CN104988078B - 破囊壶菌、脂肪酸组合物和其制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及破囊壶菌、脂肪酸组合物和其制备方法及用途，具体地本发明涉及分离的破囊壶菌微生物以及其菌株和突变体。本发明还涉及生物质、微生物油、组合物、培养物、生成微生物油的方法、和使用分离破囊壶菌、生物质及微生物油的方法。

Description

破囊壶菌、脂肪酸组合物和其制备方法及用途

本发明申请是基于申请日为2009年3月19日、申请号为200980159422.0(国际申请号为PCT/US2009/001720)、名称为“破囊壶菌、脂肪酸组合物和其制备方法及用途”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及分离的破囊壶菌(thraustochytrid)微生物及其菌株和变体。本发明还涉及破囊壶菌生物质、微生物油、组合物、培养物、生产微生物油的方法和使用分离破囊壶菌、生物质及微生物油的方法。

背景技术

脂肪酸基于碳链长度和饱和特性分类。短链脂肪酸通常具有12个碳或更少，中链脂肪酸通常具有14到18个碳，长链脂肪酸通常具有20个或更多碳。碳原子间不存在双键时脂肪酸定义为饱和脂肪酸且在双键存在时定义为不饱和脂肪酸。仅存在一个双键时不饱和长链脂肪酸是单不饱和且存在大于一个双键时是多不饱和。

多不饱和脂肪酸(PUFA)基于所述脂肪酸甲基末端的第一个双键位置分类。Ω-3(n-3)脂肪酸在第三个碳上包含第一个双键，而Ω-6(n-6)脂肪酸在第六个碳上包含第一个双键。例如，二十二碳六烯酸("DHA")是Ω-3长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)，具有22个碳的链长度和6个双键，通常标为"22:6 n-3"。其他Ω-3 LC-PUFA包括标为"20:5 n-3"的二十碳五烯酸("EPA")和标为"22:5 n-3"的Ω-3二十二碳五烯酸("DPA n-3")。DHA和EPA定义为“必需”脂肪酸。Ω-6 LC-PUFA包括标为"20:4 n-6"的花生四烯酸("ARA")和标为"22:5 n-6"的Ω-6二十二碳五烯酸("DPA n-6")。

Ω-3脂肪酸是生物学上重要的分子，由于其在细胞膜的存在而影响细胞生理学，调节生物活性化合物的生成和基因表达，且用作生物合成底物。Roche,H.M.,Proc.Nutr.Soc.58:397-401(1999)。例如，DHA占人大脑皮层中脂质的约15％-20％、视网膜中脂质的约30％-60％，其集中于睾丸和精液中，且是乳汁中的重要成分。Jean-PascalBergé和Gilles Barnathan，“来自海洋生物脂质的脂肪酸：分子生物多样性，作为生物标记的作用，生物活性化合物和经济方面”(Fatty Acids from Lipids of Marine Organisms:Molecular Biodiversity,Roles as Biomarkers,Biologically Active Compounds,andEconomical Aspects)，《海洋生物技术》(Marine Biotechnology)I 49(T.Scheper编,2005)。DHA占大脑中Ω-3脂肪酸的多达97％和视网膜中Ω-3脂肪酸的多达93％。此外，DHA对胎儿和婴儿发育以及维持成人中的认知功能是必需的。同上。包括DHA和EPA在内的Ω-3脂肪酸也具有抗炎特性。参见例如同上以及Simopoulos,A.P.,J.Am.Coll.Nutr.21:495-595(2002)。由于Ω-3脂肪酸不在人体内从头合成，这些脂肪酸必须获得自营养源。

亚麻籽油和鱼油被视作Ω-3脂肪酸的良好膳食来源。亚麻籽油不含EPA、DHA、DPA或ARA，但含有能使身体生成EPA的基础成分亚麻酸(C18:3 n-3)。然而，有证据显示代谢转化率可以较慢且可变，特别是在健康受损的机体中。鱼油在脂肪酸组成的类型和水平上差异很大，这取决于具体物种和其饮食。例如，水产养殖的鱼往往Ω-3脂肪酸水平低于野生鱼。此外，鱼油具有含环境污染物的风险并可能涉及稳定性问题和鱼腥味或口味。

破囊壶菌是破囊壶菌目(Thraustochytriales)微生物。破囊壶菌包括裂殖壶菌属(Schizochytrium)的成员且被认为是包括DHA在内的Ω-3脂肪酸的替代来源。参见美国专利第5,130,242号。这些海洋异养微生物生成的油通常具有比相应鱼或微藻油更简单的多不饱和脂肪酸分布。Lewis,T.E.,Mar.Biotechnol.1:580-587(1999)。据报道，破囊壶菌菌株以该生物体所产生总脂肪酸的高百分比生成Ω-3脂肪酸。美国专利第5,130,242号；Huang,J.等，J.Am.Oil.Chem.Soc.78:605-610(2001)；Huang,J.等,Mar.Biotechnol.5:450-457(2003)。然而，分离的破囊壶菌在生成LC-PUFA的特性和量上不同，从而一些前述菌株可能具有的Ω-6脂肪酸水平不理想和/或在培养中表现出低生产率。由此，从营养源中分离出证明有高生产率和理想LC-PUFA分布的破囊壶菌的需求一直存在。

发明内容

本发明涉及以ATCC登录号PTA-9695保藏的破囊壶菌物种的分离破囊壶菌微生物或其衍生菌株，其中所述微生物或其衍生菌株生成的总脂肪酸包括约10重量％或更少的二十碳五烯酸。

本发明也涉及具有以ATCC登录号PTA-9695保藏的破囊壶菌物种特征的分离破囊壶菌微生物，其中所述微生物或其衍生菌株生成的总脂肪酸包括约10重量％或更少的二十碳五烯酸。

本发明也涉及含有甘油三酯组分的分离破囊壶菌微生物或其衍生菌株，其中所述甘油三酯组分的二十二碳六烯酸含量为至少约40重量％，其中所述甘油三酯组分的二十二碳五烯酸n-6含量为至少约0.5重量％-约6重量％，且其中所述微生物或其衍生菌株生成的总脂肪酸包括约10重量％或更少的二十碳五烯酸。

本发明也涉及与以ATCC登录号PTA-9695保藏的破囊壶菌物种同种的分离破囊壶菌微生物或其衍生菌株，其中所述微生物或其衍生菌株生成的总脂肪酸包括约10重量％或更少的二十碳五烯酸。

在一些实施方式中，本发明衍生自分离破囊壶菌微生物的菌株是突变菌株。

本发明也涉及以ATCC登录号PTA-9695、PTA-9696、PTA-9697或PTA-9698保藏的分离微生物。

本发明也涉及含任意一种本发明破囊壶菌微生物或其混合物的破囊壶菌生物质。

本发明也涉及分离的破囊壶菌生物质，其中至少约50重量％的生物质细胞干重是脂肪酸，且其中至少约50重量％的脂肪酸是Ω-3脂肪酸。在一些实施方式中，至少约50重量％的脂肪酸是二十二碳六烯酸。本发明还涉及分离的破囊壶菌生物质，其中至少约25重量％的生物质细胞干重是二十二碳六烯酸。

在一些实施方式中，本发明也涉及分离的破囊壶菌生物质，其中约10重量％或更少的脂肪酸是二十碳五烯酸，且其中二十二碳六烯酸与二十碳五烯酸的重量比为至少约5:1。

在一些实施方式中，本发明也涉及分离的破囊壶菌生物质，其中约1.5重量％或更少的脂肪酸是花生四烯酸，且其中二十二碳六烯酸与花生四烯酸的重量比为至少约20:1。

在一些实施方式中，本发明也涉及分离的破囊壶菌生物质，其含有的二十二碳六烯酸与二十二碳五烯酸n-6的重量比为至少约10:1。

本发明也涉及含任意一种本发明破囊壶菌微生物或其混合物的分离破囊壶菌培养物。在一些实施方式中，所述培养物包括至少约5％的溶解氧。

本发明也涉及用于动物或人的食品、化妆品或药物组合物，其包含本发明破囊壶菌微生物或生物质中的任何一种或其混合物。

本发明也涉及含有至少约70重量％甘油三酯组分的微生物油，其中所述甘油三酯组分的二十二碳六烯酸含量为至少约50重量％，其中所述甘油三酯组分的二十二碳五烯酸n-6含量为约0.5重量％-约6重量％。在一些实施方式中，所述微生物油还包括占所述甘油三酯组分约1.5重量％或更少的花生四烯酸含量。

本发明也涉及含有至少约70重量％甘油三酯组分的微生物油，其中所述甘油三酯组分的二十二碳六烯酸含量为至少约40重量％，其中所述甘油三酯组分的二十二碳五烯酸n-6含量为至少约0.5重量％-约6重量％，且其中二十二碳六烯酸与二十二碳五烯酸n-6的比例为大于约6:1。

本发明也涉及含有至少约70重量％甘油三酯组分的微生物油，其中所述甘油三酯组分的二十二碳六烯酸含量为至少约60重量％。

在一些实施方式中，所述微生物油甘油三酯组分的至少约20％甘油三酯在所述甘油三酯内的两个位置上含有二十二碳六烯酸，所述位置选自sn-1、sn-2和sn-3位置中的任意两个。在一些实施方式中，所述微生物油甘油三酯组分的至少约5％甘油三酯在所述甘油三酯中sn-1、sn-2和sn-3三个位置都含有二十二碳六烯酸。

在一些实施方式中，所述微生物油还包括约5重量％或更少的十七酸。

本发明也涉及用于动物或人的食品、化妆品或药物组合物，其包含本发明的任何微生物油。在一些实施方式中，所述食品是婴儿配方。在一些实施方式中，所述婴儿配方适合早产儿。在一些实施方式中，所述食品是牛奶、饮料、治疗性饮品、营养素饮料或其组合。在一些实施方式中，所述食品是用于动物或人食物的添加剂。在一些实施方式中，所述食品是营养补充品。在一些实施方式中，所述食品是动物饲料。在一些实施方式中，所述动物饲料是水产养殖饲料。在一些实施方式中，所述动物饲料是牲畜饲料、动物园动物饲料、役畜饲料、家畜饲料或其组合。

本发明也涉及含Ω-3脂肪酸的微生物油的生产方法，该方法包括：(a)使本发明的任何一种分离破囊壶菌微生物或其混合物在培养物中生长以生成生物质，和(b)从所述生物质中提取含Ω-3脂肪酸的油。在一些实施方式中，所述培养物包括至少约5％的溶解氧。在一些实施方式中，所述培养物pH维持在约6.5-约8.5。在一些实施方式中，所述培养物温度维持在约17℃-约30℃。在一些实施方式中，所述培养物包括约5g/L-约50g/L浓度的葡萄糖。

本发明也涉及含Ω-3脂肪酸的微生物油的生产方法，该方法包括从本发明任何一种生物质中提取含Ω-3脂肪酸的油。在一些实施方式中，所述微生物油用己烷提取方法提取。在一些实施方式中，微生物油用无溶剂提取方法提取。

在一些实施方式中，在pH约6.5-约8.0的培养基中约17℃-约30℃生长7天后，从每升本发明任何培养物中分离的生物质干细胞重为至少约50g，所述培养基包含碳、氮和营养源及约950ppm-约8500ppm氯离子。

在一些实施方式中，在pH约6.5-约8.0的培养基中约17℃-约30℃生长7天后，本发明的任何一种分离培养物的Ω-3脂肪酸生产率为至少约2克/升/天，所述培养基包含碳源、氮源和营养素及约950ppm-约8500ppm氯离子。

本发明也涉及通过本发明方法产生的微生物油。

本发明也涉及采用本发明的任何分离微生物、生物质或微生物油或其混合物生产治疗炎症或其相关病症的药物。

本发明也涉及采用本发明的任何分离微生物、生物质或微生物油或其混合物治疗炎症或其相关病症。

本发明也涉及用于治疗炎症或其相关病症的本发明的任何分离微生物、生物质或微生物油或其混合物。

本发明也涉及在需要的对象中治疗炎症或其相关病症的方法，包括将本发明的任何分离微生物、生物质或微生物油或其混合物以及药学上可接受载体给予对象。

具体地，本发明涉及如下各项：

1.一种以ATCC登录号PTA-9695保藏的破囊壶菌的分离破囊壶菌微生物或其衍生菌株，其中所述微生物或其衍生菌株生成的总脂肪酸包括约10重量％或更少的二十碳五烯酸。

