KR20240021906A - 발현 벡터, 박테리아 서열-무함유 벡터, 및 이를 제조하고 사용하는 방법 - Google Patents

발현 벡터, 박테리아 서열-무함유 벡터, 및 이를 제조하고 사용하는 방법 Download PDF

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KR20240021906A
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로데릭 슬라브체브
나피세 나피씨
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메디파지 바이오슈티컬스, 인크.
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Abstract

본 개시내용은 발현 벡터, 박테리아 서열-무함유 벡터, 예컨대 미니스트링 DNA (msDNA), 및 벡터 생산 시스템을 사용하는 것을 포함하는, 박테리아 서열-무함유 벡터를 제조하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한 벡터를 포함하는 조성물, 및 벡터 및 조성물의 용도를 제공한다.

Description

발현 벡터, 박테리아 서열-무함유 벡터, 및 이를 제조하고 사용하는 방법
서열 목록에 대한 참조
EFS-WEB을 통해 전자적으로 제출됨
전자적으로 제출된 서열 목록 (명칭: 4471_007PC03_Seqlisting_ST25.txt; 크기: 216,898 바이트; 및 생성 날짜: 2022년 6월 15일)의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
개시내용의 분야
본 개시내용은 발현 벡터, 박테리아 서열-무함유 벡터, 박테리아 서열-무함유 벡터를 제조하기 위한 벡터 생산 시스템, 및 이의 용도를 제공한다.
유전자 요법은 상당한 치료 가능성을 가지고 있지만, 그 잠재성을 실현하는 데는 여전히 과제가 남아있다.
대부분의 임상 시험은 바이러스 전달 시스템, 예컨대 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 및 아데노-연관 바이러스 벡터를 활용해 왔다. 진전이 이루어졌지만, 바이러스 시스템은 형질도입 및 트랜스진 발현 효율이 다양하며, 바람직하지 않은 효과, 예컨대 염증 및 면역 반응 또는 삽입 돌연변이유발에 대한 우려가 여전히 남아있다. 더욱이, 바이러스 벡터의 생산, 정제 및 저장은 종종 비용이 많이 들고 가변성이 높으며 비효율적이다. 예를 들어, 문헌 [Lingelbach, D., Drug Development & Delivery 20(5): 50-54 (2020)]; [Wright, J.F., Gene Therapy 15:840-848 (2008)]을 참조한다.
비바이러스 벡터가 또한 유전자 요법 전달 시스템으로서 조사되어 왔다. 바이러스 대응물보다 안전하지만, 비바이러스 벡터의 유효성은 예를 들어 낮은 트랜스진 발현 수준 및 발현 내구성에 의해 제한될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Kay, M., Nature Reviews Genetics 12: 316-328 (2011)]을 참조한다.
본원에 기재된 것과 같은 개선된 벡터가 필요하다.
간단한 요약
본 개시내용은 하기를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다: (a) 백본 서열, (b) 하기를 포함하는 서열: (i) 관심 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트, (ii) 발현 카세트의 5' 측면을 플랭킹하는 제1 레콤비나제에 대한 제1 표적 서열, (iii) 발현 카세트의 3' 측면을 플랭킹하는 제1 레콤비나제에 대한 제2 표적 서열, 및 (iv) 제1 레콤비나제에 대한 비-결합 영역 내 제1 및 제2 표적 서열 내에 통합된 하나 이상의 추가 레콤비나제에 대한 하나 이상의 추가 표적 서열, 및 (c) 하기 중 하나 이상: (i) 제1 레콤비나제 및 하나 이상의 추가 레콤비나제에 대한 비-결합 영역 내 제1 레콤비나제에 대한 제1 및/또는 제2 표적 서열 내에 통합된 엔도뉴클레아제 표적 서열, 여기서 엔도뉴클레아제 표적 서열은 백본 서열과 제1 레콤비나제 및 하나 이상의 추가 레콤비나제에 대한 절단 부위 사이에 있음, (ii) 제1 레콤비나제에 대한 제1 표적 서열의 3' 말단과 발현 카세트 내 또 다른 인핸서 또는 프로모터의 5' 말단 사이에 통합된 서열식별번호: 12와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 합성 인핸서, (iii) 제1 레콤비나제에 대한 제1 표적 서열의 3' 말단과 발현 카세트 내 프로모터의 5' 말단 사이에 통합된 사이토메갈로바이러스 (CMV) 인핸서, (iv) 인트론을 포함하는 5' 비번역 영역 (5'UTR), 여기서 5'UTR은 프로모터와 관심 핵산 서열 사이에서 발현 카세트에 통합됨, (v) 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된 척추동물 염색질 인슐레이터, (vi) 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소 (WPRE), (vii) 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된 스캐폴드/매트릭스 부착 영역 (S/MAR), 또는 (viii) 제1 레콤비나제 및 하나 이상의 추가 레콤비나제에 대한 비-결합 영역 내 제1 레콤비나제에 대한 제1 및/또는 제2 표적 서열 내에 통합된 DNA 핵 표적화 서열 (DTS), 여기서 DTS는 발현 카세트와 제1 레콤비나제 및 하나 이상의 추가 레콤비나제에 대한 절단 부위 사이에 있음.
일부 측면에서, 발현 벡터는 제1 레콤비나제 및 하나 이상의 추가 레콤비나제에 대한 비-결합 영역 내 제1 레콤비나제에 대한 제1 및/또는 제2 표적 서열 내에 통합된 엔도뉴클레아제 표적 서열을 포함하고, 여기서 엔도뉴클레아제 표적 서열은 백본 서열과 제1 레콤비나제 및 하나 이상의 추가 레콤비나제에 대한 절단 부위 사이에 있다. 일부 측면에서, 엔도뉴클레아제 표적 서열은 제1 레콤비나제에 대한 제1 및 제2 표적 서열 내에 통합된다. 일부 측면에서, 엔도뉴클레아제 표적 서열은 귀소 엔도뉴클레아제에 대한 것이다. 일부 측면에서, 엔도뉴클레아제 표적 서열은 I-AniI, I-CeuI, I-ChuI, I-CpaI, I-CpaII, I-CreI, I-DmoI, H-DreI, I-HmuI, I-HmuII, I-LlaI, I-MsoI, PI-PfuI, PI-PkoII, I-PorI, I-PpoI, PI-PspI, I-ScaI, I-SceI, PI-SceI, I-SceII, I-SecIII, I-SceIV, I-SceV, I-SceVI, I-SceVII, I-Ssp6803I, I-TevI, I-TevII, I-TevIII, PI-TliI, PI-TliII, I-Tsp061I 또는 I-Vdi141I에 대한 것이다. 일부 측면에서, 엔도뉴클레아제 표적 서열은 I-SceI에 대한 것이다. 일부 측면에서, 엔도뉴클레아제 표적 서열은 PI-SceI에 대한 것이다. 일부 측면에서, 엔도뉴클레아제 표적 서열은 Cas 엔도뉴클레아제에 대한 것이다. 일부 측면에서, Cas 엔도뉴클레아제는 Cas9이다.
일부 측면에서, 발현 벡터는 제1 레콤비나제에 대한 제1 표적 서열의 3' 말단과 발현 카세트 내 또 다른 인핸서 또는 프로모터의 5' 말단 사이에 통합된 서열식별번호: 12와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 합성 인핸서를 포함한다. 일부 측면에서, 합성 인핸서는 서열식별번호: 12와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열의 다중 인접 카피를 포함한다. 일부 측면에서, 합성 인핸서는 서열식별번호: 46과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 합성 인핸서는 닭 β-액틴 프로모터의 5' 말단에 통합된다. 일부 측면에서, 서열식별번호: 47과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 키메라 인트론은 닭 β-액틴 프로모터의 3' 말단 및 관심 핵산 서열의 5'에 통합된다.
일부 측면에서, 발현 벡터는 제1 레콤비나제에 대한 제1 표적 서열의 3' 말단과 발현 카세트 내 프로모터의 5' 말단 사이에 통합된 CMV 인핸서를 포함한다. 일부 측면에서, CMV 인핸서는 서열식별번호: 12 또는 서열식별번호: 46과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 합성 인핸서의 3' 말단에 통합된다. 일부 측면에서, CMV 프로모터는 CMV 인핸서의 3' 말단 및 관심 핵산 서열의 5'에 통합된다.
일부 측면에서, 발현 벡터는 제1 레콤비나제에 대한 제1 표적 서열과 관심 핵산 서열 사이에 통합된 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 38 또는 서열식별번호: 39와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 발현 벡터는 인트론을 포함하는 5'UTR을 포함하고, 여기서 5'UTR은 프로모터와 관심 핵산 서열 사이에서 발현 카세트에 통합된다. 일부 측면에서, 인트론은 서열식별번호: 1과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 5'UTR은 인트론 내에 통합된 비-코딩 서열을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 5'UTR은 서열식별번호: 1의 위치 25 내지 55로부터의 임의의 2개의 뉴클레오티드에 상응하는 인트론 내 2개의 뉴클레오티드 사이에 통합된 비-코딩 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 비-코딩 서열은 S/MAR이다. 일부 측면에서, S/MAR은 MAR-5이다. 일부 측면에서, 5'UTR은 서열식별번호: 3과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 5'UTR은 서열식별번호: 5와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 프로모터는 닭 β-액틴 프로모터이다. 일부 측면에서, 프로모터는 CMV 프로모터이다. 일부 측면에서, 프로모터는 CMV 인핸서의 3' 말단에 통합된다. 일부 측면에서, CMV 인핸서는 서열식별번호: 12 또는 서열식별번호: 46과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 합성 인핸서의 3' 말단에 통합된다.
일부 측면에서, 발현 벡터는 관심 핵산 서열의 3' 말단에 통합된 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 일부 측면에서, 폴리아데닐화 신호는 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14 또는 서열식별번호: 15와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 발현 벡터는 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된 척추동물 염색질 인슐레이터를 포함한다. 일부 측면에서, 척추동물 염색질 인슐레이터는 5'-HS4 닭-β-글로빈 인슐레이터 (cHS4)이다. 일부 측면에서, 폴리아데닐화 신호는 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14 또는 서열식별번호: 15와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 발현 벡터는 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된 WPRE를 포함한다. 일부 측면에서, 폴리아데닐화 신호는 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14 또는 서열식별번호: 15와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 발현 벡터는 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된 S/MAR을 포함한다. 일부 측면에서, S/MAR은 MAR-5이다. 일부 측면에서, 폴리아데닐화 신호는 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14 또는 서열식별번호: 15와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 발현 벡터는 제1 레콤비나제에 대한 제1 및 제2 표적 서열의 각 측면을 플랭킹하는 인핸서 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 발현 벡터는 제1 레콤비나제에 대한 제1 및 제2 표적 서열의 각 측면을 플랭킹하는 적어도 2개의 인핸서 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 인핸서 서열은 SV40 인핸서 서열이다.
일부 측면에서, 발현 벡터는 제1 레콤비나제 및 하나 이상의 추가 레콤비나제에 대한 비-결합 영역 내 제1 레콤비나제에 대한 제1 및/또는 제2 표적 서열 내에 통합된 DTS를 포함하고, 여기서 DTS는 발현 카세트와 제1 레콤비나제 및 하나 이상의 추가 레콤비나제에 대한 절단 부위 사이에 있다. 일부 측면에서, DTS는 SV40 인핸서 서열이다. 일부 측면에서, DTS는 세포-특이적이다.
일부 측면에서, 제1 및 제2 표적 서열 및 하나 이상의 추가 표적 서열은 PY54 pal 부위, N15 telRL 부위, loxP 부위, φK02 telRL 부위, FRT 부위, phiC31 attP 부위 및 λ attP 부위로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 측면에서, 발현 벡터는 각각의 표적 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 발현 벡터는 pal 부위 및 pal 부위 내에 통합된 telRL, loxP 및 FRT 레콤비나제 표적 결합 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 제1 레콤비나제에 대한 제1 및 제2 표적 서열은 각각 서열식별번호: 33의 핵산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 발현 벡터는 박테리아 서열-무함유 벡터를 생산하기 위한 것이다. 일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 원형 공유 폐쇄형 벡터이다. 일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 선형 공유 폐쇄형 벡터이다.
본 개시내용은 유도성 프로모터의 제어 하에 레콤비나제를 코딩하는 재조합 세포를 포함하는 벡터 생산 시스템에 관한 것이며, 여기서 재조합 세포는 임의의 상기 발현 벡터를 포함하고, 여기서 레콤비나제는 제1 레콤비나제에 대한 제1 및 제2 표적 서열 또는 발현 벡터 내 하나 이상의 추가 레콤비나제에 대한 하나 이상의 추가 표적 서열 중 하나를 표적화한다. 일부 측면에서, 레콤비나제는 TelN, Tel, Cre 또는 Flp이다.
일부 측면에서, 재조합 세포는 유도성 프로모터의 제어 하에 엔도뉴클레아제를 추가로 코딩하고, 여기서 엔도뉴클레아제는 엔도뉴클레아제 표적 서열을 포함하는 발현 벡터 내 엔도뉴클레아제 표적 서열을 표적화한다. 일부 측면에서, 엔도뉴클레아제는 귀소 엔도뉴클레아제이다. 일부 측면에서, 귀소 엔도뉴클레아제는 I-AniI, I-CeuI, I-ChuI, I-CpaI, I-CpaII, I-CreI, I-DmoI, H-DreI, I-HmuI, I-HmuII, I-LlaI, I-MsoI, PI-PfuI, PI-PkoII, I-PorI, I-PpoI, PI-PspI, I-ScaI, I-SceI, PI-SceI, I-SceII, I-SecIII, I-SceIV, I-SceV, I-SceVI, I-SceVII, I-Ssp6803I, I-TevI, I-TevII, I-TevIII, PI-TliI, PI-TliII, I-Tsp061I 또는 I-Vdi141I이다. 일부 측면에서, 엔도뉴클레아제는 I-SceI이다. 일부 측면에서, 엔도뉴클레아제는 PI-SceI이다. 일부 측면에서, 재조합 세포는 엔도뉴클레아제를 포함하는 뉴클레아제 게놈 편집 시스템을 코딩한다. 일부 측면에서, 뉴클레아제 게놈 편집 시스템은 가이드 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제를 포함하는 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문구조 반복부 (CRISPR) 뉴클레아제 시스템이다. 일부 측면에서, Cas 엔도뉴클레아제는 Cas9이다. 일부 측면에서, 유도성 프로모터는 열-조절성, 화학적-조절성, IPTG 조절성, 글루코스-조절성, 아라비노스 유도성, T7 폴리머라제 조절성, 저온-충격 유도성, pH 유도성, 또는 이들의 조합이다.
본 개시내용은 레콤비나제의 발현에 적합한 조건 하에 임의의 상기 벡터 생산 시스템을 인큐베이션하는 것을 포함하는, 박테리아 서열-무함유 벡터를 생산하는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 방법은 엔도뉴클레아제의 발현에 적합한 조건 하에 엔도뉴클레아제를 코딩하는 임의의 상기 벡터 생산 시스템을 인큐베이션하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 방법은 뉴클레아제 게놈 편집 시스템의 발현에 적합한 조건 하에 뉴클레아제 게놈 편집 시스템을 코딩하는 임의의 상기 벡터 생산 시스템을 인큐베이션하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 방법은 박테리아 서열-무함유 벡터를 수확하는 것을 추가로 포함한다.
본 개시내용은 박테리아 서열-무함유 벡터를 생산하는 임의의 상기 방법에 의해 생산된 박테리아 서열-무함유 벡터에 관한 것이다.
본 개시내용은 하기를 포함하는 박테리아 서열-무함유 벡터에 관한 것이다: (a) 관심 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트, 및 (b) 하기 중 하나 이상: (i) 발현 카세트 내 또 다른 인핸서 또는 프로모터에 대해 5'에 위치된 서열식별번호: 12와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 합성 인핸서, (ii) 발현 카세트 내 프로모터에 대해 5'에 위치된 CMV 인핸서, (iii) 인트론을 포함하는 5'UTR, 여기서 5'UTR은 프로모터와 관심 핵산 서열 사이에서 발현 카세트에 통합됨, (iv) 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된 척추동물 염색질 인슐레이터, (v) 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된 WPRE, (vi) 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된 S/MAR, 또는 (vii) 발현 카세트에 대해 5'에 위치된 DTS.
일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 발현 카세트 내 또 다른 인핸서 또는 프로모터에 대해 5'에 위치된 서열식별번호: 12와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 합성 인핸서를 포함한다. 일부 측면에서, 합성 인핸서는 서열식별번호: 12와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열의 다중 인접 카피를 포함한다. 일부 측면에서, 합성 인핸서는 서열식별번호: 46과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 합성 인핸서는 닭 β-액틴 프로모터의 5' 말단에 통합된다. 일부 측면에서, 서열식별번호: 47과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 키메라 인트론은 닭 β-액틴 프로모터의 3' 말단 및 관심 핵산 서열의 5'에 통합된다.
일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 발현 카세트 내 프로모터에 대해 5'에 위치된 CMV 인핸서를 포함한다. 일부 측면에서, CMV 인핸서는 서열식별번호: 12 또는 서열식별번호: 46과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 합성 인핸서의 3' 말단에 통합된다. 일부 측면에서, CMV 프로모터는 CMV 인핸서의 3' 말단 및 관심 핵산 서열의 5'에 통합된다.
일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 관심 핵산 서열에 대해 5'에 위치된 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 38 또는 서열식별번호: 39와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 인트론을 포함하는 5'UTR을 포함하고, 여기서 5'UTR은 프로모터와 관심 핵산 서열 사이에서 발현 카세트에 통합된다. 일부 측면에서, 인트론은 서열식별번호: 1과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 5'UTR은 인트론 내에 통합된 비-코딩 서열을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 5'UTR은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 위치 25 및 55로부터의 임의의 2개의 뉴클레오티드에 상응하는 인트론 내 2개의 뉴클레오티드 사이에 통합된 비-코딩 서열을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 비-코딩 서열은 S/MAR이다. 일부 측면에서, S/MAR은 MAR-5이다. 일부 측면에서, 5'UTR은 서열식별번호: 3과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 5'UTR은 서열식별번호: 5와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 프로모터는 닭 β-액틴 프로모터이다. 일부 측면에서, 프로모터는 CMV 프로모터이다. 일부 측면에서, 프로모터는 CMV 인핸서의 3' 말단에 통합된다. 일부 측면에서, CMV 인핸서는 서열식별번호: 12 또는 서열식별번호: 46과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 합성 인핸서의 3' 말단에 통합된다.
