KR102319845B1 - 조류 숙주 세포에 대한 crispr-cas 시스템 - Google Patents

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요하네스 안드리스 라우보스
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디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
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    • C12Q2521/301—Endonuclease

Abstract

본 발명은 분자 생물학 및 세포 생물학의 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 라비린툴로마이세테스(Labyrinthulomycetes) 숙주 세포에 대한 CRISPR-Cas 시스템에 관한 것이다.

Description

조류 숙주 세포에 대한 CRISPR-CAS 시스템
관련 출원의 상호 참조
본원은 2016년 7월 13일자로 출원된 미국 가 특허출원 제 62/361,741 호를 우선권 주장하며, 상기 출원의 내용은 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다.
기술 분야
본 명세는 분자 생물학 및 세포 생물학의 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 조류 라비린툴로마이세테스(Labyrinthulomycetes) 숙주 세포에 대한 CRISPR-Cas 시스템에 관한 것이다.
게놈 기법 및 분석 방법에 있어서 최근의 진보는 다양한 범위의 생물학적 기능 및 질병과 관련된 유전인자를 분류하고 맵핑하는 능력을 현저하게 가속화하였다. 개별적인 유전요소의 선택적인 섭동을 허용함으로써 원인 유전변이의 체계적인 역공학을 가능하게 할 뿐만 아니라 합성 생물학, 생물공학, 및 의학적 응용을 진보시키기 위해서는 정밀 게놈 공학 기술이 필요하다. 게놈-편집 기법, 예를 들어 디자이너 아연 집게, 전사 활성자-형 효과기 뉴클레아제(TALEN), 또는 귀소 메가뉴클레아제를 표적화된 게놈 섭동의 생성에 이용할 수 있지만, 입수 가능하고, 셋업이 용이하며, 규모조정이 가능하고, 게놈내 다중 위치의 표적화가 가능한 신규의 게놈 공학 기술이 여전히 필요하다. 상기 메가뉴클레아제의 공학은 상기 효소의 DNA 인식 및 절단 기능이 단일 도메인 중에 뒤얽혀있기 때문에 대부분의 학술 연구가들에게는 도전이었다. 조작된 아연 집게 배열의 확고한 제작도 또한 배열 중 개별적인 집게 도메인들간의 상황 의존적인 영향을 해명할 필요성으로 인해 많은 실험실들의 경우 어려운 것으로 입증되었다.
따라서 다수의 응용과 함께 숙주 세포내 특정 서열의 표적화를 위한 대안의 확고한 기법에 대한 급박한 필요성이 존재한다. 상기 기술적 문제에 대한 해법은 특허청구범위에서 특성화된 실시태양들에 의해 제공된다.
본원은, 표적-특이적인 서열에 대한 맞춤 단백질의 생성이 필요한 것이 아니라 오히려 특정한 폴리뉴클레오타이드 표적을 인식하도록 안내-폴리뉴클레오타이드에 의해 프로그램화될 수 있는 단일 Cas 효소를 필요로 하는 CRISPR-Cas 시스템을 기본으로 한다; 즉 상기 Cas 효소를 상기 안내-폴리뉴클레오타이드 분자를 사용하여 특정한 폴리뉴클레오타이드 표적에 모집할 수 있다. 상기 CRISPR-Cas 시스템을 게놈 기법 및 분석 방법의 레퍼토리에 첨가하는 것은 분자 생물학 분야에서 기존의 방법들을 현저하게 단순화시킬 수 있다.
본 발명은 안내-폴리뉴클레오타이드 및 Cas 단백질을 포함하는 CRISPR-Cas 시스템의 소스를 포함하는 비-천연 또는 조작된 조성물을 제공하며, 여기에서 상기 안내-폴리뉴클레오타이드는 근본적으로 숙주 세포 중의 표적-폴리뉴클레오타이드의 역 보체인 서열을 포함하고 상기 안내-폴리뉴클레오타이드는 상기 숙주 세포 중의 표적-폴리뉴클레오타이드에서 상기 Cas 단백질의 결합을 지시하여 CRISPR-Cas 복합체를 형성시킬 수 있다.
본 발명은 또한 숙주 세포를 본 발명에 따른 조성물과 접촉시킴을 포함하는, 세포에서 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하는 방법에 관한 것이며, 여기에서 상기 안내-폴리뉴클레오타이드는 상기 숙주 세포 중의 표적-폴리뉴클레오타이드에서 상기 Cas 단백질의 결합을 지시하여 CRISPR-Cas 복합체를 형성시킨다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 숙주 세포를 본 발명에 따른 조성물과 접촉시킴을 포함하는, 숙주 세포의 생성 방법에 관한 것이며, 여기에서 상기 안내-폴리뉴클레오타이드는 상기 숙주 세포 중의 표적-폴리뉴클레오타이드에서 상기 Cas 단백질의 결합을 지시하여 CRISPR-Cas 복합체를 형성시킨다.
본 발명은 또한 관심 화합물에 도움이 되는 조건하에서 본 발명에 따른 숙주 세포를 배양하고 임의로 상기 관심 화합물을 정제 또는 단리시킴을 포함하는, 상기 관심 화합물의 생성 방법에 관한 것이다.
본 명세의 성질, 목적, 및 장점을 더욱 이해하기 위해서, 하기 도면과 함께 하기 상세한 설명을 참조할 것이며, 여기에서 같은 참조번호는 같은 요소를 나타낸다.
도 1은 전형적인 안내-폴리뉴클레오타이드의 예들을 묘사한다. 2개의 안내-폴리뉴클레오타이드는 모두 안내-서열(crRNA) 및 안내-폴리뉴클레오타이드 구조 성분을 포함하는 안내-RNA들이다. 상부 도면에서, 상기 안내-폴리뉴클레오타이드 구조 성분은 서로에 대해 하이브리드화된 2개의 별도의 분자들로 구성되며; 상기 개별적인 성분을 tracr 서열 및 tracr-짝 서열이라 칭할 수 있다. 하부 도면에서, 상기 안내-폴리뉴클레오타이드 구조 성분은 내부 하이브리드화를 갖는 단일 분자로 구성된다. 본 도면은 문헌[Sander and Joung, 2014 and Mali et al., Nat Methods.10(10):957-63, 2013]으로부터 적합화되었다.
도 2는 안내-폴리뉴클레오타이드(gRSR로서 약기되는 안내 RNA 자기-가공 리보자임)가 어떻게 형성되는 지를 묘사한다. 햄머헤드 리보자임 및 HDV 리보자임은 RNA 분자를 절단시켜 최종 및 기능 성숙 안내-폴리뉴클레오타이드(안내-RNA)를 형성시킨다.
도 3은 1% 아가로스 젤상에서 실행된 절단된 플라스미드 및 PCR-증폭된 단편을 도시한다.
도 4는 pYB32 및 pYB33 세균 형질전환으로부터 생성되는 형질전환체의 콜로니 PCR의 결과를 도시한다.
도 5는 T188 및 T189 형질전환체의 게놈 DNA로부터 유래된 증폭산물들이 분리된 아가로스 젤을 도시하며, 프로모터 및 부분 Cas9의 존재에 대해 시험되었다.
도 6은 Cas9의 OrfA/Pfa1 유전자좌에의 통합을 입증하는 아가로스 젤상에서 실행된 T188 및 T189 형질전환체의 게놈 DNA로부터 유래된 증폭산물들을 도시한다.
도 7은 1% 아가로스 젤상에서 실행된 게놈 DNA로부터 증폭된 스키조키트리움(Schizochytrium) 지방산 신타제(FAS) 유전자의 일부를 도시한다.
도 8은 벡터 pCL400 중의 FAS 유전자좌내로의 파로모마이신 및 gRNA 카세트의 PCR 클로닝의 결과를 도시한다.
도 9는 하나의 증폭산물로서 첫 번째 3 CS gRNA 표적을 포함하는 전체 영역을 증폭시키기 위해 수행된 PCR 및 gRNA3 CS4 표적을 별도로 증폭시키기 위한 또 다른 PCR의 결과들을 도시한다.
도 10은 T206 형질전환체의 게놈 DNA로부터 gRNA3 CS1 표적을 별도로 증폭시키기 위해 수행된 PCR의 결과를 도시한다.
도 11은 pLC122-Cas9 및 pYB30 플라스미드의 절단의 결과를 도시한다.
도 12는 pYB61 세균 형질전환으로부터 생성되는 형질전환체의 콜로니 PCR의 결과를 도시한다.
도 13은 1% 아가로스 젤상의 pCL122 플라스미드의 절단 결과를 도시한다.
도 14는 1% 아가로스 젤상의 pYB66 클로닝을 위한 gRNA3 CS1 카세트의 증폭산물을 도시한다.
도 15는 1% 아가로스 젤상의 gRNA3 CS1(pYB66 단편)의 절단 결과를 도시한다.
도 16은 pYB66 세균 형질전환으로부터 생성되는 형질전환체의 콜로니 PCR의 결과를 묘사한다.
도 17은 1% 아가로스 젤상의 pYB61 플라스미드의 절단 결과를 도시한다.
도 18은 1% 아가로스 젤상의 pYB73 클로닝을 위한 gRNA CS1 카세트의 증폭산물을 도시한다.
도 19는 pYB73 세균 형질전환으로부터 생성되는 형질전환체의 콜로니 PCR의 결과를 도시한다.
도 20은 T212 형질전환체의 게놈 DNA로부터 유래된 증폭산물들이 분리된 아가로스 젤을 도시하며, CarG 유전자의 존재에 대해 시험되었다.
도 21은 T280, T281, T285 및 T286 형질전환체의 게놈 DNA로부터 유래된 증폭산물들이 분리된 아가로스 젤을 도시하며, 부분적인 프로모터 및 Cas9 서열의 존재에 대해 시험되었다.
도 22는 T281 및 T286 형질전환체의 게놈 DNA로부터 유래된 증폭산물들이 분리된 아가로스 젤을 도시하며, gRNA 카세트의 존재에 대해 시험되었다.
도 23은 T282 및 T287 형질전환체의 게놈 DNA로부터 유래된 증폭산물들이 분리된 아가로스 젤을 도시하며, 부분적인 gRNA 카세트의 존재에 대해 시험되었다.
도 24는 T281, T282, T286 및 T287 형질전환체의 게놈 DNA로부터 gRNA3 CS1 표적을 별도로 증폭시키도록 수행된 PCR의 결과를 도시한다.
서열 목록의 설명
서열번호 1은 pCL122-Cas9 벡터 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 2는 pYB31 벡터 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 3은 pYB32 벡터 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 4는 pYB33 벡터 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 5는 pCL399 벡터 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 6은 pCL400 벡터 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 7은 pCL401 벡터 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 8은 pCL402 벡터 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 9는 pYB36 벡터 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 10은 pYB37 벡터 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 11은 pYB38 벡터 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 12는 pYB39 벡터 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 13은 121 Tub seq F 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 14는 pYB32/3 CR1 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 15는 CS 프로 Kpn IF F1 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 16은 CS 프로 BamH IF R1 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 17은 CS 프로 BamH IF F2 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 18은 CS 프로 Nde IF R2 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 19는 O A1-KO F 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 20은 pYB32/3 SV40 R1 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 21은 O A1-KO R 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 22는 pYB32/3 C F1 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 23은 5' FAS PmeNde 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 24는 3' FAS PmeHpa 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 25는 pCL402 IF F 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 26은 pCL402 IF R 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 27은 pYB36 CS1 F 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 28은 pYB36 CS1 R 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 29는 pYB36 CS3 R 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 30은 pYB36 CS4 F 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 31은 pYB36 CS4 R 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 32는 pYB30 벡터 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 33은 pYB61 벡터 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 34는 pYB66 벡터 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 35는 pYB73 벡터 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 36은 pCL310 벡터 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 37은 pCL122 벡터 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 38은 pYB66 BamBgl F 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 39는 pYB66 Nde R 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 40은 pYB66 EF1seq F 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 41은 pCL122 OrfC R 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 42는 pYB73 gRNA Pst Kpn IF F 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 43은 pYB73 gRNA Xho Pst IF R 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 44는 pYB73 seq F 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 45는 pYB73 seq R 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 46은 pYB13 pYB1 seq F 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 47은 TT pYB73 HDV R 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
본 명세를 추가로 기재하기 전에, 특정 실시태양들의 변화를 수행할 수 있고 상기 변화가 여전히 첨부된 특허청구범위의 범위내에 있을 수 있기 때문에, 상기 명세가 하기에 기재되는 명세의 특정 실시태양들로 제한되지 않음을 알아야 한다. 또한, 사용되는 용어는 특정 실시태양들을 기재하기 위한 것이며 제한을 의도하는 것은 아님을 알아야 한다. 대신에, 본 명세의 범위는 첨부되는 특허청구범위에 의해 확립될 것이다.
첫 번째 태양에서, 본 발명은 안내-폴리뉴클레오타이드 및 Cas 단백질을 포함하는 CRISPR-Cas 시스템의 소스를 포함하는 비-천연 또는 조작된 조성물을 제공하며, 여기에서 상기 안내-폴리뉴클레오타이드는 근본적으로 숙주 세포 중의 표적-폴리뉴클레오타이드의 역 보체인 안내-서열을 포함하고, 상기 안내-폴리뉴클레오타이드는 상기 숙주 세포 중의 표적-폴리뉴클레오타이드에서 상기 Cas 단백질의 결합을 지시하여 CRISPR-Cas 복합체를 형성시킬 수 있으며, 여기에서 상기 안내-서열은 근본적으로 상기 숙주 세포의 게놈 중 5'-(N)yPAM-3' 폴리뉴클레오타이드 서열 표적의 (N)y 부분의 역 보체이고, 여기에서 y는 8 내지 30, 보다 바람직하게는 10 내지 30, 보다 바람직하게는 15 내지 30, 보다 바람직하게 17 내지 27, 보다 바람직하게 17 내지 20, 보다 바람직하게 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27의 정수이며, 여기에서 PAM은 프로토스페이서 인접 모티프이고, 여기에서 상기 숙주 세포는 라비린툴로마이세테스 강, 바람직하게는 트라우스토키트리알레스(Thraustochytriales) 목, 보다 바람직하게는 트라우스토키트리아세아에(Thraustochytriaceae) 과, 보다 바람직하게는 아우란티오키트리움(Aurantiochytrium), 오블롱기키트리움(Oblongichytrium), 스키조키트리움(Schizochytrium), 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 및 울케니아(Ulkenia)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 속의 일원, 훨씬 더 바람직하게는 스키조키트리움 종 ATCC# 20888의 것이며, 여기에서 PAM은 바람직하게는 5′-XGG-3′, 5′-XGGXG-3′, 5′-XXAGAAW-3′, 5′-XXXXGATT-3′, 5′-XXAGAA-3′, 5′-XAAAAC-3′로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 서열이고, 여기에서 X는 임의의 뉴클레오타이드 또는 그의 유사체일 수 있으며, 바람직하게 X는 임의의 뉴클레오타이드일 수 있고; W는 A 또는 T이다.
본 명세서에서 상기 조성물, 소스, CRISPR-Cas 시스템, 안내-폴리뉴클레오타이드, Cas 단백질, 표적-폴리뉴클레오타이드, 숙주 세포 및 CRISPR-Cas 복합체는 본 발명에 따른 조성물, 소스, CRISPR-Cas 시스템, 안내-폴리뉴클레오타이드, Cas 단백질, 표적-폴리뉴클레오타이드, 숙주 세포 및 CRISPR-Cas 복합체로서 지칭된다. 완성을 위해서, "하나의"는 본 명세서의 다른 곳에서 "적어도 하나"로서 정의되기 때문에, 본 발명에 따른 하나의 조성물은 적어도 하나, 즉 1, 2, 3 또는 그 이상의 안내-폴리뉴클레오타이드 및/또는 적어도 하나, 즉 1, 2, 3 또는 그 이상의 Cas 단백질의 소스를 포함한다. 상응하게, 본 발명은 편의상 멀티플렉스 CRISPR-Cas 시스템을 제공한다. 상기와 같은 멀티플렉스 CRISPR-Cas 시스템은 편의상 공여체 폴리뉴클레오타이드의 도입, 폴리뉴클레오타이드의 결실 및 숙주 세포의 게놈내로의 폴리뉴클레오타이드 라이브러리 삽입에 사용될 수 있다. 본 명세서에서, 멀티플렉스 CRISPR-Cas 시스템은 하나 이상의 Cas 단백질, 하나 이상의 안내-폴리뉴클레오타이드 및/또는 하나 이상의 공여체 폴리뉴클레오타이드의 사용을 지칭할 수 있다.
"CRISPR 시스템", "CRISPR-Cas 시스템" 및 "CRISPR 효소 시스템"이란 용어들은 본 명세서에서 호환 가능하게 사용되며 본 발명의 모든 실시태양들의 상황에서 표적-폴리뉴클레오타이드와 함께 CRISPR-Cas 복합체를 형성하는데 필요한 요소들의 집합을 지칭하고; 이들 요소는 비제한적으로 Cas 단백질 및 안내-폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
"CRISPR-Cas 복합체"란 용어는 본 발명의 모든 실시태양들의 상황에서 표적-폴리뉴클레오타이드에 하이브리드화되고 Cas 단백질과 복합체화된 안내-폴리뉴클레오타이드를 포함하는 복합체를 지칭한다. 가장 간단한 형태로, 돌연변이되지 않은 Cas 단백질, 예를 들어 비제한적으로 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)의 Cas9 단백질이 사용되는 경우, 상기 CRISPR-Cas 복합체의 형성은 표적-폴리뉴클레오타이드 중의 또는 상기 부근의(예를 들어 상기로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 또는 그 이상의 염기쌍내의) 하나 또는 2개의 폴리뉴클레오타이드 가닥 모두의 절단을 생성시킨다. 전형적으로, 본 발명에 따른(본 명세서에서 하기에 정의된) 표적-폴리뉴클레오타이드는 PAM 서열(본 명세서에서 하기에 정의됨)과 결합되고 상기 PAM 서열은 바람직하게는 상기 표적-폴리뉴클레오타이드의 바로 하류(3')에 있으며; 상기 CRISPR-Cas 복합체의 형성은 전형적으로 상기 PAM 서열의 3 염기쌍 상류(5')에서 하나 또는 2개 모두의 폴리뉴클레오타이드 가닥의 절단을 생성시킨다.
"비-천연 조성물"이란 용어는 본 발명의 모든 실시태양들의 상황에서 본 발명에 사용되는 그의 형태 중에 자연적으로 존재하지 않는 조성물을 지칭한다. 상기 개별적인 요소는 예를 들어 그대로 또는 자연 중의 다른 요소들과 함께 존재할 수 있지만, 상기 비-천연 조성물은 예를 들어 다소 천연 조성물 이외의 적어도 하나의 요소를 포함한다.
"조작된 조성물"이란 용어는 본 발명의 모든 실시태양들의 상황에서 요소 중 적어도 하나가, 생성되는 요소가 자연적으로 존재하지 않도록 하는 방식으로 조작된, 즉 인간에 의해 변형된 조성물을 지칭한다. 적어도 하나의 조작된 요소를 포함함으로써, 조작된 조성물은 자연에 존재하지 않는 것이 된다.
"폴리뉴클레오타이드", "뉴클레오타이드 서열" 및 "핵산"이란 용어는 본 명세서에서 호환 가능하게 사용되며 본 발명의 실시태양들의 상황에서 데옥시리보뉴클레오타이드이든 리보뉴클레오타이드이든, 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체성 형태, 또는 이들의 혼합물 또는 유사체를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있으며 공지되거나 공지되지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 하기는 폴리뉴클레오타이드의 비제한적인 예들이다: 유전자 또는 유전자 단편의 암호화 또는 비-암호화 영역, 연관 분석으로부터 한정된 유전자좌들(유전자좌), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA(tRNA), 리보솜 RNA(rRNA), 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은-헤어핀 RNA(shRNA), 미세-RNA(miRNA), 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지된 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 탐침, 올리고뉴클레오타이드 및 프라이머. 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드, 예를 들어 메틸화된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체 또는 뉴클레오타이드 균등물을 포함할 수 있다(여기에서 뉴클레오타이드 유사체 또는 균등물은 변형된 염기 및/또는 변형된 주쇄, 및/또는 비-천연 뉴클레오사이드간 결합, 또는 이들 변형의 조합을 갖는 잔기로서 정의된다). 바람직한 뉴클레오타이드 유사체 및 균등물은 "일반적인 정의" 섹션에 기재되어 있다. 경우에 따라, 상기 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형을 폴리뉴클레오타이드의 조립 전 또는 후에 도입시킬 수도 있다. 폴리뉴클레오타이드를 중합 후에, 예를 들어 표지화 화합물과의 접합에 의해 추가로 변형시킬 수도 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "폴리뉴클레오타이드"는 통상적인 포스포다이에스터 결합 또는 비-통상적인 결합(예를 들어 아미드 결합, 예를 들어 펩타이드 핵산(PNA) 중에서 발견되는)을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 번역되지 않은 5' 및 3' 서열, 암호화 서열을 포함한, 완전길이 cDNA 서열의 뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라 상기 핵산 서열의 단편, 에피토프, 도메인 및 변체를 함유할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 임의의 폴리리보뉴클레오타이드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드로 구성될 수 있으며, 이들은 변형되지 않은 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 단일- 또는 이중-가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 및 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일 가닥 또는 보다 전형적으로 이중 가닥 또는 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자로 구성될 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 RNA 또는 DNA 또는 RNA와 DNA 모두를 포함하는 삼중-가닥 영역으로 구성될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 리보뉴클레오사이드(아데노신, 구아노신, 유리딘, 또는 시티딘; "RNA 분자") 또는 데옥시리보뉴클레오사이드(데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘, 또는 데옥시시티딘; "DNA 분자"), 또는 이들의 임의의 포스포에스터 유사체, 예를 들어 포스포로티오에이트 및 티오에스터를 함유할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 또한 안정성 또는 다른 이유로 변형된 하나 이상의 변형된 염기 또는 DNA 또는 RNA 주쇄를 함유할 수 있다. "변형된" 염기는 예를 들어 트리틸화된 염기 및 통상적이지 않은 염기, 예를 들어 이노신을 포함한다. DNA 및 RNA에 다양한 변형을 수행할 수 있으며; 따라서, "폴리뉴클레오타이드"는 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태를 포함한다. 핵산 분자란 용어는 오직 상기 분자의 1차 및 2차 구조만을 지칭하며, 상기를 임의의 특정한 3차 형태로 제한하지 않는다. 따라서, 상기 용어는 특히 선형 또는 환상 DNA 분자(예를 들어 제한 단편), 플라스미드, 및 염색체에서 발견되는 이중 가닥 DNA를 포함한다. 특정한 이중 가닥 DNA 분자 구조의 논의에서, 서열은 본 명세서에서 오직 DNA의 전사되지 않은 가닥(즉 mRNA와 상동성인 서열을 갖는 가닥)을 따라 5'에서 3' 방향의 서열만을 제공하는 통상적인 규약에 따라 기재될 수 있다.
"단리된" 핵산 분자란 용어는 그의 고유 환경으로부터 제거된 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 지칭한다. 단리된 핵산 분자의 추가적인 예는 이종 숙주 세포 중에서 유지되는 재조합 폴리뉴클레오타이드 또는 용액 중 정제된(부분적으로 또는 실질적으로) 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 단리된 RNA 분자는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사물을 포함한다. 본 발명에 따른 단리된 핵산 분자는 합성적으로 생성된 상기와 같은 분자를 추가로 포함한다. 또한, 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드는 조절 요소, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 부위, 또는 전사 종결자를 포함할 수 있다.
"유전자"는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드의 조립체를 지칭하며 cDNA 및 게놈 DNA 핵산을 포함한다. "유전자"는 또한 개별적인 암호화 분절(엑손) 사이의 개재 서열(인트론)뿐만 아니라 암호화 서열에 선행(5' 비-암호화 서열) 및 후행(3' 비-암호화 서열)하는 조절 서열을 포함하여, 특정 단백질을 발현하는 핵산 단편을 지칭한다. "고유 유전자"는 그 자신의 조절 서열을 갖는, 자연에서 발견되는 바와 같은 유전자를 지칭한다.
일부 실시태양에서, 상기 핵산 분자는 본 명세서에 보고된 폴리뉴클레오타이드 서열에 적어도 약 80%, 85%, 또는 90% 일치하는, 또는 본 명세서에 보고된 폴리뉴클레오타이드 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, "일치성 퍼센트"란 용어는 서열 비교에 의해 측정시, 2개 이상의 아미노산 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열간의 관계이다. 당해 분야에서, "일치성"은 또한 서열들의 스트링간의 합치에 의해 측정시, 경우에 따라, 아미노산 또는 폴리뉴클레오타이드 서열간의 서열 관련성 정도를 의미한다.
본 발명의 참조 폴리뉴클레오타이드 서열에 적어도, 예를 들어 95% "일치하는" 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자의 경우, 상기 핵산 분자의 폴리뉴클레오타이드 서열은 상기 폴리뉴클레오타이드 서열이 상기 참조 폴리뉴클레오타이드 서열의 각 100 뉴클레오타이드당 5개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 포함할 수 있음을 제외하고, 상기 참조 서열과 일치함을 의미한다. 즉, 참조 폴리뉴클레오타이드 서열에 적어도 95% 일치하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자를 획득하기 위해서, 상기 참조 서열 중 뉴클레오타이드의 5% 이하가 결실되거나 또 다른 뉴클레오타이드로 치환될 수 있거나, 또는 상기 참조 서열의 전체 뉴클레오타이드의 5% 이하의 뉴클레오타이드의 수가 상기 참조 서열내에 삽입될 수 있다.
실제적인 문제로서, 임의의 특정 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열이 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는 지의 여부를 공지된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 통상적으로 측정할 수 있다. 의문의 서열(본 발명의 서열)과 주 서열간의 최상의 전체적인 합치를 측정하는 방법을, 서열의 정렬 및 일치성 점수의 계산을 사용하여 결정할 수 있다. 상기 정렬은 참조 알고리즘 및 지니어스 참조 어셈블러(Geneious reference assembler)에 대한 지도와 함께 컴퓨터 프로그램 지니어스(www.geneious.com)를 사용하여 수행되었다.
