atcgtaggat 540
tctcgcccgt tcctgtttca aagttcaacg gcgaaggcgt cgcgtcgcag atgagaaatg 600
tgcctactat cccagacgca aagcgcagcg tcacagcaca gccttcctcg gcggtatgtt 660
ccgggttctg gcgcatgcgc tgcaggagtg taccctccgc gtagacccta ctgacgggcc 720
caaacagaaa ctgcagcacg tcgatatcgt ggataagatt aatccccagc acgccgccct 780
tcttcttatc tgcgcgccaa gaaccgagcg gcggcgcgaa gtaagaggcc ggcttcagaa 840
gtgtccagag gccgttcact gcaacgacgg tgccgagtga gtctgtctct aacaaagact 900
ttgtggtttg gatgtacgga ttgaagcggc ggtggtggcc gatctggatg ttgatcttcg 960
catccttgcc tctcttctca tctttacatt tctgttcctt gacggtagcg aggaggtgct 1020
cggccgactc cagatcgtca ctgatcggtt tctcaaggag gatattgcgg attccgttct 1080
ccagcagctg gagcgtgacg tccacgtgcg tgtgattggg cgtgctcacg atcgccgcgt 1140
ctggtttccc ggttgtctta ccgacaacgt ctaacataga cgtaatagaa tcatagcaag 1200
gaacgccaaa tgattctgcg accgggattg cagagggtga agggtcaaca aaagcgatca 1260
gctgggttcg tgggtgtcgt tgcacggatt gtgcgtgacg gggcccaata agtccggcac 1320
cgacgatgac aatgaggata ttcttgtcct tttccttgct gcagggcacc attgtgcatg 1380
tcggtggctg gaaataaaca gaacagggat atggtcaagt cggagaatcg gtgcaggata 1440
gaccggctac ttgatgtagg acgacagtcg cgatctaccg agagcgtgag attcactgtg 1500
ggactgattt atgtaatttg aggcgcagca gacttaggga cttgaaatgt ggctgtctgt 1560
ggatgcattt gcggggtatg gagtacagag tgcatacagc tgtgtatatg gagttcctta 1620
cggagagggt gacctggtat ggggagaacg ggcaaaatgc tcacccggca acctctcaaa 1680
gcgtttaccc ggtatactcc tctgatatca atatttccaa tcagcaccta tatcatcacg 1740
acgctctcct gaggattccg tagctaaccg ccctggatcc tacattaata aataagccat 1800
ttgctttttc tgctgcgagt gtgattctca atacgattac gtatcacatg cagattgcct 1860
ttacttcagc tgcatttgat cagccacagc tctaagagca aacataccct acctacctac 1920
ctacttcgcc tagggtacat aatcaccgcc atctcctcct cgatcagtct tcaactcaat 1980
cagctcattc attctattct taatataata tataccttta gatctccagc agagacccga 2040
agagtcggca attcaaaatg cccgcaaacc tcaaaatcgg tatcccaacc gtgtccctgt 2100
caaaaccggg cctgcactct cttgaccata agctccgctc ggccgctcat ggcttcgcgg 2160
ggatcgagct gtttattgat gacctctccc atttcgcctc atcgtcattc aatggctccc 2220
tcactcaagc ggcaaagtat atctcctcgc tcgccaagca acttaacctc acatttatct 2280
gcctgcaacc attcggtttc tacgagggtc tggtggacac aaatcagtcg acgtacctgc 2340
tcactgagaa actcccgctc tggtttgcga tcgcccgcat tataggcaca gatctcatcc 2400
aaatccccgc aaatttcctc cagaatgacc ctgtcaccgg ggctgcacga acaagcggcg 2460
acataaggct tatcgtctca gatctgcaga cgatcgcaga tatcggtgta aagcagggct 2520
tccgctttgt gtacgaggcg ctctgctggt cgacgcatgt cgatacatgg gaagcagcgt 2580
ggaatgtcgt caagctggtt gatagagaga atttcgggat ctgcctggat agcttcaaca 2640
cgcggacccc gcttccgtca ctgggaagac gccggatgct gagcaagccg tggccaagtc 2700
catggagacg ctccgttctc tcgtctccag tggagaactg gacatcagga aaatcttcta 2760
catccagctt gtcgatggcg agcggttgtc ggcgccgctg gacgagaagc acccctttca 2820
tgtggagggc caacccccga agaatgagct ggagtcgcaa tgcgcggtta ttcccctgtg 2880
aagaggagag gggtgggtat cttcctgtgt tggagatcgc gagggcgttc tttgaaatcg 2940
ggttcgaggg gtgggtgagt ctagagctgt tttcaaggac gtgtaatgat cccgatgtga 3000
acacggtggg ggagcatgcg agacgtggga tggatagaag gaggagggtt gttgcggcgc 3060
taggactcga tgttgaggtg ccagcacgta actgtgaatg ttagcatgaa cggcaaggag 3120
agggtggagg tgcaggtgca ggaggagctg gctgttcagc atcggctgta ggtagtggta 3180
tcttgaaagg acgatagggt ttgatctaga gatttttatt ttgtctaatt actggtaatg 3240
atggcctcat gcacgctgtt gaacacgctg tacaacatca ctgttgaaga tgatacct 3298
<210> 8
<211> 502
<212> PRT
<213> 来自肺炎克雷伯杆菌 ATCC25597的AroY;
<400> 8
Met Thr Ala Pro Ile Gln Asp Leu Arg Asp Ala Ile Ala Leu Leu Gln
1 5 10 15
Gln His Asp Asn Gln Tyr Leu Glu Thr Asp His Pro Val Asp Pro Asn
20 25 30
Ala Glu Leu Ala Gly Val Tyr Arg His Ile Gly Ala Gly Gly Thr Val
35 40 45
Lys Arg Pro Thr Arg Ile Gly Pro Ala Met Met Phe Asn Asn Ile Lys
50 55 60
Gly Tyr Pro His Ser Arg Ile Leu Val Gly Met His Ala Ser Arg Gln
65 70 75 80
Arg Ala Ala Leu Leu Leu Gly Cys Glu Ala Ser Gln Leu Ala Leu Glu
85 90 95
Val Gly Lys Ala Val Lys Lys Pro Val Ala Pro Val Val Val Pro Ala
100 105 110
Ser Ser Ala Pro Cys Gln Glu Gln Ile Phe Leu Ala Asp Asp Pro Asp
115 120 125
Phe Asp Leu Arg Thr Leu Leu Pro Ala His Thr Asn Thr Pro Ile Asp
130 135 140
Ala Gly Pro Phe Phe Cys Leu Gly Leu Ala Leu Ala Ser Asp Pro Val
145 150 155 160
Asp Ala Ser Leu Thr Asp Val Thr Ile His Arg Leu Cys Val Gln Gly
165 170 175
Arg Asp Glu Leu Ser Met Phe Leu Ala Ala Gly Arg His Ile Glu Val
180 185 190
Phe Arg Gln Lys Ala Glu Ala Ala Gly Lys Pro Leu Pro Ile Thr Ile
195 200 205
Asn Met Gly Leu Asp Pro Ala Ile Tyr Ile Gly Ala Cys Phe Glu Ala
210 215 220
Pro Thr Thr Pro Phe Gly Tyr Asn Glu Leu Gly Val Ala Gly Ala Leu
225 230 235 240
Arg Gln Arg Pro Val Glu Leu Val Gln Gly Val Ser Val Pro Glu Lys
245 250 255
Ala Ile Ala Arg Ala Glu Ile Val Ile Glu Gly Glu Leu Leu Pro Gly
260 265 270
Val Arg Val Arg Glu Asp Gln His Thr Asn Ser Gly His Ala Met Pro
275 280 285
Glu Phe Pro Gly Tyr Cys Gly Gly Ala Asn Pro Ser Leu Pro Val Ile
290 295 300
Lys Val Lys Ala Val Thr Met Arg Asn Asn Ala Ile Leu Gln Thr Leu
305 310 315 320
Val Gly Pro Gly Glu Glu His Thr Thr Leu Ala Gly Leu Pro Thr Glu
325 330 335
Ala Ser Ile Trp Asn Ala Val Glu Ala Ala Ile Pro Gly Phe Leu Gln
340 345 350
Asn Val Tyr Ala His Thr Ala Gly Gly Gly Lys Phe Leu Gly Ile Leu
355 360 365
Gln Val Lys Lys Arg Gln Pro Ala Asp Glu Gly Arg Gln Gly Gln Ala
370 375 380
Ala Leu Leu Ala Leu Ala Thr Tyr Ser Glu Leu Lys Asn Ile Ile Leu
385 390 395 400
Val Asp Glu Asp Val Asp Ile Phe Asp Ser Asp Asp Ile Leu Trp Ala
405 410 415
Met Thr Thr Arg Met Gln Gly Asp Val Ser Ile Thr Thr Ile Pro Gly
420 425 430
Ile Arg Gly His Gln Leu Asp Pro Ser Gln Thr Pro Glu Tyr Ser Pro
435 440 445
Ser Ile Arg Gly Asn Gly Ile Ser Cys Lys Thr Ile Phe Asp Cys Thr
450 455 460
Val Pro Trp Ala Leu Lys Ser His Phe Glu Arg Ala Pro Phe Ala Asp
465 470 475 480
Val Asp Pro Arg Pro Phe Ala Pro Glu Tyr Phe Ala Arg Leu Glu Lys
485 490 495
Asn Gln Gly Ser Ala Lys
500
<210> 9
<211> 5502
<212> DNA
<213> 肺炎克雷伯杆菌342的aroY基因加两千碱基的周围DNA序列;
<400> 9
gcgacgccga ctgggcgatc cgtgaactgc tggcgcgtat gacccagcgt ctgcagggct 60
gtgaaaccat agaggatgtg attaaggtgg cggagctgtt cgcgccgaac atcgccccga 120
cgatccccgg taaactgtat attctggata ccgatccatg gcagatgcgc tgcgtggcgc 180
agtggctgtc gcccgccggg gagacgacgt cctttgctcc cgacgactgc tgggcgatac 240
ggcggggact cagccatccg ccggtgcagg gtgagcccga tatcacctgc tatcatctgc 300
cggaggcgca cgccggccag tcgctctgcg taccgctcat cgcccagggc gaagcgatcg 360
gtctgctgag ctttcagaac gtcaccgcca gtgacgcccc ttcccgggct tacctggagc 420
tgatggccga agcgctgggg ctggcgctcg ccaatcagcg tttacgcagc gccctgctgg 480
aaaaagcgtt gttcgattcg ctgaccggcc tgcgtaaccg ccatcatctt gatgaagcgc 540
tgcactcgca gatggcgctg gcggtccata cccacacccc gctgagctgc ctgatgatcg 600
acatcgatca cttcaaagcc atcaatgacc gctacggcca tgaagccggg gatctggtga 660
ttaagagcgt cgcgaccatt gtgcagcgcg cggtgcgcga tatcggcatg gctttccgct 720
acggcggcga ggagttttta gtgctgctcc ccgggattga cgaagccggg gcgcaccagt 780
gcgccagcga gatctacacc caggtgcaca atatgacgct gcgcgatggc ctgacggaga 840
taggccaggt ggatgtgtcg attggcatcg ccagctaccc gcagcacacc caaagcgaca 900
gcctgctgcg cgcagcggac gccgcgctgt accgggcgaa agagctgggc cgttcaagga 960
ttgtcagctt tggccgcctg aagacccgct aagcgggatt attgctcagc ggcattaagc 1020
agcgagataa ctttccgcac caccgccgaa cggaaatggc ggtggtaaac catgctcagc 1080
tcactctccg ccagccgatc ctgaagatcg atatacacca cgttatcaag gcgtaaggcc 1140
ctcgccgaga ccggcaccag cgccaccccc accccggcgg agaccaggct aatcatcgag 1200
gtgacatcgt taattcgctg caccacctgc ggcgtaaaac ccgcgacgcg acaggcgtca 1260
ataaatacct gctccagtcc ggtgccctgc ggatcgtcaa gcgagatcca gttgtcagtg 1320
cgcaacgagg ccagattgag cgcccccacg cctgccagcg gatgctgttg ataaagcgcc 1380
aggcaaagtt tttcccgcac aaatggcctg accaccagcg cgtccggcgg tgacgccagc 1440
ggcgcgcgga tgatggcgat atccagacgc agatccagca gcgcttcgta gagcatttgc 1500
acatccccct gcaccagcga cagctcaatc cccggccagt cagcgcgcag ctcgcgcagg 1560
agccccggca gtttgctgtc atacatcgca ctggagacat agcccagatg caatcgcccc 1620
tgctcgcctc gtgcggtgcg ctgggcgtcc aggaccgcct gatcggccat ctccagcgcc 1680
agccgcgtct tctgcaagaa ggcctcgccc gcggcggtga gggtcaggcg ccggttagcg 1740
cgggagaaga gcaccacgcc caggcgctgc tcgagttgtt taatctgctg gctgagggcg 1800
ggctgggcga tatgtaaccg ctctgccgcc cgatgcatat gtagttcttc agcaacgacc 1860
acaaaatggc gtaacgctcg caaggacatg gccggactcc gcggagtaaa ttgataataa 1920
aaatgttatc aataaagcat gaatgatgca attgataacc attagcctgc gagcatactg 1980
tgcgcatcga cacgctaagg agaacatcat gaccgcaccg attcaggatc tgcgcgacgc 2040
tatcgcgctg ctgcaacagc atgacaatca gtacctcgaa accgatcatc cggttgaccc 2100
taacgctgag ctggccggcg tctatcgcca catcggcgcg ggcggcaccg tgaagcgccc 2160
cacgcgcatc ggcccggcga tgatgtttaa caatattaag ggctatccgc actcgcgcat 2220
tctggtgggc atgcacgcca gccgccagcg ggccgcgctg ctgctgggct gcgaagcctc 2280
acagctggcg ctggaggtag gcaaagcggt gaaaaaaccg gtcgcgccgg tggtcgttcc 2340
ggccagcagc gccccctgtc aggaacaggt ctttctggcc gacgatccgg attttgattt 2400
gcgcaccctg ctcccggcgc ccaccaacac cccgatcgac gccggtccct tcttctgcct 2460
gggcctggcg ctggccagcg atcccgacga cgcctcgctc accgacgtca ccatccaccg 2520
cttgtgcgtc cagggccggg atgagctgtc gatgtttctc gccgctggcc gccatatcga 2580
agtgtttcgt cagaaagccg aggccgctgg caaaccgctg ccgataacca tcaatatggg 2640
actcgatccg gctatctata tcggcgcctg ctttgaagcg ccgaccacac gtttggctat 2700
aacgaactgg gcgtcgccgg tgcgctgcgt cagcgtccgg tagagctggt acagggcgtc 2760
agcgtcccgg agaaagccat cgctcgcgcc gagatcgtta tcgaagggga actgctgccg 2820
ggggtacgcg tcagagaaga tcagcacaca acagcggcca tgcgatgccg gaatttcctg 2880
gttactgcgg cggcgccaat ccgtcgctgc cggtcattaa agtcaaagcg gtgaccatgc 2940
gaaacaatgc gattctgcag acgctggtag ggccgggcga agagcatacc accctcgccg 3000
gattgccaac ggaagccagt atctggaatg ctgtcgaggc tgctatcccg ggctttttac 3060
aaaatgtcta cgcccacacc gcgggcggcg gtaaattcct cgggatcctg caggtgaaaa 3120
aacgccagcc cgccgacgaa gggcgtcagg ggcaggccgc gttgctggcg ctggcgacct 3180
attccgagct gaaaaatatc attctggtcg atgaagatgt cgatatcttt gacagcgacg 3240
atatcctgtg ggccatgacc acccgcatgc agggggatgt cagcatcacg acgatcccag 3300
gcattcgtgg tcaccagctg gatccttccc agaccccggc ctacagcccg tcgatccgcg 3360
gagagggtat cagttgcaag acgattttcg attgcacggt gccgtgggcg ctaaaatcac 3420
acttcgagcg cgcaccgttt gccgatgtcg atccgcgtcc gtttgcgccg gagtattttg 3480
cccggctgga aaaaaaccac ggtcagtaaa atcaggtgat agccgccgga gcacggcggc 3540
atcttccggg ccagcatcac ctgcagcggg tggctgacgc agggttagtt gatcgcggcg 3600
gagaggtctt ttttcacctg ctcacgctgc tcgggggtca acacctggct cacgtcgaag 3660
tagtatttca cacgataata ccgcacctgc tggtccagct ggccaaaggc ggccagctgc 3720
tgtttgacct tagcgtcatc ccatttcccg gagtgaataa cgtctgccag ggcaccatcc 3780
tgatagccgc tgatttaatc tggcttacat tgttttcgaa tccctgacgc agcgcctgga 3840
ttttggcgac ctgctcttca ctcagcttca ggtgctggac gaccggatcc tgcgagacag 3900
acggtatatc ggcggaggtc gacgcctggc tggctgccgt aaagcaggtg gtcagcgcaa 3960