2.一种具有以ATCC登录号PTA-9695保藏的破囊壶菌特征的分离破囊壶菌微生物，其中所述微生物或其衍生菌株生成的总脂肪酸包括约10重量％或更少的二十碳五烯酸。

3.一种含有甘油三酯组分的分离破囊壶菌微生物或其衍生菌株，其中所述甘油三酯组分的二十二碳六烯酸含量为至少约40重量％，其中所述甘油三酯组分的二十二碳五烯酸n-6含量为至少约0.5重量％-约6重量％，且其中所述微生物或其衍生菌株生成的总脂肪酸包括约10重量％或更少的二十碳五烯酸。

4.一种与以ATCC登录号PTA-9695保藏的破囊壶菌同种的分离破囊壶菌微生物或其衍生菌株，其中所述微生物或其衍生菌株生成的总脂肪酸包括约10重量％或更少的二十碳五烯酸。

5.如项1到4中任一项所述的分离破囊壶菌微生物，其特征在于，所述衍生菌株是突变菌株。

6.一种以ATCC登录号PTA-9695保藏的分离的破囊壶菌微生物。

7.一种以ATCC登录号PTA-9696保藏的分离的破囊壶菌微生物。

8.一种以ATCC登录号PTA-9697保藏的分离的破囊壶菌微生物。

9.一种以ATCC登录号PTA-9698保藏的分离的破囊壶菌微生物。

10.一种含有前述项中任一项所述的破囊壶菌微生物或其混合物的破囊壶菌生物质。

11.一种分离的破囊壶菌生物质，其中，至少约50重量％的所述生物质的细胞干重是脂肪酸，且其中至少约50重量％的脂肪酸是Ω-3脂肪酸。

12.如项11所述的分离破囊壶菌生物质，其特征在于，所述至少约50重量％的所述脂肪酸是二十二碳六烯酸。

13.一种分离的破囊壶菌生物质，其中，至少约25重量％的所述生物质的细胞干重是二十二碳六烯酸。

14.如项10到13中任一项所述的分离破囊壶菌生物质，其特征在于，约10重量％或更少的所述脂肪酸是二十碳五烯酸，且其中二十二碳六烯酸与二十碳五烯酸的重量比为至少约5:1。

15.如项10到14中任一项所述的分离破囊壶菌生物质，其特征在于，约1.5重量％或更少的所述脂肪酸是花生四烯酸，且其中二十二碳六烯酸与花生四烯酸的重量比为至少约20:1。

16.如项10到15中任一项所述的分离破囊壶菌生物质，其特征在于，所述生物质还含有重量比为至少约10:1的二十二碳六烯酸与二十二碳五烯酸n-6。

17.一种含有项1到9中任一项所述的破囊壶菌微生物或其混合物的分离破囊壶菌培养物。

18.如项17所述的分离破囊壶菌培养物，其特征在于，所述破囊壶菌培养物还包括至少约5％的溶解氧。

19.一种用于动物或人的食品、化妆品或药物组合物，其包括项1到16中任一项所述的破囊壶菌微生物或破囊壶菌生物质或其混合物。

20.一种含有至少约70重量％甘油三酯组分的微生物油，其中，所述甘油三酯组分的二十二碳六烯酸含量为至少约50重量％，其中所述甘油三酯组分的二十二碳五烯酸n-6含量为约0.5重量％-约6重量％。

21.如项20所述的微生物油，其特征在于，所述微生物油中所述甘油三酯组分的花生四烯酸含量为约1.5重量％或更少。

22.一种含有至少约70重量％甘油三酯组分的微生物油，其中，所述甘油三酯组分的二十二碳六烯酸含量为至少约40重量％，其中所述甘油三酯组分的二十二碳五烯酸n-6含量为至少约0.5重量％-约6重量％，且其中二十二碳六烯酸与二十二碳五烯酸n-6的比例为大于约6:1。

23.一种含有至少约70重量％甘油三酯组分的微生物油，其中，所述甘油三酯组分的二十二碳六烯酸含量为至少约60重量％。

24.如项20到23中任一项所述的微生物油，其特征在于，所述甘油三酯组分的至少约20％甘油三酯在所述甘油三酯内的两个位置上含有二十二碳六烯酸，所述位置选自sn-1、sn-2和sn-3位置中的任意两个。

25.如项20到23中任一项所述的微生物油，其特征在于，所述甘油三酯组分的至少约5％甘油三酯在所述甘油三酯中sn-1、sn-2和sn-3三个位置上都含有二十二碳六烯酸。

26.如项20到23中任一项所述的微生物油，其特征在于，所述微生物油还包括约5重量％或更少的十七酸。

27.一种用于动物或人的食品、化妆品或药物组合物，其包括项20到26中任一项所述的微生物油。

28.如项19或27所述的食品，其特征在于，所述食品是婴儿配方。

29.如项28所述的食品，其特征在于，所述婴儿配方适合早产儿。

30.如项19或27所述的食品，其特征在于，所述食品是牛奶、饮料、治疗性饮品、营养素饮料或其组合。

31.如项19或27所述的食品，其特征在于，所述食品是用于动物或人食物的添加剂。

32.如项19或27所述的食品，其特征在于，所述食品是营养补充品。

33.如项19或27所述的食品，其特征在于，所述食品是动物饲料。

34.如项33所述的动物饲料，其特征在于，所述动物饲料是水产养殖饲料。

35.如项33所述的动物饲料，其特征在于，所述动物饲料是牲畜饲料、动物园动物饲料、役畜饲料、家畜饲料或其组合。

36.一种含Ω-3脂肪酸的微生物油的生产方法，所述方法包括：

(a)使项1到9中任一项所述的分离破囊壶菌微生物或其混合物在培养物中生长以生成生物质，和

(b)从所述生物质中提取含Ω-3脂肪酸的油。

37.如项36所述的方法，其特征在于，所述培养物包括至少约5％的溶解氧。

38.如项36所述的方法，其特征在于，所述培养物pH维持在约6.5-约8.5。

39.如项36所述的方法，其特征在于，所述培养物温度维持在约17℃-约30℃。

40.如项36所述的方法，其特征在于，所述培养物包括约5g/L–约50g/L浓度的葡萄糖。

41.一种含Ω-3脂肪酸的微生物油的生产方法，所述方法包括从项10到16中任一项所述的生物质中提取含Ω-3脂肪酸的油。

42.如项41所述的方法，其特征在于，所述含Ω-3脂肪酸的微生物油用己烷提取方法提取。

43.如项41所述的方法，其特征在于，所述含Ω-3脂肪酸的微生物油用无溶剂提取方法提取。

44.如项36到43中任一项所述的方法或者项17或18所述的分离破囊壶菌培养物，其特征在于，所述从每升培养物中分离的生物质细胞干重在pH约6.5-约8.0的培养基中约17℃-约30℃生长约7天后为至少约50g，所述培养基包含碳、氮和营养源及约950ppm-约8500ppm氯离子。

45.如项36到43中任一项所述的方法或者项17或18所述的分离破囊壶菌培养物，其特征在于，所述Ω-3脂肪酸生产率在pH约6.5-约8.0的培养基中约17℃-约30℃生长约7天后为至少约2克/升/天，所述培养基包含碳、氮和营养源及约950ppm-约8500ppm氯离子。

46.一种通过项36到45中任一项所述的方法产生的微生物油。

47.项1到16、20到26、46中任一项所述的分离微生物、生物质或微生物油或其混合物在生产治疗炎症或其相关病症的药物中的应用。

48.项1到16、20到26、46中任一项所述的分离微生物、生物质或微生物油或其混合物在治疗炎症或其相关病症中的应用。

49.如项1到16、20到26、46中任一项所述的分离微生物、生物质或微生物油或其混合物，用于治疗炎症或其相关病症。

50.一种在需要的对象中治疗炎症或其相关病症的方法，所述方法包括将项1到16、20到26、46中任一项所述的分离微生物、生物质或微生物油或其混合物以及药学上可接受载体给予对象。

发明详述

本发明涉及分离的破囊壶菌微生物及其菌株和突变体，以及其生物质、微生物油、组合物和培养物。本发明还涉及从本发明的破囊壶菌生成微生物油的方法和使用破囊壶菌、生物质及微生物油的方法。本文所述的破囊壶菌与现有分离物相比较高产，并生成独特脂肪酸分布，其部分特征是高水平的Ω-3脂肪酸，具体是高水平的DHA。

破囊壶菌微生物

本发明涉及分离的破囊壶菌，包括其突变体、重组体和变体。

在一些实施方式中，本发明涉及以ATCC登录号PTA-9695保藏的破囊壶菌。所述分离的破囊壶菌在本文中也称为裂殖壶菌(Schizochytrium)ATCC PTA-9695。ATCC登录号PTA-9695相关破囊壶菌于2009年1月7日根据布达佩斯条约保藏于美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection，专利保藏所(Patent Depository)，弗吉尼亚州马纳萨斯大学大道10801，20110-2209)。

在一些实施方式中，本发明涉及以ATCC登录号PTA-9695保藏的分离的破囊壶菌菌株。在一些实施方式中，本发明涉及与以ATCC登录号PTA-9695保藏的破囊壶菌同种的分离破囊壶菌微生物。

在一些实施方式中，本发明涉及具有以ATCC登录号PTA-9695保藏的破囊壶菌特征的分离破囊壶菌微生物或其衍生菌株。以ATCC登录号PTA-9695保藏的破囊壶菌的特征包括生长和表型特征(表型特征例子包括形态和增殖特性)、其物理和化学性质(如干重和脂质分布)和其基因序列。在一些实施方式中，本发明的分离破囊壶菌具有与以ATCC登录号PTA-9695保藏的破囊壶菌几乎相同的表型特征。在一些实施方式中，本发明的分离破囊壶菌具有与以ATCC登录号PTA-9695保藏的破囊壶菌几乎相同的生长特性。

在一些实施方式中，本发明涉及本发明的分离破囊壶菌的突变体、变体或重组体，其中所述突变体、变体或重组体生成的总脂肪酸包括约10重量％或更少的二十碳五烯酸。突变菌株可通过熟知的方法生成。常用方法包括辐射；高温处理；诱变剂处理。变异菌株可以是本文所述物种的其他天然产生的分离物和/或亚分离物。重组菌株可通过分子生物学中表达外源基因或改变内源基因功能或表达的熟知方法生成。在一些实施方式中，所述突变、变异或重组菌株比野生型菌株产生更高量的Ω-3脂肪酸，包括DHA和/或EPA。在一些实施方式中，所述突变、变异或重组菌株产生较低量的一种或多种脂肪酸，如较低量的EPA、ARA、DPA n-6或其组合。在一些实施方式中，在每升培养物中，所述突变、变异或重组菌株产生比野生型菌株更大的细胞干重。这些突变、变异或重组菌株是本发明的分离破囊壶菌衍生菌株的例子。

在一些实施方式中，本发明涉及以ATCC登录号PTA-9695保藏的破囊壶菌突变菌株。在进一步的实施方式中，所述突变菌株是以ATCC登录号PTA-9696、PTA-9697或PTA-9698保藏的菌株。ATCC登录号PTA-9696、PTA-9697和PTA-9698相关破囊壶菌菌株于2009年1月7日根据布达佩斯条约保藏于美国模式培养保藏所，专利保藏所(Patent Depository)，弗吉尼亚州马纳萨斯大学大道10801，20110-2209。这些保藏的突变菌株是以ATCC登录号PTA-9695保藏的破囊壶菌的衍生物。