본 발명에 따른 안내-폴리뉴클레오타이드는 표적-폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화할 수 있는 적어도 하나의 안내-서열을 포함하며 상기 표적-폴리뉴클레오타이드에의 상기 CRISPR-Cas 시스템의 서열-특이적 결합을 지시하여 CRISPR-Cas 복합체를 형성시킬 수 있다. 활성 CRISPR-Cas 복합체의 형성을 가능하게 하기 위해서, 상기 안내-폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는 또한, 특이적인 2차 구조를 갖고 상기 Cas 단백질의 상기 안내-폴리뉴클레오타이드에의 결합을 허용하는 서열을 포함한다. 상기와 같은 서열은 당해 분야에 tracr RNA, tracr 서열, tracr 스캐폴드 또는 안내-폴리뉴클레오타이드 구조 성분으로서 공지되어 있으며, 이들 용어는 본 명세서에서 호환 가능하게 사용되고; 여기에서 상기 tracr은 전사촉진 CRISPR에 대한 약어이고; 따라서 tracrRNA는 전사촉진 CRISPR RNA를 의미한다. 원 CRISPR-Cas 시스템 중의 tracrRNA는 crRNA(안내-서열)를 Cas 뉴클레아제에 연결하며, 어떠한 crRNA에도 결합할 수 있는 내인성 세균 RNA이다. 안내-폴리뉴클레오타이드 구조 성분은 단일의 폴리뉴클레오타이드 분자로 구성되거나 또는 서로에 대해 하이브리드화된 2개 이상의 분자, 또는 Cas 단백질 또는 유사한 기능의 다른 뉴클레아제와 결합하는 2개 이상의 분자로 구성될 수 있다. 안내-폴리뉴클레오타이드 구조의 상기와 같은 성분을 tracr 서열 및 tracr-짝 서열로서 지칭할 수 있다.
상응하게, 상기 안내-폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는 또한 tracr 서열 및/또는 tracr-짝 서열을 포함한다. 상기 안내-폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에서 상기에 제시된 폴리뉴클레오타이드의 일반적인 정의에 따른 폴리뉴클레오타이드이며; 바람직한 안내-폴리뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드를 포함하고, 보다 바람직한 안내-폴리뉴클레오타이드는 RNA(안내-RNA)이다. 안내-폴리뉴클레오타이드 구조의 2가지 예를 도 1에 묘사한다.
본 발명의 상황에서, 서열은 주 서열이 바람직하게는 숙주 세포에서와 같은 생리학적 조건하에서 표적-서열 또는 표적-폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화할 수 있는 경우, 근본적으로 상기 표적-서열 또는 표적-폴리뉴클레오타이드의 역보체로서 지칭된다. 안내-서열과 그의 상응하는 표적-서열간의 상보성 정도는 적합한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬될 때, 바람직하게는 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 초과 서열 일치성이다. 상기 표적-폴리뉴클레오타이드가 이중가닥 폴리뉴클레오타이드인 경우, 안내-서열과 같은 주 서열은 상기 표적-폴리뉴클레오타이드의 어느 한 가닥, 예를 들어 암호화 가닥 또는 비-암호화 가닥과 하이브리드화할 수 있다.
바람직하게, 본 발명에 따른 안내-서열은 표적 중 독특한 표적-서열을 표적화한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 안내-서열은 PAM 서열에 바로 인접한 표적-폴리뉴클레오타이드 중 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20, 보다 바람직하게는 8, 9, 10, 11 또는 12 뉴클레오타이드와 100% 서열 일치성을 갖는다.
본 발명에 따른 안내-서열은 길이가 바람직하게는 8 내지 30, 보다 바람직하게는 10 내지 30, 보다 바람직하게는 15 내지 30, 보다 바람직하게는 17 내지 27, 보다 바람직하게는 17 내지 20, 보다 바람직하게는 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27 뉴클레오타이드이다. CRISPR-Cas 시스템의 표적-서열에의 서열-특이적 결합을 지시하여 CRISPR-Cas 복합체를 형성시키는 안내-서열의 능력을 임의의 적합한 분석에 의해 평가할 수 있다. 예를 들어, 시험하려는 안내-서열을 포함하여, CRISPR-Cas 복합체를 형성하기에 충분한 CRISPR 시스템의 성분들을, 예를 들어 상기 CRISPR-Cas 시스템의 성분들을 암호화하는 벡터에 의한 형질감염, 이어서 예를 들어 표준 서열 분석에 의한, 우선적인 절단 및/또는 상기 표적-서열내 세포 수복 기전에 의해 유도된 생성된 돌연변이의 평가에 의해, 상응하는 표적-서열을 갖는 숙주 세포에 제공할 수 있다. 표적-폴리뉴클레오타이드의 절단을 또한, 상기 표적-폴리뉴클레오타이드, 시험하려는 안내-서열 및 상기 시험 안내-서열과 상이한 대조용 안내-서열을 포함한 CRISPR-Cas 시스템의 성분들을 제공하고, 상기 시험 및 대조용 안내-서열 반응들간에 표적-서열에서의 절단률 또는 결합을 비교함으로써 시험관에서 평가할 수 있다. 다른 분석들이 가능하며, 이는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
안내-폴리뉴클레오타이드 구조 성분은 활성 CRISPR-Cas 복합체의 형성에 필요한 것으로 여겨진다. 상기 안내-폴리뉴클레오타이드 구조 성분은 반드시 안내-서열에 작동적으로 연결되는 것은 아닌 것으로 여겨지나; 안내-폴리뉴클레오타이드 구조 성분은 안내-폴리뉴클레오타이드내의 안내-서열에 작동적으로 연결될 수도 있다. 본 발명에 따른 안내-폴리뉴클레오타이드 구조 성분[상기는 야생형 안내-폴리뉴클레오타이드 구조 성분의 전부 또는 일부(예를 들어 야생형 tracr-서열의 약 또는 약 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85 초과, 또는 그 이상의 뉴클레오타이드)를 포함하거나 또는 상기로 이루어질 수 있다]은, 예를 들어 본 발명에 따른 tracr-서열의 적어도 일부의 본 발명에 따른 tracr-짝 서열의 전부 또는 일부에의 하이브리드화에 의해서 및 바람직하게는 본 발명에 따른 안내-서열에 작동적으로 연결되어 CRISPR-Cas 복합체 부분을 형성한다. 본 발명에 따른 tracr-서열은 바람직하게는 숙주 세포에서와 같은 생리학적 조건하에서 본 발명에 따른 tracr-짝 서열에 하이브리드화하고 CRISPR-Cas 복합체의 형성을 촉진하기에 충분한 상보성을 갖는다. 본 발명에 따른 표적-서열과 같이, 기능성이기에 충분한 상보성이 존재한다면, 완전한 상보성은 필요하지 않은 것으로 여겨진다. 바람직하게, 본 발명에 따른 tracr-서열은 최적으로 정렬될 때 본 발명에 따른 tracr-짝 서열의 길이를 따라 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 서열 일치성을 갖는다. 최적의 정렬은 상기에 논의된 바와 같이 서열 정렬에 대한 임의의 적합한 알고리즘을 사용하여 측정될 수 있다.
일반적으로, 본 발명에 따른 tracr 짝 서열은 본 발명에 따른 tracr 서열과 표적-서열에서 CRISPR-Cas 복합체의 형성을 촉진하기에 충분한 상보성을 갖는 임의의 서열을 포함하며, 여기에서 상기 CRISPR-Cas 복합체는 본 발명에 따른 tracr 서열에 하이브리드화된 본 발명에 따른 tracr 짝 서열을 포함한다. 본 발명에 따른 tracr 서열과 본 발명에 따른 tracr 짝 서열의 상보성 정도는 바람직하게는 2개 서열 중 보다 짧은 서열의 길이를 따라 상기 tracr 짝 서열 및 tracr 서열의 최적의 정렬에 관해 정의된다. 최적의 정렬은 상기에 논의된 바와 같이 서열 정렬에 대한 임의의 적합한 알고리즘을 사용하여 측정될 수 있다.
바람직하게, 본 발명에 따른 tracr 짝 서열 및 본 발명에 따른 tracr 서열에 대해서, 2차 구조는 예를 들어 상기 tracr 서열 또는 tracr 짝 서열 중 어느 하나내에서의 자기-상보성을 고려한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 tracr 서열 및 본 발명에 따른 tracr 짝 서열간의 상보성 정도는 상기 2개 서열 중 보다 짧은 서열의 길이를 따라 최적으로 정렬될 때 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 초과의 서열 일치성이다. 바람직하게 본 발명에 따른 tracr 짝 서열은 길이가 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50 이상의 뉴클레오타이드이다. 바람직하게 본 발명에 따른 tracr 서열은 길이가 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50 이상의 뉴클레오타이드이다. 바람직하게, 본 발명에 따른 tracr 서열 및 본 발명에 따른 tracr 짝 서열, 즉 안내-폴리뉴클레오타이드 구조 성분은, 상기 둘간의 하이브리드화가 2차 구조를 포함하는 하이브리드화 복합체, 예를 들어 헤어핀을 생성시키도록 단일의 전사물내에 포함된다. 상기와 같은 하이브리드화 복합체는 또한 상기 tracr 서열 및 tracr 짝 서열이 단일의 전사물 중에 포함되지 않는 경우에 형성될 수도 있다. 헤어핀 구조의 형성을 위한 본 발명에 따른 tracr 서열 및/또는 본 발명에 따른 tracr 짝 서열 및/또는 본 발명에 따른 안내-폴리뉴클레오타이드 구조 성분에서 바람직한 고리 형성 서열은 길이가 4 뉴클레오타이드이고, 가장 바람직하게는 GAAA 서열을 가지며; 교체 서열일 수도 있는, 보다 길거나 보다 짧은 고리 서열을 사용할 수도 있다. 상기 고리 서열은 바람직하게는 뉴클레오타이드 트리플릿(예를 들어 AAA) 및 추가적인 뉴클레오타이드(예를 들어 C 또는 G)를 포함한다. 고리 형성 서열의 예는 CAAA 및 AAAG를 포함한다. 바람직하게 본 발명에 따른 tracr 서열 및/또는 본 발명에 따른 tracr 짝 서열 또는 그의 하이브리드화 복합체 및/또는 본 발명에 따른 안내-폴리뉴클레오타이드 구조 성분은 적어도 2개 이상의 헤어핀을 포함하거나 또는 상기를 형성할 수 있다. 보다 바람직하게, 본 발명에 따른 tracr 서열 및/또는 본 발명에 따른 tracr 짝 서열 또는 그의 하이브리드화 복합체 및/또는 본 발명에 따른 안내-폴리뉴클레오타이드 구조 성분은 2, 3, 4 또는 5개의 헤어핀을 포함하거나 또는 상기를 형성할 수 있다. 바람직하게, 본 발명에 따른 tracr 서열 및/또는 본 발명에 따른 tracr 짝 서열 또는 그의 하이브리드화 복합체 및/또는 본 발명에 따른 안내-폴리뉴클레오타이드 구조 성분은 5개 이하의 헤어핀을 포함하거나 또는 상기를 형성할 수 있다. 바람직하게, 본 발명에 따른 tracr 서열 및 본 발명에 따른 tracr-짝 서열 또는 본 발명에 따른 tracr 서열 및 본 발명에 따른 tracr 짝 서열의 하이브리드화 복합체 및/또는 본 발명에 따른 안내-폴리뉴클레오타이드 구조 성분의 단일 전사물은 전사 종결 서열을 추가로 포함하며; 바람직하게 상기는 폴리T 서열, 예를 들어 6개의 T 뉴클레오타이드이다. 말한 바와 같이, 안내-폴리뉴클레오타이드 구조 성분은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며; 배경 정보는 문헌[Gaj et al., 2013]에서 찾을 수 있다.
본 발명에 따른 모든 실시태양들의 상황에서, "표적-폴리뉴클레오타이드"란 용어는 본 발명에 따른 안내-서열이 상보성을 갖도록 설계된 본 발명에 따른 표적-서열을 지칭하며, 이때 본 발명에 따른 표적-서열과 본 발명에 따른 안내-서열간의 하이브리드화는 CRISPR-Cas 복합체의 형성을 촉진한다. CRISPR-Cas 복합체의 하이브리드화를 일으키고 상기 복합체의 형성을 촉진하기에 충분한 상보성이 존재하는 한, 완전한 상보성이 반드시 요구되는 것은 아니다. 바람직하게, 본 발명에 따른 안내-서열은 표적 중의 독특한 표적-서열을 표적화한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 안내-서열은 PAM 서열에 바로 인접한 표적-폴리뉴클레오타이드 중의 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20, 보다 바람직하게는 8, 9, 10, 11 또는 12 뉴클레오타이드와 100% 서열 일치성을 갖는다. 본 발명에 따른 표적-폴리뉴클레오타이드는 임의의 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 상기 표적-폴리뉴클레오타이드가 이중가닥 폴리뉴클레오타이드인 경우, 본 발명에 따른 안내-서열은 상기 표적-폴리뉴클레오타이드의 어느 한 가닥, 예를 들어 암호화 가닥 또는 비-암호화 가닥과 하이브리드화할 수 있다.
본 발명에 따른 표적-폴리뉴클레오타이드는 세포의 핵 또는 세포질 중에 위치할 수 있다. 본 발명에 따른 표적-폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포의 세포소기관, 예를 들어 미토콘드리아 또는 색소체 중에 위치할 수도 있다. 본 발명에 따른 표적-폴리뉴클레오타이드는 게놈내에 포함되거나, 염색체내에 포함되거나 또는 염색체외에 존재할 수 있으며, 인공 염색체 중에 포함될 수도 있고, 임의의 염색체 개체 또는 염색체-외 개체, 예를 들어 상염색체 복제 개체, 예를 들어 에피솜 플라스미드 또는 벡터 중에 존재할 수도 있다. 본 발명에 따른 표적-폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포에 고유이거나 외래일 수 있다.
본 발명에 따른 표적-폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는, CRISPR-Cas 복합체에 의해 인식되는 짧은 폴리뉴클레오타이드인 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)와 결합된다. 바람직하게, 상기 표적-폴리뉴클레오타이드 및 PAM은 연결되며, 여기에서 상기 PAM은 바람직하게는 상기 표적-폴리뉴클레오타이드의 바로 하류(3')에 있다. 상기 PAM의 정확한 서열 및 길이는 다양할 수 있다, 예를 들어 상이한 Cas 단백질 및 유사한 기능의 뉴클레아제는 상이한 PAM 서열을 필요로 할 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 PAM은 2 내지 8 뉴클레오타이드 길이의 폴리뉴클레오타이드이다. 바람직한 PAM은 5′-XGG-3′, 5′-XGGXG-3′, 5′-XXAGAAW-3′, 5′-XXXXGATT-3′, 5′-XXAGAA-3′, 5′-XAAAAC-3′(여기에서 X는 임의의 뉴클레오타이드 또는 그의 유사체, 바람직하게는 임의의 뉴클레오타이드일 수 있고; W는 A 또는 T이다)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 보다 바람직한 PAM은 5'-XGG-3'이다. 상기 PAM은 바람직하게는 Cas 단백질과 합치된다. 가장 널리 사용되는 CAS/CRISPR 시스템은 스트렙토코커스 피오게네스로부터 유래되며 합치하는 PAM 서열 5'-XGG-3'은 표적-서열의 바로 하류(3')에 위치한다. 네이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis) Cas 단백질에 바람직한 PAM은 5′-XXXXGATT-3′이고; 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus) Cas 단백질에 바람직한 PAM은 5′-XXAGAA-3′이며; 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola)에 바람직한 PAM은 5′-XAAAAC-3′이다. 바람직한 PAM은 사용된 Cas 단백질과 합치한다. 본 발명에 따른 Cas 단백질을, 야생형 Cas 단백질과 합치하는 고유 PAM보다는 상이한 PAM과 합치하도록 조작할 수 있다. 이와 같이, 본 발명에 따른 CRISPR-Cas 시스템을 맞춤된 특이적 표적화에 사용할 수 있다.
"하이브리드화"란 용어는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드가 반응하여, 뉴클레오타이드 잔기의 염기들간의 수소 결합을 통해 안정화되는 복합체를 형성하는 반응을 지칭한다. 상기 수소 결합은 와트슨 크리크 염기 짝짓기, 후그스테인 결합에 의해, 또는 임의의 다른 서열-특이적인 방식으로 발생할 수 있다. 상기 복합체는 듀플렉스 구조를 형성하는 2개의 가닥, 다중 가닥 복합체를 형성하는 3개 이상의 가닥, 단일의 자기-하이브리드화 가닥, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 하이브리드화 반응은 보다 광범위한 가공 중의 한 단계, 예를 들어 효소에 의한 폴리뉴클레오타이드의 절단을 구성할 수 있다. 바람직한 하이브리드화 조건은 본 발명에 따른 숙주 세포내에서와 같은 생리학적 조건이다.
본 발명의 모든 실시태양들의 상황에서 "소스"란 용어는 안내-폴리뉴클레오타이드 및 Cas 단백질을 포함하는 CRISPR-Cas 시스템의 임의의 소스를 지칭한다. 상기 안내-폴리뉴클레오타이드 및 Cas 단백질은 별도의 소스 중에 존재할 수 있다. 상기와 같은 경우에, 본 발명에 따른 조성물은 안내-폴리뉴클레오타이드의 소스 및 Cas-단백질의 소스를 포함하는 CRISPR-Cas 시스템을 포함한다. 임의의 소스는 상기 안내-폴리뉴클레오타이드 및 Cas 단백질이 CRISPR-Cas 시스템내에서 기능할 수 있는 형태로 그대로 존재할 수 있음을 의미한다. 상기 안내-폴리뉴클레오타이드 및/또는 Cas-단백질은 그의 활성 형태로 제공될 수 있으며 예를 들어 불활성 형태로부터 또는 또 다른 개체로부터 제공될 수 있다. 상기 안내-폴리뉴클레오타이드는 예를 들어 또 다른 폴리뉴클레오타이드상에 존재하거나 또는 실제 안내-폴리뉴클레오타이드를 제공하도록 전사된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화될 수 있다. 상기 Cas 단백질은 실제 Cas 단백질을 제공하도록 전사되고/되거나 번역된 폴리뉴클레오타이드(예를 들어 DNA 또는 mRNA)에 의해 암호화될 수 있다. 암호화 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에 정의된 바와 같은 핵산 구조물 중에 및/또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 벡터 중에 존재할 수 있다. 상기와 같은 핵산 구조물 및 벡터는 본 명세서에서 본 발명에 따른 핵산 구조물 및 본 발명에 따른 벡터로서 지칭된다.
바람직하게, 본 발명에 따른 조성물에서, 상기 Cas 단백질 또는 관련 기능의 뉴클레아제는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암화되고/되거나 상기 안내-폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되거나 상기 상에 존재한다.
바람직하게, 본 발명에 따른 조성물에서, 상기 Cas 단백질 또는 관련 기능의 뉴클레아제는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되고/되거나 상기 안내-폴리뉴클레오타이드는 또 다른 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되거나 상기 상에 존재하고 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드들은 벡터 중에 포함된다.
바람직하게, 본 발명에 따른 조성물에서, 상기 안내-폴리뉴클레오타이드는 실제 안내-폴리뉴클레오타이드를 제공하도록 전사된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된다. 상응하게, 하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 조성물에서, 바람직하게 상기 안내-폴리뉴클레오타이드는 상기 안내-폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 형태로 존재하고 상기 안내-폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포에서 상기 폴리뉴클레오타이드의 전사시에 수득된다.
바람직하게, 본 발명에 따른 조성물에서, 상기 Cas 단백질은 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되고 상기 안내-폴리뉴클레오타이드는 또 다른 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되거나 상기 상에 존재하고 상기 폴리뉴클레오타이드는 하나의 벡터 중에 포함된다.
바람직하게, 본 발명에 따른 조성물에서, 상기 Cas 단백질은 하나의 벡터 중에 포함된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되고 상기 안내-폴리뉴클레오타이드는 또 다른 벡터 중에 포함된 또 다른 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되거나 상기 상에 존재한다. 바람직하게, 상기 Cas 단백질을 암호화하는 벡터는 저 사본 벡터이고/이거나 상기 Cas 전사물의 발현을 구동하는 프로모터는 저-강도 프로모터이고 상기 안내-폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 벡터는 고 사본 벡터이고/이거나 상기 gRNA 전사물의 발현을 구동하는 프로모터는 고-강도 프로모터이다. 이는 상기 Cas 단백질 및 안내-폴리뉴클레오타이드의 차별적인 발현을 허용하며; 상기 Cas 단백질은 예를 들어 상기 안내-폴리뉴클레오타이드보다 낮은 수준으로 발현될 수 있다. 프로모터 강도를 임의의 수단에 의해, 예를 들어 RNA 서열분석에 의해 평가할 수 있다. RNA 서열분석(RNAseq)은 상이한 조건하에서 전사체 전체에 걸친 발현을 측정하기 위한 매우 민감하고 정확한 도구이다. 상기는 RPKM 값(백만개의 맵핑된 판독당 전사물의 킬로염기당 판독)으로서 보고되는 전사물 수준에서의 유전자 발현의 정량적인 근사치를 허용한다. 스키조키트리움으로부터의 전형적인 유전자의 RPKM 값 및 상대적인 프로모터 강도를 표 1에 제공한다.
유전자 평균 RPKM 값 상대적인
프로모터 강도
아르기나제 (EC 3.5.3.1) 3694.34 강함
피루베이트 키나제 (EC 2.7.1.40) 2127.49 강함
열 충격 단백질 70 1857.74 강함
글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제 (EC 1.2.1.12) 1688.00 강함
튜불린 알파 쇄 696.85 중간
단백질 번역 연장 인자 1A (EF-1A) 682.30 중간
아이소시트레이트 라이아제 (EC 4.1.3.1) 510.45 중간
아코니테이트 하이드라타제 2 (EC 4.2.1.3) 317.74 중간
말레이트 데하이드로게나제 (EC 1.1.1.37) 192.47 중간
액포 ATP 신타제 서브유닛 D (EC 3.6.3.14) 163.74 중간
아실-CoA 데하이드로게나제 (EC 1.3.99.3) 94.43 약함
아세틸스페르미딘 데아세틸라제 (EC 3.5.1.48) 90.60 약함
아세토락테이트 신타제 (EC 2.2.1.6) 63.21 약함
말레일아세토아세테이트 아이소머라제 (EC 5.2.1.2) 39.46 약함
피토엔 데세튜라제 (EC 1.14.99.-) (카로틴 신타제) 31.56 약함
ATP-의존성 RNA 헬리카제 28.42 약함
아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제 (EC 2.3.1.9) 26.74 약함
저-강도(즉 약한) 스키조키트리움 프로모터의 예는 비제한적으로 카로티노이드 신타제의 발현을 구동하는 것들을 포함한다. 중간-강도(즉 중간) 스키조키트리움 프로모터의 예는 비제한적으로 알파-튜불린의 발현을 구동하는 것들을 포함한다. 고-강도(즉 강한) 스키조키트리움 프로모터의 예는 비제한적으로 연장 인자 1(EF-1)의 발현을 구동하는 것들을 포함한다. RPKM 값은 일반적으로 상대적인 프로모터 강도를 가리키는 것으로 간주되지만, 고유 게놈 환경에서의 프로모터는 발현 벡터 환경에서와 정확하게 동일한 강도를 갖지 않을 수도 있음은 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있다. 따라서, 당해 분야의 숙련가는 표 1에 제공된 상대적인 프로모터 강도가 본 발명의 상황에서 변할 수 있음을 알 것이다.
따라서 본 발명은 상기 안내-폴리뉴클레오타이드 및 Cas 단백질이 그대로 제공되거나, 또는 벡터상에서 암호화되거나 또는 벡터상에 존재할 가능성들을 제공한다. 후자의 경우에, 상기 암호화 폴리뉴클레오타이드는 각각 별도의 벡터상에 있거나 또는 둘 다 단일 벡터상에 있을 수 있다. 상응하게, 하나의 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물을 제공하며, 여기에서 본 발명에 따른 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 안내-폴리뉴클레오타이드 또는 본 발명에 따른 안내-폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 단일 벡터상에 존재하며, 상기 벡터는 프로모터 및 종결자 요소와 같이 상기 암호화된 생성물을 발현하는데 필요한 임의의 요소를 추가로 포함할 수 있다. 상기와 같은 단일(올인원) 벡터는 CRISPR-Cas 시스템에 필요한 모든 성분이 함께 존재한다는 장점을 가지며; 또한, 임의로 공여체 폴리뉴클레오타이드와 함께, 단일의 형질전환 사건이면 상기 성분들을 숙주 세포내로 도입시키기에 충분하다.
벡터
본 발명의 모든 실시태양들의 상황에서, 벡터는 편의상 재조합 DNA 과정이 가해질 수 있고 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드의 발현을 매개할 수 있는 임의의 벡터(예를 들어 플라스미드 또는 바이러스)일 수 있다. 상기 벡터의 선택은 전형적으로 상기 벡터와 상기 벡터가 도입되는 숙주 세포와의 적합성에 따라 변할 것이다. 바람직한 벡터는 본 명세서의 실시예들에 사용되는 벡터이다. 벡터는 선형 폴리뉴클레오타이드 또는 선형 또는 폐쇄된 환상 플라스미드일 수 있다. 벡터는 통합 또는 자율 복제 벡터, 즉 염색체 또는 염색체-외 개체로서 존재하고 그의 복제가 염색체 복제에 의존적이거나 독립적인 벡터, 예를 들어 플라스미드, 염색체외 요소, 미니-염색체, 또는 인공 염색체일 수 있다.
바람직하게 벡터는, 숙주 세포내로 도입될 때 게놈내에 통합되고 상기가 통합된 염색체(들)와 함께 복제되는 것일 수 있다. 통합 벡터는 숙주 세포의 염색체 중에서 무작위로 또는 소정의 표적 유전자좌에서 통합될 수 있다. 바람직한 통합 벡터는 DNA 단편을 포함하며, 상기 단편은 상기 벡터의 소정의 유전자좌에의 통합을 표적화하기 위해 숙주 세포의 게놈 중의 상기 소정의 표적 유전자좌 중의 DNA 서열에 상동성이다. 표적화된 통합을 촉진하기 위해서, 벡터를 바람직하게는 상기 세포의 형질전환에 앞서 선형화시킨다. 선형화를 바람직하게는 상기 벡터의 적어도 하나의 단부, 바람직하게는 어느 한 단부가 상기 표적 유전자좌에 상동성인 서열에 의해 측면 인접되도록 수행한다. 상기 표적 유전자좌에 측면 인접한 상동성 서열의 길이는 바람직하게 적어도 30 bp, 바람직하게 적어도 50 bp, 바람직하게 적어도 0.1 kb, 훨씬 바람직하게 적어도 0.2 kb, 보다 바람직하게 적어도 0.5 kb, 훨씬 더 바람직하게 적어도 1 kb, 가장 바람직하게 적어도 2 kb이다. 바람직하게, 상기 숙주 세포의 게놈내로의 표적화된 통합, 즉 소정의 표적 유전자좌 중의 통합의 효율은 상기 숙주 세포의 증대된 상동성 재조합 능력에 의해 증가된다.