일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 관심 핵산 서열의 3' 말단에 통합된 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 일부 측면에서, 폴리아데닐화 신호는 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14 또는 서열식별번호: 15와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된 척추동물 염색질 인슐레이터를 포함한다. 일부 측면에서, 척추동물 염색질 인슐레이터는 cHS4이다. 일부 측면에서, 폴리아데닐화 신호는 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14 또는 서열식별번호: 15와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된 WPRE를 포함한다. 일부 측면에서, 폴리아데닐화 신호는 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14 또는 서열식별번호: 15와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된 S/MAR을 포함한다. 일부 측면에서, S/MAR은 MAR-5이다.
일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 발현 카세트의 각 측면을 플랭킹하는 인핸서 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 발현 카세트의 각 측면을 플랭킹하는 적어도 2개의 인핸서 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 인핸서 서열은 SV40 인핸서 서열이다.
일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 발현 카세트에 대해 5'에 위치된 DTS를 포함한다. 일부 측면에서, DTS는 SV40 인핸서 서열이다. 일부 측면에서, DTS는 세포-특이적이다.
일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 원형 공유 폐쇄형 벡터이다.
일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 선형 공유 폐쇄형 벡터이다.
본 개시내용은 임의의 상기 발현 벡터 또는 임의의 상기 박테리아 서열-무함유 벡터를 포함하는 재조합 세포에 관한 것이다.
본 개시내용은 임의의 상기 발현 벡터 또는 임의의 상기 박테리아 서열-무함유 벡터를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 측면에서, 조성물은 전달제를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 전달제는 나노입자이다. 일부 측면에서, 전달제는 표적화 리간드를 포함한다. 일부 측면에서, 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 제약 조성물이다.
본 개시내용은 임의의 상기 발현 벡터, 임의의 상기 박테리아 서열-무함유 벡터, 또는 상기 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 개시내용은 서열식별번호: 1과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 개시내용은 서열식별번호: 2와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 개시내용은 서열식별번호: 3과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 개시내용은 서열식별번호: 5와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 개시내용은 서열식별번호: 12와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 개시내용은 서열식별번호: 46과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 개시내용은 서열식별번호: 13과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 개시내용은 서열식별번호: 14와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 개시내용은 서열식별번호: 15와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
일부 측면에서, 서열식별번호: 13-15 중 어느 하나와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 임의의 상기 폴리뉴클레오티드는 핵산 서열의 3' 말단에 100 내지 120개의 아데닌 뉴클레오티드를 추가로 포함한다.
본 개시내용은 서열식별번호: 16과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 개시내용은 서열식별번호: 17과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 개시내용은 서열식별번호: 18과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 개시내용은 서열식별번호: 35와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 개시내용은 서열식별번호: 36과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 개시내용은 서열식별번호: 37과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 개시내용은 서열식별번호: 38과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 개시내용은 서열식별번호: 39와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 개시내용은 임의의 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
본 개시내용은 서열식별번호: 2, 3 또는 5 중 어느 하나와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 (i) 서열식별번호: 13-18 중 어느 하나와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 (ii) 서열식별번호: 13-15 중 어느 하나와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 핵산 서열의 3' 말단에 100 내지 120개의 아데닌 뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
본 개시내용은 임의의 상기 발현 벡터, 임의의 박테리아 서열-무함유 벡터, 또는 임의의 상기 제약 조성물로부터의 관심 핵산 서열을 유전자 편집을 위한 표적 부위에 삽입하는 것을 포함하는 유전자 편집 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 유전자 편집은 비-상동성 말단 연결에 의해 이루어진다. 일부 측면에서, 유전자 편집은 상동성-지정 복구에 의해 이루어진다.
도 1은 발현 벡터 pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*의 벡터 맵을 보여준다.
도 2는 발현 벡터 pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA의 벡터 맵을 보여준다.
도 3은 라이브 이미지화를 통해 HEK-293 세포 내 형광을 평가하는 현미경사진을 보여준다. (A)는 플라스미드 없이 리포펙타민에 노출된 음성 대조군 세포를 보여주고, (B)는 도 1의 발현 벡터로 형질감염된 세포를 보여주고, (C)는 도 2의 발현 벡터로 형질감염된 세포를 보여주고, (D)는 CAG 프로모터의 제어 하에 eGFP를 발현하는 부모 발현 벡터 pGL2-SS*-CAG-eGFP-BGpA-SS* (PP-CAG-GFP)로 형질감염된 양성 대조군 세포를 보여준다.
도 4는 도 3(A)-(D)에 따라 절개된 세포의 상대적 형광 강도의 막대 그래프를 보여준다. 도 4-5에서 "pGL2-SecNLuc-eGFP"는 도 1의 pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS* 발현 벡터로 형질감염된 세포를 나타낸다. 도 4-5에서 "pcDNA-SecNLuc-eGFP"는 도 2의 pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA 발현 벡터로 형질감염된 세포를 나타낸다.
도 5는 도 3(A)-(C)에 따라 형질감염된 세포의 배지 내 상대적 루시퍼라제 강도의 막대 그래프를 보여준다.
도 6은 발현 벡터 pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*의 벡터 맵을 보여준다.
도 7은 발현 벡터 pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*의 벡터 맵을 보여준다.
도 8은 발현 벡터 pGL2-SS*-CMV-UTR2-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*의 벡터 맵을 보여준다.
도 9는 포유동물 발현 카세트가 결여된 puc57 플라스미드로 세포를 전기천공한 음성 대조군 (Neg. Ctl. (플라스미드 없음))과 비교하여 도 1 (pGL2-SecNLuc-eGFP), 도 6 (WPRE), 도 7 (5'UTR1+WPRE) 및 도 8 (5'UTR2+WPRE)의 발현 벡터로 세포를 전기천공한 후 2, 6, 10, 14, 17, 20, 27 및 34일차에 HEK-293 세포의 배지에서 상대적 루미노미터 단위 (상대적 빛 단위, RLU라고도 함)의 발광에 의해 표시된 바와 같은 장기간 루시퍼라제 활성의 선 그래프를 보여준다. * = p<0.05, ** = p<0.01, *** = p<0.001, 및 **** = p<0.0001.
도 10은 계대 번호 1, 2, 3 및 5에서 도 9에 기재된 바와 같이 형질감염된 및 음성 대조군 HEK-293 세포의 배지에서 RLU의 발광에 의해 표시된 바와 같은 루시퍼라제 활성의 막대 그래프를 보여준다.
도 11은 도 7의 발현 벡터 (2nd gen pDNA (CMV+U1+W)), 도 7의 발현 벡터로부터 생산된 msDNA (2nd gen msDNA (CMV+U1+W)), 또는 루시퍼라제 트랜스진 (통상적인 pcDNA)을 함유하는 도 2의 발현 벡터로 세포를 전기천공한 후 각각 8, 15, 24, 31, 38, 45 및 52일차에 상응하는 계대 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7에서 HEK-293 세포 내 상대적 루시퍼라제 강도의 선 그래프를 보여준다. 통상적인 pcDNA 데이터세트와 비교하여 ** = p<0.01, *** = p<0.001, 및 **** = p<0.0001.
도 12는 도 9에 기재된 바와 같이 도 1 또는 도 7의 발현 벡터로 형질감염된 세포 내 형광을 보여준다. (A)는 계대 번호 1, 2, 3 및 5에서 라이브 이미지화를 통해 HEK-293 세포 내 형광을 평가하는 현미경사진을 보여준다. (B)는 각 계대 번호에서 3개의 라이브 형광 이미지로부터 관측 시야에서 관찰된 eGFP 양성 (GFP+) 세포의 선 그래프를 보여준다; 유의하지 않음 (ns) = p>0.05. (C)는 계대 번호 5에서 3개의 라이브 형광 이미지로부터 측정된 GFP+ 세포에 대한 평균 형광 강도 (MFI)를 도시하는 도트 플롯을 보여준다. 각 구축물에 대한 기본 막대 그래프는 모든 측정된 GFP+ 세포로부터의 평균 MFI 값을 보여준다. **** = p<0.0001.
도 13은 50 μg의 pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA (양성 대조군, PSNLuc), pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS* (pCAGLuc), 또는 pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS* (pGSNLuc-WPRE)의 단일 유체역학적 꼬리 정맥 주사 후 1, 3, 7, 10, 15, 22, 28, 42 및 56일차에 야생형 마우스로부터 수집된 혈장 내 RLU/mg 단백질의 선 그래프를 보여준다.
도 14는 50 μg의 pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA (양성 대조군, PSNLuc), pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS* (pCAGLuc), 또는 pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS* (pCAGLucWPRE)의 단일 유체역학적 꼬리 정맥 주사 후 1, 3, 7, 10, 15, 22, 28, 42 및 56일차에 야생형 마우스로부터 수집된 혈장 내 RLU/mg 단백질의 선 그래프를 보여준다.
도 15는 5 μg의 pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA (양성 대조군, pDNA CMV-U (SSeq 없음)), pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS* (SSeq pDNA CAG), 또는 pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS* (SSeq pDNA CAG-W)의 단일 유체역학적 꼬리 정맥 주사 후 1, 3, 7, 10, 15, 22, 28, 42 및 56일차에 야생형 마우스로부터 수집된 혈장 내 RLU/mg 단백질의 선 그래프를 보여준다.
도 16은 5 μg의 pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA (양성 대조군, No-SSeq pDNA CMV-U), pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS* (2XSSeq pDNA CAG-W), 또는 msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA (2XSSeq msDNA CAG-W)의 단일 유체역학적 꼬리 정맥 주사 후 1, 3, 7, 10, 15, 22, 28, 42 및 56일차에 야생형 마우스로부터 수집된 혈장 내 RLU/mg 단백질의 선 그래프를 보여준다.
도 17A-D는 벡터 주사 없는 음성 대조군 마우스 뿐만 아니라 도 16에 기재된 벡터 5 μg의 단일 유체역학적 꼬리 정맥 주사 후 56일차에 야생형 마우스로부터의 간에서 ELISA에 의해 결정된 바와 같은 GFP 발현의 막대 그래프를 보여준다. (A)는 GFP 농도 (μg/mL)를 보여준다. (B)는 총 단백질 μg로 정규화된 GFP μg을 보여준다. (C)는 총 조직 g으로 정규화된 GFP μg을 보여준다. (D)는 대조군에 비해 GFP의 발현 수준을 보여준다. *P<0.05, ** P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 18은 벡터 주사 없는 음성 대조군 마우스 뿐만 아니라 도 16에 기재된 바와 같은 벡터 5 μg의 단일 유체역학적 꼬리 정맥 주사 후 56일차에 야생형 마우스로부터의 간에서 세포질성 GFP 단백질 농도 (pg/mL)의 막대 그래프를 보여준다.
도 19는 각 주사에 대해 왼쪽에서 오른쪽으로 막대 그래프에 의해 표시된 바와 같이 1, 3, 10, 30, 58, 92, 119 및 174일차에 지질 나노입자 (LNP) 담체 (비히클(대조군)) 또는 LNP 및 msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA (LNP-2G msDNA-CAG-SecretedNanoLuc), pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS* (LNP-2G ppDNA-CAG-SecretedNanoLuc), msDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA (LNP-2G msDNA-CMV-SecretedNanoLuc), pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS* (LNP-2G ppDNA-CMV-SecretedNanoLuc), 또는 pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA (LNP-Conv.pDNA-CMV-SecretedNanoLuc)의 리포플렉스를 사용하여 마우스에서 단일 정맥내 꼬리 정맥 주사 후 생체내 전신 생물발광 이미지화로부터 총 플럭스 (광자/초)의 막대 그래프를 보여준다. LNP-2G msDNA-CAG-SecretedNanoLuc 주사에 대한 막대 그래프는 해시선으로 묶여 있다.
도 20은 msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA를 주사받은 마우스로부터의 피질, 시상, 뇌간 및 소뇌로부터의 시상면 뇌 섹션에서 녹색 형광 단백질 (GFP) 발현의 현미경사진을 보여준다. 백색 화살표는 트랜스진 발현을 나타낸다. 핵은 디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)을 사용한 염색에 의해 표시된다.
도 21-22는 msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA를 주사받은 마우스로부터의 피질 및 시상 (도 21) 및 소뇌 및 뇌간 (도 22)으로부터의 시상면 뇌 섹션 내 GFP 발현의 현미경사진을 보여준다. 뉴런은 뉴런 마커 NeuN으로 표시된다.
도 23-24는 msDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA를 주사받은 마우스로부터의 피질 및 시상 (도 23) 및 소뇌 및 뇌간 (도 24)으로부터의 시상면 뇌 섹션 내 GFP 발현의 현미경사진을 보여준다. 뉴런은 뉴런 마커 NeuN으로 표시된다.
도 25-26은 지질 나노입자 담체 (LNP) 및 pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA (양성 대조군, LNP-Conv.pDNA-CMV-SecretedNLuc), pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS* (LNP-ppDNA-CMV-SecretedNLuc), msDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA (LNP-msDNA-CMV-SecretedNLuc), pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS* (LNP-ppDNA-CAG-SecretedNLuc), 또는 msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA (LNP-msDNA-CAG-SecretedNLuc)의 리포플렉스를 사용한 형질감염 후 3 및 5일에 인간 T 세포 (Pan-T(TA+) 세포, 도 25) 또는 간세포 (Huh7 세포, 도 26), PBS 대조군 또는 미처리 세포 내 루시퍼라제 발현과 연관된 발광의 막대 그래프를 보여준다.
도 27A-C, 도 28A-C 및 도 29A-B는 CRISPR 유전자 편집 시스템 및 통상적인 플라스미드 또는 5' 및 3' 상동성 아암에 의해 플랭킹된 GOI (HDR-GOI-HDR)를 운반하는 msDNA의 형질감염 후 3일 (도 27A-C), 7일 (도 28A-C) 및 15일 (도 29A-B)에 관심 유전자 (GOI)에 대한 녹인 (KI) 효율 (Q3)의 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 산점도를 보여준다. 도 27 및 28의 (A)는 GOI의 임의의 HDR KI가 없는 대조군, 야생형 (WT) 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)에 대한 FACS 산점도를 보여준다. 도 27-28의 (A) 및 도 29의 (B)는 통상적인 플라스미드 (플라스미드 DNA HDR-GOI-HDR)를 사용하여 GOI의 HDR KI에 따른 iPSC의 FACS 산점도를 보여준다. 도 27-28의 (C) 및 도 29의 (B)는 msDNA (msDNA HDR-GOI-HDR)를 사용하여 GOI의 HDR KI에 따른 iPSC의 FACS 산점도를 보여준다.
도 30은 발현 벡터 SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*의 벡터 맵을 보여준다.
도 31은 발현 벡터 SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*의 벡터 맵을 보여준다.
도 32는 발현 벡터 SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*의 벡터 맵을 보여준다.
도 33은 발현 벡터 SS*-UCOE-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*의 벡터 맵을 보여준다.
도 34는 발현 벡터 SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-huMAR-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*의 벡터 맵을 보여준다.
도 35는 발현 벡터 SS*-UCOE-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-huMAR-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*의 벡터 맵을 보여준다.
도 36은 발현 벡터 SS*-UCOE-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*의 벡터 맵을 보여준다.
도 37은 발현 벡터 SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-huMAR-WPRE-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*의 벡터 맵을 보여준다.
도 38은 발현 벡터 SS*-UCOE-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-huMAR-WPRE-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*의 벡터 맵을 보여준다.
도 39는 도 2 (통상적인 pDNA CMV-U), 도 30 (A: CMV-U1-3'UTR), 도 31 (B: E1-CMV-U1-3'UTR) 및 도 32 (C: E1-CMV-U1-WPRE-3'UTR)의 발현 벡터로 세포를 전기천공한 후 2, 3, 7, 10, 14, 21 및 28일차에 HEK-293 세포의 배지에서 RLU의 발광에 의해 표시된 바와 같은 루시퍼라제 활성의 선 그래프를 보여준다. * = p<0.05 및 ** = p<0.01.
도 40은 도 39에 기재된 발현 벡터로 0일차에 세포를 전기천공한 후 7일마다 계대 후 계대 번호 1, 2, 3, 4 및 5에서 HEK-293 세포 내 상대적 루시퍼라제 강도의 선 그래프를 보여준다. * = p<0.05 및 ** = p<0.01.
도 41은 발현 벡터 pGL2-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-b글로빈 폴리A의 벡터 맵을 보여준다.
도 42는 발현 벡터 4-1 pGL2-SS*-CAG [CMV 인핸서+CBA 프로모터+인트론]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR(108 - 120 폴리A)-SS*의 벡터 맵을 보여준다.
도 43은 발현 벡터 4-2 pGL2-SS*-CAG [E1 X3+CBA 프로모터+인트론]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR(108 - 120 폴리A)-SS*의 벡터 맵을 보여준다.
도 44는 발현 벡터 4-3 pGL2-SS*-CAG [E2(U100)+CBA 프로모터+인트론]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR(108 - 120 폴리A)-SS*의 벡터 맵을 보여준다.
도 45는 발현 벡터 4-4 pGL2-SS*-CAG [E1 X3+CBA 프로모터+UTR1]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR(108 - 120 폴리A)-SS*의 벡터 맵을 보여준다.
도 46은 발현 벡터 4-5-pGL2-SS*-CAG [E2 (U100)+CBA 프로모터+UTR1]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR (108 - 120 폴리A)-SS*의 벡터 맵을 보여준다.
도 47은 발현 벡터 4-6-pGL2-SS*-CMV 인핸서-EF1-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR(108 - 120 폴리A)-SS*의 벡터 맵을 보여준다.
도 48은 도 41 (통상적인 SSeq pDNA CAG-W 없음) 및 도 42-47 (각각 4-1 내지 4-6)에 표시된 발현 벡터로 형질감염시킨 후 3 및 6일에 HEK-293 세포의 배지에서 RLU의 발광에 의해 표시된 바와 같은 루시퍼라제 활성의 막대 그래프를 보여준다.