tggcgagcag ggtgttacgc aagcgagtat tcacagtgaa tgatccttca aaaaagaaaa 4020
tgagaggcga ttatcactgc gctaataaag actatctgta acaaagggtt aatttaaaac 4080
tggataaaaa aaggatggta agaaacagaa atcagatccc gggtcagcag cacagaaaga 4140
tatattcatc cttccagtaa cggccctgtc caatgatatc cccggcggcg ctgattaact 4200
gtttttgctt ttggtttcaa tcccctcaac gatcacatgg ctggtcaggg tatgaataga 4260
ttgcaacagc ccgggaaaag cggggtcgtt ttctttatcc cagaagtaat ctttatccac 4320
tttgacgcaa tcgaagcgga agcgctccag cagcgggaag gacgtcgtcc gcggccaaaa 4380
tcatccagcc agaccgggca aagcgccgcc agcgtgctca gcgccgtcag ctcacgtccg 4440
gcgataaact cgtgaaagtt ctcatttatt tccagagcaa tgtgtttaca ggagcgcagg 4500
aaatcacaga gatagcgatc cgtcagaata aagtggctta ataaatcatc aatattcagc 4560
gatatcggtt tattatcgac ccgggcgaaa tcaaatacag aaagtaactc gatttgccga 4620
ataaatagag caagcttatc gcgttcggta agcgtggaga aagaaaacgt cgacgcagag 4680
gtggtatttt gtgcgggtgc tataatatct ttagtaagca actcccacga gtggtagctg 4740
ccgtcatcgc taatagcggg ctccagaacg aagcgataag aggtattttt cacgttttct 4800
tcaaccattt aaaaaatacc aaaaataaga aagggttaag catgtcatat attttccgcc 4860
aacaaaaata gtttaaagtg atcgataata atcattcgat agttaaaaac tatcaagata 4920
taatttattg atcggtaaat tgaattaata taaattagcc actgccgtaa ctccctctga 4980
aaagtcaatt aaaatattgt ttcaaaccag ccagttacca gagtattctg cgtaaagcct 5040
ggtcgtctca cgctttgtgc tgccaggtaa aaaaagagag gggtaataaa aatgaaaaat 5100
acaagccgcc agttttagtc atatcattat gccgaatatg aataacgctg cgctgaggcg 5160
ccgcttcgcc tggcatgcca tgagtcctca acaaaaaagt gtgactcagt cgacaaaacg 5220
tcatattttc ccgctatcct gcagcgaaga agagtgaagt ggatgacagg cagtgaaaaa 5280
aataaacgtg attccgctgg ggctgatgct attcatgctc atcgccagcg catggctggg 5340
ccctgcgccg cggcacaccg gcagcatgca gtgcgtttgg tttgacgggg caatggtgag 5400
ctgcctgccg aagcaacgac tgggcgaagg ctcgccgcat catttactgg tcagacgata 5460
aaccggtact cgccgggtgg tgttgaacag attatcgctg gc 5502
<210> 10
<211> 4629
<212> DNA
<213> 来自贝氏不动杆菌ADP1的catA基因的DNA序列，包括410碱基的上游序列和两个下游开放阅读框;
<400> 10
atctgctcga ccatagtaat gatcacatta tgagctaaat ttacttttta aaatttaaat 60
atattatata tatttgaatt ttattgtttt attttaattt ttagcttaga agtttttatt 120
aagatttatt tttaaattag atgtcgaaaa aattagtata ccaaaaaagc atgaaaacat 180
actctcttag gaattggagt cgccatgagt ttcagataca gttgatcagt atggaaggta 240
tagaaacgac tatcgaaata aataagtttg tggtgtgtga agcaaggtaa agctcaaggc 300
tgaggcaaac caagcaaagg ttaattgaac cgatatgcac aacacattca acgatagcgt 360
cgacagataa gtttatcaaa tgatgttttg gcgatttcaa ggagaaagcc atggaagtta 420
aaatattcaa tactcaggat gtgcaagatt ttttacgtgt tgcaagcgga cttgagcaag 480
aaggtggcaa tccgcgtgta aagcagatca tccatcgtgt gctttcagat ttatataaag 540
ccattgaaga tttgaatatc acttcagatg aatactgggc aggtgtggca tatttaaatc 600
agctaggtgc caatcaagaa gctggtttac tctcgccagg cttgggtttt gaccattacc 660
tcgatatgcg tatggatgcc gaagatgccg cactaggtat tgaaaatgcg acaccacgta 720
ccattgaagg cccgctatac gtggcaggtg cgcctgaatc ggtaggttat gcgcgcatgg 780
atgacggaag tgatccaaat ggtcataccc tgattctaca tggcacgatc tttgatgcag 840
atggaaaacc tttacccaat gccaaagttg aaatctggca tgccaatacc aaaggctttt 900
attcacactt cgacccaaca ggcgagcagc aggcgttcaa tatgcgccgt agtattatta 960
ccgatgaaaa cggtcagtat cgcgttcgta ccattttgcc tgcgggttat ggttgcccac 1020
cagaaggtcc aacgcaacag ttgctgaatc agttgggccg tcatggtaac cgccctgcgc 1080
acattcacta ttttgtttct gccgatggac accgcaaact aactacgcaa attaatgtgg 1140
ctggcgatcc gtacacctat gacgactttg cttatgcaac ccgtgaaggc ttggtggttg 1200
atgcagtgga acacaccgat cctgaagcca ttaaggccaa tgatgttgaa ggcccattcg 1260
ctgaaatggt tttcgatcta aaattgacgc gtttggttga tggtgtagat aaccaagttg 1320
ttgatcgtcc acgtctagcg gtgtaataca ccaaaatggt tcaaaattat caggcgagtg 1380
atcatgatca ctggcctgtt tttatttcag ggaagggtgg agacaattac gtggacaatc 1440
aaatcattca ggaaaccgta gataaaattt taagcgtatt gccgaatcag gctgggcaat 1500
tggcacgctt ggttcgtctg atgcagtttg cttgtgaccc caccattacc gtcattggta 1560
aatataatca tggtaaaagc cgactactca atgagctgat cgggacagat attttttctg 1620
ttgccgataa acgagagacg attcaactgg ccgaacataa acaagatcag gtgcgttggt 1680
tggatgcacc cggactcgat gcagatgttg cggcagtgga tgatcgtcat gcttttgaag 1740
cagtctggac acaggcagat attcgccttt ttgtgcattc agtccgagaa ggcgaactcg 1800
atgcaactga gcatcatctt ttacaacaac ttattgaaga tgcagaccat agccggcgcc 1860
aaaccatact ggtcttgacc cagatagatc agataccgga tcagacaatt ttaacccaga 1920
ttaaaacctc aattgcacag caggtaccca aactcgatat ttgggctgtt tcggccactc 1980
gccaccgtca gggtattgaa aatggaaaaa ccttgctgat cgaaaaaagt ggaatcggcg 2040
cgttacgaca tacacttgag caggcacttg ctcaggttcc atctgcacga acgtatgaaa 2100
agaatagatt gctgtctgac ttgcatcatc aacttaagca gttattactc gatcaaaaac 2160
atgtacttca gcaactacaa cagacacagc agcagcaatt gcatgacttt gatacaggac 2220
tcatcaacat actcgataag attcgagtag atcttgagcc cattgtaaat atagatggtc 2280
aagaccaagc actcaatcca gattcatttg ccacgatgtt taaaaataca gcagccaagc 2340
agcaacgtgc caaagtgcag attgcttact cacgtgcctg tatcgagatc aatagccatc 2400
tcatacgtca cggtgtggtg ggtttacccg cagagcaaca aaccacgata aaaagtattg 2460
atacggtcat tgttgcggtt tttggaattt cagtgaaatt tcgcgatcag ctacgtgcat 2520
tgttttatac cgataccgaa cgacaacgct tgcaaagaga gtttcgattt tattttgaaa 2580
agtcagcagg ccgaatgatt ttagctgcca agattgagca gacaatgcgg cagcaagggt 2640
gtattcaaaa tgcaatgatg gcgttgcaac agatggagag tgcagcatga ccagcggcgg 2700
acacattcaa ttgtttatcg aacacacccg gcagattgcg actgcccaag gggatataca 2760
gttggcattg caatcgatgc agcaatggcg cgaagcattt gctacagcat taaaacaaaa 2820
tacctttgat ttaacgggct ggtcaccgca gacaaagatc gccaatcaac tcaagcaatt 2880
taaccataag cttacaacgc atgtatcgaa ttgggatacc gaatggcata cttttagtgc 2940
tgctcaatcg gttgcagaag tatttcatga tcgggtgatg ttgcttgtat tcggtaagtt 3000
taatgccgga aagagttcat tgtgtaactt actggccgaa tgctttcgtt ctcacgaaca 3060
aaccgtgcaa tattttcatg ttcaaaatga acagatattt tataccgaat ctcacttacg 3120
cgaaggtgca accgagacga cagcgcaact acagggcgta tgtctgggtg aaaaacttat 3180
tttgctagat acaccaggtt tgcattctgg tactcagaaa aatgcagcgc tcacacaaaa 3240
atttatcgac agtgcagatg gtgtgctgtg gctcagtagc gcaacttcac cgggtcaggt 3300
gcaagagcta gatgcactgg ggcgcgagtt aaagcgtcat aaacctttat ttcctgttat 3360
tacccgaagc gattttgtcg aagaagatga aattgatggt gagctatgta cagtgctttg 3420
caataaaaat tcagaacaac gtgcgttgca agagtctgat gtattgatgc gtgcgaaaga 3480
aaaactgcac atatgcaagt ggatgtgagt ttattaaagc cgcccgtgtc cgtttcaact 3540
caaatggcgc gtgaagcaga tatgaaccca caagccatga acgaggctgg ttttgagcga 3600
ttatttgcag cacttttggc tcttattgag cctgctttgc gctataagca gcgtaaacct 3660
gccgaagtat tgttgcattt tttgcaagaa catatcattg aaggtttaag gttttacctg 3720
caacccgatc tagagcaaat acaacaggac ctcaaacagg ctcaagatga tttacgacag 3780
ctacacaccg atttagccga ggcagtctgg cgtagcgtat tgcctgagct accacaactt 3840
cttgagcaac atgcaagtac acaaaatatt gatgccgtag tgaacagttt gaacgagtgg 3900
ataaacgtcg cattcgaaca acagcttgca attcagcttg atgcttatgg tttaaatttg 3960
gattcgctta gcaagatcga aaaaaccgaa aaaatgcagt atgaacgcat tgcgggaatg 4020
gtggtgcatg atggcttgta cacgactctc acgcagcaga ttcaacaagc tgtcaaagct 4080
tctacgagtg aattgattga tcagtgtcag gctcaacttg agcagtcaat caaacatgtt 4140
caaacactcg atgaaacctt catcgattac agcgcagcac tcgatcaact cagccaagcg 4200
ctacgcattg aataaagagc agtaaatttt tcagacatat tttattcgat gagtggcctg 4260
atatggtgcg ttgcaaacac ctcctgtaca caggcgagaa ttttaggaat gtaattactg 4320
tggtccatat ttcgcaccgc gagtgaaatt gggctatagg catcatcatc taaaattgga 4380
atataaagta gattcttcac cccaatatcc atggcagacg ccggtacgat gcagacgcct 4440
tcacctgctg ccaccaagcc gagtgccagt tgaatttctc gaatttcggt gagtttggat 4500
ggtactaggc ctagttcggt aaagagtgac tgaataaagg tcgcaaaatt gggcttttga 4560
gagactgggt acagcagcat cggttcatca ataatttgag agagatgaac ccctgttgct 4620
gcaaactga 4629
<210> 11
<211> 311
<212> PRT
<213> 来自贝氏不动杆菌ADP1的CatA;
<400> 11
Met Glu Val Lys Ile Phe Asn Thr Gln Asp Val Gln Asp Phe Leu Arg
1 5 10 15
Val Ala Ser Gly Leu Glu Gln Glu Gly Gly Asn Pro Arg Val Lys Gln
20 25 30
Ile Ile His Arg Val Leu Ser Asp Leu Tyr Lys Ala Ile Glu Asp Leu
35 40 45
Asn Ile Thr Ser Asp Glu Tyr Trp Ala Gly Val Ala Tyr Leu Asn Gln
50 55 60
Leu Gly Ala Asn Gln Glu Ala Gly Leu Leu Ser Pro Gly Leu Gly Phe
65 70 75 80
Asp His Tyr Leu Asp Met Arg Met Asp Ala Glu Asp Ala Ala Leu Gly
85 90 95
Ile Glu Asn Ala Thr Pro Arg Thr Ile Glu Gly Pro Leu Tyr Val Ala
100 105 110
Gly Ala Pro Glu Ser Val Gly Tyr Ala Arg Met Asp Asp Gly Ser Asp
115 120 125
Pro Asn Gly His Thr Leu Ile Leu His Gly Thr Ile Phe Asp Ala Asp
130 135 140
Gly Lys Pro Leu Pro Asn Ala Lys Val Glu Ile Trp His Ala Asn Thr
145 150 155 160
Lys Gly Phe Tyr Ser His Phe Asp Pro Thr Gly Glu Gln Gln Ala Phe
165 170 175
Asn Met Arg Arg Ser Ile Ile Thr Asp Glu Asn Gly Gln Tyr Arg Val
180 185 190
Arg Thr Ile Leu Pro Ala Gly Tyr Gly Cys Pro Pro Glu Gly Pro Thr
195 200 205
Gln Gln Leu Leu Asn Gln Leu Gly Arg His Gly Asn Arg Pro Ala His
210 215 220
Ile His Tyr Phe Val Ser Ala Asp Gly His Arg Lys Leu Thr Thr Gln
225 230 235 240
Ile Asn Val Ala Gly Asp Pro Tyr Thr Tyr Asp Asp Phe Ala Tyr Ala
245 250 255
Thr Arg Glu Gly Leu Val Val Asp Ala Val Glu His Thr Asp Pro Glu
260 265 270
Ala Ile Lys Ala Asn Asp Val Glu Gly Pro Phe Ala Glu Met Val Phe
275 280 285
Asp Leu Lys Leu Thr Arg Leu Val Asp Gly Val Asp Asn Gln Val Val
290 295 300
Asp Arg Pro Arg Leu Ala Val
305 310
<210> 12
<211> 1461
<212> DNA
<213> 来自不动杆菌属物种ADP1的quiC;
<400> 12
atgaaattaa cttctttacg cgtatcttta ttggcgctgg gcttggtaac atcaggtttt 60
gctgcggcag aaacttatac tgtagatcgt tatcaggatg atagtgaaaa aggctctttg 120
cgttgggcaa ttgaacaatc taatgcaaat agcgcacaag agaatcagat tctgattcag 180
gctgttggta aggcacctta tgtgatcaag gtggataaac cgttaccacc gattaaatca 240
tctgtaaaaa ttattggtac agaatgggat aaaacgggcg aatttattgc gattgatggt 300
tcaaactata tcaagggcga aggcgaaaaa gcatgtccag gtgcaaatcc aggacaatat 360
ggtaccaatg ttcgtaccat gactttacca ggtttggttc tacaagatgt caatggtgtg 420
accctgaaag gtcttgatgt tcatcgcttc tgtattggtg tactggtaaa tcgttcaagc 480
aataatttga ttcagcataa ccgtatttca aataattacg gtggcgctgg tgtcatgatc 540
acgggtgatg atggtaaagg taacccaacg tctaccacca ccaataacaa caaagtattg 600
gataatgtgt ttattgacaa tggcgatggt cttgaactga cgcgtggagc agcattcaac 660
ctgattgcta acaatctgtt tacatcgacc aaagccaatc cagagccgtc tcaaggcatt 720
gaaattcttt gggggaatga caatgcagtg gtgggtaaca aatttgaaaa ctattcagat 780
ggtctacaaa tcaactgggg taaacgtaat tacatcgctt ataacgaatt gaccaataac 840
tctttgggtt tcaatcttac aggtgatgga aacatcttcg atagtaacaa agtgcatggc 900
aatcgtattg gtatcgcaat tcgttctgaa aaagatgcaa atgcacgtat cacacttacc 960
aaaaatcaga tttgggataa tggtaaagat atcaaacgct gtgaggctgg tggttcatgt 1020
gttccaaacc aacgtttagg tgcaattgta tttggtgttc ctgcgcttga gcatgaaggt 1080
tttgtaggct ctcgtggtgg cggtgtagtc attgaacctg caaaattaca aaaaacatgt 1140
acacagccaa atcaacaaaa ctgtaatgcc attccgaacc aaggtattca ggcacctaaa 1200
ctgactgtca gtaaaaaaca acttacagtt gaagttaaag gaacaccaaa ccagcgttac 1260