상기 벡터 중 상동성 측면 인접 DNA 서열(표적 유전자좌에 상동성이다)은 발현된 유전자좌로부터 유래할 수 있으며, 이는 상기 서열이 숙주 세포에서 발현이 가능한 유전자로부터 유래됨을 의미한다. 측면 인접 DNA 서열을, 배양 배지에 적합한 선택성 인자가 보충될 때 형질전환된 세포가 성장하도록 선택성 마커 유전자와 결합시킬 수 있다. 상기 측면 인접 DNA 서열을 당해 분야의 숙련가에게 공지된 임의의 수단에 의해 설계할 수 있으며; 하나의 바람직한 설계는 포화된 및/또는 다중불포화된 지방산 신타제(PUFA 신타제)를 암호화하는 유전자에의 상동성 재조합을 지시하고, 따라서 이들 신타제의 돌연변이 또는 붕괴는 포화된 및/또는 다중불포화된 지방산에 대한 영양요구성을 생성시킨다. 포화된 및/또는 다중불포화된 지방산에 영양요구성인 세포는 성장을 위한 보충제로서 포화된 및/또는 다중불포화된 지방산을 필요로 한다. 또 다른 바람직한 설계는 우성 선택성 마커 유전자의 형질전환체가 적합한 우성 선택성 인자의 존재하에서 성장할 수 있도록 상기 선택성 마커 유전자의 발현을 가능하게 한다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드의 하나 초과의 사본을 미생물 숙주 세포내에 삽입하여 상기 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 생성물의 생산을 매개할 수 있다. 이를, 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오타이드의 다중 사본을 상기 숙주 세포의 게놈내에 통합시키거나 또는 상기 폴리뉴클레오타이드의 통합을 고도로 발현된 유전자좌에 작동 가능한 배열로 표적화함으로써 수행할 수 있다. 한편으로, 다중 사본의 통합을, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 갖는 증폭 가능한 선택성 마커 유전자를 포함시킴으로써 성취할 수 있으며, 따라서 상기 선택성 마커 유전자의 증폭된 사본(및 이에 의해 핵산 서열의 추가적인 사본)을 함유하는 세포를, 적합한 선택성 인자의 존재하에서 상기 세포를 배양함으로써 선택할 수 있다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드의 사본수를 훨씬 더 증가시키기 위해서, WO98/46772에 기재된 바와 같은 유전자 전환의 기법을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 Cas 단백질 및/또는 본 발명에 따른 안내-폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포의 게놈내에 통합시킬 때, 예를 들어 목적하는 게놈 편집이 발생했을 때, 상기 폴리뉴클레오타이드를 상기 게놈으로부터 절제하는 것이 바람직할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 절제를 당해 분야의 숙련가에게 공지된 임의의 수단에 의해 수행할 수 있으며; 하나의 바람직한 수단은 영양요구성이 치유된 세포가 상기 영양요구체에 의해 요구된 영양소가 생략된 배양 배지에서 생육에 의해 대신 선택될 수 있도록 영양요구성을 유도한 유전자 돌연변이 또는 붕괴를 복구하는 뉴클레오타이드에 의한 2차 형질전환에 의한다. 또 다른 절제 수단은 본 발명에 따른 CRISPR-Cas 시스템의 사용일 수 있다.
본 발명에 따른 벡터는 숙주 세포내로 도입되는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 함께 함유하는 단일 벡터 또는 플라스미드 또는 2개 이상의 벡터 또는 플라스미드를 포함하는 벡터 시스템일 수 있다.
본 발명에 따른 벡터는, 형질전환된 세포의 용이한 선택을 허용하는 하나 이상의 선택성 마커를 함유할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 조성물에서 하나 이상의 또는 모든 벡터는 선택성 마커를 포함하며, 바람직하게 각각의 벡터는 별개의 선택성 마커를 포함한다. 선택성 마커는 생성물이 살생물제 또는 바이러스 내성, 중금속에 대한 내성, 영양요구체에 대한 원영양요구성 등을 제공하는 유전자이다. 상기 선택성 마커는 발현 카세트로서 상기 벡터상에서 세포내에 도입되거나 또는 별도의 벡터상에 도입될 수 있다.
라비린툴로마이세트 세포에 사용하기 위한 선택성 마커는 비제한적으로 nptII(네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II, 파로모마이신 내성을 부여한다), ALS(아세토락테이트 신타제, 설포메투론메틸 내성을 부여한다), bsd(블라스티시딘-S-데아미나제, 블라스티시딘 내성을 부여한다), 및 Sh ble(플레오마이신 결합, 제오신 내성을 부여한다)를 포함하는 그룹 중에서 선택될 수 있다.
한편으로, 특이성 선택 마커, 예를 들어 앞서 논의된 균주로서 포화되거나 다중불포화된 지방산 신타제 유전자의 불활성화 돌연변이를 갖는 상응하는 돌연변이 숙주 세포를 요구하는 영양요구성 마커를 사용할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 상기 선택 마커는 선택 마커 유전자가 없는 폴리펩타이드를 생성시킬 수 있는 형질전환된 숙주 세포를 수득하기 위해서 발현 구조물의 도입 후에 형질전환된 숙주 세포로부터 결실된다.
본 발명에 따른 벡터를 구성하기 위해서 상술한 요소들을 결찰시키는데 사용되는 과정은 당해 분야의 숙련가에게 주지되어 있다(예를 들어 문헌[Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001]; 및 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley InterScience, NY, 1995]을 참조하시오).
본 발명의 모든 실시태양들의 상황에서 Cas 단백질은 본 발명의 목적에 적합한 임의의 Cas 단백질을 지칭한다. Cas 단백질은 효소 활성을 포함하거나 효소 활성을 포함하지 않을 수도 있다. Cas 단백질의 비제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9(또한 Csn1 및 Csx12로서 공지됨), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx1S, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 그의 상동체 또는 그의 변형된 버전을 포함한다. 이들 Cas 단백질은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며; 예를 들어 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 단백질의 아미노산 서열은 스위스프롯(SwissProt) 데이터베이스에서 수납번호 Q99ZW2하에 발견될 수 있다. 바람직하게, 본 발명에 따른 변형되지 않은 Cas 단백질, 예를 들어 Cas9는 DNA 절단 활성을 갖는다. 바람직하게, 상응하는 Cas 단백질은 Cas9이며, 스트렙토코커스 피오게네스 또는 스트렙토코커스 뉴모니아에로부터의 Cas9일 수 있다. 바람직하게, 본 발명에 따른 Cas 단백질은 표적-폴리뉴클레오타이드의 위치에서, 예를 들어 상기 표적-폴리뉴클레오타이드내 및/또는 상기 표적-폴리뉴클레오타이드의 역보체내에서 하나 또는 2개의 폴리뉴클레오타이드 가닥 모두의 절단을 지시한다. 상기 표적-폴리뉴클레오타이드의 위치는 본 명세서에서 표적-폴리뉴클레오타이드의 첫 번째 또는 최종 뉴클레오타이드로부터 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500, 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 이내; 보다 바람직하게는 표적-폴리뉴클레오타이드의 첫 번째 또는 최종 뉴클레오타이드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500, 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 이내; 훨씬 더 바람직하게는 표적-폴리뉴클레오타이드의 첫 번째 또는 최종 뉴클레오타이드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50 뉴클레오타이드 이내로서 한정된다. 상응하게, 본 발명에 따른 Cas 단백질은 바람직하게는 표적-폴리뉴클레오타이드의 첫 번째 또는 최종 뉴클레오타이드로부터 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500, 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 이내; 보다 바람직하게는 표적-폴리뉴클레오타이드의 첫 번째 또는 최종 뉴클레오타이드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500, 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 이내; 훨씬 더 바람직하게는 표적-폴리뉴클레오타이드의 첫 번째 또는 최종 뉴클레오타이드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50 뉴클레오타이드 이내에서 하나 또는 2개의 폴리뉴클레오타이드 가닥 모두의 절단을 지시한다. 전형적으로, 본 발명에 따른 표적-폴리뉴클레오타이드는 PAM 서열(본 명세서의 다른 어딘가에서 정의됨)과 결합되며 상기 PAM 서열은 바람직하게는 표적-서열의 바로 하류(3')에 있고; 상기 CRISPR-Cas 복합체의 형성은 전형적으로 상기 PAM 서열의 3 염기쌍 상류(5')에서 하나 또는 2개의 폴리뉴클레오타이드 가닥 모두의 절단을 생성시킨다.
바람직하게, 본 발명에 따른 조성물 중의 Cas 단백질은 상기 표적-폴리뉴클레오타이드의 위치에서 2개의 폴리뉴클레오타이드 가닥 모두의 절단을 지시하는 활성을 갖는다. Cas 뉴클레아제 활성은 전형적으로 2개의 분리된 촉매 도메인, 즉 RuvC 및 HNH에 의해 수행된다. 각각의 도메인은 하나의 폴리뉴클레오타이드 가닥을 절단하고 각각의 도메인은 단일 점 돌연변이에 의해 불활성화될 수 있다.
따라서 본 발명에 따른 Cas 단백질은 편의상, 돌연변이된 Cas 단백질이 변경된 뉴클레아제 활성을 갖고 표적-폴리뉴클레오타이드의 하나 또는 2개의 가닥 모두를 절단하는 능력이 결여되도록 상응하는 야생형 Cas 단백질에 대해 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스로부터의 Cas9의 RuvC I 촉매 도메인에서 아스파테이트에서 알라닌으로의 치환(D10A)은 Cas9를 2개의 가닥을 모두 절단하는 뉴클레아제에서 니카제(상기는 본 명세서에서 표적-폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥을 절단하는 Cas 단백질로서 정의된다)로 전환시킨다. Cas9를 니카제로 만드는 돌연변이의 다른 예는 비제한적으로 H840A, N854A, 및 N863A를 포함한다. 본 발명의 상황에서, 니카제 활성을 갖는 Cas 단백질을 상동성 재조합을 통한 게놈 편집, 바람직하게는 문헌[Ran et al., 2013]에 따른 이중 닉킹(nicking) 기법에 사용할 수 있다. 상응하게, 본 발명에 따른 바람직한 Cas 단백질은 상기 단백질이 상응하는 야생형 Cas 단백질에 비해 변경된 뉴클레아제 활성을 갖도록, 바람직하게는 상기 표적-서열의 위치에서 단일의 폴리뉴클레오타이드 가닥의 절단을 지시하는 활성을 갖는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 상기와 같은 소위 니카제 돌연변이체를 편의상 듀플렉스 셋업에, 즉 RuvC 돌연변이된 Cas 단백질 니카제 돌연변이체 및 NHN이 돌연변이된 Cas 단백질 니카제 돌연변이체를 포함하는 본 발명에 따른 조성물에 사용할 수 있으며, 따라서 상기 하나의 Cas 단백질 돌연변이체는 상기 폴리뉴클레오타이드 표적의 하나의 가닥을 닉킹하고 다른 Cas 단백질 돌연변이체는 상기 폴리뉴클레오타이드 표적의 다른 가닥을 닉킹한다. 상기 사용되는 2개의 안내-폴리뉴클레오타이드에 따라, 2개의 상이한 CRISPR-Cas 복합체는 상기 폴리뉴클레오타이드 표적 중에 2개의 단일-가닥 닉을 유효하게 생성시킬 것이며; 이들 닉은 5, 10, 20, 30 이상 떨어진 다수의 뉴클레오타이드들일 수 있다. 상기와 같은 이중 닉킹 방법은 비-상동성 말단 부착(NEJH)의 특이성을 크게 증대시킨다. 이중 닉킹에 대한 배경 정보를 예를 들어 문헌[Ran et al., 2013]에서 찾을 수 있다.
본 발명에 따른 Cas 단백질은 Cas9의 2개 이상의 돌연변이된 촉매 도메인, 예를 들어 RuvC I, RuvC II 및/또는 RuvC III를 포함하여 모든 DNA 절단 활성이 실질적으로 없는 돌연변이된 Cas9를 생성시킬 수 있다 일부 실시태양에서, D10A 돌연변이를 H840A, N854A, 또는 N863A 돌연변이 중 하나 이상과 병용하여 모든 DNA 절단 활성이 실질적으로 없는 Cas9 효소를 생성시킨다. 바람직하게, Cas 단백질은 상기 돌연변이된 효소의 DNA 절단 활성이 돌연변이되지 않은 형태에 대해서 약 25%, 10%, 5%, 1%, 0.1%, 0.01% 미만, 또는 그 이하일 때 모든 DNA 절단 활성이 실질적으로 없는 것으로 간주된다. 실질적으로 모든 효소 활성이 없는 Cas 단백질을, 상기 CRISPR-Cas 복합체가 상기 표적-폴리뉴클레오타이드로부터의 전사를 방해할 것이기 때문에, 편의상 유전자 침묵 또는 발현의 하향 조절에 사용할 수 있다. 다른 돌연변이들이 유용할 수 있으며; 상기 Cas9 또는 다른 Cas 단백질이 스트렙토코커스 피오게네스 이외의 종으로부터의 것인 경우, 상응하는 아미노산에서 돌연변이를 수행하여 유사한 효과를 성취할 수 있고; 당해 분야의 숙련가는 이들 상응하는 아미노산을 어떻게 식별하는 지를 안다.
본 발명에 따른 Cas 단백질은 융합 단백질일 수 있으며 적어도 하나의 이종 기능성 도메인을 포함하고, 상기와 같은 도메인은 바람직하게는 문헌[Aggarwal, A. K.; Wah, D. A.; Hirsch, J. A.; Dorner, L. F.; Schildkraut, I. (1997). "Structure of the multimodular endonuclease FokI bound to DNA". Nature 388 (6637): 97-100]에 기재된 바와 같은 FokI 활성을 포함하는 도메인이다. 상기 효소 FokI은 플라보박테리움 오케아노코이테스(Flavobacterium okeanokoites)에서 자연적으로 발견되며 N-말단 DNA-결합 도메인 및 C-말단의 비-특이성 DNA 절단 도메인으로 이루어지는 세균성 IIS형 제한 엔도뉴클레아제이다(Durai et al., 2005). 상기 FokI 단백질이 5′-GGATG-3′:3′-CATCC-5′ 인식 부위에서 그의 DNA-결합 도메인을 통해 이중 가닥 DNA에 결합할 때, 상기 DNA 절단 도메인은 활성화되어 추가의 서열 특이성 없이 상기 인식 부위의 하류에서 첫 번째 가닥 9 뉴클레오타이드 및 상기 부위의 가장 가까운 뉴클레오타이드의 상류에서 두 번째 가닥 13 뉴클레오타이드를 절단한다(Wah et al., 1998). Cas9-FokI 융합은 특히 문헌[Guilinger et al., 2014]; 및 문헌[Tsai et al., 2014]에서 기재되었다.
본 발명에 따른 Cas 융합 단백질은 상기 Cas 단백질 외에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 도메인을 포함할 수 있다. Cas 단백질에 융합될 수 있는 단백질 도메인의 예는 비제한적으로 에피토프 태그, 리포터 유전자 서열, 및 하기의 활성 중 하나 이상을 갖는 단백질 도메인을 포함한다: 메틸라제 활성, 데미틸라제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 역사적인 변형 활성, RNA 절단 활성 및 핵산 결합 활성. 에피토프 태그의 비제한적인 예는 히스티딘(His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그, 및 티오레독신(Trx) 태그를 포함한다. 리포터 유전자의 예는 비제한적으로 글루타치온-S-트랜스퍼라제(GST), 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시페라제, 녹색 형광 단백질(GFP), HcRed, DsRed, 시안 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP), 및 청색 형광 단백질(BFP)을 포함하는 자가형광 단백질을 포함한다. Cas 단백질을, DNA 분자에 결합하거나 다른 세포 분자에 결합하는 단백질 또는 단백질의 단편을 암호화하는 유전자 서열, 예를 들어 비제한적으로 말토스 결합 단백질(MBP), S-태그, Lex A DNA 결합 도메인(DBD) 융합물, GAL4 DNA 결합 도메인 융합물, 및 헤르페스 단순 바이러스(HSV) BP 16 단백질 융합물에 융합시킬 수 있다. CRISPR 효소를 포함하는 융합 단백질의 부분을 형성할 수 있는 추가적인 도메인은 US20110059502에 기재되어 있다. 태그된 Cas 단백질을 사용하여 표적-폴리뉴클레오타이드의 위치를 확인할 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 Cas 융합 단백질은 본 명세서에서 상기에 정의한 바와 같은 FokI 도메인을 포함한다.
본 발명에 따른 바람직한 Cas 단백질은 핵 국소화 서열, 바람직하게는 이종 핵 국소화 서열을 포함한다. 상기와 같은 핵 국소화 서열을 또한 핵 국소화 신호라 칭한다. 바람직하게, 상기와 같은 핵 국소화 신호는 상기 CRISPR-Cas 복합체에, 숙주 세포의 핵 중에서 검출 가능한 양으로 상기 CRISPR-Cas 복합체의 축적을 구동하기에 충분한 강도를 부여한다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 핵 국소화 서열이 숙주 세포에서 CRISPR-Cas 활성에 필요하지 않지만 상기와 같은 서열을 포함하는 것은, 특히 상기 핵내로의 표적 핵산 분자에 대한 상기 시스템의 활성을 증대시키는 것으로 여겨진다. 상기와 같은 핵 국소화 서열은 바람직하게는 Cas 단백질 중에 존재하지만, 상기 CRISPR-Cas 시스템의 핵에의 표적화를 촉진하도록 다른 어딘가에 또한 존재할 수도 있다. 바람직한 핵 국소화 서열은 SV40 핵 국소화 서열이다.
본 발명에 따른 조성물 및 임의의 다른 실시태양에서, Cas 단백질 암호화 폴리뉴클레오타이드를 바람직하게는 상기를 발현시키고자 하는 숙주 세포에 코돈 최적화시킨다, 보다 바람직하게 상기 Cas 단백질 암호화 폴리뉴클레오타이드를 코돈 쌍 최적화시킨다. 일반적으로, 코돈 최적화는 관심 숙주 세포에서의 증대된 발현을 위해, 고유 아미노산 서열을 유지시키면서 숙주 세포의 유전자에 보다 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 상기 고유 서열 중 적어도 하나의 코돈(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 초과, 또는 그 이상의 코돈)을 교체시킴으로써 핵산 서열을 변형시키는 과정을 지칭한다. 다양한 종들이 특정 아미노산의 몇몇 코돈에 대해 특정한 편향을 나타낸다. 코돈 편향(유기체들간의 코돈 사용의 차이)은 종종 메신저 RNA(mRNA)의 번역 효율과 상관있으며, 이는 차례로 다른 것들 중에서도 특히 번역되는 코돈의 성질 및 특정한 전달 RNA(tRNA) 분자의 입수성에 따라 변하는 것으로 여겨진다. 하나의 세포 중의 선택된 tRNA의 우세성은 일반적으로 펩타이드 합성에 가장 빈번하게 사용되는 코돈의 반영이다. 상응하게, 유전자를 코돈 최적화에 기반하여 주어진 유기체에서의 최적의 유전자 발현에 맞출 수 있다. 코돈 사용 표를, 예를 들어 "코돈 사용 데이터베이스"에서 쉽게 입수할 수 있으며 상기 표를 다양한 방식으로 적합화시킬 수 있다. 예를 들어 문헌[Nakamura, Y., et al., 2000]을 참조하시오. 특정한 숙주 세포에서 발현을 위해 특정한 서열을 코돈 최적화하기 위한 컴퓨터 알고리즘을 또한 입수할 수 있으며, 예를 들어 진 포지(Gene Forge)(앱타젠(Aptagen); 미국 펜실바니아주 저커버스 소재)를 또한 입수할 수 있다. 바람직하게 Cas 단백질을 암호화하는 서열 중 하나 이상의 코돈(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 또는 그 이상, 또는 모든 코돈)은 특정 아미노산에 대해 가장 빈번히 사용되는 코돈에 상응한다. 코돈 최적화에 바람직한 방법은 WO2006/077258 및 WO2008/000632에 기재되어 있다. WO2008/000632는 코돈-쌍 최적화를 다룬다. 코돈-쌍 최적화는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 개선된 발현 및/또는 상기 암호화된 폴리펩타이드의 개선된 생성을 획득하기 위해, 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 그의 코돈-사용, 특히 사용되는 코돈-쌍에 대해 변형시킨 방법이다. 코돈 쌍은 암호화 서열 중 2개의 후속적인 트리플릿(코돈)의 세트로서 정의된다. 본 발명에 따른 조성물에서 소스 중 Cas 단백질의 양은 변할 수 있으며 최적의 성능을 위해 최적화시킬 수 있다. 높은 수준의 Cas 단백질은, 안내-폴리뉴클레오타이드가 존재하지 않는다 하더라도, 숙주 세포에 대해 독성일 수 있기 때문에(예를 들어 문헌[Ryan et al., 2014] 및 문헌[Jacobs et al., 2014]을 참조하시오) 상기 숙주 세포에서 Cas 단백질의 너무 높은 수준은 피하는 것이 편할 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 예를 들어 Cas 단백질의 발현을 위해 보다 약한 프로모터, 억제성 프로모터 또는 유도성 프로모터를 선택함으로써 발현 수준을 어떻게 조절하는 지를 안다. 단백질의 발현에 적합한 프로모터의 예는 본 명세서의 다른 어딘가에 묘사되어 있다.
본 발명에 따른 안내-폴리뉴클레오타이드가 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 본 발명에 따른 조성물에서, 상기 안내-폴리뉴클레오타이드의 발현을 암호화 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결된 프로모터에 의해 촉진할 수 있다. 상기와 같은 프로모터는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 임의의 적합한 프로모터일 수 있다. 다수 유형의 프로모터를 사용할 수 있다. 편의상 RNA 폴리머라제 III 프로모터 또는 RNA 폴리머라제 II 프로모터를 사용할 수 있다. RNA 폴리머라제 III 및 그의 프로모터에 대한 배경 정보를 예를 들어 문헌[Marck et al., 2006]에서 찾을 수 있다. 상응하게, 편의상 RNA 폴리머라제 II 프로모터를 사용할 수 있으며, 상기는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있고 예를 들어 문헌[Kornberg, 1999]에 리뷰되어 있다. 그러나, RNA II 폴리머라제로부터의 전사물은 종종 복잡한 전사 종결자를 가지며 전사물은 폴리아데닐화되고; 이는, 기능성 CRISPR-Cas 시스템을 생성시키기 위해 필요한 2차 구조를 성취하기 위해서 5' 및 3' 단부를 모두 정확하게 한정할 필요가 있기 때문에 상기 안내-폴리뉴클레오타이드의 요건을 방해할 수도 있다. 그러나 상기 결점은 회피될 수 있다. RNA 폴리머라제 II 프로모터가 사용되는 경우, 상기 안내-폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 또한 자기-가공 리보자임을 암호화할 수 있고 RNA 폴리머라제 II 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있으며; 이와 같이 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 안내-폴리뉴클레오타이드 및 자기-가공 리보자임을 포함하는 프리-안내-폴리뉴클레오타이드를 암호화하며, 여기에서 상기 안내-폴리뉴클레오타이드는 전사시 상기 프리-안내-폴리뉴클레오타이드 전사물로부터 자기-가공 리보자임에 의해 방출된다. RNA 폴리머라제 II 프로모터에 작동적으로 연결된 본 발명에 따른 프리-안내-폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바람직한 구조물은 본 명세서에서 실시예 1 내지 4에 묘사된 것들이다. 상기와 같은 구조물에 대한 배경 정보를 예를 들어 문헌[Gao et al., 2014]에서 찾을 수 있다.
바람직하게, 본 발명에 따른 조성물에서, 상기 안내-폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된다.
바람직하게, 상기 안내-폴리뉴클레오타이드가 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 본 발명에 따른 조성물에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 RNA 폴리머라제 II 프로모터에 작동적으로 연결되며 상기 안내-폴리뉴클레오타이드 및 자기-가공 리보자임을 포함하는 프리-안내-폴리뉴클레오타이드를 암호화하고, 여기에서 상기 안내-폴리뉴클레오타이드는 전사시 상기 프리-안내-폴리뉴클레오타이드 전사물로부터 자기-가공 리보자임에 의해 방출된다. RNA 폴리머라제 II 프로모터에 작동적으로 연결된 본 발명에 따른 프리-안내-폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바람직한 구조물은 본 명세서에서 실시예 1 내지 4에 묘사된 것들이다. 편의상, 다수의 프리-안내-폴리뉴클레오타이드 및 다수의 자기-가공 리보자임을 하나 이상의 RNA 폴리머라제 II 프로모터에 작동적으로 연결된 단일 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화할 수 있다.
본 발명의 첫 번째 태양에 따른 조성물을 편의상 숙주 세포에서 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하는데 사용할 수 있다. 상응하게, 두 번재 태양에서, 본 발명은 숙주 세포에서 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 숙주 세포를 본 발명의 첫 번째 태양에 따른 조성물과 접촉시킴을 포함하고, 여기에서 상기 안내-폴리뉴클레오타이드는 상기 숙주 세포 중의 표적-폴리뉴클레오타이드에서 Cas 단백질의 결합을 지시하여 CRISPR-Cas 복합체를 형성시킨다.
본 발명의 상황에서 "발현"이란 용어는 본 명세서에서 폴리뉴클레오타이드가 폴리뉴클레오타이드 주형으로부터 전사되는 과정(예를 들어 DNA 주형 폴리뉴클레오타이드가 mRNA 폴리뉴클레오타이드 전사물 또는 다른 RNA 전사물로 전사된다) 및/또는 mRNA 전사물이 후속적으로 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질로 번역되는 과정으로서 정의된다. 전사물 및 암호화된 폴리펩타이드를 집합적으로 "유전자 산물"로서 지칭할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드 전사물이 게놈 주형 DNA로부터 유래되는 경우, 발현은 숙주 세포에서 상기 mRNA 전사물의 이어맞추기를 포함할 수 있다. "조절 발현"이란 용어는 본 명세서에서 동일한 조건을 사용하여 분석시 발현이 조절되지 않은 모 숙주 세포에 비해 증가되거나 감소된 발현을 지칭한다. 감소된 발현은 mRNA와 같은 전사물의 감소된 양 및/또는 폴리펩타이드와 같은 번역 산물의 감소된 양일 수 있다. 증가된 발현은 mRNA와 같은 전사물의 증대된 양 및/또는 폴리펩타이드와 같은 번역 산물의 증대된 양일 수 있음이 된다.
바람직하게, 상기 CRISPR-Cas 복합체는 상기 표적-폴리뉴클레오타이드의 위치에서 하나 또는 2개의 폴리뉴클레오타이드 가닥 모두를 절단하여 유전자 산물의 조절된 발현을 생성시킨다. 상기 CRISPR-Cas 복합체는 또한 변경된 뉴클레아제 활성을 가질 수 있으며 표적-폴리뉴클레오타이드의 하나 또는 2개의 가닥을 모두 절단하는 능력이 실질적으로 없다; 상기와 같은 경우에 발현은 표적-폴리뉴클레오타이드에 대한 상기 복합체의 결합에 의해 조절된다. 실질적으로 모든 효소 활성이 없는 Cas 단백질을 편의상 유전자 침묵화 또는 발현의 하향조절에 사용할 수 있는데, 그 이유는 상기 CRISPR-Cas 복합체가 상기 표적-폴리뉴클레오타이드로부터의 전사를 방해할 것이기 때문이다. 한편으로, Cas 단백질을 관심 유전자의 프로그램화 가능한 전사 활성화 또는 침묵화를 위한 전사 인자로 변형시킬 수 있다(문헌[Larson, et al., 2013]).