在一些实施方式中，包括突变体、变体或重组体在内的本发明的分离破囊壶菌包括分离自破囊壶菌的一个或多个组分的脂肪酸分布。所述分离自破囊壶菌的一个或多个组分包括总脂肪酸组分、甾醇酯组分、甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、甾醇组分、甘油二酯组分、极性组分(包括磷脂组分)和其组合。

破囊壶菌培养物和分离的破囊壶菌生物质

本发明还涉及含一种或多种本发明的分离破囊壶菌的培养物。接种、培养和回收微菌落的不同发酵参数在本领域已知，如美国专利第5,130,242号所述。可使用任何常规培养基培养破囊壶菌。液体或固体培养基可包含天然或人工海水。碳源包括但不限于葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、糖蜜、岩藻糖、葡萄糖胺、葡聚糖、脂肪、油、甘油、醋酸钠和甘露醇。氮源包括但不限于蛋白胨、酵母膏、多价蛋白胨、麦芽膏、肉膏、酪蛋白氨基酸、玉米浆、有机氮源、谷氨酸钠、尿素、无机氮源、乙酸铵、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、硫酸钠。一种典型的培养基示于表1：

表1:容器培养基

高压灭菌后(金属)

高压灭菌后(维生素)

硫胺素** mg/L 9.75 0.1-100,1-50,或5-25

维生素B12** mg/L 0.16 0.1-100,0.1-10,或0.1-1

Ca1/2-泛酸盐** mg/L 3.33 0.1-100,0.1-50,或1-10

高压灭菌后(碳)

葡萄糖 g/L 30.0 5-150,10-100,或20-50

氮供料：

成分 浓度

NH₄OH mL/L 21.6 0-150,10-100,或15-50

典型的培养条件包括下列：

pH 约6.5-约8.5，约6.5-约8.0，或约7.0-约7.5

温度：约17-约30℃，约20-约25℃，或约22-约23℃

溶解氧：约5-约100％饱和，约10-约80％饱和，或约20-约50％饱和

控制葡萄糖@:约5-约50g/L，约10-约40g/L，或约20-约35g/L。

在一些实施方式中，所述培养基包括至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％溶解氧(作为饱和水平的百分比)。在一些实施方式中，所述培养基包括约5％-约20％、约5％-约50％、约5％-约100％、约10％-约20％、约10％-约50％、约10％-约100％、约20％-约50％、或约20％-约100％溶解氧(作为饱和水平的百分比)。

本发明还涉及本发明破囊壶菌的分离生物质。本发明的分离破囊壶菌生物质是通过分离破囊壶菌生物质的任何常规方法获得的收集细胞生物质，如美国专利第5,130,242号和美国申请公开号2002/0001833所述。

在一些实施方式中，在pH约6.5-约8.5的培养基中约17℃-约30℃生长约7天后，分离自每升培养物的生物质细胞干重为至少约50g、至少约60g、至少约70g、至少约80g、至少约100g、至少约120g、至少约140g、至少约160g、至少约180g、或至少约200g，所述培养基包含碳、氮和营养源及约950ppm-约8500ppm氯离子。在一些实施方式中，在pH约6.5、约7、约7.5、约8.0或约8.5的培养基中约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、或约30℃生长约7天后，分离自每升培养物的生物质细胞干重为至少约50g、至少约60g、至少约70g、至少约80g、至少约100g、至少约120g、至少约140g、至少约160g、至少约180g、或至少约200g，所述培养基包含碳、氮和营养源及约950ppm-约8500ppm氯离子。在一些实施方式中，在pH约6.5-约8.5的培养基中约17℃-约30℃生长约7天后，分离自每升培养物的生物质细胞干重为约50g-约200g，所述培养基包含碳、氮和营养源及约950ppm-约8500ppm氯离子。在一些实施方式中，在pH约6.5、约7、约7.5、约8.0或约8.5的培养基中约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、或约30℃生长约7天后，分离自每升培养物的生物质细胞干重为约50g-约200g，所述培养基包含碳、氮和营养源及约950ppm-约8500ppm氯离子。

在一些实施方式中，分离的破囊壶菌培养物在pH约6.5-约8.5的培养基中约17℃-约30℃生长约7天后Ω-3脂肪酸生产率为至少约2克/升/天、至少约4克/升/天、或至少约8克/升/天，所述培养基包含碳、氮和营养源及约950ppm-约8500ppm氯离子。在一些实施方式中，分离的破囊壶菌培养物在pH约6.5-约8.5的培养基中约17℃-约30℃生长约7天后Ω-3脂肪酸生产率为约1克/升/天-约20克/升/天、约2克/升/天-约15克/升/天、约2克/升/天-约10克/升/天、约3克/升/天-约10克/升/天、或约4克/升/天-约9克/升/天，所述培养基包含碳、氮和营养源及约950ppm-约8500ppm氯离子。

在一些实施方式中，所述发酵体积(培养体积)为至少约2升、至少约10升、至少约50升、至少约100升、至少约200升、至少约500升、至少约1000升、至少约10,000升、至少约20,000升、至少约50,000升、至少约100,000升、至少约150,000升、至少约200,000升、或至少约250,000升。在一些实施方式中，所述发酵体积是约2升-约300,000升，约2升、约10升、约50升、约100升、约200升、约500升、约1000升、约10,000升、约20,000升、约50,000升、约100,000升、约150,000升、约200,000升、约250,000升、或约300,000升。

在一些实施方式中，本发明涉及含本发明脂肪酸分布的分离破囊壶菌生物质。在一些实施方式中，至少约50％、至少约60％、至少约70％或至少约80％的生物质细胞干重是脂肪酸。在一些实施方式中，大于约50％、大于约55％或大于约60％的生物质细胞干重是脂肪酸。在一些实施方式中，约50％-约60％、约50％-约70％、约50％-约80％、约55％-约70％、约55％-约80％、约60％-约70％、或约60％-约80％重量的生物质细胞干重是脂肪酸。在一些实施方式中，所述生物质中至少约50％、至少约60％、至少约70％或至少约80％重量的脂肪酸是Ω-3脂肪酸。在一些实施方式中，所述生物质中约50％-约60％、约50％-约70％、约50％-约80％重量的脂肪酸是Ω-3脂肪酸。在一些实施方式中，所述生物质中至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％或至少约80％重量的脂肪酸是DHA。在一些实施方式中，所述生物质中至少约50％-约60％、约50％-约70％、或约50％-约80％重量的脂肪酸是DHA。在一些实施方式中，至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、或至少约60％重量的生物质细胞干重是二十二碳六烯酸。在一些实施方式中，约25％-约65％、约25％-约50％、约30％-约40％、或约25％-约35％重量的生物质细胞干重是二十二碳六烯酸。在一些实施方式中，所述生物质中约10％或更少、约9％或更少、约8％或更少、约7％或更少、约6％或更少、约5％或更少、约4％或更少、约3％或更少、约2％或更少、或约1％或更少重量的脂肪酸是EPA。在一些实施方式中，所述生物质中约1％-约10％、约1％-约5％、约2％-约5％、约3％-约5％、或约3％-约10％重量的脂肪酸是EPA。在一些实施方式中，所述生物质中几乎没有EPA。在一些实施方式中，所述生物质包含的DHA与EPA重量比为至少约5:1、至少约7:1、至少约10:1、至少约11:1、至少约14:1、至少约15:1、至少约17:1、至少约20:1、至少约25:1、至少约50:1、或至少约100:1，其中所述生物质中约10％或更少重量的脂肪酸是EPA。在一些实施方式中，所述生物质中约0.1％-0.2％、约0.1％-约0.3％、约0.1％-约0.4％、约0.1％-约0.5％、或约0.1％-约1.5％重量的脂肪酸是ARA。在一些实施方式中，所述生物质中约1.5％或更少、约1％或更少、约0.5％或更少、约0.4％或更少、约0.3％或更少、约0.2％或更少、或约0.1％或更少重量的脂肪酸是ARA。在一些实施方式中，所述生物质几乎没有ARA。在一些实施方式中，所述生物质包含的DHA与ARA重量比为至少约20:1、至少约40:1、至少约60:1、至少约80:1、至少约100:1、至少约150:1、至少约200:1、至少约250:1、或至少约300:1。在一些实施方式中，所述生物质中约0.5％-约1％、约0.5％-约2％、约0.5％-约5％、约0.5％-约6％、约1％-约5％、约1％-约6％、约2％-约5％、或约2％-约6％重量的脂肪酸是DPA n-6。在一些实施方式中，所述生物质中约6％或更少、约5％或更少、约2％或更少、约1％或更少、或约0.5％或更少重量的脂肪酸是DPA n-6。在一些实施方式中，所述生物质几乎没有DPA n-6。在一些实施方式中，所述生物质包含的DHA与DPA n-6重量比为大于约6:1、至少约8:1、至少约10:1、至少约15:1、至少约20:1、至少约25:1、至少约50:1、或至少约100:1。在一些实施方式中，所述生物质包含脂肪酸，其具有各自占约5％或更少、约4％或更少、约3％或更少、或约2％或更少重量的亚油酸(18:2 n-6)、亚麻酸(18:3 n-3)、二十烯酸(20:1 n-9)和芥酸(22:1 n-9)。

本发明的分离生物质的特征与分离生物质的内源或天然特性，而不是外源引入物质相关。

微生物油

本发明还涉及生成微生物油的方法。在一些实施方式中，所述方法包括使本发明的破囊壶菌在培养物中生长以生成生物质并从该生物质中提取含Ω-3脂肪酸的油。所述油可从新收集的生物质中提取或从以前收集的在防止酸败条件下保存的生物质中提取。可采用已知方法培养本发明的破囊壶菌，从培养物中分离生物质，从该生物质中提取微生物油，并分析从该生物质提取的油的脂肪酸分布。参见例如美国专利第5,130,242号。

本发明还涉及含有本发明脂肪酸分布的微生物油。本发明的微生物油可以是衍生自微生物的任何油，包括例如：从所述微生物生物质提取而没有进一步加工的粗油；用进一步加工步骤如精炼、漂白和/或脱臭处理粗微生物油获得的精制油；通过稀释粗制或精制微生物油获得的稀释微生物油；或者例如用更多纯化方法处理粗制或精制微生物油以增加油中脂肪酸(如DHA)浓度而获得的富集油。

在一些实施方式中，所述微生物油包括约0％、至少约0.1％、至少约0.2％、至少约0.5％、至少约1％、至少约1.5％、至少约2％、或至少约5％重量的甾醇酯组分。在一些实施方式中，所述微生物油包括约0％-约1.5％、约0％-约2％、约0％-约5％、约1％-约1.5％、约0.2％-约1.5％、约0.2％-约2％、或约0.2％-约5％重量的甾醇酯组分。在一些实施方式中，所述微生物油包括小于约5％、小于约4％、小于约3％、或小于约2％重量的甾醇酯组分。在一些实施方式中，所述微生物油包括至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、或至少约90％重量的甘油三酯组分。在一些实施方式中，所述微生物油包括约65％-约95％、约75％-约95％或约80％-约95％重量，或约97％重量或约98％重量的甘油三酯组分。在一些实施方式中，所述微生物油包括至少约0.5％、至少约1％、至少约1.5％、至少约2％、至少约2.5％、或至少约5％重量的游离脂肪酸组分。在一些实施方式中，所述微生物油包括约0.5％-约5％、约0.5％-约2.5％、约0.5％-约2％、约0.5％-约1.5％、约0.5％-约1％、约1％-约2.5％、约1％-约5％、约1.5％-约2.5％、约2％-约2.5％、或约2％-约5％重量的游离脂肪酸组分。在一些实施方式中，所述微生物油包括小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％、或小于约1％重量的游离脂肪酸组分。在一些实施方式中，所述微生物油包括至少约0.5％、至少约1％、至少约1.5％、至少约2％、或至少约5％重量的甾醇组分。在一些实施方式中，所述微生物油包括约0.5％-约1.5％、约1％-约1.5％、约0.5％-约2％、约0.5％-约5％、约1％-约2％、或约1％-约5％重量的甾醇组分。在一些实施方式中，所述微生物油包括小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％、或小于约1％重量的甾醇组分。在一些实施方式中，所述微生物油包括至少约1.5％、至少约2％、至少约2.5％、至少约3％、至少约3.5％、或至少约5％重量的甘油二酯组分。在一些实施方式中，所述微生物油包括约1.5％-约3％、约2％-约3％、约1.5％-约3.5％、约1.5％-约5％、约2.5％-约3％、约2.5％-约3.5％、或约2.5％-约5％重量的甘油二酯组分。在一些实施方式中，所述微生物油包括小于约2％、小于约1.5％、小于约1％、或小于约0.5％重量油的不皂化物。存在于所述微生物油中的脂类如甘油三酯组分，可通过快速层析分离并通过薄层层析(TLC)分析，或通过本领域已知的其他方法分离和分析。

