CN115698297A - 多模块生物合成酶基因组合文库的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种方法,具体是一种制备包含编码多模块生物合成酶的多个基因在内的基因簇构建体的方法,其包括以下工序:(A)制备可重构基因簇构建体并具有可交替连接结构的多个DNA片段的工序;(B)通过将工序(A)中制备的多个DNA片段在溶液中混合来交替连接多个DNA片段,从而得到基因簇构建体的工序。

Description

多模块生物合成酶基因组合文库的制备方法
技术领域
本发明涉及一种制备包含编码多模块生物合成酶的多个基因在内的基因簇构建体的方法、以及由该基因簇构建体制备多模块生物合成酶基因组合文库的方法。
背景技术
已知由放线菌或丝状菌等微生物产生的天然化合物是具有多种多样的结构和生物活性的有用物质。目前,通过解读基因组,可以很容易地确定用于生物合成有用物质的基因簇。此外,还明确了存在大量用于生物合成人类未利用的有用物质的基因簇。在微生物的次级代谢产物中,重点研究了用于对具有产业重要性的聚酮类化合物和肽类化合物进行生物合成的基因簇。例如,可以列举出I型聚酮合酶(PolyKetideSynthase;PKS),其用于在放线菌产生的次级代谢产物中临床应用的erythromycin、FK-506(tacrolimus)、rapamycin及avermectin等大环内酯类化合物的生物合成。
考虑到通过传统的化学方法生产聚酮化合物等的难度、以及野生型细胞中的聚酮通常的低生产性,寻找用于生产聚酮化合物的改良或替代方法成为备受瞩目的焦点。由于这些原因,通过将生物合成所需的基因簇从原始菌株引入到其他细胞中来尝试化合物的异源生产。实际上,异源表达的传统方法大多限定于小的基因簇(<40kb),而很多PKS基因簇都比它大得多,其为从数千碱基到100千碱基以上的DNA。
作为组装DNA的方法,已知有金门(Golden Gate)法、吉布森(Gibson)法等连接多个DNA片段的方法(非专利文献1)。
Golden Gate法是准备一个或两个末端包含由IIs型限制性核酸内切酶识别的碱基序列的多个DNA片段,并用IIs型限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行处理的方法。可以通过由IIs型限制性核酸内切酶切割产生的粘性末端(sticky end),来使多个DNA片段杂交,接着利用DNA连接酶连接缺口,来制造出具有所需碱基序列的DNA片段。通过设计由IIs型限制性核酸内切酶识别的碱基序列的类型和排列,可以将由IIs型限制性核酸内切酶切割的多个DNA片段连接起来以使限制性核酸内切酶的识别位点消除,从而制造出具有所需碱基序列的DNA片段。报告了一种通过利用Golden Gate法来将具有所需碱基序列的DNA片段导入克隆载体的方法等(专利文献1和非专利文献1)。
Gibson法是准备以相邻连接的DNA片段的各自末端部的连接区域重叠15~80个碱基对(bp)左右的方式(以成为相同碱基序列的方式)进行设计的多个DNA片段,用5'核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶进行处理的方法。通过5'核酸外切酶从DNA片段末端部分地产生单链DNA。所产生的单链DNA在重复的碱基序列部分中杂交。然后,通过DNA聚合酶填充间隙,并通过DNA连接酶来连接缺口,从而可以制造出具有所需碱基序列的DNA片段。
在Gibson法中,由于不需要包含由限制性核酸内切酶识别的碱基序列等,因此没有碱基序列的限制,并且也适用于长DNA片段的构建(非专利文献2、专利文献2以及专利文献3)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:美国专利申请公开第2010/0291633号说明书
专利文献2:美国专利第7723077号说明书
专利文献3:日本特表2011-512140号公报
非专利文献
非专利文献1:PLoS One,2009年,4(5),e5553
非专利文献2:化学和生物,2016年,Vol.54,No.10,pp.740~746
发明内容
发明所要解决的课题
即使通过混合PKS模块生产出新物质,多数情况下产量也会大大减少,并且目前尚未建立有效的改变方法。原因很复杂,可以想到的说明之一是,构建大部分的聚酮骨架的是伸长基质,难以人为地改变伸长反应,据推测由上游模块提供的酮类无法扩展。
可以想到的另一个说明是,在异源生产时,任一宿主的转录控制系统都与放线菌或丝状菌不同,因此为了得到充分的表达量,需要置换生物合成所需的全部基因的启动子。例如,通过添加或置换已知在异种宿主中发挥功能的强启动子,可以提高在异种宿主中的聚酮的生产率(非专利文献2、非专利文献3)。然而,次级代谢产物的生物合成反应大多涉及多个阶段,因此需要使多个基因共表达。此时,如果尽可能地使各基因高表达,则不能达到最佳的生产水平(非专利文献4),并且需要协调的表达。考虑到预测基因表达的理想平衡的难度,在异种宿主中制备生产率高的生物合成基因簇的最有效的方法在于制备具备对与合成调节相关的转录和翻译进行控制的各种启动子强度和核糖体结合位点(RBS)的基因簇库。可以认为,通过在广义范围的转录水平和翻译水平两者中控制单个酶的相对量,可以发现与蛋白质表达的理想平衡相关的组合。
因此,为了同时研究多个PKS模块的组合和表达参数,从效率性的观点出发,优选组合文库技术,该组合文库技术对于各模块和/或表达参数,从存在多个选择项中选择一个,将它们分别连接以构建多种PKS基因簇。
用于解决问题的方法
本发明提供了以下发明〔1〕至〔11〕。
〔1〕一种方法,具体是一种制备包含编码多模块生物合成酶的多个基因在内的基因簇构建体的方法,
其包括以下工序:
(A)制备可重构所述基因簇构建体并具有可交替连接结构的多个DNA片段的工序;
(B)通过将工序(A)中制备的多个DNA片段在溶液中混合来交替连接多个DNA片段,从而得到基因簇构建体的工序。
〔2〕根据〔1〕所述的方法,其中,所述DNA片段各自包含在质粒中,并且还包括由所述质粒制备所述工序(A)的DNA片段的工序。
〔3〕一种方法,具体是一种制备包含编码多模块生物合成酶的多个基因在内的基因簇构建体的方法,
其包括以下工序:
(P)制备包含具有可交替连接的结构的多个DNA片段在内的多种质粒的工序;
(A1)分别用适合的限制性核酸内切酶处理多种所述质粒,并制备多种DNA片段的混合液的工序;
以及(B1)使用在工序(A1)中得到的DNA片段的混合液,使DNA片段再聚集以得到所述基因簇构建体的工序。
〔4〕根据〔3〕所述的方法,其中,在所述工序(P)中,制备包含多个DNA片段的多种质粒,该DNA片段具有能够通过使用枯草芽孢杆菌来交替连接的结构。
〔5〕根据〔1〕至〔4〕中任一项所述的方法,其中,所述多模块生物合成酶是模块化聚酮合酶(PKS)。
〔6〕根据〔3〕所述的方法,其中,所述限制性核酸内切酶是TypeII限制性核酸内切酶。
〔7〕一种制备质粒组合文库的方法,其中,将通过〔1〕至〔6〕中任一项所述的方法制备的所述基因簇构建体转化为枯草芽孢杆菌,并从枯草芽孢杆菌中回收质粒DNA。
〔8〕根据〔3〕所述的方法,其中,选择多种通过〔7〕所述的制备方法来得到的质粒,将其作为所述工序(A1)中的质粒进行再利用,并实施所述工序(A1)和所述工序(B1)。
〔9〕一种通过〔7〕所述的制备方法来得到的质粒组合文库。
〔10〕一种通过将〔9〕所述的质粒转化到宿主细胞中来制备多模块生物合成酶的方法。
〔11〕根据〔10〕所述的方法,其中,所述宿主细胞是Streptomyces属的微生物。
发明效果
根据本发明,可以由通过一锅反应而合成的基因簇构建体构建多模块生物合成酶的组合文库,例如PKS基因簇文库整体。由此,可以期待用于优化基因簇表达产量和提高生理活性的化学多样性的生成。
附图说明
图1是示意性地示出实施例1和2的顺序的图。
图2是示出实施例1和2中得到的质粒的限制性消化模式的一例的图片。
图3是OGAB载体1.0的载体图。
图4是OGAB载体2.0的载体图。
图5是OGAB载体2.1的载体图。
图6是OGAB载体2.2的载体图。
具体实施方式
以下,对本发明具体实施方式详细进行说明。但是,本发明并不限于以下实施方式。
一种制备包含编码一实施方式所涉及的多模块生物合成酶的多个基因在内的基因簇构建体的方法,其包括以下工序:(A)制备可重构基因簇构建体并具有可交替连接结构的多个DNA片段的工序;以及(B)通过将工序(A)中制备的多个DNA片段在溶液中混合来交替连接多个DNA片段,从而得到基因簇构建体的工序。
根据另一实施方式所涉及的制备包含编码多模块生物合成酶的多个基因在内的基因簇构建体的方法包括以下工序:(P)制备包含具有可交替连接的结构的多个DNA片段在内的多种质粒的工序,(A1)通过将多种所述质粒分别用适合的限制性核酸内切酶进行处理,来制备多种DNA片段的混合液的工序;以及(B1)使用在工序(A1)中得到的DNA片段的混合液,使DNA片段再聚集,以得到所述基因簇构建体的工序。
在本说明书中,作为多模块生物合成酶,可以列举出I型聚酮合酶(有时仅记载为“PKS”或“I型PKS”。)和非核糖体肽合成酶。
通过将本发明中得到的基因簇构建体或质粒与特定宿主相组合,可以高效地产生由多模块生物合成酶生物合成的有用物质(例如,聚酮或非核糖体肽)。在一个优选的实施方式中,本发明可以利用编码天然产生的多模块生物合成酶的基因(例如,I型PKS基因或非核糖体肽合成酶)实质上缺失的、且进行了基因操作的宿主细胞。这些宿主细胞可以用包含编码各种多模块生物合成酶的基因(例如,I型PKS基因或非核糖体肽合成酶基因)在内的质粒进行转化,以产生由多模块生物合成酶生物合成的有用物质(例如,活性聚酮或非核糖体肽)。本发明提供在生长周期的适当阶段大量产生的产物。由这样产生的多模块生物合成酶生物合成的有用物质(例如,聚酮或非核糖体肽)取决于由多模块生物合成酶生物合成的有用物质(例如,聚酮或非核糖体肽)的类型,并且可以作为治疗剂用于治疗多种疾病。例如,已发现由本发明的质粒转化而成的宿主所产生的一些聚酮或或非核糖体肽可用于免疫抑制剂、抗肿瘤剂、以及治疗病毒、细菌和寄生虫感染。
更优选地,用于重组由目标多模块生物合成酶生物合成的有用物质(例如,聚酮或非核糖体肽)的宿主细胞可以来源于可由本发明的质粒转化而成的任何生物。因此,本发明的宿主细胞可以来源于原核生物或真核生物。然而,优选的宿主细胞由放线菌构成,更优选为Streptomyces属的宿主。使用Streptomyces属的宿主的最大优点在于,与使用大肠杆菌的异源表达生产相比,生产效价高,并且存在I型PKS的活性表达所必需的翻译后修饰体系。具体而言,可以列举出S.albus、S.ambofaciens、S.avermitilis、S.azureus、S.cinnamonensis、S.coelicolor、S.curacoi、S.erythraeus、S.fradiae、S.galilaeus、S.glaucescens、S.hygroscopicus、S.lividans、S.parvulus、S.peucetius、S.rimosus、S.roseofulvus、S.thermotolerans、S.violaceoruber等,优选S.albus。
上述宿主细胞可以通过使用标准技术(例如,同源重组)使来源于该宿主细胞的编码由天然产生的多模块生物合成酶的基因(例如,PKS基因或非核糖体肽合成酶基因)缺失来进行基因操作。
编码本发明的质粒中所包含的多模块生物合成酶的DNA(例如,编码PKS或非核糖体肽合成酶的DNA)可以是天然型的,也可以是改变了密码子用法的DNA,还可以是改变了1个或2个以上氨基酸的DNA。在一个优选实施方式中,Streptomyces PKS包括3个开放阅读框(ORF1、ORF2、ORF3)的产物。PKS包含酮合成酶(KS)结构域、酰基转移酶(AT)结构域、酰基载体蛋白(ACP)这3种结构域,通过这3种结构域可以延长聚酮链。PKS还可以具有酮还原酶(KR)结构域、脱水酶(DH)结构域、烯醇还原酶(ER)结构域等与主链修饰相关的结构域。作为由PKS制备的化合物,可以列举出6-脱氧红霉内酯B(6-dEB)、富伦菌素、榴菌素、曲霉素、6-甲基水杨酸、土霉素、四环素、红霉素、甘油霉素、七尾霉素、美达霉素、柔红霉素、酪氨酸、卡波霉素、螺旋霉素、阿维菌素、莫能菌素、无活菌素、克拉霉素、脂霉素、利福霉素和杀念菌素。
“非核糖体肽”是指属于由简单的氨基酸单体构成的复杂天然产物家族的肽类。这可以通过被称为非核糖体肽合成酶(NRPS)的大型多功能蛋白质在多种细菌或真菌中合成。NRPS系统的特征在于,能够合成包含蛋白质新生和非蛋白质新生氨基酸在内的肽。
“非核糖体肽合成酶”(NRPS)是指在被称为模块的活性位点的协同组中组织而成的大型多功能蛋白质,在此,各模块是用于催化肽伸长和官能团修饰的1个循环所必需的部分。模块的数量和顺序、以及各NRPS的模块内存在的结构域的类型,通过指示所摄入的氨基酸的数量、顺序、选择、以及与特定类型的伸长相关的修饰,来确定所得到的肽产物的结构变化。
质粒包含与编码所需多模块生物合成酶的DNA(例如,编码PKS的DNA)可操作地连接的控制序列。用于本发明的合适的表达系统包括在真核生物宿主细胞和原核生物宿主细胞中发挥作用的系统。然而,如上所述,原核生物系统是优选的,而且与Streptomyces属细菌兼容的系统尤其重要。用于这种系统的控制序列包括启动子、核糖体结合位点、终止子、增强子等。有用的启动子在Streptomyces属的宿主细胞中发挥功能,例如,可以列举出pGapdh、pErmE、pKasO等,但并不限定于此。
选择标记也可以包含在质粒中。已知各种标记在转化细胞系的选择中是有用的,而且,通常,当细胞在适当的选择培养基中生长时,其表达包括赋予转化细胞上可选择的表型的基因。例如,这些标记包括赋予质粒以抗生素抗性或敏感性的基因。或者,一些聚酮本身是有颜色的,其特征在于提供一种用于对由本发明的构建物成功转化而成的细胞进行选择与生俱来的(built-in)标记。
质粒可以包含在宿主细胞中发挥功能的功能序列。作为功能序列,例如,可以列举出质粒复制起点序列、编码用于将质粒整合在宿主基因组中的酶的序列、接合(conjugation)起始点序列等。
可以通过将控制序列、选择标记以及功能序列等嵌入到编码基因簇构建体中的多模块生物合成酶的多个基因的适当位置中,来使其包含在质粒中。
将本发明的质粒导入适当的宿主细胞中的方法对于本领域的技术人员来说是公知的,而且代表性地包括使用CaCl2或2价阳离子和如DMSO那样的其他药剂。质粒也可以通过电穿孔导入宿主细胞中。一旦表达多模块生物合成酶(例如,PKS),则可鉴定有用物质(例如,聚酮)产生菌落,而且可使用公知的技术进行分离。
在本发明的一个优选实施方式中,将包含编码多模块生物合成酶的DNA在内的区域从本发明的质粒转移到大肠杆菌的质粒中以改造质粒骨架(亚克隆),接着通过接合(conjugation)从大肠杆菌转移到Streptomyces属微生物中,由此实施向宿主细胞的导入。由此,将编码多模块生物合成酶的DNA整合到如Streptomyces属微生物那样的宿主细胞基因组中。
在一个实施方式中,本发明的质粒可以包含枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和Streptomyces属微生物中的复制起点序列、用于从大肠杆菌到Streptomyces属微生物的接合转移的接合起始点序列(OriT)以及编码将Streptomyces属微生物整合到基因组中所需的整合酶的序列。这样的质粒从枯草芽孢杆菌中回收后,可以在无需进行用于改造质粒骨架的亚克隆的情况下,转化大肠杆菌,然后通过接合从大肠杆菌转移至Streptomyces属微生物。
本发明的另一个优选实施方式是包含编码大的多模块生物合成酶的DNA在内的质粒。例如,来源于Streptomyces aureofaciens株Tu117的脂霉素生物合成基因簇具有与7个模块相对应的开放阅读框(LipPKS1、LipPKS2、LipPKS3、LipPKS4、LipNRPS、LipMT、LipTE)。
基因簇构建体只要是包含编码多模块生物合成酶的DNA(例如,编码多模块生物合成酶中包含的结构域的DNA)在内的构建体即可,而多模块生物合成酶的类型并没有特别限定。优选地,可以列举出用于构成PKS或NRPS的基因簇。此外,基因簇构建体的大小也没有特别限定。编码多模块生物合成酶的DNA(例如,编码多模块生物合成酶中包含的结构域的DNA)的类型不仅可以是具有微生物等天然来源序列的DNA,也可以是具有人工设计序列的DNA等,并没有特别限制。在天然来源序列中,为了表达对应的氨基酸,不同的生物物种主要使用一个密码子,但在进行异源表达时,优选使用与宿主的密码子使用频率相匹配的人工设计序列。可能影响异源表达结果的其他因素可以列举出GC含量(碱基序列内鸟嘌呤和胞嘧啶的总含量)、重复序列等。重复序列会降低遗传稳定性,存在错误杂交的风险,并阻碍重复片段的合成。因此,在异源表达的情况下,编码多模块生物合成酶的DNA优选地与密码子使用量和GC含量相关联地进行优化。然而,这些要求通常很难同时得到最佳满足。例如,作为优化密码子的结果,可能会导致非常重复的DNA序列或高GC含量。
在本发明中,编码多模块生物合成酶的DNA的GC含量为30~70%。编码多模块生物合成酶的DNA的GC含量优选为70%以下、68%以下、65%以下、60%以下。通过使用本发明所涉及的方法,即使编码多模块生物合成酶的DNA的GC含量为50%以上、52%以上、55%以上、58%以上、60%以上,也可以高效率地合成目的质粒。在本发明中,编码多模块生物合成酶的DNA优选地优化密码子,以使得其不会出现20bp以上的碱基序列的重复。优选地避免编码多模块生物合成酶的DNA中GC含量出现极端差异。例如,最高和最低的50bp长度间的GC含量的差异优选为52%以下。最好尽量减少均聚物。最好尽可能地使分散在编码多模块生物合成酶的DNA内的小重复序列的数量/长度最小化。序列的重复性如表1所示,可以利用作为以重复序列的长度加权的重复次数的总和(sum(n_count x n length)for n=5to n=24)而计算出的分数进行评价。编码多模块生物合成酶的DNA重复分数优选为1000以下、900以下。通过使用本发明,编码多模块生物合成酶的DNA的重复分数可以为600以上。重复序列的长度小,且5~10bp的重复次数的总和优选为150以下、120以下、100以下、80以下、60以下。通过使用本发明,编码多模块生物合成酶的DNA中所含的5~10bp长度的重复次数可以为50以上。
pps基因是从NRPS基因簇中的Plipastatin基因簇获得的基因。LipPKS_original基因是从脂霉素PKS基因簇获得的未修饰PKS基因。LipPKS_optimized基因是本发明中使用的密码子优化脂霉素基因(表1、表2)。
[表1]
GC 5bp重复 6bp重复 7bp重复s 8bp重复s 9bp重复s 10bp重复 11bp重复 12bp重复 13bp重复 14bp重复
ppsA 0.47 32 14 7 4 3 2 2 2 1 1
ppsB 0.45 33 14 6 4 3 3 2 2 2 2
ppsC 0.48 29 14 7 5 3 2 2 2 2 1
ppsD 0.47 42 16 9 5 4 3 3 2 2 2
ppsE 0.45 21 11 5 4 2 2 2 2 1 1
LipPKS1_original 0.74 95 31 17 10 5 4 4 3 3 2
LipPKS2_original 0.72 91 33 18 10 6 5 4 3 2 2
LipPKS3_original 0.71 94 31 18 10 6 4 4 4 3 2
LipPKS4_original 0.71 86 34 18 9 6 4 4 3 3 2
LipPKS1_optimized 0.64 36 14 8 5 4 3 2 2 2 1
LipPKS2_optimized 0.64 49 21 11 5 4 3 3 2 2 2
LipPKS3_optimized 0.64 48 22 9 6 4 3 2 2 2 2
LipPKS4_optimized 0.64 48 19 10 5 4 3 3 2 2 2
[表2]
15bp重复 16bp重复 17bp重复 18bp重复 19bp重复 20bp重复 21bp重复 22bp重复 23bp重复 24bp重复 分数 长度
ppsA 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 550 7686
ppsB 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 585 7683
ppsC 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 556 7668
ppsD 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 796 10851
ppsE 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 454 3840
LipPKS1_original 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1245 6780
LipPKS2_original 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1307 10749
LipPKS3_original 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1325 10839
LipPKS4_original 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1283 9834
LipPKS1_optimized 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 617 6780
LipPKS2_optimized 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 818 10749
LipPKS3_optimized 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 802 10839
LipPKS4_optimized 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 794 9834
pps基因来自于2007年OGAB论文中的plipastatin基因簇,在这篇论文中Tsuge-sensei提出了NRPS基因簇。LipPKS_original基因是来自于脂霉素PKS基因簇的未修饰的PKS基因。
LipPKS_optimized基因是本研究中使用的经密码子优化的脂霉素基因。
分数是按由重复长度加权的重复计数的总和来计算的:
n=5至n=24的总和(n_计数x n长度)
编码多模块生物合成酶的DNA(例如,编码多模块生物合成酶中包含的结构域的DNA)的大小优选为100kDa以上、200kDa以上、300kDa以上、400kDa以上、500kDa以上、600kDa以上、700kDa以上、800kDa以上、900kDa以上、1000kDa以上。
基因簇构建体由具有可交替连接的结构的多个DNA片段构成。所谓可连接,是指在基因簇构建体上具有相邻序列的DNA片段可以保持一定的顺序和方向进行连接。具体而言,作为所述DNA片段,例如,可以列举出具有末端的片段,该末端利用片段的粘性末端的碱基序列的互补性,能够在相互保持顺序的状态下重复连接。该粘性末端的结构只要是除回文结构(palindrome)以外的结构即可,还包括5'末端突出、3'末端突出的形状的不同,并没有特别限制。但是,在制备DNA片段时,优选地通过限制性核酸内切酶的消化来制备突出末端。作为限制性核酸内切酶,当使用用于可识别特定的序列并在其附近制作任意序列的突出末端的酶时,由于DNA片段的粘性末端在各连接位点会有所不同,因此可保持其连接顺序。通过适当地设计各DNA片段的粘性末端的序列,可以得到包含多个DNA(例如,编码PKS或NRPS的DNA))的基因簇构建体,其中,该多个DNA用于编码各DNA片段以预定的顺序进行排列的多模块生物合成酶。作为这些限制性核酸内切酶的例子,除了通常的分子生物学中使用的限制性核酸内切酶以外,还可以列举出人工限制性核酸内切酶的TALEN或ZNF、或者CRISPR-Cpf1等可生成粘性末端的CRISPR技术的相关酶等,优选使用如AarI、AlwNI、BbsI、BbvI、BcoDI、BfuAI、BglI、BsaI、BsaXI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BspMI、BspQI、BtgZI、DraIII、FokI、PflMI、SfaNI、SfiI等这样的TypeII限制性核酸内切酶。通过使用NEBetaTM Tools,可以确定最佳的粘性末端。粘性末端的碱基数优选为3~6,更优选为3~4。1个DNA片段中所含的碱基数优选为1~5kb。也可以是2kb以上、3kb以上、4kb以上。用于生成粘性末端的限制性核酸内切酶的类型数量对于1个DNA片段的切割,优选利用1种限制性核酸内切酶进行切割。未必需要通过同一种的限制性核酸内切酶的消化来得到所有的DNA片段,但使用的限制性核酸内切酶的类型的总数越少越好,优选为3种以下,更优选为2种以下,进一步优选为1种。
所述基因簇构建体除了编码多模块生物合成酶的DNA(例如,编码多模块生物合成酶中包含的结构域的DNA)以外,还可以包含其他基因。例如,当基因簇构建体包含PKS基因的情况下,除了PKS基因以外,为了修饰最终的聚酮产物、将聚酮输送到细胞外、或赋予对抗生素聚酮的抗性,重要的是还包含其他非PKS基因。
作为DNA片段的类型,为3~60(种),优选为5~50(种),更优选为8~40(种),进一步优选为10~30(种)。
在本发明所涉及的制备基因簇构建体的方法的工序(A)中,制备多个DNA片段,其中,该多个片段能够重构基因簇构建体并且具有可交替连接的结构。也可以通过用限制性核酸内切酶切割各DNA片段来形成可交替连接的结构的粘性末端。或者,也可以通过合成包含各DNA片段的质粒,并用限制性核酸内切酶进行切割,来制备具有可交替连接的结构的粘性末端的各DNA片段。各DNA片段的GC含量可以为65%以下。优选地,各DNA片段不会出现20bp以上的碱基序列的重复。各DNA片段的长度也可以不一致。优选地,具有相同粘合序列的DNA片段的长度一致。
在本发明所涉及的制备基因簇构建体的方法的工序(B)中,将工序(A)中制备的多个DNA片段混合在溶液中。进行混合以使得所有DNA片段的摩尔浓度比为0.8~1.2,优选为0.9~1.1,更优选为0.95~1.05,进一步优选为约1.0。DNA片段的混合根据需要在存在合成用质粒的情况下进行,从而使DNA片段聚集,并得到包含编码多模块生物合成酶的多个基因簇的串联重复序列在内的构建体。通过将得到的基因簇构建体导入枯草芽孢杆菌中,得到包含编码多模块生物合成酶的基因簇在内的质粒库,将该质粒库的多模块生物合成酶的基因簇转移到穿梭质粒中,并利用与大肠杆菌的conjugation转移到如Streptomyces属细菌那样的适当的宿主细胞中,从而可以在宿主细胞中表达多模块生物合成酶。例如,当上述组合文库由针对各基因具有不同强度或表达量的启动子的质粒构成的情况下,通过在适当的宿主细胞中表达多模块生物合成酶,可以发现用于高表达的优选启动子的组合。
在本发明所涉及的制备基因簇构建体的方法的工序(P)中,制备多个质粒(种子质粒)。考虑到工序(A1)和工序(B1),种子质粒可以具有以下结构:以在构建聚集体之后将其分割成DNA片段的方式,根据各自的设计,在DNA片段的边界或其附近导入适当的限制性核酸内切酶识别序列。作为限制性核酸内切酶,优选使用如AarI、AlwNI、BbsI、BbvI、BcoDI、BfuAI、BglI、BsaI、BsaXI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BspMI、BspQI、BtgZI、DraIIIFokI、PflMI、SfaNI、SfiI等那样可制备任意序列的粘性末端的酶。通过这些限制性核酸内切酶处理而得到的多个粘合序列可以在单一种类的质粒内成为唯一的序列。此外,种子质粒群也可以在组合文库的重组单位(多数情况下一个DNA片段与该单位一致,但在某些情况下,重组单位有时在一部分的种子质粒中由多个DNA片段构成。)中,在同一链上以相同的顺序具有相同的粘合序列。
在本发明所涉及的制备基因簇构建体的方法的工序(A1)中,通过将多种种子质粒分别用适合的限制性核酸内切酶进行处理,来制备多种DNA片段的混合液。作为限制性核酸内切酶,可以列举出上述例示的酶。所得的限制性核酸内切酶消化物包含所需的DNA片段和来源于质粒的片段。在本发明的一个优选实施方式中,本发明中使用的DNA片段和来源于种子质粒的片段的大小不同,因此通过电泳对它们的大小进行分级,从而可以得到所需DNA片段的近似等摩尔量的混合物。所谓近似等摩尔量的混合物,是指所有DNA片段的摩尔浓度比为0.8~1.2的范围,优选为0.9~1.1的范围,更优选为0.95~1.05的范围,进一步优选为约1.0。
在本发明所涉及的制备基因簇构建体的方法的工序(B1)中,根据需要,通过将工序(A1)中得到的所需DNA片段的近似等摩尔量的混合物在聚集用质粒的存在下进行再聚集,来得到包含编码多模块生物合成酶的多个基因簇的串联重复序列在内的基因簇构建体。使用所得到的基因簇构建体,以与上述(B)的记载相同的方式得到质粒库。质粒库使用对构成簇的基因序列和宿主细胞中的启动子强度等控制序列中的至少1种进行各种变更而成的序列并在宿主细胞中表达,从而可以筛选出高表达多模块生物合成酶基因簇。
也可以通过使用DNA连接酶等连接(连接)DNA片段混合液来制备基因簇构建体,但由上述工序(P)得到的各DNA片段并不只限定于基因聚集的起始材料,只要是最终能够如上述那样分割成各DNA片段的结构即可,也可以利用通过任意聚集方法来准备的聚集体。在此,DNA片段混合液中的所有DNA片段的摩尔浓度比为0.8~1.2的范围,优选为0.9~1.1的范围,更优选为0.95~1.05的范围,进一步优选为约1.0。
DNA片段的连接方法并没有特别限制,但最好在聚乙二醇和盐的存在下进行连接。作为盐,优选为一价碱金属盐。优选地,用T4DNA聚合酶在37℃下持续30分钟以上。