도 49는 플랭킹 슈퍼 서열 (SSeq), 합성 인핸서 (E1), CMV 프로모터 (PCMV), tRNA-gRNA-PAM 삽입을 갖는 최적화된 내부 인트론을 함유하는 합성 5'UTR (UTR-tRNA-gRNA-PAM-1), Casβ2 유전자, 및 인간 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호 및 gRNA-PAM 삽입을 함유하는 3'UTR (HBg3'UTR-gRNA-PAM)을 함유하는 자기-제한 CRISPR 유전자 편집 시스템에 대한 예시적인 서열의 다이어그램을 보여준다.
도 50은 상동성 아암에 의해 플랭킹된 치료용 GOI를 갖는 염색체 DNA의 상동성-지정 복구 (HDR) 동안 도 52의 서열로부터의 자기-제한 Cas 발현의 다이어그램을 보여준다.
도 51은 자기-제한 CRISPR 유전자 편집 시스템을 사용한 2개의 유전자-편집 시나리오에 대한 다이어그램을 보여준다. 시나리오 1에서, 인간 발현 카세트 (예를 들어, 치료용 GOI)를 함유하는 msDNA는 일시적 발현을 위해 먼저 형질감염된 후, HDR 녹인을 위해 도 42의 유전자 편집 시스템이 뒤따른다. 시나리오 2에서, HDR 녹인은 자기-제한 CRISPR 유전자 편집 시스템 및 상동성 아암에 의해 플랭킹된 인간 발현 카세트를 모두 함유하는 단일 msDNA에 의해 매개된다.
상세한 설명
본 개시내용은 발현 벡터, 박테리아 서열-무함유 벡터 (예를 들어, 미니스트링 DNA (msDNA)), 벡터 생산 시스템, 박테리아 서열-무함유 벡터를 제조하는 방법, 조성물, 및 이의 용도를 제공한다.
본원에 인용된 모든 저널 기사, 도서, 매뉴얼, 특허 출원 및 특허를 제한 없이 포함하여 본원에 인용된 모든 간행물은 각각의 개별 간행물이 참조로 포함되도록 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
I. 용어
본 개시내용을 보다 쉽게 이해할 수 있도록, 먼저 특정 용어를 정의한다. 본 출원에서 사용된 바와 같이, 본원에 달리 명시적으로 제공된 경우를 제외하고, 하기 용어는 각각 아래에 제시된 의미를 가질 수 있다. 추가적인 정의는 출원 전반에 걸쳐 제시된다.
용어 "a" 또는 "an" 실체는 해당 실체 중 하나 이상을 지칭한다는 점에 유의해야 하며; 예를 들어 "뉴클레오티드 서열"은 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 "a" (또는 "an"), "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "및/또는"은 서로의 유무에 관계없이 명시된 특색 또는 구성성분 각각의 특정 개시내용으로서 받아들여져야 한다. 그러므로, "A 및/또는 B"와 같은 문구에서 사용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A" (단독) 및 "B" (단독)를 포함하도록 의도된다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 문구에서 사용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 하기 측면 각각을 포함하도록 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
본원에서 측면이 표현 "포함하는"으로 기재된 경우에는 "로 이루어진" 및/또는 "로 본질적으로 이루어진"의 용어로 기재된 달리 유사한 측면도 제공되는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "약" 또는 "로 본질적으로 구성된"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정된 바와 같이 특정 값 또는 조성에 대해 허용가능한 오차 범위 내에 있는 값 또는 조성을 지칭하며, 이는 부분적으로 값 또는 조성이 측정되거나 결정되는 방법, 즉 측정 시스템의 한계에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, "약" 또는 "로 본질적으로 구성된"은 관련 기술분야의 실시에 따라 1 또는 1 초과의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약" 또는 "로 본질적으로 구성된"은 최대 10% (즉, ±10%) 범위를 의미할 수 있다. 더욱이, 특히 생물학적 시스템 또는 프로세스와 관련하여, 이 용어는 값의 최대 10배 또는 최대 5배를 의미할 수 있다. 달리 언급되지 않는 한, 특정 값 또는 조성이 출원 및 청구범위에 제공되는 경우, "약" 또는 "로 본질적으로 구성된"의 의미는 해당 특정 값 또는 조성에 대해 허용가능한 오차 범위 내에 있는 것으로 가정되어야 한다.
본원에 기재된 바와 같이, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위 또는 정수 범위는 달리 명시되지 않는 한 인용된 범위 내의 임의의 정수 값 및 적절한 경우 그 분수 (예컨대 정수의 10분의 1 및 100분의 1)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 숫자 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용과 관련된 기술분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌 [the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press]; [The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 5th ed., 2013, Academic Press]; 및 [the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, 2006, Oxford University Press]은 본 개시내용에서 사용된 많은 용어의 일반 사전을 통상의 기술자에게 제공한다.
단위, 접두사 및 기호는 국제단위계 (SI) 승인 형태로 표시된다.
달리 명시되지 않는 한, 뉴클레오티드 서열은 5'에서 3' 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기록된다. 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기록된다.
본원에 제공된 표제는 전체로서 명세서를 참조하여 가질 수 있는 본 개시내용의 다양한 측면의 제한이 아니다. 따라서, 바로 아래에 정의된 용어들은 본 명세서 전체를 참조하여 보다 완전하게 정의된다.
"아미노산"은 중심 탄소 원자 (알파-탄소 원자)가 수소 원자, 카르복실산 기 (이의 탄소 원자는 본원에서 "카르복실 탄소 원자"로 지칭됨), 아미노 기 (이의 질소 원자는 본원에서 "아미노 질소 원자"로 지칭됨), 및 측쇄 기 R에 연결된 구조를 갖는 분자이다. 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에 혼입되면, 아미노산은 하나의 아미노산을 또 다른 아미노산에 연결하는 탈수 반응에서 아미노산 카르복실 기의 하나 이상의 원자를 잃는다. 결과적으로, 단백질에 혼입되면, 아미노산은 "아미노산 잔기"로 지칭된다.
"단백질" 또는 "폴리펩티드"는 펩티드 결합을 통해 연결된 2개 이상의 개별 아미노산 (자연 발생 여부에 관계없이)의 임의의 중합체를 지칭하며, 하나의 아미노산 (또는 아미노산 잔기)의 알파-탄소에 결합된 카르복실산 기의 카르복실 탄소 원자가 인접한 아미노산의 비-알파-탄소에 결합된 아미노 기의 아미노 질소 원자에 공유결합적으로 결합될 때 발생한다. 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 유사하게, 단백질 및 폴리펩티드의 단편은 또한 본 개시내용의 범위 내에 속하며, 본원에서 "단백질" 또는 "폴리펩티드"로 지칭될 수 있다. 본 개시내용의 한 측면에서, 폴리펩티드는 2개 이상의 부모 펩티드 세그먼트 또는 단백질의 키메라를 포함한다. 용어 "폴리펩티드"는 또한 제한 없이 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 카르바밀화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해 절단, 비-자연 발생 아미노산에 의한 변형, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 라벨링 구성성분과의 접합을 포함하는 폴리펩티드의 번역후 변형 ("PTM")의 생성물을 지칭하고 포함하도록 의도된다. 폴리펩티드는 천연 생물학적 공급원으로부터 유래되거나 재조합 기술에 의해 생산될 수 있지만, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역될 필요는 없다. 이는 화학적 합성을 포함하여 어떤 방식으로든 생성될 수 있다. "단리된" 폴리펩티드 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체는 자연 환경에 존재하지 않는 폴리펩티드를 지칭한다. 특정 수준의 정제가 필요하지 않는다. 예를 들어, 단리된 폴리펩티드는 천연 또는 자연 환경으로부터 간단히 제거될 수 있다. 숙주 세포에서 발현된 재조합적으로 생산된 폴리펩티드 및 단백질은 임의의 적합한 기술에 의해 분리되거나 분획화되거나 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 천연 또는 재조합 폴리펩티드와 마찬가지로 본 개시내용의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다.
본원에 개시된 바와 같은 2개 이상의 단백질을 포함하는 재조합 폴리펩티드 (즉, 재조합 단백질)는 각 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일 코딩 서열에 의해 코딩될 수 있다. 달리 언급되지 않는 한, 각 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일 mRNA의 번역이 각 단백질을 포함하는 단일 폴리펩티드를 초래하도록 "프레임 내"에 있다. 전형적으로, 본원에 기재된 바와 같은 재조합 폴리펩티드 내의 단백질은 서로 직접 융합되거나 펩티드 링커에 의해 분리될 것이다. 펩티드 링커를 코딩하는 다양한 폴리뉴클레오티드 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 자기-절단 펩티드를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 일부 예에서, 폴리뉴클레오티드는 코딩 서열과 바로 옆에 인접하지 않거나 그로부터 유래된 유기체의 자연 발생 게놈 내 코딩 서열과 바로 옆에 인접한 (5' 말단 또는 3' 말단에서) 서열을 포함한다. 따라서 이 용어는 예를 들어 벡터, 자율 복제 플라스미드 또는 바이러스, 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA에 혼입되거나, 또는 다른 서열과 독립적으로 별도의 분자 (예를 들어, cDNA)로 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 본 개시내용의 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 어느 하나의 뉴클레오티드의 변형된 형태일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 폴리뉴클레오티드는 특히 단일- 및 이중-가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 및 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일-가닥 또는 보다 전형적으로 이중-가닥 또는 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자를 지칭한다. 용어 폴리뉴클레오티드는 게놈 DNA 또는 RNA (유기체에 따라 다름, 즉, 바이러스의 RNA 게놈), 뿐만 아니라 게놈 DNA에 의해 코딩된 mRNA, 및 cDNA를 포함한다. 특정 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 통상적인 포스포디에스테르 결합 또는 비-통상적인 결합 (예를 들어, 아미드 결합, 예컨대 펩티드 핵산 (PNA)에서 발견되는 것)을 포함한다. "단리된" 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 천연 환경으로부터 제거된 핵산 분자, 예를 들어 DNA 또는 RNA를 의미한다. 예를 들어, 벡터에 함유된 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자는 본 개시내용의 목적을 위해 "단리된" 것으로 간주된다. 단리된 폴리뉴클레오티드의 추가 예는 이종 숙주 세포에서 유지되거나 용액 내의 다른 폴리뉴클레오티드로부터 (부분적으로 또는 실질적으로) 정제된 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 단리된 RNA 분자는 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체를 포함한다. 본 개시내용에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 합성적으로 생산된 폴리뉴클레오티드 및 핵산 (예를 들어, 핵산 분자)을 추가로 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "코딩 영역" 또는 "코딩 서열"은 아미노산으로 번역가능한 코돈으로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 일부이다. "정지 코돈" (TAG, TGA 또는 TAA)은 전형적으로 아미노산으로 번역되지 않지만, 이는 코딩 영역의 일부로 간주될 수 있지만, 임의의 플랭킹 서열, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결자, 인트론 등은 코딩 영역의 일부가 아니다. 코딩 영역의 경계는 전형적으로 생성된 폴리펩티드의 아미노-말단을 코딩하는 5' 말단의 시작 코돈, 및 생성된 폴리펩티드의 카르복실-말단을 코딩하는 3' 말단의 번역 정지 코돈에 의해 결정된다.
본원에서 사용된 바와 같은 "발현 카세트"는 관심 핵산 서열 (예를 들어, 폴리펩티드, DNA 또는 RNA의 발현을 위한 핵산 서열) 및 발현 제어 영역을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "트랜스진"은 "관심 유전자 (GOI)"와 상호교환적으로 사용될 수 있고, 아미노산으로 번역가능한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드의 일부를 지칭한다. "정지 코돈" (TAG, TGA 또는 TAA)은 전형적으로 아미노산으로 번역되지 않지만, 트랜스진의 일부로 간주될 수 있지만, 임의의 플랭킹 서열, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결자, 인트론 등은 트랜스진의 일부가 아니다. 트랜스진의 경계는 전형적으로 생성된 폴리펩티드의 아미노-말단을 코딩하는 5' 말단의 시작 코돈, 및 생성된 폴리펩티드의 카르복실-말단을 코딩하는 3' 말단의 번역 정지 코돈에 의해 결정된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "발현 제어 영역"은 코딩 영역에 의해 코딩된 생성물의 발현을 지시하거나 제어하기 위해 코딩 영역과 작동가능하게 연관된 전사 제어 요소를 지칭하며, 예를 들어 시스-조절성 모듈 (CRM), 프로모터 (예를 들어, 조직 특이적 프로모터 및/또는 유도성 프로모터), 인핸서, 오퍼레이터, 억제자, 리보솜 결합 부위, 번역 리더 서열, 인트론, 전사후 요소, 폴리아데닐화 인식 서열, RNA 프로세싱 부위, 이펙터 결합 부위, 스템-루프 구조, 및 전사 종결 신호, miRNA 결합 부위, 및 이들의 조합을 포함한다. 발현 제어 영역은 관심 핵산 서열의 상류 (5'), 내부 또는 하류 (3')에 위치된 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이는 연관 관심 핵산 서열의 전사, RNA 프로세싱, 안정성 또는 번역에 영향을 미친다. 트랜스진이 진핵 세포에서 발현되도록 의도된 경우, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열은 일반적으로 트랜스진에 대해 3'에 위치될 것이다.
프로모터 기능의 유도가 생성물을 코딩하는 코딩 영역을 포함하는 mRNA의 전사를 초래하는 경우, 및 프로모터와 코딩 영역 사이의 연결의 성질이 코딩 영역에 의해 코딩된 생성물의 발현을 지시하는 프로모터의 능력을 방해하지 않거나 전사되는 DNA 주형의 능력을 방해하지 않는 경우, 코딩 영역 및 프로모터는 "작동가능하게 연관" (즉, "작동가능하게 연결")된다. 발현 제어 영역은 코딩 영역의 상류 (5' 비-코딩 서열), 내부 또는 하류 (3' 비-코딩 서열)에 위치된 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이는 연관된 코딩 영역의 전사, RNA 프로세싱, 안정성 또는 번역에 영향을 미친다. 코딩 영역이 진핵 세포에서 발현되도록 의도된 경우, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열은 일반적으로 코딩 서열에 대해 3'에 위치될 것이다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "숙주 세포" 및 "세포"는 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 핵산 분자 (예를 들어, 재조합 핵산 분자)를 보유하거나 보유할 수 있는 임의의 유형의 세포 또는 세포 집단, 예를 들어 일차 세포, 배양 중인 세포, 또는 세포주로부터의 세포를 지칭할 수 있다. 숙주 세포는 원핵 세포일 수 있거나, 대안적으로 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들어 진균 세포, 예컨대 효모 세포, 및 다양한 동물 세포, 예컨대 곤충 세포 또는 포유동물 세포일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 "배양" "배양하다" 및 "배양하는"은 세포 성장 또는 분열을 허용하거나 세포를 살아있는 상태로 유지하는 시험관내 조건 하에 세포를 인큐베이션하는 것을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같은 "배양된 세포"는 시험관내에서 증식되는 세포를 의미한다.
"대상체"는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 용어 "비인간 동물"은 척추동물, 예컨대 포유동물, 조류, 애완동물, 농장 동물, 비인간 영장류, 양, 소, 염소, 돼지, 닭, 개, 고양이, 및 설치류, 예컨대 마우스, 래트 및 기니피그를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 측면에서, 대상체는 인간이다. 용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
"투여하는"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 다양한 방법 및 전달 시스템을 사용하여 대상체에게 치료제를 물리적으로 도입하는 것을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 대상체의 용어 "치료하다", "치료하는", "치료" 또는 "요법"은 질환과 연관된 증상, 합병증, 병태 또는 생화학적 징후의 진행, 발달, 중증도 또는 재발을 역전, 경감, 호전, 억제 또는 둔화 또는 예방하거나 전반적 생존을 향상시키는 목적으로 대상체에게 수행되거나 활성제를 투여하는 임의의 유형의 중재 또는 프로세스를 지칭한다. 치료는 질환을 갖는 대상체 또는 질환을 갖지 않는 대상체에 대한 것일 수 있다 (예를 들어, 예방, 예컨대 백신접종).
용어 "유효 용량" "유효 투여량" 또는 "유효량"은 원하는 효과를 달성하거나 적어도 부분적으로 달성하기에 충분한 작용제의 양으로서 정의된다. 약물 또는 치료제의 "치료 유효량" 또는 "치료 유효 투여량"은 단독으로 또는 또 다른 치료제와 조합하여 사용되는 경우 질환 증상의 중증도의 감소, 질환 증상이 없는 기간의 빈도 및 지속시간의 증가, 전반적 생존 (질환 진단일 또는 질환 치료 시작일로부터 해당 질환으로 진단된 환자가 여전히 생존하는 시간의 길이)의 증가, 또는 질환 고통으로 인한 손상 또는 장애의 예방에 의해 입증되는 질환 퇴행을 촉진하는 약물의 임의의 양이다. 약물의 치료 유효량 또는 투여량은 "예방적 유효량" 또는 "예방적 유효 투여량"을 포함하며, 이는 질환이 발생할 위험이 있거나 질환이 재발할 위험이 있는 대상체에게 단독으로 또는 또 다른 치료제와 조합하여 투여될 때 질환의 발병 또는 재발을 억제하는 약물의 임의의 양이다. 질환 퇴행을 촉진하거나 질환의 발병 또는 재발을 억제하는 치료제의 능력은 숙련된 전문가에게 공지된 다양한 방법을 사용하여, 예컨대 임상 시험 동안 인간 대상체에서, 인간에서 효능을 예측하는 동물 모델 시스템에서, 또는 시험관내 검정에서 작용제의 활성을 검정함으로써 평가될 수 있다.
본 개시내용의 다양한 측면은 하기 하위섹션에서 더 자세히 설명된다.