在一些实施方式中，所述微生物油和/或其选自甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、甾醇组分、甘油二酯组分和其组合的一个或多个组分包括至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、或至少约80％重量的DHA。在一些实施方式中，所述微生物油和/或其选自甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、甾醇组分、甘油二酯组分和其组合的一个或多个组分包括约40％-约45％、约40％-约50％、约40％-约60％、约50％-约60％、约55％-约60％、约40％-约65％、约50％-约65％、约55％-约65％、约40％-约70％、约40％-约80％、约50％-约80％、约55％-约80％、约60％-约80％、或约70％-约80％重量的DHA。在一些实施方式中，所述微生物油含有的甾醇酯组分包括约45％或更少、约40％或更少、约35％或更少、约30％或更少、约25％或更少、约20％或更少、约15％或更少、或约13％或更少重量的DHA。在一些实施方式中，所述微生物油和/或选自甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、甾醇组分、甘油二酯组分和其组合的一个或多个组分包括约10％或更少、约9％或更少、约8％或更少、约7％或更少、约6％或更少、约5％或更少、约4％或更少、约3％或更少、约2％或更少、或约1％或更少重量的EPA。在一些实施方式中，所述微生物油和/或选自甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、甾醇组分、甘油二酯组分和其组合的一个或多个组分包括约2％-约3％、约2％-约3.5％、约2.5％-约3.5％、2％-约6％、约2.5％-约6％、约3.0％-约6％、约3.5％-约6％、约5％-约6％、或约2％-约10％重量的EPA。在一些实施方式中，所述微生物油和/或选自甾醇酯组分、甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、甾醇组分、甘油二酯组分、极性组分(包括磷脂组分)和其组合的一个或多个组分几乎没有EPA。在一些实施方式中，所述微生物油和/或选自甾醇酯组分、甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、甾醇组分、甘油二酯组分、极性组分(包括磷脂组分)和其组合的一个或多个组分包含的DHA与EPA的重量比为至少约5:1、至少约7:1、至少约9:1、至少约10:1、至少约15:1、至少约20:1、至少约25:1、至少约30:1、或至少约50:1，其中所述微生物油和/或其一个或多个组分包括10％或更少重量的EPA。在一些实施方式中，所述微生物油和/或选自甾醇酯组分、甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、甾醇组分、甘油二酯组分、极性组分(包括磷脂组分)和其组合的一个或多个组分包含的DHA与EPA的重量比为至少5:1，但小于约20:1。在一些实施方式中，DHA与EPA的重量比为约5:1-约18:1、约7:1-约16:1、或约10:1-约15:1。在一些实施方式中，所述微生物油和/或选自甾醇酯组分、甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、甾醇组分、甘油二酯组分、极性组分(包括磷脂组分)和其组合的一个或多个组分包括约0.1％-约0.25％、约0.2％-约0.25％、约0.1％-约0.5％、或约0.1％-约1.5％重量的ARA。在一些实施方式中，所述微生物油和/或选自甾醇酯组分、甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、甾醇组分、甘油二酯组分、极性组分(包括磷脂组分)和其组合的一个或多个组分包括约1.5％或更少、约1％或更少、约0.5％或更少、约0.2％或更少、或约0.1％或更少重量的ARA。在一些实施方式中，所述微生物油和/或选自甾醇酯组分、甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、甾醇组分、甘油二酯组分、极性组分(包括磷脂组分)和其组合的一个或多个组分几乎没有ARA。在一些实施方式中，所述微生物油和/或选自甾醇酯组分、甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、甘油二酯组分、极性组分(包括磷脂组分)和其组合的一个或多个组分包含的DHA与ARA的重量比为至少约20:1、至少约30:1、至少约35:1、至少约40:1、至少约60:1、至少约80:1、至少约100:1、至少约150:1、至少约200:1、至少约250:1、或至少约300:1。在一些实施方式中，所述微生物油和/或选自甾醇酯组分、甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、甾醇组分、甘油二酯组分、极性组分(包括磷脂组分)和其组合的一个或多个组分包括约0.5％-约1％、约0.5％-约2％、约0.5％-约2.5％、约0.5％-约3％、约0.5％-约3.5％、约0.5％-约5％、约0.5％-约6％、约1％-约2％、约2％-约3％、约2％-约3.5％、约1％-约2.5％、约1％-约3％、约1％-约3.5％、约1％-约5％、或约1％-约6％重量的DPA n-6。在一些实施方式中，所述微生物油和/或选自甾醇酯组分、甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、甾醇组分、甘油二酯组分、极性组分(包括磷脂组分)和其组合的一个或多个组分包括约6％或更少、约5％或更少、约3％或更少、约2.5％或更少、约2％或更少、约1％或更少、或约0.5％或更少重量的DPA n-6。在一些实施方式中，所述微生物油和/或选自甾醇酯组分、甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、甾醇组分、甘油二酯组分、极性组分(包括磷脂组分)和其组合的一个或多个组分几乎没有DPA n-6。在一些实施方式中，所述微生物油和/或选自甾醇酯组分、甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、甾醇组分、甘油二酯组分、极性组分(包括磷脂组分)和其组合的一个或多个组分包含的DHA与DPA n-6的重量比大于约6:1，至少约8:1、至少约10:1、至少约15:1、至少约20:1、至少约25:1、至少约50:1、或至少约100:1。在一些实施方式中，所述微生物油和/或选自甾醇酯组分、甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、甾醇组分、甘油二酯组分、极性组分(包括磷脂组分)和其组合的一个或多个组分包括各自占约5％或更少、约4％或更少、约3％或更少、约2％或更少、约1.5％或更少、约1％或更少、或约0.5％或更少重量的亚油酸(18:2 n-6)、亚麻酸(18:3 n-3)、二十烯酸(20:1 n-9)和芥酸(22:1 n-9)。在一些实施方式中，所述微生物油和/或选自甾醇酯组分、甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、甾醇组分、甘油二酯组分、极性组分(包括磷脂组分)和其组合的一个或多个组分包括约5％或更少、约4％或更少、约3％或更少、约2％或更少、约1.5％或更少、约1％或更少重量的十七酸(17:0)。在一些实施方式中，所述微生物油和/或其一个或多个组分包括约0.01％-约5％、约0.05％-约3％、或约0.1％-约1％重量的十七酸。

所述甘油三酯分子包含3个中心碳原子(C_sn-1H₂R1-C_sn-2H₂R2-C_sn-3H₂R3)，可形成不同的位置异构体。在一些实施方式中，所述微生物油包括甘油三酯组分，所述甘油三酯组分中至少约20％、至少约30％、至少约35％、或至少约40％的甘油三酯在该甘油三酯内两个位置(选自sn-1、sn-2和sn-3位置中的任意两个)上含有DHA(双取代DHA)，这是基于HPLC色谱仪的相对峰面积百分数。在一些实施方式中，所述微生物油包括甘油三酯组分，所述甘油三酯组分中至少约20％-约40％、约20％-约35％、约30％-约40％、或约30％-约35％的甘油三酯在该甘油三酯内两个位置(选自sn-1、sn-2或sn-3位置中的任意两个)上含有DHA，这是基于HPLC色谱仪的相对峰面积百分数。在一些实施方式中，所述微生物油包括甘油三酯组分，所述甘油三酯组分中至少约5％、至少约10％、至少约15％、或至少约20％的甘油三酯在所有sn-1、sn-2和sn-3位置上含有DHA(三取代DHA)，这是基于HPLC色谱仪的相对峰面积百分数。在一些实施方式中，所述微生物油包括甘油三酯组分，所述甘油三酯组分中至少约5％-约20％、约5％-约15％、约10％-约20％、或约10％-约15％的甘油三酯在所有sn-1、sn-2和sn-3位置上含有DHA，这是基于HPLC色谱仪的相对峰面积百分数。相反，美国专利第6,582,941号报道的TAG物质在所有3个位置上不含DHA。在一些实施方式中，所述微生物油包括甘油三酯组分，所述甘油三酯组分中至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、或至少约75％的甘油三酯在甘油三酯内选自任一sn-1、sn-2或sn-3位置的一个位置上含有DHA，这是基于HPLC色谱仪的相对峰面积百分数。在一些实施方式中，所述微生物油包括甘油三酯组分，所述甘油三酯组分中至少约50％-约75％、约50％-约70％、约50％-约65％、约60％-约75％、约60％-约70％、或约60％-约65％的甘油三酯在甘油三酯内选自任一sn-1、sn-2和sn-3位置的一个位置上含有DHA，这是基于HPLC色谱仪的相对峰面积百分数。

组合物

本发明还涉及含有本发明破囊壶菌、本发明分离生物质、本发明微生物油、或其组合的组合物。

本发明的破囊壶菌、生物质或微生物油可通过任何已知技术根据组合物需求而进行进一步化学或物理修饰或加工。

破囊壶菌细胞或生物质可在用于组合物前干燥，方法包括但不限于冷冻干燥、空气干燥、喷雾干燥、隧道干燥、真空干燥(冻干)或类似方法。或者，生物质经收获和清洗后能直接用于组合物而不需干燥。参见美国专利第5,130,242和6,812,009号。

本发明的微生物油可用作起始材料以更有效生成富含脂肪酸如DHA的产物。例如，可对本发明的微生物油应用本领域已知的不同纯化技术如蒸馏或尿素加合，以生成具有更高浓度DHA或其他脂肪酸的更高效产物。本发明的微生物油也可用于化学反应以生成所述油中脂肪酸的衍生化合物，如DHA或其他脂肪酸的酯和盐。

本发明的组合物可包括一种或多种赋形剂。本文使用的“赋形剂”指用于本发明组合物以使该组合物具有理想特征的成分或成分的混合物，该组合物包括食物以及药物、化妆品和工业组合物。本发明的赋形剂加入药物组合物时可描述为“药学上可接受”的赋形剂，意味着所述赋形剂是在全面医学判断范围内以相应合理益处/风险比在所需接触持续期间适于接触人和动物组织而无过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题性并发症的化合物、物质、组合物、盐和/或剂型。在一些实施方式中，术语“药学上可接受”指联邦或州政府监管机构批准或者美国药典(U.S.Pharmacopeia)或其他国际公认药典中列出用于动物，更具体是人。可使用不同的赋形剂。在一些实施方式中，所述赋形剂可以是但不限于碱性剂、稳定剂、抗氧化剂、粘合剂、分离剂、涂层剂、外相成分、控释成分、溶剂、表面活性剂、湿润剂、缓冲剂、填充剂、软化剂、或其组合。除了本文所讨论之外，赋形剂可包括但不限于《雷明顿：药学科学和实践》(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)第21版,(2005)所列。本文中将赋形剂纳入具体分类(例如“溶剂”)用于阐明而不是限制赋形剂作用。一种具体赋形剂可处于多个类别内。

本发明的组合物包括但不限于食品、药物组合物、化妆品和工业组合物。

在一些实施方式中，所述组合物是食品。食品是动物或人消耗的任何食物，且包括固体和液体组合物。食品可以是动物或人食物的添加剂。食物包括但不限于普通食物；液体产品，包括牛奶、饮料、治疗性饮品和营养素饮料；功能性食品；补充品；保健营养品；婴儿配方，包括早产儿配方；怀孕或哺乳期妇女食品；成人食品；老年食品；和动物饲料。