例如,当编码PKS的DNA由按照P、Q、R、S的顺序连接了4个结构域的P-Q-R-S进行表示的情况下,基因簇构建体包括由-(P-Q-R-S)n-表示的串联重复序列(n为2以上的整数)。优选地,在基因簇构建体的各ORF(P-Q-R-S)的5'末端或3'末端上附加在宿主细胞中发挥功能的启动子、核糖体结合序列(RBS序列)、增强子等控制序列。此外,也可以在基因簇构建体的各ORF(P-Q-R-S)的5'末端或3'末端上附加在宿主细胞中发挥功能的功能序列、以及选择标记等序列。此外,基因簇构建体优选地包括对枯草芽孢杆菌有效的复制起点。例如,在枯草芽孢杆菌的情况下,具有θ型复制机制,具体而言,可以列举出pTB19(Imanaka,T.,etal.,J.Gen.Microbioi.,130,1399-1408.(1984))和pLS32(Tanaka,T and Ogra,M.,FEBSLett.,422,243-246.(1998)、pAMβ1(Swinfield,T.J.,et al.,Gene,87,79-90.(1990))等质粒中含有的复制起点等序列。
通过将枯草芽孢杆菌感受态细胞与基因簇构建体一起培养,来将基因簇构建体摄入至枯草芽孢杆菌内,从而形成包含编码多模块生物合成酶的DNA(例如,编码PKS或NRPS的DNA)在内的质粒。作为枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备方法,优选使用Anagnostopoulou,C.and Spizizen,J.,J.Bacteriol.,81,741-746(1961)中记载的方法。加入到枯草芽孢杆菌感受态细胞中的基因簇构建体溶液的液量并没有特别限制。相对于枯草芽孢杆菌感受态细胞的培养液的液量,基因簇构建体溶液的液量优选为1/20至等量的范围内,更优选为半量。
编码多模块生物合成酶的DNA(例如,编码PKS或NRPS的DNA)串联重复序列在形成质粒时,将编码串联重复序列中的至少1个、优选地将编码1个多模块生物合成酶的DNA(例如,编码PKS或NRPS的DNA)整合到质粒中。作为从枯草芽孢杆菌中纯化质粒的方法,可以使用公知的方法。
通过上述方法而得到的质粒具有编码目标多模块生物合成酶的DNA(例如,编码PKS或NRPS的DNA),这可以通过限制性核酸内切酶切割而产生的片段的大小模式、PCR法、碱基序列确定法来确认。
终止子只要是在所述宿主细胞中发挥功能的终止子即可,并没有特别限定,例如可以优选地列举出来源于fd噬菌体的终止子(fd-ter)、来源于T4噬菌体的终止子(T4-ter)及来源于T7噬菌体的终止子(T7-ter)等。其中,从上述稳定化效果更佳的观点出发,特别优选为来源于fd噬菌体的终止子。
可以使用公知的核糖体结合序列(RBS)。
在本发明的一个实施方式中,可以培养将包含编码多模块生物合成酶的DNA(例如,编码PKS或NRPS的DNA)在内的质粒导入宿主细胞的转化子,并通过该培养物得到有用物质(例如,聚酮或非核糖体肽)。所谓“培养物”,是指培养上清、培养细胞、培养菌体、或细胞或菌体的破碎物中的任一种。培养本发明的转化子的方法可以按照宿主培养使用的通常方法来进行。
培养本发明的转化子的培养基只要是含有宿主可同化的碳源、氮源、无机盐类等且能够有效地培养转化子的培养基即可,也可以使用天然培养基、合成培养基中的任一种。作为碳源,可以列举出葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、棉子糖、淀粉等碳水化合物、乙酸、丙酸等有机酸、乙醇、丙醇等醇类。作为氮源,可以列举出氨、氯化铵、硫酸铵、醋酸铵、磷酸铵等无机酸或有机酸的铵盐或其他含氮化合物。除此之外,也可以使用蛋白胨、肉提取物、玉米浆、各种氨基酸等。作为无机物,可以列举出磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。
培养通常在温度28~38℃、振荡培养或通气搅拌培养等好氧的条件下进行。pH的调整通过使用无机或有机酸、碱溶液等来进行。
在上述培养条件下培养时,可以高收率地生产有用物质(例如,聚酮)。
培养后,当在菌体内或细胞内生产有用物质(例如聚酮)的情况下,可以通过实施均质器处理等来使菌体或细胞破碎,从而提取该有用物质。另一方面,当有用物质(例如聚酮)分泌到菌体外或细胞外的情况下,直接使用培养液、或通过离心分离等去除菌体或细胞。然后,通过硫酸铵沉淀提取等从所述培养物中提取该有用物质,根据需要进一步使用各种色谱等进行分离纯化。
模块化PKS在模块内依次催化多个化学反应,各结构域的空间配置也很重要。在过去几年中,一些研究已确定了PKS模块和结构域交换的最佳融合边界候选,但由于蛋白质序列不同,因此该空间配置可能因模块而异。这意味着组合生物合成的最佳边界位置可能取决于内容物。因此,通过使用本发明,可以使用各种结构域边界来执行AT结构域交换等的有针对性的变更,并且可以用in vitro评价所得酶的活性。
实施例
下面,根据实施例对本发明进行说明,但本发明并不限定于这些实施例。
图1是示意性地示出实施例1和2的顺序的图。图1中,位于箭头下方的示意图分别表示包含编码多模块生物合成酶的多个基因在内的基因簇构建体。在各基因簇构建体中,启动子、RBS、编码多模块生物合成酶的基因(CDS)与终止子的组合经由间隔序列排列多个。在实施例1和2中,通过将具有可交替连接的结构的多个DNA片段(图1中箭头上方的示意图)进行连接来获得该基因簇构建体。另外,在实施例1中,通过一次连接所有DNA片段来获得基因簇构建体。在实施例2中,将DNA片段分为3个组,在各个组中一旦得到基因簇构建体并将其作为质粒后,将3个组中得到的质粒放在一起,之后再次分解为DNA片段,接着进行连接以得到基因簇构建体。另外,在连接DNA片段时,还包含作为载体骨架的DNA片段。
实施例1和2
<DNA设计>
作为编码多模块生物合成酶的多个基因,利用了以下基因序列。以下的基因序列选自来源于Streptomyces aureofaciens株Tu117的脂霉素生物合成基因簇。
LipPKS1
LipPKS2
LipPKS3
LipPKS4
LipNRPS
LipMT
LipTE
对所有的CDS进行自定义设计,并进行密码子优化,以使GC含量小于70%且不会出现20bp以上的重复。还取得了在目标生产宿主(链霉菌浴)中有效表达的必要条件的平衡。
密码子优化前的GC含量(%):
LipPKS1:74.2%
LipPKS2:72.3%
LipPKS3:71.3%
LipPKS4:71.3%
LipNRPS:75.2%
LipMT:71.1%
LipTE:74.5%
密码子优化后的GC含量(%):
LipPKS1:63.7%
LipPKS2:63.7%
LipPKS3:63.9%
LipPKS4:63.9%
LipNRPS:65.3%
LipMT:59.6%
LipTE:65.7%
从CDS(BsmbI、BsaI、AarI)中删除了在组合文库和载体转移的组装中使用的所有的原生限制性核酸内切酶识别位点。
得到的序列优化CDS用于通过使用链霉菌的启动子和RBS序列来设计新的基因簇。
具体而言:
启动子和RBS配置在各PKS CDS之前,终止子和间隔序列配置在各CDS的最后。实施例中使用的启动子的序列如序列号14~23所示。
在一个启动子的控制下,将LipNRPS、LipMT和LipTE基因集中放到单个操纵子中。3个CDS分别保留了独自的RBS。终止子配置在该操纵子的最后。
因此,所设计的基因簇构建体重复如下序列:载体骨架的序列、以及依次包含在CDS之前包含启动子和RBS且在CDS之后包含终止子和间接序列的LipPKS1基因(基因1)、LipPKS2基因(基因2)、LipPKS3基因(基因3)、LipPKS4(基因4)基因和上述操纵子(基因5)的序列。
<组装>
实施例1(直接OGAB法)
用UV分光光度计(Thermofisher Nanodrop)测量包含启动子变体的所有DNA片段(序列号1~13及28~37)的浓度,并制备等摩尔的片段混合物。利用DNase(LucigenCorporation)进行处理,并去除混入的线状DNA。相对于各DNA片段,浓度标准化为100ng/μl。将500ng的各DNA片段集中放于管中,用BsaI-HFv2限制性核酸内切酶(NEB)进行处理。为了纯化用限制性核酸内切酶消化的DNA,进行苯酚氯仿处理、丁醇处理、乙醇沉淀。使用透析管进行凝胶提取,从消化的质粒混合物中去除靶片段,并将得到的消化后的靶片段用乙醇沉淀法进行纯化。将消化后的片段与消化的载体(OGAB载体1.0)、1μl的T4 DNA Ligase(TAKARA BIO)以及连接酶缓冲液混合,在37℃下孵育3小时后,完成连接,并得到所设计的基因簇构建体。将包含基因簇构建体的DNA连接酶溶液与枯草芽孢杆菌感受态细胞混合,将细胞在37℃下进行短时间的孵育后铺展在四环素选择板上。菌落增殖一段时间后,从板上拾起转化子,并在37℃下于2ml LB中增殖一晚。质粒提取按照以往的方案进行,通过限制消化模式(限制性核酸内切酶:NotI的切割模式)来确认所得到的质粒是否按照预想的那样进行了组装。另外,OGAB载体1.0的碱基序列如序列号24所示。图3是OGAB载体1.0的载体图。
图2是示出所得到的质粒的限制性消化模式的一例的图片。在所分析的24个菌落中,按照预想的那样进行组装的菌落数量为20(20/24=83%)。
实施例2(标准OGAB法)
组1:DNA片段(序列号1~13)
组2:DNA片段(序列号1~3、5~9及28~32)
组3:DNA片段(序列号1~3、5~9及33~37)
首先,分别对上述组1~组3,按照与实施例1相同的步骤得到质粒。然后,使用组1~组3的质粒代替DNA片段,按照与实施例1相同的步骤得到重组后的质粒。以与实施例1相同的方式通过限制消化模式来确认所得到的质粒是否按照预想的那样进行了组装。结果,在所分析的24个菌落中,按照预想的那样进行组装的菌落数量为23(23/24=96%)。
在实施例1和实施例2中,插入至5处启动子位置(参照图1)处的启动子的类型都是随机的,并没有发现明显的偏差。即,能够构建没有偏差的组合文库。此外,使用Flongle(Oxford Nanopore Technologies公司制造)对通过限制消化模式按照预想的那样进行组装的质粒的碱基序列进行解读,其结果发现与所设计的碱基序列非常一致(约60kbp中,99.96%匹配)。
实施例3
用限制性核酸内切酶AarI从仅使用实施例2的组1的DNA片段得到的质粒中切除LipPKS基因簇,连接到E.coli-Streptomyces穿梭载体(pSYN0002,序列号38)的限制性核酸内切酶AarI位点,并用E.coli(ET12567(pUZ8002))进行克隆。使用该E.coli,接合转移到Streptomyces中,并确认LipPKS基因簇的表达。
实施例4
除了使用直接穿梭载体(OGAB载体2.0,序列号25)代替实施例1的OGAB载体1.0、以及作为DNA片段使用具有序列号1~13所示的碱基序列的DNA片段以外,其他以与实施例1相同的方法得到质粒。图4是OGAB载体2.0的载体图。OGAB载体2.0包含枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和Streptomyces属微生物中的复制起始点序列、用于从大肠杆菌接合转移到Streptomyces属微生物的接合起始点序列(OriT)以及将Streptomyces属微生物插入到基因组所需的位点特异性重组系统(编码phiC 31整合酶的序列和phiC31 attP序列)。将得到的质粒转化到E.coli中,使用该E.coli,接合转移到Streptomyces中,并确认LipPKS基因簇的表达。
实施例5
除了使用直接穿梭载体(OGAB载体2.1,序列号26)代替实施例4的OGAB载体2.0以外,其他按照与实施例4相同的步骤接合转移到Streptomyces中,并确认LipPKS基因簇的表达。图5是OGAB载体2.1的载体图。OGAB载体2.1是将OGAB载体2.0中的Streptomyces属微生物插入到基因组所需的位点特异性重组系统变更为编码phiBT1整合酶的序列和phiBT1attP序列的载体。
实施例6
除了使用直接穿梭载体(OGAB载体2.2,序列号27)代替实施例4的OGAB载体2.0以外,其他按照与实施例4相同的步骤接合转移到Streptomyces中,并确认LipPKS基因簇的表达。图6是OGAB载体2.2的载体图。OGAB载体2.2是在OGAB载体2.1中追加了编码整合酶(Tyrosine-type recombinase)和氯霉素抗性基因的序列的载体。
序列表
<110>丝芭博株式会社
<120>多模块生物合成酶基因组合文库的制备方法
<130> FP21-0415-00
<150> JP2020-091799
<151> 2020-05-26
<160> 38
<170>PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 3427
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>DNA片段
<400> 1
cgtctcattg gtcgagcgtc tgtcggacgc gcagcgcctg ggacacccca tcttggctgt 60
agtgcgcggt tcggccatta accaggacgg tgcctcgaac ggtttgaccg cccccaacgg 120
tccggcccag caacgcgtaa ttcggcaggc gcttgctaca gcaggattgg gtccaaccga 180
tattgacgcg gtagaaggtc acggcaccgg tacgtcgctc ggcgacccaa tcgaggcgca 240
ggctctgatg gaaacctacg gtcaagagcg acccgaggaa cggcccttgt ggctcggctc 300
gttgaagtca aacatcggtc atgcacaggc ggcagccggt gtaggcggtg taatcaagat 360
ggtcatggcg ctcggagagg gagtcctgcc ccgcaccttg cacgcggacg agccgtcacc 420
acacattgac tggaccgcgg gcaacgtacg tcttctgacg gaatccaggg aatggccggt 480
caccggacag ccccggcgcg ccggtatttc gagcttcggt gccagcggca caaacgccca 540
tttgatcctg gaacaggcgc cggctcgtcc ggctgaggac acaccggagg aaccggcact 600
cccattggta ccttggctcg tatcggcaaa gagtgaggcg gcattgagag ctcaagccga 660
gcgcttgcgc tcctatgtcg ctgagcgccc tggtctgcgt ccggctgacg tagcattcag 720
cttggcgacc acgcggggcg cgctcgaaca tcgtgctgtc gtggttggta cggacctggg 780
cgagctggcg gagggcctgg gggctctgac ccagaccgcc accgtcgtac cgggtcggac 840
cgcattcttg ttcaccggtc agggtgcaca acgcgtcgga atgggtcgcg aactctatga 900
cacatttccg gccttccgga aggcgctgga cgaggtctgc gctgtgctgg atccgttgct 960
cccccgtcct tcgcgggaag tgatgtggga tgaggatcca gaggctctgt cgagaaccga 1020
gttcacccag ccgacgttgt tcgccatcga ggtcgctctg ttccgcttgc tggagtcatg 1080
gggcattcat cctgacgcag tggcgggtca ctcaatcggt gagatcgcgg ctgcgcacgt 1140
aaccggtgtg ttgtcgctcg ctgacgcatg tgtccttgtt gccgctcgcg gccgtctgat 1200
gcaggcattg ccccatgacg gcgtgatgat cgccgtacaa gcaacggagg atgaggtgtt 1260
gcccctgttg gagaaagtga ccggtcaagc tgacatagcc gcggtaaacg ctcccgaagc 1320
cgtggtcgtg tctggcgccg aaacggaggt cgagcatgtg gctgccacct tgggcgccca 1380
gggtcggcgt gtcaagcgct tgaccgtcag ccacgctttc cattccccgt tgatggaccc 1440
tatactgaag gacttccaaa ccgtagtgga gggcctcagt ttcaggcaac catccctgcc 1500
gtttgtctcc acggtcactg gaacggttgc tggcgccgaa ataaccgaac cagcatactg 1560
ggtccgtcac gttcgtcaga cagtgcggtt cgccgacgga ctccgcgcgc tgcacgaact 1620
tggcgtcagg aagttcatcg aaattggacc ggacgcgatt ctgacgggac tggtggagca 1680
aacgctcgac acccaagcgg tccccgtcct tcggcgtgac cgggatgagg tgcgcgccgc 1740
tgtcgaagcg gctggcggtt tctttacacg cggcggtagc gtcgactggc cagcacttct 1800
ggcgggtgga agacgtgtag acttgccaac gtacgcgttt caacatgaaa ggtactggtt 1860
ggacgccccc gtgtccgtcg gcgacgctac cgctctggga ttgcgccggg cagaacatcc 1920
actgctcgga gcggcagtgg agctggccgg ctccgatcgg atggtattcg ctgggcgttt 1980
gtccgctgcg tcccaaggct ggctggtgga tcatgccgtc catggtaccg tgcttgtgcc 2040
gggtaccaca ttggtagagt tggccctggc tgccggtgac cagatgggct cgggccgcct 2100
ggaagagttg accctccagg caccactggt cctgcctgaa accggtgcgg tgcagctcca 2160
ggtgtccgtg ggtgaggcag acgcagaggg acgcagaacc gtcgaaatcc atagccgccc 2220
agagcgggat gcagcggagg tcgcatgggc atgtaacgct ttgggcgctc tgaccgaagc 2280
ggcagcggaa cccacccccg ccgcactggg cgaagtctgg ccaccgcagg acgcttccgc 2340
cgtggaagtc ggcgatttct atgacgatct ggccgacagg ggctacgaat atggacccgt 2400
gttccagggc ctgcaccggg cttggcggcg tggtgacgaa gtattcgccg aggtagcgtt 2460
gccagaagag gcagcgaaca ccgtcgatgc cttcggcgtg catcctgccc tcctggacgc 2520
tgccttgcat gccatgaact ttgccagcgt caccatggga agcggaaccc ctttgccatt 2580
cgcgtggacg ggtgtgacgc tgcacgcggt gggcgcaacc gcgcttcggg tgcgcatagc 2640
ccccgacgat gcccggggtg ccgtatcggt tgaattgttc gaccaggccg gacttcctgt 2700
cgcatctgtg gaaagcttgg cgctgcgtga ggtgtcgccc gagcaactgg ccgtcgcgga 2760
tgaccccgat agcttgttcg aggtagaatg ggtaagcgca gcggacggcg gatccgccga 2820
agccggtgcc ccgagttggg cggtactggg cgatagccct ttggcggaag gcggtcccgt 2880
gttcgcggac gtggaagctc tggtggccag cagtcaggat ttgccgggta ccgtggtatt 2940
gcagtgcccc gcggtagaag gggcgccggt cccagatgcc gtacgtgacc gcttgacggg 3000
agtcctggat gtgctgcaac gctgggtcgc cgacgaacgt ctggcctcct ctaggctggt 3060
ggtagttaca cgtggtgcag tggctgcgag cgctaacgag ccggtagacg tccgtgttgc 3120
ccccgtgtgg ggtctggtgc gtgctgcaca agcggaacat ccggatcgtt tcgtcctggc 3180
tgatttgccc gcgggcgcgg gagcccgcga actctcggtc ggcctcgcct gtgatgaacc 3240
gcaatgggca gtgcgggatg gtgccgtccg tgtgccacgg ctggtacgcg cacaggctgc 3300
ggtatcagga gtgccggcat ttggtaacgg tccggtattg gtgaccggag cctccggtgc 3360
cctgggtggc gtggtcgcga ggcacttggt gtctgtccat ggagtccgtg agctggtact 3420
tgagacg 3427
<210> 2
<211> 3432
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>DNA片段
<400> 2
cgtctcatga tgaaccgagc cctcatatcg attggtccgc aggccaggta cgtctgctga 60
ccgaggaacg cgagtggccg gaggcgggac acccccggcg tgcggctgtt tctagtttcg 120
gtgtaagcgg caccaacgct cacgtgatat tggaagccgc acccggtact ggtggagcac 180
cagaagtctc tgacggcgtg ttgggctcgg cgccggaaac cgtgccttgg gtcctctcag 240
ctgcgtcccc tgacgccctg cgcgcccagg ctgaacgctt gcggggtcac gttgcagaaa 300
ggcctggtct ggccagcgct gatgtagcct ttgcactggc gacccggcgc accgcactgg 360
agtaccgggc ggtcgcagta ggcgcagaac gggatgagct gttggatacc ttggatgctc 420
tgtccgccgg tcgccctgct ccccgcgcag tgccaggtga tgcagctgcc cactcccgtc 480
ggccagtctt cgtgttccct ggtcagggtt cccagtgggc cggaatggcc gtcgaactgc 540
tcgacagctc accggtgttc gcagacagca tgcacgcctg ttcggaagct cttaacgagt 600
tcgtcgactg gaacctgctc gaagtgctgc ggtcaggcga tgaagagttg agcaaccgtg 660
tcgatgtagt gcaacctgtc ctttgggcgg tgatggtgtc actggccgcg ctgtggcagg 720
catgcggcgt ccgcccggca gcggtcgtag gacattcgca aggtgagatt gctgcggccg 780
tcgtggctgg cgcgttgagc ctgcgtgatg gtgcccgagt ggtagctctc cgctccgctg 840
tcatagctcg cttgctggcc ggaaagggag caatggcctc tgtcgccctt gcttccgata 900
cggtccgtga acgtcttacg ccctgggagg gccggctctc gttggctgcg gtcaacggtc 960
ccagttccag cgtagtgtgt ggtcacctgg atgcactgga tgagttcgtg tcggctcttg 1020
aacatgacgg tgtgcgtgta cgtcggatcg cggtggacta cgccagtcac tcggtatttg 1080
tcgagcaggc ggaggaagag ctgaggaacg tactgaccga ggtgagccct ttgccgggtc 1140
aggtaccgtt ctattcaacc gtaaccggcg cagtactgga taccacgacc ctggacgcag 1200
gttattggta tcgcaacctg cggcaaacgg tacgcttcga ggaaaccgtg cgcgagctga 1260
cccgacgcgg ccacgacgct ttcatcgagg tgtcggccca cccagtgctg accgtcggca 1320
tacaagatac tcttgaagcg accggtaccc gtcacgctgt atgcggtacc ttgcggcgcg 1380
gcgagggtgg cgcccagcgt ctgttgacgt cccttggaga agcctgggtc gcaggtatcg 1440
cagtggattg gtcccgcttg acgccgacca caaccgctgt ccagctgccc acgtacgcgt 1500
tccagcacca aaggtactgg ctcgactcca ccacggccaa caccggcgat cgcccggccg 1560
cggaccgcga cacggcgttc tgggaggcag tgcagcatac cgatttggat gccttcgcgg 1620
ccgaacttga catcgctccc gacgctccac tgggaaccgt gttgcctgcc ctcgctgact 1680
ggcggcagcg cctgcggacc gccgcagcgg tggatgcgtg gcggtaccgc acggcattca 1740
agcgtctgcc tgatgcaccc ggcgctccag tcctgacggg ctcctggttg gctgtcgttc 1800
cggtccgcca tctcgacgat ccatcggtta cgaccagcct ggacgcggtg gcaaaggccg 1860
gtgctgaggt agtgcagctg gccatcgaag acgccgacgc cgacgtcgac cggctgaccg 1920
agaggctgcg cggcctggtc gccggtttgg gcgctgcccc ggccggtata atgtcgttct 1980
tgggcctcga tgaagagcgg catcgcgacc atcctgcgat gcctagcggc ctggccacct 2040
ccttggcgtt ggtccgggcc ctgggtcgag caggtatagg cgccccgctc tggatggtca 2100
cccgtgaggc tgtcgccgcg ggtcaagata cgcatccaca tgctcccctc ggctcactga 2160
tttgggggct cgggcaggtc acggcgttgg agcacgcaga ccgctggggt ggcctcatag 2220
atctccctgg agtctgtgat gctcgcgtcg cgcgcatgct ctgcgctggc ctcagcggtc 2280
ggggtgcgga ggatcagctg gcgctgcgtc catcgggaac ctttgtgcgg cgcttggccc 2340
atatccctgg agaacaacgt gcagcccgcc ggtcctggca gccccgggga accgtgatcg 2400
tgaccggagg caccggcgcc cttggcgctg tcctggcccg ctggctggcc accgaagacg 2460
cggagcatct ggtgctcacg ggtaggcgtg gagctgatgc tccgggagcc gaacgcttgc 2520
gcgacgagct ggtcgcgacg ggtgcccgcg tcaccctcgc tgcgtgcgac gtcgccgacc 2580
ggaaggccgt cgctgcgctg ttggatgaac tggccgcgga cggagaaacc gtccgcgctg 2640
tcttgcacgc cgcgggagtg gccgatttga cctccctcga gaacaccggc ccggaagcct 2700
tcgccgcggg cgtcgctgca aaggtcgatg gtgcgttgca cttgaccgag ttgctcgacc 2760
atgactcgct cgacgctttc gtcctgtttt ccagcatcgc cggagtctgg ggttcgggtg 2820
accacggtgc ctatgccgct gcgaacgcat tcctgaacgc cctggcggaa tacaaccggg 2880
cacggggtat tcccactacc tcaatcgcct ggggtgtttg gaacgcattc ggcgtcgagg 2940
gtgcgggtgg catatccgaa gcggtcgacc tggaccaact gcatcgccgt ggtctgcctc 3000
tgatcgaacc tgaattgggc ttgacggcgt tgcgtcgcgc cctggaccgc gacgagactg 3060