aacgtagaat tttttggaaa tcgtaatgca tcttcttccg aagctgagca atatttaggt 1320
tcaattgttg tagtgacaga tcatcaaggt cttgcaaaag caaactgggc accaaaagtc 1380
agcatgccat ctgttactgc gaatgtaact gatcacttgg gcgccacttc agagttaagt 1440
tctgcagtga aaatgagata a 1461
<210> 13
<211> 1461
<212> DNA
<213> 来自不动杆菌属物种ADP1的经密码子优化的quiC基因;
<400> 13
atgaaactga ccagcctgcg tgttagcctg ctggcactgg gtctggttac cagcggtttt 60
gcagcagcag aaacctatac cgttgatcgt tatcaggatg atagcgaaaa aggtagcctg 120
cgttgggcaa ttgaacagag caatgcaaat agcgcacaag aaaaccagat tctgattcag 180
gcagttggta aagcaccgta tgttatcaaa gttgataaac cgctgcctcc gattaaaagc 240
agcgttaaaa tcattggcac cgagtgggat aaaaccggtg aatttattgc aattgatggc 300
agcaactata tcaaaggcga aggtgaaaaa gcatgtccgg gtgcaaatcc gggtcagtat 360
ggcaccaatg ttcgtaccat gaccctgcct ggtctggttc tgcaagatgt taatggtgtt 420
accctgaaag gtctggatgt tcatcgtttt tgtattggtg ttctggttaa tcgcagcagc 480
aataacctga ttcagcataa tcgtatcagc aacaattatg gtggtgccgg tgttatgatt 540
accggtgatg atggtaaagg taatccgacc agcaccacca ccaataataa caaagttctg 600
gataacgtgt tcatcgataa tggtgatggt ctggaactga cccgtggtgc agcatttaat 660
ctgattgcaa ataacctgtt taccagcaca aaagccaatc cggaaccgag ccagggtatt 720
gaaattctgt ggggtaatga taatgccgtg gtgggtaaca aattcgaaaa ctattcagat 780
ggcctgcaaa tcaattgggg taaacgtaac tatatcgcct ataacgaact gaccaataac 840
agcctgggtt tcaatctgac aggtgatggt aacattttcg acagcaataa agtgcatggt 900
aaccgtattg gtattgccat tcgtagtgaa aaagatgcca atgcacgtat taccctgacc 960
aaaaatcaga tttgggataa cggcaaagat atcaaacgtt gtgaagccgg tggtagctgt 1020
gttccgaatc agcgtctggg tgcaattgtt tttggtgttc cggcactgga acatgaaggt 1080
tttgttggta gccgtggcgg tggtgttgtt attgaaccgg caaaactgca aaaaacctgc 1140
acccagccga accagcagaa ttgtaatgca attcctaatc agggtattca ggcaccgaaa 1200
ctgacagtta gcaaaaaaca gctgaccgtt gaagttaaag gcacccctaa tcagcgttat 1260
aatgtggaat tttttggcaa tcgtaatgcc agcagcagcg aagcagaaca gtatctgggt 1320
agcattgttg ttgttaccga tcatcagggt ctggcaaaag caaattgggc tccgaaagtt 1380
agcatgccga gcgttaccgc aaatgtgaca gatcatctgg gtgcgaccag cgaactgagc 1440
agcgcagtta aaatgcgtta a 1461
<210> 14
<211> 486
<212> PRT
<213> 来自不动杆菌属物种ADP1的QuiC;
<400> 14
Met Lys Leu Thr Ser Leu Arg Val Ser Leu Leu Ala Leu Gly Leu Val
1 5 10 15
Thr Ser Gly Phe Ala Ala Ala Glu Thr Tyr Thr Val Asp Arg Tyr Gln
20 25 30
Asp Asp Ser Glu Lys Gly Ser Leu Arg Trp Ala Ile Glu Gln Ser Asn
35 40 45
Ala Asn Ser Ala Gln Glu Asn Gln Ile Leu Ile Gln Ala Val Gly Lys
50 55 60
Ala Pro Tyr Val Ile Lys Val Asp Lys Pro Leu Pro Pro Ile Lys Ser
65 70 75 80
Ser Val Lys Ile Ile Gly Thr Glu Trp Asp Lys Thr Gly Glu Phe Ile
85 90 95
Ala Ile Asp Gly Ser Asn Tyr Ile Lys Gly Glu Gly Glu Lys Ala Cys
100 105 110
Pro Gly Ala Asn Pro Gly Gln Tyr Gly Thr Asn Val Arg Thr Met Thr
115 120 125
Leu Pro Gly Leu Val Leu Gln Asp Val Asn Gly Val Thr Leu Lys Gly
130 135 140
Leu Asp Val His Arg Phe Cys Ile Gly Val Leu Val Asn Arg Ser Ser
145 150 155 160
Asn Asn Leu Ile Gln His Asn Arg Ile Ser Asn Asn Tyr Gly Gly Ala
165 170 175
Gly Val Met Ile Thr Gly Asp Asp Gly Lys Gly Asn Pro Thr Ser Thr
180 185 190
Thr Thr Asn Asn Asn Lys Val Leu Asp Asn Val Phe Ile Asp Asn Gly
195 200 205
Asp Gly Leu Glu Leu Thr Arg Gly Ala Ala Phe Asn Leu Ile Ala Asn
210 215 220
Asn Leu Phe Thr Ser Thr Lys Ala Asn Pro Glu Pro Ser Gln Gly Ile
225 230 235 240
Glu Ile Leu Trp Gly Asn Asp Asn Ala Val Val Gly Asn Lys Phe Glu
245 250 255
Asn Tyr Ser Asp Gly Leu Gln Ile Asn Trp Gly Lys Arg Asn Tyr Ile
260 265 270
Ala Tyr Asn Glu Leu Thr Asn Asn Ser Leu Gly Phe Asn Leu Thr Gly
275 280 285
Asp Gly Asn Ile Phe Asp Ser Asn Lys Val His Gly Asn Arg Ile Gly
290 295 300
Ile Ala Ile Arg Ser Glu Lys Asp Ala Asn Ala Arg Ile Thr Leu Thr
305 310 315 320
Lys Asn Gln Ile Trp Asp Asn Gly Lys Asp Ile Lys Arg Cys Glu Ala
325 330 335
Gly Gly Ser Cys Val Pro Asn Gln Arg Leu Gly Ala Ile Val Phe Gly
340 345 350
Val Pro Ala Leu Glu His Glu Gly Phe Val Gly Ser Arg Gly Gly Gly
355 360 365
Val Val Ile Glu Pro Ala Lys Leu Gln Lys Thr Cys Thr Gln Pro Asn
370 375 380
Gln Gln Asn Cys Asn Ala Ile Pro Asn Gln Gly Ile Gln Ala Pro Lys
385 390 395 400
Leu Thr Val Ser Lys Lys Gln Leu Thr Val Glu Val Lys Gly Thr Pro
405 410 415
Asn Gln Arg Tyr Asn Val Glu Phe Phe Gly Asn Arg Asn Ala Ser Ser
420 425 430
Ser Glu Ala Glu Gln Tyr Leu Gly Ser Ile Val Val Val Thr Asp His
435 440 445
Gln Gly Leu Ala Lys Ala Asn Trp Ala Pro Lys Val Ser Met Pro Ser
450 455 460
Val Thr Ala Asn Val Thr Asp His Leu Gly Ala Thr Ser Glu Leu Ser
465 470 475 480
Ser Ala Val Lys Met Arg
485
<210> 15
<211> 9462
<212> DNA
<213> 质粒pAC21;
<220>
<221> misc_feature
<222> (5924)..(5924)
<223> n是a、c、g或t
<400> 15
gttgacagta agacgggtaa gcctgttgat gataccgctg ccttactggg tgcattagcc 60
agtctgaatg acctgtcacg ggataatccg aagtggtcag actggaaaat cagagggcag 120
gaactgctga acagcaaaaa gtcagatagc accacatagc agacccgcca taaaacgccc 180
tgagaagccc gtgacgggct tttcttgtat tatgggtagt ttccttgcat gaatccataa 240
aaggcgcctg tagtgccatt tacccccatt cactgccaga gccgtgagcg cagcgaactg 300
aatgtcacga aaaagacagc gactcaggtg cctgatggtc ggagacaaaa ggaatattca 360
gcgatttgcc cgagcttgcg agggtgctac ttaagccttt agggttttaa ggtctgtttt 420
gtagaggagc aaacagcgtt tgcgacatcc ttttgtaata ctgcggaact gactaaagta 480
gtgagttata cacagggctg ggatctattc tttttatctt tttttattct ttctttattc 540
tataaattat aaccacttga atataaacaa aaaaaacaca caaaggtcta gcggaattta 600
cagagggtct agcagaattt acaagttttc cagcaaaggt ctagcagaat ttacagatac 660
ccacaactca aaggaaaagg actagtaatt atcattgact agcccatctc aattggtata 720
gtgattaaaa tcacctagac caattgagat gtatgtctga attagttgtt ttcaaagcaa 780
atgaactagc gattagtcgc tatgacttaa cggagcatga aaccaagcta attttatgct 840
gtgtggcact actcaacccc acgattgaaa accctacaag gaaagaacgg acggtatcgt 900
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agtctgtcaa gcggagcaaa gtcgatatga ccgccttcag tttcgatgac gaaataacgg 5700
ccttcagtcc gcaacagatg ggcaacaccc aagcccgttc ccggaccaag aatagtgata 5760
acaccatcgc taggaagcgc ttcatcagga ccacaaatat gatccagata agaagaatcc 5820
atatgcgcaa ccgcgtgggc aaccgcgccg aagtcattga tcagaacatg cgtatcgatg 5880
tccagctttt cattcagagt agctggtctt aatacccaag ggttattggt aagttttaaa 5940
acttcaccat gaaccgggcc agcccatgca atagctgcgg cacgtggcag aggacgaccc 6000
agtttttcac cgaaacgttc ccaagctaac tgcaagctag catgttctgc cgttttaaaa 6060
gttgtttctt ctccaagaga aagaacccga ccattgctta cttccgcaat agagaaacgc 6120
gcatgcgttc caccgatgtc aatcgcaaca atttccataa taattccttt ctgaaatcag 6180
aaggctaccc aacaggtaaa ataagtccgc ccgctttata ccatcgttgt aaacaaaaag 6240
tataattggt taagacttat ctaaaaaaga caaaaggatt cagccaaagc aagtttaact 6300
acttctggga gcgccacatc tcctcgattt catccaggct ccgacctttg gtttccggca 6360
cgaagcgagc aacaatcaag ccacctaaga tacttaatgc tgcgaaaacg agataggaga 6420
aaccgtggtt gaaagtctga ttcaatgctg gagaaccatc ggcaacctta aacaggaagt 6480
taaccaagat attagctaac cattgtccgg taacagcgat aggcatagct gcgcccttga 6540
tggaactcgg gaacatttct gacagaacaa cccagcagac agggccccat gacataccaa 6600
agactgcaat ataaagaagc acagaagcca aaggcaaaac accaccgact ttgaaccaga 6660
aacagcagcc taaaacagcc atcattgcag ccataccgag agcaccccaa ataagcagag 6720
gtttacggcc gaagcggtca acaacacggg aagcaatcat ggtgaagatg aagttcacaa 6780
caccgataga gatggtctgc aataatgccg tatcagctcc aaaacctaaa ttctggaaca 6840
tctgcggtgc ataatacagc acggcgttaa taccgactaa ctgctggaag gcagcaacgg 6900
atacaccggc aaaaacaacg gtgataccaa aagcaaacaa acctgcgctg cttttgtcca 6960
tggctttatc aaagccagct ttaatctttt gaatcgtcag attaggatcg gcttgcggtt 7020
ccagacgagc aaggattttg ctagcctcgg aatgacgtcc cttcatcacc aaccaatgcg 7080
gcgtatccgg tgcggttaac agcagcaata agaaggcaat accgatcagg ccttctgaag 7140
ccggagacca gcaccaacca ctggcattaa cccaatcgat agaaccgaaa tgagccagta 7200
accaggtaaa gatataaccg gttaaagcac ccgtcacaat ggccatctgc tgaccagaaa 7260
ccatctgacc acgtttgtct ggcggagcaa tttcagcaat ataggttggg gtcaaggttg 7320
aaacgacacc gatacctaaa ccggcaagaa accggaaaaa gcaaaaaatt tgtaaagccg 7380
aaccaccggt tccaaataat ttttcggtta acgcagcacc aaaaccggcg gcgacgaaac 7440
aaatggaact catcaacaat ccgccgcgac gaccgaagcg aataccaatc cagccagaca 7500
gcaaagaacc ggtaacacaa ccgaccaaaa cagcaacaac gaccatccca gaaagggaag 7560
ccgcagccgt agcagacagg tgacgagggg caataaaatg gatatcaacc ggtgtaccga 7620
ttgcagcgat aaccgctgaa tcgtaaccga aaagcaagcc gcctatagca gcgattaggg 7680
ctagtcgcgt gactagaccc tgactacttt cagaactcat ggcgattcct ctccctctag 7740
agcgtcctgc tgttgttaag attattatac cacaccttgt agataaagtc aacaactttt 7800
tgcaaaattt ttcaggaatt ttagcagagg ttgttctgga tgtagaacaa aacatctttc 7860
cgctcttgtg ctgttaggat atctttcttg gaagctaggt aggcctcgag ttatggcagt 7920
tggttaaaag gaaacaaaaa gaccgttttc acacaaaacg gtctttttcg atttcttttt 7980
acagtcacag ccacttttgc accaattaag gccacgctgt catttaaact ccgtttttcc 8040
agttcaaatg caattgcctt caatgcacct tcgtagctgt ggtgagccag cggtgctggc 8100
tctcccccat ttacggataa gaatgcattt tccgagttaa taccgtcggc aatacctgac 8160
attaatactt cacagtcgct ggcatcgagt acggaaaact taatcgaaga cgaaccacag 8220
ttaataacca aaacaaccgg aaattcattc atctcttttc tcatcctgag ttacggatta 8280
aaacagtttg tatacgatgt tcaggatggt cagcagacca atcacggtaa caaacacgtt 8340
atccagacga ccacggtatt tcgccagaga cggcgcttta cggatggcat acatcggcaa 8400
caggcacagc agggatgcga taatcggtgc gcccatggct tcaatcaggt cgaggatgtt 8460
cgggttggcg taggcaacaa cccaggtgga gcccatgatg aagatcatgc tgagagtatt 8520
cagtttaccc agcgacactt tggttttgtc acctttataa ccgaacttca gaatcagacc 8580
attcaagcct tccagcgtcc ccagatagtg accgaagaaa gatttgaaga tagccacgag 8640
tgcgatgatg gaagccgcat attccagtgt aatcgcgaac gttgttttgg taccggtcat 8700
ggacgcaaag tggttagcca gataagaaag cactggaata ttctgcgctt tggcttccgc 8760
catgttggcc ggagacagag taaacaggca gctaaaggca aagaacatca ccactgcaac 8820
catcagcatg ctggcacgag aaatgatttg ggaacattta cgttcggtga agtcgcgacc 8880
gaagtctttc tcatactctt cacgtttaga aaccacgaag gaagagacga ttggcgagaa 8940
gttaaaggag aaaaccatga tggaaatccc cagccagaca gtgatcagga taccgtcatg 9000
accggttaac gacagcgaac cgaggtcaac ctggtcgata actgcagagt tccagtaagg 9060
gatcagcgac aaagaaatca gcaccaggct ggcgataaac ggccatacca ggtagctcag 9120
ggtaccgagc tcgaattcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg 9180
cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc gtaatagcga 9240
agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatggcgcct 9300
gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatat ggtgcactct 9360
cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc caacacccgc 9420
tgacgaattc 9430
<210> 17
<211> 5768
<212> DNA
<213> 质粒pMH17F;
<400> 17
gttgacagta agacgggtaa gcctgttgat gataccgctg ccttactggg tgcattagcc 60
agtctgaatg acctgtcacg ggataatccg aagtggtcag actggaaaat cagagggcag 120
gaactgctga acagcaaaaa gtcagatagc accacatagc agacccgcca taaaacgccc 180
tgagaagccc gtgacgggct tttcttgtat tatgggtagt ttccttgcat gaatccataa 240