본 발명의 첫 번째 태양에 따른 조성물을 편의상 폴리뉴클레오타이드의 결실에 사용할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 첫 번째 태양에 따른 조성물이 적어도 하나 또는 2개의 안내-폴리뉴클레오타이드의 소스를 포함하고/하거나 적어도 하나의 Cas 단백질의 소스를 포함하는 경우, 상기 표적-폴리뉴클레오타이드의 하나의 위치 또는 상이한 위치에서 하나 또는 2개의 폴리뉴클레오타이드 가닥을 모두 절단하여 상기 표적-폴리뉴클레오타이드로부터 폴리뉴클레오타이드 단편의 결실을 생성시키는, 적어도 하나의 CRISPR-Cas 복합체 또는 2개의 상이한 CRISPR-Cas 복합체가 형성된다. 바람직하게, 적어도 하나 또는 2개의 안내-폴리뉴클레오타이드 및/또는 적어도 하나의 Cas 단백질의 소스를 포함하는 본 발명에 따른 상기와 같은 조성물은, 상기 안내-폴리뉴클레오타이드(들)에 의해 표적화된 적어도 하나 또는 2개의 표적-폴리뉴클레오타이드에 적어도 부분적으로 상보성인, 본 명세서에서 하기에 정의하는 바와 같은 외인성 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 결실되는 상기와 같은 폴리뉴클레오타이드 단편 또는 결실된 단편은 길이가 수 뉴클레오타이드 내지 수천 뉴클레오타이드일 수 있으며, 전체 유전자가 결실되거나 또는 유전자들의 클러스터가 결실될 수 있다. 상응하게, 본 발명은 숙주 세포에서 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하는 방법을 제공하며, 여기에서 폴리뉴클레오타이드 단편은 표적-폴리뉴클레오타이드로부터 결실된다.
하나의 실시태양에서, 발현 조절 방법은 상기 표적-폴리뉴클레오타이드 중 적어도 하나의 위치에서 하나 또는 2개의 폴리뉴클레오타이드 가닥 모두의 절단에 이어서 외인성 폴리뉴클레오타이드와의 상동성 재조합에 의한 상기 표적-폴리뉴클레오타이드의 변형을 포함한다. 상기와 같은 경우에, 본 발명의 첫 번째 태양에 따른 조성물은 바람직하게는 상기와 같은 외인성 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 상기와 같은 변형은 상기 표적-폴리뉴클레오타이드 중의 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 삽입, 결실 또는 치환을 생성시킬 수 있으며, 여기에서 상기 삽입 또는 치환 뉴클레오타이드는 상기 외인성 폴리뉴클레오타이드로부터 기원할 수 있다. 변형은 또한 상기 외인성 폴리뉴클레오타이드가 문헌[Dong et al.] 및 [Beetham et al.]에 기재된 바와 같은 비-통합 존재인 경우 이루어질 수 있으며; 이 경우에 상기 표적-폴리뉴클레오타이드는 변형되지만 상기 외인성 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드는 상기 표적-폴리뉴클레오타이드내로 도입된다. 결과적으로, 상기 생성 숙주는 본 발명에 따른 Cas-단백질을 단백질로서 숙주 세포에 도입시키는 경우 비-재조합 숙주 세포이다. 상기 외인성 폴리뉴클레오타이드는 임의의 관심 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 본 명세서에서 하기에 정의하는 바와 같은 관심 화합물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 상기와 같은 폴리뉴클레오타이드의 일부 또는 그의 변체일 수 있다. 상기와 같은 외인성 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에서 본 발명에 따른 외인성 폴리뉴클레오타이드로서 지칭되며 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
다양한 용도가 본 발명에 따른 조성물 및 방법에 대해서 당해 분야의 숙련가에 의해 고려될 수 있다. 게놈 중 폴리뉴클레오타이드(또는 유전자)를 본 발명에 따른 조성물 및 방법을 사용하여 변형시키거나, 편집하거나 또는 붕괴시킬 수 있다. 예를 들어 상기 표적-폴리뉴클레오타이드의 2개 가닥 모두를 절단하는 완전 활성 Cas 단백질을 사용하는 경우 및 외인성 폴리뉴클레오타이드가 적합한 복구 주형으로서 존재하지 않는 경우, 이중가닥 절단이 비-상동성 말단 부착 복구(NHEJ)에 의해 복구된다. NHEJ 동안 하나 또는 다수의 뉴클레오타이드의 삽입 및/또는 결실(일부의 경우에 치환으로서 이해될 수 있다)이 발생할 수 있으며, 이들은 상기 복구 부위에 무작위로 삽입되거나 결실되고; 이는 NHEJ의 특징이다. 상기와 같은 삽입 및/또는 결실은 암호화 서열의 판독 프레임에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 (조기)정지 코돈의 발생 또는 이어맞추기 부위의 변경의 경우에 유전자 산물 또는 심지어 절두된 단백질 중의 아미노산 변화를 생성시킬 수 있다.
외인성 폴리뉴클레오타이드가 복구 주형으로서 존재하는 경우, 게놈 중 폴리뉴클레오타이드(또는 유전자)를 상동성 말단 부착 복구(HEJ)(또한 상동성-지시된 복구(HDR)로서 공지되어 있다)를 사용하는 본 발명에 따른 조성물 및 방법을 사용하여 변형시키거나, 편집하거나 붕괴시킬 수 있다. 예를 들어 상기 표적-폴리뉴클레오타이드에 일치하는 서열을 갖는 외인성 폴리뉴클레오타이드(즉 상기 이중 가닥 절단의 상류(5') 및 하류(3'))가 본 발명에 따른 CRISPR-Cas 시스템과 함께 존재하는 경우, HDR은 상기 표적-폴리뉴클레오타이드 중의 이중 가닥 절단에 상기 외인성 폴리뉴클레오타이드의 상응하는 뉴클레오타이드를 도입시킬 것이다(또는 실제로 재생성시킬 것이다). 바람직하게, 본 발명에 따른 외인성 폴리뉴클레오타이드는 상기 표적 서열 자체에 이어서 기능성 PAM 서열을 함유하지 않아 상기 외인성 폴리뉴클레오타이드 자체 또는 변형된 표적-폴리뉴클레오타이드가 상기 CRISPR-Cas 시스템에 의해 (재)절단될 위험을 피한다.
본 발명의 실시태양에서, 본 발명에 따른 CRISPR-Cas 시스템이 외인성 폴리뉴클레오타이드(공여체 폴리뉴클레오타이드, 공여체 DNA, 복구 주형)를 포함하는 경우, 본 발명에 따른 CRISPR-Cas 시스템은 바람직하게는 하나 이상의 별도의 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터에 의해 암호화되거나 또는 상기 상에 존재하는 2개 이상의 안내-폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 2개 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드는 상기 CRISPR-Cas 시스템과 함께 제공되어 2개 이상의 CRISPR-Cas 복합체의 형성을 가능하게 한다. 본 발명에 따른 방법에서, 본 발명에 따른 상기와 같은 CRISPR-Cas 시스템을 편의상 2개 이상의 표적-폴리뉴클레오타이드에서의 발현을 조절하는데 사용할 수 있다, 즉 다수의 표적 부위를 표적화하는 방법에 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 상기와 같은 CRISPR-Cas 시스템은 하나 이상의 표적-폴리뉴클레오타이드에서 우연히 1, 2 또는 그 이상의 CRISPR-Cas 복합체를 형성시킬 것이다. 상기와 같은 방법을 사용하여 숙주 세포의 게놈 중에, 임의로 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드와 함께 하나 이상의 삽입, 결실, 치환을 생성시키거나, 또는 상기 형성된 CRISPR-Cas 복합체를 통해 유전자의 발현을 조절할 수 있다.
숙주 세포
본 발명의 상기 태양에 따른 방법에서, 바람직한 숙주 세포는 본 명세서의 다른 어딘가에서 정의된 바와 같은 관심 화합물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 상기 태양에 따른 방법에서, 상기 숙주 세포는 재조합 숙주 세포이거나 또는 비-재조합 숙주 세포일 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 숙주 세포는 라비린툴로마이세트, 바람직하게는 트라우스토키트리알레스 목의 일원, 바람직하게는 트라우스토키트리아세아에 과의 일원, 보다 바람직하게는 아우란티오키트리움, 오블롱기키트리움, 스키조키트리움, 트라우스토키트리움 및 울케니아로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 속의 일원, 훨씬 더 바람직하게는 스키조키트리움 종 ATCC# 20888이다.
본 발명의 상기 태양에 따른 숙주 세포 중의 폴리뉴클레오타이드의 발현 조절 방법은, 바람직하게는 본 발명의 첫 번째 태양에 따른 조성물의 성분들을 포함하는 변형된 숙주 세포를 생성시킨다. 상응하게, 세 번째 태양에서, 본 발명은 본 발명의 첫 번째 태양에 따른 조성물을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 상기와 같은 숙주 세포는 본 명세서에 정의된 바와 같은 임의의 숙주 세포일 수 있으며 본 명세서에서 달리 어딘가에 정의된 바와 같은 관심 화합물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있다.
네 번째 태양에서, 본 발명은 숙주 세포의 생성 방법을 제공하며, 상기 방법은 숙주 세포를 본 발명의 첫 번째 태양에 따른 조성물과 접촉시킴을 포함하고, 여기에서 상기 안내-폴리뉴클레오타이드는 상기 숙주 세포 중의 표적-폴리뉴클레오타이드에서 Cas 단백질의 결합을 지시하여 CRISPR-Cas 복합체를 형성시킨다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 첫 번째 태양에 따른 조성물과의 접촉을 2 단계로 수행할 수 있으며, 여기에서 상기 숙주 세포를 본 발명에 따른 Cas 단백질의 소스와 1차 접촉시키고 후속으로 상기 숙주 세포를 본 발명에 따른 안내-폴리뉴클레오타이드의 소스 및 임의로 본 발명에 따른 외인성 폴리뉴클레오타이드와 접촉시킨다. 본 발명의 상기 실시태양에서 숙주 세포는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 임의의 유형의 숙주 세포일 수 있으며 본 명세서의 다른 어딘가에 정의된 바와 같은 관심 화합물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 숙주 세포의 바람직한 생성 방법은 자손 숙주 세포를 생성시키는 단계를 포함하며, 여기에서 상기 자손 숙주 세포 중에 본 발명에 따른 CRISPR-Cas 시스템의 성분은 더 이상 존재하지 않는다.
본 발명의 첫 번째 태양에 따른 조성물은 본 명세서에 정의된 바와 같은 임의의 상기와 같은 조성물일 수 있다. 숙주 세포를 본 발명에 따른 조성물과 접촉시키는 것을 당해 분야의 숙련가에게 공지된 임의의 수단에 의해 수행할 수 있다. 본 발명에 따른 숙주 세포를 간단히 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 용액으로 가져올 수 있다. 본 발명에 따른 조성물을 숙주 세포로 전달하는 특정한 수단을 사용할 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 상기와 같은 방법들을 알고 있으며(예를 들어 상기 문헌[Sambrook & Russell]; 문헌[Ausubel]을 참조하시오), 여기에는 비제한적으로 일렉트로포레이션 방법, 입자 충격 또는 미립자가속장치 충격, 원형질체 방법 및 아그로박테리움(Agrobacterium) 매개된 형질전환(AMT)이 포함된다. 라비린툴로마이세테스를 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 형질전환시킬 수 있다. 트라우스토키트리드의 유전자 형질전환을 위한 일반적인 기법이 미국특허 제 7,001,772 호 및 미국특허 제 8,637,651 호 및 문헌[Cheng et al. (2012)](이들은 모두 내용 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다)에 상세히 기재되어 있다.
바람직하게, 상기 CRISPR-Cas 복합체는 상기 표적-폴리뉴클레오타이드의 위치에서 하나 또는 2개의 폴리뉴클레오타이드 가닥 모두를 절단하여 상기 유전자 산물의 조절된 발현을 생성시킨다. 상기 CRISPR-Cas 복합체는 또한 변경된 뉴클레아제 활성을 가질 수 있으며 표적-폴리뉴클레오타이드의 하나 또는 2개의 가닥 모두를 절단하는 능력이 없을 수 있고; 상기와 같은 경우에, 발현은 상기 복합체의 상기 표적-폴리뉴클레오타이드에의 결합에 의해 조절된다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 첫 번째 태양에 따른 조성물이 적어도 하나 또는 2개의 안내-폴리뉴클레오타이드의 소스 및/또는 적어도 하나의 Cas 단백질의 소스를 포함하는 경우, 상기 표적-폴리뉴클레오타이드의 하나의 위치 또는 상이한 위치에서 하나 또는 2개의 폴리뉴클레오타이드 가닥을 모두 절단하여, 상기 표적-폴리뉴클레오타이드로부터 폴리뉴클레오타이드 단편의 결실을 생성시키는 적어도 하나의 CRISPR-Cas 복합체 또는 2개의 상이한 CRISPR-Cas 복합체가 형성된다. 바람직하게, 적어도 하나 또는 2개의 안내-폴리뉴클레오타이드 및/또는 적어도 하나의 Cas 단백질의 소스를 포함하는 본 발명에 따른 상기와 같은 조성물은 상기 안내-폴리뉴클레오타이드(들)에 의해 표적화된 상기 적어도 하나 또는 2개의 표적-폴리뉴클레오타이드에 적어도 부분적으로 상보성인, 본 명세서에서 하기에 정의하는 바와 같은 외인성 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 결실되는 상기와 같은 폴리뉴클레오타이드 단편 또는 결실된 단편은 길이가 수 뉴클레오타이드 내지 수천 뉴클레오타이드일 수 있으며, 전체 유전자가 결실되거나 또는 유전자들의 클러스터가 결실될 수 있다. 상응하게, 본 발명은 숙주 세포에서 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하는 방법을 제공하며, 여기에서 폴리뉴클레오타이드 단편은 표적-폴리뉴클레오타이드로부터 결실된다.
하나의 실시태양에서, 폴리뉴클레오타이드 단편이 표적-폴리뉴클레오타이드로부터 결실되는, 숙주 세포 중의 폴리뉴클레오타이드의 발현 조절 방법은 숙주 세포를 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물과 접촉시킴을 포함하며, 여기에서 상기 안내-폴리뉴클레오타이드는 상기 숙주 세포 중의 표적-폴리뉴클레오타이드에서 상기 Cas 단백질의 결합을 지시하여 CRISPR-Cas 복합체를 형성시킨다. 바람직하게, 폴리뉴클레오타이드 단편이 표적-폴리뉴클레오타이드로부터 결실되는, 숙주 세포 중의 폴리뉴클레오타이드의 발현 조절 방법은 숙주 세포를 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물과 접촉시킴을 포함하며, 여기에서 상기 안내-폴리뉴클레오타이드는 상기 숙주 세포 중의 표적-폴리뉴클레오타이드에서 상기 Cas 단백질의 결합을 지시하여 CRISPR-Cas 복합체를 형성시킨다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, 폴리뉴클레오타이드 단편이 표적-폴리뉴클레오타이드로부터 결실되는, 숙주 세포 중의 폴리뉴클레오타이드의 발현 조절 방법은 숙주 세포를 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물과 접촉시킴을 포함하며, 여기에서 상기 안내-폴리뉴클레오타이드는 상기 숙주 세포 중의 표적-폴리뉴클레오타이드에서 상기 Cas 단백질의 결합을 지시하여 CRISPR-Cas 복합체를 형성시키고, 여기에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물은 외인성 또는 공여체 폴리뉴클레오타이드를 포함하지 않는다. 숙주 세포에서 폴리뉴클레오타이드의 발현 조절 방법의 또 다른 실시태양에서, 상기 조성물은 자율적으로 복제하는 벡터 중에 포함된다.
따라서, 본 발명은 하나의 실시태양에서 세포 중의 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하는 방법에 관한 것으로, 여기에서 폴리뉴클레오타이드 단편이 표적-폴리뉴클레오타이드로부터 결실되며, 상기 방법은 숙주 세포를 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물과 접촉시킴을 포함하지만, 바람직하게는 본 명세서에 정의된 바와 같은 공여체 폴리뉴클레오타이드는 포함하지 않으며, 여기에서 상기 안내-폴리뉴클레오타이드는 상기 숙주 세포 중의 표적-폴리뉴클레오타이드에서 Cas 단백질의 결합을 지시하여 CRISPR-Cas 복합체를 형성시킨다.
바람직한 실시태양에서, 상기 Cas 단백질은 상기 표적-서열의 위치에서 2개의 폴리뉴클레오타이드 가닥 모두의 절단을 지시하는 활성을 가지며, 여기에서 상기 절단은, 상기 Cas 단백질에 의해 절단시 서로 재결합하여 2개의 상동성 영역들 사이에 포함된 폴리뉴클레오타이드의 결실을 생성시키는 상기 영역들 사이에 포함된 게놈의 영역 중에서 발생한다. 바람직하게, 상기 2개의 상동성 영역간의 상동성 정도는 상동성 재조합을 허용하는 정도이다. 바람직하게, 상기 2개의 상동성 영역은 상기 상동성 영역의 전체 길이에 걸쳐 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는다. 놀랍게도, 상동성 영역의 길이는 라비린툴로마이세테스에서조차 매우 짧을 수 있으며, 여기에서 상동성 재조합을 허용하기 위해서 대개는 적어도 1 또는 수 kbp의 길이가 필요한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 바람직한 실시태양에서, 상기 상동성 영역의 길이는 바람직하게는 1 kb 이하, 0.5 kb 이하, 100 bp 이하, 50 bp 이하, 40 bp 이하, 30 bp 이하, 20 bp 이하, 10 bp 이하이다.
바람직하게 상기 2개의 상동성 영역간의 거리는 10 kb 이하, 9 이하, 8 kb 이하, 7 kb 이하, 6 kb 이하, 5 kb 이하, 4 kb 이하, 3 kb 이하, 2 kb 이하, 1 kb 이하, 0.5 kb 이하, 100bp 이하, 50bp 이하, 40bp 이하, 30 bp 이하, 20 bp 이하, 10 bp 이하이다.
하나의 태양에서, 본 발명은 하나 이상의 PAM 부위를 표적화하고 공여체 DNA의 사용 없이 폴리뉴클레오타이드의 결실을 생성시키는 방법을 설계하기 위해서 상기 PAM 부위의 이웃 중 약 7 내지 20 bp의 상동성 영역 사이에 포함된 게놈 중에서 PAM 부위를 식별할 수 있는 소프트웨어 알고리즘에 관한 것이다.
상기 방법을 설계된 방식으로 폴리뉴클레오타이드 서열의 효율적인 제거에 사용할 수 있다. 예를 들어, Cas9 발현 카세트를 상기 게놈 DNA에 도입시킬 때 및 상기 CRISPR/CAS9 시스템에 의해 매개되는 수회 라운드의 변형 후에, 상기 CAS9 발현 카세트를 상기 Cas9 발현 카세트 중의 한 부위를 표적화하는 gRNA의 도입에 의해 상기 게놈으로부터 제거할 수 있으며, 여기에서 상기 Cas9 발현 카세트는 상기 정의된 바와 같은 2개의 상동성 영역 사이에, 바람직하게 100-bp 길이로, 보다 바람직하게 20-bp, 15-bp 길이로 또는 더 짧게 포함되며, 상기 Cas9 개방 판독 프레임 또는 상기 발현 카세트의 큰 부분을 절단시킨다.
상기 방법을 또한 유전자의 일시적인 불활성화에 사용할 수 있다. 예를 들어, 각각 5'-단부 및 3'-단부에 2개의 상동성 영역을 포함하는 카로티노이드 신타제 또는 포화된 지방산 신타제 또는 다중불포화된 지방산 신타제 유전자의 ORF에 폴리뉴클레오타이드 서열을 삽입함으로써 상기 유전자(예를 들어 카로티노에드 신타제 또는 포화된 지방산 신타제 또는 다중불포화된 지방산 신타제)를 비-기능성으로 만들 수 있으며, 여기에서 바람직하게 상기 상동성 영역은 100-bp, 보다 바람직하게 20-bp, 15-bp 길이이거나 또는 더 짧다. 상기 언급한 신타제 유전자를 상술한 바와 같이 공여체 DNA 없이 CRISPR-Cas9 시스템을 사용하여 다시 기능성으로 만들 수 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 발현 조절 방법은 상기 표적-폴리뉴클레오타이드의 적어도 하나의 위치에서 하나 또는 2개의 폴리뉴클레오타이드 가닥 모두의 절단에 이어서 외인성 폴리뉴클레오타이드와의 상동성 재조합에 의한 상기 표적-폴리뉴클레오타이드의 변형을 포함한다. 상기와 같은 경우에, 본 발명의 첫 번째 태양에 따른 조성물은 바람직하게는 상기와 같은 외인성 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 상기와 같은 변형은 상기 표적-폴리뉴클레오타이드 중의 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 삽입, 결실 또는 치환을 생성시킬 수 있으며, 여기에서 상기 삽입 또는 치환 뉴클레오타이드는 상기 외인성 폴리뉴클레오타이드로부터 기원할 수도 또는 기원하지 않을 수도 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 외인성 폴리뉴클레오타이드는 상기 표적-폴리뉴클레오타이드와의 상동성 영역을 포함한다. 바람직하게, 이들 상동성 영역간의 상동성 정도는 상동성 재조합을 허용하는 정도이다. 바람직하게 상기 상동성 영역은 상기 상동성 영역의 전체 길이에 걸쳐 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는다. 상기 외인성 폴리뉴클레오타이드가 비-통합 개체인 경우 변형을 또한 수행할 수 있으며; 이 경우에 상기 표적-폴리뉴클레오타이드는 변형되지만 상기 외인성 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드는 상기 표적-폴리뉴클레오타이드내로 도입되지 않는다. 결과적으로, 상기 생성되는 숙주는 본 발명에 따른 Cas-단백질을 단백질로서 상기 숙주 세포에 도입시킬 때 비-재조합 숙주이다. 따라서, 본 발명의 상기 태양에 따른 방법에서, 상기 숙주 세포는 재조합 숙주 세포이거나 또는 비-재조합 숙주 세포일 수 있다. 상기 외인성 폴리뉴클레오타이드는 임의의 관심 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 본 명세서에서 정의된 바와 같은 관심 화합물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 상기와 같은 폴리뉴클레오타이드의 일부 또는 그의 변체일 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 관심 화합물의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 관심 화합물에 도움이 되는 조건하에서 본 발명의 세 번째 또는 네 번째 태양에 따른 숙주 세포 또는 본 발명의 두 번째 태양에 따른 방법에 의해 수득된 숙주 세포, 또는 본 발명의 네 번째 태양에 따른 방법에 의해 수득될 수 있는 숙주 세포를 배양하고 임의로 상기 관심 화합물을 정제 또는 단리시킴을 포함한다.
본 발명의 모든 실시태양의 상황에서 관심 화합물은 임의의 생물학적 화합물일 수 있다. 상기 생물학적 화합물은 바이오매스 또는 생물중합체 또는 대사길항물질일 수 있다. 상기 생물학적 화합물은 단일 폴리뉴클레오타이드 또는 생합성 또는 대사 경로를 구성하는 일련의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되거나 또는 단일 폴리뉴클레오타이드의 생성물 또는 일련의 폴리뉴클레오타이드의 생성물의 직접적인 결과일 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오타이드는 유전자일 수 있고, 상기 일련의 폴리뉴클레오타이드는 유전자 클러스터일 수 있다. 본 발명의 모든 실시태양에서, 상기 생물학적 관심 화합물을 암호화하는 단일 폴리뉴클레오타이드 또는 일련의 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 생물학적 관심 화합물과 관련된 생합성 또는 대사 경로는 본 발명에 따른 조성물 및 방법에 바람직한 표적이다. 상기 생물학적 화합물은 상기 숙주 세포에 고유하거나 또는 상기 숙주 세포에 이종일 수 있다.
"이종 생물학적 화합물"이란 용어는 본 명세서에서 상기 세포에 고유하지 않은 생물학적 화합물; 또는 구조적 변형이 이루어져 상기 고유의 생물학적 화합물을 변경시킨 고유의 생물학적 화합물로서 정의된다.
"생물중합체"란 용어는 본 명세서에서 동일하거나, 유사하거나 또는 다른 서브유닛(단량체)의 쇄로서 정의된다. 상기 생물중합체는 임의의 생물중합체일 수 있다. 상기 생물중합체는 예를 들어 비제한적으로 핵산, 폴리아민, 폴리올, 폴리펩타이드(또는 폴리아미드), 또는 폴리사카라이드일 수 있다.
상기 생물중합체는 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 관심 생물학적 활성을 갖는 임의의 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 "폴리펩타이드"란 용어는 본 명세서에서 특정 길이의 암호화된 생성물을 지칭함을 의미하지 않으며, 따라서 펩타이드, 올리고펩타이드, 및 단백질을 포함한다. 폴리펩타이드란 용어는 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭한다. 상기 중합체는 선형이거나 분지될 수 있으며, 상기는 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 상기는 비-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 상기 용어는 또한 변형된 아미노산 중합체를 포함한다; 예를 들어 다이설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작, 예를 들어 표지화 성분과의 접합. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "아미노산"이란 용어는 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산, 예를 들어 글리신 및 D 또는 L 광학 이성질체 모두, 및 아미노산 유사체 및 펩티도유사물질을 포함한다. 폴리펩타이드는 천연 대립유전자 및 상기-언급한 폴리펩타이드의 조작된 변형 및 하이브리드 폴리펩타이드를 추가로 포함한다. 상기 폴리펩타이드는 상기 숙주 세포에 고유하거나 또는 이종일 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 콜라겐 또는 젤라틴이거나, 또는 그의 변체 또는 하이브리드일 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 항체 또는 그의 부분, 항원, 응고인자, 효소, 호르몬 또는 호르몬 변체, 수용체 또는 그의 부분, 조절 단백질, 구조 단백질, 리포터, 또는 수송 단배질, 분비 과정에 관련된 단백질, 폴딩 과정에 관련된 단백질, 셰프론, 펩타이드 아미노산 수송체, 글리코실화 인자, 전사 인자, 합성 펩타이드 또는 올리고펩타이드, 세포내 단백질일 수 있다. 상기 세포내 단백질은 효소, 예를 들어 프로테아제, 세라미다제, 에폭사이드 하이드롤라제, 아미노펩티다제, 아실라제, 알돌라제, 하이드록실라제, 아미노펩티다제, 리파제일 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 또한 세포외로 분비된 효소일 수 있다. 상기와 같은 효소는 옥시도리덕타제, 트랜스퍼라제, 하이드롤라제, 라이아제, 아이소머라제, 리가제, 카탈라제, 셀룰라제, 키티나제, 큐티나제, 데옥시리보뉴클레아제, 덱스트라나제, 에스테라제의 그룹에 속할 수 있다. 상기 효소는 카보하이드라제, 예를 들어 셀룰라제, 예를 들어 엔도글루카나제, β-글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제 또는 β-글루코시다제, 헤미셀룰라제 또는 펙틴분해 효소, 예를 들어 자일라나제, 자일로시다제, 만나나제, 갈락타나제, 갈락토시다제, 펙틴 메틸 에스테라제, 펙틴 라이아제, 펙테이트 라이아제, 엔도 폴리갈락튜로나제, 엑소폴리갈락튜로나제 람노갈락튜로나제, 아라바나제, 아라비노퓨라노시다제, 아라비녹실란 하이드롤라제, 갈락튜로나제, 라이아제, 또는 전분분해 효소; 하이드롤라제, 아이소머라제, 또는 리가제, 포스파타제, 예를 들어 피타제, 에스테라제, 예를 들어 리파제, 단백질분해 효소, 옥시도리덕타제, 예를 들어 옥시다제, 트랜스퍼라제, 또는 아이소머라제일 수 있다. 상기 효소는 피타제일 수 있다. 상기 효소는 아미노펩티다제, 아스파라기나제, 아밀라제, 말토제닉 아밀라제, 카보하이드라제, 카복시펩티다제, 엔도-프로테아제, 메탈로-프로테아제, 세린-프로테아제 카탈라제, 키티나제, 큐티나제, 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼라제, 데옥시리보뉴클레아제, 에스테라제, 알파-갈락토시다제, 베타-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 알파-글루코시다제, 베타-글루코시다제, 할로페록시다제, 단백질 데아미나제, 인베르타제, 라카제, 리파제, 만노시다제, 뮤타나제, 옥시다제, 펙틴분해 효소, 페록시다제, 포스포리파제, 갈락토리파제, 클로로필라제, 폴리페놀옥시다제, 리보뉴클레아제, 트랜스글루타미나제, 또는 글루코스 옥시다제, 헥소스 옥시다제, 모노옥시게나제일 수 있다.