tcctgacggt agctccggtg gcgtgggaac gcttctttcc actgttctct gctgcacggc 3120
cccggcctct gtttgaggat ctgccgcaag tgagggcgtt gtcggccccc gtgcctacca 3180
cggcgggccc agctgtggaa ccgggtcgta ggggaagcgg tctgggcgac cttcctctca 3240
cggaccgcga tagcgccctt ttggcgcttg tacgcggaga atcagcgtcg gtcttggggt 3300
acgaaagacc tgaccggctc gaccctgatc gcgctctccg cgatgtggga ttcgattccc 3360
ttacggcaat ggagctgagg aaccgtctgg ccactgcaac cggcctgacc ctcccagcgg 3420
cactgtgaga cg 3432
<210> 3
<211> 3420
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>DNA片段
<400> 3
cgtctcacat acggccgcca gaggcccctt cggcaatagg ctaccatgtc aacacccttc 60
cactgaggct gacggtggac cctggacgcg gtttccgcga cctcgtaaag gaggctcgca 120
ccgctttctt tggagcgctg gcgcattcag acaccccggt ggacgcgatc gcacacgaga 180
cagctagaga gcccgtatcg tggcgcgaca ccctgtttca gcatatgttc aactacgtcc 240
ctgttgagag cgccggtgct cttacgctgg gcggtgcccc ggcccgtgcg cttcacgttg 300
aaacgggttt cagtaagttc gacctggagc tgttcgtcca gtcgggcgct gaccacattg 360
gcctgcgtat cttgtactgc tcggaggtcc tggaccgcgc cgacgcccag gccctggcac 420
accgttatgc agcgttgctg cacaccgtgg cggctgaccc cgatcgcccg gtaggggagt 480
tggacgtgtg gtcggcggag gacagagctc tcccaggtcc gggcacggca cgctccgtcc 540
cagacaccga agtggaagcg gatggtgacc tggacgcgtt ccgcacgagc cccgacggct 600
cggtcctggg cctggcggac gcggccgcgc actgtgcagc tgccggtggc tatccttatg 660
tggtccaccc acttgatgca cgtcatatcg cggtagttgg aagggcgggc aaccgcctgc 720
cggcgggcgt tcgtggtgag gtttgcctgg tgcggccgga ccgcgccacg cacgtcgcca 780
caggctggac gggctcactg ggccgggacg gcgcgttgga gctgtacggc cgcgctgagc 840
gggtcgccct cctgcacggt cgcgccgtac acccagaacg cgtagaggcc gctctcctgg 900
cacaccctga ggtgacccgc gctgcattgg tcgtgaccga cggcaccgca ttggccttcg 960
tcactgccga cgagcggccg ggattggcag atgacgtcgc aggtcatgct gcgcgtctgc 1020
tccccagggc cgcgcaaccg gcaagagtga tccgcaccga cacccttcca ctccgtccag 1080
accatggttg ggataccgct gcactcatgg cgctggcggc tgcggagccc gaatcaggac 1140
aggatgacgc ggacggcttg gtcgccgagc ttcgtggtct gtggagagat cttctgggtc 1200
tggctgaacc tgtgggcgcg gatgcggact tcttttcctt gggaggtcat agcctgcttg 1260
gcgcccagct tgtgcaacgg gtggatgacg tgacaggtcg ccgtatcaag ttggctgatc 1320
tgttcgacaa cccaacccct cgttcgttgg cgcgtcactt gcgcgctccc cgcgcgggat 1380
cgtgacaaac accccatgtc gatactgaac gaatcgacgc acactccctt ccttggtatc 1440
tgaaagggga tacgcatgga ggtcagcctg atgggtctgg ctggtatggg ttggattgcc 1500
aagtcactga cagcggccgc agaactcggt ttggcagacc atctcgacgg caccccaatg 1560
accgcagaag agctcgcaaa gcagaccggc acccaccccg agacactgga ggcacttttg 1620
cgcatcctgt cagccctggg tgtgtttcgg cgcgacgatg ccggtgttta ccgcaactcc 1680
gcgttgtcgg accaattgcg cgatgaccat cctcaatcca tgagacatta cgtgatgctt 1740
tcgggcggtc tgtatgctga caccttcaca gcggtaaccc acacacttcg caccggtgaa 1800
tccgcctttc ggcatctgca cggtacgagg atctatgagt acttggaaca gaggccggcg 1860
gaggctgacc tgtatgacaa ggccatggca gacctggccc gcccggtggc ggctgccctg 1920
gcaggtacct atgattttgg cgcggtaagg tcagtgcttg acgtgggagg caactccggc 1980
gagctgttga agggcctgct cacagcccat ccgcatctga cgggtacttg cctggaccgc 2040
ccggacgtct gcgctcgggc gaccgcagaa ttggcggcct cagaccgtga ggacctgaag 2100
gatcgtctgg tctaccggcc aggggacttc cttcaagaag tgcccgccgg atccgatctg 2160
tacacagtga agaacgtctt gcataactgg aaccatgaac attcagtggt aatcctgggc 2220
cggatccggg aagctatgga aagaacagac gccgatcgtt cagccggacg tagggctcgg 2280
ctgctcgtga tagagccact tatcgagaca gatttggact ggatgcgtgt cctgttccag 2340
atggtcgtat gcgaggacgg cacccgtggt aggacagacg aagtgcaacg tgcgcagata 2400
gccgaagccg gtcttgaagt gctcgacacg ctgcgcctga gcacaggtca tacggcccac 2460
atttgcgcag cggcccactg acaaacaccc catgtcgata ctgaacgaat cgacgcacac 2520
tcccttcctt ggtatctgaa aggggatacg catgacgtcc gcagtcgata caggtgtttg 2580
gattcgtcgc taccgcccgg cacctgatgc aggcgtacgg ttgctctgcc ttccacacgc 2640
gggcggagcg gcaagctact atgtaccggt tgccgcggca ctggcccctg cagcggatgt 2700
acttgctgtc caataccccg gccgccagga tcgtcgctcc gaagagcccc ttggtgacct 2760
gcgggagctg gctgatcgcg tcgcggacgc tgtgggtgac ggtgacgagc gccctcttgc 2820
ggtctttgga cattcgatgg gagcgctgct cgggtacgag gtagcacttc gcctggagga 2880
agccgggcgc ggtccggtcc gcctgttcgt gagcggccgt cgggcacctt ccgctgtacg 2940
gccgtcggag gacatgcaca agcgcaccga cagcgccctg cttgacggtg tgcggcgtct 3000
gtccggaacg gacgctcagg ttttcgagga cgaagagctg gtgcggatgg tattgccagc 3060
catccgcgcc gattaccggg ccgtcgaaac ctacgaaccg cggcctggcg atcgtgttcg 3120
ctgcccagtc accgtcctga ccggtgatga cgatcctatg gccaccgtcg aggaagcgcg 3180
ggcctggagc gctcacaccg aaggccctac ggacctgcac gtgttcccgg gcggacattt 3240
ctaccttaac gaccgcgcgg ctgacgtcct caccgtggtc cgcgctcatc tgggcctttg 3300
atgacataac cccttggggc ctctaaacgg gtcttgaggg gttttttgcg cgacttccag 3360
agaagatgac tactgacttg agcgttccaa aacttagcag gtggtcttga aaatgagacg 3420
<210> 4
<211> 3419
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>DNA片段
<400> 4
cgtctcaatt agcacctgct tggattaact acacaatgag accttgaggt aaaccaaata 60
agcacgtagt ggcgctgctc cttcggtcgg acgtgcgtct acgggcacct taccgcagcc 120
gtcggctgtg cgacacggac ggatcgggcg aactggccga tgctgggaga agcgcgctgc 180
tgtacggcgc gcaccgggtg cggagcccct cggcgagcgg tgtgaaactt ctgtgaatgg 240
cctgttcggt tgcttttttt atacggctgc cagataaggc ttgcagcatc tgggcggcta 300
ccgctatgat cggggcgttc ctgcaattct tagtgcgagt atctgaaagg ggatacgcat 360
ggcgggccca ccgcctttcc ctcgtcggcg tggcccctca ggccgacgtc ggtgcggcgg 420
acgggctaca ccgggtagcg tccgggaccg caccggcaga cgcccagcgg ctgtccccag 480
ccgcgccgtg tgcgcggccg acctttgtga agagaacgac gatggctcca agaacgtgtc 540
ggaacaccgc ggatcagcgg gtggtagcgt tctgtttcct cgtacgggca cagtcctgcc 600
atgggtgctt acgggaccgg gcgcagcggc ggtgcgtgca cgctccgaag cgctgcgcac 660
ccacctccgc gcctctacgg aatggagccc tgcaggcgta ggtcaggcgc tgctggcagg 720
aacaggggcg ggcgcggaca cccaccgtgc cgttgttctc gccggtgatc gtgcccaaac 780
tctgaatgcc ctggccgcgc tgtctgcagg agcggaccac ccagccgtct ttaccagcac 840
ccgtgccgac gccagcccag ctggtccagt gtttgtgttt ccaggccagg ggtctcaatg 900
gactggtatg gctcgcgaat tgttggattc tgcccccgta tttgcccgta aattgcatga 960
ttgcgccgac gcatttgccc cgtatttggg tcacagcctc ctggattccg ttactggggc 1020
ggccggcggg ccagagcctg ttggcgcgga tgttgtgcaa ccagccttgt tcgcagtgat 1080
ggttgccttg acggatctct ggaatgcggc cggtgtggca ccaggcgcct tgctcggtca 1140
ttcactgggg gagctcgccg ccgcccacgt cgctggcgtt ctcagcctgg acgattcggc 1200
gcgcgtggtc gcgcgctgga gccaagccca agcaactctc gcaggccgtg gggacatggt 1260
ttccgtgctg ctgcctgcgg acgaactggc ggatctgttg gaccgccgtt ggccggggcg 1320
tctggtagtt gcggtggaga atggcccggg tagtgccgta gccagcggtg atctggatgc 1380
cgcggcagaa cttgtagccc atcttactgc ggaaggcatt catgcgcgtc gtgtcgatgt 1440
cggcttggcc gcgcactctc cccacatcga cgctattctc ccccgcatcc gcgcggatat 1500
tgctccgatc cgcgcacata cccccagtat ccctgtttac agcgcgctgc acggcggcgc 1560
actcgacggt acccctatgg atgcggcgta ttggtgccgt aatttgcgtt caactgtgcg 1620
ttttgcggat gctacgcgcg cagctttgga agcaggccat acaacatttg tggaagtttc 1680
acctcatccg gtcttgacga cggccatgga agtgagtgcc acccgtgcgg cccatgcggc 1740
gaccgtattg ggaactcttc gtcgtggtga gggtggtcca agccgttttc tggcatcact 1800
ggcggaactc catgtttcag gtggtgatgc cgatttgcgt acggttctgc ccgcgagcca 1860
ggcggctggc ttgccggaaa ccgtcctgac ggcgggtccg cgtggcgaga gcgctgacgg 1920
cgatagccgt catgaagtgc tgtgtgcacg tctggcaccg ctcgacccag ccgaacgccg 1980
cgcccaactt ctgacagttg tgcgtgaatc tgcggcggcg gccttggatg gcgatgacca 2040
gggaagcatc gatggtcgtc gcacctttcg tgatttgggt attacttcac ttgcggcggt 2100
tggcattcgt gatcgcctgc actccgcgac aggtcttcgc ctgtcaccta ccgtggtctt 2160
tgaccatcct actccagatg cattggccgc ccaccttgat acagaactgt ttgggaccgg 2220
ggcagatgcc gaaccggctc cggcagccgg cggccgtgca gttccacatg atgaaccgat 2280
ggcaattgtg ggtatggcct gtcgttaccc gggtggagtt ggcgcaccgg cggatctctg 2340
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tatcgctgat ggctacgacc cggaacttgc cgggccgggc cgttttagcc aacgcgaggg 2460
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<223>DNA片段
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<223>DNA片段
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<220>
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<400> 8
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tcgtgggcag tcttgggtga ttccagcctg gccgagggag gcctggtgtt cgcagatgtc 2100
gaggccctgg tagccagctc acaagatctg ccgggtacgg tcgtgttgga atgtccagct 2160
gtggagggcg cgcccgtgcc agatgctgtg cgtgaccgtc ttaccggcgt cctcagcgtg 2220
ttgcagaggt gggtcgctga cgaacgtttg gcatcgtccc gtcttgtagt ggtcacgcgg 2280
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gtcgaagtac tggcttgcga tgccgcagat cgcaacgccc ttgcccaagc actgagcggc 2760
cgccggttga ccgcagtgat ccatgccgcg ggcgtcctcg acgatggcgt gttggaagct 2820
ctggatgcgt cccgcttgga tacggtcctt cggccgaaga tggatgcggc ctggaacctg 2880
cacgagctca ccagggacct tgatttgacc gcatttgtac tgttctcctc agcgaccggc 2940
gtactgggta acgcgggcca agccaactac gcagctgcga acgttttcct ggacgcgttg 3000
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gaggcttccg caatgaccgc cggcttggca gaaaccgatc gtcacaggat tgctcgcctg 3120
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<210> 9
<211> 3403
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>DNA片段
<400> 9
cgtctcaaca tcaacgatac tggttggaca gcacgaccgg atccggtgtc gatgtgggcg 60
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agttcggact gcatcccgcg cttgccgatg cgggtctgca ggcgggactt ctgaccctgt 720
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acgccctcgt agcgtcgagc gctgacttgc ctgataccgt cgtgttggaa tgtcctgcag 1140
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tccgtgatgg tgtcgttcgc gttccccgtc ttgttcgtgc ccaagcgccg gcgggtgagg 1500
caccgggttt tggtgacgga cccgtattgg ttactggcgc cagcggtgtt ttgggcggta 1560
tcgttgcgcg tcaccttgta tcagcgcacg gcgtgcgtga gctcgttctg gtttcgcgcc 1620
gcggaccggc agcggccggc atggatcgtt tggaagccga actggtcgcc cttggggcaa 1680
cggtcgaaag tattgcttgc gatgtagctg atcgtgatgc cctggcacgc gttctgacag 1740
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gtttggacga ggcccgtttt gacacggtgt tgcgcccgaa agtggatgcg gcgtcacatc 1860
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ctgcagtgct cggtcacgcc agcccggatg ccgttgagcc cgaacgtgct tttaaagatc 2460
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gtgctggttt ctccgaagga gccggaatgc tgttggtgag acg 3403
<210> 10
<211> 3435
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>DNA片段
<400> 10
cgtctcagag attggccctg atgctatact taccggcctg gtagaacaaa accagaccct 60
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tgaacatatg agacg 3435
<210> 11
<211> 3399
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>DNA片段
<400> 11
cgtctcactt tgccagagga agcggctaac gcggctgacg cattcggtct gcaccccgcg 60
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<210> 12
<211> 3438
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>DNA片段
<400> 12
cgtctcatac tgctttcgcg gcgcggtcca tccgccgatg gcatggccga agtccaacgc 60
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gtccgggcgc ggcgccaggc cgcggtcggc gcagccgctg gttctggtgg aggcctcgta 720
gaaaggcttg cggctatgtc cgagtcacga cgtgccgcgc atctgcttga tctggtccgg 780
accgaagtcg ctggtgtact gggccaccgc tccgcggcta ccattgaacc cgagcgcgcc 840
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ggagacatcc agcgccgcct gacggcgctg cttgctcgct ttgacgaggc cgcggggcca 1140
gtcgaagcag ctcaagtggc agataagatc gatgcagcca ccgacgatga aatttttgct 1200
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ggggtttttt gactacgtaa tgagaccttg aggtaaacca aataagcacg tagtggcgct 1320
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ggacggatcg ggcgaactgg ccgatgctgg gagaagcgcg ctgctgtacg gcgcgcaccg 1440
ggtgcggagc ccctcggcga gcggtgtgaa acttctgtga atggcctgtt cggttgcttt 1500
ttttatacgg ctgccagata aggcttgcag catctgggcg gctaccgcta tgatcggggc 1560
gttcctgcaa ttcttagtgc gagtatctga aaggggatac gcatgtcgaa cgaacaaaag 1620
ctccgtgatt atttgaagcg cgtcaccaca gatcttgcag aaacccggcg tcgtctgggt 1680
caagccgagg cggcacggca cgaaccaata gcgattgtcg gcatggcctg ccgctatcca 1740
gggggtgtag agtctccaga agacctgtgg gaactggttg cggagggccg cgacgccatc 1800
gatgtcatgc caggcgaccg gggttgggat gtcgacgcgc tgtatgatcc tgacccgagc 1860
tcgaccggta agacgtactc tcgcgagggt ggattcctgc gaaacgcagc ggaattcgat 1920
cccgcgtttt tcggcatctc acctcgggaa gccctggcga tggatccaca gcaacgtttg 1980
ctcttggaaa ctagctggga ggcgttcgag cgcgccggta tcgaccccgc aaccctgcgc 2040
ggatcgcgga cgggtgtgtt cgccggtgtc atgtatcatg attacgggtc tcggctgggt 2100
accggaacgg tacccgagga cgtcgagggc tatgtcggca acggaagcgc cggttcgatc 2160
gccacgggtc gtatcgccta cacccttggc ctggaaggtc cggcggtcac cgtcgatacc 2220
gcgtgcagct ctagtctggt cgccatgcat ttggccatcc aagcgatacg gcaaggagag 2280
tgcagcatgg cgctggccgg aggtgtgacc gtcatggcaa ccccggacac ctttgtggaa 2340
ttctcgagac agcgcggtct ggcccccgac ggccgctgta aggctttcgg agcaggagcc 2400
gatggtaccg gctgggcaga gggagctggt atgctgctcg tggaacgtct gtcggatgct 2460
gaacgtttgg gccatcccat ccttgctgtc gtacggggta gcgcggtcaa ccaggacgga 2520
gccagtaacg gcttgaccgc gccaaacgga ccctcgcagc aacgcgtgat acgccaggcc 2580
ctggccacag caggtttggg tcccaccgat atcgacgcgg tcgagggtca cggaaccggc 2640
acgtccctgg gtgaccccat tgaagtgcaa gcgctgcaag cgacctacgg ccaggagcgg 2700
ccggcagagc ggccgttgtg gttgggtagc ctcaagtcta acattgggca cgcccaggcg 2760
gccgctggtg tgggcggtgt gatcaagatg gtcatggccc ttcgggaagg cgtgctgccg 2820
cggacccttc acgctgacga accttcaccg catatcgatt ggacagccgg tgcggtccgc 2880
ctcctgaccg aacaatccgc ctggccggac accgatcgtc cacggcgtgc cgcggtgtcg 2940
tccttcggag tctcgggcac caacgcgcac gttatcattg agcagccatc cgaacctgta 3000
gaacctgcgg acacggaccc ggagtcacac agcgacagcg aggcagattc ggatggaacc 3060
ccagtggtac accctgcact gctcccctgg cctgtctccg cccggggtgc agatgccgtc 3120
agagctcaag ctgcccgttt gcatgcgcat ctgttggcca ggccggatct cacggcggct 3180
gatgtagctt tcagccttgg caccacacgg accgcgctgc ctcatcggtt tattgcactg 3240
ggtaccgacc gcgccgaatt gatcaacacc ctcgcccggt tcgccgaagg ctcggaatca 3300