aaggcgcctg tagtgccatt tacccccatt cactgccaga gccgtgagcg cagcgaactg 300
aatgtcacga aaaagacagc gactcaggtg cctgatggtc ggagacaaaa ggaatattca 360
gcgatttgcc cgagcttgcg agggtgctac ttaagccttt agggttttaa ggtctgtttt 420
gtagaggagc aaacagcgtt tgcgacatcc ttttgtaata ctgcggaact gactaaagta 480
gtgagttata cacagggctg ggatctattc tttttatctt tttttattct ttctttattc 540
tataaattat aaccacttga atataaacaa aaaaaacaca caaaggtcta gcggaattta 600
cagagggtct agcagaattt acaagttttc cagcaaaggt ctagcagaat ttacagatac 660
ccacaactca aaggaaaagg actagtaatt atcattgact agcccatctc aattggtata 720
gtgattaaaa tcacctagac caattgagat gtatgtctga attagttgtt ttcaaagcaa 780
atgaactagc gattagtcgc tatgacttaa cggagcatga aaccaagcta attttatgct 840
gtgtggcact actcaacccc acgattgaaa accctacaag gaaagaacgg acggtatcgt 900
tcacttataa ccaatacgct cagatgatga acatcagtag ggaaaatgct tatggtgtat 960
tagctaaagc aaccagagag ctgatgacga gaactgtgga aatcaggaat cctttggtta 1020
aaggctttga gattttccag tggacaaact atgccaagtt ctcaagcgaa aaattagaat 1080
tagtttttag tgaagagata ttgccttatc ttttccagtt aaaaaaattc ataaaatata 1140
atctggaaca tgttaagtct tttgaaaaca aatactctat gaggatttat gagtggttat 1200
taaaagaact aacacaaaag aaaactcaca aggcaaatat agagattagc cttgatgaat 1260
ttaagttcat gttaatgctt gaaaataact accatgagtt taaaaggctt aaccaatggg 1320
ttttgaaacc aataagtaaa gatttaaaca cttacagcaa tatgaaattg gtggttgata 1380
agcgaggccg cccgactgat acgttgattt tccaagttga actagataga caaatggatc 1440
tcgtaaccga acttgagaac aaccagataa aaatgaatgg tgacaaaata ccaacaacca 1500
ttacatcaga ttcctaccta cgtaacggac taagaaaaac actacacgat gctttaactg 1560
caaaaattca gctcaccagt tttgaggcaa aatttttgag tgacatgcaa agtaagcatg 1620
atctcaatgg ttcgttctca tggctcacgc aaaaacaacg aaccacacta gagaacatac 1680
tggctaaata cggaaggatc tgaggttctt atggctcttg tatctatcag tgaagcatca 1740
agactaacaa acaaaagtag aacaactgtt caccgttaga tatcaaaggg aaaactgtcc 1800
atatgcacag atgaaaacgg tgtaaaaaag atagatacat cagagctttt acgagttttt 1860
ggtgcattta aagctgttca ccatgaacag atcgacaatg taacagatga acagcatgta 1920
acacctaata gaacaggtga aaccagtaaa acaaagcaac tagaacatga aattgaacac 1980
ctgagacaac ttgttacagc tcaacagtca cacatagaca gcctgaaaca ggcgatgctg 2040
cttatcgaat caaagctgcc gacaacacgg gagccagtga cgcctcccgt ggggaaaaaa 2100
tcatggcaat tctggaagaa atagcgcttt cagccggcaa acctgaagcc ggatctgcga 2160
ttctgataac aaactagcaa caccagaaca gcccgtttgc gggcagcaaa acccgttatg 2220
cttgtaaacc gttttgtgaa aaaattttta aaataaaaaa ggggacctct agggtcccca 2280
attaattagt aatataatct attaaaggtc attcaaaagg tcatccaccg gatcaattcc 2340
cctgctcgcg caggctgggt gccaagctct cgggtaacat caaggcccga tccttggagc 2400
ccttgccctc ccgcacgatg atcgtgccgt gatcgaaatc cagatccttg acccgcagtt 2460
gcaaaccctc actgatccgc atgcccgttc catacagaag ctgggcgaac aaacgatgct 2520
cgccttccag aaaaccgagg atgcgaacca cttcatccgg ggtcagcacc accggcaagc 2580
gccgcgacgg ccgaggtctt ccgatctcct gaagccaggg cagatccgtg cacagcacct 2640
tgccgtagaa gaacagcaag gccgccaatg cctgacgatg cgtggagacc gaaaccttgc 2700
gctcgttcgc cagccaggac agaaatgcct cgacttcgct gctgcccaag gttgccgggt 2760
gacgcacacc gtggaaacgg atgaaggcac gaacccagtg gacataagcc tgttcggttc 2820
gtaagctgta atgcaagtag cgtatgcgct cacgcaactg gtccagaacc ttgaccgaac 2880
gcagcggtgg taacggcgca gtggcggttt tcatggcttg ttatgactgt ttttttgggg 2940
tacagtctat gcctcgggca tccaagcagc aagcgcgtta cgccgtgggt cgatgtttga 3000
tgttatggag cagcaacgat gttacgcagc agggcagtcg ccctaaaaca aagttaaaca 3060
tcatgaggga agcggtgatc gccgaagtat cgactcaact atcagaggta gttggcgtca 3120
tcgagcgcca tctcgaaccg acgttgctgg ccgtacattt gtacggctcc gcagtggatg 3180
gcggcctgaa gccacacagt gatattgatt tgctggttac ggtgaccgta aggcttgatg 3240
aaacaacgcg gcgagctttg atcaacgacc ttttggaaac ttcggcttcc cctggagaga 3300
gcgagattct ccgcgctgta gaagtcacca ttgttgtgca cgacgacatc attccgtggc 3360
gttatccagc taagcgcgaa ctgcaatttg gagaatggca gcgcaatgac attcttgcag 3420
gtatcttcga gccagccacg atcgacattg atctggctat cttgctgaca aaagcaagag 3480
aacatagcgt tgccttggta ggtccagcgg cggaggaact ctttgatccg gttcctgaac 3540
aggatctatt tgaggcgcta aatgaaacct taacgctatg gaactcgccg cccgactggg 3600
ctggcgatga gcgaaatgta gtgcttacgt tgtcccgcat ttggtacagc gcagtaaccg 3660
gcaaaatcgc gccgaaggat gtcgctgccg actgggcaat ggagcgcctg ccggcccagt 3720
atcagcccgt catacttgaa gctagacagg cttatcttgg acaagaagaa gatcgcttgg 3780
cctcgcgcgc agatcagttg gaagaatttg tccactacgt gaaaggcgag atcaccaagg 3840
tagtcggcaa ataatgtcta acaattcgtt caagccgacg ccgcttcgcg gcgcggctta 3900
actcaagcgt tagatgcact aagcacataa ttgctcacag ccaaactatc aggtcaagtc 3960
tgcttttatt atttttaagc gtgcataata agccctacac aaattgggag atatatcatg 4020
aaaggctggc tttttcttgt tatcgcaata gttggcgaag taatcgcaac atccgcatta 4080
aaatctagcg agggctttac taagctgatc cggtggatga ccttttgaat gacctttaat 4140
agattatatt actaattaat tggggaccct agaggtcccc ttttttattt taaaaatttt 4200
ttcacaaaac ggtttacaag catacgttgg ccgattcatt aatgcagctg gcacgacagg 4260
tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta gctcactcat 4320
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tacctagaga gggtgagaat tgccgaacat gcgcataagt ttcccggaca gatttcaggt 4440
ggtcagcagc aacgcgttgc cattgcgcgt tcgctgtgta tgaagccgaa aattatgttg 4500
tttgatgagc caacgtcggc gctcgatcct gagatggtga aagaggtgct ggatacgatg 4560
attgggctgg cgcagtcggg tatgacaatg ttgtgtgtaa cacatgagat ggggtttgca 4620
cgaaccgtcg ctgaccgggt aatttttatg gatcgtgggg aaatagtgga gcaagctgca 4680
cctgatgaat tttttgcgca tcctaaatca gagcgtacga gggcattttt atcgcaggta 4740
atccattaat tgaatgttag ttcgaaaagc aaaaaggcca tcctttcgga tggcctttcg 4800
cttgatttga tgtctggcag tttatggcgg gcgtcctgcc cgccaccctc cgggccgttg 4860
cttcgcaacg ttcaaatccg ctcccggcgg atttgtccta ctcgggagag tgttcaccga 4920
caaacaacag ataaaacaaa aggcccagtc ttccgactga gccttttgtt ttatttgatg 4980
tctggcagtt ccctactctc gcatggggag accccacact accatcggcg ctacggcggt 5040
ttcacttctg agttcggcat ggggtcaggt gggaccaccg cgctactgcc gccagacaaa 5100
ttcttttcta atctgccgaa ctttaaccta aaaagtggtg ctgataccca gagtcgaact 5160
ggggacctca cccttaccaa gggtgcgctc taccaactga gccatatcag cacgctaaat 5220
ttgatgcctg gcagttccct actctcgcat ggggagaccc cacactacca tcggcgctac 5280
ggcgtttcac ttctgagttc ggcatggggt caggtgggac caccgcgcta cggccgccag 5340
gcaaattctg ttttatcaga ccgcttctgc gttctgattt aatctgtatc aggctgaaaa 5400
tcttctctca tccggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacgccaa 5460
gctcgagctc gaattcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg 5520
ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag 5580
aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggcgcctga 5640
tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg tgcactctca 5700
gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg 5760
acgaattc 5768
<210> 18
<211> 1053
<212> DNA
<213> 野生型aroG基因的编码区;
<400> 18
atgaattatc agaacgacga tttacgcatc aaagaaatca aagagttact tcctcctgtc 60
gcattgctgg aaaaattccc cgctactgaa aatgccgcga atacggttgc ccatgcccga 120
aaagcgatcc ataagatcct gaaaggtaat gatgatcgcc tgttggttgt gattggccca 180
tgctcaattc atgatcctgt cgcggcaaaa gagtatgcca ctcgcttgct ggcgctgcgt 240
gaagagctga aagatgagct ggaaatcgta atgcgcgtct attttgaaaa gccgcgtacc 300
acggtgggct ggaaagggct gattaacgat ccgcatatgg ataatagctt ccagatcaac 360
gacggtctgc gtatagcccg taaattgctg cttgatatta acgacagcgg tctgccagcg 420
gcaggtgagt ttctcgatat gatcacccca caatatctcg ctgacctgat gagctggggc 480
gcaattggcg cacgtaccac cgaatcgcag gtgcaccgcg aactggcatc agggctttct 540
tgtccggtcg gcttcaaaaa tggcaccgac ggtacgatta aagtggctat cgatgccatt 600
aatgccgccg gtgcgccgca ctgcttcctg tccgtaacga aatgggggca ttcggcgatt 660
gtgaatacca gcggtaacgg cgattgccat atcattctgc gcggcggtaa agagcctaac 720
tacagcgcga agcacgttgc tgaagtgaaa gaagggctga acaaagcagg cctgccagca 780
caggtgatga tcgatttcag ccatgctaac tcgtccaaac aattcaaaaa gcagatggat 840
gtttgtgctg acgtttgcca gcagattgcc ggtggcgaaa aggccattat tggcgtgatg 900
gtggaaagcc atctggtgga aggcaatcag agcctcgaga gcggggagcc gctggcctac 960
ggtaagagca tcaccgatgc ctgcatcggc tgggaagata ccgatgctct gttacgtcaa 1020
ctggcgaatg cagtaaaagc gcgtcgcggg taa 1053
<210> 19
<211> 8820
<212> DNA
<213> 质粒pMH28F;
<220>
<221> misc_feature
<222> (5894)..(5894)
<223> n是a、c、g或t
<400> 19
gttgacagta agacgggtaa gcctgttgat gataccgctg ccttactggg tgcattagcc 60
agtctgaatg acctgtcacg ggataatccg aagtggtcag actggaaaat cagagggcag 120
gaactgctga acagcaaaaa gtcagatagc accacatagc agacccgcca taaaacgccc 180
tgagaagccc gtgacgggct tttcttgtat tatgggtagt ttccttgcat gaatccataa 240
aaggcgcctg tagtgccatt tacccccatt cactgccaga gccgtgagcg cagcgaactg 300
aatgtcacga aaaagacagc gactcaggtg cctgatggtc ggagacaaaa ggaatattca 360
gcgatttgcc cgagcttgcg agggtgctac ttaagccttt agggttttaa ggtctgtttt 420
gtagaggagc aaacagcgtt tgcgacatcc ttttgtaata ctgcggaact gactaaagta 480
gtgagttata cacagggctg ggatctattc tttttatctt tttttattct ttctttattc 540
tataaattat aaccacttga atataaacaa aaaaaacaca caaaggtcta gcggaattta 600
cagagggtct agcagaattt acaagttttc cagcaaaggt ctagcagaat ttacagatac 660
ccacaactca aaggaaaagg actagtaatt atcattgact agcccatctc aattggtata 720
gtgattaaaa tcacctagac caattgagat gtatgtctga attagttgtt ttcaaagcaa 780
atgaactagc gattagtcgc tatgacttaa cggagcatga aaccaagcta attttatgct 840
gtgtggcact actcaacccc acgattgaaa accctacaag gaaagaacgg acggtatcgt 900
tcacttataa ccaatacgct cagatgatga acatcagtag ggaaaatgct tatggtgtat 960
tagctaaagc aaccagagag ctgatgacga gaactgtgga aatcaggaat cctttggtta 1020
aaggctttga gattttccag tggacaaact atgccaagtt ctcaagcgaa aaattagaat 1080
tagtttttag tgaagagata ttgccttatc ttttccagtt aaaaaaattc ataaaatata 1140
atctggaaca tgttaagtct tttgaaaaca aatactctat gaggatttat gagtggttat 1200
taaaagaact aacacaaaag aaaactcaca aggcaaatat agagattagc cttgatgaat 1260
ttaagttcat gttaatgctt gaaaataact accatgagtt taaaaggctt aaccaatggg 1320
ttttgaaacc aataagtaaa gatttaaaca cttacagcaa tatgaaattg gtggttgata 1380
agcgaggccg cccgactgat acgttgattt tccaagttga actagataga caaatggatc 1440
tcgtaaccga acttgagaac aaccagataa aaatgaatgg tgacaaaata ccaacaacca 1500
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tggctaaata cggaaggatc tgaggttctt atggctcttg tatctatcag tgaagcatca 1740
agactaacaa acaaaagtag aacaactgtt caccgttaga tatcaaaggg aaaactgtcc 1800
atatgcacag atgaaaacgg tgtaaaaaag atagatacat cagagctttt acgagttttt 1860
ggtgcattta aagctgttca ccatgaacag atcgacaatg taacagatga acagcatgta 1920
acacctaata gaacaggtga aaccagtaaa acaaagcaac tagaacatga aattgaacac 1980
ctgagacaac ttgttacagc tcaacagtca cacatagaca gcctgaaaca ggcgatgctg 2040
cttatcgaat caaagctgcc gacaacacgg gagccagtga cgcctcccgt ggggaaaaaa 2100
tcatggcaat tctggaagaa atagcgcttt cagccggcaa acctgaagcc ggatctgcga 2160
ttctgataac aaactagcaa caccagaaca gcccgtttgc gggcagcaaa acccgttatg 2220
cttgtaaacc gttttgtgaa aaaattttta aaataaaaaa ggggacctct agggtcccca 2280