在一些实施方式中，本发明的破囊壶菌、生物质或微生物油可直接使用或作为以下一种或多种中的添加剂：油、起酥油、涂抹食品、其他脂肪成分、饮料、调味汁、奶制或豆制品(如牛奶、酸乳、奶酪和冰淇凌)、烤焙物、营养品，例如作为营养补充品(以胶囊或片剂形式)、维生素补充物、膳食补充剂、粉末冲泡饮品、成品或半成品粉末食品、和其组合。

含本发明微生物油的食物组合物的部分列表包括但不限于豆制品(牛奶、冰淇凌、酸乳、饮品、奶油、涂抹食品、增白剂)；汤和汤混合物；面团、糊状物和烘培食物，包括例如精致烘培制品、早餐谷物、蛋糕、芝士蛋糕、馅饼、纸杯蛋糕、曲奇、条状食物、面包、花卷蛋糕、饼干、松饼、酥皮糕点、司康、油煎面包块、薄脆饼干、甜食、甜品小食、派、格兰诺拉麦片/小食条和烤吐司；糖果；硬糖果；巧克力和其他糖果；口香糖；液体食品，例如牛奶、能量饮料、婴儿配方、碳酸饮料、茶、流质食物、果汁、果汁饮料、蔬菜汁饮料；复合维生素糖浆、餐食替代物、药膳和糖浆；粉末冲泡饮料混合物；意大利面；加工鱼制品；加工肉制品；加工禽制品；肉汁和调味汁；调味品(蕃茄酱、蛋黄酱等)；植物油涂抹食品；奶制品；酸乳；黄油；冷冻奶制品；冰淇淋；速冻甜食；冻酸奶；半固体食品如婴儿食品；布丁和果冻；加工和未加工奶酪；煎饼混合物；食物条，包括能量条；华夫格混合物；沙拉酱；鸡蛋替代混合物；坚果和坚果涂抹食品；咸味休闲食品如薯片、和其他片或脆片、玉米片、墨西哥玉米片、膨化休闲食品、爆米花、椒盐卷饼、薯条和坚果；特色小吃如调味汁、干果小吃、肉类零食、猪肉皮、健康食物条和年糕/玉米饼。

在一些实施方式中，本发明的微生物油可用于补充婴儿配方。本发明的微生物油可单独或与产生花生四烯酸(ARA)的微生物衍生的身体精油组合来补充婴儿配方。产生ARA的微生物是例如高山被孢霉(Mortierella alpina)或舒克里被孢霉(Mortierellasect.schmuckeri)。或者，婴儿配方可添加本发明微生物油与富含ARA的油，包括

(马泰克生物科学公司(Martek Biosciences),马里兰州哥伦比亚)的组合。

在一些实施方式中，所述组合物是动物饲料。“动物”指属于动物界的任何非人生物，包括但不限于水生和陆生动物。术语“动物饲料”或“动物食物”指用于非人动物的任何食物，无论是鱼；经济鱼类；观赏鱼；仔鱼；双壳类；软体动物；甲壳动物；贝类；虾；幼虾；卤虫；轮虫；盐水虾；滤食动物；两栖动物；爬行动物；哺乳动物；家畜；耕畜；动物园动物；运动类动物；种畜；比赛类动物；表演类动物；活化石动物(heirloom animals)；稀有或濒危动物；伴侣动物；宠物如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠或马；灵长类动物如猴(例如卷尾猴、恒河猴、非洲绿猴、赤猴、食蟹猕猴和长尾猴)、猿、猩猩、狒狒、长臂猿和黑猩猩；犬科动物如狗和狼；猫科动物如猫、狮子和虎；马科动物如马、驴子和斑马；食用动物如奶牛、牛、猪和羊；有蹄动物如鹿和长颈鹿；啮齿动物如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；等等。动物饲料包括但不限于水产养殖饲料、家畜饲料，包括宠物饲料、动物园动物饲料、役畜饲料、畜牲饲料或其组合。

在一些实施方式中，所述组合物是人可消耗其肉或制品的任何动物的饲料或饲料补充品，如从其获得肉、蛋或乳汁可为人食用的任何动物。喂养这些动物时，可将营养素如LC-PUFA掺入该动物的肉、乳汁、蛋或其他产品以增加这些营养素的含量。

在一些实施方式中，所述组合物是喷雾干燥物质，其可压碎以形成适当大小的颗粒用于浮游动物、卤虫、轮虫和滤食动物消耗。在一些实施方式中，喂以所述组合物的浮游动物、卤虫或轮虫随之被仔鱼、鱼、贝类、双壳类或甲壳动物吃掉。

在一些实施方式中，所述组合物是药物组合物。合适的药物组合物包括但不限于抗炎组合物、冠心病治疗药物、动脉硬化治疗药物、化疗剂、活性赋形剂、骨质疏松药物、抗抑郁药、抗惊厥药、抗幽门螺杆菌药物、神经退行性疾病治疗药物、退行性肝病治疗药物、抗生素、降胆固醇组合物和降甘油三酯组合物。在一些实施方式中，所述组合物是医疗食品。医疗食品包括在医师指导下使用或外部给予的组合物中的食物和用于某一病症的特定饮食控制的食物，其独特营养需求基于公认的科学原理通过医学评估确定。

在一些实施方式中，所述微生物油可制成剂型。剂型可包括但不限于片剂、胶囊、囊片、丹剂、丸剂、散剂和颗粒剂、胃肠外剂型，胃肠外剂型包括但不限于溶液剂、混悬剂、乳剂和粉末剂，其含有有效量的所述微生物油。本领域也已知这些制剂还可包含药学上可接受稀释剂、填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、表面活性剂、疏水性运载体、水溶性运载体、乳化剂、缓冲剂、湿润剂、保湿剂、增溶剂、防腐剂等。给予形式可包括但不限于片剂、糖衣丸、胶囊、囊片和丸剂，其含有所述微生物油和一种或多种药学上可接受的适当载体。

对于口服给药，所述微生物油可与本领域熟知的药学上可接受载体联用。这类载体能使本发明的微生物油制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、混悬剂等，以便待治疗个体口服摄入。在一些实施方式中，所述剂型是片剂、丸剂或囊片。获得口服药物制品可通过加入固体赋形剂，任选研磨所得混合物，如需要在加入适当辅剂后加工颗粒混合物，从而获得片剂或糖衣丸芯体。合适的赋形剂包括但不限于填充剂如糖，包括但不限于乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇；纤维素制品例如但不限于玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、土豆淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如需要，可加入崩解剂，例如但不限于交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或藻酸或其盐如藻酸钠。能口服使用的药物制品包括但不限于由明胶制成的推入配合(push-fit)胶囊，以及由明胶和塑化剂如甘油或山梨醇制成的密封软胶囊。

在一些实施方式中，所述组合物是化妆品。化妆品包括但不限于乳液、乳霜、洗液、面膜、肥皂、洗发水、化妆水、面霜、护发素、彩妆用品、沐浴基和分散液。化妆试剂可以是医用或非医用。

在一些实施方式中，所述组合物是工业组合物。在一些实施方式中，所述组合物是一种或多种产品的原材料。产品包括但不限于聚合物；照相感光材料；去垢剂；工业用油；或工业清洁剂。例如，美国专利第7,259,006号描述了使用含DHA的脂肪和油生成山嵛酸和用山嵛酸生产照相感光材料。

使用组合物的方法

在一些实施方式中，所述组合物能用于治疗人或动物中的某一病症。

术语“处理”和“治疗”指治疗性治疗和预防或防止性措施，其中目标是防止或缓解(减轻)不需要的生理状况、疾病或失调，或是获得有益或需要的临床结果。对于本发明目的，有益或需要的临床结果包括但不限于缓解与某一病症、疾病或失调相关的症状或征兆；减轻某一病症、疾病或失调的程度；稳定某一病症、疾病或失调(即其中所述病症、疾病或失调不恶化)；延迟所述病症、疾病或失调的发生或进展；改善所述病症、疾病或失调；缓和(无论组分或全部且无论能检测或不能检测)所述病症、疾病或失调；或者改良或改进某一病症、疾病或失调。治疗也包括与若不接受治疗的预期存活期相比，延长存活期。

在一些实施方式中，用所述组合物治疗某一病症、疾病或失调，如痤疮、急性炎症、年龄相关性黄斑部病变、变态反应、阿尔茨海默病、关节炎、哮喘、动脉粥样硬化、自身免疫病、血脂异常、乳腺囊肿、恶病质、癌症、心脏再狭窄、心血管疾病、慢性炎症、冠心病、囊性纤维化、退行性肝病、糖尿病、湿疹、肠胃失调、心脏病、高甘油三酯水平、高血压、多动症、免疫疾病、抑制肿瘤生长、炎症病症、肠失调、肾功能障碍、白血病、重郁症、多发性硬化症、神经退化性疾病、骨关节炎、骨质疏松症、过氧化物酶体异常、子痫前期、早产、银屑病、肺异常性类风湿关节炎、心脏病风险或血栓。

在一些实施方式中，所述组合物用于增加妊娠最后三个月的妊娠期长度。

在一些实施方式中，所述组合物用于控制血压。

在一些实施方式中，所述组合物用于改善或维持认知功能。

在一些实施方式中，所述组合物用于改善或维持记忆。

所述组合物或剂型可通过任何与该组合物或剂型相容的途径给予对象体内。如果某一物质由对象引入其体内，或如另一人、机器或装置将该物质引入对象体内，则认为“给予”了该物质。因此，“给予”包括自身给予、通过其他方式给予和间接给予。本文涉及“给予”使用的术语“持续”或“连续”指给予频率为至少每天一次。然而，应注意给予频率可以大于每天一次且仍为“持续”或“连续”，例如每天二次或甚至三次，只要不超过本文指定的剂量水平。给予的方式和方法在本领域已知且技术人员可参考不同的药理学参考文献用于指导。例如，可查阅“现代药剂学”(Modern Pharmaceutics),Banker和Rhodes,美国健康信息(Informa Healthcare)，第4版(2002)和“Goodman&Gilman的《治疗学的药学基础》”(Goodman&Gilman’s The Pharmaceutical Basis of Therapeutics)，纽约的麦克劳希尔有限公司(McGraw-Hill Companies,Inc.),第10版(2001)。

“对象”、“个体”或“患者”指需要诊断、预后或治疗的任何对象，无论是人或非人。哺乳动物对象包括但不限于人；家畜；耕畜；动物园动物；运动类动物；宠物如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、或马；灵长类动物如猴(例如卷尾猴、恒河猴、非洲绿猴、赤猴、食蟹猕猴和长尾猴)、猿、猩猩、狒狒、长臂猿和黑猩猩；犬科动物如狗和狼；猫科动物如猫、狮子和虎；马科动物如马、驴子和斑马；食用动物如奶牛、牛、猪和羊；有蹄动物如鹿和长颈鹿；啮齿动物如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；等等。术语对象也涵盖模型动物，例如疾病模型动物。在一些实施方式中，术语对象包括经济上或其他方面有价值的动物，例如经济上重要的种畜、比赛类动物、表演类动物、活化石动物、稀有或濒危动物、或伴侣动物。在一些实施方式中，对象是人对象。在某些实施方式中，对象是非人对象。

所述组合物可以“治疗有效量”、“预防有效量”、“治疗剂量”、或“预防剂量”给予。“治疗有效量”或“治疗剂量”指在必要的剂量和时间段内有效获得所需治疗结果的量。治疗结果可以是例如减轻症状、延长存活、改善移动性等。治疗结果不必是“治愈”。“预防有效量”或“预防剂量”指在必要的剂量和时间段内有效获得所需预防结果的量。通常，由于预防剂量在疾病早期之前或期间用于对象，预防有效量小于疾病晚期治疗的治疗有效量。