gcggctgatg gcctcaccgg cactgcgacc ccaggcgcaa ccgcattcct cttcagcggc 3360
caaggctcac aatgggcggg catgggtaga gaactccaag ctcggttccc ccgctttagg 3420
caggccttgg atgagacg 3438
<210> 13
<211> 3440
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>DNA片段
<400> 13
cgtctcaact ggtcttcgac caccctaccc cgctggctat cgccgcatac ttgaaggccg 60
agctgtacgg acctgatccg ggtgacgatt ccagcgtcct gaccgagctc gatggcctgt 120
cccaacggtt ggcggcaatc gatcccgaca ccaacacccg ccttgagatc accctgcgtc 180
tgcgctcgtt gctgacgcag tggtccgaac cggacggtgg acgcaccact gcagagacag 240
caacggcaac gagtaccacg gcattggaat cggcatccgc ggacgaggtc ctggctttca 300
ttgacaccga gttggggatt tgatgacata accccttggg gcctctaaac gggtcttgag 360
gggttttttg ccgtgaacta gagaccgtca gcgtcgagca cgcggcgctg ctccttcggt 420
cggacgtgcg tctacgggca ccttaccgca gccgtcggct gtgcgacacg gacggatcgg 480
gcgaactggc cgatgctggg agaagcgcgc tgctgtacgg cgcgcaccgg gtgcggagcc 540
cctcggcgag cggtgtgaaa cttctgtgaa tggcctgttc ggttgctttt tttatacggc 600
tgccagataa ggcttgcagc atctgggcgg ctaccgctat gatcggggcg ttcctgcaat 660
tcttagtgcg agtatctgaa aggggatacg catggcggac cacgacaagc tcgttgatta 720
tttgaagcgc gtcaccgcag atcttcaaca gacccgccag cgtctgcggg agtacgaaac 780
ccagagccat gaaccaatag caatcgttgg catgggctgc cgctaccctg gatccgtggc 840
atcccctgaa gagctgtggc gcctggtcca cggtggcgtg gacgccgtcg gcggtctccc 900
gaccgaccgg gggtgggatg tggaagcctt gtacgatcct aaggcacaga acccgggcac 960
gacctatgcc cgtgaaggtg gctacctgac cggagcgaca gagttcgacc cggaattctt 1020
tggtatctcc ccccgtgagg ccctggccat ggatcctcaa cagcgcttgg tgctcgaggt 1080
cgcttgggaa accctggagc atgccggcat cgactccgcc acactgcgcg gcagctcgac 1140
cggtgttttc gtgggatgta actatcagga gtaccgggca aggctgtcgg aggtacagga 1200
aggccttgaa ggccatctgg tgaccggctc cgtaagctcc gtggtgtcgg gccgtgtttc 1260
ttacgtcctc ggccttgagg gccccgctct tacggtcgac accgcttgtt ccagtagctt 1320
ggtcaccctg cacttggctt gcgaagcact taggcggaac gaatgtacca tggcacttgc 1380
cggcggagtg gctgtcatgt caacaccgca taccatcacg ggtttctccc ggcaacgggg 1440
cgtggcagcg gacggccggt gcaaggcatt tagcgcaagc gcagacggta tgggtttcgg 1500
cgaaggtgta ggtcttctgc tcgtggaacg tctgtcggat gctcgacgtt tgggccatcg 1560
cgtgcttgct gtcgtacggg gtagcgcggt caaccaggac ggagccagta acggcttgtc 1620
cgcgccatca ggacccgctc agcaacgcgt gatacgccag gccctggtca acgccggtgt 1680
gcaggccagc caggtcgacg tggtcgaggc tcacggaacc ggcacgcgcc tgggtgaccc 1740
cattgaagct caagcgctgc aagcgaccta cggccagggt cggccggcag agcggccgtt 1800
gtggttgggt agcctcaagt ctaacattgg gcacgcccag gcggccgctg gtgtgggcgg 1860
tgtgatcaag atggtcatgg cccttcggga aggcgtgctg ccgcccaccc ttcacgctga 1920
cgaaccttca ccgcatatcg attggacagc cggtaacgtc cgcctcctga ccgaatcacg 1980
ggaatggccg gaagcgggtc agccacggcg tgccgcggtg tcgtccttcg gaatctcggg 2040
caccaacgcg cacgttatct tggaggcggc agaagcagtt gacgcatcgg gggaggctga 2100
cggcggtgcc ggcgacgaag gcacgccagt gctttctgga accgacgtgg tagcctggcc 2160
tgtcagtgca gcctcgccag acgccctgcg ggcacaggcc gaaagattga gggctcatgt 2220
ggctgagcgt cctgggttgg ccagcgcgga tgtagctttc tcgcttgcaa ctagcaggtc 2280
ggcccttgca cggcgcgcgc tggttgtggg tggggatcgc gacgagctgg tcgcaggcct 2340
ggagagtctg gccgcagacc ggcccggcaa cggccttgtc aagggtttgg ctgacctcgc 2400
aaccaagccg gtgttcgtct tccccggcca gggatcccaa tgggccggaa tggccgtcga 2460
actgctcgat agctccccag tctttgcgga tagtatgcaa gcttgctcgg aagctctgaa 2520
cgagttcgta gattggaacc tcctggaggt cctgcggtcc gatgacgaag agttgagcaa 2580
ccgcgtagat gtggtccagc ctgtgctgtg ggccgtaatg gtgtccctcg cggcactctg 2640
gcaggcgtgc ggcgtccgcc cggcagccgt ggtaggccat tctcagggcg agatagcagc 2700
tgccgtggtc gctggtgccc tgtcactccg tgatggggcc cgcgtggtag ccttgcggtc 2760
ggcggtaata gcgcggctgt tggccggtaa gggtgcgatg gcctccgttg cgctcgcatc 2820
cgataccgtg cgtgaacgcc tgaccccctg ggagggtcgt ctgtccttgg cggctgtaaa 2880
cggcccttcg tcatcggtgg tctgcggcca cttggacgcg ttggatgagt tcgtgtctgc 2940
attggaacat gacggcgtga gggtgcgcag gatagccgtg gactacgcgt cccactctgt 3000
cttcgtagaa caagcggagg aagagttgcg caacgtcctg accgaagtct cgccgttgcc 3060
gggcgaggta ccgttctatt ccaccgttac cggcgcggtg ctcgacacca cgacccttga 3120
tgctggatat tggtaccgga acttgcgcca gacggtacgt ttcgaagaga ctgtgcgcga 3180
actgaccagg cgcggtcacg atgcattcat tgaagtttct gcccatccgg tcctgacggt 3240
cggcattcag gacaccttgg aggctaccgg aacacgccac gccgtctgtg ggacactgcg 3300
tcgcggcgaa ggaggcgcgc aacggctcct gacgtccctt ggagaagcat gggtggcggg 3360
catcgcggtc gattggtcgc gattgacgcc caccgctacc gccgtagaac tgccaacgta 3420
cgcctttcaa cattgagacg 3440
<210> 14
<211> 900
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>启动子
<400> 14
actacgagat ttgaggtaaa ccaaataagc acgtagtggc acaatgagac cttgaggtaa 60
accaaaacgc cacgcgtagt gagacataca cgttcgttgg gttcacgact caacacgcta 120
gggacgtgaa gtcgattcct tcgatgcatt gtaatagcca ccaaaagagt gatgatagtc 180
atgggtgtct gtagcacgtg catcgctcat tacaacggtt attaagcacg tagtggcgtg 240
cacgcggtcg atcttgacgg ctggcgagag gtgcggggag gatctgaccg acgcggtcca 300
cacgtggcac cgcgatgctg ttgtgggcac aatcgtgccg gttggtagga tccagcgatg 360
gcgggcccac cgcctttccc tcgtcggcgt ggcccctcag gccgacgtcg gtgcggcgga 420
cgggctacac cgggtagcgt ccgggaccgc accggcagac gcccagcggc tgtccccagc 480
cgcgccgtgt gcgcggccga cctttgtgaa gagaacgacg atggctccaa gaacgtgtcg 540
gaacaccgcg gatcagcggg tggtagcgtt ctgtttcctc gtacgggcac agtcctgcca 600
tgggtgctta cgggaccggg cgcagcggcg gtgcgtgcac gctccgaagc gctgcgcacc 660
cacctccgcg cctctacgga atggagccct gcaggcgtag gtcaggcgct gctggcagga 720
acaggggcgg gcgcggacac ccaccgtgcc gttgttctcg ccggtgatcg tgcccaaact 780
ctgaatgccc tggccgcgct gtctgcagga gcggaccacc cagccgtctt taccagcacc 840
cgtgccgacg ccagcccagc tggtccagtg tttgtgtttc caggccaggg gtctcaatgg 900
<210> 15
<211> 571
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>启动子
<400> 15
actacgagat ttgaggtaaa ccaaataagc acgtagtggc attccgagac catgtcgata 60
ctgaacgaat cgacgccacg cgtagtgaga catacacgtt cgttgggttc acgactcaac 120
acgctaggga cgtgaagtcg attccttcga tgcattgtaa tagccaccaa aagagtgatg 180
atagtcatgg gtgtctgtag cacgtgcatc gctcattaca acggttatac gcacactccc 240
ttccttgtgt tcacattcga acggtgtctg ctttgacaac atgctgtgcg gtgttgtaaa 300
gtcgtggcca ggagaatacg acagcgtgca ggactggggg agttatgcag tccgcagaaa 360
aggcaaagcc tgctgatggc gccgcagcgg cattgctggc aaccctcacc cataaacggc 420
gtctggacgc ggccaccccg aaggaaagcg cactgtggtt gctggaccgc ctgctccctg 480
aagcgggtgt aaacaatgtt ccactggccg tccgcgtcga tggtcgtctg gacgccgcgg 540
ctttgcaagc agcggtcgac ggtctcgtgc g 571
<210> 16
<211> 829
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>启动子
<400> 16
actacgagat ttgaggtaaa ccaaataagc acgtagtggc gtaatgagac cttgaggtaa 60
accaacgcca cgcgtagtga gacatacacg ttcgttgggt tcacgactca acacgctagg 120
gacgtgaagt cgattccttc gatgcattgt aatagccacc aaaagagtga tgatagtcat 180
gggtgtctgt agcacgtgca tcgctcatta caacggttat aataagcacg tagtggctgt 240
tcacattcga acggtgtctg ctttgacaac atgctgtgcg gtgttgtaaa gtcgtggcca 300
ggagaatacg acagcgtgca ggactggggg agttatgtcg aacgaacaaa agctccgtga 360
ttatttgaag cgcgtcacca cagatcttgc agaaacccgg cgtcgtctgg gtcaagccga 420
ggcggcacgg cacgaaccaa tagcgattgt cggcatggcc tgccgctatc cagggggtgt 480
agagtctcca gaagacctgt gggaactggt tgcggagggc cgcgacgcca tcgatgtcat 540
gccaggcgac cggggttggg atgtcgacgc gctgtatgat cctgacccga gctcgaccgg 600
taagacgtac tctcgcgagg gtggattcct gcgaaacgca gcggaattcg atcccgcgtt 660
tttcggcatc tcacctcggg aagccctggc gatggatcca cagcaacgtt tgctcttgga 720
aactagctgg gaggcgttcg agcgcgccgg tatcgacccc gcaaccctgc gcggatcgcg 780
gacgggtgtg ttcgccggtg tcatgtatca tgattacggg tctcggctg 829
<210> 17
<211> 594
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>启动子
<400> 17
actacgagat ttgaggtaaa ccaaataagc acgtagtggc attccgagac catgtcgata 60
ctgaacacgc cacgcgtagt gagacataca cgttcgttgg gttcacgact caacacgcta 120
gggacgtgaa gtcgattcct tcgatgcatt gtaatagcca ccaaaagagt gatgatagtc 180
atgggtgtct gtagcacgtg catcgctcat tacaacggtt atgaatcgac gcacactccc 240
ttccttggtg cacgcggtcg atcttgacgg ctggcgagag gtgcggggag gatctgaccg 300
acgcggtcca cacgtggcac cgcgatgctg ttgtgggcac aatcgtgccg gttggtagga 360
tccagcgatg cagtccgcag aaaaggcaaa gcctgctgat ggcgccgcag cggcattgct 420
ggcaaccctc acccataaac ggcgtctgga cgcggccacc ccgaaggaaa gcgcactgtg 480
gttgctggac cgcctgctcc ctgaagcggg tgtaaacaat gttccactgg ccgtccgcgt 540
cgatggtcgt ctggacgccg cggctttgca agcagcggtc gacggtctcg tgcg 594
<210> 18
<211> 540
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>启动子
<400> 18
actacgagat ttgaggtaaa ccaaataagc acgtagtggc tagatgagac cgcgcagatg 60
tacgacaata tcgcacgcca cgcgtagtga gacatacacg ttcgttgggt tcacgactca 120
acacgctagg gacgtgaagt cgattccttc gatgcattgt aatagccacc aaaagagtga 180
tgatagtcat gggtgtctgt agcacgtgca tcgctcatta caacggttat ttagtcaccc 240
ttgggccgtg cacgcggtcg atcttgacgg ctggcgagag gtgcggggag gatctgaccg 300
acgcggtcca cacgtggcac cgcgatgctg ttgtgggcac aatcgtgccg gttggtagga 360
tccagcgatg gcgaccccaa acgagaaagt tgtggaggct ctgcgcgcct ccctcaagga 420
aaccgaactc cttcgtcaac agaacaatgc gctccgcgcg gccagctcgg aaccagtagc 480
aatcgttggc atgggctgcc gcttccctgg aggtgtggta tcccctgaag gtctctggga 540
<210> 19
<211> 852
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>启动子
<400> 19
actacgagat ttgaggtaaa ccaaataagc acgtagtggc gtaatgagac cttgaggtaa 60
accaaataag acgccacgcg tagtgagaca tacacgttcg ttgggttcac gactcaacac 120
gctagggacg tgaagtcgat tccttcgatg cattgtaata gccaccaaaa gagtgatgat 180
agtcatgggt gtctgtagca cgtgcatcgc tcattacaac ggttatcacg tagtggcgtg 240
cacgcggtcg atcttgacgg ctggcgagag gtgcggggag gatctgaccg acgcggtcca 300
cacgtggcac cgcgatgctg ttgtgggcac aatcgtgccg gttggtagga tccagcgatg 360
tcgaacgaac aaaagctccg tgattatttg aagcgcgtca ccacagatct tgcagaaacc 420
cggcgtcgtc tgggtcaagc cgaggcggca cggcacgaac caatagcgat tgtcggcatg 480
gcctgccgct atccaggggg tgtagagtct ccagaagacc tgtgggaact ggttgcggag 540
ggccgcgacg ccatcgatgt catgccaggc gaccggggtt gggatgtcga cgcgctgtat 600
gatcctgacc cgagctcgac cggtaagacg tactctcgcg agggtggatt cctgcgaaac 660
gcagcggaat tcgatcccgc gtttttcggc atctcacctc gggaagccct ggcgatggat 720
ccacagcaac gtttgctctt ggaaactagc tgggaggcgt tcgagcgcgc cggtatcgac 780
cccgcaaccc tgcgcggatc gcggacgggt gtgttcgccg gtgtcatgta tcatgattac 840
gggtctcggc tg 852
<210> 20
<211> 559
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>启动子
<400> 20
actacgagat ttgaggtaaa ccaaataagc acgtagtggc aactagagac cgtcagcgtc 60
acgccacgcg tagtgagaca tacacgttcg ttgggttcac gactcaacac gctagggacg 120
tgaagtcgat tccttcgatg cattgtaata gccaccaaaa gagtgatgat agtcatgggt 180
gtctgtagca cgtgcatcgc tcattacaac ggttatgagc acgcggcgtg cacgcggtcg 240
atcttgacgg ctggcgagag gtgcggggag gatctgaccg acgcggtcca cacgtggcac 300
cgcgatgctg ttgtgggcac aatcgtgccg gttggtagga tccagcgatg gcggaccacg 360
acaagctcgt tgattatttg aagcgcgtca ccgcagatct tcaacagacc cgccagcgtc 420
tgcgggagta cgaaacccag agccatgaac caatagcaat cgttggcatg ggctgccgct 480
accctggatc cgtggcatcc cctgaagagc tgtggcgcct ggtccacggt ggcgtggacg 540
ccgtcggcgg tctcccgac 559
<210> 21
<211> 517
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>启动子
<400> 21
actacgagat ttgaggtaaa ccaaataagc acgtagtggc tagatgagac cgcgcagatg 60
tacgacaata tcgcttagtc acccacgcca cgcgtagtga gacatacacg ttcgttgggt 120
tcacgactca acacgctagg gacgtgaagt cgattccttc gatgcattgt aatagccacc 180
aaaagagtga tgatagtcat gggtgtctgt agcacgtgca tcgctcatta caacggttat 240
ttgggcctgt tcacattcga acggtgtctg ctttgacaac atgctgtgcg gtgttgtaaa 300
gtcgtggcca ggagaatacg acagcgtgca ggactggggg agttatggcg accccaaacg 360
agaaagttgt ggaggctctg cgcgcctccc tcaaggaaac cgaactcctt cgtcaacaga 420
acaatgcgct ccgcgcggcc agctcggaac cagtagcaat cgttggcatg ggctgccgct 480
tccctggagg tgtggtatcc cctgaaggtc tctggga 517
<210> 22
<211> 536
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>启动子
<400> 22
actacgagat ttgaggtaaa ccaaataagc acgtagtggc aactagagac cgtcagcgtc 60
gacgccacgc gtagtgagac atacacgttc gttgggttca cgactcaaca cgctagggac 120
gtgaagtcga ttccttcgat gcattgtaat agccaccaaa agagtgatga tagtcatggg 180
tgtctgtagc acgtgcatcg ctcattacaa cggttatagc acgcggctgt tcacattcga 240
acggtgtctg ctttgacaac atgctgtgcg gtgttgtaaa gtcgtggcca ggagaatacg 300
acagcgtgca ggactggggg agttatggcg gaccacgaca agctcgttga ttatttgaag 360
cgcgtcaccg cagatcttca acagacccgc cagcgtctgc gggagtacga aacccagagc 420
catgaaccaa tagcaatcgt tggcatgggc tgccgctacc ctggatccgt ggcatcccct 480
gaagagctgt ggcgcctggt ccacggtggc gtggacgccg tcggcggtct cccgac 536
<210> 23
<211> 877
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>启动子
<400> 23
actacgagat ttgaggtaaa ccaaataagc acgtagtggc acaatgagac cttgaggtaa 60
accaaataag acgccacgcg tagtgagaca tacacgttcg ttgggttcac gactcaacac 120
gctagggacg tgaagtcgat tccttcgatg cattgtaata gccaccaaaa gagtgatgat 180
agtcatgggt gtctgtagca cgtgcatcgc tcattacaac ggttatcacg tagtggctgt 240
tcacattcga acggtgtctg ctttgacaac atgctgtgcg gtgttgtaaa gtcgtggcca 300
ggagaatacg acagcgtgca ggactggggg agttatggcg ggcccaccgc ctttccctcg 360
tcggcgtggc ccctcaggcc gacgtcggtg cggcggacgg gctacaccgg gtagcgtccg 420
ggaccgcacc ggcagacgcc cagcggctgt ccccagccgc gccgtgtgcg cggccgacct 480
ttgtgaagag aacgacgatg gctccaagaa cgtgtcggaa caccgcggat cagcgggtgg 540
tagcgttctg tttcctcgta cgggcacagt cctgccatgg gtgcttacgg gaccgggcgc 600
agcggcggtg cgtgcacgct ccgaagcgct gcgcacccac ctccgcgcct ctacggaatg 660
gagccctgca ggcgtaggtc aggcgctgct ggcaggaaca ggggcgggcg cggacaccca 720
ccgtgccgtt gttctcgccg gtgatcgtgc ccaaactctg aatgccctgg ccgcgctgtc 780
tgcaggagcg gaccacccag ccgtctttac cagcacccgt gccgacgcca gcccagctgg 840
tccagtgttt gtgtttccag gccaggggtc tcaatgg 877
<210> 24
<211> 17749
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> OGAB 载体1.0
<400> 24
gcggccgcaa gcttgaagag ctcttctttc agaacgctcg gttgccgccg ggcgtttttt 60
atgagacgtc tcggcctgtt tggccattaa cgtgcaggtg gatccagatc taagcttcta 120