II. 박테리아 서열-무함유 벡터를 생산하기 위한 발현 벡터 및 벡터 생산 시스템
박테리아 서열-무함유 벡터 및 이의 생산은 미국 특허 번호 9,290,778 및 9,862,954; 문헌 [Nafissi and Slavcev, Microbial Cell Factories 11:154 (2012)]; 및 [Nafissi et al., Nucleic Acids 3(6):e165 (2014)] (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 이들 박테리아 서열-무함유 벡터는 관심 핵산 서열(들)을 함유하는 발현 카세트의 각 측면 (즉, 5' 및 3' 측면)을 플랭킹하는 레콤비나제에 대한 표적 서열을 포함하는 특수화된 "슈퍼 서열" ("SS" 또는 대안적으로 "SSeq") 부위를 함유하는 발현 벡터 (예를 들어, 플라스미드)로부터 생산된다. 구체적으로, 각각의 SS는 제1 레콤비나제에 대한 표적 서열을 함유하며, 제1 레콤비나제에 대한 비-결합 영역 내에 통합된 하나 이상의 추가 레콤비나제에 대한 추가 표적 서열을 함유한다. 발현 벡터가 적절한 레콤비나제를 발현하는 재조합 세포에 존재하는 경우, 발현 카세트를 함유하는 박테리아 서열-무함유 벡터가 발현 벡터의 백본 DNA로부터 분리된다. 원형 공유 폐쇄형 (CCC) 박테리아 서열-무함유 벡터를 생산하기 위해, 발현 벡터는 예를 들어 SS의 표적 서열을 통해 작용하는 레콤비나제, 예컨대 Cre 또는 Flp를 발현하는 재조합 세포에 배치된다. 선형 공유 폐쇄형 (LCC) 박테리아 서열-무함유 벡터 (본원에서 미니스트링 DNA (msDNA)로도 지칭됨)를 생산하기 위해, 발현 벡터는 예를 들어 SS의 표적 서열을 통해 작용하는 레콤비나제, 예컨대 TelN 또는 Tel을 발현하는 재조합 세포에 배치된다. 그 후, 재조합으로부터 생성된 박테리아 서열-무함유 벡터는 세포로부터 정제되고 전달 벡터로서 직접 사용될 수 있다. 미국 특허 번호 9,290,778 및 9,862,954, 문헌 [Nafissi and Slavcev], 및 [Nafissi et al.]을 참조한다.
LCC 말단을 갖는 msDNA 벡터는 비틀림이 없으며 이. 콜라이에서 생산되는 동안 기라제-지정 음성 슈퍼코일링이 발생하지 않는다. 더욱이, 이중 가닥 LCC 토폴로지로 인해, msDNA의 세포의 염색체로의 통합은 염색체 파단을 야기하여, 이에 의해 집단으로부터 세포를 제거한다. 그러므로, msDNA는 삽입 돌연변이유발의 임의의 위험을 제거하여, msDNA를 투여받은 환자를 잠재적 유전독성 및 암으로부터 보호한다 (Nafissi et al.).
본 개시내용은 박테리아 서열-무함유 벡터의 개선된 생산 및 개선된 박테리아 서열-무함유 벡터를 제공한다. 일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터의 생산은 오염성 발현 벡터 서열의 제거에 의해 개선된다. 일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 세포 내 확립 능력 (즉, 형질감염 효율), 개선된 트랜스진 발현 (예를 들어, 향상된 전사 및 번역의 조합에 의해 매개됨), 및 세포 내 개선된 확장 (예를 들어, 벡터의 딸 세포로의 복제 및 분할)을 통해 개선된다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 개선은 관련 기술분야에 공지된 다른 방법에 따라 생산된 CCC 또는 LCC 벡터에 적응될 수 있다.
A. 발현 벡터
하기를 포함하는 발현 벡터가 본원에 제공된다: (a) 백본 서열, (b) 하기를 포함하는 서열: (i) 관심 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트, (ii) 발현 카세트의 5' 측면을 플랭킹하는 제1 레콤비나제에 대한 제1 표적 서열, (iii) 발현 카세트의 3' 측면을 플랭킹하는 제1 레콤비나제에 대한 제2 표적 서열, 및 (iv) 제1 레콤비나제에 대한 비-결합 영역 내 제1 및 제2 표적 서열 내에 통합된 하나 이상의 추가 레콤비나제에 대한 하나 이상의 추가 표적 서열, 및 (c) 하기 중 하나 이상: (i) 제1 레콤비나제 및 하나 이상의 추가 레콤비나제에 대한 비-결합 영역 내 제1 레콤비나제에 대한 제1 및/또는 제2 표적 서열 내에 통합된 엔도뉴클레아제 표적 서열, 여기서 엔도뉴클레아제 표적 서열은 백본 서열과 제1 레콤비나제 및 하나 이상의 추가 레콤비나제에 대한 절단 부위 사이에 있음, (ii) 제1 레콤비나제에 대한 제1 표적 서열의 3' 말단과 발현 카세트 내 또 다른 인핸서 또는 프로모터의 5' 말단 사이에 통합된 서열식별번호: 12와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 합성 인핸서, (iii) 제1 레콤비나제에 대한 제1 표적 서열의 3' 말단과 발현 카세트 내 프로모터의 5' 말단 사이에 통합된 사이토메갈로바이러스 (CMV) 인핸서, (iv) 인트론을 포함하는 5' 비번역 영역 (5'UTR), 여기서 5'UTR은 프로모터와 관심 핵산 서열 사이에서 발현 카세트에 통합됨, (v) 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된 척추동물 염색질 인슐레이터, (vi) 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소 (WPRE), (vii) 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된 스캐폴드/매트릭스 부착 영역 (S/MAR), 또는 (viii) 제1 레콤비나제 및 하나 이상의 추가 레콤비나제에 대한 비-결합 영역 내 제1 레콤비나제에 대한 제1 및/또는 제2 표적 서열 내에 통합된 DNA 핵 표적화 서열 (DTS), 여기서 DTS는 발현 카세트와 제1 레콤비나제 및 하나 이상의 추가 레콤비나제에 대한 절단 부위 사이에 있음.
본원에서 언급된 바와 같은 "백본" 서열은 발현 카세트의 서열 및 제1 레콤비나제의 제1 및 제2 표적 서열을 포함하는 플랭킹 SS 부위 외부의 발현 벡터의 서열이다. 백본 서열은 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이 숙주 세포 (예를 들어, 이. 콜라이)에서 발현 벡터의 증폭 및 항생제 선택을 위한 서열을 포함할 수 있다.
레콤비나제에 대한 "비-결합" 영역은 본원에 기재된 바와 같은 레콤비나제에 의해 작용하지 않는 (예를 들어, 레콤비나제에 의해 결합 및/또는 절단되지 않는) 제1 레콤비나제에 대한 표적 서열 내의 영역이다.
레콤비나제에 대한 "절단 부위"는 레콤비나제가 재조합과 연관된 DNA에서 이중-가닥 파단 또는 단일-가닥 틈을 개시하는 부위이다.
일부 측면에서, 발현 벡터는 제1 레콤비나제 및 하나 이상의 추가 레콤비나제에 대한 비-결합 영역 내 제1 레콤비나제에 대한 제1 및/또는 제2 표적 서열 내에 통합된 엔도뉴클레아제 표적 서열을 포함하고, 여기서 엔도뉴클레아제 표적 서열은 백본 서열과 제1 레콤비나제 및 하나 이상의 추가 레콤비나제에 대한 절단 부위 사이에 있다. 일부 측면에서, 엔도뉴클레아제 표적 서열은 제1 레콤비나제에 대한 제1 표적 서열 내에 통합된다. 일부 측면에서, 엔도뉴클레아제 표적 서열은 제1 레콤비나제에 대한 제2 표적 서열 내에 통합된다. 일부 측면에서, 엔도뉴클레아제 표적 서열은 제1 레콤비나제에 대한 제1 및 제2 표적 서열 내에 통합된다. 일부 측면에서, 동일한 엔도뉴클레아제 표적 서열은 제1 레콤비나제에 대한 제1 및 제2 표적 서열 내에 통합된다. 일부 측면에서, 제1 레콤비나제에 대한 제1 및 제2 표적 서열 내에 통합된 엔도뉴클레아제 표적 서열은 동일한 엔도뉴클레아제에 대한 것이다. 일부 측면에서, 제1 레콤비나제에 대한 제1 표적 서열 내에 통합된 엔도뉴클레아제 표적 서열은 제1 레콤비나제에 대한 제2 표적 서열 내에 통합된 엔도뉴클레아제 표적 서열과 상이하다. 일부 측면에서, 제1 레콤비나제에 대한 제1 표적 서열 내에 통합된 엔도뉴클레아제 표적 서열은 제1 레콤비나제에 대한 제2 표적 서열 내에 통합된 엔도뉴클레아제 표적 서열과 상이한 엔도뉴클레아제에 대한 것이다.
발현 벡터 내 백본 서열과 레콤비나제에 대한 절단 부위 사이의 엔도뉴클레아제 표적 서열의 위치는 본원에 기재된 바와 같은 재조합 후에 엔도뉴클레아제 표적 서열이 박테리아 서열-무함유 벡터가 아닌 백본 서열과 계속 연관되어 있음을 보장한다. 그러므로, 재조합 후에, 백본 서열 및 엔도뉴클레아제 표적 부위를 함유하는 서열은 엔도뉴클레아제에 노출시킴으로써 박테리아 서열-무함유 벡터를 함유하는 제제로부터 제거되어, 박테리아 서열-무함유 벡터를 생산하는 방법에서 백본 서열을 제거하기 위한 정제 단계의 필요성을 감소시키거나 회피할 수 있다. 일부 측면에서, 엔도뉴클레아제는 본원에 기재된 바와 같은 벡터 생산 시스템의 숙주 세포에서 재조합 후에 발현되며, 여기서 엔도뉴클레아제는 엔도뉴클레아제 표적 부위에서 DNA를 절단하고, 백본 서열 및 엔도뉴클레아제 표적 부위를 함유하는 서열은 엑소뉴클레아제 (예를 들어, 엑소뉴클레아제 V)에 의해 분해된다.
일부 측면에서, 발현 벡터는 귀소 엔도뉴클레아제에 대한 엔도뉴클레아제 표적 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 엔도뉴클레아제 표적 서열은 I-AniI, I-CeuI, I-ChuI, I-CpaI, I-CpaII, I-CreI, I-DmoI, H-DreI, I-HmuI, I-HmuII, I-LlaI, I-MsoI, PI-PfuI, PI-PkoII, I-PorI, I-PpoI, PI-PspI, I-ScaI, I-SceI, PI-SceI, I-SceII, I-SecIII, I-SceIV, I-SceV, I-SceVI, I-SceVII, I-Ssp6803I, I-TevI, I-TevII, I-TevIII, PI-TliI, PI-TliII, I-Tsp061I 또는 I-Vdi141I에 대한 것이다. 일부 측면에서, 엔도뉴클레아제 표적 서열은 I-SceI에 대한 것이다. 일부 측면에서, 엔도뉴클레아제 표적 서열은 PI-SceI에 대한 것이다. 귀소 엔도뉴클레아제에 대한 표적 서열은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
일부 측면에서, 발현 벡터는 뉴클레아제 게놈 편집 시스템의 일부인 엔도뉴클레아제를 포함하여 게놈 편집에 사용되는 엔도뉴클레아제에 대한 엔도뉴클레아제 표적 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 뉴클레아제 게놈 편집 시스템은 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문구조 반복부-Cas (CRISPR-Cas) 시스템, 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 시스템, 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN) 시스템, 또는 메가뉴클레아제 시스템이다.
일부 측면에서, 발현 벡터는 Cas 엔도뉴클레아제에 대한 엔도뉴클레아제 표적 서열을 포함한다. 일부 측면에서, Cas 엔도뉴클레아제는 Cas9 (예를 들어, 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas 9 (SpCas9), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) Cas9 (SaCas9), 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) Cas9 (FnCas9), 또는 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) Cas9 (NmCas9)), Cas9 변이체 (예를 들어, Cas9β2, xCas9, SpCas9-NG, SpCas9-NRRH, SpCas9-NRCH, SpCas9-NRTH, SpG, SpRY), Cas3, Cas12 (예를 들어, Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, 또는 Cas12e), Cas13 (예를 들어, Cas13a, Cas13b, Cas13c 또는 Cas13d), 또는 Cas14이다. 일부 측면에서, 본원에서 사용된 바와 같은 Cas 엔도뉴클레아제에 대한 엔도뉴클레아제 표적 서열은 가이드 RNA (gRNA) 표적화 서열과 상동성이고, Cas 엔도뉴클레아제에 의해 인식되는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)를 포함한다. PAM 부위를 갖는 gRNA 표적화 서열과 상동성인 서열은 널리 공지된 CRISPR 시스템에 기초하여 일상적으로 설계될 수 있다. gRNA는 표적화 RNA (crRNA) 서열 및 트랜스-활성화 RNA (tracrRNA) 서열의 융합체를 포함하며, 이는 Cas 엔도뉴클레아제를 엔도뉴클레아제 표적 부위로 지정하고 절단을 촉매작용하는 상호작용 및 기능을 한다.
일부 측면에서, 발현 벡터는 제1 레콤비나제에 대한 제1 표적 서열의 3' 말단과 발현 카세트 내 또 다른 인핸서 또는 프로모터의 5' 말단 사이에 통합된 서열식별번호: 12와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 합성 인핸서를 포함한다. 일부 측면에서, 발현 벡터는 제1 레콤비나제에 대한 제1 표적 서열의 3' 말단과 발현 카세트 내 또 다른 인핸서 또는 프로모터의 5' 말단 사이에 통합된 서열식별번호: 12의 핵산 서열을 포함하는 합성 인핸서를 포함한다. 일부 측면에서, 합성 인핸서는 핵산 서열의 다중 인접 카피, 예컨대, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 인접 카피를 포함한다. 일부 측면에서, 합성 인핸서는 핵산 서열의 3개 인접 카피를 포함한다. 일부 측면에서, 합성 인핸서는 서열식별번호: 46과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 합성 인핸서는 서열식별번호: 46의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 합성 인핸서는 닭 β-액틴 프로모터의 5' 말단에 통합된다. 일부 측면에서, 서열식별번호: 47과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 키메라 인트론은 닭 β-액틴 프로모터의 3' 말단 및 관심 핵산 서열의 5'에 통합된다. 일부 측면에서, 서열식별번호: 47의 핵산 서열을 포함하는 키메라 인트론은 닭 β-액틴 프로모터의 3' 말단 및 관심 핵산 서열의 5'에 통합된다.
일부 측면에서, 발현 벡터는 제1 레콤비나제에 대한 제1 표적 서열의 3' 말단과 발현 카세트 내 프로모터의 5' 말단 사이에 통합된 CMV 인핸서를 포함한다. 일부 측면에서, CMV 인핸서는 서열식별번호: 12와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 합성 인핸서의 3' 말단에 통합된다. 일부 측면에서, CMV 인핸서는 서열식별번호: 12의 핵산 서열을 포함하는 합성 인핸서의 3' 말단에 통합된다. 일부 측면에서, CMV 인핸서는 합성 인핸서의 다중 인접 카피의 3' 말단에, 예컨대, 예를 들어 합성 인핸서의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 인접 카피의 3' 말단에 통합된다. 일부 측면에서, CMV 인핸서는 합성 인핸서의 3개 인접 카피의 3' 말단에 통합된다. 일부 측면에서, CMV 인핸서는 서열식별번호: 46과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열의 3' 말단에 통합된다. 일부 측면에서, CMV 인핸서는 서열식별번호: 46의 핵산 서열의 3' 말단에 통합된다. 일부 측면에서, CMV 프로모터는 CMV 인핸서의 3' 말단 및 관심 핵산 서열의 5'에 통합된다.
일부 측면에서, 발현 벡터는 제1 레콤비나제에 대한 제1 표적 서열과 관심 핵산 서열 사이에 통합된 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 38 또는 서열식별번호: 39와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 발현 벡터는 제1 레콤비나제에 대한 제1 표적 서열과 관심 핵산 서열 사이에 통합된 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 38 또는 서열식별번호: 39의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 38 또는 서열식별번호: 39, 또는 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 38 또는 서열식별번호: 39의 핵산 서열와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열은 관심 핵산 서열에 대해 5'에 위치된 발현 카세트 내 모든 조절 요소를 포함한다.
일부 측면에서, 발현 벡터는 인트론을 포함하는 5'UTR을 포함하고, 여기서 5'UTR (즉, 인트론을 포함하는 5'UTR)은 프로모터와 관심 핵산 서열 사이에서 발현 카세트에 통합된다.
일부 측면에서, 5'UTR은 각각 5'UTR이 결여된 동일한 발현 벡터 또는 박테리아 서열-무함유 벡터와 비교하여 발현 벡터 또는 발현 벡터로부터 생산된 박테리아 서열-무함유 벡터로부터의 트랜스진 전사체 스플라이싱 및 번역을 개선하기 위한 것이다.
일부 측면에서, 인트론은 서열식별번호: 1과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 인트론은 서열식별번호: 1의 핵산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 5'UTR은 서열식별번호: 2와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함하며, 이는 내부 최소 인트론을 갖는 최적화된 5'UTR (본원에서 "5'UTR1"로도 지칭됨)이다. 일부 측면에서, 5'UTR은 서열식별번호: 2의 핵산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 5'UTR은 서열식별번호: 4와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 5'UTR은 서열식별번호: 4의 핵산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 5'UTR은 인트론 내에 통합된 비-코딩 서열을 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 인트론은 서열식별번호: 1과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일하거나 서열식별번호: 1을 포함하고, 비-코딩 서열은 서열식별번호: 1의 위치 25 내지 55로부터의 임의의 2개의 뉴클레오티드에 상응하는 인트론 내 2개의 뉴클레오티드 사이에 통합된다.
일부 측면에서, 비-코딩 서열은 비-원핵생물성 및 비-바이러스성이다. 일부 측면에서, 비-코딩 서열은 진핵생물 서열이다. 일부 측면에서, 비-코딩 서열은 인트론, 유비쿼터스 염색질 개방 요소 (UCOE), S/MAR, SV40 인핸서 서열 (예를 들어, 하나 또는 하나 초과의 SV40 인핸서 서열, 예컨대 2, 3, 4, 5개 이상의 SV40 인핸서 서열), 척추동물 염색질 인슐레이터 (예를 들어, cHS4), WPRE, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 측면에서, 비-코딩 서열은 S/MAR을 포함한다. 일부 측면에서, S/MAR은 서열식별번호: 9로서 본원에 제공된 MAR-5이다.
일부 측면에서, 5'UTR은 서열식별번호: 3과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 5'UTR은 서열식별번호: 3을 포함한다.
일부 측면에서, 5'UTR은 서열식별번호: 5와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 5'UTR은 서열식별번호: 5를 포함한다.
일부 측면에서, 5'UTR은 닭 β-액틴 프로모터와 관심 핵산 서열 사이에서 발현 카세트에 통합된다.
일부 측면에서, 5'UTR은 CMV 프로모터와 관심 핵산 서열 사이에서 발현 카세트에 통합된다.