본 발명에 따라, 관심 화합물은 WO2010/102982에 기재된 바와 같은 개선된 분비 특징을 갖는 폴리펩타이드 또는 효소일 수 있다. 본 발명에 따라, 관심 화합물은 또 다른 폴리펩타이드가 상기 폴리펩타이드 또는 그의 단편의 N-말단 또는 C-말단에 융합된, 융합된 또는 하이브리드 폴리펩타이드일 수 있다. 융합된 폴리펩타이드는 하나 이상의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열(또는 그의 일부)을 또 다른 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열(또는 그의 일부)에 융합시킴으로써 생성된다.
융합 폴리펩타이드의 생성 기법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 암호화 서열들을 이들이 인프레임이고 상기 융합된 폴리펩타이드의 발현이 동일한 프로모터(들) 및 종결자의 조절하에 있도록 결찰시킴을 포함한다. 상기 하이브리드 폴리펩타이드는 적어도 2개의 상이한 폴리펩타이드로부터 수득된 부분적인 또는 완전한 폴리펩타이드 서열의 조합을 포함할 수 있으며, 여기에서 하나 이상은 상기 숙주 세포에 대해 이종일 수 있다. 융합 폴리펩타이드 및 신호 서열 융합의 예는 예를 들어 WO2010/121933에 기재된 바와 같다.
상기 생물중합체는 폴리사카라이드일 수 있다. 상기 폴리사카라이드는 임의의 폴리사카라이드, 예를 들어 비제한적으로 뮤코폴리사카라이드(예를 들어 헤파린 및 히아루론산) 및 질소-함유 폴리사카라이드(예를 들어 키틴)일 수 있다. 바람직한 옵션에서, 상기 폴리사카라이드는 히아루론산이다.
상기 관심 화합물을 암호화하거나 본 발명에 따른 상기 관심 화합물의 생성에 관련된 화합물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 1차 또는 2차 대사산물, 예를 들어 유기산, 카로티노이드, (베타-락탐) 항생제 및 비타민의 합성에 관련된 효소를 암호화할 수 있다. 상기와 같은 대사산물은 본 발명에 따른 생물학적 화합물로서 간주될 수 있다.
"대사산물"이란 용어는 1차 및 2차 대사산물 모두를 포함하며; 상기 대사산물은 임의의 대사산물일 수 있다. 바람직한 대사산물은 불포화된 지방 및 지질(비제한적으로 지방산 도코사헥사엔산, 도코사펜타엔산, 에루크산, 파울린산, 바크센산(시스 또는 트랜스), 에이코사펜타엔산, 에이코사테트라엔산(n-3), 아라키돈산(n-6), 옥사데카펜타엔산, 스테아리돈산, 리놀렌산(n6 또는 n3), 리놀레산, 올레산, 팔미톨레산, 옥타코사옥타엔산, 및 이들 중에 포함된 지질을 포함한다), 포화된 지방 및 지질(비제한적으로 지방산: 카프로산, 카프릴산, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키드산, 베헨산, 및 이들 중에 포함된 지질을 포함한다), 황산화된 지질, 소포로지질, 락톤, 세라미드, 인지질, 지방 알콜, 지방산 에스터, 지방산 에테르, 지방산 알데하이드, 스테롤, 카로티노이드, 옥시리핀, 레솔빈, 류코트리엔, 프로스타글란딘, 유기산(비제한적으로 아세트산, 부티르산, 시트르산, 글루콘산, 아디프산, 푸마르산, 이타콘산, 말산, 메발론산 및 숙신산을 포함한다), 당 알콜 및 당산이다.
대사산물은 예를 들어 생합성 또는 대사 경로 중의 하나 이상의 유전자에 의해 암호화될 수 있다. 1차 대사산물은 세포의 1차 또는 일반적인 대사의 산물이며, 이는 에너지 대사, 성장 및 구조에 관한 것이다. 2차 대사산물은 2차 대사의 산물이다(예를 들어 문헌[R. B. Herbert, The Biosynthesis of Secondary Metabolites, Chapman and Hall, New York, 1981]을 참조하시오).
1차 대사산물은 비제한적으로 아미노산, 지방산, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 당, 트리글리세라이드, 또는 비타민일 수 있다.
2차 대사산물은 비제한적으로 알칼로이드, 쿠마린, 플라보노이드, 폴리케타이드, 퀴닌, 스테로이드, 펩타이드 또는 터펜일 수 있다. 상기 2차 대사산물은 항생제, 섭식저해물질, 유인물질, 살균제, 살진균제, 호르몬, 살충제, 또는 살서제일 수 있다.
상기 생물학적 화합물은 또한 선택성 마커의 생성물일 수 있다. 선택성 마커는 생성물이 살생물제 또는 바이러스 내성, 중금속 내성, 영양요구체에 대한 원영양요구 등을 제공하는 관심 폴리뉴클레오타이드의 생성물이다. 선택성 마커는 비제한적으로 nptII(네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II), ALS(아세토락테이트 신타제), bsd(블라스티시딘-S-데아미나제), 및 Sh ble(플레오마이신 결합)뿐만 아니라 이들의 균등물을 포함한다.
본 발명에 따라, 관심 화합물은 바람직하게는 관심 화합물 목록에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드이다.
본 발명의 또 다른 실시태양에 따라, 관심 화합물은 바람직하게는 대사산물이다.
본 발명에 따른 숙주 세포는 이미 상기 관심 화합물을 생성할 수 있다. 상기 숙주 세포에는 또한 폴리펩타이드를 암호화하는 동종 또는 이종 핵산 구조물이 제공될 수 있으며, 여기에서 상기 폴리펩타이드는 상기 관심 화합물 또는 상기 관심 화합물의 생성에 관련된 폴리펩타이드일 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 상기 관심 화합물을 생성할 수 있도록 조류 숙주 세포를 어떻게 변형시키는 지를 알고 있다.
일반적인 정의
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위 전체를 통해서, "포함하다", "함유하다" 및 "갖는"이란 단어 및 "포함하다", "포함하는", "함유하다" 및 "함유하는"과 같은 변형들은 포괄적으로 해석되어야 한다. 즉, 이들 단어는 문맥상 허용되는 경우 구체적으로 명시되지 않은 다른 요소들 또는 정수들의 가능한 포함을 전달하고자 한다.
"하나의"란 용어는 본 명세서에서 상기 관사의 문법적 목적어 중 하나 또는 하나 초과(즉 하나 또는 적어도 하나)를 지칭한다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미할 수 있다.
"약" 또는 "대략적으로"란 단어는 수치와 함께 사용될 때(예를 들어 약 10) 바람직하게는 상기 값이 상기 주어진 값(10)의 1% 초과 또는 미만의 값일 수 있음을 의미한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 과학기술 용어들은 본 명세가 속하는 분야의 통상적인 숙련가에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
바람직한 뉴클레오타이드 유사체 또는 균등물은 변형된 주쇄를 포함한다. 상기와 같은 주쇄의 예는 모폴리노 주쇄, 카바메이트 주쇄, 실록산 주쇄, 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 주쇄, 포름아세틸 및 티오포름아세틸 주쇄, 메틸렌포름아세틸 주쇄, 리보아세틸 주쇄, 알켄 함유 주쇄, 설파메이트, 설포네이트 및 설폰아미드 주쇄, 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 주쇄, 및 아미드 주쇄에 의해 제공된다. 주쇄 중의 잔기간의 결합은 인 원자를 포함하지 않는 것, 예를 들어 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오사이드간 결합, 혼합된 이종원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오사이드간 결합, 또는 하나 이상의 단쇄 이종원자 또는 헤테로사이클릭 뉴클레오사이드간 결합에 의해 형성되는 것이 더욱 바람직하다.
바람직한 뉴클레오타이드 유사체 또는 균등물은 변형된 폴리아미드 주쇄(문헌[Nielsen, et al. (1991) Science 254, 1497-1500]를 갖는 펩타이드 핵산(PNA)을 포함한다. PNA-계 분자는 염기쌍 인식에 관하여 DNA 분자의 진정한 유사물질이다. 상기 PNA의 주쇄는 펩타이드 결합에 의해 연결된 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위로 구성되며, 여기에서 상기 핵염기는 메틸렌 카보닐 결합에 의해 주쇄에 연결된다. 또 다른 주쇄는 1-탄소 연장된 피롤리딘 PNA 단량체를 포함한다(문헌[Govindaraju and Kumar (2005) Chem. Commun, 495-497]). PNA 분자의 주쇄는 하전된 포스페이트기를 함유하지 않으므로, PNA-RNA 하이브리드가 각각 RNA-RNA 또는 RNA-DNA 하이브리드보다 대개는 더 안정하다(문헌[Egholm et al. (1993) Nature 365, 566-568]).
더욱 바람직한 주쇄는 모폴리노 뉴클레오타이드 유사체 또는 균등물을 포함하며, 여기에서 리보스 또는 데옥시리보스 당이 6-원 모폴리노 고리에 의해 교체된다. 가장 바람직한 뉴클레오타이드 유사체 또는 균등물은 포스포로다이아미데이트 모폴리노 올리고머(PMO)를 포함하며, 여기에서 상기 리보스 또는 데옥시리보스 당은 6-원 모폴리노 고리에 의해 교체되고, 인접한 모폴리노 고리들간의 음이온성 포스포다이에스터 결합은 비-이온성 포스포로다이아미데이트 결합에 의해 교체된다.
추가의 바람직한 뉴클레오타이드 유사체 또는 균등물은 상기 포스포다이에스터 결합 중의 비-가교 산소 중 적어도 하나의 치환을 포함한다. 상기 변형은 염기-짝짓기를 약간 탈안정화시키지만 뉴클레아제 분해에 상당한 내성을 가한다. 바람직한 뉴클레오타이드 유사체 또는 균등물은 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 포스포트라이에스터, 아미노알킬포스포트라이에스터, H-포스포네이트, 3'-알킬렌 포스포네이트, 5'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함한 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포아미데이트 및 아미노알킬포스포아미데이트를 포함한 포스포아미데이트, 티오노포스포아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트라이에스터, 셀레노포스페이트 또는 보라노포스페이트를 포함한다.
더욱 바람직한 뉴클레오타이드 유사체 또는 균등물은 2', 3' 및/또는 5' 위치에서 일- 또는 이치환된 하나 이상의 당 부분, 예를 들어 -OH; -F; 하나 이상의 헤테로원자에 의해 중단될 수 있는, 치환되거나 비치환된, 선형 또는 분지된 저급(C1-C10) 알킬, 알케닐, 알키닐, 알크아릴, 알릴, 아릴, 또는 아르알킬; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; O-, S-, 또는 N-알릴; O-알킬-O-알킬, -메톡시, -아미노프로폭시; 아미노옥시, 메톡시에톡시; -다이메틸아미노옥시에톡시; 및 -다이메틸아미노에톡시에톡시를 포함한다. 상기 당 부분은 피라노스 또는 그의 유도체, 또는 데옥시피라노스 또는 그의 유도체, 바람직하게는 리보스 또는 그의 유도체, 또는 데옥시리보스 또는 그의 유도체일 수 있다. 상기와 같은 바람직한 유도체화된 당 부분은 잠김 핵산(LNA)(여기에서 2'-탄소 원자는 당 고리의 3' 또는 4' 탄소 원저에 결합되어 바이사이클릭 당 부분을 형성한다)을 포함한다. 바람직한 LNA는 2'-O,4'-C-에틸렌-가교된 핵산을 포함한다(문헌[Morita et al. 2001. Nucleic Acid Res Supplement No. 1: 241-242]). 이들 치환은 상기 뉴클레오타이드 유사체 또는 균등물을 RNase H 및 뉴클레아제 내성으로 만들고 표적에 대한 친화성을 증가시킨다.
본 발명의 상황에서 아미노산- 또는 핵산-서열의 "서열 일치성" 또는 "일치성"은 본 명세서에서 서열들간의 비교에 의해 측정된 바와 같은, 2개 이상의 아미노산(펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질) 서열 또는 2개 이상의 핵산(뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드) 서열간의 관계로서 정의된다. 당해 분야에서, "일치성"은 또한 경우에 따라, 서열들의 스트링간의 합치에 의해 측정된 바와 같은, 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열들간의 서열 관련성 정도를 의미한다. 본 발명 내에서, 특정 서열과의 서열 일치성은 바람직하게는 상기 특정 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열의 전체 길이에 걸친 서열 일치성을 의미한다.
2개의 아미노산 서열간의 "유사성"은 하나의 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 아미노산 서열 및 그의 보존된 아미노산 치환체를 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 서열에 비교함으로써 측정된다. 바람직한 실시태양에서, 일치성 또는 유사성은 본 명세서에서 확인된 바와 같은 전체 서열(서열번호)에 걸쳐 산정된다. "일치성" 및 "유사성"은 공지된 방법, 예를 들어 비제한적으로 문헌[Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988]; 문헌[Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993]; 문헌[Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994]; 문헌[Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987]; 및 문헌[Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991]; 및 문헌[Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988)]에 기재된 것들에 의해 쉽게 산정될 수 있다.
일치성을 측정하기에 바람직한 방법은 시험된 서열들간의 최대의 합치를 제공하도록 설계된다. 일치성 및 유사성을 측정하기 위한 방법은 공개적으로 입수할 수 있는 컴퓨터 프로그램에 체계적으로 정리되어 있다. 2개 서열간의 일치성 및 유사성을 측정하기에 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은 예를 들어 GCG 프로그램 패키지(문헌[Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984)]), BestFit, BLASTP, BLASTN, 및 FASTA(문헌[Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)])를 포함한다. 상기 BLAST X 프로그램은 NCBI 및 다른 소스로부터 공개적으로 입수할 수 있다(문헌[BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894]; 문헌[Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]). 주지된 스미스 워터맨(Smith Waterman) 알고리즘을 또한 일치성 측정에 사용할 수 있다.
폴리펩타이드 서열 비교에 바람직한 매개변수는 하기와 같다: 알고리즘: 니들맨 앤드 분취(Needleman and Wunsch)(문헌[J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970)]); 비교 행렬: BLOSSUM62(문헌[Hentikoff and Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992)]); 끊김 벌점: 12; 및 끊김 길이 벌점: 4. 이들 매개변수에 유용한 프로그램을 미국 위스콘신주 매디슨에 위치한 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)으로부터 "Ogap" 프로그램으로서 공개적으로 입수할 수 있다. 상기 언급한 매개변수는 아미노산 비교를 위한 디폴트 매개변수(단부 끊김에 대한 벌점 없음과 함께)이다.
핵산 비교에 바람직한 매개변수는 하기와 같다: 알고리즘: 니들맨 앤드 분취(문헌[J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970)]); 비교 행렬: 합치 = +10, 오합치 = 0; 끊김 벌점: 50; 끊김 길이 벌점: 3. 미국 위스콘신주 매디슨에 위치한 제네틱스 컴퓨터 그룹으로부터 끊김 프로그램으로서 입수할 수 있다. 핵산 비교용 디폴트 매개변수는 상기에 제공되어 있다.
임의로, 아미노산 유사성 정도의 측정에서, 숙련가는 또한 상기 숙련가에게 명백한 바와 같이, 소위 "보존적" 아미노산 치환을 고려할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 잔기들의 호환성을 지칭한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 아이소류신이고; 지방족-하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 세린 및 쓰레오닌이며; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 아스파라진 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판이며; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 리신, 아르기닌 및 히스티딘이고; 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환기는 발린-류신-아이소류신, 페닐알라닌-타이로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 및 아스파라진-글루타민이다. 본 명세서에 개시된 아미노산 서열의 치환적 변체는 상기 개시된 서열 중 적어도 하나의 잔기가 제거되었고 상이한 잔기가 대신에 삽입된 것들이다. 바람직하게, 상기 아미노산 변화는 보존적이다. 각각의 천연 아미노산에 대한 바람직한 보존적 치환은 하기와 같다: Ala에서 ser로; Arg에서 lys로; Asn에서 gln 또는 his로; Asp에서 glu로; Cys에서 ser 또는 ala로; Gln에서 asn로; Glu에서 asp로; Gly에서 pro로; His에서 asn 또는 gln로; Ile에서 leu 또는 val로; Leu에서 ile 또는 val로; Lys에서 arg로; gln 또는 glu로; Met에서 leu 또는 ile로; Phe에서 met, leu 또는 tyr로; Ser에서 thr로; Thr에서 ser로; Trp에서 tyr로; Tyr에서 trp 또는 phe로; 및 Val에서 ile 또는 leu로.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 뉴클레오타이드 서열에 의해 나타낸다. 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 아미노산 서열에 의해 나타낸다. 본 발명에 따른 핵산 구조물은 천연 유전자로부터 단리되거나 또는 달리 자연에는 존재하지 않는 방식으로 결합되거나 병치된 폴리뉴클레오타이드의 분절을 함유하도록 변형된 폴리뉴클레오타이드로서 정의된다. 임의로, 본 발명에 따른 핵산 구조물 중에 존재하는 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 조절 서열에 작동적으로 연결되며, 상기 서열은 숙주 세포 또는 무세포 시스템에서 암호화된 생성물의 생성 또는 발현을 지시한다.
본 명세서에 제공된 바와 같은 서열 정보는 잘못 식별된 염기의 포함을 요하는 것으로 좁게 이해되어서는 안 된다. 숙련가는 상기와 같은 잘못 식별된 염기를 식별할 수 있으며 상기와 같은 오류를 어떻게 보정하는 지를 알고 있다.
본 발명의 모든 실시태양, 즉 본 발명에 따른 조성물, 발현의 조절 방법, 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 숙주 세포, 본 발명에 따른 숙주 세포의 생성 방법, 본 발명에 따른 숙주 세포, 및 본 발명에 따른 관심 화합물의 생성 방법은 바람직하게는 무세포 시험관내 시스템이 아닌 숙주 세포를 참조한다; 즉, 본 발명에 따른 CRISPR-Cas 시스템은 바람직하게는 무세포 시험관내 시스템이 아닌 숙주 세포 시스템이다.
본 발명의 모든 실시태양, 예를 들어 본 발명에 따른 조성물, 발현의 조절 방법, 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 숙주 세포, 본 발명에 따른 숙주 세포의 생성 방법, 본 발명에 따른 숙주 세포, 및 본 발명에 따른 관심 화합물의 생성 방법에서, 상기 숙주 세포는 반수체, 이배체 또는 배수체 숙주 세포일 수 있다.
본 발명에 따른 숙주 세포는 라비린툴로마이세테스 숙주 세포, 바람직하게는 트라우스토키트리알레스 목, 보다 바람직하게는 트라우스토키트리아세아에 과, 보다 바람직하게는 아우란티오키트리움, 오블롱기키트리움, 스키조키트리움, 트라우스토키트리움 및 울케니아로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 속의 일원, 훨씬 더 바람직하게는 스키조키트리움 종 ATCC# 20888이다.
바람직하게는 게놈 중 변형은 본 명세서에서 하나 이상의 변형으로서 이해된다. 바람직하게는 본 발명에 따른 숙주 세포의 게놈 중 변형은
a) 모 숙주 세포에 재조합 유전자 조작 기법을 가하고/가하거나
b) 모 숙주 세포에 (고전적인) 돌연변이유발을 가하고/가하거나;
c) 모 숙주 세포에 억제 화합물 또는 조성물을 가함
으로써 수행될 수 있다.
숙주 세포의 게놈의 변형은 본 명세서에서 상기 숙주 세포의 게놈 중 폴리뉴클레오타이드 서열의 변화를 생성시키는 임의의 사건으로서 정의된다.
바람직하게, 본 발명에 따른 숙주 세포는 바람직하게는, 동일한 조건하에서 분석시, 변형되지 않은 모 숙주 세포와 비교하는 경우 본 명세서에서 정의된 바와 같은 불필요한 화합물을 생성시키지 않거나 감소시키는 그의 게놈 중의 변형을 갖는다.
변형을 당해 분야의 숙련가에게 공지된 임의의 수단에 의해, 예를 들어 고전적인 균주 개선, 무작위 돌연변이유발에 이은 선택에 의해 도입시킬 수 있다. 변형을 또한 부위-지향된 돌연변이유발에 의해 도입시킬 수 있다.
변형을 폴리뉴클레오타이드 서열 중 하나 이상의 뉴클레오타이드의 도입(삽입), 치환(교체), 또는 제거(결실)에 의해 수행할 수 있다. 폴리펩타이드와 같은 불필요한 화합물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 전체 또는 부분 결실을 성취할 수 있다. 불필요한 화합물은 본 명세서에서 달리 어딘가에 나열된 임의의 불필요한 화합물일 수 있으며; 상기는 또한 대사산물과 같은 불필요한 화합물의 생물학적 합성 경로에서 단백질 및/또는 효소일 수 있다. 한편으로, 상기 불필요한 화합물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를, 상기 불필요한 화합물을 암호화하지 않거나 또는 상기 불필요한 화합물의 부분적으로 또는 완전히 불활성인 형태를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열로 부분적으로 또는 완전히 교체할 수 있다. 또 다른 대안에서, 하나 이상의 뉴클레오타이드를 상기 불필요한 화합물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드내에 삽입시켜 상기 폴리뉴클레오타이드의 붕괴 및 결과적으로 상기 붕괴된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 상기 불필요한 화합물의 부분적인 또는 완전한 불활성화를 생성시킬 수 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 돌연변이 미생물 숙주 세포는
a) 불필요한 화합물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 완전한 또는 부분적인 결실,
b) 불필요한 화합물을 암호화하지 않거나 또는 상기 불필요한 화합물의 부분적으로 또는 완전히 불활성인 형태를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의한, 상기 불필요한 화합물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 완전한 또는 부분적인 교체,
c) 불필요한 화합물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열 중 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입에 의한 상기 폴리뉴클레오타이드의 붕괴 및 결과적인 상기 붕괴된 폴리뉴클레오타이드에 의한 상기 불필요한 화합물의 부분적인 또는 완전한 불활성화
중에서 선택된 그의 게놈 중의 변형을 포함한다.
상기 변형은 예를 들어 상기 불필요한 화합물의 전사 또는 번역에 필요한 암호화 서열 또는 조절 요소 중에 있을 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드를 정지 코돈의 도입, 개시 코돈의 제거 또는 암호화 서열의 개방 판독 프레임의 변화 또는 프레임-이동을 생성시키기 위해 삽입하거나 제거할 수 있다. 상기 암호화 서열 또는 그의 조절 요소의 변형을 부위-지향된 또는 무작위 돌연변이유발, DNA 셔플링 방법, DNA 조립 방법, 유전자 합성(예를 들어 문헌[Young and Dong (2004), Nucleic Acids Research 32(7) electronic access at nar.oupjournals.org/cgi/reprint/32/7/e59 or Gupta et al. (1968), Proc. Natl. Acad. Sci USA, 60: 1338-1344]; 문헌[Scarpulla et al. (1982), Anal. Biochem. 121: 356-365; Stemmer et al. (1995), Gene 164: 49-53]을 참조하시오), 또는 당해 분야에 공지된 방법에 따른 PCR 생성된 돌연변이유발에 의해 수행할 수 있다. 무작위 돌연변이유발 과정의 예는 당해 분야에 주지되어 있다, 예를 들어 화학적(예를 들어 NTG) 돌연변이유발 또는 물리적(예를 들어 UV) 돌연변이유발. 부위-지향된 돌연변이유발 과정의 예는 퀵체인지(QuickChange)(상표) 부위-지향된 돌연변이유발 키트(스트라타진 클로닝 시스템(Stratagene Cloning Systems), 미국 캘리포니아주 라졸라 소재), 디 얼터드 사이츠('The Altered Sites)(등록상표) II 시험관내 돌연변이유발 시스템스(프로메가 코포레이션(Promega Corporation)) 또는 문헌[Ho et al., "Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction", Gene, 1989 Apr 15, 77(1):51-9]에 기재된 바와 같은 PCR을 사용하거나 또는 문헌[Molecular Biology: Current Innovations and Future Trends., Eds. A.M. Griffin and H.G. Griffin. ISBN 1-898486-01-8; 1995 Horizon Scientific Press, PO Box 1, Wymondham, Norfolk, U.K.]에 기재된 바와 같은 PCR을 사용하는 오버랩 연장에 의한 것이다.
바람직한 변형 방법은 재조합 유전자 조작 기법, 예를 들어 부분 또는 완전한 유전자 교체 또는 부분 또는 완전한 유전자 결실을 기반으로 한다.
예를 들어, 폴리뉴클레오타이드, 핵산 구조물 또는 발현 카세트의 교체의 경우에, 적합한 DNA 서열을 교체하려는 표적 유전자좌에 도입시킬 수 있다. 적합한 DNA 서열은 바람직하게는 클로닝 벡터상에 존재한다. 바람직한 통합적인 클로닝 벡터는 DNA 단편을 포함하며, 상기 단편은 폴리뉴클레오타이드에 상동성이고/이거나, 소정의 유전자좌에의 클로닝 벡터의 통합을 표적화하기 위해 교체시키고자 하는 유전자좌에 측면 인접한 폴리뉴클레오타이드에 상동성을 갖는다. 표적화된 통합을 촉진하기 위해서, 상기 클로닝 벡터를 바람직하게는 세포의 형질전환에 앞서 선형화시킨다. 바람직하게, 선형화를 상기 클로닝 벡터의 적어도 하나, 바람직하게는 어느 한 단부가, 교체시키려는 DNA 서열(또는 측면에 인접한 서열)에 상동성인 서열에 측면 인접하도록 수행한다. 상기 과정을 상동성 재조합이라 칭하며 상기 기법을 또한 (부분적인) 유전자 결실을 성취하기 위해 사용할 수 있다.