tagaagcttg gtaccgacgt ctcggcctgt ttggcccgcc gcatccatac cgccagttgt 180
ttaccctcac aacgttccag taaccgggca tgttcatcat cagtaacccg tatcgtgagc 240
atcctctctc gtttcatcgg tatcattacc cccatgaaca gaaatccccc ttacacggag 300
gcatcagtga ccaaacagga aaaaaccgcc cttaacatgg cccgctttat cagaagccag 360
acattaacgc ttctggagaa actcaacgag ctggacgcgg atgaacaggc agacatctgt 420
gaatcgcttc acgaccacgc tgatgagctt taccgcagct gcctcgcgcg tttcggtgat 480
gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccgaagacgg tcacagcttg tctgtaagcg 540
gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc 600
gcagccatga cccagtcacg tagcgatagc ggagtgtata ctggcttaac tatgcggcat 660
cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa 720
ggagaaaata ccgcatcagg cactcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg 780
tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag 840
aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc 900
gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca 960
aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt 1020
ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc 1080
tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc 1140
tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc 1200
ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact 1260
tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg 1320
ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta 1380
tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca 1440
aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa 1500
aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg 1560
aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc 1620
ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg 1680
acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat 1740
ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg 1800
gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa 1860
taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca 1920
tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc 1980
gcaacgttgt tgccattgct gcaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt 2040
cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa 2100
aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat 2160
cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct 2220
tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga 2280
gttgctcttg cccggcgtca acacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag 2340
tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga 2400
gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca 2460
ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg 2520
cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc 2580
agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag 2640
gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctggatc cacctgcacg taaaaggcct 2700
tcttggccac cccgggccgt cgaccaattc tcatgtttga cagcttatca tcgaatttct 2760
gccattcatc cgcttattat cacttattca ggcgtagcaa ccaggcgttt aagggcacca 2820
ataactgcct taaaaaaatt acgccccgcc ctgccactca tcgcagtact gttgtaattc 2880
attaagcatt ctgccgacat ggaagccatc acaaacggca tgatgaacct gaatcgccag 2940
cggcatcagc accttgtcgc cttgcgtata atatttgccc atggtgaaaa cgggggcgaa 3000
gaagttgtcc atattggcca cgtttaaatc aaaactggtg aaactcaccc agggattggc 3060
tgagacgaaa aacatattct caataaaccc tttagggaaa taggccaggt tttcaccgta 3120
acacgccaca tcttgcgaat atatgtgtag aaactgccgg aaatcgtcgt ggtattcact 3180
ccagagcgat gaaaacgttt cagtttgctc atggaaaacg gtgtaacaag ggtgaacact 3240
atcccatatc accagctcac cgtctttcat tgccatacgg aattccggat gagcattcat 3300
caggcgggca agaatgtgaa taaaggccgg ataaaacttg tgcttatttt tctttacggt 3360
ctttaaaaag gccgtaatat ccagctgaac ggtctggtta taggtacatt gagcaactga 3420
ctgaaatgcc tcaaaatgtt ctttacgatg ccattgggat atatcaacgg tggtatatcc 3480
agtgattttt ttctccattt tagcttcctt agctcctgaa aatctcgata actcaaaaaa 3540
tacgcccggt agtgatctta tttcattatg gtgaaagttg gaacctctta cgtgccgatc 3600
aacgtctcat tttcgccaaa agttggccca gggcttcccg gtatcaacag ggacaccagg 3660
atttatttat tctgcgaagt gatcttccgt cacaggtatt tattcgcgat aagctcatgg 3720
agcggcgtaa ccgtcgcaca ggaaggacag agaaagcgcg gatctgggaa gtgacggaca 3780
gaacggtcag gacctggatt ggggaggcgg ttgccgccgc tgctgctgac ggtgtgacgt 3840
tctctgttcc ggtcacacca catacgttcc gccattccta tgcgatgcac atgctgtatg 3900
ccggtatacc gctgaaagtt ctgcaaagcc tgatgggaca taagtccatc agttcaacgg 3960
aagtctacac gaaggttttt gcgctggatg tggctgcccg gcaccgggtg cagtttgcga 4020
tgccggagtc tgatgcggtt gcgatgctga aacaattatc ctgagaataa atgccttggc 4080
ctttatatgg aaatgtggaa ctgagtggat atgctgtttt tgtctgttaa acagagaagc 4140
tggctgttat ccactgagaa gcgaacgaaa cagtcgggaa aatctcccat tatcgtagag 4200
atccgcatta ttaatctcag gagcctgtgt agcgtttata ggaagtagtg ttctgtcatg 4260
atgcctgcaa gcggtaacga aaacgatttg aatatgcctt caggaacaat agaaatcttc 4320
gtgcggtgtt acgttgaagt ggagcggatt atgtcagcaa tggacagaac aacctaatga 4380
acacagaacc atgatgtggt ctgtcctttt acagccagta gtgctcgccg cagtcgagcg 4440
acagggcgaa gccctcgagt gagcgaggaa gcaccaggga acagcactta tatattctgc 4500
ttacacacga tgcctgaaaa aacttccctt ggggttatcc acttatccac ggggatattt 4560
ttataattat tttttttata gtttttagat cttctttttt agagcgcctt gtaggccttt 4620
atccatgctg gttctagaga aggtgttgtg acaaattgcc ctttcagtgt gacaaatcac 4680
cctcaaatga cagtcctgtc tgtgacaaat tgcccttaac cctgtgacaa attgccctca 4740
gaagaagctg ttttttcaca aagttatccc tgcttattga ctctttttta tttagtgtga 4800
caatctaaaa acttgtcaca cttcacatgg atctgtcatg gcggaaacag cggttatcaa 4860
tcacaagaaa cgtaaaaata gcccgcgaat cgtccagtca aacgacctca ctgaggcggc 4920
atatagtctc tcccgggatc aaaaacgtat gctgtatctg ttcgttgacc agatcagaaa 4980
atctgatggc accctacagg aacatgacgg tatctgcgag atccatgttg ctaaatatgc 5040
tgaaatattc ggattgacct ctgcggaagc cagtaaggat atacggcagg cattgaagag 5100
tttcgcgggg aaggaagtgg ttttttatcg ccctgaagag gatgccggcg atgaaaaagg 5160
ctatgaatct tttccttggt ttatcaaacg tgcgcacagt ccatccagag ggctttacag 5220
tgtacatatc aacccatatc tcattccctt ctttatcggg ttacagaacc ggtttacgca 5280
gtttcggctt agtgaaacaa aagaaatcac caatccgtat gccatgcgtt tatacgaatc 5340
cctgtgtcag tatcgtaagc cggatggctc aggcatcgtc tctctgaaaa tcgactggat 5400
catagagcgt taccagctgc ctcaaagtta ccagcgtatg cctgacttcc gccgccgctt 5460
cctgcaggtc tgtgttaatg agatcaacag cagaactcca atgcgcctct catacattga 5520
gaaaaagaaa ggccgccaga cgactcatat cgtattttcc ttccgcgata tcacttccat 5580
gacgacagga tagtctgagg gttatctgtc acagatttga gggtggttcg tcacatttgt 5640
tctgacctac tgagggtaat ttgtcacagt tttgctgttt ccttcagcct gcatggattt 5700
tctcatactt tttgaactgt aatttttaag gaagccaaat ttgagggcag tttgtcacag 5760
ttgatttcct tctctttccc ttcgtcatgt gacctgatac gcgtgctacc ttaagagagt 5820
caattcgccc ttcccggtcg atatgaacag cttatttaca taattcacgt tattggtagt 5880
tataaatgaa attcctaata tcggttatga agtgaaattg aatttctact tgatctttct 5940
ctctattttt gtaaaataaa attaagaata tttaaatatt caatgattca tttttgcaga 6000
aatcggagga agaagaatat atgaaaacat ttaacatttc tcaacaagat ccccccatat 6060
tgttgtataa gtgatgaaat actgaattta aaacttagtt tatatgtggt aaaatgtttt 6120
aatcaagttt aggaggaatt aattatgaag tgtaatgaat aatgaatgta acagggttca 6180
attaaaagag ggaagcgtat cattaaccct ataaactacg tctgccctca ttattggagg 6240
gtgaaatgtg aatacatcct attcacaatc gaatttacga cacaaccaaa ttttaatttg 6300
gctttgcatt ttatcttttt ttagcgtatt aaatgaaatg gttttgaacg tctcattacc 6360
tgatattgca aatgatttta ataaaccacc agcgagtaca aactgggtga acacagcctt 6420
tatgttaacc ttttccattg gaacagctgt atatggaaag ctatctgatc aattaggcat 6480
caaaaggtta ctcctatttg gaattataat aaattgtttc gggtcggtaa ttgggtttgt 6540
tggccattct ttcttttcct tacttattat ggctcgtttt attcaagggg ctggtgcagc 6600
tgcatttcca gcactcgtaa tggttgtagt tgcgcgctat attccaaagg aaaatagggg 6660
taaagcattt ggtcttattg gatcgatagt agccatggga gaaggagtcg gtccagcgat 6720
tggtggaatg atagcccatt atattcattg gtcctatctt ctactcattc ctatgataac 6780
aattatcact gttccgtttc ttatgaaatt attaaagaaa gaagtaagga taaaaggtca 6840
ttttgatatc aaaggaatta tactaatgtc tgtaggcatt gtatttttta tgttgtttac 6900
aacatcatat agcatttctt ttcttatcgt tagcgtgctg tcattcctga tatttgtaaa 6960
acatatcagg aaagtaacag atccttttgt tgatcccgga ttagggaaaa atataccttt 7020
tatgattgga gttctttgtg ggggaattat atttggaaca gtagcagggt ttgtctctat 7080
ggttccttat atgatgaaag atgttcacca gctaagtact gccgaaatcg gaagtgtaat 7140
tattttccct ggaacaatga gtgtcattat tttcggctac attggtggga tacttgttga 7200
tagaagaggt cctttatacg tgttaaacat cggagttaca tttctttctg ttagcttttt 7260
aactgcttcc tttcttttag aaacaacatc atggttcatg acaattataa tcgtatttgt 7320
tttaggtggg ctttcgttca ccaaaacagt tatatcaaca attgtttcaa gtagcttgaa 7380
acagcaggaa gctggtgctg gaatgagttt gcttaacttt accagctttt tatcagaggg 7440
aacaggtatt gcaattgtag gtggtttatt atccataccc ttacttgatc aaaggttgtt 7500
acctatggaa gttgatcagt caacttatct gtatagtaat ttgttattac ttttttcagg 7560
aatcattgtc attagttggc tggttacctt gaatgtatat aaacattctc aaagggattt 7620
ctaaatcgtt aagggatcaa ctttgggaga gagttcaaaa ttgatccttt ttttataaca 7680
ggaattgggc atcaaataaa acgaaaggct cagtcgaaag actgggcctt tcgttttatc 7740
tgttgtttgt cggtgaacgc tctcctgagt aggacaaatc cgccgggagc ggatttgaac 7800
gttgcgaagc aacggcccgg agggtggcgg gcaggacgcc cgccataaac tgccaggcat 7860
caaattaagc agaaggccat cctgacggat ggcctttttg cgtttctaca aactcttcct 7920
gtcgtcatat ctacaattct acacagccca gtccagacta ttcggcactg aaattatggg 7980
tgaagtggtc aagacctcac taggcacctt aaaaatagcg caccctgaag aagatttatt 8040
tgaggtagcc cttgcctacc tagcttccaa gaaagatatc ctaacagcac aagagcggaa 8100
agatgttttg ttctacatcc agaacaacct ctgctaaaat tcctgaaaaa ttttgcaaaa 8160
agttgttgac tttatctaca aggtgtggca taatgtgtgg aattgtgagc ggataacaat 8220
taagctaatt ctatggtaaa agcattcctg aacccaatat ccttattttt agtggacaag 8280
gccttgttct catatggttg cttgagccag tgccttacaa ggctcttccg ctttggcagg 8340
ctgttcaaaa ttatttatta gagcaactca aggaactagg cggagatcca aaagcaaccg 8400
atgcagcacg tgtttttcgg attgctggga gcgtcaatag taagaatgga gcggaagtaa 8460
gagcggaata tcggcacgat tacagatatg agttaaggca gattcaattt gattaccttc 8520
cagaactcaa tgaggttatt aatcccgctc cacaaaagaa aaaacggggg cgtaaaaaga 8580
aagtagttca gttattcaat acctacaaac tccattacgc tcgcctattg gatatagtga 8640
aattggtgga actacgaaat tatgaggtaa ctggatacag ggaaatcatt tgctttttat 8700
accgttattg gttgtgctgt tacacgaacg accctgtaga ggctttaaat caaacacaga 8760
cacttaattt acagttcact gagcctttac ccttaaaaga ggttgaaagg gctacacgga 8820
gcgcagaaaa ggcgtgggaa gcacgaaata acgaagaggc taaccggatt gcaatcgaaa 8880
aaggatatcc cagtgctgga tacaatatta gcaataaaaa gttgattgaa tggctagata 8940
tcacaccaga agaacagaag catttacaga cgattataga cgctaatgag aaacggagaa 9000
gaaagcggga aagggatagg atttatcaag aacaaaaacg tcgtgagcgg ggagatatga 9060
cccgacagga gtatattaag caacaacagg ataaaacaga tgataaatta tttaaattgc 9120
aggagttatt agaacagaat cccaaaatct caaaaattaa attagcaaaa atacttggtg 9180
tagataaatc gcacttatac agactgctga aacaactata actggaaaaa attagtgtct 9240
catggttcgt cgcccttata ttatgggcgt tagcctgctt gctaattgga taggtgttat 9300
tgtcatttca acgtcggacg ttttggtaga tgaacgtcgg acgttatttg cttcaataga 9360
ttgttgatgt attaagggtt gcagtgaatc gacaagcaaa aagttatgac gttgtgaaaa 9420
aattgaatag aaaattggaa attacgtcgg acgttctaac ttaaaaaccc tgttatatca 9480
atgatttaaa aggaaattaa cgtcataaaa gacctttctg caacaaaagt ttttctggaa 9540
gagttgaggt tattttatag gtattatgga cttttgtaga ctttttgtgt actttttgtg 9600
gactccacac tcgctggtat cgtgttattt tttaattgag atatgaatat ggaaattaaa 9660
cgttttaggc gttggtttgg tgatgacaaa aaaataagag tacccgctca caacggatac 9720
tctttcgaga aatgtacgaa acgctataaa taaaaaataa ctagatacat ttacattgta 9780
tcacgtttcg tacatttctc caataacaaa ttgattggag gaatgcaaag tgaataatga 9840
accagtaaaa cgtggtaaga agaacagatg ggaattaaac ctacctataa tgacttatgt 9900
agtagctgat gattggattg ataaactagg acacgaaacg tttactttat ggttgaggtt 9960
ccatacttgg gtagatagag aagatgaact ccgagattat gatcgcatac ctagaagttt 10020
tgagaacata tataaaaaga cactaggaat ctcaaaaagt aagttttata gattgataaa 10080
acctttatgg gaatatggat taatagacat catagaatac gaagaatcta accgtaattc 10140
tactaaacct aaaaatataa ttgtttatga gtatccttta cacgaaatag aaagaaagta 10200
taaaccacta gaaaaattaa gagattggga taaagactat aattccgttt ctaaagaatt 10260
aggtaaaaca ggtggtagac caaggaaaaa agatagtgaa gaagaacccg aaaagaaacc 10320
cgaagaagta actaaaaaga aacgtaaata taagttaaaa agagttatcc acaacggttt 10380
caaaaatgaa acggtggagg gtttcaaaaa tgaaacggtg gagggtttca aaaatgaaac 10440
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accaactggt cgtacaataa ataggtcatt acttttttca caagaagata ttaaacaggc 10620
ctatcaattt attaatagat tttcagttat acagttacgt gaaaacttta gctttgataa 10680
acactttgaa gaacggttgg tatgttattt atggaaagca gggatttcta ctttttacac 10740
gcacgaaatc agtaaaatga taaaaaaaat agcagactat gaaaaatcta aaaaaggtag 10800
attaaaccca atacgtgacc gagccttata tatggtaaat ggtcttgtaa tgaatagagc 10860
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ttaaatctcg cgccgatcaa ctgggtgcca gcgtggtggt gtcgatggta gaacgaagcg 13140
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cgctgttagc gggcccatta agttctgtct cggcgcgtct gcgtctggct ggctggcata 13440
aatatctcac tcgcaatcaa attcagccga tagcggaacg ggaaggcgac tggagtgcca 13500
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ttttatttaa aataccctct gaaaagaaag gaaacgacag gtgctgaaag cgagcttttt 17640
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catcgctaat aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt atattcgat 17749
<210> 25
<211> 16509
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
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<400> 25
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tgataaaacc tttatgggaa tatggattaa tagacatcat agaatacgaa gaatctaacc 10680
gtaattctac taaacctaaa aatataattg tttatgagta tcctttacac gaaatagaaa 10740