일부 측면에서, 5'UTR은 프로모터와 관심 핵산 서열 사이에서 발현 카세트에 통합되고, 여기서 프로모터는 CMV 인핸서의 3' 말단에 통합된다. 일부 측면에서, CMV 인핸서는 서열식별번호: 12와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 합성 인핸서의 3' 말단에 통합된다. 일부 측면에서, CMV 인핸서는 서열식별번호: 12의 핵산 서열을 포함하는 합성 인핸서의 3' 말단에 통합된다. 일부 측면에서, CMV 인핸서는 합성 인핸서의 다중 인접 카피의 3' 말단에, 예컨대, 예를 들어 합성 인핸서의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 인접 카피의 3' 말단에 통합된다. 일부 측면에서, CMV 인핸서는 합성 인핸서의 3개 인접 카피의 3' 말단에 통합된다. 일부 측면에서, CMV 인핸서는 서열식별번호: 46과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열의 3' 말단에 통합된다. 일부 측면에서, CMV 인핸서는 서열식별번호: 46의 핵산 서열의 3' 말단에 통합된다.
일부 측면에서, 발현 벡터는 관심 핵산 서열의 3' 말단에 통합된 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 일부 측면에서, 폴리아데닐화 신호는 제노푸스 라에비스(Xenopus laevis) 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호, 인간 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호, 또는 하이브리드 제노푸스 라에비스 및 인간 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 일부 측면에서, 폴리아데닐화 신호는 제노푸스 라에비스 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호, 인간 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호, 또는 하이브리드 제노푸스 라에비스 및 인간 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호의 다중 카피, 예컨대, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개 카피를 포함한다. 일부 측면에서, 폴리아데닐화 신호는 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14 또는 서열식별번호: 15와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 폴리아데닐화 신호는 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14 또는 서열식별번호: 15의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 폴리아데닐산 꼬리 (즉, 폴리(A) 꼬리는 폴리아데닐화 신호의 3' 말단에 위치된다. 일부 측면에서, 폴리(A) 꼬리는 길이가 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120개 이상의 잔기이다. 일부 측면에서, 폴리아데닐화 신호 및 폴리(A) 꼬리를 포함하는 서열은 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 17 또는 서열식별번호: 18과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일하다. 일부 측면에서, 폴리아데닐화 신호 및 폴리(A) 꼬리를 포함하는 서열은 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 17 또는 서열식별번호: 18을 포함한다.
일부 측면에서, 발현 벡터는 발현 카세트 내 척추동물 염색질 인슐레이터를 포함한다. 일부 측면에서, 척추동물 염색질 인슐레이터는 5'-HS4 닭-β-글로빈 인슐레이터 (cHS4)이다. 예를 들어 문헌 [Benabdellah et al., PLoS ONE 9(1): e84268 (2014)]; [Lu et al., FEBS Open Bio 10: 644-656 (2020)]; [Hanawa et al., Mol. Ther. 17(4): 667-674 (2009)]; [Walters et al., Mol. Cell. Biol. 19(5): 3714-3726 (1999)]을 참조한다. 일부 측면에서, 척추동물 염색질 인슐레이터는 본원에 기재된 바와 같은 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된다. 일부 측면에서, 척추동물 염색질 인슐레이터는 본원에 기재된 바와 같은 5'UTR의 인트론 내에 통합된다.
일부 측면에서, 척추동물 염색질 인슐레이터는 서열식별번호: 8과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 척추동물 염색질 인슐레이터는 서열식별번호: 8을 포함한다.
일부 측면에서, 척추동물 염색질 인슐레이터는 각각 척추동물 염색질 인슐레이터 없이 동일한 발현 벡터 또는 박테리아 서열-무함유 벡터와 비교하여 발현 벡터 또는 발현 벡터로부터 생산된 박테리아 서열-무함유 벡터의 확립 (즉, 형질감염 효율)을 개선하기 위한 것이다.
일부 측면에서, 발현 벡터는 발현 카세트 내 WPRE를 포함한다. 예를 들어 문헌 [Higashimoto et al., Gene Therapy 14: 1298-1304 (2007)]을 참조한다. 일부 측면에서, WPRE는 본원에 기재된 바와 같은 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된다. 일부 측면에서, WPRE는 본원에 기재된 바와 같은 S/MAR의 3' 말단 및 본원에 기재된 바와 같은 폴리아데닐화 신호의 5' 말단에서 발현 카세트에 통합된다. 일부 측면에서, WPRE는 본원에 기재된 바와 같은 5'UTR의 인트론 내에 통합된다.
일부 측면에서, WPRE는 서열식별번호: 11과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, WPRE는 서열식별번호: 11을 포함한다.
일부 측면에서, WPRE는 각각 WPRE가 결여된 동일한 발현 벡터 또는 박테리아 서열-무함유 벡터와 비교하여 발현 벡터 또는 발현 벡터로부터 생산된 박테리아 서열-무함유 벡터로부터의 트랜스진의 발현을 개선한다.
일부 측면에서, 발현 벡터는 발현 카세트 내 S/MAR을 포함한다. 예를 들어 문헌 [Martens et al., Mol. Cell. Biol. 22(8): 2598-2606 (2002)]; [Narwade et al., Nucleic Acids Res. 47(14): 7247-7261 (2019)]을 참조한다. 일부 측면에서, S/MAR은 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된다. 일부 측면에서, S/MAR은 본원에 기재된 바와 같은 관심 핵산 서열의 3' 말단 및 WPRE의 5' 말단에서 발현 카세트에 통합된다. 일부 측면에서, S/MAR은 본원에 기재된 바와 같은 5'UTR의 인트론 내에 통합된다.
일부 측면에서, S/MAR은 인간 베타-인터페론 MAR의 단편인 MAR-3, MAR-4 또는 MAR-5이다. 예를 들어 문헌 [Wang et al., Mol. Biol. Cell 30: 2761-2770 (2019)]을 참조한다. 일부 측면에서, S/MAR은 서열식별번호: 9와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, S/MAR은 서열식별번호: 9를 포함한다.
일부 측면에서, S/MAR은 인간 세포독성 세린 프로테아제-B (CSP-B) MAR 또는 CSP-C MAR이다. 예를 들어 문헌 [Hanson and Ley, Blood 79(3):610-618 (1992)]; [Klein et al., Tissue Antigens 35(5):220-228 (1990)]을 참조한다. 일부 측면에서, S/MAR은 서열식별번호: 10과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, S/MAR은 서열식별번호: 10을 포함한다.
일부 측면에서, S/MAR은 각각 S/MAR이 결여된 동일한 발현 벡터 또는 박테리아 서열-무함유 벡터와 비교하여 발현 벡터 또는 발현 벡터로부터 생산된 박테리아 서열-무함유 벡터의 발현 수준, 안정성 및/또는 내구성을 개선하기 위한 것이다 (예를 들어, 에피솜 유지 및 복제, 예컨대 딸 세포로의 벡터의 확장 및 분할에 의해, 및/또는 후성유전학적 침묵 방지에 의해).
일부 측면에서, 상기 기재된 바와 같은 (c)(i)-(c)(vii) 중 임의의 하나 이상을 포함하는 발현 벡터 (즉, DTS 없이)는 제1 레콤비나제에 대한 제1 및 제2 표적 서열의 각 측면을 플랭킹하는 인핸서 서열을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 제1 레콤비나제에 대한 제1 및 제2 표적 서열의 각 측면을 플랭킹하는 인핸서 서열은 제1 레콤비나제에 대한 제1 및 제2 표적 서열의 각 측면을 플랭킹하는 적어도 2개의 인핸서 서열이다. 일부 측면에서, 인핸서 서열은 SV40 인핸서 서열이다.
일부 측면에서, 발현 벡터는 DTS를 포함한다. 일부 측면에서, DTS는 제1 레콤비나제 및 하나 이상의 추가 레콤비나제에 대한 비-결합 영역 내 제1 레콤비나제에 대한 제1 및/또는 제2 표적 서열 내에 통합되고, 여기서 DTS는 발현 카세트와 제1 레콤비나제 및 하나 이상의 추가 레콤비나제에 대한 절단 부위 사이에 있다. 일부 측면에서, DTS는 SV40 인핸서 서열이다. 일부 측면에서, DTS는 세포-특이적이다. 일부 측면에서, DTS는 평활근 세포, 배아 줄기 세포, 유형 II 폐포세포, 내피 세포 또는 골모세포에 특이적이다.
발현 카세트와 발현 벡터 내 레콤비나제에 대한 절단 부위 사이의 DTS의 위치는 DTS가 본원에 기재된 바와 같은 재조합 후에 백본 서열이 아닌 박테리아 서열-무함유 벡터와 회합된 상태로 유지되도록 보장한다.
일부 측면에서, 발현 벡터는 발현 카세트 내 UCOE를 포함한다. 예를 들어 문헌 [Muller-Kuller et al., Nucleic Acids Res. 43(3): 1577-1592 (2015)]; [Skipper et al., BMC Biotechnol. 19:75 (2019)]; [Rudina et al., bioRxiv, doi.org/10.1101/626713 (2019)]; [Neville et al., Biotechnol. Adv. 35(5): 557-564 (2017)]을 참조한다. 일부 측면에서, UCOE는 제1 레콤비나제에 대한 제1 표적 서열의 3' 말단과 발현 카세트 내 프로모터 또는 임의의 인핸서의 5' 말단 사이에 위치된다. 일부 측면에서, UCOE는 본원에 기재된 바와 같은 5'UTR의 인트론 내에 통합된다.
일부 측면에서, UCOE는 A2UCOE이다. 일부 측면에서, UCOE는 서열식별번호: 6과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, UCOE는 서열식별번호: 6이다.
일부 측면에서, UCOE는 SRF-UCOE이다. 예를 들어 국제 공개 번호 WO2020223160을 참조한다. 일부 측면에서, UCOE는 서열식별번호: 7과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, UCOE는 서열식별번호: 7이다.
일부 측면에서, UCOE는 각각 UCOE가 결여된 동일한 발현 벡터 또는 박테리아 서열-무함유 벡터와 비교하여 발현 벡터 또는 발현 벡터로부터 생산된 박테리아 서열-무함유 벡터로부터의 트랜스진의 발현을 개선한다.
일부 측면에서, 발현 벡터는 발현 카세트 내 인핸서-1을 포함한다. 일부 측면에서, 인핸서-1은 제1 레콤비나제에 대한 제1 표적 서열의 3' 말단과 발현 카세트 내 프로모터 또는 임의의 다른 인핸서의 5' 말단 사이에 통합된다. 일부 측면에서, 인핸서-1은 UCOE의 3' 말단과 CMV 인핸서의 5' 말단 사이에 통합된다. 일부 측면에서, 인핸서-1은 서열식별번호: 12와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 인핸서-1은 서열식별번호: 12이다.
일부 측면에서, 발현 벡터는 발현 카세트 내 CMV, EF1, SV40, CAG, Rho, VDM2, HCR 또는 HLP 프로모터, 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 측면에서, 발현 벡터는 발현 카세트 내 CMV 프로모터 변이체를 포함한다. 예를 들어 국제 공개 번호 WO2012099540; 문헌 [Xu et al., Bioengineered 10(1): 548-560, DOI: 10.1080/21655979.2019.1684863 (2019)]을 참조한다.
일부 측면에서, 발현 벡터는 발현 카세트 내 EF1-알파 프로모터를 포함한다. 일부 측면에서, 발현 벡터는 발현 카세트 내 CMV 인핸서 및 EF1-알파 프로모터를 포함한다.
일부 측면에서, 발현 벡터는 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호의 2개 카피를 포함하는 발현 카세트 내 3'UTR을 포함한다. 일부 측면에서, 3'UTR은 관심 핵산 서열과 제1 레콤비나제에 대한 제2 표적 서열의 5' 말단 사이에 통합된다.
일부 측면에서, 3'UTR은 제노푸스 라에비스 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호의 2개 카피를 포함한다. 일부 측면에서, 3'UTR은 서열식별번호: 13과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 3'UTR은 서열식별번호: 13이다.
일부 측면에서, 3'UTR은 인간 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호의 2개 카피를 포함한다. 일부 측면에서, 3'UTR은 서열식별번호: 14와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 3'UTR은 서열식별번호: 14이다.
일부 측면에서, 3'UTR은 제노푸스 라에비스 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호의 1개 카피 및 인간 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호의 1개 카피를 포함한다. 일부 측면에서, 3'UTR은 서열식별번호: 15와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 3'UTR은 서열식별번호: 15이다.
일부 측면에서, 3'UTR은 100 내지 120개의 아데닌 뉴클레오티드, 즉, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119 또는 120개의 아데닌 뉴클레오티드를 포함하는 폴리(A) 꼬리를 추가로 포함한다 (즉, 3'UTR의 3' 말단에).
일부 측면에서, 3'UTR은 서열식별번호: 16과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 3'UTR은 서열식별번호: 16이다.
일부 측면에서, 3'UTR은 서열식별번호: 17과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 3'UTR은 서열식별번호: 17이다.
일부 측면에서, 3'UTR은 서열식별번호: 18과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 3'UTR은 서열식별번호: 18이다.
발현 벡터는 본원에 기재된 바와 같은 제1 및/또는 제2 표적 서열 및/또는 발현 카세트에 대한 상기 변형의 임의의 조합을 함유할 수 있다. 일부 측면에서, 조합은 상승작용적 효과를 제공한다.
일부 측면에서, 제1 레콤비나제에 대한 제1 및 제2 표적 서열 및 하나 이상의 추가 레콤비나제에 대한 하나 이상의 추가 표적 서열은 PY54 pal 부위, N15 telRL 부위, loxP 부위, φK02 telRL 부위, FRT 부위, phiC31 attP 부위 및 λ attP 부위로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 측면에서, 발현 벡터는 각각의 표적 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 발현 벡터는 pal 부위 및 pal 부위 내에 통합된 telRL, loxP 및 FRT 레콤비나제 표적 결합 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 제1 레콤비나제에 대한 제1 및 제2 표적 서열은 각각 서열식별번호: 33의 핵산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 임의의 발현 카세트 내 관심 핵산 서열은 하기를 코딩하는 서열을 포함한다: 폴리펩티드, RNA (메신저 RNA (mRNA), 마이크로-RNA (miRNA), 작은 간섭 RNA (siRNA), 작은 헤어핀 RNA (shRNA), 리보자임 또는 안티센스 RNA), 또는 비-코딩 DNA (예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드). 일부 측면에서, 관심 핵산 서열은 인트론 및/또는 엑손을 포함하는 게놈 DNA 서열이다. 일부 측면에서, 관심 핵산 서열은 하기를 코딩하는 서열을 포함한다: 항암제, 종양 서프레서, 아폽토시스 작용제, 항혈관신생제, 효소, 세포독성제, 자살 유전자, 시토카인, 인터페론, 인터루킨, 면역조정제, 면역자극제, 면역억제제, 케모카인, 항원-제시 세포 자극용 항원, 항체 (예를 들어, 항체의 중쇄 및/또는 경쇄, 예컨대 모노클로날, 키메라, 인간화 또는 인간 항체, 또는 이의 항원-결합 단편), 게놈 편집 시스템 또는 이의 일부 (예를 들어, CRISPR-Cas, TALEN, ZFN 또는 메가뉴클레아제 시스템 또는 이의 일부, 예컨대 Cas 엔도뉴클레아제 또는 gRNA), 또는 면역원성 작용제 (예를 들어, VLP 및/또는 백신으로서). 일부 측면에서, 관심 핵산 서열은 핵산 서열이 세포내에서 발현될 때 VLP를 형성할 수 있는 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함한다.