根据待给予对象的破囊壶菌、生物质或微生物油的DHA或其他脂肪酸成分的量，可将不同剂量的药物组合物给予对象。术语“日剂量”、“日剂量水平”、“每日剂量”在本文中指每天(每24小时段)给予的DHA或其他脂肪酸成分总量。因此，例如给予对象2mg DHA的日剂量意味着该对象每天接受共2mg DHA，无论DHA以含2mg DHA的单个剂型或是以各含0.5mgDHA的四个剂型(总共2mg DHA)给予。在一些实施方式中，每日DHA量以单个剂型或两个剂型给予。本发明的剂型可一次施用或多次施用。例如，若每日用4片，每片含0.5mg DHA，则可每天一次服用所有4片，或每天两次2片，或每6小时1片。在一些实施方式中，日剂量为约100mg–约15g DHA。在一些实施方式中，日剂量为约100mg-约250mg、约100mg-约500mg、约100mg-约1g、约1g-约2.5g、约1g-约5g、约1g-约10g、约1g-约15g、约5g-约10g、约5g-约15g、约10g-约15g、约100mg-约10g、约100mg-约5g、或约100mg-约2.5g。

可用不同方案给予本发明的组合物或剂型。例如，在一些实施方式中，连续数天每日给予，或者每隔一天(每两天)给予。可以在一天或多天给予。

给予所述组合物和剂型可与治疗所述病症的其他方案联用。例如，本发明的方法可与膳食方案(例如低糖饮食、高蛋白饮食、高纤维饮食等)、锻炼方案、减肥方案、戒烟方案或其组合联用。本发明的方法也可与其他药品联合治疗所述病症。本发明的组合物或剂型可在其他方案或药品之前或之后给予。

含组合物的药盒

本发明还涉及含一个或多个单位的本发明组合物的药盒或包装。药盒或包装可包括数单位的食品、药物组合物、化妆品或工业组合物，其含有本发明的破囊壶菌、生物质或微生物油、或其组合。药盒或包装也可包括含本发明破囊壶菌、生物质或微生物油、或其组合的添加剂，用于制备食品、化妆品、药物组合物或工业组合物。

在一些实施方式中，所述药盒或包装含有根据本发明方法给予的一个或多个单位的药物组合物。所述药盒或包装可含有一剂量单位，或大于一剂量单位(即多剂量单位)。如果所述药盒或包装中存在多剂量单位，可任选安排该多剂量单位以依序给予。

本发明的药盒可任选包含与该药盒的单位或剂型相关的说明。这类说明可以是政府监管药品生产、使用或销售的机构规定的形式，这反映其被生产、使用或销售监管机构批准用于人给药以治疗某一病症或失调。所述说明可以是传递根据本发明方法使用药盒中单位或剂型的信息的任何形式。例如，所述说明可以是印刷品，或是预录制媒体装置形式。

在检查病人过程中，医学专业人员可确定施用本发明的一种方法是适合该病人的，或医师可确定通过施用本发明方法的一种方法能改善病人病症。开出任何方案前，医师可告知病人例如与该方案相关的不同风险和益处。充分告知病人与该方案相关的所有已知和疑似风险。这类提示可以是口头以及书面形式。在一些实施方式中，医师可提供关于该方案的文献资料给病人，例如产品信息、教材等。

本发明也涉及教育消费者了解治疗方式的方法，该方法包括在销售点分发剂型与消费者信息。在一些实施方式中，分发在具有药剂师或医疗服务提供者的销售点进行。

术语“消费者信息”可包括但不限于英语文本、非英语文本、视觉图像、图表、电话录音、网址、客服代表联系方式。在一些实施方式中，消费者信息提供指南用于根据本发明方法使用剂型、合适使用年龄、提示、禁忌、合适剂量、警告、网址的电话。在一些实施方式中，本方法还包括提供专业信息给某一地点的相关人员，以回答消费者关于根据本发明方法使用所述方案的问题。术语“专业信息”包括但不限于涉及根据本发明方法给予时方案的信息，信息设计成能使医学专业人员回答消费者问题的形式。

“医学专业人员”包括例如医师、医师助理、执业护士、药剂师和客服代表。

总体上描述本发明后，可参考本文提供的实施例进一步加以理解。这些实施例仅用阐明且不用于限制。

实施例1

鉴定以ATCC登录号PTA-9695保藏的分离破囊壶菌以便分类。

在低潮期从潮间带生境中收集样品。将水、沉淀物、活植物物质和腐败植物/动物残骸置于50ml无菌管。各样品组分与水一起平铺于分离培养基的固体琼脂板上。分离培养基由以下组成：500ml人工海水、500ml蒸馏水、1g葡萄糖、1g甘油、13g琼脂、1g谷氨酸盐、0.5g酵母膏、0.5g酪蛋白水解物、1ml维生素溶液(100mg/L硫胺素,0.5mg/L生物素,0.5mgB12)、1ml痕量矿物质溶液(PII金属，每升含有：6.0g FeCl₃6H₂O,6.84g H₃BO₃,0.86gMnCl₂4H₂O,0.06g ZnCl₂,0.026 CoCl₂6H₂O,0.052g NiSO₄H₂O,0.002g CuSO₄5H₂O和0.005gNa₂MoO₄2H₂O)和各500mg的青霉素G和硫酸链霉素。琼脂板避光20-25℃孵育。2-4天后，琼脂板放大后加以检测，用无菌牙签挑出细胞菌落并重划线培养于新鲜培养基板。细胞重复划线培养于新鲜培养基上，直到去除污染生物。

将来自琼脂板的菌落转移到皮氏培养皿中，所述培养皿具有半皿海水和1ml高压灭菌的新孵化盐水虾幼虫悬浮液。2-3天后盐水虾幼虫严重过度生长，产生孢子囊簇。释放的游动孢子在排出时具有双鞭毛，活跃地游离成熟孢子囊，孢子释放后其在壁上的残留物清晰可见(相位差)。测得孢子囊直径为12.5μm-25μm，游动孢子大小为2.5μm-2.8μm x 4.5μm-4.8μm。各单独孢子囊有8-24个孢子。沉淀的游动孢子放大并迅速经历二分裂，产生四分体、八分体并最终形成孢子囊簇。四分体形成在孢子囊成熟前较早期开始。这些特征与裂殖壶菌属一致。

基于其18s rRNA基因与已知物种的相似性，进一步鉴定以ATCC登录号PTA-9695保藏的分离破囊壶菌。以ATCC登录号PTA-9695保藏的破囊壶菌的总基因组DNA通过标准方法制备(Sambrook J.和Russell D.2001.《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:ALaboratory Manual),第3版,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor LaboratoryPress),纽约冷泉港)并用于PCR扩增18s rRNA基因。用前述引物完成该18s rRNA基因的PCR扩增(Honda等，J.Eukaryot.Microbiol.46(6)1999)。用染色体DNA摸板的PCR条件如下：0.2μM dNTPs,0.1uM各引物,8％DMSO,200ng染色体DNA,2.5U

II融合HS DNA聚合酶(司查塔基公司(Stratagene))和1X

缓冲剂(司查塔基公司)，50μL总体积。PCR操作包括以下步骤：(1)95℃2分钟；(2)95℃45秒；(3)55℃30秒；(4)72℃2分钟；(5)重复步骤2-4，40轮；(6)72℃5分钟；和(7)保持于6℃。

用上述染色体模板的PCR扩增产生具有预期大小的独特DNA产物。根据厂商说明将所述PCR产物克隆到pJET1.2/钝端(Fermentas)载体中，用提供的标准引物确定插入序列。

表2显示以ATCC登录号PTA-9695保藏的破囊壶菌的18s rRNA序列与国家生物技术信息中心(NCBI)电子数据库中DNA序列的比对。简要地，通过VectorNTI程序(英杰公司(Invitrogen))的"AlignX"程序内评分矩阵"swgapdnamt"(一种DNA比对标准)测定“相同性％”。从NCBI电子数据库的基本局部比对搜索工具(BLAST)计算结果获得“覆盖％”，“覆盖％”是比对区段内含有的查询长度的百分数。

表2:18s rRNA序列的比较

(p):指示部分序列

如表2所示，发现在相同性％方面，以ATCC登录号PTA-9695保藏的破囊壶菌的18srRNA基因序列(SEQ ID NO:1)与Honda,D.等,J.Euk.Micro.46(6):637-647(1999)提供的黃金石斛破囊壶菌(T.aggregatum)尽管不同但密切相关。公开的黃金石斛破囊壶菌18s rRNA序列是部分序列，在该序列中间有约71个DNA核苷酸的缺口。在覆盖百分数方面，与黃金石斛破囊壶菌相比，本发明分离物的18s rRNA基因序列更接近裂殖壶菌ATCC 20888。

高度保守蛋白如肌动蛋白和β-微管蛋白与18s rRNA基因一起广泛用作评估生物间系统发生关系的标记(Baldauf,S.M.Am.Nat.154,S178(1999))。以ATCC登录号PTA-9695保藏的破囊壶菌的总基因组DNA也用作肌动蛋白和β-微管蛋白基因的PCR扩增模板。PCR扩增使用的引物设计成针对黃金石斛破囊壶菌的肌动蛋白和β-微管蛋白DNA序列的保守区。

用染色体DNA摸板的PCR条件如下：0.2μM dNTPs,0.1uM各引物,8％DMSO,200ng染色体DNA,2.5U力蛋白酶(Herculase)

II融合DNA聚合酶(司查塔基(Stratagene))和1X力蛋白酶

缓冲剂(司查塔基)，50μL总体积。PCR操作包括以下步骤：(1)95℃2分钟；(2)95℃30秒；(3)55℃30秒；(4)72℃2分钟；(5)重复步骤2-4，40轮；(6)72℃5分钟；和(7)保持于6℃。

用上述染色体模板的PCR扩增产生具有预期大小的独特DNA产物。根据厂商说明将各PCR产物克隆到pJET1.2/钝端(Fermentas)载体中，用提供的标准引物确定插入序列。

表3显示以ATCC登录号PTA-9695保藏的破囊壶菌的肌动蛋白氨基酸序列(SEQ IDNO:3)相较公开数据库中肌动蛋白序列的相同性。用VectorNTI程序的"AlignX"程序内评分矩阵"blosum62mt2"(一种蛋白比对标准)测定相同性。

表3:肌动蛋白序列相同性％的比较

表4显示以ATCC登录号PTA-9695保藏的破囊壶菌的β-微管蛋白氨基酸序列(SEQID NO:5)相较公开数据库中β-微管蛋白序列的相同性。用VectorNTI程序的"AlignX"程序内评分矩阵"blosum62mt2"(一种蛋白比对标准)测定相同性。

表4：β-微管蛋白序列相同性％的比较

破囊壶菌

相同性％

科格仑斯奥兰壶菌(Aplanochytrium kerguelense)	100
		斯托凯奥兰壶菌(Aplanochytrium stocchinoi)	100
麦尼日本壶菌	100
		拉普利壶菌(Labyrinthula)N8	100
破囊壶菌RT49	100
		黃金石斛破囊壶菌	100
破囊壶菌HU1	100
		奥雷姆破囊壶菌	100
凯尼破囊壶菌(Thraustochytrium kinnei)	100
		破囊壶菌#32	100
破囊壶菌PW19	100
		黄金石斛裂殖壶菌	100
裂殖壶菌ATCC 20888	100

基于上述特征，认为以ATCC登录号PTA-9695保藏的分离破囊壶菌代表一种新的裂殖壶菌种并因而命名为裂殖壶菌ATCC PTA-9695。

实施例2

以ATCC登录号PTA-9695保藏的分离破囊壶菌如下所述在不同培养条件下产生高水平的细胞生长。典型的培养基和培养条件示于表1。也观察到高水平的脂肪酸和DNA(即大于50重量％的细胞干重是脂肪酸且大于50重量％的脂肪酸是DHA)。

在具有22.5℃时8200ppm Cl-、pH 7.0时20％溶解氧的碳和氮补料培养物中，所述分离物在培养7天后产生140g/L的细胞干重，有70重量％的脂肪酸含量。使用闭环氨补料且pH维持于7.0。这些条件下7天内Ω-3的产率为8.92g/(L*天)，有4.7g/L EPA(5重量％的脂肪酸)和56.3g/L DHA(57重量％的脂肪酸)。