예를 들어, 내인성 폴리뉴클레오타이드에 상응하는 폴리뉴클레오타이드를 결함성 폴리뉴클레오타이드, 즉 (완전히 기능성인) 폴리펩타이드를 생성시키지 못하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 교체시킬 수 있다. 상동성 재조합에 의해, 상기 결함성 폴리뉴클레오타이드는 상기 내인성 폴리뉴클레오타이드를 대체한다. 상기 결함성 폴리뉴클레오타이드는 또한 마커를 암호화하는 것이 바람직할 수 있으며, 상기 마커는 핵산 서열이 변형된 형질전환체의 선택에 사용될 수 있다.
불필요한 화합물을 생성시키지 않거나 상기 화합물의 생성을 감소시키는 변형을, 상이한 방법에 의해, 예를 들어 상기와 같은 불필요한 화합물에 대한 항체 또는 화학적 억제제 또는 단백질 억제제 또는 물리적 억제제에 의해 획득할 수 있다(문헌[Tour O. et al., "Genetically targeted chromophore-assisted light inactivation", (2003) Nat. Biotech]). 한편으로, 또는 상기 언급한 기법과 함께, 불필요한 화합물의 감소된 생성 또는 생성되지 않음을 또한 예를 들어 UV 또는 화학적 돌연변이유발(문헌[Lian et al., "Increase of docosahexaenoic acid production by Schizochytrium sp. through mutagenesis and enzyme assay" (2010) Appl Biochem Biotechnol 162(4):935-941])에 의해 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 불필요한 폴리펩타이드의 효소 활성을 억제하는 억제제의 사용(예를 들어 β-글루코시다제의 억제제로서 기능하는 노지리마이신(문헌[Ren et al., "Effect of biotin and cerulenin addition on DHA production by Schizochytrium sp." (2012-01) Chinese J Bioprocess Engineering])에 의해 획득할 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 숙주 세포의 게놈 중 변형은 불필요한 화합물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 적어도 하나의 위치에서의 변형이다.
화합물, 예를 들어 불필요한 화합물, 예를 들어 불필요한 폴리펩타이드 및/또는 효소의 생성에서 세포의 결함은 본 명세서에서, 바람직하게는 게놈 중에서, 동일한 조건하에서 분석시 상기 세포가 변형되지 않은 모 숙주 세포에 비해, a) 상기 불필요한 화합물을 덜 생성시키거나 상기 불필요한 화합물을 실질적으로 생성시키지 않고/않거나 b) 감소된 활성 또는 감소된 비활성을 갖는 상기 불필요한 화합물, 또는 활성을 갖지 않거나 비활성을 갖지 않는 불필요한 화합물, 및 상기 가능성들 중 하나 이상의 조합을 생성시키는 표현형 특징을 생성시키도록 변형된 돌연변이 미생물 숙주 세포로서 정의된다.
바람직하게, 본 발명에 따른 변형된 숙주 세포는, 변형되지 않았고 동일한 조건하에서 측정된 모 숙주 세포에 비해 1% 미만의 상기 불필요한 화합물, 적어도 5% 미만의 상기 불필요한 화합물, 적어도 10% 미만의 상기 불필요한 화합물, 적어도 20% 미만의 상기 불필요한 화합물, 적어도 30% 미만의 상기 불필요한 화합물, 적어도 40% 미만의 상기 불필요한 화합물, 적어도 50% 미만의 상기 불필요한 화합물, 적어도 60% 미만의 상기 불필요한 화합물, 적어도 70% 미만의 상기 불필요한 화합물, 적어도 80% 미만의 상기 불필요한 화합물, 적어도 90% 미만의 상기 불필요한 화합물, 적어도 91% 미만의 상기 불필요한 화합물, 적어도 92% 미만의 상기 불필요한 화합물, 적어도 93% 미만의 상기 불필요한 화합물, 적어도 94% 미만의 상기 불필요한 화합물, 적어도 95% 미만의 상기 불필요한 화합물, 적어도 96% 미만의 상기 불필요한 화합물, 적어도 97% 미만의 상기 불필요한 화합물, 적어도 98% 미만의 상기 불필요한 화합물, 적어도 99% 미만의 상기 불필요한 화합물, 적어도 99.9% 미만의 상기 불필요한 화합물, 또는 가장 바람직하게는 100% 미만의 상기 불필요한 화합물을 생성시킨다.
본 명세서에 제공된 바와 같은 서열 정보는 잘못 식별된 염기의 포함을 요하는 것으로 좁게 이해되어서는 안 된다. 숙련가는 상기와 같은 잘못 식별된 염기를 식별할 수 있으며 상기와 같은 오류를 어떻게 보정하는 지를 알고 있다.
본 명세서에 제시된 각각의 참고문헌의 개시는 내용 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다.
본 발명을 하기의 실시예들에 의해 추가로 예시한다:
실시예
실시예 1
형질전환을 위한 Cas9 벡터의 설계 및 형성
스트렙토코커스 피오게네스 MGAS5005 Cas9 서열을 스키조키트리움에서 발현을 위해 코돈-최적화하였다. 사용된 기본 Cas9 펩타이드 서열은 기재된 HA-태그 또는 GFP 융합 없이, 문헌[Jinek et al., 2013]에 사용된 바와 근본적으로 동일하였다(하기를 참조하시오). 상기 Cas9를 합성한 후에(DNA2.0, 미국 캘리포니아주 뉴워크 소재), 상기를 파로모마이신 선택 카세트를 함유하는 pCL122 벡터내로 클로닝하여 pCL122-Cas9(서열번호 )로 표기되는 벡터를 생성시켰다. OrfA/Pfa1 측면을 합성하고 pCL121(제오신 선택 카세트를 가졌다)내에 클로닝하고(젠스크립트(Genscript) USA, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재) 최종 벡터를 pYB31(서열번호 2)로 표기하였다; 예를 들어 미국특허 제 8,940,884 호를 참조하시오. 상기 Cas9 유전자를, BamHI 및 NdeI 제한 부위 및 효소(뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 미국 매사추세츠주 입스위치 소재)(도 3) 및 래피드 DNA 라이게이션(Rapid DNA Ligation) 키트(롯슈(Roche), 스위스 리치-로트크로이츠 소재)를 사용하여 절단 및 결찰을 통해 pCL122-Cas9 벡터로부터 pYB31 벡터내로 서브클로닝하였다. NEB10β 화학적 수용성 세포를 형질전환시키고(뉴잉글랜드 바이오랩스) 생성 콜로니를, 프라이머 121 Tub seq F(서열번호 13) 및 pYB32/3C R1(서열번호 14)(표 2) 및 5% DMSO(v:v)와 함께 선택된 콜로니, GoTaq 그린 마스터 믹스(프로메가(Promega), 미국 일리노이주 시카고 소재)를 사용하여 콜로니 PCR에 의해 선별하였으며 하기의 순환 조건을 상기 반응에 적용하였다: 95 ℃ 5분, (95 ℃ 30초, 59 ℃ 30초, 72 ℃ 1분) x 35주기, 72 ℃ 5분(도 4). 플라스미드를 PCR에 의해 양성 콜로니로부터 단리하고, 서열분석하고, 하나의 생성 벡터를 pYB32(서열번호 3)로 표기하였다.
프라이머 명칭 서열번호 프라이머 서열, 5′→ 3′
121 Tub seq F 13 GGATCTCATGCTGGAGTTCTTC
pYB32/3C R1 14 GTACTTCTCGTGGTAGGCAACC
앞서 언급한 바와 같이, 다른 연구들은 Cas9 발현의 수준이 형질전환체 생육성 및 뉴클레아제 활성의 최적화에 중요함을 지적하였다. 상기 pYB32 플라스미드에서, 상기 Cas9 유전자는 중간 강도 프로모터인 알파 튜불린 프로모터의 조절하에 있다. 카로틴 신타제(CS) 유전자로부터의 약한 프로모터를 또한 시험하고자 선택하였으며 인퓨전(InFusion) PCR 클로닝(클론테크/타카라 바이오 USA 인코포레이티드(Clontech/Takara Bio USA Inc.), 미국 캘리포니아주 마운틴뷰 소재)을 통해 pYB31내로 클로닝하였다. pYB31 플라스미드를 인퓨전 클로닝을 위한 준비에서 KpnI 및 NdeI 효소(뉴잉글랜드 바이오랩스)로 절단하였다. CS 프로모터를, 5% DMSO(v:v), KOD 핫스타트 마스터 믹스(HotStart Master Mix)(EMD 밀리포어(Millipore), 미국 매사추세츠주 빌레리카 소재) 및 주형으로서 사용된, CS 프로모터를 갖는 플라스미드 pTH043과 함께, CS 프로 KpnI IF F1(서열번호 15) 및 CS 프로 BamHI IF R1 프라이머(서열번호 16)(표 3)로 증폭시켰다. 반응 순환 조건은 하기와 같았다: 95 ℃ 2분, (95 ℃ 20초, 66 ℃ 10초, 70 ℃ 20초) x 35주기, 70 ℃ 2분. Cas9를, 5% DMSO(v:v), KOD 핫스타트 마스터 믹스, 및 주형으로서 사용된 pCL122-Cas9와 함께, CS 프로 BamHI IF F2(서열번호 17) 및 CS 프로 NdeI IF R2(서열번호 18) 프라이머(표 3)로 증폭시켰다. 반응 순환 조건은 하기와 같았다: 95 ℃ 2분, (95 ℃ 20초, 65 ℃ 10초, 70 ℃ 1분 45초) x 35주기, 70 ℃ 2분.
프라이머 명칭 서열 번호 프라이머 서열, 5′→ 3′
CS pro Kpn IF F1 15 GTCTGAATTCCCGGGGTACCGAGCGGGCGATTCCACCGTC
CS pro BamH IF R1 16 GTACTTCTTATCCATGGATCCCTCGGTCTCCGAGCGAGCGAG
CS pro BamH IF F2 17 TCGCTCGCTCGGAGACCGAGGGATCCATGGATAAGAAGTAC
CS pro Nde IF R2 18 GATTCACTAGTTTAGATCATATGTTAGACCTTGCGCTTCTTCTTAGGGTCC
PCR 산물을 1% 아가로스 젤(론자(Lonza), 스위스 바젤 소재)상에서 실행시키고, 예상된 크기의 밴드를 절제하고 QIAquick 젤 추출 키트(퀴아겐(Qiagen), 독일 힐덴 소재)를 사용하여 젤 정제하였다(도 3). 인퓨전 클로닝에 대한 제조사의 프로토콜에 따라, 상기 Cas9 PCR 단편, CS 프로모터 PCR 단편 및 선형화된 pYB31 단편을 결찰하고, NEB10β 화학적 수용성 세포를 형질전환시키고, 생성 콜로니를 상술한 바와 같은 콜로니 PCR에 의해 선별하였다(도 4)(72 ℃에서 1분 30초 연장 시간으로). 서열 확인 후에, 상기 CS 프로모터에 작동적으로 연결된 Cas9를 함유하는 생성 벡터들 중 하나를 pYB33(서열번호 4)으로 표기하였다.
pYB32 및 pYB33의 클로닝을 절단, 결찰 및 인퓨전 PCR 클로닝의 조합을 통해 수행하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 단편들이 모두 생성되었으며 컬럼 정제후 예상된 크기의 밴드를 가졌다. 절단된 플라스미드 및 PCR 증폭된 단편을 1% 아가로스 젤상에서 실행시켰다. 모든 레인에서 하기와 같이 예상된 크기의 단편들이 관찰되었다: pYB31-BamHI+NdeI=838 bp + 6555 bp, pYB31-KpnI+NdeI=1289bp + 6104bp, Cas9-BamHI+NdeI=4157bp + 5773bp, CS PCR 단편=1046 bp, Cas9 PCR 단편=4189 bp. 상기 젤 및 모든 후속 젤들에 사용된 분자량 마커는 DNA 콴티-래더(Quanti-Ladder)(오리진(Origene), 미국 메릴랜드주 록빌 소재)였으며, 단편 크기를 도 3의 우측 패널에 나타낸다.
pYB32 및 pYB33 세균 형질전환으로부터 생성되는 콜로니를 콜로니 PCR에 의해 분석하였으며, 예상된 크기의 증폭산물을 갖는 콜로니들을 도 4에 굵은 글씨로 표시한다. 이들 콜로니는 pYB32-2, -4, -9, -14, -15, -24, -25, -28, 및 pYB33-16 및 pYB33D-1, -14이다. pYB32-2 및 pYB33-16이 정확한 서열을 갖는 것으로 확인된 것들 중에 있었으며 이들을 후속 연구에 사용하였다. pYB32 및 pYB33의 클로닝으로부터의 콜로니 PCR 결과들에 대해서, 예상된 증폭산물 크기는 하기와 같다: pYB32=1028 bp, pYB33=1584bp.
실시예 2
Cas9 형질전환체의 형질전환 및 선택
스키조키트리움 종의 야생형 균주, ATCC 20888을 하기에 기재하는 바와 같은 입자 충격 방법 및 유전자총 장비(바이오래드(Bio-Rad), 미국 노쓰캐롤라이나주 롤리 소재)를 사용하여 pYB32 및 pYB33에 의한 형질전환에 사용하였다. 간단히, 20888을 27 ℃에서 250 ㎖ 편평-바닥 삼각 플라스크 중의 25 ㎖의 M50-20 배지(예를 들어 미국특허 제 8,003,772 호를 참조하시오)에서, 200 rpm에서 밤새 진탕시키면서 증식시켰다. 상기에 이어서, 상기 배양물을 250 ㎖ 진탕형 플라스크 중의 50 ㎖의 M2B 배지(예를 들어 미국특허 제 8,003,772 호를 참조하시오)에 1/100 희석하고 동일한 조건하에서 밤새 증식시켰다. 상기 스키조키트리움 배양물이 초기 로그기(0.6-2 OD 단위/㎖)에 있었을 때, 배양물을 3,220 x g에서 10분간 원심분리에 의해 수확하였다. 상등액을 경사분리하고, 펠릿을 M2B에 20 OD 단위/㎖의 최종 농도로 재현탁시키고 100 ㎕의 생성 세포 현탁액을 비-선택성 M2B 아가 플레이트(대략적으로 4 ㎝ 직경)의 대략 1/3상에 환상 움직임으로 도말하였다. 플라스미드 pYB32 및 pYB33을 25 ℃에서 밤새 SwaI로 절단하고 QIAquick PCR 정제 키트(퀴아겐, 독일 힐덴 소재)를 사용하여 정제하였다. 이어서 5 ㎍의 각각의 정제된 플라스미드를 50 ㎕의 2.5 M CaCl2, 20 ㎕의 0.1 M 스페르미딘 및 50 ㎕의 제조된 M10 텅스텐 비드(제조사의 프로토콜에 따라, 바이오 래드)와 혼합하고, 1분간 와동시키고, 이어서 실온에서 10분간 배양하여 상기 비드를 침전되게 하였다. DNA-코팅된 비드를 250 ㎕의 100% 에탄올로 1회 세척하고, 이어서 비드를 60 ㎕의 100% 에탄올에 재현탁시켰다. 각각의 제조된 거대담체(거대담체 조립 제조에 대한 제조사의 프로토콜에 따라)는 거대담체 디스크의 중심에 스폿팅된 에탄올 중의 코팅된 비드 10 ㎕를 가졌으며 에탄올은 건조되었다. 파열판 홀더는 70% 아이소프로판올 중에서 짧은 멸균 후 내부에 놓은 1,100 psi-지정된 파열판을 가졌으며, 조립된 거대담체를 꼭대기 선반 위치의 유전자총 플랫폼에 설치하고 스키조키트리움의 세포 패치가 있는 M2B 아가 플레이트를 상기 꼭대기로부터 세 번째 선반상에 세포쪽을 위로 하여 놓았다. 진공이 상기 유전자총 챔버내부에서 약 27 psi에 도달했으면, 파열판이 파손될 때까지 헬륨을 발사하고, 헬륨 흐름을 차단시키고, 상기 챔버를 대기로 배기시키고, 충격판을 상기 챔버로부터 제거하였다. 상기 충격 과정을 모든 샘플 및 대조용에 대해 반복하였으며, pYB32로 충격된 스키조키트리움 종 20888을 T188로 표기하고, pYB33으로 충격된 스키조키트리움 배양물은 T189로 표기하였다. 충격판을 27 ℃에서 4시간 동안 배양하고, 그 후에 세포를 상기 플레이트로부터 약 1 ㎖의 M2B로 세척하고 0.4% 무작위-메틸화된 β-사이클로덱스트린(CTD 홀딩스 인코포레이티드(Holdings, Inc.), 미국 플로리다주 하이스프링스 소재) 중의 0.5 mM DHA(누첵 프렙(Nu-Chek Prep), 미국 미네소타주 워터빌 소재) 및 50 ㎍/㎖ 제오신(써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific), 미국 매사추세츠주 월썸 소재)을 함유하는 4개의 M2B 아가 플레이트들간에 균등하게 분배하였다. 세포를 3 ㎜ 멸균 유리 비드로 도말하고, 비드를 제거하고 플레이트를 싸고 27 ℃에서 약 7 내지 10일 동안 배양하였다. 콜로니의 크기가 2 내지 4 밀리미터에 도달했을 때, 각각의 콜로니를 DHA(상술한 바와 같이 무작위로 메틸화된 β-사이클로덱스트린과 복합체화되었다)와 함께 또는 상기 없이 100 ㎍/㎖ 제오신을 함유하는 M2B 아가 플레이트상에 반복해서 덧대어 OrfA/Pfa1 유전자의 붕괴에 의해 유도된 영양요구변이를 선택하였다.
DHA에 대해 영양요구성인 것으로 확인된 콜로니를 고르고, 250 ㎖ 편평 바닥 삼각 플라스크 중의 40% β-사이클로덱스트린 및 50 mM DHA 용액 500 ㎕가 보충된 50 ㎖의 M50-20내에 접종하고, 27 ℃ 진탕기에서 200 rpm에서 48시간 동안 두었다. 48시간 배양후에, 2 ㎖의 배양물을 5,000xg에서 10분간 원심분리에 의해 수집하고, 상등액을 경사분리하고, 펠릿을 변형된 페놀-클로로포름 추출에 따른 게놈 DNA 단리에 사용하였다. 게놈 DNA를 추출하고 GoTaq 그린 마스터믹스(프로메가, 미국 노쓰캐롤라이나주 더럼 소재)와 함께 PCR 주형으로서 사용하고 pYB32 및 pYB33에 대한 콜로니 PCR 선별에 대해 기재된 바와 같은 프라이머, GoTaq 그린 마스터 믹스 및 순환 조건을 사용하여 제오신 카세트 및 Cas9 유전자의 존재를 확인하였다(도 5). 상기 T188 및 T189 형질전환체 중의 OrfA/Pfa1 유전자의 붕괴를 PCR에 의해 확인하였다. 구체적으로, 5' 측면인접 영역을, O A1-KO F(서열번호 19) 및 pYB32/3 SV40 R1(서열번호 20) 프라이머(표 4), GoTaq 그린 마스터믹스, 5% DMSO(v:v) 및 주형으로서 T188/T189 gDNA와 함께 PCR에 의해 탐문하였으며, 순환 조건은 하기와 같았다: 95 ℃ 2분, (95 ℃ 30초, 60 ℃ 30초, 72 ℃ 2분 15초) x 35주기, 72 ℃ 5분. 더욱 또한, 3' 측면인접 영역을, O A1-KO R(서열번호 21) 및 pYB32/2 CF1(서열번호 22) 프라이머(표 4), GoTaq 그린 마스터믹스, 5% DMSO(v:v) 및 주형으로서 T188/T189 gDNA와 함께 PCR에 의해 탐문하였으며, 순환 조건은 하기와 같았다: 95 ℃ 2분, (95 ℃ 30초, 59 ℃ 30초, 72 ℃ 2분) x 35주기, 72 ℃ 5분(도 6).
프라이머 명칭 서열번호 프라이머 서열, 5′→ 3′
O A1-KO F 19 CCAAGTTCGCCAAGGCTTC
pYB32/3 SV40 R1 20 GTGGAATCGAAATCTCGTAGCAC
O A1-KO R 21 GCTGTTGCAACTTTGCTCCAC
pYB32/3C F1 22 GTTAAGAAGACCGAGGTCCAGAC
Cas9 유전자 통합 및 OrfA/Pfa1에서의 붕괴에 대한 PCR에 의한 양성 배양물을, 무작위로 메틸화된 β-사이클로덱스트린 및 DHA가 보충된 25 ㎖의 M50-20에 접종하고, 앞서 기재된 바와 같이 24시간 동안 증식시켰다. 상기 배양물의 OD600을 측정하고, 각 배양물의 2 OD 단위를, 250 ㎖ 진탕형 삼각 플라스크 중의 무작위로 메틸화된 β-사이클로덱스트린 및 DHA가 보충된 50 ㎖의 SPFM, pH 6.75에 접종하고 27 ℃ 진탕기에서 200 rpm으로 48시간 동안 증식시킨 후에 5% 글리세롤(v:v)을 저온보존을 위해 가하였다. 2개의 클론, 각각 형질전환 그룹으로부터 하나씩을 추가의 연구 - T188-1-20 및 T189-1-20을 위해 선택하였다.
야생형 스키조키트리움 종 20888을 충격에 의해 pYB32 및 pYB33으로 형질전환시켜, 다중불포화된 지방산(PUFA) 신타제의 OrfA/PFA1 유전자좌에서 Cas9의 삽입에 기인하여 20888 중에 DHA 영양요구변이를 생성시켰다. 콜로니들을 카운트하고 DHA가 있거나 없는 선택성 플레이트상에서 반복하여 덧대었다. DHA에 대해 영양요구성인 콜로니를 상기 2개의 형질전환 그룹 모두로부터 무작위로 골라 추가의 특성화를 위해 사용하였다.
하기 표 5에 나타낸 바와 같이, pYB33 플라스미드에 의한 형질전환 효율이 pYB32 플라스미드의 경우보다 더 낮았으며, 발견된 영양요구성 콜로니들의 분획에 대해 유사한 성향이 관찰되었다.
형질전환 5 ㎍ DNA당 총 콜로니 영양요구성 콜로니 녹아웃%
T188: pYB32―Tub pro-Cas9 160 80 50%
T189: pYB33―CS pro-Cas9 96 37 38.5%
T188 및 T189 형질전환체를 Cas9에 결합된 프로모터의 존재 및 상기 Cas9 유전자의 상류 영역에 대해 탐문하였다. T188 클론에 대해서, 예상된 증폭산물 크기는 1028 bp이고, T189는 1584 bp였다. 도 5에 도시된 바와 같이, 클론 T189-1-30을 제외한 모두가 상기 예상된 증폭산물 크기를 생성시켰으며 이들을 추가의 시험에 사용하였다.
상기 OrfA/Pfa1 유전자좌 중 Cas9의 통합을 PCR에 의해 확인하였으며, 5' 및 3' 측면인접 영역을 모두 야생형-특이성 외부 프라이머 및 Cas9-특이성 내부 프라이머의 조합으로 증폭시켰고, 따라서 증폭산물은 오직 통합이 발생한 경우에만 성취될 수 있었다(도 6). 상기 Cas9 통합 부위의 5' 측면에 대한 예상 증폭산물 크기는 2229 bp였고, 3' 측면의 경우 1973 bp였다. 상기 시험된 균주들은 모두 OrfA/Pfa1 유전자좌에서 Cas9의 통합에 대해 양성이었다.
실시예 3
gRNA 벡터의 설계 및 형성
상기 안내 RNA(gRNA) 카세트는 모두 스키조키트리움으로부터 유래된 연장 인자 1α(EF-1α) 프로모터에 의해 발현되도록 설계되었다. 각각의 경우에, 상기 gRNA 서열은 2개의 리보자임 서열, 헴머헤드 및 HDV가 측면에 인접해 있다(문헌[Gao Y and Zhao Y "Self-processing of ribozyme-flanked RNAs into guide RNAs in vitro and in vivo for CRISPR-mediated genome editing" J Integr Plant Biol. 56(4):343-349 (2014)]). "NGG" 프로토스페이서-인접 모티프를 함유하는 4개의 표적 서열이 카로틴 신타제 유전자내에서 확인되었으며 각각의 바로 상류 20 bp가 표적 서열로서 선택되었다. 상기 두 리보자임 모두, 표적 서열 및 안내 RNA를 포함하는 하나의 카세트를 합성하고 BglII 및 NdeI 부위(DNA2.0)를 사용하여 pCL122 벡터내에 클로닝하여 pCL401-추가적인 클로닝을 위한 전구체 플라스미드(서열번호 7)로 표기된 벡터를 생성시켰다. 최종 gRNA 카세트 벡터를 제조하기 위해서, 플라스미드 pSP73(프로메가)을 NdeI 및 HPaI로 절단하고 생성되는 보다 큰 단편을 젤 정제하였다. 스키조키트리움 지방산 신타제 단편(FAS)의 단편을, 5' FAS PmeNde(서열번호 23) 및 3' FAS PmeHpa(서열번호 24) 프라이머(표 6), KOD 핫 스타트 마스터믹스, 및 5% DMSO와 함께 스키조키트리움 종 20888 게놈 DNA로부터 PCR에 의해, 하기의 순환 조건을 사용하여 증폭시켰다: 95 ℃ 2분, (95 ℃ 20초, 62 ℃ 10초, 70 ℃ 51초) x 40주기, 70 ℃ 5분(도 7). 상기 생성 단편을 HpaI 및 NdeI 제한 효소로 절단하고 정제하였다.
프라이머 명칭 서열번호 프라이머 서열, 5′→ 3′
5′ FAS PmeNde 23 TAGCATATGTTTAAACTCGCGGCGTCTTTCGC
3′ FAS PmeHpa 24 AGTTAACGTTTAAACAGAGGAGGTGGCTGGC
적합한 정제 및 절단된 pSP73 및 FAS 단편을 래피드 DNA 라이게이션 키트(롯슈)를 사용하여 결찰시키고 NEB10β 세포(뉴잉글랜드 바이오랩스)내로 형질전환시켜 벡터 pCL399(서열번호 5)를 생성시켰다. 이어서 상기 pCL399 벡터를 NdeI 엔도뉴클레아제 단독으로 절단하고, 단부를 녹두 뉴클레아제(뉴잉글랜드 바이오랩스)로 절두하고, 상기 벡터를 래피드 DNA 결찰 키트로 재결찰시켜 NdeI 부위를 제거하였다. 상기 생성 벡터를 pCL400(서열번호 6)으로 표기하였다. 파로모마이신 발현 카세트 및 gRNA 카세트를 인퓨전 PCR 클로닝에 의해, XhoI로 미리절단시킨 pCL400내로 삽입되는 주형으로서 pCL401(서열번호 7)을 사용하여 증폭시켜 벡터 pCL402(서열번호 8)를 생성시켰다. 간단히, pCL402 IF F(서열번호 25) 및 PCL402 IF R(서열번호 26) 프라이머(표 7), 5% DMSO(v:v), KOD 핫 스타트 마스터믹스, pCL401 플라스미드 주형을 사용하고 하기 순환 조건을 사용하여 pCL401로부터 목적하는 단편을 증폭시켰다: 95 ℃ 2분, (95 ℃ 20초, 60 ℃ 10초, 70 ℃ 1분 25초) x 35주기, 70 ℃ 5분(도 8). 상기 생성 벡터를 pCL402로 표기하였다.