예시적인 치료적 표적 및 적응증은 하기를 포함한다: 단일유전자 장애와 연관된 유전자, 예를 들어 간, 혈액 또는 눈 장애, 갈락토시다제 알파 (GLA, 예를 들어 파브리병 치료용), 나트륨 전압-개폐 채널 알파 서브유닛 1 (SCN1A, 예를 들어 드라베 증후군 치료용), ATP 결합 카세트 서브패밀리 A 구성원 4 (ABCA4, 예를 들어 스타가르트병 치료용), 계면활성제 단백질 B (SP-B, 예를 들어 계면활성제 기능장애 장애 치료용), 계면활성제 단백질 C (SP-C, 예를 들어 계면활성제 기능장애 장애 치료용), ATP-결합 카세트 서브패밀리 A 구성원 3 (ABCA3, 예를 들어 계면활성제 기능장애 장애 치료용), 용질 담체 패밀리 34 구성원 2 (SLC34A2, 예를 들어 폐포 미세결석증 및/또는 고환 미세결석증 치료용), 낭포성 섬유증 막횡단 전도도 조절제 (CFTR, 예를 들어 낭포성 섬유증 치료용), 글루타메이트 데카르복실라제 (GAD, 예를 들어 GAD65 또는 GAD67, 예를 들어 파킨슨병 치료용), 아스파르토아실라제 유전자 (ASPA, 아미노아실라제 (AAC)로도 공지됨, 예를 들어 카나반병 치료용), 방향족 L-아미노산 데카르복실라제 (AADC, 예를 들어 파킨슨병 치료용 및/또는 AADC 결핍증 치료용), 뉴르투린 (NRTN, 예를 들어 파킨슨병 치료용), 신경교세포주-유래 신경영양 인자 (GDNF, 예를 들어 파킨슨병 치료용), 신경 성장 인자 (NGF, 예를 들어 알츠하이머병 치료용), 트리펩티딜 펩티다제 I (TPP1, 세로이드 리포푸시노시스 뉴런-2 (CLN2)로도 공지됨, 예를 들어 바텐병, 예를 들어 CLN2 질환 치료용), 아릴술파타제 A (ARSA, 예를 들어 이염백색질장애 치료용), N-술포글루코사민 술포히드롤라제 (SGSH, 예를 들어 산필리포 증후군, 유형 A 치료용), 술파타제-변형 인자 1 (SUMF1, 예를 들어 산필리포 증후군, 유형 A 치료용), N-아세틸-알파-글루코사미니다제 (NAGLU, 예를 들어 산필리포 증후군, 유형 B 치료용), 운동 뉴런 1의 생존 (SMN1, 예를 들어 척수성 근위축증 1 치료용), 망막 색소 상피-특이적 65 kDa 단백질 (RPE65, 레티노이드 이소메로히드롤라제로도 공지됨, 예를 들어 레버 선천 흑내장증 치료용), Rab 에스코트 단백질 1 (REP1, 예를 들어 맥락막혈증 치료용), 레티노시신 1 (RS1, 예를 들어 X-연관 청소년 망막분리증 치료용), 알파-1 항트립신 (AAT, 예를 들어 유전성 폐기종 또는 AAT 결핍증 치료용), 미니디스트로핀 (예를 들어 뒤센 근이영양증 치료용), α-사르코글리칸 (αSG, 예를 들어 뒤센 근이영양증 또는 지대 근이영양증 유형 2 치료용), β-사르코글리칸 (βSG), γ-사르코글리칸 (γSG, 예를 들어 지대 근이영양증 유형 2 치료용), δ-사르코글리칸 (γSG), 이포단백질 리파제 (LPL, 예를 들어 가족성 LPL 결핍증 치료용), 산 알파-글루코시다제 (GAA, 예를 들어 폼페병 치료용), 종양 괴사 인자 수용체:Fc (TNFR:Fc, 예를 들어 관절염, 예를 들어 염증성 관절염 치료용), 근형질/소포체 Ca(2+)ATPase 2a (SERCA2a, 예를 들어 울혈성 심부전 치료용), 인자 VIII 또는 인자 IX (FVIII 또는 FIX, 예를 들어 혈우병 B 치료용), 포르포빌리노겐 데아미나제 유전자 (PBGD, 예를 들어 급성 간헐성 포르피린증 치료용), 가용성 fms-유사 티로신 키나제-1 (sFLT1, 예를 들어 연령-관련 황반 변성 또는 암, 예를 들어 난소암 치료용), VEGFR-1 및 VEGF-R2의 도메인을 포함하는 가용성 키메라 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 수용체 (예를 들어 암, 예를 들어 흑색종 또는 결장암 치료용), 가용성 VEGFR3 (예를 들어 암, 예를 들어 자궁내막암 치료용), 가용성 VEGF-C 미끼 수용체 (sVEGFR3-Fc, 예를 들어 암, 예를 들어 흑색종, 신장 세포 암종 또는 전립선암 치료용), 색소 상피-유래 성장 인자 (PEDF, 예를 들어 암, 예를 들어 루이스 폐암종 치료용), VEGFR2에 대한 중화 모노클로날 항체 (예를 들어, DC101, 예를 들어 암, 예를 들어 흑색종 또는 교모세포종 치료용), 엔도스타틴 (예를 들어 암, 예를 들어 방광암 또는 췌장암 치료용), 안지오스타틴 (예를 들어 암, 예를 들어 간암 치료용), 엔도스타틴 및 안지오스타틴 둘 모두 (즉, 바이시스트론 서열로서, 예를 들어 암, 예를 들어 난소암 또는 전립선암 치료용), 엔도스타틴 돌연변이체 (즉, P1254A-엔도스타틴, 예를 들어 암, 예를 들어 난소암 치료용), TSP-1의 항혈관신생 도메인 (3TSR, 예를 들어 암, 예를 들어 췌장암 치료용), 조직 인자 경로 억제제-2 (TFPI-2, 예를 들어 암, 예를 들어 교모세포종 치료용), 플라스미노겐의 단편 (예를 들어, 크링글 5, 예를 들어 암, 예를 들어 난소암 치료용), 플라스미노겐 크링글 1-5 (예를 들어 암, 예를 들어 흑색종 또는 폐암 치료용), 폴딩되지 않은 단백질 반응 단백질에 대한 siRNA (UPR; 예를 들어, IRE1α, XBP-1 또는 ATF6, 예를 들어 암, 예를 들어 유방암 치료용), 바소스타틴 (예를 들어 암, 예를 들어 폐암 치료용), 헤르페스 심플렉스 바이러스 유형 1 티미딘 키나제 (HSV-TK, 예를 들어 암, 예를 들어 유방암 치료용), sc39TK (예를 들어 암, 예를 들어 자궁경부암 치료용), 디프테리아 독소 A (DTA, 예를 들어 암, 예를 들어 자궁경부암 또는 골수종 치료용), 아폽토시스의 p53 상향조절된 조정제 (PUMA, 예를 들어 암, 예를 들어 자궁경부암 또는 골수종 치료용), 종양 괴사 인자 (TNF)-관련 아폽토시스-유도 리간드 (TRAIL, 예를 들어 암, 예를 들어 림프종, 간세포 암종, 두경부 편평 세포 암종 (즉, 두경부 암), 또는 교모세포종 치료용), 가용성 TRAIL (예를 들어 암, 예를 들어 간암 또는 폐 선암종 치료용), IFN-β (예를 들어 암, 예를 들어 결장직장암, 폐암, 신경모세포종, 또는 다형성 교모세포종 치료용), IFN-α (예를 들어 암, 예를 들어 전이성 흑색종 치료용), CD-40 리간드 (CD40L) 또는 CD40L 돌연변이체 (예를 들어 암, 예를 들어 폐암 치료용), 흑색종 분화-연관 유전자-7 및 인터루킨 24 (mda-7 및 IL24, 예를 들어 암, 예를 들어 에를리히 복수 종양 치료용), 아폽토틴 및 IL24 (예를 들어 암, 예를 들어 간암 치료용), IL24 (예를 들어 암, 예를 들어 혼합형-계통 백혈병 (MLL)/AF4 양성 급성 림프모구성 백혈병 (ALL) 치료용), IL15 (예를 들어 암, 예를 들어 전이성 간세포 암종 치료용), 이차 림프 조직 케모카인 (SLC, 예를 들어 암, 예를 들어 간암 치료용), Nk4 (간세포 성장 인자 (HGF)의 N-말단 헤어핀 및 후속 4개의 크링글 도메인, 예를 들어 암, 예를 들어 전이성 루이스 폐암종 치료용), 종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 구성원 14 (TNFSF14, LIGHT로도 공지됨, 예를 들어 암, 예를 들어 자궁경부암 치료용), 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF, 예를 들어 암 치료용), TNF-α (예를 들어 암, 예를 들어 신경교종 치료용), 서바이빈의 우성 음성 돌연변이체 (예를 들어, C84A 또는 T34A, 예를 들어 암, 예를 들어 결장암 또는 위암 치료용), 인간 텔로머라제 역전사효소의 C-말단 단편 (hTERTC27, 예를 들어 암, 예를 들어 다형성 교모세포종 치료용), 마스핀 (예를 들어 암, 예를 들어 전립선암 치료용), nm23H1 (예를 들어 암, 예를 들어 전이성 난소암 치료용), 인간 간세포 성장 인자의 크링글 1 도메인 (HGFK1, 예를 들어 암, 예를 들어 결장직장암종 치료용), 항-칼시토닌 리보자임 (예를 들어 암, 예를 들어 전립선암 치료용), 진핵생물 번역 개시 인자 4E-결합 단백질 1 (4EBP1, 예를 들어 암, 예를 들어 폐암 치료용), C-X-C 모티프 케모카인 수용체 2 (CXCR2) C-꼬리 서열 (예를 들어 암, 예를 들어 췌장암 치료용), 알파-토코페롤-연관 단백질 (TAP, 예를 들어 암, 예를 들어 전립선암 치료용), 트리코산틴 (예를 들어 암, 예를 들어 간세포 암종 치료용), 데코린 (예를 들어 암, 예를 들어 다형성 교모세포종 치료용), 카텔리시딘 (예를 들어 암, 예를 들어 결장암 치료용), 니만-피크 유형 C2 (NPC2, 예를 들어 암, 예를 들어 간세포 암종 치료용), 뮬러리안 억제 성분 (MIS, 예를 들어 암, 예를 들어 난소암 치료용), p53 (예를 들어 암, 예를 들어 기관지폐포암 치료용), 암 1에서 고도로 발현되는 shRNA (Hec1, 예를 들어 암, 예를 들어 신경교종 치료용), 엡스타인-바 바이러스 잠복막 단백질-1에 대한 shRNA (EBV LMP-1, 예를 들어 암, 예를 들어 비인두암 치료용), 인간 유두종 바이러스 16 E7 종양유전자에 대한 안티센스 RNA (HPV16-E7, 예를 들어 암, 예를 들어 자궁경부암 치료용), 안드로겐 수용체에 대한 shRNA (AR, 예를 들어 암, 예를 들어 전립선암 치료용), 달팽이에 대한 siRNA (SNA1로도 공지됨, 예를 들어 암, 예를 들어 췌장암 치료용), Slug에 대한 siRNA (즉, SNAI2의 단백질 생성물, 예를 들어 암, 예를 들어 담관암종 (간암) 치료용), 4.5 LIM-전용 단백질 2에 대한 shRNA (FHL2, 예를 들어 암, 예를 들어 결장암 치료용), miR-26a (예를 들어 암, 예를 들어 간세포 암종 치료용), HPV 16 구조적 단백질 L1 (HPV16-L1, 예를 들어 암, 예를 들어 자궁경부암 치료용), HPV 16 E5, E6, 및 E7 종양유전자 (HPV16 E5/E6/E7, 예를 들어 암, 예를 들어 자궁경부암 치료용), B-세포 백혈병/림프종 1 (BLC1) 이디오타입 (예를 들어 암, 예를 들어 B 세포 백혈병/림프종 1 치료용), 열 충격 단백질에 융합된 EBV LMP1 및 LMP2 (EBV LMP2/1-hsp, 예를 들어 암, 예를 들어 비인두 암종 치료용), 암종배아 항원 (CEA, 예를 들어 암, 예를 들어 결장암 치료용), 열 충격 단백질과 조합된 가용성 형태의 B 및 T 림프구 감쇠제 (BTLA 및 HSP70, 예를 들어 암, 예를 들어 흑색종 폐전이 치료용), HPV16-L1/E7 (예를 들어 암, 예를 들어 자궁경부암 치료용), HPV16-L1 (예를 들어 암, 예를 들어 자궁경부암 치료용), 항-EGFR 항체 (예를 들어, 14D1, 예를 들어 암, 예를 들어 외음부 암종 치료용), 항-사멸 수용체 5 (DR5) 항체 (예를 들어, 아드엑시맙(adximab), 예를 들어 암, 예를 들어 간암 또는 결장암 치료용), 항-에놀라제 1 (ENOI1) 항체 (예를 들어 암, 예를 들어 췌관 선암종 치료용), 항-VEGFA 항체 (예를 들어, 베바시주맙, 예를 들어 암, 예를 들어 전이성 폐암 또는 난소암 치료용), 뮤신 1 (MUC1) 항원 (예를 들어 암, 예를 들어 위암 치료용), 또는 아쿠아포린 (예를 들어, hAQP1, 예를 들어 방사선조사 유도 이하선 타액 기능저하, 즉, 구강건조증 치료용).
일부 측면에서, 관심 핵산 서열은 유전자 편집 (예를 들어, 유전적 결핍증, 장애 또는 질환의 치료를 포함하는 유전자 요법)에서 사용하기 위한 것이다.
일부 측면에서, 관심 핵산 서열은 유전자 편집을 위한 표적 부위 (즉, 유전자 편집의 표적인 DNA 또는 RNA 서열 내의 부위)에 삽입하기 위한 것이다. 유전자 편집을 위한 표적 부위는 임의의 유전적 요소, 예컨대 임의의 시스 요소를 포함한다. 일부 측면에서, 유전자 편집을 위한 표적 부위는 유전자의 엑손, 유전자의 인트론, 또는 유전자의 조절 요소 내에 위치된다.
일부 측면에서, 유전자 편집은 엔도뉴클레아제를 포함한다. 일부 측면에서, 엔도뉴클레아제는 게놈 편집 시스템과 연관된다. 일부 측면에서, 엔도뉴클레아제는 예를 들어 귀소 엔도뉴클레아제, 부위-특이적 뉴클레아제, 구조-가이드 뉴클레아제, 또는 RNA-가이드 뉴클레아제 (예를 들어, 트랜스포존-코딩된 RNA-가이드 뉴클레아제)이다.
일부 측면에서, 유전자 편집은 유전자 편집을 위한 표적 부위 내에 이중-가닥 파단을 생성하는 게놈 편집 시스템을 포함한다. 일부 측면에서, 게놈 편집 시스템은 CRISPR-Cas, TALEN, ZFN 또는 메가뉴클레아제 유전자 편집 시스템이다.
일부 측면에서, 관심 핵산 서열은 이중-가닥 파단에서 비-상동성 말단 연결에 의해 유전자 편집을 위한 표적 부위에 삽입된다. 일부 측면에서, 이중-가닥 파단은 CRISPR-Cas 시스템에 의해 생성된다. 일부 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 발현 벡터는 제1 레콤비나제에 대한 제1 및 제2 표적 서열과 관심 핵산 서열 사이 (즉, 5' 슈퍼 서열과 관심 핵산 서열 사이 및 3' 슈퍼 서열과 관심 핵산 서열 사이)에 위치된 Cas 엔도뉴클레아제 표적 서열 (즉, gRNA 표적화 서열과 상동성인 서열)을 포함하며, 여기서 유전자 편집을 위한 표적 부위 (예를 들어, 염색체 내 표적 부위)는 동일한 Cas 엔도뉴클레아제 표적 서열을 포함한다. 예를 들어, 발현 벡터로부터 생성된 박테리아 서열-무함유 벡터 (예를 들어, msDNA) 내 핵산 서열을 플랭킹하는 Cas 엔도뉴클레아제 표적 서열의 프로세싱은 슈퍼 서열의 제거를 초래하며, 선형 공유 폐쇄형 박테리아 서열-무함유 벡터, 예컨대 msDNA를 대신 선형 및 개방형으로 만들고, 비-상동성 말단-연결 사건을 처리할 수 있는 반응성 말단이 갖도록 한다.
일부 측면에서, 관심 핵산 서열은 상동성-지정 복구에 의해 유전자 편집을 위한 표적 부위에 삽입되며, 이는 이중-가닥 파단을 플랭킹하는 서열과 관심 핵산 서열과 연관된 상동성 서열 사이의 재조합을 통해 발생한다.
일부 측면에서, 관심 핵산 서열은 상동성-지정 복구를 뒷받침하기 위해 이중-가닥 파단을 플랭킹하는 서열과 충분한 상동성을 갖는다.
일부 측면에서, 관심 핵산 서열은 5' 및 3' 상동성 아암 (즉, 상동성-지정 복구를 매개하기 위해 이중-가닥 파단을 플랭킹하는 서열과 충분한 상동성을 갖는 서열)에 의해 플랭킹된다.
일부 측면에서, 상동성-지정 복구를 매개하기에 충분한 상동성은 관심 핵산 서열과 이중-가닥 파단을 플랭킹하는 서열 사이 또는 관심 핵산 서열을 플랭킹하는 상동성 아암과 이중-가닥 파단을 플랭킹하는 서열 사이에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 약 100% 상동성을 포함한다. 일부 측면에서, 이중-가닥 파단을 플랭킹하는 서열은 이중-가닥 파단의 약 100개 염기, 약 90개 염기, 약 80개 염기, 약 70개 염기, 약 60개 염기, 약 50개 염기, 약 45개 염기, 약 40개 염기, 약 35개 염기, 약 30개 염기, 약 25개 염기, 약 20개 염기, 약 15개 염기, 약 10개 염기 또는 약 5개 염기 내에 있거나, 이중-가닥 파단을 바로 옆에 플랭킹한다.
일부 측면에서, 상동성-지정 복구는 CRISPR-Cas 시스템에 의해 이루어진다. 일부 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 발현 벡터는 CRISPR-Cas 시스템을 포함한다. 일부 측면에서, 발현 벡터는 Cas 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 면역침묵된 Cas9-β2)를 코딩하는 서열의 각 측면을 플랭킹하는 tRNA-gRNA 폴리시스트론을 포함한다. 예시적인 측면은 도 49에 표시된다. 일부 측면에서, 발현 벡터는 인트론 내 tRNA-gRNA 폴리시스트론을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 5'UTR (예를 들어, 5'UTR1)을 포함한다. 일부 측면에서, 발현 벡터는 tRNA-gRNA 폴리시스트론을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 키메라 인트론을 포함한다. 일부 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 EF1-알파 프로모터는 고유 인트론에 tRNA-gRNA 폴리시스트론을 포함한다. 일부 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 폴리아데닐화 신호 또는 3'UTR은 tRNA-gRNA 폴리시스트론을 포함한다. 예를 들어, 플랭킹 tRNA-gRNA 폴리시스트론을 포함하는 벡터 (즉, 발현 벡터 또는 박테리아 서열-무함유 벡터 (예를 들어, msDNA))로부터 Cas 엔도뉴클레아제의 발현 시, gRNA는 유리 RNA로서 절개되고, 유전자 편집을 위한 표적 부위 (예를 들어, 염색체 내 표적 부위) 뿐만 아니라 벡터 상의 플랭킹 gRNA 부위로 Cas 엔도뉴클레아제를 표적화한다. 이는 벡터로부터 Cas 엔도뉴클레아제의 자기-제한을 초래하고, 이는 Cas 엔도뉴클레아제의 추가 발현을 제한한다. 이 프로세스의 개략도는 도 50에 나타냈으며, 이는 또한 별도의 벡터 상에 상동성 아암에 의해 플랭킹된 관심 핵산 (즉, 관심 유전자, GOI)을 사용한 상동성-지정 복구의 매개를 보여준다. 일부 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 발현 벡터는 예를 들어 도 51의 시나리오 1에 나타낸 바와 같이 상동성 아암에 의해 플랭킹된 관심 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 관심 핵산 서열 및 자기-제한 CRISPR-Cas 시스템은 도 51의 시나리오 2에 나타낸 바와 같이 본원에 기재된 바와 같은 단일 발현 벡터에 위치된다. 후자의 측면에서, 자기-제한 CRISPR-Cas 시스템을 포함하는 서열은 상동성 아암에 의해 플랭킹된 관심 핵산 서열을 포함하는 서열에 대해 5'에 위치된다.
일부 측면에서, 관심 핵산 서열은 유전자 편집을 위한 표적 부위와 상동성이고, 표적 부위와 비교하여 하나 이상의 뉴클레오티드 삽입, 결실, 역위 또는 재배열을 포함한다. 일부 측면에서, 관심 핵산은 게놈 서열, 코딩 영역, 엑손, 인트론, 또는 표적 부위에서 상동성 서열을 대체하는 이의 임의의 부분이다.
일부 측면에서, 관심 핵산 서열은 유전자 편집을 위한 표적 부위와 비-상동성이다.