在具有22.5℃时3640ppm Cl-、pH 7.0时20％溶解氧的碳和氮补料培养物中，所述分离物在培养7天后产生82g/L的细胞干重，有58重量％的脂肪酸含量。这些条件下7天内Ω-3的产率为4.5g/(L*天)，有2.1g/L EPA(4.3重量％的脂肪酸)和28.5g/L DHA(58.7重量％的脂肪酸)。

在具有22.5℃时980ppm Cl-、pH 7.0时20％溶解氧的碳和氮补料培养物中，所述分离物在培养7天后产生60g/L的细胞干重，有53重量％的脂肪酸含量。这些条件下7天内Ω-3的产率为2.8g/(L*天)，有1.1g/L EPA(3.4重量％的脂肪酸)和18.4g/L DHA(56.8重量％的脂肪酸)。

实施例3

从以ATCC登录号PTA-9695保藏的分离破囊壶菌的生物质样品(样品A)中提取油。在具有22.5℃时980ppm Cl^-、pH 7.0时20％溶解氧的碳和氮补料培养物中生成所述生物质样品。通过己烷提取方法从生物质样品A中提取油以产生微生物油样品A1。简要地，用己烷研磨干燥生物质约2小时，采用不锈钢管和不锈钢球轴承。真空过滤浆液并收集过滤物。用旋转蒸发器去除己烷。也用

方法(基伊埃韦斯伐里亚分离机英国有限公司(GEA Westfalia Separator UK Ltd.)，英国米尔顿凯恩斯)从生物质样品A中提取油以产生微生物油样品A2。用低压快速层析从微生物油样品A1和A2中分离单独脂类，测定各类别的重量百分数。用带火焰离子化检测的气相色谱(GC-FID)测定各类别中作为脂肪酸甲酯(FAME)的脂肪酸分布。

快速层析-用快速层析分离粗制油中存在的脂类，确定所述油中存在的各类别的重量百分数。所述层析系统采用硅胶60(EMD化学公司(EMD Chemical)，新泽西州格洛斯特县)，流动相由3mL/分钟的石油醚和乙酸乙酯组成。使用分步梯度以从柱中选择性洗脱各脂类。流动相梯度始于100％石油醚且止于50％乙酸乙酯(接着是100％甲醇洗)。用吉尔森(Gilson)FC 204大床馏分收集器(吉尔森有限公司(Gilson,Inc.),威斯康星州米德顿)在10mL试管中收集馏分。通过薄层层析(TLC)分析各管，收集含各脂类的管(由具预期保留因子(Rf)的TLC板上的单一点判断)，浓缩至干并称重。然后，通过重量法测定总馏分含量。

TLC分析-在硅胶板上进行薄层层析。板用由石油醚:乙醚:乙酸(80:20:1)组成的溶剂体系洗脱并用碘蒸气显色。然后，将各点的Rf值与文献报道的各脂类值作比较。

脂肪酸分析-分析生物质和分离脂类样品中作为FAME的脂肪酸组成。样品直接称重到螺口试管中，将1mL溶于甲苯的C19:0内标(NuCheck,明尼苏达州伊利森)和2mL溶于甲醇的1.5N HCl加入各管。短暂振荡管并置于100℃加热器内2小时。从加热器中取出管，冷却，加入1mL溶于水的饱和NaCl。再次振荡管，离心，将顶(有机)层组分置于GC小管并通过GC-FID分析。用3点内标校准曲线定量FAME，所述曲线用Nu-Chek-Prep GLC参考标准(Nu-Chek Prep公司，明尼苏达州伊利森)产生并基于保留时间初步鉴定。存在的脂肪酸表示为总FAME的mg/g和％。

通过将粗制油溶于己烷并应用于柱顶部来制备样品A1。用快速层析分馏样品后，甾醇酯组分占所述粗制油重量的1.2重量％，甘油三酯(TAG)组分占82.7重量％，游离脂肪酸(FFA)组分占0.9重量％，且甘油二酯(DAG)组分占2.9重量％。样品A1粗制油和分离组分的总脂肪酸分布分别示于下表5和6，以mg/g和％FAME计算。

表5:以mg/g FAME计算的样品A1脂肪酸分布

表6:作为总FAME百分数的样品A1脂肪酸分布

通过将粗制油溶于己烷并应用于柱顶部来制备样品A2。用快速层析分馏样品后，甾醇酯组分占所述粗制油重量的0.8重量％，甘油三酯(TAG)组分占83.4重量％，游离脂肪酸(FFA)组分占1.8重量％，且甘油二酯(DAG)组分占5.6重量％。样品A2粗制油和分离组分的总脂肪酸分布分别示于下表7和8，以mg/g和％FAME计算。

表7:以mg/g FAME计算的样品A2脂肪酸分布

表8:作为总FAME百分数的样品A2脂肪酸分布

实施例4

从如实施例3所述用己烷提取(样品A1)或

方法(基伊埃韦斯伐里亚分离机英国有限公司,英国米尔顿凯恩斯)(样品A2)先前提取自以ATCC登录号PTA-9695保藏的分离破囊壶菌的微生物油样品中分离甘油三酯(TAG)。用带大气压化学电离质谱(APCI-MS)检测的非水反相高效液相色谱(NARP-HPLC)确定各TAG异构体的相对面积百分数，用质谱碎裂模式初步鉴定各位置异构体。

用快速层析分离含TAG的单独脂类。通过HPLC/APCI-MS分析所述TAG组分以确定各TAG种类中存在哪种脂肪酸部分，以及各TAG种类的相对量。基于各峰的保留时间和APCI谱初步鉴定各TAG峰。使用NARP-HPLC时，各TAG的保留随着等价碳数(ECN)而增加，ECN定义为所有酰基链中碳总数减去双键数的两倍。同样，使用最佳层析条件时，具有相同ECN但饱和和不饱和脂肪酸分布不同的TAG种类临界配对以及链长度不同的脂肪酸也可分辨。各TAG峰的APCI质谱提供了质子化分子离子[M+H]⁺、铵加合离子[M+NH₄]⁺和DAG碎片离子的质量。各TAG产生独特的质谱，DAG碎片的质量有助于确定各TAG种类的特征。对应于sn-2位置酰基损失的碎片离子是APCI谱中最小强度信号，因为其在能量上低于sn-1或sn-3位置损失。《通过液相色谱质谱法的现代脂类分析和相关技术》(Modern Methods for Lipid Analysis byLiquid Chromatography Mass Spectrometry and Related Techniques)276-297(William Craig Byrdwell编,2005)。

快速层析-用快速层析分离粗制油中存在的脂类，确定所述油中存在的各类别重量百分数。所述层析系统采用硅胶60，流动相由3mL/分钟的石油醚和乙酸乙酯组成。使用分步梯度以从柱中选择性洗脱各脂类。流动相梯度始于100％石油醚且止于50％乙酸乙酯(接着是100％甲醇洗)。用吉尔森FC204大床馏分收集器(吉尔森有限公司,威斯康星州米德顿)在20mL试管中收集馏分。通过TLC分析各管，收集含各脂类的管(由具预期Rf的TLC板上的单一点判断)，浓缩至干并称重。然后，通过重量法测定总馏分含量。

TLC分析-在硅胶板上进行薄层层析。板用由石油醚:乙醚:乙酸(80:20:1)组成的溶剂体系洗脱并用碘蒸气显色。然后，将各点的Rf值与文献报道的各脂类值作比较。

HPLC/APCI-MS分析-所用LC/MS系统由装有大气压化学电离(APCI)的惠普(Hewlett Packard)1100型HPLC和惠普1100型质量选择检测器(MSD)(安捷伦科技有限公司(Agilent Technologies,Inc.)，加利福尼亚州圣克拉拉)组成。该HPLC方法使用2个串联的

C18柱(250mm x 4.6mm,5μm；菲罗门公司(Phenomenex,Inc.)(加利福尼亚州托兰斯))，流速为1mL/分钟，注入体积为2μL，柱温度为50℃。流动相由溶于异丙醇的0.1％乙酸铵(溶剂A)和乙腈(溶剂B)组成。使用线性梯度，从20％溶剂A开始，40分钟内增加到75％溶剂A，在75％溶剂A保持5分钟，1分钟内回到20％溶剂A，在20％溶剂A再保持9分钟。MSD质量范围设置为m/z 400–1150，碎裂电压为150，干燥气流速为6L/分钟，喷雾器压力为45psig，干燥气温度为350℃，蒸发温度为325℃，毛细管电压为3500V，电晕电流为10μA。

二十二碳六烯酸甘油三酯(Tri-DHA)-MS分析-Tri-DHA STD(NuCheck，明尼苏达州伊利森)用于评估色谱系统和检测器响应的准确性。Tri-DHA峰的保留时间为22.5分钟，总离子色谱图(TIC)产生良好的信噪比。Tri-DHA峰的APCI质谱显示在m/z 1023.7处出现质子化分子离子[M+H]⁺、在m/z 1040.8处出现铵加合离子[M+NH₄]⁺和在m/z 695.5处出现单一特征性DAG碎片。

在己烷中制备分离TAG组分的样品并通过NARP HPLC/APCI-MS分析以确定单独TAG异构体的特征。

评估各峰的质谱并初步鉴定各脂肪酸组分，如下表9和10所概括。

表9:通过LC/APCI-MS初步鉴定样品A1中的TAG种类

表10:通过LC/APCI-MS初步鉴定样品A2中的TAG种类

实施例5

如实施例3所述用

方法从发酵肉汤中提取油后，通过精炼、漂白和脱臭步骤进一步加工所述粗制油以获得最终的油。用富油酸葵花籽油稀释最终油以获得DHA含量约400mg/g的成品商业用油。分离单独脂类并用带火焰离子化检测的气相色谱(GC-FID)测定各类别中作为脂肪酸甲酯(FAME)的脂肪酸分布。

快速层析-用快速层析分离最终油中存在的脂类，确定所述油中存在的各类别重量百分数。所述层析系统采用硅胶60(EMD化学公司，新泽西州格洛斯特县)，流动相由3mL/分钟的石油醚和乙酸乙酯组成。使用分步梯度以从柱中选择性洗脱各脂类。流动相梯度始于100％石油醚且止于50％乙酸乙酯(接着是100％甲醇洗)。用吉尔森FC 204大床馏分收集器(吉尔森有限公司，威斯康星州米德顿)在10mL试管中收集馏分。通过薄层层析(TLC)分析各管，收集含各脂类的管(由具预期保留因子(Rf)的TLC板上的单一点判断)，浓缩至干并称重。然后，通过重量法测定总馏分含量。

TLC分析-在硅胶板上进行薄层层析。板用由石油醚:乙醚:乙酸(80:20:1)组成的溶剂体系洗脱并用碘蒸气显色。然后，将各点的Rf值与文献报道的各脂类值作比较。

脂肪酸分析-分析最终油样品和分离脂类中作为FAME的脂肪酸组成。样品直接称重到螺口试管中，将1mL溶于甲苯的C19:0内标(NuCheck,明尼苏达州伊利森)和2mL溶于甲醇的1.5N HCl加入各管。短暂振荡管并置于100℃加热器内2小时。从加热器中取出管，冷却，加入1mL溶于水的饱和NaCl。再次振荡管，离心，将顶(有机)层组分置于GC小管并通过GC-FID分析。用3点内标校准曲线定量FAME，所述曲线用Nu-Chek-Prep GLC参考标准(Nu-Chek Prep公司，明尼苏达州伊利森)产生并基于保留时间初步鉴定。存在的脂肪酸表示为总FAME的mg/g和％。

通过将250mg最终油溶于600μL己烷并应用于柱顶部来制备样品。用快速层析分馏样品后，甾醇酯组分占所述最终油重量的1.2重量％，甘油三酯(TAG)组分占92.1重量％，游离脂肪酸(FFA)组分占2.1重量％，甾醇组分占1.1重量％，且甘油二酯(DAG)组分占2.8重量％。