attaattagt aatataatct attaaaggtc attcaaaagg tcatccaccg gatcaattcc 2340
cctgctcgcg caggctgggt gccaagctct cgggtaacat caaggcccga tccttggagc 2400
ccttgccctc ccgcacgatg atcgtgccgt gatcgaaatc cagatccttg acccgcagtt 2460
gcaaaccctc actgatccgc atgcccgttc catacagaag ctgggcgaac aaacgatgct 2520
cgccttccag aaaaccgagg atgcgaacca cttcatccgg ggtcagcacc accggcaagc 2580
gccgcgacgg ccgaggtctt ccgatctcct gaagccaggg cagatccgtg cacagcacct 2640
tgccgtagaa gaacagcaag gccgccaatg cctgacgatg cgtggagacc gaaaccttgc 2700
gctcgttcgc cagccaggac agaaatgcct cgacttcgct gctgcccaag gttgccgggt 2760
gacgcacacc gtggaaacgg atgaaggcac gaacccagtg gacataagcc tgttcggttc 2820
gtaagctgta atgcaagtag cgtatgcgct cacgcaactg gtccagaacc ttgaccgaac 2880
gcagcggtgg taacggcgca gtggcggttt tcatggcttg ttatgactgt ttttttgggg 2940
tacagtctat gcctcgggca tccaagcagc aagcgcgtta cgccgtgggt cgatgtttga 3000
tgttatggag cagcaacgat gttacgcagc agggcagtcg ccctaaaaca aagttaaaca 3060
tcatgaggga agcggtgatc gccgaagtat cgactcaact atcagaggta gttggcgtca 3120
tcgagcgcca tctcgaaccg acgttgctgg ccgtacattt gtacggctcc gcagtggatg 3180
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cgaagatgct gcaggtaact acatccacta cggtgttcgc gagttcggta tgaccgcgat 7620
tgctaacggt atctccctgc acggtggttt cctgccgtac acctccacct tcctgatgtt 7680
cgtggaatac gcacgtaacg ccgtacgtat ggctgcgctg atgaaacagc gtcaggtgat 7740
ggtttacacc cacgactcca tcggtctggg cgaagatggc ccgactcacc agccggttga 7800
gcaggtcgct tctctgcgcg tgaccccgaa catgtctaca tggcgtccgt gtgaccaggt 7860
tgaatccgcg gtcgcgtgga aatacggcgt tgagcgtcag gacggcccga ctgcgcttat 7920
cctctcccgt cagaacctgg cgcagcagga acgaactgaa gagcaactgg caaacatcgc 7980
gcgcggtggt tatgtgctga aagactgcgc cggtcagccg gaactgattt tcatcgctac 8040
cggttcagaa gttgaactgg ctgttgctgc ctacgaaaaa ctgactgccg aaggcgtgaa 8100
agcgcgcgtg gtgtccatgc cgtctaccga cgcatttgac aagcaggatg ctgcttaccg 8160
tgaatccgta ctgccgaaag cggttactgc acgcgttgct gtagaagcgg gtattgctga 8220
ctactggtac aagtatgttg gcctgaacgg tgctatcgtc ggtatgacca ccttcggtga 8280
atctgctccg gcagagctgc tgtttgaaga gttcggcttc actgttgata acgttgttgc 8340
gaaagcaaaa gaactgctgt aattagcatt tcgggtaaaa aggtcgcttc ggcgaccttt 8400
tttattacct tgatatgtcc gtttgcggac aagcaataga taaagcgtgt tgtagatcac 8460
aaatatttat atgcaataaa tatcaattat gtaatatgca tcacgatatg cgtattgaca 8520
tttgttgtta taactataac tcaatgttat ataagaaatt aacttgaaat aattaacaaa 8580
caaaggagtt acagttagaa attgtaggag agatctcgtt tttcgcgaca atctggcgtt 8640
tttcttgcta attccaggat taatccgttc atagtgtaaa accccgttta cacattctga 8700
cggaagatat agattggaag tattgcattc actaagataa gtatggcaac actggaacag 8760
acatgaatta tcagaacgac gatttacgca tcaaagaaat caaagagtta cttcctcctg 8820
tcgcattgct ggaaaaattc cccgctactg aaaatgccgc gaatacggtt gcccatgccc 8880
gaaaagcgat ccataagatc ctgaaaggta atgatgatcg cctgttggtt gtgattggcc 8940
catgctcaat tcatgatcct gtcgcggcaa aagagtatgc cactcgcttg ctggcgctgc 9000
gtgaagagct gaaagatgag ctggaaatcg taatgcgcgt ctattttgaa aagccgcgta 9060
ccacggtggg ctggaaaggg ctgattaacg atccgcatat ggataatagc ttccagatca 9120
acgacggtct gcgtatagcc cgtaaattgc tgcttgatat taacgacagc ggtctgccag 9180
cggcaggtga gtttctcgat atgatcaccc cacaatatct cgctgacctg atgagctggg 9240
gcgcaattgg cgcacgtacc accgaatcgc aggtgcaccg cgaactggca tcagggcttt 9300
cttgtccggt cggcttcaaa aatggcaccg acggtacgat taaagtggct atcgatgcca 9360
ttaatgccgc cggtgcgccg cactgcttcc tgtccgtaac gaaatggggg cattcggcga 9420
ttgtgaatac cagcggtaac ggcgattgcc atatcattct gcgcggcggt aaagagccta 9480
actacagcgc gaagcacgtt gctgaagtga aagaagggct gaacaaagca ggcctgccag 9540
cacaggtgat gatcgatttc agccatgcta actcgtccaa acaattcaaa aagcagatgg 9600
atgtttgtgc tgacgtttgc cagcagattg ccggtggcga aaaggccatt attggcgtga 9660
tggtggaaag ccatctggtg gaaggcaatc agagcctcga gagcggggag ccgctggcct 9720
acggtaagag catcaccgat gcctgcatcg gctgggaaga taccgatgct ctgttacgtc 9780
aactggcgaa tgcagtaaaa gcgcgtcgcg ggtaaggttt aattgtcgga tgcgccgtca 9840
gagtggcgta tccgatgaat caccacaggc ctgataagtc gcgcagcgtc gcatcaggca 9900
atgtgctcca ttgttagcaa caaaaaagcc gactcacttg cagtcggctt tctcatttta 9960
aacgaatgac gtttacttcg ctttaccctg gtttgcaacc gccgctgctt tcgctctcga 10020
ggctattgac gacagctatg gttcactgtc caccaaccaa aactgtgctc agtaccgcca 10080
atatttctcc cttgaggggt acaaagaggt gtccctagaa gagatccacg ctgtgtaaaa 10140
attttacaaa aaggtattga ctttccctac agggtgtgta ataatttaat tacaggcggg 10200
ggcaaccccg cctgttctag aggaggagga atcgccatgg agaggattgt cgttactctc 10260
ggggaacgta gttacccaat taccatcgca tctggtttgt ttaatgaacc agcttcattc 10320
ttaccgctga aatcgggcga gcaggtcatg ttggtcacca acgaaaccct ggctcctctg 10380
tatctcgata aggtccgcgg cgtacttgaa caggcgggtg ttaacgtcga tagcgttatc 10440
ctccctgacg gcgagcagta taaaagcctg gctgtactcg ataccgtctt tacggcgttg 10500
ttacaaaagc cgcatggtcg cgatactacg ctggtggcgc ttggcggcgg cgtagtgggc 10560
gatctgaccg gcttcgcggc ggcgagttat cagcgcggtg ttcgtttcat tcaagtcccg 10620
acgacgttac tgtcgcaggt cgattcctcc gttggcggca aaactgcggt caaccatccc 10680
ctcggtaaaa acatgattgg cgcgttctac cagcctgctt cagtggtggt ggatctcgac 10740
tgtctgaaaa cgcttccccc gcgtgagtta gcgtcggggc tggcagaagt catcaaatac 10800
ggcattattc ttgacggtgc gtttttcaac tggctggaag agaatctgga tgcgttgttg 10860
cgtctggacg gtccggcaat ggcgtactgt attcgccgtt gttgtgaact gaaggcagaa 10920
gttgtcgccg ccgacgagcg cgaaaccggg ttacgtgctt tactgaatct gggacacacc 10980
tttggtcatg ccattgaagc tgaaatgggg tatggcaatt ggttacatgg tgaagcggtc 11040
gctgcgggta tggtgatggc ggcgcggacg tcggaacgtc tcgggcagtt tagttctgcc 11100
gaaacgcagc gtattataac cctgctcacg cgggctgggt taccggtcaa tgggccgcgc 11160
gaaatgtccg cgcaggcgta tttaccgcat atgctgcgtg acaagaaagt ccttgcggga 11220
gagatgcgct taattcttcc gttggcaatt ggtaagagtg aagttcgcag cggcgtttcg 11280
cacgagcttg ttcttaacgc cattgccgat tgtcaatcag cgtaatcatc gttcatgcct 11340
gatgccgcta tgtaggccgg ataaggcgtt cacgccgcat ccggcaaccg atgcctgatg 11400
cgacgcggtc gcgtcttatc aggcctacag gtcgatgccg atatgtacat cgtattcggc 11460
aattaataca tagca 11475
<210> 33
<211> 7769
<212> DNA
<213> 质粒pYEP24;
<400> 33
gaattctgaa ccagtcctaa aacgagtaaa taggaccggc aattcttcaa gcaataaaca 60
ggaataccaa ttattaaaag ataacttagt cagatcgtac aataaagctt tgaagaaaaa 120
tgcgccttat tcaatctttg ctataaaaaa tggcccaaaa tctcacattg gaagacattt 180
gatgacctca tttctttcaa tgaagggcct aacggagttg actaatgttg tgggaaattg 240
gagcgataag cgtgcttctg ccgtggccag gacaacgtat actcatcaga taacagcaat 300
acctgatcac tacttcgcac tagtttctcg gtactatgca tatgatccaa tatcaaagga 360
aatgatagca ttgaaggatg agactaatcc aattgaggag tggcagcata tagaacagct 420
aaagggtagt gctgaaggaa gcatacgata ccccgcatgg aatgggataa tatcacagga 480
ggtactagac tacctttcat cctacataaa tagacgcata taagtacgca tttaagcata 540
aacacgcact atgccgttct tctcatgtat atatatatac aggcaacacg cagatatagg 600
tgcgacgtga acagtgagct gtatgtgcgc agctcgcgtt gcattttcgg aagcgctcgt 660
tttcggaaac gctttgaagt tcctattccg aagttcctat tctctagaaa gtataggaac 720
ttcagagcgc ttttgaaaac caaaagcgct ctgaagacgc actttcaaaa aaccaaaaac 780
gcaccggact gtaacgagct actaaaatat tgcgaatacc gcttccacaa acattgctca 840
aaagtatctc tttgctatat atctctgtgc tatatcccta tataacctac ccatccacct 900
ttcgctcctt gaacttgcat ctaaactcga cctctacatt ttttatgttt atctctagta 960
ttactcttta gacaaaaaaa ttgtagtaag aactattcat agagtgaatc gaaaacaata 1020
cgaaaatgta aacatttcct atacgtagta tatagagaca aaatagaaga aaccgttcat 1080
aattttctga ccaatgaaga atcatcaacg ctatcacttt ctgttcacaa agtatgcgca 1140
atccacatcg gtatagaata taatcgggga tgcctttatc ttgaaaaaat gcacccgcag 1200
cttcgctagt aatcagtaaa cgcgggaagt ggagtcaggc tttttttatg gaagagaaaa 1260
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agactgcatt atagagcgca caaaggagaa aaaaagtaat ctaagatgct ttgttagaaa 1380
aatagcgctc tcgggatgca tttttgtaga acaaaaaaga agtatagatt ctttgttggt 1440
aaaatagcgc tctcgcgttg catttctgtt ctgtaaaaat gcagctcaga ttctttgttt 1500
gaaaaattag cgctctcgcg ttgcattttt gttttacaaa aatgaagcac agattcttcg 1560
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tgtttgaaaa attagcgctc tcgcgttgca tttttgttct acaaaatgaa gcacagatgc 1680
ttcgttaaca aagatatgct attgaagtgc aagatggaaa cgcagaaaat gaaccgggga 1740
tgcgacgtgc aagattacct atgcaataga tgcaatagtt tctccaggaa ccgaaataca 1800
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tgtttcaggg aaaactccca ggttcggatg ttcaaaattc aatgatgggt aacaagtacg 1920
atcgtaaatc tgtaaaacag tttgtcggat attaggctgt atctcctcaa agcgtattcg 1980
aatatcattg agaagctgca gcgtcacatc ggataataat gatggcagcc attgtagaag 2040
tgccttttgc atttctagtc tctttctcgg tctagctagt tttactacat cgcgaagata 2100
gaatcttaga tcacactgcc tttgctgagc tggatcaata gagtaacaaa agagtggtaa 2160
ggcctcgtta aaggacaagg acctgagcgg aagtgtatcg tacagtagac ggagtatact 2220
agtatagtct atagtccgtg gaattctcat gtttgacagc ttatcatcga taagcttttc 2280
aattcaattc atcatttttt ttttattctt ttttttgatt tcggtttctt tgaaattttt 2340
ttgattcggt aatctccgaa cagaaggaag aacgaaggaa ggagcacaga cttagattgg 2400
tatatatacg catatgtagt gttgaagaaa catgaaattg cccagtattc ttaacccaac 2460
tgcacagaac aaaaacctgc aggaaacgaa gataaatcat gtcgaaagct acatataagg 2520
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agcaaacaaa cttgtgtgct tcattggatg ttcgtaccac caaggaatta ctggagttag 2640
ttgaagcatt aggtcccaaa atttgtttac taaaaacaca tgtggatatc ttgactgatt 2700
tttccatgga gggcacagtt aagccgctaa aggcattatc cgccaagtac aattttttac 2760
tcttcgaaga cagaaaattt gctgacattg gtaatacagt caaattgcag tactctgcgg 2820
gtgtatacag aatagcagaa tgggcagaca ttacgaatgc acacggtgtg gtgggcccag 2880
gtattgttag cggtttgaag caggcggcag aagaagtaac aaaggaacct agaggccttt 2940
tgatgttagc agaattgtca tgcaagggct ccctatctac tggagaatat actaagggta 3000
ctgttgacat tgcgaagagc gacaaagatt ttgttatcgg ctttattgct caaagagaca 3060
tgggtggaag agatgaaggt tacgattggt tgattatgac acccggtgtg ggtttagatg 3120
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ctgacattat tattgttgga agaggactat ttgcaaaggg aagggatgct aaggtagagg 3240
gtgaacgtta cagaaaagca ggctgggaag catatttgag aagatgcggc cagcaaaact 3300
aaaaaactgt attataagta aatgcatgta tactaaactc acaaattaga gcttcaattt 3360
aattatatca gttattaccc gggaatctcg gtcgtaatga tttttataat gacgaaaaaa 3420
aaaaaattgg aaagaaaaag ctttaatgcg gtagtttatc acagttaaat tgctaacgca 3480
gtcaggcacc gtgtatgaaa tctaacaatg cgctcatcgt catcctcggc accgtcaccc 3540
tggatgctgt aggcataggc ttggttatgc cggtactgcc gggcctcttg cgggatatcg 3600
tccattccga cagcatcgcc agtcactatg gcgtgctgct agcgctatat gcgttgatgc 3660
aatttctatg cgcacccgtt ctcggagcac tgtccgaccg ctttggccgc cgcccagtcc 3720
tgctcgcttc gctacttgga gccactatcg actacgcgat catggcgacc acacccgtcc 3780
tgtggatcct ctacgccgga cgcatcgtgg ccggcatcac cggcgccaca ggtgcggttg 3840
ctggcgccta tatcgccgac atcaccgatg gggaagatcg ggctcgccac ttcgggctca 3900
tgagcgcttg tttcggcgtg ggtatggtgg caggccccgt ggccggggga ctgttgggcg 3960