일부 측면에서, 관심 핵산 서열은 누락된 기능을 복원하거나, 비정상적인 기능을 수정하거나, 유전자 편집을 위한 표적 부위와 연관된 추가 기능을 제공한다.
일부 측면에서, 관심 핵산 서열은 유전자 편집을 위한 표적 부위와 연관된 유전자 발현의 녹아웃을 위한 것이다 (즉, 유전자 침묵).
일부 측면에서, 관심 핵산 서열은 생체내 유전자 편집을 위한 것이다.
일부 측면에서, 관심 핵산 서열은 시험관내 유전자 편집을 위한 것이다.
일부 측면에서, 관심 핵산 서열은 생체외 유전자 편집을 위한 것이다 (예를 들어, 세포 요법, 예컨대 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 요법).
일부 측면에서, 유전자 편집은 후성유전학적 변형을 포함하고, 본원에 기재된 바와 같은 발현 벡터는 관심 핵산으로서 후성유전학적 이펙터 분자를 포함한다. 일부 측면에서, 후성유전학적 이펙터 분자는 예를 들어 아세틸화 또는 탈아세틸화, 메틸화 또는 탈메틸화, 또는 인산화 또는 탈인산화를 매개한다. 일부 측면에서, 후성유전학적 이펙터 분자는 아세틸화 또는 탈아세틸화, 메틸화 또는 탈메틸화, 또는 인산화 또는 탈인산화를 억제한다. 일부 측면에서, 후성유전학적 변형은 히스톤 변형이다. 일부 측면에서, 히스톤 변형은 히스톤 아세틸화이고, 관심 핵산은 히스톤 아세틸트랜스퍼라제이다. 일부 측면에서, 히스톤 변형은 히스톤 탈아세틸화이고, 관심 핵산은 히스톤 데아세틸라제이다. 일부 측면에서, 후성유전학적 변형은 DNA 변형이다. 일부 측면에서, DNA 변형은 DNA 메틸화이고, 관심 핵산은 DNA 메틸라제이다. 일부 측면에서, DNA 변형은 DNA 탈메틸화이고, 관심 핵산은 DNA 탈메틸라제이다. 일부 측면에서, 후성유전학적 이펙터 분자는 염색체 상의 한 위치에 이펙터를 표적화하기 위해 표적화 분자, 예컨대 DNA-결합 분자에 융합된다.
일부 측면에서, 발현 카세트는 다유전자성이며, 즉, 발현 카세트는 각각 2개 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 2개 이상의 관심 핵산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 발현 카세트는 폴리펩티드를 코딩하는 각 핵산 서열 사이에 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하여, 발현 카세트의 번역 생성물이 세포내에서 2개 이상의 폴리펩티드로 절단되도록 한다. 일부 측면에서, 자기-절단 펩티드는 2A 자기-절단 펩티드이다. 일부 측면에서, 2A 자기-절단 펩티드는 돼지 테스코바이러스-1로부터의 P2A이다. 일부 측면에서, 2A 자기-절단 펩티드는 토세아 아시그나(thosea asigna) 바이러스 2A로부터의 T2A이다. 일부 측면에서, 자기-절단 펩티드는 2A, P2A 및 T2A 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 일부 측면에서, 자기-절단 펩티드는 P2A 및 T2A를 포함한다.
일부 측면에서, 발현 카세트는 유전자 발현에 대한 마커를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 유전자 발현에 대한 마커는 형광 리포터 유전자, 예컨대 녹색 형광 단백질 (GFP, 예를 들어 향상된 GFP (eGFP)), 적색 형광 단백질 (RFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 또는 근적외선 형광 단백질 (iRFP); 생물발광 리포터 유전자, 예컨대 루시퍼라제 (예를 들어, 나노루시퍼라제, 즉, NanoLuc® (NLuc), England et al., Bioconjug. Chem. 27(5):1175-1187 (2016), 프로메가 코포레이션); 선택가능한 항생제 마커; 또는 LacZ이다. 일부 측면에서, 발현 카세트는 유전자 발현에 대한 마커를 코딩하는 핵산 서열과 폴리펩티드를 코딩하는 임의의 다른 핵산 서열 사이에 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
발현 카세트는 관심 핵산 서열(들)에 작동가능하게 연결된 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 발현 제어 영역을 함유할 수 있다. 일부 측면에서, 발현 제어 영역은 프로모터, 인핸서, 오퍼레이터, 리프레서, 리보솜 결합 부위, 번역 리더 서열, 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, RNA 프로세싱 부위, 이펙터 결합 부위, 스템-루프 구조, 전사 종결 신호, 또는 이들의 조합이다.
일부 측면에서, 발현 벡터는 박테리아 서열-무함유 벡터를 생산하기 위한 것이다. 일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 원형 공유 폐쇄형 벡터이다. 일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 선형 공유 폐쇄형 벡터이다.
B. 벡터 생산 시스템
유도성 프로모터의 제어 하에 레콤비나제를 코딩하는 재조합 세포를 포함하는 벡터 생산 시스템이 본원에 제공되며, 여기서 재조합 세포는 제1 레콤비나제에 대한 제1 및 제2 표적 서열 및 하나 이상의 추가 레콤비나제에 대한 하나 이상의 추가 표적 서열을 함유하는 본원에 기재된 바와 같은 발현 벡터를 포함하고, 여기서 레콤비나제는 제1 레콤비나제에 대한 제1 및 제2 표적 서열 또는 하나 이상의 추가 레콤비나제에 대한 하나 이상의 추가 표적 서열 중 하나를 표적화한다.
벡터 생산 시스템에 사용하기에 적합한 숙주 세포는 미생물 세포, 예를 들어 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜라이 세포, 및 효모 세포, 예컨대 에스. 세레비시아에(S. cerevisiae)를 포함한다. 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 (예를 들어, K1 계통 (ATCC CCL 61) 또는 Pro5 변이체 (ATCC CRL 1281)); CV-1 계통 (ATCC CCL 70), COS-1 계통 (ATCC CRL 1650) 또는 COS-7 계통 (ATCC CRL 1651; 뮤린 L-세포; 뮤린 3T3 세포 (ATCC CRL 1658)의 SV40-형질전환된 아프리카 녹색 원숭이 신장으로부터 유래된 섬유모세포-유사 세포; 뮤린 C127 세포; 293 계통의 인간 배아 신장 세포 (ATCC CRL 1573); HeLa 계통의 것을 포함하는 인간 암종 세포 (ATCC CCL 2); 및 계통 IMR-32 (ATCC CCL 127), SK-N-MC (ATCC HTB 10) 또는 SK-N-SH (ATCC HTB 11)의 신경모세포종 세포를 포함하는 포유동물 숙주 세포가 또한 사용될 수 있다.
적합한 레콤비나제는 TelN, Tel, Tel (gp26 K02 파지), Cre, Flp, phiC31, Int, 및 다른 람도이드 파지 인테그라제, 예를 들어 phi 80, HK022 및 HP1 레콤비나제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 본원에 기재된 바와 같은 레콤비나제에 대한 표적 서열에서 DNA 교환을 촉매작용한다. 일부 측면에서, 레콤비나제는 TelN, Tel, Cre 또는 Flp이다.
일부 측면에서, 재조합 세포는 유도성 프로모터의 제어 하에 엔도뉴클레아제를 추가로 코딩하고, 여기서 엔도뉴클레아제는 발현 벡터에서 엔도뉴클레아제 표적 서열을 표적화한다.
적합한 엔도뉴클레아제는 엔도뉴클레아제 표적 서열에서 폴리뉴클레오티드를 절단한다. 일부 측면에서, 엔도뉴클레아제는 귀소 엔도뉴클레아제이다. 일부 측면에서, 귀소 엔도뉴클레아제는 I-AniI, I-CeuI, I-ChuI, I-CpaI, I-CpaII, I-CreI, I-DmoI, H-DreI, I-HmuI, I-HmuII, I-LlaI, I-MsoI, PI-PfuI, PI-PkoII, I-PorI, I-PpoI, PI-PspI, I-ScaI, I-SceI, PI-SceI, I-SceII, I-SecIII, I-SceIV, I-SceV, I-SceVI, I-SceVII, I-Ssp6803I, I-TevI, I-TevII, I-TevIII, PI-TliI, PI-TliII, I-Tsp061I 또는 I-Vdi141I이다. 일부 측면에서, 엔도뉴클레아제는 I-SceI이다. 일부 측면에서, 엔도뉴클레아제는 PI-SceI이다. 일부 측면에서, 재조합 세포는 엔도뉴클레아제를 포함하는 뉴클레아제 게놈 편집 시스템을 코딩한다. 일부 측면에서, 게놈 편집 시스템은 CRISPR-Cas, TALEN, ZFN 또는 메가뉴클레아제 시스템이다. 일부 측면에서, 뉴클레아제 게놈 편집 시스템은 부류 1 또는 부류 2 CRISPR-Cas 시스템이다. 일부 측면에서, 뉴클레아제 게놈 편집 시스템은 유형 I, II, III, IV, V, 또는 VI CRISPR-Cas 시스템이다. 일부 측면에서, CRISPR-Cas 시스템 중 Cas 엔도뉴클레아제는 Cas9 (예를 들어, SpCas9, SaCas9, FnCas9 또는 NmCas9), Cas9 변이체 (예를 들어, Casβ9, xCas9, SpCas9-NG, SpCas9-NRRH, SpCas9-NRCH, SpCas9-NRTH, SpG, SpRY), Cas3, Cas12 (예를 들어, Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d 또는 Cas12e), Cas13 (예를 들어, Cas13a, Cas13b, Cas13c 또는 Cas13d), 또는 Cas14이다.
레콤비나제, 또는 레콤비나제 및 엔도뉴클레아제를 코딩하는 재조합 숙주 세포는 널리 공지된 기술을 사용하여 제조된다. 예를 들어, 선택된 레콤비나제 또는 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열은 세포 형질전환을 위한 적절한 조건 하에 적합한 벡터를 사용하여 세포에 도입된다. 재조합 숙주 세포는 발현 벡터를 통해, 또는 레콤비나제-코딩 및/또는 엔도뉴클레아제-코딩 핵산 서열의 숙주 세포 게놈으로의 통합에 의해 형질전환될 수 있다. 엔도뉴클레아제가 뉴클레아제 게놈 편집 시스템과 연관된 측면에서, 숙주 세포는 모든 구성성분을 포함하는 하나 이상의 발현 벡터를 사용한 숙주 세포의 형질전환, 모든 구성성분의 숙주 세포 게놈으로의 통합, 또는 구성성분의 형질전환 및 통합의 혼합물에 의해 뉴클레아제 게놈 편집 시스템의 모든 구성성분을 코딩하도록 설계될 수 있다. 일부 측면에서, 숙주 세포는 Cas 또는 Cas-유사 엔도뉴클레아제 및 gRNA를 코딩한다.
뉴클레아제 게놈 편집 시스템의 엔도뉴클레아제를 포함하는 레콤비나제 또는 엔도뉴클레아제의 발현은 유도성 프로모터, 즉 특정 물리적 또는 화학적 조건 또는 자극 하에 활성화되는 프로모터의 제어 하에 이루어진다. 일부 측면에서, 유도성 프로모터는 열-조절성, 화학적-조절성, IPTG 조절성, 글루코스-조절성, 아라비노스 유도성, T7 폴리머라제 조절성, 저온-충격 유도성, pH 유도성, 또는 이들의 조합이다.
제1 레콤비나제에 대한 제1 및 제2 표적 서열 및 하나 이상의 추가 레콤비나제에 대한 하나 이상의 추가 표적 서열을 함유하는 본원에 기재된 바와 같은 발현 벡터를 포함하는 재조합 세포가 본원에 제공된다. 일부 측면에서, 재조합 세포는 제1 레콤비나제 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 레콤비나제 중 하나 이상을 코딩한다. 일부 측면에서, 재조합 세포는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 엔도뉴클레아제를 코딩한다. 일부 측면에서, 재조합 세포는 본원에 기재된 바와 같은 뉴클레아제 게놈 편집 시스템을 코딩한다.
레콤비나제의 발현에 적합한 조건 하에 본원에 기재된 바와 같은 벡터 생산 시스템을 인큐베이션하는 것을 포함하는, 박테리아 서열-무함유 벡터를 생산하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 측면에서, 방법은 재조합 세포에 의해 코딩된 엔도뉴클레아제의 발현에 적합한 조건 하에 벡터 생산 시스템을 인큐베이션하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 방법은 재조합 세포에 의해 코딩된 뉴클레아제 게놈 편집 시스템의 발현에 적합한 조건 하에 벡터 생산 시스템을 인큐베이션하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 방법은 박테리아 서열-무함유 벡터를 수확하는 것을 추가로 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 박테리아 서열-무함유 벡터를 생산하는 방법에 의해 생산된 박테리아 서열-무함유 벡터가 본원에 제공된다.
III. 박테리아 서열-무함유 벡터
하기를 포함하는 박테리아 서열-무함유 벡터가 본원에 제공된다: (a) 관심 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트, 및 (b) 하기 중 하나 이상: (i) 발현 카세트 내 또 다른 인핸서 또는 프로모터에 대해 5'에 위치된 서열식별번호: 12와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 합성 인핸서, (ii) 발현 카세트 내 프로모터에 대해 5'에 위치된 CMV 인핸서, (iii) 인트론을 포함하는 5'UTR, 여기서 5'UTR은 프로모터와 관심 핵산 서열 사이에서 발현 카세트에 통합됨, (iv) 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된 척추동물 염색질 인슐레이터, (v) 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된 WPRE, (vi) 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된 S/MAR, 또는 (vii) 발현 카세트에 대해 5'에 위치된 DTS.
일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 발현 카세트 내 또 다른 인핸서 또는 프로모터에 대해 5'에 위치된 서열식별번호: 12와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 합성 인핸서를 포함한다. 일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 발현 카세트 내 또 다른 인핸서 또는 프로모터에 대해 5'에 위치된 서열식별번호: 12의 핵산 서열을 포함하는 합성 인핸서를 포함한다. 일부 측면에서, 합성 인핸서는 핵산 서열의 다중 인접 카피, 예컨대, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 인접 카피를 포함한다. 일부 측면에서, 합성 인핸서는 핵산 서열의 3개 인접 카피를 포함한다. 일부 측면에서, 합성 인핸서는 서열식별번호: 46과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 합성 인핸서는 서열식별번호: 46의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 합성 인핸서는 닭 β-액틴 프로모터의 5' 말단에 통합된다. 일부 측면에서, 서열식별번호: 47과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 키메라 인트론은 닭 β-액틴 프로모터의 3' 말단 및 관심 핵산 서열의 5'에 통합된다. 일부 측면에서, 서열식별번호: 47의 핵산 서열을 포함하는 키메라 인트론은 닭 β-액틴 프로모터의 3' 말단 및 관심 핵산 서열의 5'에 통합된다.
일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 발현 카세트 내 프로모터에 대해 5'에 위치된 CMV 인핸서를 포함한다. 일부 측면에서, CMV 인핸서는 서열식별번호: 12와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 합성 인핸서의 3' 말단에 통합된다. 일부 측면에서, CMV 인핸서는 서열식별번호: 12의 핵산 서열을 포함하는 합성 인핸서의 3' 말단에 통합된다. 일부 측면에서, CMV 인핸서는 합성 인핸서의 다중 인접 카피의 3' 말단에, 예컨대, 예를 들어 합성 인핸서의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 인접 카피의 3' 말단에 통합된다. 일부 측면에서, CMV 인핸서는 합성 인핸서의 3개 인접 카피의 3' 말단에 통합된다. 일부 측면에서, CMV 인핸서는 서열식별번호: 46과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열의 3' 말단에 통합된다. 일부 측면에서, CMV 인핸서는 서열식별번호: 46의 핵산 서열의 3' 말단에 통합된다. 일부 측면에서, CMV 프로모터는 CMV 인핸서의 3' 말단 및 관심 핵산 서열의 5'에 통합된다.
일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 관심 핵산 서열에 대해 5'에 위치된 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 38 또는 서열식별번호: 39와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 관심 핵산 서열에 대해 5'에 위치된 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 38 또는 서열식별번호: 39의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 38 또는 서열식별번호: 39와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열, 또는 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 38 또는 서열식별번호: 39의 핵산 서열은 관심 핵산 서열에 대해 5'에 위치된 발현 카세트 내 모든 조절 요소를 포함한다.
일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 인트론을 포함하는 5'UTR을 포함하고, 여기서 5'UTR (즉, 인트론을 포함하는 5'UTR)은 프로모터와 관심 핵산 서열 사이에서 발현 카세트에 통합된다.
일부 측면에서, 5'UTR은 5'UTR이 결여된 동일한 박테리아 서열-무함유 벡터와 비교하여 박테리아 서열-무함유 벡터로부터의 트랜스진 전사체 스플라이싱 및 번역을 개선하기 위한 것이다.
일부 측면에서, 인트론은 서열식별번호: 1과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 인트론은 서열식별번호: 1의 핵산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 5'UTR은 서열식별번호: 2와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 5'UTR은 서열식별번호: 2의 핵산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 5'UTR은 서열식별번호: 4와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 5'UTR은 서열식별번호: 4의 핵산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 5'UTR은 인트론 내에 통합된 비-코딩 서열을 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 인트론은 서열식별번호: 1과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일하거나 서열식별번호: 1을 포함하고, 비-코딩 서열은 서열식별번호: 1의 위치 25 내지 55로부터의 임의의 2개의 뉴클레오티드에 상응하는 인트론 내 2개의 뉴클레오티드 사이에 통합된다.
일부 측면에서, 비-코딩 서열은 비-원핵생물성 및 비-바이러스성이다. 일부 측면에서, 비-코딩 서열은 진핵생물이다. 일부 측면에서, 비-코딩 서열은 인트론, UCOE, S/MAR, SV40 인핸서 서열 (예를 들어, 하나 또는 하나 초과의 SV40 인핸서 서열, 예컨대 2, 3, 4, 5개 이상의 SV40 인핸서 서열), 척추동물 염색질 인슐레이터 (예를 들어, cHS4), WPRE, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 측면에서, 비-코딩 서열은 S/MAR을 포함한다. 일부 측면에서, S/MAR은 서열식별번호: 9로서 본원에 제공된 MAR-5이다.