收集组分的TLC分析显示FFA和甾醇组分分别与TAG和DAG混合。

最终油和分离组分的总脂肪酸分布分别示于下表11和12，以mg/g和％FAME计算。

表11:以mg/g FAME计算的脂肪酸分布

表12:作为总FAME百分数的脂肪酸分布

实施例6

用实施例4所述技术对实施例5所述最终油的甘油三酯(TAG)进行分析。初步鉴定各脂肪酸组分，如下表13和14所概括。

表13:初步鉴定主要TAG种类

表14:通过LC/APCI-MS初步鉴定TAG种类

实施例7

在有980ppm Cl^ˉ的碳和氮补料培养物(破囊壶菌培养基)中制备以ATCC登录号PTA-9695保藏的分离破囊壶菌的2日龄接种瓶。

根据以下过程进行突变：

将约50ml的无菌烧瓶(T＝2日龄)倒入40ml无菌玻璃匀浆器中。培养物在匀浆器中接受50次来回匀浆。吸出培养物并经50微米无菌滤网过滤，所述滤网置于50ml无菌管中(该筛网用作保留较大菌落团同时使较小团块和单一细胞通过50该微米筛网的方式)。全部浓缩的浸泡物收集于50ml无菌管中。振荡所浸泡培养物并以高至1:100倍的水平在含破囊壶菌培养基的管中稀释。振荡稀释的浸泡样品，然后将200μl接种物加入100 x 15mm的破囊壶菌培养基琼脂培养皿，所述培养皿含有4-5颗玻璃珠(3mm玻璃珠)。轻柔振荡各板以使珠沿着板均匀平铺接种物。从板中倒出珠且将板加盖静置约5分钟以干燥。关闭无菌操作橱和周边区域的灯，因为该过程在弱光下进行。所述过程仅在极少量的间接和微弱光下进行。

将5块重复板置于除去盖子的XL交联机(美国斯贝克公司(SpectronicsCorporation)，纽约)底部，同时辐射样品。所述交联机以微焦耳水平传递能量，以达到90％-95％杀死的水平。用相同操作接种未诱变细胞到5个重复对照板。这些细胞计数用于计算杀死％。一旦停止辐射，取出板，放回盖子，用石蜡膜包裹板，然后用铝箔包。板必须在第1周避光培养以使它们不能修复受损基因。

板置于22.5℃室内约10天，然后计数菌落。进行最终计数时，用无菌接种环挑出菌落并重划线培养于新鲜破囊壶菌培养基板。将各菌落接种在单独板上。随着板生长密集，用接种环取出样品，接种到含50ml破囊壶菌培养基的250ml无菌摇瓶中。将该瓶在22.5℃室内置于200rpm摇床上。第7天时收获摇瓶培养物到50ml无菌管内。测pH，离心样品以收集生物质团块。冲洗各样品并重悬于异丙醇和蒸馏水的50:50混合物中，然后再离心。冷冻干燥所收集的团块，称重，进行FAME分析。表15-21的数据代表用上面方法产生的突变体。

实施例8

从美国组织和培养物保藏所(American Tissue and Culture Collection,ATCC)获得4个破囊壶菌样品，分析各样品中生物质的脂肪酸分布、所提取粗制油的脂肪酸分布、粗制油的甘油三酯(TAG)组分、和粗制油的极性脂质(PL)组分。分析的样品是ATCC 34304、20890、20889和20892。将菌株接种到含50ml以下培养基的250ml摇瓶中：1g蛋白胨、1g酵母膏、5g葡萄糖，溶于1升人工海水。培养物在定轨摇床中以200rpm,20℃振荡孵育。7天后，通过离心(5087xg)收获培养物，用水:异丙醇(1:1)的混合物洗涤，再次离心。冷冻干燥所得团块。用Bligh和Dyer(Can.J.of Biol.And Phys.37:911-917(1959))的方法从干燥生物质中提取粗制油。用Kaluzny等(J.Lipid Res.26:135-140(1959))开发的固相提取(SPE)方法的变化形式从粗制油中分离TAG和PL。分析粗制油和分离组分的DHA和EPA含量以及总脂肪酸含量(用脂肪酸甲酯表示)。

脂类提取–从冷冻干燥的生物质中提取粗制油，这是通过称取100-200mg粗制油到1.5 x 10cm螺口试管中，加入8mL单相体系(由1:2:0.8氯仿:甲醇:水(CHCl₃:MeOH:H₂O)组成)，用装有PT-DA 3012/2聚集器的

PT 3100分散装置匀浆。样品以10000rpm浸在冰浴中匀化2分钟。通过加入2.1mL CHCl₃，振荡1分钟，加入1.7mL H₂O，再振荡1分钟，产生两相体系。用巴氏吸管取出底(有机)层并置于收集瓶。用2.1mL CHCl₃部分再提取留在试管中的MeOH-H₂O层2次。合并有机层并在氮气流下干燥。

固相提取–通过SPE从粗脂肪中分离TAG和PL组分，使用置于Vac Elut装置中的500mg氨丙基管(Burdick和Jackson)。所述氨丙基管用5mL己烷调节，将10-20mg各样品溶于400μL CHCl₃并施加于所述管。用4mL的2:1CHCl₃:异丙醇(IPA)洗柱以洗脱所有中性脂质，收集所述脂质并在氮气下干燥。然后，用5mL溶于醚的2％乙酸(HOAc)洗脱所述脂肪酸，弃去。用5mL MeOH洗脱所述PL组分，收集并在氮气下干燥。将所述中性脂质组分重溶于400μL己烷并施加于第二个氨丙基柱(之前用5mL己烷调节)。用5mL溶于己烷的1％乙酸乙酯(EtOAc)洗脱甾醇酯，弃去。最后，用5mL溶于己烷的3％EtOAc洗脱TAG，收集并在氮气下干燥。

TLC分析-在硅胶板上进行薄层层析。板用由石油醚:乙醚:乙酸(80:20:1)组成的溶剂体系洗脱并用碘蒸气显色。

脂肪酸分析-分析生物质样品、粗制油、分离的TAG和PL组分中作为FAME的脂肪酸组成。样品直接称重到螺口试管中，将1mL溶于甲苯的C19:0内标和2mL溶于甲醇的1.5N HCl加入各管。短暂振荡管并置于100℃加热器内2小时。从加热器中取出管，冷却，加入1mL溶于水的饱和NaCl。再次振荡管，离心，将顶(有机)层组分置于GC小管并通过GC-FID分析。用3点内标校准曲线定量FAME，所述曲线用Nu-Chek-Prep GLC参考标准产生并基于保留时间初步鉴定。存在的脂肪酸表示为总FAME的mg/g和％。

ATCC34304-估计ATCC 34304生物质中FAME总和形式的脂质含量为9.1％，溶剂提取后的粗制油量为9.2重量％，从而所述生物质中脂肪的回收率为101％。所述生物质的EPA和DHA含量分别测定为4.8mg/g和38.7mg/g。所提取的粗制油含有25.9mg/g EPA和238.7mg/g DHA。分离的TAG含有13.9mg/g EPA和303.9mg/g DHA，而分离的PL含有38.7mg/g EPA和237.980mg/g DHA。所述生物质、提取的粗制油、TAG组分和PL组分的总脂肪酸分布示于下表22和23，分别计算为mg/g和％FAME。

表22:以mg/g计算的ATCC 34304脂肪酸分布

表23:以总FAME百分比计算的ATCC 34304脂肪酸分布

ATCC 20890-估计ATCC 20890生物质中FAME总和形式的脂质含量为9.2％，溶剂提取后的粗制油量为10.2重量％，从而所述生物质中脂肪的回收率为111％。所述生物质的EPA和DHA含量分别测定为12.2mg/g和36.6mg/g。所提取的粗制油含有64.7mg/g EPA和194.2mg/g DHA。分离的TAG含有41.9mg/g EPA和230.2mg/g DHA，而分离的PL含有54.4mg/gEPA和149.5mg/g DHA。所述生物质、提取的粗制油、TAG组分和PL组分的总脂肪酸分布示于下表24和25，分别计算为mg/g和％FAME。

表24:以mg/g计算的ATCC 20890脂肪酸分布

表25:以总FAME百分比计算的ATCC 20890脂肪酸分布

ATCC 20889-估计所述生物质中FAME总和形式的脂质含量为3.3％，溶剂提取后的粗制油量为3.4重量％，从而所述生物质中脂肪的回收率为103％。所述生物质的EPA和DHA含量分别测定为2.3mg/g和16.5mg/g。所提取的粗制油含有26.8mg/g EPA和205.1mg/gDHA。分离的TAG含有7.3mg/g EPA和185.9mg/g DHA，而分离的PL含有35.2mg/g EPA和218.6mg/g DHA。所述生物质、提取的粗制油、TAG组分和PL组分的总脂肪酸分布示于下表26和27，分别计算为mg/g和％FAME。

表26:以mg/g计算的ATCC 20889脂肪酸分布

表27:以总FAME百分比计算的ATCC 20889脂肪酸分布

ATCC 20892-估计所述生物质中FAME总和形式的脂质含量为8.8％，溶剂提取后的粗制油量为12.1重量％，从而所述生物质中脂肪的回收率为138％。所述生物质的EPA和DHA含量分别测定为8.3mg/g和43.3mg/g。所提取的粗制油含有50.5mg/g EPA和260.1mg/gDHA。分离的TAG含有798.7mg/g EPA和407.7mg/g DHA，而分离的PL含有50.4mg/g EPA和243.12mg/g DHA。所述生物质、提取的粗制油、TAG组分和PL组分的总脂肪酸分布示于下表28和29，分别计算为mg/g和％FAME。

表28:以mg/g计算的ATCC 20892脂肪酸分布

表29:以总FAME百分比计算的ATCC 20892脂肪酸分布

本说明书中提到的所有发表物、专利和专利申请通过引用纳入本文，就好像将各篇单独的发表物、专利或专利申请具体地和单独地通过引用纳入本文一样。

Claims (14)

1.一种含有脂肪酸分布的分离的破囊壶菌生物质，其中在所述脂肪酸分布中，所述生物质的细胞干重的至少50重量%是脂肪酸，且其中所述脂肪酸的至少50重量%是二十二碳六烯酸。

2.一种含有脂肪酸分布的分离的破囊壶菌生物质，其中在所述脂肪酸分布中，所述生物质的细胞干重的至少25重量%是二十二碳六烯酸。

3.如权利要求1或2所述的分离破囊壶菌生物质，其中在所述脂肪酸分布中，所述脂肪酸的10重量%或更少是二十碳五烯酸，且其中二十二碳六烯酸与二十碳五烯酸的重量比为至少5:1。

4.如权利要求3所述的分离破囊壶菌生物质，其中在所述脂肪酸分布中，所述脂肪酸的1.5重量%或更少是花生四烯酸，且其中二十二碳六烯酸与花生四烯酸的重量比为至少20:1。

5.如权利要求4所述的分离破囊壶菌生物质，其中，所述生物质还含有重量比为至少10:1的二十二碳六烯酸与二十二碳五烯酸n-6。

6.如权利要求1所述的分离破囊壶菌生物质，其中所述脂肪酸的至少60重量%是ω-3脂肪酸。

7.如权利要求1所述的分离破囊壶菌生物质，其中所述脂肪酸的至少55重量%是二十二碳六烯酸。

8.如权利要求1所述的分离破囊壶菌生物质，其中所述生物质的细胞干重的至少30重量%是二十二碳六烯酸。

9.一种用于动物或人的食品、化妆品或药物组合物，其包括权利要求1或3所述的破囊壶菌生物质或其混合物。

10.如权利要求9所述的食品、化妆品或药物组合物，其中所述食品是用于动物或人食物的添加剂。

11.如权利要求9所述的食品、化妆品或药物组合物，其中所述食品是营养补充品。

12.如权利要求9所述的食品、化妆品或药物组合物，其中所述食品是动物饲料。

13.如权利要求12所述的食品、化妆品或药物组合物，其中所述动物饲料是水产养殖饲料。

14.如权利要求12所述的食品、化妆品或药物组合物，其中所述动物饲料是牲畜饲料、动物园动物饲料、役畜饲料、家畜饲料或其组合。