프라이머 명칭 서열번호 프라이머 서열, 5′→ 3′
pCL402 IF F 25 GAGGCGCTGACCGCCGGCCAAGCTTCCAATTTTAGGCC
pCL402 IF R 26 GCAGGTGCCGAGTTTCTCGAGAAGAATCTGAACTCACGTC
4개의 게놈 카로틴 신타제 표적 서열을 BglII 및 NdeI 측면 인접 부위와 함께 합성하였다(유로핀스(Eurofins), 미국 노쓰캐롤라이나주 미베인 소재). 상기 단편을 gRNA3 CS1, CS2, CS3 및 CS4로 표기하였다. 4개의 단편 전부 및 벡터 pCL0402를 BglII및 NdeI로 절단하였다. 모든 적합한 단편을 젤 또는 컬럼 정제하고 이어서 래피드 DNA 라이게이션 키트(롯슈)를 사용하여 함께 결찰하고 생성되는 벡터들을 pYB36(gRNA3 CS1; 서열번호 9), pYB37(gRNA3 CS2; 서열번호 10), pYB38(gRNA3 CS3; 서열번호 11), 및 pYB39(gRNA3 CS4; 서열번호 12)로 표기하였다.
스키조키트리움으로부터 유전자 편집 성분을 제거하기 위해서, Cas9 및 안내 RNA 카세트를 모두 ("녹아웃") 유전자를 붕괴시키도록 설계하고 이에 의해 영양요구변이를 유도하였다. 상기 Cas9 선택에 의한 영양요구변이는 DHA에 대한 것인 반면, gRNA 삽입에 대해 유도된 영양요구변이는 지방산 신타제 유전자좌(FAS)의 붕괴로 인해 팔미트산에 대한 것이었다. 상기 FAS 유전자의 부분을 스키조키트리움 종 20888 게놈 DNA로부터 증폭시키고 이어서 1% 아가로스 젤상에서 실행시켰다(도 8). 상기 증폭산물의 예상 크기는 2530 bp였다. 2개의 샘플을 제조하고 이들을 젤상에 로딩하였으며, 예상된 크기의 밴드는 상기 PCR의 주요 산물이었으나 다른 보다 작은 크기의 밴드들이 존재하였고, 이는 PCR 조건이 덜 이상적이었을 수도 있고 차후에 최적화시킬 필요가 있을 수도 있음을 암시한다. 2.5 kbp 밴드를 절단하고, 젤 정제하고 벡터 pCL399의 클로닝에 사용하였다.
PCR을 벡터 pCL400 중의 FAS 유전자좌내로의 파로모마이신 및 gRNA 카세트의 클로닝을 위해 셋업하였다. 상기 증폭산물의 예상 크기는 3376 bp였으며, 상기는 상기 젤상에 나타난 주요 밴드였다(도 8). 이어서 상기 단편을 pCL400내로 클로닝시켜 pCL402를 생성시켰다.
실시예 4
gRNA 구조물의 형질전환 및 선택
T188-1-20 및 T189-1-20 균주(둘 다 PCR에 의해 상이한 프로모터, 각각 알파 튜불린 및 Cs의 조절하에서 Cas9 발현 카세트를 함유하는 것으로 확인되었으며 PUFA 신타제의 OrfA/PFA1 유전자좌에 삽입되었다)를 0.5 mM DNA와 함께 0.4% 무작위 메틸화된 β-사이클로덱스트린이 보충된 25 ㎖의 M50-20을 함유하는 편평바닥 삼각 플라스크에 접종하고 27 ℃, 200 rpm에서 밤새 증식시켰다. 상기 두 균주 모두 상술한 바와 같이 β-사이클로덱스트린 및 DHA가 보충된 50 ㎖의 M2B를 함유하는 진탕형 플라스크에 1/50 희석시키고 27 ℃에서 밤새 증식시켰다. T188 및 T189 배양물을 상술한 바와 같이 다음날 수확하고 충격을 위한 준비를 상술한 바와 같이 수행하였다. pYB36-39 플라스미드를 PmeI에 의한 충격에 앞서 절단하고 컬럼 정제하고, 4개의 절단된 플라스미드를 모두 사용하여 상기 2개의 균주를 형질전환시켜 T202-209로 표기된 형질전환을 생성시켰다(각각 pYB36-39를 갖는 T188, pYB36-39를 갖는 T189). 생성되는 형질전환체를 충격으로부터 회수 후 4시간째에 0.5 mM DHA, 0.5 mM C16:0(팔미트산, 시그마 알드리치(Sigma-Aldrich), 미국 미주리주 세인트 루이스 소재) 및 50 ㎍/㎖ 파로모마이신과 함께 0.4%의 β-사이클로덱스트린을 함유하는 M2B 플레이트상에 도말하였다. 플레이트를 싸고 27 ℃에서 7 내지 10일간 배양하였다. 일단 직경이 2 내지 4 ㎜가 되었으면, 콜로니를 0.5 mM 팔미트산의 존재 또는 부재하에 M2B+0.4% β-사이클로덱스트린+0.5 mM DHA+0.5 ㎍/㎖ 파로모마이신상에 반복해서 덧대어 FAS 유전자좌에 gRNA 카세트 삽입의 결과로서 생성된 팔미트산에 대한 영양요구변이를 확인하였다. 상기 DHA 및 팔미트산 모두에 대해 영양요구성인 것으로 확인된 8개 형질전환 각각으로부터 10개의 콜로니를 골라, 0.4% β-사이클로덱스트린, 0.5 mM DHA 및 0.5 mM 팔미트산이 보충된 25 ㎖의 M50-20을 함유하는 편평바닥 삼각 플라스크에 접종하고, 배양물을 27 ℃, 200 rpm에서 48시간 동안 증식시켰으며, 이때에 2 ㎖의 각 배양물을 게놈 DNA 제조를 위해 수집하였다. 게놈 DNA를 페놀:클로로포름으로 추출한 후에, PCR을 수행하여 gRNA 카세트가 표적화된 영역들을 함유하는 카로틴 신타제 유전자좌를 증폭시켰다. T202, 203, 204, 207, 208로부터 선택된 형질전환체로부터의 gDNA를 하기의 순환 조건을 사용하여 pYB36 CS1 F(서열번호 27) 및 pYB36 CS3 R(서열번호 29) 프라이머(표 8), 5% DMSO(v:v), KOD 핫 스타트 마스터믹스, 주형으로서 각각의 gDNA를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다: 95 ℃ 2분, (95 ℃ 20초, 61 ℃ 10초, 70 ℃ 21초) x 35주기, 70 ℃ 5분(도 9). T206으로부터 gDNA를 하기의 순환 조건을 사용하여 pYB36 CS1 F 및 pYB36 CS1 R(서열번호 28) 프라이머(표 8), 5% DMSO(v:v), KOD 핫 스타트 마스터믹스로 증폭시켰다: 95 ℃ 2분, (95 ℃ 20초, 61 ℃ 10초, 70 ℃ 11초) x 35주기, 70 ℃ 5분(도 10). T205 및 T209로부터 gDNA를 하기의 순환 조건을 사용하여 pYB36 CS4 F(서열번호 30) 및 pYB36 CS4 R(서열번호 31) 프라이머(표 8), 5% DMSO(v:v), KOD 핫 스타트 마스터믹스로 증폭시켰다: 95 ℃ 2분, (95 ℃ 20초, 61 ℃ 10초, 70 ℃ 21초) x 35주기, 70 ℃ 5분(도 9).
프라이머 명칭 서열번호 프라이머 서열, 5′→ 3′
pYB36 CS1 F 27 GAGTCGAAGGAGACGTTGTCG
pYB36 CS1 R 28 GTCATTGCGAATGATGCGATATG
pYB36 CS3 R 29 GGTCATCATGGAATACAACGCAG
pYB36 CS4 F 30 CGAGCTCATTTGTGCTACACTCTATG
pYB36 CS4 R 31 CACAAGATTTGCAGGATTGATGC
생성되는 PCR 증폭산물을 컬럼 정제하고, pJet1.2 벡터(써모피셔, 미국 매사추세츠주 월썸 소재)내에 클로닝하고, 생성되는 세균 형질전환체에서 플라스미드를 소량 추출하고, 삽입물을 상기 키트에 제공된 프라이머로 서열분석하였다. 서열을 지니어스(Geneious) 소프트웨어를 사용하여 정렬시켰다.
gRNA를 암호화하는 벡터에 의한 2개의 Cas9 배경(T188 및 T189)의 형질전환이 성공적으로 수행되었으며 하기 표 9에 나타낸 바와 같은 다수의 이중 영양요구성 균주(T202-209로 표기됨)를 생성시켰다. 선택 균주를 나중에 유전자 수준으로 분석하여 카로티노이드 신타제 유전자좌의 임의의 돌연변이를 검출하였으며, 이는 비-상동성 말단 부착(NHEJ) 사건을 가리킨다.
형질전환 총 콜로니
(3ug DNA 당) 		16:0 영양요구체의 수 KO 퍼센트
T202 (T188+gRNA1) 103 17/32 53%
T203 (T188+gRNA2) 93 15/32 46%
T204 (T188+gRNA3) 65 15/32 46%
T205 (T188+gRNA4) 50 15/32 46%
T206 (T189+gRNA1) 53 12/32 37%
T207 (T189+gRNA2) 28 8/20 40%
T208 (T189+gRNA3) 38 9/29 31%
T209 (T189+gRNA4) 28 9/22 41%
gDNA를 영양요구성인 것으로 나타난(DNA 및 팔미트산 모두가 보충될 것을 요한다) gRNA + Cas9 형질전환체로부터 단리한 후에, 하나의 PCR을 사용하여 하나의 증폭산물로서 첫 번째 3 CS gRNA 표적을 포함하는 전체 영역을 증폭시키고 또 다른 PCR을 사용하여 별도로 gRNA3 CS4 표적을 증폭시켰다(도 9). gRNA3 CS1-3 형질전환체 DNA로부터의 증폭산물에 대한 예상 크기는 1040 bp였으며, gRNA 3 CS4 형질전환체로부터의 경우는 715 bp였다. gRNA CS1-3 표적에 대한 증폭산물의 경우에, 상기 T188 계통으로부터 온 샘플은 정확한 크기의 단일 밴드를 가졌다. 그러나 T189로부터 온 샘플(T189 모 균주 자체로부터의 gDNA 포함)은 가장 현저한 약 1 kbp 밴드 및 두 번째로 가장 현저한 약 1.5 kbp 밴드와 함께 다수의 밴드를 가졌다. 상기 1.5 kbp 밴드는 비-특이적인 증폭의 산물인 것으로 판단되었다. 비특이적인 밴드의 존재를 감소시키고자 상기 PCR의 최적화를 수행하지는 않았으며, 약 1 kbp 밴드를 상기 형질전환체 모두에 대해 상기 젤로부터 절단하고 pJet1.2 클로닝에 사용하였다. CS4 증폭산물은 모두 정확한 크기의 단일 밴드였다. 상기 생성되는, Cas9/gRNA 형질전환체 각각으로부터의 증폭산물을 갖는 다수의 pJet 형질전환체 콜로니를 서열분석을 위해 보내어 Cas9/gRNA가 CS 서열에 임의의 영향을 미치는 지의 여부를 측정하였다.
추가로, 클론의 T206 계통상에서 분석을 수행하였다. 도 9에 기재된 바와 같이, T206 형질전환체는 gDNA 추출되었으며 PCR용 주형으로서 사용되어 오직 gRNA3 CS1 표적 서열만을 증폭시켰고 예상되는 증폭산물 크기는 689 bp였다. 상기 크기의 밴드가 상기 젤상에서 관찰되었으며, 이는 다른 것들 가운데에서 주 밴드였고, 보다 큰 분자량을 갖는 것이었으며, 선행 도면상에서 관찰된 것들과 유사하였다. 예상된 약 700 bp 크기의 젤 단편을 절단하고 정제하고 상기 단편의 pJet1.2 클로닝 및 서열분석에 사용하여 Cas9-gDNA가 CS 유전자 중의 임의의 서열 변화를 유도하였는지를 측정하였다(도 10).
Cas9 및 gRNA 암호화 벡터 모두로 형질전환된 클론들로부터의 CS 유전자좌의 증폭산물을 함유하는 다수의 pJet 벡터를 서열분석할 때, 여러 종류의 변화가 발생함이 관찰되었다(표 10). 선행 연구는 CAS9가 DNA를 절단하고 PAM 서열 상류의 3 염기쌍 위치에서 이중 가닥 절단을 생성시킴을 입증하였다(문헌[Jinek et al. "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity" Science 337(6096):816-821, 2012]). 상기 이중 가닥 절단 부위에서 다양한 길이의 삽입 및/또는 결실 돌연변이를 생성시킬 수도 있는 부정확한 비-상동성 말단 부착(NHEJ)-매개된 복구로부터 돌연변이가 발생할 수도 있음이 공지되어 있다(문헌[Sander and Joung, "CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes" Nat Biotechnol. 32(4):347-355, 2014]). 관찰된 변화는 모두 예상된 바와 같이 PAM에 비해 -3번 위치에서 발생한다(이 경우 AGG). Cas9+gRNA 형질전환체에서 검출된 스키조키트리움 종 20888의 카로티노이드 신타제의 예시적인 돌연변이를 표 10에 나타내며, 이때 결실은 대시로 도시하고 삽입은 밑줄로 도시되었다.
야생형 뉴클레오타이드 위치 # 15 16 17 18 19 20 PAM/NGG
야생형 A C G C G C AGG
CS1 표적 변체 #1 A C G C - - AGG
CS1 표적 변체 #2 A C - C G C AGG
CS1 표적 변체 #3 A C G C C G C AGG
CS1 표적 변체 #4 A C G T C G C AGG
본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 각각의 참고문헌이 구체적이고 개별적으로 참고로 인용됨을 가리키는 바와 같이 본 명세서에 참고로 인용된다. 임의의 참고문헌의 인용은 출원일 이전의 그의 명세에 대한 것이며 본 명세가 종래 발명 때문에 상기와 같은 참고문헌에 선행할 자격을 갖지 않음을 인정하는 것으로서 이해해서는 안 된다.
각각의 상술한 요소들, 또는 2개 이상의 요소가 함께 상술한 유형과 상이한 다른 유형의 방법에서 유용한 용도를 또한 발견할 수 있음을 알 것이다. 추가의 분석 없이, 상기는 본 명세의 요지를 충분히 밝혀서, 다른 이들이 현재의 지식을 적용함으로써, 종래 기술의 관점으로부터, 첨부된 특허청구범위에 제시된 본 명세의 일반적이거나 특정한 태양의 필수적인 특징을 공정하게 구성하는 특징들을 생략하지 않고서 상기 명세를 다양한 용도들에 쉽게 적합화시킬 수 있다. 상기 실시태양들은 단지 예로서 제공되며; 본 명세의 범위는 오직 하기 특허청구범위에 의해서만 제한되게 된다.
실시예 5
표적화되지 않은 Cas9 벡터(pYB61)의 설계 및 형성
앞서, Cas9 플라스미드를 PUFA 신타제 유전자(OrfA 서브유닛; pYB32 및 pYB33을 참조하시오)에서 표적화된 통합을 위해 설계하였다. 이러한 방식으로 설계된 Cas9 카세트의 통합은 상기 OrfA 유전자의 녹아웃 및 DHA 영양요구변이를 생성시켰다. 영양요구변이의 유도는 OrfA 유전자좌에서의 후속적인 통합을 위한 형질전환체의 보다 용이한 선별을 가능하게 하나, CRISPR-매개된 카로틴 신타제 녹아웃의 분화를 보다 어렵게 한다. 임의의 염색체 유전자좌에 표적화하지 않으면서 Cas9에 대한 발현 카세트를 갖는 플라스미드를 형성시켜 이소성, 무작위 통합의 영향을 시험하였다. 플라스미드 pCL122-Cas9(서열번호 1)를 BamHI-HF(NEB) 및 NdeI(NEB)로 절단시켜 2개의 단편, 크기 4140 bp 및 5780 bp를 생성시켰다. 상기 4140 bp 단편을 1% 아가로스 젤상에서 분리시키고, 절제하고, QIAquick 젤 추출 키트(퀴아겐)를 사용하여 정제시켰다(도 11). 플라스미드 pYB30(서열번호 32)은 GFP 및 제오신 내성의 발현을 구동하는 알파-튜불린 프로모터의 부분적인 단편을 함유한다. 상기 플라스미드를 BamHI-HF(NEB) 및 NdeI(NEB)로 절단시켜, 2개의 단편 838 bp 및 4724 bp를 생성시켰다. 상기 4724 bp 단편을 1% 아가로스 젤상에서 분리시키고, 절제하고, QIAquick 젤 추출 키트(퀴아겐)를 사용하여 정제시켰다(도 11). 상기 2개의 관심 단편을 래피드 DNA 라이게이션 키트(롯슈)를 사용하여 결찰시켰다. 이어서 NEB10β 화학적 수용성 세포(NEB)를 상기 결찰 반응의 일부로 형질전환시켰다. 생성되는 콜로니를 2x GoTaq 그린 마스터 믹스(프로메가), 프라이머 121 Tub seq F 및 pYB32/3C R1 및 5% 최종 DMSO와 함께 PCR에 의한 선별을 위해 주형으로서 사용하였다. 하기의 순환 조건을 적용하였다: 95 ℃ 5분, [95 ℃ 30초, 59 ℃ 30초, 72 ℃ 1분] 35주기 동안, 및 72 ℃ 5분(앞서 기재됨)(도 12). 플라스미드를 PCR에 의해 양성 형질전환체로서 확인된 콜로니로부터 추출하고, 서열분석하고, 생성 벡터를 pYB61(서열번호 33)로 표기하였다.
프라이머 명칭 서열번호 프라이머 서열, 5'→3'
121 Tub seq F 13 GGATCTCATGCTGGAGTTCTTC
pYB32/3C R1 14 GTACTTCTCGTGGTAGGCAACC
실시예 6
표적화되지 않은 gRNA 벡터(pYB66)의 설계 및 형성
앞서, gRNA 플라스미드를 지방산 신타제(FAS) 유전자 유전자좌에 대해 표적화하여, 팔미트산에 대한 영양요구성 요건을 생성시켰다. 상기 영양요구변이는 CRISPR-매개된 카로틴 신타제 불활성화로부터 생성되는 표현형을 가렸다. 카로티노이드 생합성에 관련된 유전자좌에서의 CRISPR-매개된 표현형 변화를 보다 잘 식별하기 위해서, 표적화되지 않은 gRNA 벡터를 제조하였다. 플라스미드 pCL122(서열번호 37)를 BamHI-HF(NEB) 및 NdeI(NEB)로 절단하여 GFP를 암호화하는 판독 프레임을 제거하여, 838 bp 및 5773 bp 크기의 2개의 단편을 생성시켰다. 상기 5773 bp 단편을 1% 아가로스 젤상에서 분리시키고, 절제하고, QIAquick 젤 추출 키트(퀴아겐)를 사용하여 정제하였다(도 13). gRNA3 CS1을 암호화하는 카세트를 2x KOD 핫 스타트 마스터 믹스(EMD 밀리포어), 프라이머 pYB66 BamBgl F 및 pYB66 Nde R, 및 5% 최종 DMSO와 함께 주형으로서 플라스미드 pYB36(서열번호 9)을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 하기의 순환 조건을 적용하였다: 95 ℃ 2분, [95 ℃ 20초, 59 ℃ 10초, 70 ℃ 5초] 35주기 동안, 및 72 ℃ 2분(앞서 기재됨)(도 14). 상기 생성되는 PCR 단편을 QIAquick PCR 정제 키트(퀴아겐)를 사용하여 컬럼 정제하고 BamHI-HF(NEB) 및 NdeI(NEB)로 절단하였다. 절단에 이어서, 상기 생성되는 DNA 단편을 다시 QIAquick PCR 정제 키트를 사용하여 정제하였다(도 15). 상기 절단된 pCL122 및 gRNA 단편을 래피드 DNA 라이게이션 키트(롯슈)를 사용하여 결찰시켰다. 이어서 NEB10β 화학적 수용성 세포를 상기 결찰 반응의 일부로 형질전환시키고 생성되는 콜로니를 2x GoTaq 그린 마스터 믹스(프로메가), 프라이머 pYB66 EF1seq F 및 pCL122 OrfC R 및 5% 최종 부피의 DMSO를 사용하여, 하기의 순환 조건으로 콜로니 PCR에 의해 선별하였다: 95 ℃ 10분, [95 ℃ 30초, 60 ℃ 30초, 72 ℃ 45초] 35주기 동안, 및 72 ℃ 5분(도 16). 플라스미드를 PCR에 의해 양성 콜로니로부터 추출하고, 서열분석하고, 생성 벡터를 pYB66(서열번호 34)으로 표기하였다.
프라이머 명칭 서열번호 프라이머 서열, 5'→ 3'
pYB66 BamBgl F 38 CAAGGGATCCAGATCTTCCGCACTGATGAGTC
pYB66 Nde R 39 AACTCATATGGTCCCATTCGCCA
pYB66 EF1seq F 40 GAGAGGATAGTATCTTGCGTGCTTG
pCL122 OrfC R 41 GCAAGGTTGGAACATTACGATCAAG
실시예 7
Cas9 및 gRNA 벡터(pYB73)의 설계 및 형성
단일의 우성 선택성 마커를 갖는 동일한 벡터상에 Cas9 및 gRNA 카세트를 모두 함유하는 벡터를 생성시켜 게놈 편집에 대한 상기와 같은 배열의 효율을 시험하였다. 플라스미드 pYB61을 PstI(NEB)로 절단하고 QIAquick PCR 정제 키트(퀴아겐)에 의해 정제하였다(도 17). 상기 gRNA 발현 카세트를 하기와 함께 PCR을 사용하여 pYB36으로부터 증폭시켰다: 2x KOD 핫 스타트 마스터 믹스(노바겐(Novagen)), 프라이머 pYB73 gRNA Pst Kpn IF F 및 pYB73 gRNA Xho Pst IF R, 및 5% 최종 DMSO. 순환 조건은 하기와 같이 사용되었다: 95 ℃ 2분, [95 ℃ 20초, 58 ℃ 10초, 70 ℃ 38초] 35주기 동안, 및 70 ℃ 2분(도 18). 상기 생성되는 PCR 단편을 QIAquick PCR 클린업 키트(퀴아겐)를 사용하여 컬럼 정제하였다. 정제된, 절단된 pYB61 단편을 제조사의 프로토콜에 따라 인퓨전 키트(클론테크)를 사용하여 상기 정제된, 절단된 gRNA PCR 단편에 결찰시켰다. NEB10β 화학적 수용성 세포를 상기 인퓨전 반응의 일부로 형질전환시키고 생성되는 세균 콜로니를 2x GoTaq 그린 마스터 믹스(프로메가), 프라이머 pYB73 seq F 및 pYB73 seq R 및 5% 최종 DMSO와 함께 PCR에 의해 선별하였다. 하기의 순환 조건을 적용하였다: 95 ℃ 10분, [95 ℃ 30초, 60 ℃ 30초, 72 ℃ 2분] 35주기 동안, 및 72 ℃ 5분(도 19). 플라스미드를 PCR에 의해 양성 콜로니로부터 추출하고, 서열분석하고, 생성 벡터를 pYB73(서열번호 35)으로 표기하였다. 플라스미드 pYB73은 임의의 특정한 유전자에 대한 표적화를 위해 설계되지 않는다.
프라이머 명칭 서열번호 프라이머 서열, 5'→ 3'
pYB73 gRNA Pst Kpn IF F 42 CATACATGGTCGACCTGCAGGGTACCTCTTATCTGCCTCGC
pYB73 gRNA Xho Pst IF R 43 ATTAATGCAGGTTCCTGCAGCTCGAGAAGAATCTGAACTCACGTC
pYB73 seq F 44 CACCCCAACTTGTTTATTGCAG
pYB73 seq R 45 GAGCGAGGAAGCGGAAGAG
실시예 8
CarG 균주에 대한 설계, 형성 및 형질전환
CRIPSR-매개된 카로틴 신타제 유전자 불활성화를 갖는 형질전환체(백색 콜로니 표현형)와, CRIPSR-매개된 카로틴 신타제 유전자 불활성화를 갖지 않는 형질전환체(황색-오렌지색 콜로니 표현형)간의 구별을 개선하기 위해서, 뮤코르 시르시넬로이데스(Mucor circinelloides)로부터의 CarG 유전자(제라닐제라닐 피로포스페이트 신타제)를 스키조키트리움에서의 발현에 대해 코돈-최적화하였다. 상기 CarG 유전자(상기는 생성된 카로티노이드의 총량을 증가시키고 형질전환체를 더 오렌지색으로 만들 것이다)를 DNA2.0에 의해 합성하고, 블라스티시딘 선택 카세트를 함유하는 스키조키트리움 발현 벡터내로 클로닝하였다. 상기 생성 벡터를 pCL310(서열번호 36)이라 명명하였다.