ccatctcctt gcatgcacca ttccttgcgg cggcggtgct caacggcctc aacctactac 4020
tgggctgctt cctaatgcag gagtcgcata agggagagcg tcgaccgatg cccttgagag 4080
ccttcaaccc agtcagctcc ttccggtggg cgcggggcat gactatcgtc gccgcactta 4140
tgactgtctt ctttatcatg caactcgtag gacaggtgcc ggcagcgctc tgggtcattt 4200
tcggcgagga ccgctttcgc tggagcgcga cgatgatcgg cctgtcgctt gcggtattcg 4260
gaatcttgca cgccctcgct caagccttcg tcactggtcc cgccaccaaa cgtttcggcg 4320
agaagcaggc cattatcgcc ggcatggcgg ccgacgcgct gggctacgtc ttgctggcgt 4380
tcgcgacgcg aggctggatg gccttcccca ttatgattct tctcgcttcc ggcggcatcg 4440
ggatgcccgc gttgcaggcc atgctgtcca ggcaggtaga tgacgaccat cagggacagc 4500
ttcaaggatc gctcgcggct cttaccagcc taacttcgat cactggaccg ctgatcgtca 4560
cggcgattta tgccgcctcg gcgagcacat ggaacgggtt ggcatggatt gtaggcgccg 4620
ccctatacct tgtctgcctc cccgcgttgc gtcgcggtgc atggagccgg gccacctcga 4680
cctgaatgga agccggcggc acctcgctaa cggattcacc actccaagaa ttggagccaa 4740
tcaattcttg cggagaactg tgaatgcgca aaccaaccct tggcagaaca tatccatcgc 4800
gtccgccatc tccagcagcc gcacgcggcg catctcgggc agcgttgggt cctggccacg 4860
ggtgcgcatg atcgtgctcc tgtcgttgag gacccggcta ggctggcggg gttgccttac 4920
tggttagcag aatgaatcac cgatacgcga gcgaacgtga agcgactgct gctgcaaaac 4980
gtctgcgacc tgagcaacaa catgaatggt cttcggtttc cgtgtttcgt aaagtctgga 5040
aacgcggaag tcagcgccct gcaccattat gttccggatc tgcatcgcag gatgctgctg 5100
gctaccctgt ggaacaccta catctgtatt aacgaagcgc tggcattgac cctgagtgat 5160
ttttctctgg tcccgccgca tccataccgc cagttgttta ccctcacaac gttccagtaa 5220
ccgggcatgt tcatcatcag taacccgtat cgtgagcatc ctctctcgtt tcatcggtat 5280
cattaccccc atgaacagaa attccccctt acacggaggc atcaagtgac caaacaggaa 5340
aaaaccgccc ttaacatggc ccgctttatc agaagccaga cattaacgct tctggagaaa 5400
ctcaacgagc tggacgcgga tgaacaggca gacatctgtg aatcgcttca cgaccacgct 5460
gatgagcttt accgcagctg cctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac 5520
atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc 5580
cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggcg cagccatgac ccagtcacgt 5640
agcgatagcg gagtgtatac tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag 5700
tgcaccatat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc 5760
gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 5820
tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 5880
agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 5940
cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga 6000
ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg 6060
tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg 6120
gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc 6180
gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg 6240
gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca 6300
ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt 6360
ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag 6420
ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg 6480
gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc 6540
ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt 6600
tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt 6660
ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca 6720
gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg 6780
tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac 6840
cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg 6900
ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc 6960
gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgctg 7020
caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac 7080
gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc 7140
ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac 7200
tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact 7260
caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa 7320
cacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt 7380
cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca 7440
ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa 7500
aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac 7560
tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg 7620
gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc 7680
gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata 7740
ggcgtatcac gaggcccttt cgtcttcaa 7769
<210> 34
<211> 2000
<212> DNA
<213> 缺失的aroE区的序列;
<400> 34
actacgtccg tcctctgaaa tcttcagcgg atggacatat cgtcaaagtt ctggaggggc 60
aggtttgccc tgcatgtggc gcaaatctgg tattacgcca gggacgcttt ggtatgttta 120
ttggttgcat taactaccct gaatgcgaac ataccgaact tatcgataaa ccggacgaaa 180
cagcaattac atgcccccaa tgtcggacgg gccatctggt ccagcgccgc tcccgttatg 240
gcaaaacatt tcactcttgt gatcgctacc cggagtgtca atttgccatt aacttcaaac 300
ccatagctgg agaatgccct gagtgtcatt atccgctact catcgaaaag aaaaccgcgc 360
agggtgtaaa acacttttgt gccagtaaac aatgtggaaa gccggtttcg gcggaataat 420
aacgtgaata ataacctgca aagagacgct atcgcagctg cgatagatgt tctcaatgaa 480
gaacgtgtca tcgcctatcc aacggaagcc gttttcggtg ttgggtgcga tcctgatagc 540
gaaacagcag tgatgcgact gttggagtta aaacagcgtc cggttgataa ggggctgatt 600
ttaatcgcag caaattacga gcagcttaaa ccctatattg atgacaccat gttgactgac 660
gtgcagcgtg aaaccatttt ttcccgctgg ccaggtcctg tcacctttgt ctttcccgcg 720
cctgcgacaa caccgcgctg gttgacgggc cgctttgatt cgcttgctgt acgagtcacc 780
gaccatccgt tggtggttgc tttgtgccag gcttatggta aaccgctggt ttctaccagt 840
gccaacttga gtggattgcc accttgtcga acagtagacg aagttcgcgc acaatttggc 900
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gatgccctga cgggtgaact gtttcgacag gggtaacata atcaggccat ccagtttccg 1020
gacagggaag agtgggacga gaataaaaaa tgtgtatgtt ttcccgctct cgtgaatggt 1080
atgcaactga catgcgcgat ctctggcgag agtctggcgt atcgctttac tggagatacg 1140
ccagaacagt ggttagcgag ttttcgtcag catcgctggg acctggaaga agaagcggaa 1200
aacttaattc aggaacaaag tgaagatgat caaggctggg tctggttacc ctgatccaga 1260
tattcgtcct tccatttcac gtaattattc gcggaatagc gtaacccagc cttctcttca 1320
tcacttaacg ggcggatctg tttgacgggg ctaccgagat acagatatcc gctctccagc 1380
cgtttatttt gtgggaccag actacccgca ccaatcatca catcatcttc tactattgcg 1440
ccatcaagta aaattgagcc catcccaacc aaaactcgat tgccaatggt gcagccgtgg 1500
agcatcacct tgtgaccaac agtgacatct tcgccaatgg ttaatgggtt gccatctggg 1560
ttgtacgagg atttatgagt gacatgcaac atactgccat cctggatatt ggtgcgtgct 1620
ccgatctgta cataatgtac atctccacga atcacaacga gcggccagat ccccacatca 1680
tcagccagac gaacgtcacc aatcacgaca ctgctatcgt cgatcattac gcgctgaccg 1740
atttgtggaa aaagatcgcg gtatgggcgt aaaacatcag acatacttac ctcagcaata 1800
aatgatttac taatgacttt gggggcatta ttggccttgt gcaagtcttt tagtatgcaa 1860
aaaagcaccg ttttgtgtgc gattgcagca aaaagggtga aaaaacaaca aacagaaaaa 1920
aagatcaaaa aaatacttgt gcaaaaaatt gggatcccta taatgcgcct ccgttgagac 1980
gacaacgtga aacacttcac 2000
<210> 35
<211> 2460
<212> DNA
<213> 在缺失的ack基因座处整合的P15aroB盒的序列;
<400> 35
gatcggcggc ataaaacgga tcgcataacg cgtcatcttg ataacgcgat tttcgacaaa 60
gaccggggca aggcgttttt ccagcggcca cgtctttgag taatgctgtc cccggcgaaa 120
caagctaaaa aaattaacag aacgattatc cggcgttgac atgcttcacc tcaacttcac 180
atataaagat tcaaaaattt gtgcaaattc acaactcagc gggacaacgt tcaaaacatt 240
ttgtcttcca tacccactat caggtatcct ttagcagcct gaaggcctaa gtagtacata 300
ttcattgagt cgtcaaattc atatacatta tgccattggc tgaaaattac gcaaaatggc 360
atagactcaa gatatttctt ccatcatgca aaaaaaaatt tgcagtgcat gatgttaatc 420
ataaatgtcg gtgtcatcat gcgctacgct ctatggctcc ctgacgtttt tttagccacg 480
tatcaattat aggtacttcc ctcgaggcta ttgacgacag ctatggttca ctgtccacca 540
accaaaactg tgctcagtac cgccaatatt tctcccttga ggggtacaaa gaggtgtccc 600
tagaagagat ccacgctgtg taaaaatttt acaaaaaggt attgactttc cctacagggt 660
gtgtaataat ttaattacag gcgggggcaa ccccgcctgt tctagaggag gaggaatcgc 720
catggagagg attgtcgtta ctctcgggga acgtagttac ccaattacca tcgcatctgg 780
tttgtttaat gaaccagctt cattcttacc gctgaaatcg ggcgagcagg tcatgttggt 840
caccaacgaa accctggctc ctctgtatct cgataaggtc cgcggcgtac ttgaacaggc 900
gggtgttaac gtcgatagcg ttatcctccc tgacggcgag cagtataaaa gcctggctgt 960
actcgatacc gtctttacgg cgttgttaca aaagccgcat ggtcgcgata ctacgctggt 1020
ggcgcttggc ggcggcgtag tgggcgatct gaccggcttc gcggcggcga gttatcagcg 1080
cggtgttcgt ttcattcaag tcccgacgac gttactgtcg caggtcgatt cctccgttgg 1140
cggcaaaact gcggtcaacc atcccctcgg taaaaacatg attggcgcgt tctaccagcc 1200
tgcttcagtg gtggtggatc tcgactgtct gaaaacgctt cccccgcgtg agttagcgtc 1260
ggggctggca gaagtcatca aatacggcat tattcttgac ggtgcgtttt tcaactggct 1320
ggaagagaat ctggatgcgt tgttgcgtct ggacggtccg gcaatggcgt actgtattcg 1380
ccgttgttgt gaactgaagg cagaagttgt cgccgccgac gagcgcgaaa ccgggttacg 1440
tgctttactg aatctgggac acacctttgg tcatgccatt gaagctgaaa tggggtatgg 1500
caattggtta catggtgaag cggtcgctgc gggtatggtg atggcggcgc ggacgtcgga 1560
acgtctcggg cagtttagtt ctgccgaaac gcagcgtatt ataaccctgc tcacgcgggc 1620
tgggttaccg gtcaatgggc cgcgcgaaat gtccgcgcag gcgtatttac cgcatatgct 1680
gcgtgacaag aaagtccttg cgggagagat gcgcttaatt cttccgttgg caattggtaa 1740
gagtgaagtt cgcagcggcg tttcgcacga gcttgttctt aacgccattg ccgattgtca 1800
atcagcgtaa tcatcgttca tgcctgatgc cgctatgtag gccggataag gcgttcacgc 1860
cgcatccggc aaccgatgcc tgatgcgacg cggtcgcgtc ttatcaggcc tacaggtcga 1920
tgccgatatg tacatcgtat tcggcaatta atacatagca tttcacaccg ccagctcagc 1980
tggcggtgct gttttgtaac ccgccaaatc ggcggtaacg aaagaggata aaccgtgtcc 2040
cgtattatta tgctgatccc taccggaacc agcgtcggtc tgaccagcgt cagccttggc 2100
gtgatccgtg caatggaacg caaaggcgtt cgtctgagcg ttttcaaacc tatcgctcag 2160
ccgcgtaccg gtggcgatgc gcccgatcag actacgacta tcgtgcgtgc gaactcttcc 2220
accacgacgg ccgctgaacc gctgaaaatg agctacgttg aaggtctgct ttccagcaat 2280
cagaaagatg tgctgatgga agagatcgtc gcaaactacc acgctaacac caaagacgct 2340
gaagtcgttc tggttgaagg tctggtcccg acacgtaagc accagtttgc ccagtctctg 2400
aactacgaaa tcgctaaaac gctgaatgcg gaaatcgtct tcgttatgtc tcagggcact 2460
<210> 36
<211> 1000
<212> DNA
<213> 缺失的poxB区的序列;
<400> 36
gcggcccggc tccgtatatg gattgggtag agcaggaagt gaaagcgctc ggcgtgacgc 60
gtttctttaa agagaaattc ttcaccccag tagcggaagc agcgaccagc ggtctgaaat 120
tcaccaaact gcaaccggca cgagaatttt acgccccggt tggcaccacg ctactggagg 180
cgctggaaag caataacgtt ccggttgtcg ccgcctgccg tgcgggtgtt tgcggctgct 240
gtaagacaaa agtggtttcc ggtgaatata cggtgagcag cacaatgacg ctgaccgacg 300
ccgaaatcgc tgaaggttac gtactggcct gctcctgcca tccgcagggg gatttggttc 360
tcgcataatc gccttatgcc cgatgatatt cctttcatcg ggctatttaa ccgttagtgc 420
ctcctttctc tcccatccct tccccctccg tcagatgaac taaacttgtt accgttatca 480
cattcaggag atggagaacc aaagggtggc atttcccgtc ataataagga catgccatga 540
ttgatttacg cagtgatacc gttacccgac cgagccgcgc catgctcgaa gcaatgatgg 600
ccgccccggt tggggacgac gtttacggag acgaccctac cgttaatgct ctgcaggact 660
acgccgcaga gctttccggt aaagaagccg ccatttttct gccgaccggc actcaggcca 720