gaaagtataa accactagaa aaattaagag attgggataa agactataat tccgtttcta 10800
aagaattagg taaaacaggt ggtagaccaa ggaaaaaaga tagtgaagaa gaacccgaaa 10860
agaaacccga agaagtaact aaaaagaaac gtaaatataa gttaaaaaga gttatccaca 10920
acggtttcaa aaatgaaacg gtggagggtt tcaaaaatga aacggtggag ggtttcaaaa 10980
atgaaacggt gaccgtttca aaaataaaac ccaataatta ttcaaatatc tttaataact 11040
tatcaaatat ttctactaat gtttcaaata atttattaat tgatgatgat gaggaaatcg 11100
aaaatgaacc aactggtcgt acaataaata ggtcattact tttttcacaa gaagatatta 11160
aacaggccta tcaatttatt aatagatttt cagttataca gttacgtgaa aactttagct 11220
ttgataaaca ctttgaagaa cggttggtat gttatttatg gaaagcaggg atttctactt 11280
tttacacgca cgaaatcagt aaaatgataa aaaaaatagc agactatgaa aaatctaaaa 11340
aaggtagatt aaacccaata cgtgaccgag ccttatatat ggtaaatggt cttgtaatga 11400
atagagcttc ttcccaaagt gaacatgcta cttataaact aaaccaatat aaaaaacaga 11460
aggaacagga aaaacaacaa caggagcaac aaagatcaag agtaccgttc tataattggt 11520
tggaggaaag agaagaacaa accgaaggtc aactacccac cacttaaagc ctaacggctt 11580
ttgaagtggg gcttgtaaaa agccctagtt gactacccca agtctttcga ggactacgtt 11640
ggaaaggtca tgacacctac aaatgctcct ctagttcgta gccactgtcg ttgatggtta 11700
aaagtcctga tgggtaggga cggtgctgtc aacatcacaa gcccttccaa catgggggaa 11760
gaggaagaac actccgagaa aggagggggc tgtcgtacac gccttgttcg tgtacgtgat 11820
ttttaacact tttatctcta atataatctc tccttgagtt agcagagact aagaataaaa 11880
cacattagga ttttttatct acatgtttga gtcggctgaa agatcgtacg taccaattat 11940
tgtttcgtga ttgttcaagc cataacactg tagggatagt ggaaagagtg cttcatctgg 12000
ttacgatcaa tcaaatattc aaacggaggg acacgatttt gatgaaacca gtaacgttat 12060
acgatgtcgc agagtatgcc ggtgtctctt atcagaccgt ttcccgcgtg gtgaaccagg 12120
ccagccacgt ttctgcgaaa acgcgggaaa aagtggaagc ggcgatggcg gagctgaatt 12180
acattcccaa ccgcgtggca caacaactgg cgggcaaaca gtcgttgctg attggcgttg 12240
ccacctccag tctggccctg cacgcgccgt cgcaaattgt cgcggcgatt aaatctcgcg 12300
ccgatcaact gggtgccagc gtggtggtgt cgatggtaga acgaagcggc gtcgaagcct 12360
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cgctggatga ccaggatgcc attgctgtgg aagctgcctg cactaatgtt ccggcgttat 12480
ttcttgatgt ctctgaccag acacccatca acagtattat tttctcccat gaagatggta 12540
cgcgactggg cgtggagcat ctggtcgcat tgggtcacca gcaaatcgcg ctgttagcgg 12600
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aacaaaccat gcaaatgctg aatgagggca tcgttcccac tgcgatgctg gttgccaacg 12780
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atatctcggt agtgggatac gacgataccg aagatagctc atgttatatc ccgccgctta 12900
ccaccatcaa acaggatttt cgcctgctgg ggcaaaccag cgtggaccgc ttgctgcaac 12960
tctctcaggg ccaggcggtg aagggcaatc agctgttgcc cgtgtcactg gtgaaaagaa 13020
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tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat 13140
gtgagttagg atcgctacct taagagacac gcgttatcgg gggttagttc gtcatcattg 13200
atgagggttg attatcacag tttattactc tgaattggct atccgcgtgt gtacctctac 13260
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aaacagttct tctttgcttc ctcgccagtt cgctcgctat gctcggttac acggctgcgg 13380
cgagcgctag tggataataa gtgactgagg tatgtgctct tcttatctcc ttttgtagtg 13440
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tgcagtaaat tgcaagattt aataaaaaaa cgcaaagcaa tgattaaagg atgttcagaa 13560
tgaaactcat ggaaacactt aaccagtgca taaacgctgg tcatgaaatg acgaaggcta 13620
tcgccattgc acagtttaat gatgacagcc cggaagcgag gaaaataacc cggcgctgga 13680
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gttatacaat tgaacaaatt aatcatatgc gtgatgtgtt tggtacgcga ttgcgacgtg 13860
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cctcagtttc tgttcatctt gctcaggatc tggctctgaa ggggctacgt gttttgctcg 13980
tggaaggtaa cgacccccag ggaacagcct caatgtatca cggatgggta ccagatcttc 14040
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atgcaataaa gcccacttgc tggccggggc ttgacattat tccttcctgt ctggctctgc 14160
accgtattga aactgagtta atgggcaaat ttgatgaagg taaactgccc accgatccac 14220
acctgatgct ccgactggcc attgaaactg ttgctcatga ctatgatgtc atagttattg 14280
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ttaccaaata cagcaatagt aatggctctc agtccccgtg gatggaggag caaattcggg 14520
atgcctgggg aagcatggtt ctaaaaaatg ttgtacgtga aacggatgaa gttggtaaag 14580
gtcagatccg gatgagaact gtttttgaac aggccattga tcaacgctct tcaactggtg 14640
cctggagaaa tgctctttct atttgggaac ctgtctgcaa tgaaattttc gatcgtctga 14700
ttaaaccacg ctgggagatt agataatgaa gcgtgcgcct gttattccaa aacatacgct 14760
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gttaattgcg cgcgtaggag taatggctcg cggtaatgcc attactttgc ctgtatgtgg 14880
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gaatgaattt gctggaaata tttctgcgct ggctgatgcg gaaaatattt cacgtaagat 15300
tattacccgc tgtatcaaca ccgccaaatt gcctaaatca gttgttgctc ttttttctca 15360
ccccggtgaa ctatctgccc ggtcaggtga tgcacttcaa aaagccttta cagataaaga 15420
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aactagctta agctcacgac atcagtttgc tcctggagcg acagtattgt ataagggcga 15600
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tctctctggg cccactgttc cacttgtatc gtcggtctga taatcagact gggaccacgg 15840
tcccactcgt atcgtcggtc tgattattag tctgggacca cggtcccact cgtatcgtcg 15900
gtctgattat tagtctggga ccacggtccc actcgtatcg tcggtctgat aatcagactg 15960
ggaccacggt cccactcgta tcgtcggtct gattattagt ctgggaccat ggtcccactc 16020
gtatcgtcgg tctgattatt agtctgggac cacggtccca ctcgtatcgt cggtctgatt 16080
attagtctgg aaccacggtc ccactcgtat cgtcggtctg attattagtc tgggaccacg 16140
gtcccactcg tatcgtcggt ctgattatta gtctgggacc acgatcccac tcgtgttgtc 16200
ggtctgatta tcggtctggg accacggtcc cacttgtatt gtcgatcaga ctatcagcgt 16260
gagactacga ttccatcaat gcctgtcaag ggcaagtatt gacatgtcgt cgtaacctgt 16320
agaacggagt aacctcggtg tgcggttgta tgcctgctgt ggattgctgc tgtgtcctgc 16380
ttatccacaa cattttgcgc acggttatgt ggacaaaata cctggttacc caggccgtgc 16440
cggcacgtta accgggctgc atccgatgca agtgtgtcgc tgtcgacgag ctcgcgagct 16500
cgattcgat 16509
<210> 26
<211> 16499
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> OGAB 载体2.1
<400> 26
gcgaccgcaa gcttgaagag ctcttctttc agaacgctcg gttgccgccg ggcgtttttt 60
atgacggtca ttacaacggt tatacgacgc cacgcgtagt gagacataca cgttcgttgg 120
atccgggttc actttggttc atgtgcagct ccatcagcaa aaggggatga taagtttatc 180
accaccgact atttgcaaca gtgccgttga tcgtgctatg atcgactgat gtcatcagcg 240
gtggagtgca atgtcgtgca atacgaatgg cgaaaagccg agctcatcgg tcagcttctc 300
aaccttgggg ttacccccgg cggtgtgctg ctggtccaca gctccttccg tagcgtccgg 360
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gggacgctcg tcatgccctc gtggtcaggt ctggacgacg agccgttcga tcctgccacg 480
tcgcccgtta caccggacct tggagttgtc tctgacacat tctggcgcct gccaaatgta 540
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tctgatccat tgcccctgcc acctcactcg cctgcaagcc cggtcgcccg tgtccatgaa 660
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gccgagttga tggcaaaggt tccctatggg gtgccgagac actgcaccat tcttcaggat 780
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gctcggttga tccgctcccg cgacattgtg gcgacagccc tgggtcaact gggccgagat 960
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tcgattggct gagctcatga gcggagaacg agatgacgtt ggaggggcaa ggtcgcgctg 1080
attgctgggg caacacgtgg agcggatcgg ggattgtctt tcttcagctc gctgatgata 1140
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gggcttcacg ttttcccagg tcagaagcgg ttttgtttcg ggtgctgggt tgttgtctct 1680
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gctgggaccc gaacgtgacc cgtgccgact tcgagcgcat gatgggcgaa gtccgcgccg 2040
gcgaaggtga cgttgtcgtt gtgaatgagc tttcccggct cactcgcaag ggcgcccatg 2100
acgcgctcga aatcgacaac gaattgaaga agcacggcgt gcgcttcatg tcggttcttg 2160
agccgttcct tgacacgtct acccctatcg gcgtcgccat tttcgcgctg atcgctgccc 2220
ttgcgaaaca ggacagtgac ctgaaggcgg agcgcctgaa gggtgcgaaa gacgagattg 2280
ccgcgctggg tggcgttcac tcgtcttccg ccccgttcgg aatgcgcgcc gtgcgcaaga 2340
aggtcgataa tctcgtgatc tccgttcttg agccggacga agacaacccg gatcacgtcg 2400
agctagttga gcgcatggcg aaaatgtcgt tcgaaggcgt gtccgacaac gccattgcaa 2460
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gcgctcaaac ggtccgatgg attctcaacc atcccgcaat cggcggtttc gcattcgagc 2640
gtgtgaagca cggtaaggcg cacatcaacg tcatacggcg cgaccccggc ggcaagccgc 2700
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ggtggcgttt cctggggtgc cgaatctgcg gcggctcaat gggtcagtcc cagggtggcc 2880
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gcggcttgtc ggtcaagcgc agcgaactgg acgaattcgt tgcttcgaag gtgtgggcac 3000
ggctccgcac agccgacatg gaagatgaac acgatcaggc atggattgcc gccgctgcgg 3060
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cgcacctaga caacgtgcgg cgctccatca aggaccttca ggcggaccgt aaggccggtc 3180
tgtacgtcgg gcgtgaagag ctggaaacgt ggcgctcaac ggtgctgcaa taccggtcct 3240
acgaagcgga gtgcacgacc cgactcgctg agcttgacga gaagatgaac ggcagcaccc 3300
gcgttccgtc tgagtggttc agcggcgaag acccgacggc cgaagggggc atctgggcaa 3360
gctgggacgt gtacgagcgt cgggagttcc tgagcttctt ccttgactcc gtcatggtcg 3420
accgggggcg ccaccctgaa accaagaaat acatccccct gaaggaccgt gtgacgctca 3480
agtgggcgga gctgctgaag gaggaagacg aagcgagcga agccactgag cgggagcttg 3540
cggcgctgta gcgagacacc cgggaagcct gatctacgtc tgtcgagaag tttcgatgac 3600
actcgttcgt tcacacgttg cagcatggat ccctcgagga gttactggcc ctgatttctc 3660
cgcttctaat accgcacatg cggccgcaag ctgtctcgac ggcgcgccta gaaacaaggc 3720
agttccgggc tgaaagtagc gccgggacta gtcttaatta acggcctgtt tggccattat 3780
gagacgccct gatgacttga cgctcgagaa ggttcacgat tagcatgccg gttacggacc 3840
tttgaggagg gctcaatgct ttccaagggc gaggaggaca acatggccat catcaaggag 3900
ttcatgcgct tcaaggtcca catggagggc tccgtcaacg ggcacgagtt cgagatcgag 3960
ggcgaggggg agggccggcc gtacgagggc acccagaccg ccaagctgaa ggtgaccaag 4020
ggcggccccc tcccgttcgc ctgggacatc ctctcccccc agttcatgta cggctcgaag 4080
gcctacgtca agcacccggc cgacatcccg gactacctga agctctcgtt cccggagggg 4140
ttcaagtggg agcgggtcat gaacttcgag gacggcggcg tcgtcaccgt cacccaggac 4200
agctccctgc aggacggcga gttcatctac aaggtcaagc tgcggggcac gaacttcccg 4260
agcgacggcc ccgtgatgca gaagaaaacg atgggctggg aagcgtcctc ggagcgcatg 4320
tacccggagg acggcgccct caagggcgag atcaagcagc gcctgaagct gaaggacggc 4380
ggccactacg acgccgaagt caagacgacg tacaaggcca agaagccggt gcagctcccg 4440
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ctggctgtta tccactgaga agcgaacgaa acagtcggga aaatctccca ttatcgtaga 4740
gatccgcatt attaatctca ggagcctgtg tagcgtttat aggaagtagt gttctgtcat 4800
gatgcctgca agcggtaaca cgatttgaat atgccttcag gaacaataga aatcttcgtg 4860
cggtgttacg ttgaagtgga gcggattatg tcagcaatgg acagaacaac ctaatgaaca 4920
cagaaccatg atgtggtctg tccttttaca gccagtagtg ctcgccgcag tcgagcgaca 4980
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cacacgatgc ctgaaaaaac ttcccttggg gttatccact tatccacggg gatattttta 5100
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cgcggggaag gaagtggttt tttatcgccc tgaagaggat gccggcgatg aaaaaggcta 5700
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gacaggatag tctgagggtt atctgtcaca gatttgaggg tggttcgtca catttgttct 6180
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catacttttt gaactgtaat ttttaaggaa gccaaatttg agggcagttt gtcacagttg 6300
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ttcgcccttc ccggtcgata tgaacagctt atttacataa ttcacgttat tggtagttat 6420
aaatgaaatt cctaatatcg gttatgaagt gaaattgaat ttctacttga tctttctctc 6480
tatttttgta aaataaaatt aagaatattt aaatattcaa tgattcattt ttgcagaaat 6540
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caagtttagg aggaattaat tatgaagtgt aatgaataat gaatgtaaca gggttcaatt 6720
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ttgcatttta tcttttttta gcgtattaaa tgaaatggtt ttgaacgtgt cattacctga 6900
tattgcaaat gattttaata aaccaccagc gagtacaaac tgggtgaaca cagcctttat 6960
gttgaccttt tccattggaa cagctgtata tggaaagcta tctgatcaat taggcatcaa 7020
aaggttactc ctatttggaa ttataataaa ttgtttcggg tcggtaattg ggtttgttgg 7080
ccattctttc ttttccttac ttattatggc tcgttttatt caaggggctg gtgcagctgc 7140
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aagaggtcct ttatacgtgt taaacatcgg agttacattt ctttctgtta gctttttaac 7800
tgcttccttt cttttagaaa caacatcatg gttcatgaca attataatcg tatttgtttt 7860
aggtgggctt tcgttcacca aaacagttat atcaacaatt gtttcaagta gcttgaaaca 7920
gcaggaagct ggtgctggaa tgagtttgct taactttacc agctttttat cagagggaac 7980
aggtattgca attgtaggtg gtttattatc cataccctta cttgatcaaa ggttgttacc 8040
tatggaagtt gatcagtcaa cttatctgta tagtaatttg ttattacttt tttcaggaat 8100
cattgtcatt agttggctgg ttaccttgaa tgtatataaa cattctcaaa gggatttcta 8160
aatcgttaag ggatcaactt tgggagagag ttcaaaattg atcctttttt tataacagga 8220
attcggcatc aaataaaacg aaaggctcag tcgaaagact gggcctttcg ttttatctgt 8280
tgtttgtcgg tgaacgctct cctgagtagg acaaatccgc cgggagcgga tttgaacgtt 8340
gcgaagcaac ggcccggagg gtggcgggca ggacgcccgc cataaactgc caggcatcaa 8400
attaagcaga aggccatcct gacggatggc ctttttgcgt ttctacaaac tcttcctgtc 8460
gtcatatcta caattctaca cagcccagtc cagactattc ggcactgaaa ttatgggtga 8520
agtggtcaag acctcactag gcaccttaaa aatagcgcac cctgaagaag atttatttga 8580
ggtagccctt gcctacctag cttccaagaa agatatccta acagcacaag agcggaaaga 8640
tgttttgttc tacatccaga acaacctctg ctaaaattcc tgaaaaattt tgcaaaaagt 8700
tgttgacttt atctacaagg tgtggcataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaattaa 8760
gctaattcta tggtaaaagc attcctgaac ccaatatcct tatttttagt ggacaaggcc 8820
ttgttctcat atggttgctt gagccagtgc cttacaaggc tcttccgctt tggcaggctg 8880
ttcaaaatta tttattagag caactcaagg aactaggcgg agatccaaaa gcaaccgatg 8940
cagcacgtgt ttttcggatt gctgggagcg tcaatagtaa gaatggagcg gaagtaagag 9000
cggaatatcg gcacgattac agatatgagt taaggcagat tcaatttgat taccttccag 9060