스키조키트리움 종 ATCC 20888의 야생형 균주를 입자 충격 방법(바이오 래드)을 통해 pCL310에 대한 형질전환에 사용하였다. ATCC 20888을 200 rpm에서 밤새 진탕시키면서 +27 ℃에서 250 ㎖ 편평바닥 삼각 플라스크 중의 25 ㎖의 M50-20 배지에서 증식시켰다. 이어서, 상기 20888 배양물을 250 ㎖ 진탕형 플라스크 중의 50 ㎖의 M2B 배지에 1/100 희석하고 앞서 사용된 조건하에서 밤새 증식시켰다. 상기 20888 배양물이 초기 로그기(0.6-2 OD 단위/㎖)에 있었을 때, 배양물을 3,220 x g에서 10분간 원심분리에 의해 수확하였다. 상등액을 경사분리하고, 펠릿을 M2B에 20 OD 단위/㎖의 최종 농도로 재현탁시켰다. 100 ㎕의 생성 세포 현탁액을 비-선택성 M2B 아가 플레이트(대략적으로 2 in 직경)의 대략 1/3상에 도말하였다. 5 ㎍의 플라스미드 DNA 및 5 ㎍의 pCL310을 50 ㎕의 2.5 M CaCl2, 20 ㎕의 0.1 M 스페르미딘 및 50 ㎕의 제조된 M10 텅스텐 비드(제조사의 프로토콜에 따라)와 혼합하고, 1분간 와동시키고, 이어서 실온에서 10분간 배양하여 상기 비드를 침전되게 하였다. DNA-코팅된 비드를 250 ㎕의 100% 에탄올로 1회 세척하고, 이어서 비드를 60 ㎕의 100% 에탄올에 재현탁시켰다. 각각의 제조된 거대담체(거대담체 조립 제조에 대한 제조사의 프로토콜에 따라)는, 후드로부터 최소의 진동을 유도하고 따라서 에탄올이 건조되게 하는 조건하에서 중심에 스폿팅된 에탄올 중의 코팅된 비드 10 ㎕를 가졌다. 파열판 홀더는 70% 아이소프로판올 중에서 짧은 멸균 후 1,100 psi 파열판을 가졌다. 조립된 거대담체 플랫폼을 꼭대기 선반 위치에 놓고 20888 세포 패치가 있는 M2B 아가 플레이트를 상기 꼭대기로부터 세 번째 선반상에 세포쪽을 위로 하여 놓았다. 진공이 상기 유전자총 챔버내부에서 약 27 인치의 수은에 도달했으면, 파열판이 파손될 때까지 헬륨을 발사하였다. 이어서 헬륨 흐름을 차단시키고, 상기 챔버를 대기로 배기시켰다. 이어서 충격판을 상기 챔버로부터 제거하였다. 상기 충격 과정을 모든 샘플 및 대조용에 대해 반복하였다. pCL310으로 충격된 20888 균주를 T212로 표기하였다. 충격판을 +27 ℃ 배양기에서 4시간 동안 배양하고, 그 후에 세포를 상기 플레이트로부터 약 1 ㎖의 M2B로 세척하고 100 ㎍/㎖ 블라스티시딘(써모피셔)을 함유하는 4개의 M2B 아가 플레이트들간에 균등하게 분배하였다. 세포를 3 ㎜ 멸균 유리 비드로 도말하였다. 비드 제거 후에, 플레이트를 싸고 +27 ℃에서 5 내지 8일 동안 배양하였다. 콜로니의 크기가 2 내지 4 밀리미터에 도달했을 때, 이들을 100 ㎍/㎖ 블라스티시딘을 함유하는 M2B 아가 플레이트상에 덧대었다. 블라스티시딘에 대해 내성인 것으로 확인된 콜로니를 고르고, 250 ㎖ 편평 바닥 삼각 플라스크 중의 50 ㎖의 M50-20내에 접종하고, +27 ℃ 및 200 rpm에서 48시간 동안 진탕기에 넣었다. 48시간 배양후에, 2 밀리리터의 배양물을 4,000xg에서 10분간 원심분리에 의해 수집하고, 상등액을 경사분리하고, 펠릿을 변형된 페놀-클로로포름 추출에 따른 게놈 DNA 단리에 사용하였다. 게놈 DNA를 추출하고 GoTaq 그린 마스터믹스(프로메가)와 함께 PCR 주형으로서 사용하고 프라이머 pYB13 YB1 seq F 및 pCL122 OrfC R 및 DMSO를 5% 최종 농도로 사용하여 Cas9 카세트의 존재를 확인하였다. 하기의 순환 조건을 적용하였다: 95 ℃ 2분, [95 ℃ 30초, 63 ℃ 30초, 72 ℃ 1분 45초] 35주기 동안, 및 72 ℃ 5분(도 20). PCR에 의해 측정시 pCL130 형질전환 DNA의 존재에 대해 양성이고 야생형 대조용에 비해 더 짙은 오렌지색을 나타내는 다수의 형질전환체를 UV-Vis 방법에 의해 총 카로티노이드에 대해 분석하였다. 상기 분석 중에서 2개의 균주, T212-3-1 및 T212-3-2가 보다 높은 총 카로티노이드를 갖는 것으로 확인되었다. T212-3-2는 게놈 편집 요소에 대한 후속 연구를 위해 선택된다.
프라이머 명칭 서열번호 프라이머 서열, 5'→ 3'
pYB13 pYB1 seq F 46 GAGAGGATAGTATCTTGCGTGCTTGG
pCL122 OrfC R 41 GCAAGGTTGGAACATTACGATCAAG
실시예 9
pYB61, pYB66 및 pYB73에 의한 T212 및 20888의 형질전환
스키조키트리움에서 편집 효율에 대한 표적화되지 않은 벡터의 영향을 시험하기 위해서 다수의 형질전환을 상술한 입자 충격 방법을 사용하여 수행하였다. 상기 형질전환을 하기와 같이 셋업하였다: T280-T212-3-2 균주를 pYB61로 형질전환시키고, T285-ATCC 20888 야생형 균주를 pYB61로 형질전환시켰다. 상기 두 형질전환을 모두 수행하여 gRNA 시험 연구를 위해 Cas9를 사전-발현하는 수용 균주를 생성시켰다. 후속의 형질전환을 하기와 같이 셋업하였다: T281-T212-3-2 균주를 pYB61 및 pYB66으로 동시-형질전환시키고, T286-ATCC 20888 야생형 균주를 pYB61 및 pYB66으로 동시-형질전환시켰다. T281 및 T286 형질전환을 수행하여, 게놈 중 임의의 특정 유전자좌에 대한 표적화를 위해 설계되지 않은 플라스미드에 의한 편집 효율을 평가하였다. pYB73으로 형질전환된 T282-T212-3-2 균주, 및 pYB73으로 형질전환된 T287-ATCC 20888 야생형 균주를, 게놈 편집을 위해 상기 두 요소를 모두 갖는 단일 플라스미드에 의한 편집 효율을 평가하기 위해 완성시켰다. T280, T282, T285, T287 형질전환을 제오신(써모피셔) 50 ㎍/㎖가 보충된 M2B 플레이트상에서 선택하였다. T281 및 T286 형질전환을 제오신 50 ㎍/㎖ 및 파로모마이신(시그마) 100 ㎍/㎖이 보충된 M2B 플레이트상에서 선택하였다. 이들 형질전환 모두로부터 생성된 콜로니를 100 ㎍/㎖의 제오신 단독 또는 100 ㎍/㎖ 제오신과 100 ㎍/㎖ 파로모마이신을 함께 함유하는 선택성 M2B 플레이트상에 덧대었다. 상기 패치 플레이트상에서 확고하게 증식하고 적용 가능한 경우 백색 콜로니 표현형을 나타낸 패치들을 추가의 분석을 위해 선택하였다. 상기 균주들을 상기 패치 플레이트로부터 떼어내어 250 ㎖ 삼각 편평바닥 플라스크 중의 25 ㎖의 M50-20 배지에 접종하였다. 플라스크를 대략 24시간 동안 +27 ℃, 200 rpm에서 배양하였다. 2 ㎖의 각 접종물의 분액을 취하여 미세원심분리 튜브에 넣고, 7,500 x g에서 10분간 회전시켰다. 상등액을 경사분리시키고 펠릿을 변형된 페놀-클로로포름 추출 방법을 사용하여 게놈 DNA의 제조에 사용하였다. 생성되는 gDNA에, 상기 선택 카세트 및 관심 유전자의 존재에 대해서 PCR에 의한 분석을 가하였다. T280, T281, T285, T286에 대해서, 상기 선택 카세트의 종결자와 상기 Cas9 유전자의 시작간의 접합부를 하기를 사용하여 증폭시켰다: 2X GoTaq 그린 마스터 믹스, 프라이머 121 Tub seq F 및 pYB32/3 CR1, 5% 최종 농도로 DMSO, 및 gDNA. 하기의 조건들을 적용하였다: 95 ℃ 2분, [95 ℃ 30초, 58 ℃ 30초, 72 ℃ 1분 2초] 35주기 동안, 및 72 ℃ 5분(도 21). T281 및 T286에 대해서, 상기 gRNA 카세트의 존재를 하기와 같이 전체 gRNA 카세트의 PCR 증폭에 의해 평가하였다: 2X GoTaq 그린 마스터 믹스, 프라이머 pYB66 EF1 seq F 및 pCL122 OrfC R, 5% 최종 농도로 DMSO, 및 gDNA. 하기의 순환 조건들을 적용하였다: 95 ℃ 2분, [95 ℃ 30초, 60 ℃ 30초, 72 ℃ 47초] 35주기 동안, 및 72 ℃ 5분(도 22). T282 및 T287에 대해서, 상기 gRNA 카세트의 존재를 하기와 같이 PCR 증폭에 의해 평가하였다: 2X GoTaq 그린 마스터 믹스, 프라이머 pYB66 EF1 seq F 및 TT pYB73 HDV R, 5% 최종 농도로 DMSO, 및 gDNA. 하기의 순환 조건들을 적용하였다: 95 ℃ 2분, [95 ℃ 30초, 60.9 ℃ 30초, 72 ℃ 16초] 35주기 동안, 및 72 ℃ 5분(도 23). PCR 증폭산물을 서열분석하고 상기 유전자 편집 실험으로부터 생성된 삽입-결실의 유형을 관찰하기 위해서 Cas9 및 gRNA에 대해 PCR에 의해 양성으로 시험된 T281, T282, T286 및 T287 형질전환체에 PCR을 가하여, gRNA가 변화에 영향을 미친 CS 유전자의 부분들을 증폭시켰다. 상기 CS 유전자의 관련 부분을 증폭시키기 위한 PCR을 하기에 의해 준비하였다: 2X KOD 핫 스타 마스터 믹스, 프라이머 pYB36 CS1 F 및 pYB36 CS1 R, 5% 최종 농도로 DMSO, 및 gDNA. 하기의 순환 조건들을 적용하였다: 95 ℃ 2분, [95 ℃ 20초, 61 ℃ 10초, 70 ℃ 11초] 35주기 동안, 및 70 ℃ 5분(도 24). PCR 단편을 QIAquick PCR 정제 키트(퀴아겐)를 사용하여 컬럼 정제하고 pYB36 CS1 F 및 pYB36 CS1 R로 서열을 확인하였다.
프라이머 명칭 서열번호 프라이머 서열, 5'→ 3'
pYB66 EF1 seq F 40 GAGAGGATAGTATCTTGCGTGCTTG
pCL122 OrfC R 41 GCAAGGTTGGAACATTACGATCAAG
TT pYB73 HDV R 47 GAAGCATGTTGCCCAGCC
pYB36 CS1 F 27 GAGTCGAAGGAGACGTTGTCG
pYB36 CS1 R 28 GTCATTGCGAATGATGCGATATG
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ccttcgagcg ctgctaattt cgcctgacgc tccttctttt gtgcttccat gacacgccgc 2580 ttcaccgtgc gttccacttc ttcctcagac atgcccttgg ctgcctcgac ctgctcggta 2640 aaacgggccc cagcacgtgc tacgagattt cgattccacc gccgccttct atgaaaggtt 2700 gggcttcgga atcgttttcc gggacgccgg ctggatgatc ctccagcgcg gggatctcat 2760 gctggagttc ttcgcccacc ccaacttgtt tattgcagct tataatggtt acaaataaag 2820 caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta gttgtggttt 2880 gtccaaactc atcaatgtat cttatcatac atggtcgacc tgcaggaacc tgcattaatg 2940 aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct 3000 cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc 3060 ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg 3120 ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg 3180 cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg 3240 actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac 3300 cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca 3360 tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt 3420 gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc 3480 caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag 3540 agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac 3600 tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt 3660 tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa 3720 gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg 3780 gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa 3840 aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat 3900 atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc 3960 gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat 4020 acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc 4080 ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc 4140 tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag 4200 ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg 4260 ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg 4320 atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag 4380 taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt 4440 catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga 4500 atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc 4560 acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc 4620 aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc 4680 ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc 4740 cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca 4800 atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat 4860 ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt 4920 ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt 4980 tcgtctcgcg cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac 5040 ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc 5100 gggtgttggc gggtgtcggg gctggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag 5160 agtgcaccaa gcttccaatt ttaggccccc cactgaccga ggtctgtcga taatccactt 5220 ttccattgat tttccaggtt tcgttaactc atgccactga gcaaaacttc ggtctttcct 5280 aacaaaagct ctcctcacaa agcatggcgc ggcaacggac gtgtcctcat actccactgc 5340 cacacaaggt cgataaacta agctcctcac aaatagagga gaattccact gacaactgaa 5400 aacaatgtat gagagacgat caccactgga gcggcgcggc ggttgggcgc ggaggtcggc 5460 agcaaaaaca agcgactcgc cgagcaaacc cgaatcagcc ttcagacggt cgtgcctaac 5520 aacacgccgt tctaccccgc cttcttcgcg ccccttcgcg tccaagcatc cttcaagttt 5580 atctctctag ttcaacttca agaagaacaa caccaccaac accatgatgc ctttgtctca 5640 agaagaatcc accctcattg aaagagcaac ggctacaatc aacagcatcc ccatctctga 5700 agactacagc gtcgccagcg cagctctctc tagcgacggc cgcatcttca ctggtgtcaa 5760 tgtatatcat tttactgggg gaccttgtgc agaactcgtg gtgctgggca ctgctgctgc 5820 tgcggcagct ggcaacctga cttgtatcgt cgcgatcgga aatgagaaca ggggcatctt 5880 gagcccctgt ggacggtgcc gacaggtgct tctcgatctg catcctggga tcaaagccat 5940 agtgaaggac agtgatggac agccgacggc agttgggatt cgtgaattgc tgccctctgg 6000 ttatgtgtgg gagggctaac acgtgctccg tgctacgaga tttcgattcc accgccgcct 6060 tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc cggctggatg atcctccagc 6120 gcggggatct catgctggag ttcttcgccc accccaactt gtttattgca gcttataatg 6180 gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt 6240 ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca tgtctgaatt cccggggtac 6300 <210> 37 <211> 6611 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCL122 vector (6611 bp) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1064) <223> EF_1alpha_promoter <220> <221> misc_feature <222> (1070)..(1162) <223> Sec1_secretion_signal <220> <221> misc_feature <222> (1163)..(1900) <223> eGFP_gene <220> <221> misc_feature <222> (1920)..(2559) <223> OrfC_terminator <220> <221> misc_feature <222> (5094)..(5542) <223> Alpha_tubulin_promoter <220> <221> misc_feature <222> (5543)..(6337) <223> NPT_gene <220> <221> misc_feature <222> (6338)..(6611) <223> SV40_terminator <400> 37 ctcttatctg cctcgcgccg ttgaccgccg cttgactctt ggcgcttgcc gctcgcatcc 60 tgcctcgctc gcgcaggcgg gcgggcgagt gggtgggtcc gcagccttcc gcgctcgccc 120 gctagctcgc tcgcgccgtg ctgcagccag cagggcagca ccgcacggca ggcaggtccc 180 ggcgcggatc gatcgatcca tcgatccatc gatccatcga tcgtgcggtc aaaaagaaag 240 gaagaagaaa ggaaaaagaa aggcgtgcgc acccgagtgc gcgctgagcg cccgctcgcg 300 gtcccgcgga gcctccgcgt tagtccccgc cccgcgccgc gcagtccccc gggaggcatc 360 gcgcacctct cgccgccccc tcgcgcctcg ccgattcccc gcctcccctt ttccgcttct 420 tcgccgcctc cgctcgcggc cgcgtcgccc gcgccccgct ccctatctgc tccccagggg 480 ggcactccgc accttttgcg cccgctgccg ccgccgcggc cgccccgccg ccctggtttc 540 ccccgcgagc gcggccgcgt cgccgcgcaa agactcgccg cgtgccgccc cgagcaacgg 600 gtggcggcgg cgcggcggcg ggcggggcgc ggcggcgcgt aggcggggct aggcgccggc 660 taggcgaaac gccgcccccg ggcgccgccg ccgcccgctc cagagcagtc gccgcgccag 720 accgccaacg cagagaccga gaccgaggta cgtcgcgccc gagcacgccg cgacgcgcgg 780 cagggacgag gagcacgacg ccgcgccgcg ccgcgcgggg ggggggaggg agaggcagga 840 cgcgggagcg agcgtgcatg tttccgcgcg agacgacgcc gcgcgcgctg gagaggagat 900 aaggcgcttg gatcgcgaga gggccagcca ggctggaggc gaaaatgggt ggagaggata 960 gtatcttgcg tgcttggacg aggagactga cgaggaggac ggatacgtcg atgatgatgt 1020 gcacagagaa gaagcagttc gaaagcgact actagcaagc aagggatcca tgaagttcgc 1080 gacctcggtc gcaattttgc ttgtggccaa catagccacc gccctcgcgc agagcgatgg 1140 ctgcaccccc accgaccaga cgatggtgag caagggcgag gagctgttca ccggggtggt 1200 gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga 1260 gggcgagggc gatgccacct acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa 1320 gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag 1380 ccgctacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta 1440 cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt 1500 gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg acttcaagga 1560 ggacggcaac atcctgggac acaagctgga gtacaactac aacagccaca acgtctatat 1620 catggccgac aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga 1680 ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc 1740 cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa 1800 cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg 1860 catggacgag ctgtacaagc accaccatca ccaccactaa catatgagtt atgagatccg 1920 aaagtgaacc ttgtcctaac ccgacagcga atggcgggag ggggcgggct aaaagatcgt 1980 attacatagt atttttcccc tactctttgt gtttgtcttt tttttttttt tgaacgcatt 2040 caagccactt gtctgggttt acttgtttgt ttgcttgctt gcttgcttgc ttgcctgctt 2100 cttggtcaga cggcccaaaa aagggaaaaa attcattcat ggcacagata agaaaaagaa 2160 aaagtttgtc gaccaccgtc atcagaaagc aagagaagag aaacactcgc gctcacattc 2220 tcgctcgcgt aagaatctta gccacgcata cgaagtaatt tgtccatctg gcgaatcttt 2280 acatgagcgt tttcaagctg gagcgtgaga tcataccttt cttgatcgta atgttccaac 2340 cttgcatagg cctcgttgcg atccgctagc aatgcgtcgt actcccgttg caactgcgcc 2400 atcgcctcat tgtgacgtga gttcagattc ttctcgagac cttcgagcgc tgctaatttc 2460 gcctgacgct ccttcttttg tgcttccatg acacgccgct tcaccgtgcg ttccacttct 2520 tcctcagaca tgcccttggc tgcctcgacc tgctcggtaa aacgggcccc agcacgtgct 2580 acgagatttc gattccaccg ccgccttcta tgaaaggttg ggcttcggaa tcgttttccg 2640 ggacgccggc tggatgatcc tccagcgcgg ggatctcatg ctggagttct tcgcccaccc 2700 caacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac 2760 aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc 2820 ttatcataca tggtcgacct gcaggaacct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag 2880 aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 2940 cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 3000 atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 3060 taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 3120 aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 3180 tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 3240 gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 3300 cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 3360 cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 3420 atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 3480 tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat 3540 ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 3600 acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 3660 aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 3720 aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 3780 tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga 3840 cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 3900 catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg 3960 ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat 4020 aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat 4080 ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg 4140 caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc 4200 attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa 4260 agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc 4320 actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt 4380 ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag 4440 ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt 4500 gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag 4560 atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac 4620 cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc 4680 gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca 4740 gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg 4800 ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat 4860 gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtctcgcgc gtttcggtga 4920 tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc 4980 ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg 5040 ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccaag cttccaattt 5100 taggcccccc actgaccgag gtctgtcgat aatccacttt tccattgatt ttccaggttt 5160 cgttaactca tgccactgag caaaacttcg gtctttccta acaaaagctc tcctcacaaa 5220 gcatggcgcg gcaacggacg tgtcctcata ctccactgcc acacaaggtc gataaactaa 5280 gctcctcaca aatagaggag aattccactg acaactgaaa acaatgtatg agagacgatc 5340 accactggag cggcgcggcg gttgggcgcg gaggtcggca gcaaaaacaa gcgactcgcc 5400 gagcaaaccc gaatcagcct tcagacggtc gtgcctaaca acacgccgtt ctaccccgcc 5460 ttcttcgcgc cccttcgcgt ccaagcatcc ttcaagttta tctctctagt tcaacttcaa 5520 gaagaacaac accaccaaca ccatgattga acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc 5580 cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga 5640 tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt ctttttgtca agaccgacct 5700 gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga ggcagcgcgg ctatcgtggc tggccacgac 5760 gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa gcgggaaggg actggctgct 5820 attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac cttgctcctg ccgagaaagt 5880 atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt gatccggcta cctgcccatt 5940 cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact cggatggaag ccggtcttgt 6000 cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg ccagccgaac tgttcgccag 6060 gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgatga tctcgtcgtg acccatggcg atgcctgctt 6120 gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc atcgactgtg gccggctggg 6180 tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt gatattgctg aagagcttgg 6240 cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc gccgctcccg attcgcagcg 6300 catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgacac gtgctacgag atttcgattc 6360 caccgccgcc ttctatgaaa ggttgggctt cggaatcgtt ttccgggacg ccggctggat 6420 gatcctccag cgcggggatc tcatgctgga gttcttcgcc caccccaact tgtttattgc 6480 agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt 6540 ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctgaat 6600 tcccggggta c 6611 <210> 38 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pYB66 Bambgl F primer <400> 38 caagggatcc agatcttccg cactgatgag tc 32 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pYB66 Nde R primer <400> 39 aactcatatg gtcccattcg cca 23 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pYB66 EF1seq F primer <400> 40 gagaggatag tatcttgcgt gcttg 25 <210> 41 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCL122 OrfC R primer <400> 41 gcaaggttgg aacattacga tcaag 25 <210> 42 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pYB73 gRNA Pst Kpn IF F primer <400> 42 catacatggt cgacctgcag ggtacctctt atctgcctcg c 41 <210> 43 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pYB73 gRNA Xho Pst IF R primer <400> 43 attaatgcag gttcctgcag ctcgagaaga atctgaactc acgtc 45 <210> 44 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pYB73 seq F primer <400> 44 caccccaact tgtttattgc ag 22 <210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pYB73 seq R primer <400> 45 gagcgaggaa gcggaagag 19 <210> 46 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pYB13 pYB1 seq F primer <400> 46 gagaggatag tatcttgcgt gcttgg 26 <210> 47 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TT pYB73 HDV R primer <400> 47 gaagcatgtt gcccagcc 18

Claims (25)

  1. 안내-폴리뉴클레오타이드 및 Cas 단백질을 포함하는 CRISPR-Cas 시스템의 소스를 포함하는 비-천연 또는 조작된 조성물로서, 상기 안내-폴리뉴클레오타이드가 근본적으로 숙주 세포 중의 표적-폴리뉴클레오타이드의 역 보체인 안내-서열을 포함하고, 상기 안내-폴리뉴클레오타이드가 상기 숙주 세포 중의 표적-폴리뉴클레오타이드에서 상기 Cas 단백질의 결합을 지시하여 CRISPR-Cas 복합체를 형성시킬 수 있으며, 상기 안내-서열이 근본적으로 상기 숙주 세포의 게놈 중 5'-(N)yPAM-3' 폴리뉴클레오타이드 서열 표적의 (N)y 부분의 역 보체이고, y가 8 내지 30의 정수이며, PAM이 프로토스페이서 인접 모티프이고, 상기 숙주 세포가 라비린툴로마이세트(Labyrinthulomycete)이며, PAM이 5'-XGG-3', 5'-XGGXG-3', 5'-XXAGAAW-3', 5'-XXXXGATT-3', 5'-XXAGAA-3', 5'-XAAAAC-3'로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 서열이고, X가 A, C, G 또는 T 또는 그의 유사체이며; W가 A 또는 T이고, 상기 Cas 단백질이 벡터 중에 포함된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되고, 상기 안내-폴리뉴클레오타이드가 또 다른 벡터 중에 포함된 또 다른 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되거나 상기 또 다른 폴리뉴클레오타이드상에 존재하고, 상기 Cas 단백질을 암호화하는 벡터가 중간 강도 프로모터에 의해 구동되고, 상기 안내-폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 벡터가 고강도 프로모터에 의해 구동되는
    조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서,
    안내-폴리뉴클레오타이드가, 전사되어 실제 안내-폴리뉴클레오타이드를 제공하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 조성물.
  5. 삭제
  6. 제 4 항에 있어서,
    Cas 단백질을 암호화하는 벡터가 저강도 프로모터에 의해 구동되는 조성물.
  7. 제 4 항에 있어서,
    하나 이상의 또는 모든 벡터가 선택성 마커를 포함하는 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서,
    하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드가 안내-폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결되는 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서,
    Cas 단백질이 하나 이상의 핵 국소화 서열을 포함하는 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서,
    Cas 단백질이 표적-서열의 위치에서 2개의 폴리뉴클레오타이드 가닥 모두의 절단을 지시하는 활성을 갖는 조성물.
  11. 제 1 항에 있어서,
    Cas 단백질 암호화 폴리뉴클레오타이드가 숙주 세포에 대해 코돈 최적화된 조성물.
  12. 제 8 항에 있어서,
    고강도 프로모터가 하기 프로모터 중 하나인 조성물:
    라비린툴로마이세트 EF-1 프로모터, 아르기나제 프로모터, 피루베이트 키나제 프로모터, 열 충격 단백질 프로모터 및 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제 프로모터.
  13. 제 1 항, 제 4 항 및 제 7 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    중강도 프로모터가 하기 프로모터 중 하나인 조성물:
    알파 튜불린 프로모터, 아이소시트레이트 라이아제 프로모터, 아코니테이트 하이드라타제 2 프로모터, 말레이트 데하이드로게나제 프로모터 및 액포 ATP 신타제 서브유닛 D 프로모터.
  14. 세포에서 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하는 방법으로서, 숙주 세포를 제 1 항에 따른 조성물과 접촉시킴을 포함하며, 안내-폴리뉴클레오타이드가 상기 숙주 세포 중의 표적-폴리뉴클레오타이드에서 Cas 단백질의 결합을 지시하여 CRISPR-Cas 복합체를 형성시키는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    숙주 세포가 관심 화합물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 방법.
  16. 제 14 항에 있어서,
    숙주 세포가 재조합 숙주 세포인 방법.
  17. 제 1 항, 제 4 항 및 제 7 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 숙주 세포.
  18. 숙주 세포의 생산 방법으로서, 숙주 세포를 제 1 항에 따른 조성물과 접촉시킴을 포함하며, 안내-폴리뉴클레오타이드가 상기 숙주 세포 중의 표적-폴리뉴클레오타이드에서 Cas 단백질의 결합을 지시하여 CRISPR-Cas 복합체를 형성시키는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    숙주 세포를 먼저 Cas 단백질의 소스와 접촉시키고 후속적으로 안내-폴리뉴클레오타이드의 소스와 접촉시키는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서,
    숙주 세포가 관심 화합물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  21. 제 17 항에 있어서,
    숙주 세포가 관심 화합물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 숙주 세포.
  22. 관심 화합물의 생성 방법으로서, 상기 관심 화합물의 생성에 도움이 되는 조건하에서 제 1 항, 제 4 항 및 제 7 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 숙주 세포를 배양함을 포함하는 방법.
  23. 제 14 항 내지 제 16 항 및 제 18 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Cas 단백질이 Cas9 단백질인 방법.
  24. 삭제
  25. 삭제
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