acctggtcgc tctgctcagt cactgcgaac gtggcgaaga gtatattgtc ggtcaggccg 780
cgcataacta tctgtttgaa gccggtggcg cagcggtgct gggcagtatt cagccgcaac 840
ccatcgacgc ggctgccgac ggcacgctac cgctggataa agtggcgatg aaaatcaaac 900
ccgacgatat ccatttcgcc cgcaccaaat tactcagtct ggaaaacacc cacaacggca 960
aagtgctgcc gcgtgaatac ctgaaagaag catgggaatt 1000
<210> 37
<211> 3392
<212> DNA
<213> 在缺失的poxB基因座处的tktA盒;
<400> 37
gcggcccggc tccgtatatg gattgggtag agcaggaagt gaaagcgctc ggcgtgacgc 60
gtttctttaa agagaaattc ttcaccccag tagcggaagc agcgaccagc ggtctgaaat 120
tcaccaaact gcaaccggca cgagaatttt acgccccggt tggcaccacg ctactggagg 180
cgctggaaag caataacgtt ccggttgtcg ccgcctgccg tgcgggtgtt tgcggctgct 240
gtaagacaaa agtggtttcc ggtgaatata cggtgagcag cacaatgacg ctgaccgacg 300
ccgaaatcgc tgaaggttac gtactggcct gctcctgcca tccgcagggg gatttggttc 360
tcgcataatc gccttatgcc cgatgatatt cctttcatcg ggctatttaa ccgttagtgc 420
ctcctttctc tcccatccct tccccctccg tcagatgaac taaacttgtt accgttatca 480
cattcaggag atggagaacc aaggaaaagc gcaacggacg ggcgagtaga ttgcgcaaca 540
tgcgagcatg atccagagat ttctgaagca gcaaaaggat gttccatgta catgacgcgc 600
ggcttgcggt aaattgttgg caaattttcc ggcgtagccc aaaacgcgct gtcgtcaagt 660
cgttaagggc gtgcccttca tcatccgatc tggagtcaaa atgtcctcac gtaaagagct 720
tgccaatgct attcgtgcgc tgagcatgga cgcagtacag aaagccaaat ccggtcaccc 780
gggtgcccct atgggtatgg ctgacattgc cgaagtcctg tggcgtgatt tcctgaaaca 840
caacccgcag aatccgtcct gggctgaccg tgaccgcttc gtgctgtcca acggccacgg 900
ctccatgctg atctacagcc tgctgcacct caccggttac gatctgccga tggaagaact 960
gaaaaacttc cgtcagctgc actctaaaac tccgggccac ccggaagtag gttataccgc 1020
tggtgtggaa accaccaccg gtccgctggg tcagggtatt gccaacgcag tcggtatggc 1080
gattgcagaa aaaacgctgg cggcgcagtt taaccgtcca ggtcacgaca ttgtcgacca 1140
ctacacctac gccttcatgg gcgacggctg catgatggaa ggcatctccc acgaagtttg 1200
ctctctggcg ggtacgctga agctgggtaa actgattgcg ttctacgatg acaacggtat 1260
ctcaatcgat ggtcacgttg aaggctggtt cactgacgac accgcaatgc gtttcgaagc 1320
ttacggctgg cacgttattc gcgacatcga cggtcatgac gcggcatcca tcaaacgcgc 1380
agtagaagaa gcgcgcgcag tgactgacaa accgtccctg ctgatgtgca aaaccatcat 1440
cggtttcggt tccccgaaca aagccggtac ccacgactcc cacggtgcgc cgctgggcga 1500
cgctgaaatt gccctgaccc gcgaacagct gggctggaaa tacgcgccgt tcgaaatccc 1560
gtctgaaatc tatgctcagt gggatgcgaa agaagcaggc caggcgaaag aatctgcatg 1620
gaatgagaag tttgcggctt acgcgaaagc ttatccgcag gaagcggctg aatttacccg 1680
ccgtatgaaa ggcgaaatgc cgtctgactt cgacgccaaa gcgaaagagt ttatcgctaa 1740
actgcaggct aatccggcga aaatcgccag ccgtaaagcg tcgcagaatg ctatcgaagc 1800
gttcggcccg ctgttgcctg aattcctcgg cggctctgct gacctggcac cgtctaacct 1860
gaccctgtgg tctggttcta aagcaatcaa cgaagatgct gcaggtaact acatccacta 1920
cggtgttcgc gagttcggta tgaccgcgat tgctaacggt atctccctgc acggtggttt 1980
cctgccgtac acctccacct tcctgatgtt cgtggaatac gcacgtaacg ccgtacgtat 2040
ggctgcgctg atgaaacagc gtcaggtgat ggtttacacc cacgactcca tcggtctggg 2100
cgaagatggc ccgactcacc agccggttga gcaggtcgct tctctgcgcg tgaccccgaa 2160
catgtctaca tggcgtccgt gtgaccaggt tgaatccgcg gtcgcgtgga aatacggcgt 2220
tgagcgtcag gacggcccga ctgcgcttat cctctcccgt cagaacctgg cgcagcagga 2280
acgaactgaa gagcaactgg caaacatcgc gcgcggtggt tatgtgctga aagactgcgc 2340
cggtcagccg gaactgattt tcatcgctac cggttcagaa gttgaactgg ctgttgctgc 2400
ctacgaaaaa ctgactgccg aaggcgtgaa agcgcgcgtg gtgtccatgc cgtctaccga 2460
cgcatttgac aagcaggatg ctgcttaccg tgaatccgta ctgccgaaag cggttactgc 2520
acgcgttgct gtagaagcgg gtattgctga ctactggtac aagtatgttg gcctgaacgg 2580
tgctatcgtc ggtatgacca ccttcggtga atctgctccg gcagagctgc tgtttgaaga 2640
gttcggcttc actgttgata acgttgttgc gaaagcaaaa gaactgctgt aattagcatt 2700
tcgggtaaaa aggtcgcttc ggcgaccttt tttattacct tgatatgtcc gtttgcggac 2760
aagcaataga taaagcgtgt tgtagatcac aaatatttat atgcaataaa tatcaattat 2820
gtaatatgca tcacgatatg cgtattgaca tttgttgtta taactataac tcaatgttat 2880
ataagaaatt aaaaagggtg gcatttcccg tcataataag gacatgccat gattgattta 2940
cgcagtgata ccgttacccg accgagccgc gccatgctcg aagcaatgat ggccgccccg 3000
gttggggacg acgtttacgg agacgaccct accgttaatg ctctgcagga ctacgccgca 3060
gagctttccg gtaaagaagc cgccattttt ctgccgaccg gcactcaggc caacctggtc 3120
gctctgctca gtcactgcga acgtggcgaa gagtatattg tcggtcaggc cgcgcataac 3180
tatctgtttg aagccggtgg cgcagcggtg ctgggcagta ttcagccgca acccatcgac 3240
gcggctgccg acggcacgct accgctggat aaagtggcga tgaaaatcaa acccgacgat 3300
atccatttcg cccgcaccaa attactcagt ctggaaaaca cccacaacgg caaagtgctg 3360
ccgcgtgaat acctgaaaga agcatgggaa tt 3392
<210> 38
<211> 1045
<212> DNA
<213> ptsHI缺失序列;
<400> 38
gaagatgaaa gctttaccaa caagaatatt gtggttattc taccatcatc gggtgagcgt 60
tatttaagca ccgcattgtt tgccgatctc ttcactgaga aagaattgca acagtaatgc 120
cagcttgtta aaaatgcgta aaaaagcacc tttttaggtg cttttttgtg gcctgcttca 180
aactttcgcc cctcctggca ttgattcagc ctgtcggaac tggtatttaa ccagactaat 240
tattttgatg cgcgaaatta atcgttacag gaaaagccaa agctgaatcg attttatgat 300
ttggttcaat tcttccttta gcggcataat gtttaatgac gtacgaaacg tcagcggtca 360
acacccgcca gcaatggact gtattgcgct cttcgtgcgt cgcgtctgtt aaaaactggc 420
gctaacaata caggctaaag tcgaaccgcc aggctagact ttagttccac aacactaaac 480
ctataagttg gggaaataca atgttccagc aagaagttac cattaccgct ccgacaatct 540
gctaatccac gagatgcggc ccaatttact gcttaggaga agatcatggg tttgttcgat 600
aaactgaaat ctctggtttc cgacgacaag aaggataccg gaactattga gatcattgct 660
ccgctctctg gcgagatcgt caatatcgaa gacgtgccgg atgtcgtttt tgcggaaaaa 720
atcgttggtg atggtattgc tatcaaacca acgggtaaca aaatggtcgc gccagtagac 780
ggcaccattg gtaaaatctt tgaaaccaac cacgcattct ctatcgaatc tgatagcggc 840
gttgaactgt tcgtccactt cggtatcgac accgttgaac tgaaaggcga aggcttcaag 900
cgtattgctg aagaaggtca gcgcgtgaaa gttggcgata ctgtcattga atttgatctg 960
ccgctgctgg aagagaaagc caagtctacc ctgactccgg ttgttatctc caacatggac 1020
gaaatcaaag aactgatcaa actgt 1045
<210> 39
<211> 4595
<212> DNA
<213> 在缺失的tdc基因座处整合的glf-glk盒;
<400> 39
ctgatttctt tgtcgctgat cccttactgg aactctgcag ttatcgacca ggttgacctc 60
ggttcgctgt cgttaaccgg tcatgacggt atcctgatca ctgtctggct ggggatttcc 120
atcatggttt tctcctttaa cttctcgcca atcgtctctt ccttcgtggt ttctaaacgt 180
gaagagtatg agaaagactt cggtcgcgac ttcaccgaac gtaaatgttc ccaaatcatt 240
tctcgtgcca gcatgctgat ggttgcagtg gtgatgttct ttgcctttag ctgcctgttt 300
actctgtctc cggccaacat ggcggaagcc aaagcgcaga atattccagt gctttcttat 360
ctggctaacc actttgcgtc catgaccggt accaaaacaa cgttcgcgat tacactggaa 420
tatgcggctt ccatcatcgc actcgtggct atcttcaaat ctttcttcgg tcactatctg 480
gggacgctgg aaggcttgaa tggtctgatt ctgaagttcg gttataaagg tgacaaaacc 540
aaagtgtcgc tgggtaaact gaatactctc agcatgatct tcatcatggg ctccacctgg 600
gttgttgcct acgccaaccc gaacatcctc gacctgattg aagccatggg cgcaccgatt 660
atcgcatccc tgctgtgcct gttgccgatg tatgccatcc gtaaagcgcc gtctctggcg 720
aaataccgtg gtcgtctgga taacgtgttt gttaccgtga ttggtctgct gaccatcctg 780
aacatcgtat acaaactgtt ttaatccgta actcaggatg agaaaagaga tgaatgaatt 840
tccggttgtt ttggttatta actgtggttc gtcttcgatt aagttttccg tactcgatgc 900
cagcgactgt gaagtattaa tgtcaggtat tgccgacggt attaactcgg aaaatgcatt 960
cttatccgta aatgggggag agccagcacc gctggctcac cacagctacg aaggtgcatt 1020
gaaggcaatt gcatttgaac tggaaaaacg gagtttaaat gacagcgtgg ccttaattgg 1080
tgcaaaagtg gctgtgactg taaaaagaaa tcgaaaaaga ccgttttgtg tgaaaacggt 1140
ctttttgttt ccttttaacc aactgccata actcgaggcc tacctagctt ccaagaaaga 1200
tatcctaaca gcacaagagc ggaaagatgt tttgttctac atccagaaca acctctgcta 1260
aaattcctga aaaattttgc aaaaagttgt tgactttatc tacaaggtgt ggtataataa 1320
tcttaacaac agcaggacgc tctagaggga gaggaatcgc catgagttct gaaagtagtc 1380
agggtctagt cacgcgacta gccctaatcg ctgctatagg cggcttgctt ttcggttacg 1440
attcagcggt tatcgctgca atcggtacac cggttgatat ccattttatt gcccctcgtc 1500
acctgtctgc tacggctgcg gcttcccttt ctgggatggt cgttgttgct gttttggtcg 1560
gttgtgttac cggttctttg ctgtctggct ggattggtat tcgcttcggt cgtcgcggcg 1620
gattgttgat gagttccatt tgtttcgtcg ccgccggttt tggtgctgcg ttaaccgaaa 1680
aattatttgg aaccggtggt tcggctttac aaattttttg ctttttccgg tttcttgccg 1740
gtttaggtat cggtgtcgtt tcaaccttga ccccaaccta tattgctgaa attgctccgc 1800
cagacaaacg tggtcagatg gtttctggtc agcagatggc cattgtgacg ggtgctttaa 1860
ccggttatat ctttacctgg ttactggctc atttcggttc tatcgattgg gttaatgcca 1920
gtggttggtg ctggtctccg gcttcagaag gcctgatcgg tattgccttc ttattgctgc 1980
tgttaaccgc accggatacg ccgcattggt tggtgatgaa gggacgtcat tccgaggcta 2040
gcaaaatcct tgctcgtctg gaaccgcaag ccgatcctaa tctgacgatt caaaagatta 2100
aagctggctt tgataaagcc atggacaaaa gcagcgcagg tttgtttgct tttggtatca 2160
ccgttgtttt tgccggtgta tccgttgctg ccttccagca gttagtcggt attaacgccg 2220
tgctgtatta tgcaccgcag atgttccaga atttaggttt tggagctgat acggcattat 2280
tgcagaccat ctctatcggt gttgtgaact tcatcttcac catgattgct tcccgtgttg 2340
ttgaccgctt cggccgtaaa cctctgctta tttggggtgc tctcggtatg gctgcaatga 2400
tggctgtttt aggctgctgt ttctggttca aagtcggtgg tgttttgcct ttggcttctg 2460
tgcttcttta tattgcagtc tttggtatgt catggggccc tgtctgctgg gttgttctgt 2520
cagaaatgtt cccgagttcc atcaagggcg cagctatgcc tatcgctgtt accggacaat 2580
ggttagctaa tatcttggtt aacttcctgt ttaaggttgc cgatggttct ccagcattga 2640
atcagacttt caaccacggt ttctcctatc tcgttttcgc agcattaagt atcttaggtg 2700
gcttgattgt tgctcgcttc gtgccggaaa ccaaaggtcg gagcctggat gaaatcgagg 2760
agatgtggcg ctcccagaag tagttaaact tgctttggct gaatcctttt gtctttttta 2820
gataagtctt aaccaattat actttttgtt tacaacgatg gtataaagcg ggcggactta 2880
ttttacctgt tgggtagcct tctgatttca gaaaggaatt attatggaaa ttgttgcgat 2940
tgacatcggt ggaacgcatg cgcgtttctc tattgcggaa gtaagcaatg gtcgggttct 3000
ttctcttgga gaagaaacaa cttttaaaac ggcagaacat gctagcttgc agttagcttg 3060
ggaacgtttc ggtgaaaaac tgggtcgtcc tctgccacgt gccgcagcta ttgcatgggc 3120
tggcccggtt catggtgaag ttttaaaact taccaataac ccttgggtat taagaccagc 3180
tactctgaat gaaaagctgg acatcgatac gcatgttctg atcaatgact tcggcgcggt 3240
tgcccacgcg gttgcgcata tggattcttc ttatctggat catatttgtg gtcctgatga 3300
agcgcttcct agcgatggtg ttatcactat tcttggtccg ggaacgggct tgggtgttgc 3360
ccatctgttg cggactgaag gccgttattt cgtcatcgaa actgaaggcg gtcatatcga 3420
ctttgctccg cttgacagac ttgaagacaa aattctggca cgtttacgtg aacgtttccg 3480
ccgcgtttct atcgaacgca ttatttctgg cccgggtctt ggtaatatct acgaagcact 3540
ggctgccatt gaaggcgttc cgttcagctt gctggatgat attaaattat ggcagatggc 3600
tttggaaggt aaagacaacc ttgctgaagc cgctttggat cgcttctgct tgagccttgg 3660
cgctatcgct ggtgatcttg ctttggcaca gggtcgaacc agtgttgtta ttggcggtgg 3720
tgtcggtctt cgtatcgctt cccatttgcc agaatctggt ttccgtcagc gctttgtttc 3780
aaaaggacgc tttgaacgcg tcatgtccaa gattccggtt aagttgatta cttatccgca 3840
gcctggactg ttgggtgcgc agctgcctat gccaacaaat attctgaagt tgaataatat 3900
tttttaatat tatgaactga atttaagagg ctgccttccg ataaaatcgg gaggtggcct 3960
tttttatatt ttttactaaa aaatgaagac aaaaaagtct taagtaagaa taatattatt 4020