aactcaatga ggttattaat cccgctccac aaaagaaaaa acgggggcgt aaaaagaaag 9120
tagttcagtt attcaatacc tacaaactcc attacgctcg cctattggat atagtgaaat 9180
tggtggaact acgaaattat gaggtaactg gatacaggga aatcatttgc tttttatacc 9240
gttattggtt gtgctgttac acgaacgacc ctgtagaggc tttaaatcaa acacagacac 9300
ttaatttaca gttcactgag cctttaccct taaaagaggt tgaaagggct acacggagcg 9360
cagaaaaggc gtgggaagca cgaaataacg aagaggctaa ccggattgca atcgaaaaag 9420
gatatcccag tgctggatac aatattagca ataaaaagtt gattgaatgg ctagatatca 9480
caccagaaga acagaagcat ttacagacga ttatagacgc taatgagaaa cggagaagaa 9540
agcgggaaag ggataggatt tatcaagaac aaaaacgtcg tgagcgggga gatatgaccc 9600
gacaggagta tattaagcaa caacaggata aaacagatga taaattattt aaattgcagg 9660
agttattaga acagaatccc aaaatctcaa aaattaaatt agcaaaaata cttggtgtag 9720
ataaatcgca cttatacaga ctgctgaaac aactataact ggaaaaaatt agtgtctcat 9780
ggttcgtcgc ccttatatta tgggcgttag cctgcttgct aattggatag gtgttattgt 9840
catttcaacg tcggacgttt tggtagatga acgtcggacg ttatttgctt caatagattg 9900
ttgatgtatt aagggttgca gtgaatcgac aagcaaaaag ttatgacgtt gtgaaaaaat 9960
tgaatagaaa attggaaatt acgtcggacg ttctaactta aaaaccctgt tatatcaatg 10020
atttaaaagg aaattaacgt cataaaagac ctttctgcaa caaaagtttt tctggaagag 10080
ttgaggttat tttataggta ttatggactt ttgtagactt tttgtgtact ttttgtggac 10140
tccacactcg ctggtatcgt gttatttttt aattgagata tgaatatgga aattaaacgt 10200
tttaggcgtt ggtttggtga tgacaaaaaa ataagagtac ccgctcacaa cggatactct 10260
ttcgagaaat gtacgaaacg ctataaataa aaaataacta gatacattta cattgtatca 10320
cgtttcgtac atttctccaa taacaaattg attggaggaa tgcaaagtga ataatgaacc 10380
agtaaaacgt ggtaagaaga acagatggga attaaaccta cctataatga cttatgtagt 10440
agctgatgat tggattgata aactaggaca cgaaacgttt actttatggt tgaggttcca 10500
tacttgggta gatagagaag atgaactccg agattatgat cgcataccta gaagttttga 10560
gaacatatat aaaaagacac taggaatctc aaaaagtaag ttttatagat tgataaaacc 10620
tttatgggaa tatggattaa tagacatcat agaatacgaa gaatctaacc gtaattctac 10680
taaacctaaa aatataattg tttatgagta tcctttacac gaaatagaaa gaaagtataa 10740
accactagaa aaattaagag attgggataa agactataat tccgtttcta aagaattagg 10800
taaaacaggt ggtagaccaa ggaaaaaaga tagtgaagaa gaacccgaaa agaaacccga 10860
agaagtaact aaaaagaaac gtaaatataa gttaaaaaga gttatccaca acggtttcaa 10920
aaatgaaacg gtggagggtt tcaaaaatga aacggtggag ggtttcaaaa atgaaacggt 10980
gaccgtttca aaaataaaac ccaataatta ttcaaatatc tttaataact tatcaaatat 11040
ttctactaat gtttcaaata atttattaat tgatgatgat gaggaaatcg aaaatgaacc 11100
aactggtcgt acaataaata ggtcattact tttttcacaa gaagatatta aacaggccta 11160
tcaatttatt aatagatttt cagttataca gttacgtgaa aactttagct ttgataaaca 11220
ctttgaagaa cggttggtat gttatttatg gaaagcaggg atttctactt tttacacgca 11280
cgaaatcagt aaaatgataa aaaaaatagc agactatgaa aaatctaaaa aaggtagatt 11340
aaacccaata cgtgaccgag ccttatatat ggtaaatggt cttgtaatga atagagcttc 11400
ttcccaaagt gaacatgcta cttataaact aaaccaatat aaaaaacaga aggaacagga 11460
aaaacaacaa caggagcaac aaagatcaag agtaccgttc tataattggt tggaggaaag 11520
agaagaacaa accgaaggtc aactacccac cacttaaagc ctaacggctt ttgaagtggg 11580
gcttgtaaaa agccctagtt gactacccca agtctttcga ggactacgtt ggaaaggtca 11640
tgacacctac aaatgctcct ctagttcgta gccactgtcg ttgatggtta aaagtcctga 11700
tgggtaggga cggtgctgtc aacatcacaa gcccttccaa catgggggaa gaggaagaac 11760
actccgagaa aggagggggc tgtcgtacac gccttgttcg tgtacgtgat ttttaacact 11820
tttatctcta atataatctc tccttgagtt agcagagact aagaataaaa cacattagga 11880
ttttttatct acatgtttga gtcggctgaa agatcgtacg taccaattat tgtttcgtga 11940
ttgttcaagc cataacactg tagggatagt ggaaagagtg cttcatctgg ttacgatcaa 12000
tcaaatattc aaacggaggg acacgatttt gatgaaacca gtaacgttat acgatgtcgc 12060
agagtatgcc ggtgtctctt atcagaccgt ttcccgcgtg gtgaaccagg ccagccacgt 12120
ttctgcgaaa acgcgggaaa aagtggaagc ggcgatggcg gagctgaatt acattcccaa 12180
ccgcgtggca caacaactgg cgggcaaaca gtcgttgctg attggcgttg ccacctccag 12240
tctggccctg cacgcgccgt cgcaaattgt cgcggcgatt aaatctcgcg ccgatcaact 12300
gggtgccagc gtggtggtgt cgatggtaga acgaagcggc gtcgaagcct gtaaaacggc 12360
ggtgcacaat cttctcgcgc aacgcgtcag tgggctgatc attaactatc cgctggatga 12420
ccaggatgcc attgctgtgg aagctgcctg cactaatgtt ccggcgttat ttcttgatgt 12480
ctctgaccag acacccatca acagtattat tttctcccat gaagatggta cgcgactggg 12540
cgtggagcat ctggtcgcat tgggtcacca gcaaatcgcg ctgttagcgg gcccattaag 12600
ttctgtctcg gcgcgtctgc gtctggctgg ctggcataaa tatctcactc gcaatcaaat 12660
tcagccgata gcggaacggg aaggcgactg gagtgccatg tccggttttc aacaaaccat 12720
gcaaatgctg aatgagggca tcgttcccac tgcgatgctg gttgccaacg atcagatggc 12780
gctgggcgca atgcgcgcca ttaccgagtc cgggctgcgc gttggtgcgg atatctcggt 12840
agtgggatac gacgataccg aagatagctc atgttatatc ccgccgctta ccaccatcaa 12900
acaggatttt cgcctgctgg ggcaaaccag cgtggaccgc ttgctgcaac tctctcaggg 12960
ccaggcggtg aagggcaatc agctgttgcc cgtgtcactg gtgaaaagaa aaaccaccct 13020
ggcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 13080
acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagg 13140
atcgctacct taagagacac gcgttatcgg gggttagttc gtcatcattg atgagggttg 13200
attatcacag tttattactc tgaattggct atccgcgtgt gtacctctac ctggagtttt 13260
tcccacggtg gatatttctt cttgcgctga gcgtaagagc tatctgacag aaacagttct 13320
tctttgcttc ctcgccagtt cgctcgctat gctcggttac acggctgcgg cgagcgctag 13380
tggataataa gtgactgagg tatgtgctct tcttatctcc ttttgtagtg ttgctcttat 13440
tttaaacaac tttgcggttt tttgatgact ttgcgatttt gttgttgctt tgcagtaaat 13500
tgcaagattt aataaaaaaa cgcaaagcaa tgattaaagg atgttcagaa tgaaactcat 13560
ggaaacactt aaccagtgca taaacgctgg tcatgaaatg acgaaggcta tcgccattgc 13620
acagtttaat gatgacagcc cggaagcgag gaaaataacc cggcgctgga gaataggtga 13680
agcagcggat ttagttgggg tttcttctca ggctatcaga gatgccgaga aagcagggcg 13740
actaccgcac ccggatatgg aaattcgagg acgggttgag caacgtgttg gttatacaat 13800
tgaacaaatt aatcatatgc gtgatgtgtt tggtacgcga ttgcgacgtg ctgaggacgt 13860
atttccaccg gtgatcgggg ttgctgccca taaaggtggc gtttacaaaa cctcagtttc 13920
tgttcatctt gctcaggatc tggctctgaa ggggctacgt gttttgctcg tggaaggtaa 13980
cgacccccag ggaacagcct caatgtatca cggatgggta ccagatcttc atattcatgc 14040
agaggacact ctcctgcctt tctatcttgg ggaaaaggac gatgtcactt atgcaataaa 14100
gcccacttgc tggccggggc ttgacattat tccttcctgt ctggctctgc accgtattga 14160
aactgagtta atgggcaaat ttgatgaagg taaactgccc accgatccac acctgatgct 14220
ccgactggcc attgaaactg ttgctcatga ctatgatgtc atagttattg acagcgcgcc 14280
taacctgggt atcggcacga ttaatgtcgt atgtgctgct gatgtgctga ttgttcccac 14340
gcctgctgag ttgtttgact acacctccgc actgcagttt ttcgatatgc ttcgtgatct 14400
gctcaagaac gttgatctta aagggttcga gcctgatgta cgtattttgc ttaccaaata 14460
cagcaatagt aatggctctc agtccccgtg gatggaggag caaattcggg atgcctgggg 14520
aagcatggtt ctaaaaaatg ttgtacgtga aacggatgaa gttggtaaag gtcagatccg 14580
gatgagaact gtttttgaac aggccattga tcaacgctct tcaactggtg cctggagaaa 14640
tgctctttct atttgggaac ctgtctgcaa tgaaattttc gatcgtctga ttaaaccacg 14700
ctgggagatt agataatgaa gcgtgcgcct gttattccaa aacatacgct caatactcaa 14760
ccggttgaag atacttcgtt atcgacacca gctgccccga tggtggattc gttaattgcg 14820
cgcgtaggag taatggctcg cggtaatgcc attactttgc ctgtatgtgg tcgggatgtg 14880
aagtttactc ttgaagtgct ccggggtgat agtgttgaaa agacctctcg ggtatggtca 14940
ggtaatgaac gtgaccagga gctgcttact gaggacgcac tggatgatct catcccttct 15000
tttctactga ctggtcaaca gacaccggcg ttcggtcgaa gagtatctgg tgtcatagaa 15060
attgccgatg ggagtcgccg tcgtaaagct gctgcactta ccgaaagtga ttatcgtgtt 15120
ctggttggcg agctggatga tgagcagatg gctgcattat ccagattggg taacgattat 15180
cgcccaacaa gtgcttatga acgtggtcag cgttatgcaa gccgattgca gaatgaattt 15240
gctggaaata tttctgcgct ggctgatgcg gaaaatattt cacgtaagat tattacccgc 15300
tgtatcaaca ccgccaaatt gcctaaatca gttgttgctc ttttttctca ccccggtgaa 15360
ctatctgccc ggtcaggtga tgcacttcaa aaagccttta cagataaaga ggaattactt 15420
aagcagcagg catctaacct tcatgagcag aaaaaagctg gggtgatatt tgaagctgaa 15480
gaagttatca ctcttttaac ttctgtgctt aaaacgtcat ctgcatcaag aactagctta 15540
agctcacgac atcagtttgc tcctggagcg acagtattgt ataagggcga taaaatggtg 15600
cttaacctgg acaggtcccg tgttccaact gagtgtatag agaaaattga ggccattctt 15660
aaggaacttg aaaagccagc accctgatgc gaccacgttt tagtctacgt ttatctgtct 15720
ttacttaatg tcctttgtta caggccagaa agcataactg gcctgaatat tctctctggg 15780
cccactgttc cacttgtatc gtcggtctga taatcagact gggaccacgg tcccactcgt 15840
atcgtcggtc tgattattag tctgggacca cggtcccact cgtatcgtcg gtctgattat 15900
tagtctggga ccacggtccc actcgtatcg tcggtctgat aatcagactg ggaccacggt 15960
cccactcgta tcgtcggtct gattattagt ctgggaccat ggtcccactc gtatcgtcgg 16020
tctgattatt agtctgggac cacggtccca ctcgtatcgt cggtctgatt attagtctgg 16080
aaccacggtc ccactcgtat cgtcggtctg attattagtc tgggaccacg gtcccactcg 16140
tatcgtcggt ctgattatta gtctgggacc acgatcccac tcgtgttgtc ggtctgatta 16200
tcggtctggg accacggtcc cacttgtatt gtcgatcaga ctatcagcgt gagactacga 16260
ttccatcaat gcctgtcaag ggcaagtatt gacatgtcgt cgtaacctgt agaacggagt 16320
aacctcggtg tgcggttgta tgcctgctgt ggattgctgc tgtgtcctgc ttatccacaa 16380
cattttgcgc acggttatgt ggacaaaata cctggttacc caggccgtgc cggcacgtta 16440
accgggctgc atccgatgca agtgtgtcgc tgtcgacgag ctcgcgagct cgattcgat 16499
<210> 27
<211> 19758
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> OGAB 载体 2.2
<400> 27
ttcagaacgc tcggttgccg ccgggcgttt tttatgagac gtctcggcct gtttggccat 60
tatgacggtc attacaacgg ttatacgacg ccacgcgtag tgagacatac acgttcgttg 120
gatccgggtt cactttggtt catgtgcagc tccatcagca aaaggggatg ataagtttat 180
caccaccgac tatttgcaac agtgccgttg atcgtgctat gatcgactga tgtcatcagc 240
ggtggagtgc aatgtcgtgc aatacgaatg gcgaaaagcc gagctcatcg gtcagcttct 300
caaccttggg gttacccccg gcggtgtgct gctggtccac agctccttcc gtagcgtccg 360
gcccctcgaa gatgggccac ttggactgat cgaggccctg cgtgctgcgc tgggtccggg 420
agggacgctc gtcatgccct cgtggtcagg tctggacgac gagccgttcg atcctgccac 480
gtcgcccgtt acaccggacc ttggagttgt ctctgacaca ttctggcgcc tgccaaatgt 540
aaagcgcagc gcccatccat ttgcctttgc ggcagcgggg ccacaggcag agcagatcat 600
ctctgatcca ttgcccctgc cacctcactc gcctgcaagc ccggtcgccc gtgtccatga 660
actcgatggg caggtacttc tcctcggcgt gggacacgat gccaacacga cgctgcatct 720
tgccgagttg atggcaaagg ttccctatgg ggtgccgaga cactgcacca ttcttcagga 780
tggcaagttg gtacgcgtcg attatctgga gaatgaccac tgctgtgagc gctttgcctt 840
ggcggacagg tggctcaagg agaagagcct tcagaaggaa ggtccagtcg gtcatgcctt 900
tgctcggttg atccgctccc gcgacattgt ggcgacagcc ctgggtcaac tgggccgaga 960
tccgttgatc ttcctgcatc cgccagaggc gggatgcgaa gaatgcgatg ccgctcgcca 1020
gtcgattggc tgagctcatg agcggagaac gagatgacgt tggaggggca aggtcgcgct 1080
gattgctggg gcaacacgtg gagcggatcg gggattgtct ttcttcagct cgctgatgat 1140
atgccttcct ggttggcttg gtttcatcag ccatccgctt gccctcatct gttacgccgg 1200
cggtagccgg ccagcctcgc agagcaggat tcccgttgag caccgccagg tgcgaataag 1260
ggacagtgaa gaaggaacac ccgctcgcgg gtgggcctac ttcacctatc ctgcccggct 1320
gacgccgttg gatacaccaa ggaaagtcta cacgaaccct ttggcaaaat cctgtatatc 1380
gtgcgaaaaa ggatggatat accgaaaaaa tcgctataat gaccccgaag cagggttatg 1440
cagcggaaaa gatccgtcga cctgcaggca tgcaagctct agcgattcca gacgtcccga 1500
aggcgtggcg cggcttcccc gtgccggagc aatcgccctg ggtgggttac acgacgcccc 1560
tctatggccc gtactgacgg acacaccgaa gccccggcgg caaccctcag cggatgcccc 1620
ggggcttcac gttttcccag gtcagaagcg gttttgtttc gggtgctggg ttgttgtctc 1680
tggacagtga tccatgggaa actactcagc accaccaatg ttcccaaaag aaagcgcagg 1740
tcagcgccca tgagccaaga tctaggcatg tcgcccttca tcgctcccga cgtccctgag 1800
caccttctag acactgttcg cgtcttcctg tacgcgcgtc agtctaaggg ccggtccgac 1860
ggctcagacg tgtcgaccga agcacagcta gcggccggtc gtgcgttggt cgcctctcgc 1920
aacgcccagg ggggtgcgcg ctgggtcgtg gcaggcgagt tcgtggacgt cgggcgctcc 1980
ggctgggacc cgaacgtgac ccgtgccgac ttcgagcgca tgatgggcga agtccgcgcc 2040
ggcgaaggtg acgttgtcgt tgtgaatgag ctttcccggc tcactcgcaa gggcgcccat 2100
gacgcgctcg aaatcgacaa cgaattgaag aagcacggcg tgcgcttcat gtcggttctt 2160
gagccgttcc ttgacacgtc tacccctatc ggcgtcgcca ttttcgcgct gatcgctgcc 2220
cttgcgaaac aggacagtga cctgaaggcg gagcgcctga agggtgcgaa agacgagatt 2280
gccgcgctgg gtggcgttca ctcgtcttcc gccccgttcg gaatgcgcgc cgtgcgcaag 2340
aaggtcgata atctcgtgat ctccgttctt gagccggacg aagacaaccc ggatcacgtc 2400
gagctagttg agcgcatggc gaaaatgtcg ttcgaaggcg tgtccgacaa cgccattgca 2460
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cgtgtgaagc acggtaaggc gcacatcaac gtcatacggc gcgaccccgg cggcaagccg 2700
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tccgggaaga atctcagcga ccggaagcct ggggccgaag tcgaaccgac gcttctgagc 2820
gggtggcgtt tcctggggtg ccgaatctgc ggcggctcaa tgggtcagtc ccagggtggc 2880
cgtaagcgca acggcgacct tgccgaaggc aattacatgt gcgccaaccc gaaggggcac 2940
ggcggcttgt cggtcaagcg cagcgaactg gacgaattcg ttgcttcgaa ggtgtgggca 3000
cggctccgca cagccgacat ggaagatgaa cacgatcagg catggattgc cgccgctgcg 3060
gagcgcttcg cccttcagca cgacctagcg ggggtggccg atgagcggcg cgaacaacag 3120
gcgcacctag acaacgtgcg gcgctccatc aaggaccttc aggcggaccg taaggccggt 3180
ctgtacgtcg ggcgtgaaga gctggaaacg tggcgctcaa cggtgctgca ataccggtcc 3240
tacgaagcgg agtgcacgac ccgactcgct gagcttgacg agaagatgaa cggcagcacc 3300
cgcgttccgt ctgagtggtt cagcggcgaa gacccgacgg ccgaaggggg catctgggca 3360
agctgggacg tgtacgagcg tcgggagttc ctgagcttct tccttgactc cgtcatggtc 3420
gaccgggggc gccaccctga aaccaagaaa tacatccccc tgaaggaccg tgtgacgctc 3480
aagtgggcgg agctgctgaa ggaggaagac gaagcgagcg aagccactga gcgggagctt 3540
gcggcgctgt agcgagacac ccgggaagcc tgatctacgt ctgtcgagaa gtttcgatga 3600
cactcgttcg ttcacacgtt gcagcatgga tccctcgagg agttactggc cctgatttct 3660
ccgcttctaa taccgcacat gcggccgcaa gctgtctcga cggcgcgcct agaaacaagg 3720
cagttccggg ctgaaagtag cgccgggact aggccattcc gcctgacctt taacggcctg 3780
tttggccatt atgagacgtt tattaaagtg caggtgtttg ccctgatgac ttgacgctcg 3840