attaactttt gatatatttt gtattagtgg atccgccctc ccgctggaaa ttgaagccat 4080
cgcagtacgt agtgcgtaaa gcctcgtgag cgggacggtc gtaaggtcgt tccgctccac 4140
ttcactgaac ggcaatccga gggtgtggat atgattagtg cattcgatat tttcaaaatt 4200
gggattggtc cctccagttc gcataccgtg gggccaatga atgccggaaa aagttttatt 4260
gatcggctgg aaagtagcgg cttattaacc gcgacgagcc atattgtggt cgatctgtac 4320
gggtcgttgt cactgacggg caaaggccat gccacggatg tcgccatcat catgggactg 4380
gcaggaaaca gtccgcagga tgttgtcatt gatgagatcc ctgcatttat agagttagta 4440
acgcgcagcg ggcggctgcc agtggcatct ggtgcgcata ttgttgattt tcctgtagca 4500
aagaacatta tcttccatcc cgaaatgttg cctcgccatg agaacggaat gcggatcact 4560
gcctggaagg gacaggaaga gctattaagt aaaac 4595
<210> 40
<211> 1069
<212> DNA
<213> galP缺失区;
<400> 40
actttggtcg tgaacatttc ccgtgggaaa aaaccgacaa agcgcagctg ctgcgcgatg 60
ctgccggtct gaagtaatct ttcttcacct gcgttcaaag gccagcctcg cgctggcctt 120
tttcttttgg ataggcgttc acgccgcatc cggcaaaaaa accgcccgca caataacatc 180
attcttcctg atcacgtttc accgcagatt atcatcacaa ctgaaaccga ttacaccaac 240
cacaacagac aaagatttgt aatattttca tattattatt cggttttcac agttgttaca 300
tttcttttca gtaaagtctt aattgcagat aacagcgttt aatctatgat gatataactc 360
aattattttc atgcacttaa atcataacta agataaatgt tagtgtaagc gattacactg 420
atgtgatttg cttcacatct ttttacgtcg tactcaccta tcttaattca caataaaaaa 480
taaccatatt ggagggcatc atgcctgacg ctaaaaaaca ggggcggtca aacaaggcaa 540
tgacgtttga aataggcgct cacgattaat ctccccaagc ttcctcccat cgcggaggaa 600
gccacctctt gcagtcatct tttcttcgct ctatcctctg ccgctatgaa aacatcccgt 660
ctccctatcg ccatccaaca ggccgttatg cgtcgcctgc gggaaaaact cgcccaggcc 720
aacctgaagc tagggcgtaa ctacccggag ccaaaactct cttacaccca gcgcggaacc 780
tccgccggaa cggcctggct ggaaagctat gaaattcgcc tcaatcccgt tttgctgttg 840
gaaaacagtg aagcttttat tgaagaagtg gtaccgcacg aactggcaca tttgctggta 900
tggaaacatt tcggccgcgt agcgccacat ggcaaagagt ggaagtggat gatggaaaac 960
gtgctgggtg ttcccgcccg tcgtacgcat cagttcgaac tgcaatccgt gcgtcgcaac 1020
accttcccct accgctgcaa gtgccaggag catcagctta ccgtacgcc 1069
<210> 41
<211> 6100
<212> DNA
<213> adhE基因座处的P15-catAX +PR-aroY+P26-quiC盒;
<400> 41
ttgattttca taggttaagc aaatcatcac cgcactgact atactctcgt attcgagcag 60
atgatttact aaaaaagttt aacattatca ggagagcatt agcttgctat tgacgacagc 120
tatggttcac tgtccaccaa ccaaaactgt gctcagtacc gccaatattt ctcccttgag 180
gggtacaaag aggtgtccct agaagagatc cacgctgtgt aaaaatttta caaaaaggta 240
ttgactttcc ctacagggtg tgtaataatt taattacagg cgggggcaac cccgcctgtt 300
ctgcagagga ggaatatagc catggaagtg aaaatcttca acacccagga tgttcaggat 360
tttctgcgtg ttgcaagcgg tctggaacaa gagggtggta atccgcgtgt taaacaaatt 420
attcatcgtg ttctgagcga cctgtataaa gcaattgaag atctgaatat caccagcgac 480
gaatattggg caggcgttgc atatctgaat cagctgggtg caaatcaaga agcaggtctg 540
ctgagtccgg gtctgggttt tgatcattat ctggatatgc gtatggatgc agaagatgca 600
gcactgggta ttgaaaatgc aacaccgcgt accattgaag gtccgctgta tgttgcgggt 660
gcaccggaaa gcgttggtta tgcacgcatg gatgatggta gcgatccgaa tggtcatacc 720
ctgattctgc atggcaccat ttttgatgca gatggtaaac cgctgccgaa tgcaaaagtt 780
gaaatttggc atgcaaacac caaaggcttt tatagccatt ttgatccgac cggtgaacag 840
caggccttta atatgcgtcg tagcattatt accgatgaga atggtcagta tcgtgttcgt 900
accattctgc ctgccggtta tggttgtcct ccggaaggtc cgacccagca actgctgaac 960
caactgggtc gtcatggtaa tcgtccggca catattcatt attttgttag cgcagatggt 1020
caccgtaaac tgaccaccca gattaatgtt gccggtgatc cgtataccta tgatgatttt 1080
gcatatgcca cccgtgaagg tctggttgtt gatgcagttg aacataccga tccggaagca 1140
attaaagcca atgatgtgga aggtcctttt gccgaaatgg tgtttgatct gaaactgacc 1200
cgtctggttg atggtgttga taatcaggtt gtggatcgtc cgcgtctggc agtttaatac 1260
accaaaatgg ttcaaaatta tcaggcgagt gatcatgatc actggcctgt ttttatttca 1320
gggaagggtg gagacaatta cgtggataat cagatcatcc aagaaaccgt ggataaaatt 1380
ctgagcgttc tgccgaatca ggcaggtcag ctggcacgtc tggtgcgtct gatgcaattt 1440
gcatgcgatc cgaccattac cgttattggc aaatataacc atggtaaaag ccgtctgctg 1500
aatgaactga ttggcaccga tatctttagc gttgcagata aacgtgaaac cattcagctg 1560
gccgaacata aacaggatca ggttcgttgg ctggatgcac ctggtctgga tgccgatgtt 1620
gcagcagttg atgatcgtca tgcatttgaa gcagtttgga cccaggcaga tattcgtctg 1680
tttgttcata gcgttcgtga aggtgaactg gatgcaaccg aacaccatct gctgcaacag 1740
ctgattgaag atgccgatca tagccgtcgt cagaccattc tggttctgac ccagattgat 1800
cagattccgg atcagaccat cctgacacag attaaaacca gcattgcaca gcaggttccg 1860
aaactggata tttgggcagt tagcgcaacc cgtcatcgtc agggcattga aaacggtaaa 1920
accctgctga tcgaaaaaag cggtattggt gcactgcgcc ataccctgga acaggcactg 1980
gcacaggtgc cgagcgcacg tacctatgaa aaaaatcgtc tgctgtcaga tctgcaccat 2040
cagctgaaac aactgctgct ggatcagaaa catgttctgc aacaactgca acagacacag 2100
caacagcagc tgcatgattt tgataccggt ctgattaaca ttctggacaa aattcgtgtt 2160
gatctggaac cgattgtgaa tattgatggt caggatcaag cactgaatcc ggatagcttt 2220
gcaaccatgt ttaaaaacac cgcagcaaaa cagcagcgtg ccaaagttca gattgcatat 2280
agccgtgcat gcattgaaat caacagccat ctgattcgcc atggtgttgt tggtctgcct 2340
gcggaacagc agaccaccat taaaagcatt gataccgtga ttgttgccgt gtttggtatc 2400
agcgttaaat ttcgtgatca gctgcgtgcc ctgttttata ccgataccga acgtcagcgt 2460
ctgcaacgtg aatttcgttt ctattttgaa aaaagtgccg gtcgcatgat tctggcagca 2520
aaaattgaac agaccatgcg tcagcagggc tgtattcaga atgccatgat ggcactgcaa 2580
caaatggaaa gcgcagcata aaaacacgga cgccgcaaac ggcgtccgaa tttcttggtc 2640
gaccgttaaa tctatcaccg caagggataa atatctaaca ccgtgcgtgt tgactatttt 2700
acctctggcg gtgataatgg ttgcatgtac taatctagat aaggaatata gccatgaccg 2760
caccgattca ggatctgcgt gatgcaattg ccctgctgca acagcatgat aatcagtatc 2820
tggaaaccga tcatccggtt gatccgaatg cagaactggc aggcgtttat cgtcatattg 2880
gtgccggtgg caccgttaaa cgtccgaccc gtattggtcc ggcaatgatg tttaataaca 2940
ttaaaggtta tccgcacagc cgtattctgg ttggtatgca tgcaagccgt cagcgtgcag 3000
cactgctgct gggttgtgaa gcaagtcagc tggcactgga agttggtaaa gcagttaaaa 3060
aaccggttgc accggtggtt gttccggcaa gcagcgcacc gtgtcaagag cagatttttc 3120
tggcagatga tccggatttt gatctgcgta ccctgctgcc tgcacatacc aataccccga 3180
ttgatgcagg tccgtttttt tgtctgggtc tggccctggc aagcgatccg gtggatgcaa 3240
gcctgaccga tgttaccatt catcgtctgt gtgttcaggg tcgtgatgaa ctgagcatgt 3300
tcctggcagc aggtcgccat attgaagttt ttcgtcagaa agcagaagca gcaggtaaac 3360
cgctgccgat taccattaat atgggtctgg acccagcaat ctatattggc gcatgttttg 3420
aagcaccgac caccccgttt ggttataatg aactgggtgt tgccggtgca ctgcgtcagc 3480
gtccggttga actggttcag ggtgttagcg ttccggaaaa agcaattgca cgtgccgaaa 3540
ttgttattga aggtgaactg ctgcctggtg ttcgtgttcg tgaagatcag cataccaatt 3600
caggtcatgc aatgccggaa tttccgggtt attgtggtgg tgcaaatccg agcctgccgg 3660
ttattaaagt taaagccgtt accatgcgca ataacgcaat tctgcaaacc ctggttggtc 3720
cgggtgaaga acataccacc ctggcaggtc tgccgaccga agcaagcatt tggaatgcag 3780
ttgaagcagc aattccgggt tttctgcaaa atgtttatgc ccataccgca ggcggtggta 3840
aatttctggg tattctgcaa gtgaaaaaac gtcagcctgc cgatgaaggt cgtcagggtc 3900
aggcagccct gctggcgctg gcaacctata gcgaactgaa aaatatcatt ctggtggatg 3960
aggatgtgga catttttgat agtgatgata ttctgtgggc aatgaccacc cgtatgcagg 4020
gtgatgttag cattaccacc attccgggta ttcgcggtca tcagctggac ccgagccaga 4080
caccggaata ttcaccgagc attcgtggta atggtattag ctgcaaaacc atctttgatt 4140
gtaccgttcc gtgggcactg aaaagccatt ttgaacgtgc accgtttgca gatgttgatc 4200
cgcgtccgtt tgcacctgaa tattttgcac gtctggaaaa aaatcagggc agcgcaaaat 4260
aagctaataa caggcctgct ggtaatcgca ggaattttta tttggatgga tccgcctacc 4320
tagcttccaa gaaagatatc ctaacagcac aagagcggaa agatgttttg ttctacatcc 4380
agaacaacct ctgctaaaat tcctgaaaaa ttttgcaaaa agttgttgac tttatctaca 4440
aggtgtggta taataatctt aacaacagca ggacgctccc gggttgagga aaacctaatg 4500
aaactgacca gcctgcgtgt tagcctgctg gcactgggtc tggttaccag cggttttgca 4560
gcagcagaaa cctataccgt tgatcgttat caggatgata gcgaaaaagg tagcctgcgt 4620
tgggcaattg aacagagcaa tgcaaatagc gcacaagaaa accagattct gattcaggca 4680
gttggtaaag caccgtatgt tatcaaagtt gataaaccgc tgcctccgat taaaagcagc 4740
gttaaaatca ttggcaccga gtgggataaa accggtgaat ttattgcaat tgatggcagc 4800
aactatatca aaggcgaagg tgaaaaagca tgtccgggtg caaatccggg tcagtatggc 4860
accaatgttc gtaccatgac cctgcctggt ctggttctgc aagatgttaa tggtgttacc 4920
ctgaaaggtc tggatgttca tcgtttttgt attggtgttc tggttaatcg cagcagcaat 4980
aacctgattc agcataatcg tatcagcaac aattatggtg gtgccggtgt tatgattacc 5040
ggtgatgatg gtaaaggtaa tccgaccagc accaccacca ataataacaa agttctggat 5100
aacgtgttca tcgataatgg tgatggtctg gaactgaccc gtggtgcagc atttaatctg 5160
attgcaaata acctgtttac cagcacaaaa gccaatccgg aaccgagcca gggtattgaa 5220
attctgtggg gtaatgataa tgccgtggtg ggtaacaaat tcgaaaacta ttcagatggc 5280
ctgcaaatca attggggtaa acgtaactat atcgcctata acgaactgac caataacagc 5340
ctgggtttca atctgacagg tgatggtaac attttcgaca gcaataaagt gcatggtaac 5400
cgtattggta ttgccattcg tagtgaaaaa gatgccaatg cacgtattac cctgaccaaa 5460
aatcagattt gggataacgg caaagatatc aaacgttgtg aagccggtgg tagctgtgtt 5520
ccgaatcagc gtctgggtgc aattgttttt ggtgttccgg cactggaaca tgaaggtttt 5580
gttggtagcc gtggcggtgg tgttgttatt gaaccggcaa aactgcaaaa aacctgcacc 5640
cagccgaacc agcagaattg taatgcaatt cctaatcagg gtattcaggc accgaaactg 5700
acagttagca aaaaacagct gaccgttgaa gttaaaggca cccctaatca gcgttataat 5760
gtggaatttt ttggcaatcg taatgccagc agcagcgaag cagaacagta tctgggtagc 5820
attgttgttg ttaccgatca tcagggtctg gcaaaagcaa attgggctcc gaaagttagc 5880
atgccgagcg ttaccgcaaa tgtgacagat catctgggtg cgaccagcga actgagcagc 5940
gcagttaaaa tgcgttaaat gcatgcgcgc cgcgttcgcg cggcgctttt ttttggtact 6000
cagtagcgct gtctggcaac ataaacggcc ccttctgggc aatgccgatc agttaaggat 6060
tagttgaccg atccttaaac tgaggcacta taacggcttc 6100

Claims (13)

1.经基因改造的细菌，其在PEP依赖性磷酸转移酶体系中有缺陷、在用于葡萄糖输入的基于GalP蛋白的体系中有缺陷，且包含编码功能性的葡萄糖易化扩散蛋白的外源基因。
2.权利要求1的经基因改造的细菌，其中功能性的葡萄糖易化扩散蛋白是由glf基因编码的Glf蛋白。
3.权利要求1的经基因改造的细菌，还包含编码葡糖激酶的外源基因。
4.权利要求1的经基因改造的细菌，还包含一个或多个外源基因，其中所述外源基因编码在从非芳族碳源开始生产顺，顺-黏康酸的黏康酸通路中起作用的蛋白质。
5.权利要求4的经基因改造的细菌，其中所述在黏康酸通路中起作用的蛋白质的基因选自由aroZ、qa-4、asbF、quiC、aroY和catAX组成的组。
6.权利要求1的经基因改造的细菌，还包含一个或多个在染色体上整合的外源基因，其中所述外源基因编码在莽草酸通路中起作用的蛋白质。
7.权利要求6的经基因改造的细菌，其中所述编码在莽草酸通路中起作用的蛋白质的外源基因选自由aroB、aroD、aroF、aroG、aroH、tktA、talB、rpe和rpi组成的组。
8.权利要求1的经基因改造的细菌，其中芳族氨基酸生物合成的负调节蛋白的活性被实质上降低或消除。
9.权利要求1的经基因改造的细菌，其中芳族氨基酸生物合成的负调节蛋白是TyrR蛋白或TyrR蛋白的同源物。
10.权利要求1的经基因改造的细菌，其中编码芳族氨基酸生物合成的负调节蛋白的基因已被缺失或突变。
11.权利要求1的经基因改造的细菌，其中至少一种在莽草酸通路中有活性的酶实质上抵抗所述微生物的代谢物的抑制。
12.权利要求1的经基因改造的细菌，其中所述微生物源自大肠杆菌C。
13.从非芳族碳源开始生产顺,顺-黏康酸的经基因改造的微生物，其包含编码不动杆菌属(Acinetobacter)细菌的QuiC酶或所述QuiC酶的同源物的外源基因，
优选地，其中：
(a)所述微生物还包含选自由aroZ、qa-4、asbF、aroY和catAX组成的组的一个或多个外源基因，其中所述外源基因编码在黏康酸通路中起作用的蛋白质；或
(b)所述微生物还包含选自由aroB、aroD、aroF、aroG、aroH、tktA、talB、rpe和rpi组成的组的一个或多个外源基因，其中所述外源基因编码在莽草酸通路中起作用的蛋白质；或
(c)由tyrR基因编码的芳族氨基酸生物合成的负调节蛋白或其同源物的活性实质上降低或消除；或
(d)所述微生物还包含aroG＊基因，所述aroG＊基因编码实质上抵抗苯丙氨酸抑制的DAHP合酶；或
(e)所述微生物还包含编码渗漏莽草酸脱氢酶的基因。
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