agaaggttca cgattagcat gccggttacg gacctttgag gagggctcaa tgctttccaa 3900
gggcgaggag gacaacatgg ccatcatcaa ggagttcatg cgcttcaagg tccacatgga 3960
gggctccgtc aacgggcacg agttcgagat cgagggcgag ggggagggcc ggccgtacga 4020
gggcacccag accgccaagc tgaaggtgac caagggcggc cccctcccgt tcgcctggga 4080
catcctctcc ccccagttca tgtacggctc gaaggcctac gtcaagcacc cggccgacat 4140
cccggactac ctgaagctct cgttcccgga ggggttcaag tgggagcggg tcatgaactt 4200
cgaggacggc ggcgtcgtca ccgtcaccca ggacagctcc ctgcaggacg gcgagttcat 4260
ctacaaggtc aagctgcggg gcacgaactt cccgagcgac ggccccgtga tgcagaagaa 4320
aacgatgggc tgggaagcgt cctcggagcg catgtacccg gaggacggcg ccctcaaggg 4380
cgagatcaag cagcgcctga agctgaagga cggcggccac tacgacgccg aagtcaagac 4440
gacgtacaag gccaagaagc cggtgcagct cccggacgcc tacaacgtga acatcaagct 4500
cgacatcacc tcgcacaacg aggactacac gatcgtggag cagtacgagc gcgccgaggg 4560
ccggcactcg accggcggca tggacgagct gtacaagtga tgatttcacc tgcacttaaa 4620
atttcgtctc taaaatcccc ggataactgc cttaaaggct aggtggaggc tcaaaaaggc 4680
cttcttggcc accccgggcc gtcgaccaat tctcatgttt gacagcttat catcgaattt 4740
ctgccattca tccgcttatt atcacttatt caggcgtagc aaccaggcgt ttaagggcac 4800
caataactgc cttaaaaaaa ttacgccccg ccctgccact catcgcagta ctgttgtaat 4860
tcattaagca ttctgccgac atggaagcca tcacaaacgg catgatgaac ctgaatcgcc 4920
agcggcatca gcaccttgtc gccttgcgta taatatttgc ccatggtgaa aacgggggcg 4980
aagaagttgt ccatattggc cacgtttaaa tcaaaactgg tgaaactcac ccagggattg 5040
gctgagacga aaaacatatt ctcaataaac cctttaggga aataggccag gttttcaccg 5100
taacacgcca catcttgcga atatatgtgt agaaactgcc ggaaatcgtc gtggtattca 5160
ctccagagcg atgaaaacgt ttcagtttgc tcatggaaaa cggtgtaaca agggtgaaca 5220
ctatcccata tcaccagctc accgtctttc attgccatac ggaattccgg atgagcattc 5280
atcaggcggg caagaatgtg aataaaggcc ggataaaact tgtgcttatt tttctttacg 5340
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gactgaaatg cctcaaaatg ttctttacga tgccattggg atatatcaac ggtggtatat 5460
ccagtgattt ttttctccat tttagcttcc ttagctcctg aaaatctcga taactcaaaa 5520
aatacgcccg gtagtgatct tatttcatta tggtgaaagt tggaacctct tacgtgccga 5580
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ggaagtctac acgaaggttt ttgcgctgga tgtggctgcc cggcaccggg tgcagtttgc 6000
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cattttgata tcaaaggaat tatactaatg tctgtaggca ttgtattttt tatgttgttt 8880
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ctcatggttc gtcgccctta tattatgggc gttagcctgc ttgctaattg gataggtgtt 11280
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ctgatgtgct gattgttccc acgcctgctg agttgtttga ctacacctcc gcactgcagt 17160
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ggcgcctgag ttacaccctc ggcctggagg gcccttccct gaccattgat actgcctgca 2760
gttccagcct ggtagcgttg catgaggcgt gccaagcatt gcgtacgggt gactgcgata 2820
tggcactgac aggcggcgtg acggtaatgc cttctacagg catgctggtc gagttttcgc 2880
gtcagcgtgg tctgtcacct gatggccgtt gtaaagcctt tagtgcgtca gctgatggct 2940
ttgggctggc agaaggggtt ggtatgcttg ttgtggaacg cttgagcgac gcacgtcgcc 3000
tcgggcatcg tgtgcttgcc gtggttcgcg gttcagcggt taatcaagat ggggccagta 3060
atggtctgtc ggcaccatcc ggcccggcac aacagcgtgt tattcgtcaa gcgcttgtga 3120
atgcgggtgt ccaggcctct caagtggacg tggttgaagc tcatggtacc ggcactaagc 3180
ttggtgatcc aattgaagcg caggcgcttc aggccactta tggtcaaggc cgcccggcag 3240
aacgtccttt gtggctcgga tctctgaaaa gcaatattgg gcatgcacaa gcagcggcgg 3300
gtgttggtgg cgttatcaaa atggttatgg cactgcgcga gggcgtactt ccccctacgc 3360
ttcatgctga ttgagacgag gctaggtgga ggctcagtga tgataagtct gcgatggtgg 3420
atgcatgtgt catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cagagggcac 3480
aatcctattc cgcgctatcc gacaatctcc aagacattag gtggagttca gttcggcgta 3540
tggcatatgt cgctggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 3600
aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 3660
atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 3720
cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 3780
ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca 3840
gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 3900
accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 3960
cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 4020
cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct 4080
gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 4140
aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 4200
aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcta ttcaacaaag 4260
ccgccgtccc gtcaagtcag cgtaaatggg tagggggctt caaatcgtcc tcgtgatacc 4320
aattcggagc ctgctttttt gtacaaactt gttgataatg gcaattcaag gatcttcacc 4380
tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact 4440
tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt 4500
cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta 4560
ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagagccac gctcaccggc tccagattta 4620
tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc 4680
gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat 4740
agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt 4800
atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg 4860
tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca 4920
gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta 4980
agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg 5040
cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact 5100
ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg 5160
ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt 5220
actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga 5280
ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc 5340
atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa 5400
caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccag atacctgaaa caaaacccat 5460
cgtacggcca aggaagtctc caataactgt gatccaccac aagcgccagg gttttcccag 5520
tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtcat gcataatccg cacgcatctg gaataaggaa 5580
gtgccattcc gcctgacctc gtctcaatta gcacctgctt ggattaacta c 5631
<210> 38
<211> 5426
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> pSYN0002 载体
<400> 38
cgagacaccc gggaagcctg atctacgtct gtcgagaagt ttcgatgaca ctcgttcgtt 60
cacacgttgc agcagattac gagaccacta gtgctgctcc ttcggtcgga cgtgcgtcta 120
cgggcacctt accgcagccg tcggctgtgc gacacggacg gatcgggcga actggccgat 180
gctgggagaa gcgcgctgct gtacggcgcg caccgggtgc ggagcccctc ggcgagcggt 240
gtgaaacttc tgtgaatggc ctgttcggtt gcttttttta tacggctgcc agataaggct 300
tgcagcatct gggcggctac cgctatgatc ggggcgttcc tgcaattctt agtgcgagta 360
tctgaaaggg gatacgccat atgctttcca agggcgagga ggacaacatg gccatcatca 420
aggagttcat gcgcttcaag gtccacatgg agggctccgt caacgggcac gagttcgaga 480
tcgagggcga gggggagggc cggccgtacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga 540
ccaagggcgg ccccctcccg ttcgcctggg acatcctctc cccccagttc atgtacggct 600
cgaaggccta cgtcaagcac ccggccgaca tcccggacta cctgaagctc tcgttcccgg 660
aggggttcaa gtgggagcgg gtcatgaact tcgaggacgg cggcgtcgtc accgtcaccc 720
aggacagctc cctgcaggac ggcgagttca tctacaaggt caagctgcgg ggcacgaact 780
tcccgagcga cggccccgtg atgcagaaga aaacgatggg ctgggaagcg tcctcggagc 840
gcatgtaccc ggaggacggc gccctcaagg gcgagatcaa gcagcgcctg aagctgaagg 900
acggcggcca ctacgacgcc gaagtcaaga cgacgtacaa ggccaagaag ccggtgcagc 960
tcccggacgc ctacaacgtg aacatcaagc tcgacatcac ctcgcacaac gaggactaca 1020
cgatcgtgga gcagtacgag cgcgccgagg gccggcactc gaccggcggc atggacgagc 1080
tgtacaagtg agccgttcgc gccgccccgg ctcgcatcgt ccccgacccg tcaacctcat 1140
ccgcaaggag tctctagagg atccgcggcc gcgcgcgata tcgaattcct ggtctccaaa 1200
agagtaactt aagccgaaca ggaagcacag ctcctactga acatgtgagc aaaaggccag 1260
caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc 1320
cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta 1380
taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg 1440
ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc 1500
tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac 1560
gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac 1620
ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg 1680
aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga 1740
agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt 1800
agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag 1860
cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct 1920
gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg 1980
atcttcacct agatcctttt ggttcatgtg cagctccatc agcaaaaggg gatgataagt 2040
ttatcaccac cgactatttg caacagtgcc gttgatcgtg ctatgatcga ctgatgtcat 2100
cagcggtgga gtgcaatgtc gtgcaatacg aatggcgaaa agccgagctc atcggtcagc 2160
ttctcaacct tggggttacc cccggcggtg tgctgctggt ccacagctcc ttccgtagcg 2220
tccggcccct cgaagatggg ccacttggac tgatcgaggc cctgcgtgct gcgctgggtc 2280
cgggagggac gctcgtcatg ccctcgtggt caggtctgga cgacgagccg ttcgatcctg 2340
ccacgtcgcc cgttacaccg gaccttggag ttgtctctga cacattctgg cgcctgccaa 2400
atgtaaagcg cagcgcccat ccatttgcct ttgcggcagc ggggccacag gcagagcaga 2460
tcatctctga tccattgccc ctgccacctc actcgcctgc aagcccggtc gcccgtgtcc 2520
atgaactcga tgggcaggta cttctcctcg gcgtgggaca cgatgccaac acgacgctgc 2580
atcttgccga gttgatggca aaggttccct atggggtgcc gagacactgc accattcttc 2640
aggatggcaa gttggtacgc gtcgattatc tcgagaatga ccactgctgt gagcgctttg 2700
ccttggcgga caggtggctc aaggagaaga gccttcagaa ggaaggtcca gtcggtcatg 2760
cctttgctcg gttgatccgc tcccgcgaca ttgtggcgac agccctgggt caactgggcc 2820
gagatccgtt gatcttcctg catccgccag aggcgggatg cgaagaatgc gatgccgctc 2880
gccagtcgat tggctgagct catgagcgga gaacgagatg acgttggagg ggcaaggtcg 2940
cgctgattgc tggggcaaca cgtggagcgg atcggggatt gtctttcttc agctcgctga 3000
tgatatgcct tcctggttgg cttggtttca tcagccatcc gcttgccctc atctgttacg 3060
ccggcggtag ccggccagcc tcgcagagca ggattcccgt tgagcaccgc caggtgcgaa 3120
taagggacag tgaagaagga acacccgctc gcgggtgggc ctacttcacc tatcctgccc 3180
ggctgacgcc gttggataca ccaaggaaag tctacacgaa ccctttggca aaatcctgta 3240
tatcgtgcga aaaaggatgg atataccgaa aaaatcgcta taatgacccc gaagcagggt 3300
tatgcagcgg aaaagatccg tcgacctgca ggcatgcaag ctctagcgat tccagacgtc 3360
ccgaaggcgt ggcgcggctt ccccgtgccg gagcaatcgc cctgggtggg ttacacgacg 3420
cccctctatg gcccgtactg acggacacac cgaagccccg gcggcaaccc tcagcggatg 3480
ccccggggct tcacgttttc ccaggtcaga agcggttttc gggagtagtg ccccaactgg 3540
ggtaaccttt gagttctctc agttgggggc gtagggtcgc cgacatgaca caaggggttg 3600
tgaccggggt ggacacgtac gcgggtgctt acgaccgtca gtcgcgcgag cgcgaaaatt 3660
cgagcgcagc aagcccagcg acacagcgta gcgccaacga ggacaaggcg gccgaccttc 3720
agcgcgaagt cgagcgcgac gggggccggt tcaggttcgt cgggcatttc agcgaagcgc 3780
cgggcacgtc ggcgttcggg acggcggagc gcccggagtt cgaacgcatc ctgaacgaat 3840
gccgcgccgg gcggctcaac atgatcattg tctatgacgt gtcgcgcttc tcgcgcctga 3900
aggtcatgga cgcgattccg attgtctcgg aattgctcgc cctgggcgtg acgattgttt 3960
ccactcagga aggcgtgttc cggcagggaa acgtcatgga cctgattcac ctgattatgc 4020
ggctcgacgc gtcgcacaaa gaatcttcgc tgaagtcggc gaagattctc gacacgaaga 4080
accttcagcg cgaattgggc gggtacgtcg gcgggaaggc gccttacggc ttcgagcttg 4140
tttcggagac gaaggagatc acgcgcaacg gccgaatggt caatgtcgtc atcaacaagc 4200
ttgcgcactc gaccactccc cttaccggac ccttcgagtt cgagcccgac gtaatccggt 4260
ggtggtggcg tgagatcaag acgcacaagc accttccctt caagccgggc agtcaagccg 4320
ccattcaccc gggcagcatc acggggcttt gtaagcgcat ggacgctgac gccgtgccga 4380
cccggggcga gacgattggg aagaaaaccg cttcaagcgc ctgggacccg gcaaccgtta 4440
tgcgaatcct tcgggacccg cgtattgcgg gcttcgccgc tgaggtgatc tacaagaaga 4500
agccggacgg cacgccgacc acgaagattg agggttaccg cattcagcgc gacccgatca 4560
cgctccggcc ggtcgagctt gattgcggac cgatcatcga gcccgctgag tggtatgagc 4620
ttcaggcgtg gttggacggc agggggcgcg gcaaggggct ttcccggggg caagccattc 4680
tgtccgccat ggacaagctg tactgcgagt gtggcgccgt catgacttcg aagcgcgggg 4740
aagaatcgat caaggactct taccgctgcc gtcgccggaa ggtggtcgac ccgtccgcac 4800
ctgggcagca cgaaggcacg tgcaacgtca gcatggcggc actcgacaag ttcgttgcgg 4860
aacgcatctt caacaagatc aggcacgccg aaggcgacga agagacgttg gcgcttctgt 4920
gggaagccgc ccgacgcttc ggcaagctca ctgaggcgcc tgagaagagc ggcgaacggg 4980
cgaaccttgt tgcggagcgc gccgacgccc tgaacgccct tgaagagctg tacgaggacc 5040
gcgcggcagg cgcgtacgac ggacccgttg gcaggaagca cttccggaag caacaggcag 5100
cgctgacgct ccggcagcaa ggggcggaag agcggcttgc cgaacttgaa gccgccgaag 5160
ccccgaagct tccccttgac caatggttcc ccgaggacgc cgacgctgac ccgaccggcc 5220
ctaagtcgtg gtgggggcgc gcgtcagtag acgacaagcg cgtgttcgtc gggctcttcg 5280
tagacaagat cgttgtcacg aagtcgacta cgggcagggg gcagggaacg cccatcgaga 5340
agcgcgcttc gatcacgtgg gcgaagccgc cgaccgacga cgacgaggac gacgcccagg 5400
acggcacgga ggacgtagcg gcgtag 5426

Claims (11)

1.一种方法,具体是一种制备包含编码多模块生物合成酶的多个基因在内的基因簇构建体的方法,
其包括以下工序:
(A)制备可重构所述基因簇构建体并具有可交替连接结构的多个DNA片段的工序;
(B)通过将工序(A)中制备的多个DNA片段在溶液中混合来交替连接多个DNA片段,从而得到基因簇构建体的工序。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述DNA片段各自包含在质粒中,并且还包括由所述质粒制备所述工序(A)的DNA片段的工序。
3.一种方法,具体是一种制备包含编码多模块生物合成酶的多个基因在内的基因簇构建体的方法,
其包括以下工序:
(P)制备包含具有可交替连接的结构的多个DNA片段在内的多种质粒的工序;
(A1)分别用适合的限制性核酸内切酶处理多种所述质粒,并制备多种DNA片段的混合液的工序;
以及(B1)使用在工序(A1)中得到的DNA片段的混合液,使DNA片段再聚集以得到所述基因簇构建体的工序。
4.根据权利要求3所述的方法,其中,在所述工序(P)中,制备包含多个DNA片段的多种质粒,该DNA片段具有能够通过使用枯草芽孢杆菌来交替连接的结构。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中,所述多模块生物合成酶是模块化聚酮合酶(PKS)。
6.根据权利要求3所述的方法,其中,所述限制性核酸内切酶是TypeII限制性核酸内切酶。
7.一种制备质粒组合文库的方法,其中,将通过权利要求1至6中任一项所述的方法制备的所述基因簇构建体转化为枯草芽孢杆菌,并从枯草芽孢杆菌中回收质粒DNA。
8.根据权利要求3所述的方法,其中,选择多种通过权利要求7所述的制备方法来得到的质粒,将其作为所述工序(A1)中的质粒进行再利用,并实施所述工序(A1)和所述工序(B1)。
9.一种通过权利要求7所述的制备方法来得到的质粒组合文库。
10.一种通过将权利要求9所述的质粒转化到宿主细胞中来制备多模块生物合成酶的方法。
11.根据权利要求10所述的方法,其中,所述宿主细胞是Streptomyces属的微生物。
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