일부 측면에서, 5'UTR은 서열식별번호: 3과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 5'UTR은 서열식별번호: 3을 포함한다.
일부 측면에서, 5'UTR은 서열식별번호: 5와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 5'UTR은 서열식별번호: 5를 포함한다.
일부 측면에서, 5'UTR은 닭 β-액틴 프로모터와 관심 핵산 서열 사이에서 발현 카세트에 통합된다.
일부 측면에서, 5'UTR은 CMV 프로모터와 관심 핵산 서열 사이에서 발현 카세트에 통합된다.
일부 측면에서, 5'UTR은 프로모터와 관심 핵산 서열 사이에서 발현 카세트에 통합되고, 여기서 프로모터는 CMV 인핸서의 3' 말단에 통합된다. 일부 측면에서, CMV 인핸서는 서열식별번호: 12와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 합성 인핸서의 3' 말단에 통합된다. 일부 측면에서, CMV 인핸서는 서열식별번호: 12의 핵산 서열을 포함하는 합성 인핸서의 3' 말단에 통합된다. 일부 측면에서, CMV 인핸서는 합성 인핸서의 다중 인접 카피의 3' 말단에, 예컨대, 예를 들어 합성 인핸서의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 인접 카피의 3' 말단에 통합된다. 일부 측면에서, CMV 인핸서는 합성 인핸서의 3개 인접 카피의 3' 말단에 통합된다. 일부 측면에서, CMV 인핸서는 서열식별번호: 46과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열의 3' 말단에 통합된다. 일부 측면에서, CMV 인핸서는 서열식별번호: 46의 핵산 서열의 3' 말단에 통합된다.
일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 관심 핵산 서열의 3' 말단에 통합된 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 일부 측면에서, 폴리아데닐화 신호는 제노푸스 라에비스 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호, 인간 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호, 또는 하이브리드 제노푸스 라에비스 및 인간 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 일부 측면에서, 폴리아데닐화 신호는 제노푸스 라에비스 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호, 인간 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호, 또는 하이브리드 제노푸스 라에비스 및 인간 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호의 다중 카피, 예컨대, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개 카피를 포함한다. 일부 측면에서, 폴리아데닐화 신호는 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14 또는 서열식별번호: 15와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 폴리아데닐화 신호는 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14 또는 서열식별번호: 15의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 폴리아데닐산 꼬리 (즉, 폴리(A) 꼬리는 폴리아데닐화 신호의 3' 말단에 위치된다. 일부 측면에서, 폴리(A) 꼬리는 길이가 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120개 이상의 잔기이다. 일부 측면에서, 폴리아데닐화 신호 및 폴리(A) 꼬리를 포함하는 서열은 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 17 또는 서열식별번호: 18과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일하다. 일부 측면에서, 폴리아데닐화 신호 및 폴리(A) 꼬리를 포함하는 서열은 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 17 또는 서열식별번호: 18을 포함한다.
일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 발현 카세트 내 척추동물 염색질 인슐레이터를 포함한다. 일부 측면에서, 척추동물 염색질 인슐레이터는 cHS4이다. 일부 측면에서, 척추동물 염색질 인슐레이터는 본원에 기재된 바와 같은 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된다. 일부 측면에서, 척추동물 염색질 인슐레이터는 본원에 기재된 바와 같은 5'UTR의 인트론 내에 통합된다.
일부 측면에서, 척추동물 염색질 인슐레이터는 서열식별번호: 8과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 척추동물 염색질 인슐레이터는 서열식별번호: 8을 포함한다.
일부 측면에서, 척추동물 염색질 인슐레이터는 척추동물 염색질 인슐레이터 없이 동일한 박테리아 서열-무함유 벡터와 비교하여 박테리아 서열-무함유 벡터의 확립 (즉, 형질감염 효율)을 개선하기 위한 것이다.
일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 발현 카세트 내 WPRE를 포함한다. 일부 측면에서, WPRE는 본원에 기재된 바와 같은 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된다. 일부 측면에서, WPRE는 본원에 기재된 바와 같은 S/MAR의 3' 말단 및 본원에 기재된 바와 같은 폴리아데닐화 신호의 5' 말단에서 발현 카세트에 통합된다. 일부 측면에서, WPRE는 본원에 기재된 바와 같은 5'UTR의 인트론 내에 통합된다.
일부 측면에서, WPRE는 서열식별번호: 11과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, WPRE는 서열식별번호: 11을 포함한다.
일부 측면에서, WPRE는 WPRE가 결여된 동일한 박테리아 서열-무함유 벡터와 비교하여 박테리아 서열-무함유 벡터로부터의 트랜스진의 발현을 개선한다.
일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 발현 카세트 내 S/MAR을 포함한다. 일부 측면에서, S/MAR은 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된다. 일부 측면에서, S/MAR은 본원에 기재된 바와 같은 관심 핵산 서열의 3' 말단 및 WPRE의 5' 말단에서 발현 카세트에 통합된다. 일부 측면에서, S/MAR은 본원에 기재된 바와 같은 5'UTR의 인트론 내에 통합된다.
일부 측면에서, S/MAR은 MAR-3, MAR-4 또는 MAR-5이다. 일부 측면에서, S/MAR은 서열식별번호: 9와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, S/MAR은 서열식별번호: 9를 포함한다.
일부 측면에서, S/MAR은 인간 CSP-B MAR 또는 CSP-C MAR이다. 일부 측면에서, S/MAR은 서열식별번호: 10과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, S/MAR은 서열식별번호: 10을 포함한다.
일부 측면에서, S/MAR은 S/MAR이 결여된 동일한 박테리아 서열-무함유 벡터와 비교하여 박테리아 서열-무함유 벡터의 발현 수준, 안정성 및/또는 내구성을 개선하기 위한 것이다 (예를 들어, 에피솜 유지 및 복제, 예컨대 딸 세포로의 벡터의 확장 및 분할에 의해, 및/또는 후성유전학적 침묵 방지에 의해).
일부 측면에서, 상기 기재된 바와 같은 (b)(i)-(b)(v) 중 임의의 하나 이상을 포함하는 박테리아 서열-무함유 벡터 (즉, DTS 없이)는 발현 카세트의 각 측면을 플랭킹하는 인핸서 서열을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 발현 카세트의 각 측면을 플랭킹하는 인핸서 서열은 발현 카세트의 각 측면을 플랭킹하는 적어도 2개의 인핸서 서열이다. 일부 측면에서, 인핸서 서열은 SV40 인핸서 서열이다.
일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 DTS를 포함한다. 일부 측면에서, DTS는 발현 카세트에 대해 5'에 위치된다. 일부 측면에서, DTS는 SV40 인핸서 서열이다. 일부 측면에서, DTS는 세포-특이적이다. 일부 측면에서, DTS는 평활근 세포, 배아 줄기 세포, 유형 II 폐포세포, 내피 세포 또는 골모세포에 특이적이다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 박테리아 서열-무함유 벡터는 발현 카세트 내 UCOE를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, UCOE는 발현 카세트 내 프로모터 또는 임의의 인핸서에 대해 5'에 위치된다. 일부 측면에서, UCOE는 본원에 기재된 바와 같은 5'UTR의 인트론 내에 통합된다.
일부 측면에서, UCOE는 A2UCOE이다. 일부 측면에서, UCOE는 서열식별번호: 6과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, UCOE는 서열식별번호: 6이다.
일부 측면에서, UCOE는 SRF-UCOE이다. 일부 측면에서, UCOE는 서열식별번호: 7과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, UCOE는 서열식별번호: 7이다.
일부 측면에서, UCOE는 UCOE가 결여된 동일한 박테리아 서열-무함유 벡터와 비교하여 박테리아 서열-무함유 벡터로부터의 트랜스진의 발현을 개선한다.
일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 발현 카세트 내 인핸서-1을 포함한다. 일부 측면에서, 인핸서-1은 발현 카세트 내 프로모터 또는 임의의 다른 인핸서에 대해 5'에 통합된다. 일부 측면에서, 인핸서-1은 UCOE의 3' 말단과 CMV 인핸서의 5' 말단 사이에 통합된다. 일부 측면에서, 인핸서-1은 서열식별번호: 12와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 인핸서-1은 서열식별번호: 12이다.
일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 발현 카세트 내 CMV, EF1, SV40, CAG, Rho, VDM2, HCR 또는 HLP 프로모터, 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 발현 카세트 내 CMV 프로모터 변이체를 포함한다.
일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 발현 카세트 내 EF1-알파 프로모터를 포함한다. 일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 발현 카세트 내 CMV 인핸서 및 EF1-알파 프로모터를 포함한다.
일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호의 2개 카피를 포함하는 발현 카세트 내 3'UTR을 포함한다. 일부 측면에서, 3'UTR은 관심 핵산 서열에 대해 3'에 통합된다.
일부 측면에서, 3'UTR은 제노푸스 라에비스 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호의 2개 카피를 포함한다. 일부 측면에서, 3'UTR은 서열식별번호: 13과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 3'UTR은 서열식별번호: 13이다.
일부 측면에서, 3'UTR은 인간 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호의 2개 카피를 포함한다. 일부 측면에서, 3'UTR은 서열식별번호: 14와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 3'UTR은 서열식별번호: 14이다.
일부 측면에서, 3'UTR은 제노푸스 라에비스 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호의 1개 카피 및 인간 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호의 1개 카피를 포함한다. 일부 측면에서, 3'UTR은 서열식별번호: 15와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 3'UTR은 서열식별번호: 15이다.
일부 측면에서, 3'UTR은 100 내지 120개의 아데닌 뉴클레오티드, 즉, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119 또는 120개의 아데닌 뉴클레오티드를 포함하는 폴리(A) 꼬리를 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 3'UTR은 서열식별번호: 16과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 3'UTR은 서열식별번호: 16이다.
일부 측면에서, 3'UTR은 서열식별번호: 17과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 3'UTR은 서열식별번호: 17이다.
일부 측면에서, 3'UTR은 서열식별번호: 18과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 3'UTR은 서열식별번호: 18이다.
본원에 기재된 바와 같은 박테리아 서열-무함유 벡터의 관심 핵산 서열은 박테리아 서열-무함유 벡터를 생산하기 위한 발현 벡터와 관련하여 본원에 기재된 임의의 핵산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 박테리아 서열-무함유 벡터는 관심 핵산 서열에 대해 5' 및 3'에 위치된 Cas 엔도뉴클레아제 표적 서열 (즉, gRNA 표적화 서열과 상동성인 서열)을 포함하며, 여기서 유전자 편집을 위한 표적 부위 (예를 들어, 염색체 내 표적 부위)는 동일한 Cas 엔도뉴클레아제 표적 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 박테리아 서열-무함유 벡터는 CRISPR-Cas 시스템을 포함한다. 일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 Cas 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 면역침묵된 Cas9-β2)를 코딩하는 서열의 각 측면을 플랭킹하는 tRNA-gRNA 폴리시스트론을 포함한다. 일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 인트론 내 tRNA-gRNA 폴리시스트론을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 5'UTR (예를 들어, 5'UTR1)을 포함한다. 일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 tRNA-gRNA 폴리시스트론을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 키메라 인트론을 포함한다. 일부 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 EF1-알파 프로모터는 고유 인트론에 tRNA-gRNA 폴리시스트론을 포함한다. 일부 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 폴리아데닐화 신호 또는 3'UTR은 tRNA-gRNA 폴리시스트론을 포함한다. 일부 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 관심 핵산 서열 및 자기-제한 CRISPR-Cas 시스템은 본원에 기재된 바와 같은 단일 박테리아 서열-무함유 벡터에 위치된다. 후자의 측면에서, 자기-제한 CRISPR-Cas 시스템을 포함하는 서열은 상동성 아암에 의해 플랭킹된 관심 핵산 서열을 포함하는 서열에 대해 5'에 위치된다.
본원에 기재된 바와 같은 박테리아 서열-무함유 벡터는 상기 변형의 임의의 조합을 함유할 수 있다. 일부 측면에서, 조합은 상승작용적 효과를 제공한다.
일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 원형 공유 폐쇄형 벡터이다.
일부 측면에서, 박테리아 서열-무함유 벡터는 선형 공유 폐쇄형 벡터이다.
본원에 개시된 바와 같은 박테리아 서열-무함유 벡터를 포함하는 재조합 세포가 본원에 제공된다.
IV. 다른 발현 벡터
상기 기재된 개선 및 변형은 또한 다른 발현 벡터, 예컨대 박테리아 서열-무함유 벡터의 생산보다는 직접적인 유전자 발현을 위해 활용되는 발현 벡터 (그러나 이에 제한되지는 않음)에 적용될 수 있다. 일부 측면에서, 본원에 기재된 핵산 서열은 DNA 서열로서 제공되고, 발현 벡터는 DNA 발현 벡터이다. 일부 측면에서, 본원에 기재된 핵산 서열은 RNA 서열로서 제공되고, 발현 벡터는 RNA 발현 벡터이다. RNA 서열은 본원에 임의의 서열식별번호로서 제공된 DNA 서열에 상응할 수 있거나, 본원에 임의의 서열식별번호로서 제공된 DNA 서열에 상보적인 DNA 서열에 상응할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 핵산 서열의 임의의 조합을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에 제공된다.
인트론, 인트론을 포함하는 5'UTR, 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 3'UTR의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에 제공된다.
서열식별번호: 1, 2, 3, 5, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 중 어느 하나와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에 제공된다. 일부 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 핵산 서열의 3' 말단에 100 내지 120개의 아데닌 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 13, 14 또는 15 중 어느 하나와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열, 및 핵산 서열의 3' 말단에 100 내지 120개의 아데닌 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 1, 2, 3, 5, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상을 포함하는 발현 벡터가 본원에 제공된다. 일부 측면에서, 발현 벡터는 서열식별번호: 1, 2, 3, 5, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 중 어느 하나와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 핵산 서열의 3' 말단에 100 내지 120개의 아데닌 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 13, 14 또는 15 중 어느 하나와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열, 및 핵산 서열의 3' 말단에 100 내지 120개의 아데닌 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 측면에서, 발현 벡터는 서열식별번호: 1, 2, 3, 5, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 측면에서, 발현 벡터는 서열식별번호: 2, 3 또는 5 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 (a) 서열식별번호: 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 (b) 서열식별번호: 13, 14 또는 15 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 핵산 서열의 3' 말단에 100 내지 120개의 아데닌 뉴클레오티드를 포함한다.
하기를 포함하는 발현 벡터가 본원에 제공된다: 인트론을 포함하는 5'UTR, 여기서 5'UTR은 프로모터와 관심 핵산 서열 사이에서 발현 카세트에 통합됨, 및/또는 관심 핵산 서열에 대해 3'에 있는 발현 카세트에 통합된 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호의 2개 카피를 포함하는 3'UTR.
일부 측면에서, 5'UTR은 서열식별번호: 2와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 5'UTR은 서열식별번호: 2의 핵산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 5'UTR은 서열식별번호: 4와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 5'UTR은 서열식별번호: 4의 핵산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 5'UTR은 인트론 내에 통합된 비-코딩 서열을 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 인트론은 서열식별번호: 1과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일하거나 서열식별번호: 1을 포함하고, 비-코딩 서열은 서열식별번호: 1의 위치 25 내지 55로부터의 임의의 2개의 뉴클레오티드에 상응하는 인트론 내 2개의 뉴클레오티드 사이에 통합된다.
일부 측면에서, 비-코딩 서열은 비-원핵생물성 및 비-바이러스성이다. 일부 측면에서, 비-코딩 서열은 진핵생물 서열이다. 일부 측면에서, 비-코딩 서열은 인트론, UCOE, S/MAR, SV40 인핸서 서열 (예를 들어, 하나 또는 하나 초과의 SV40 인핸서 서열, 예컨대 2, 3, 4, 5개 이상의 SV40 인핸서 서열), 척추동물 염색질 인슐레이터 (예를 들어, cHS4), WPRE, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 측면에서, 비-코딩 서열은 S/MAR이다. 일부 측면에서, S/MAR은 서열식별번호: 9로서 본원에 제공된 MAR-5이다.
일부 측면에서, 5'UTR은 서열식별번호: 3과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 5'UTR은 서열식별번호: 3을 포함한다.
일부 측면에서, 5'UTR은 서열식별번호: 5와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 5'UTR은 서열식별번호: 5를 포함한다.
일부 측면에서, 3'UTR은 제노푸스 라에비스 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호의 2개 카피를 포함한다. 일부 측면에서, 3'UTR은 서열식별번호: 13과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 3'UTR은 서열식별번호: 13이다.
일부 측면에서, 3'UTR은 인간 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호의 2개 카피를 포함한다. 일부 측면에서, 3'UTR은 서열식별번호: 14와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 3'UTR은 서열식별번호: 14이다.
일부 측면에서, 3'UTR은 제노푸스 라에비스 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호의 1개 카피 및 인간 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호의 1개 카피를 포함한다. 일부 측면에서, 3'UTR은 서열식별번호: 15와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 3'UTR은 서열식별번호: 15이다.
일부 측면에서, 3'UTR은 100 내지 120개의 아데닌 뉴클레오티드, 즉, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119 또는 120개의 아데닌 뉴클레오티드를 포함하는 폴리(A) 꼬리를 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 3'UTR은 서열식별번호: 16과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 3'UTR은 서열식별번호: 16이다.
일부 측면에서, 3'UTR은 서열식별번호: 17과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 3'UTR은 서열식별번호: 17이다.
일부 측면에서, 3'UTR은 서열식별번호: 18과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 3'UTR은 서열식별번호: 18이다.
서열식별번호: 12와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 합성 인핸서를 포함하는 발현 벡터가 본원에 제공된다. 일부 측면에서, 발현 벡터는 서열식별번호: 12의 핵산 서열을 포함하는 합성 인핸서를 포함한다. 일부 측면에서, 합성 인핸서는 핵산 서열의 다중 인접 카피, 예컨대, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 인접 카피를 포함한다. 일부 측면에서, 합성 인핸서는 핵산 서열의 3개 인접 카피를 포함한다. 일부 측면에서, 합성 인핸서는 서열식별번호: 46과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 합성 인핸서는 서열식별번호: 46의 핵산 서열을 포함한다.
서열식별번호: 35, 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 38 또는 서열식별번호: 39와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터가 본원에 제공된다. 일부 측면에서, 발현 벡터는 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 38 또는 서열식별번호: 39의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 38 또는 서열식별번호: 39와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열, 또는 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 38 또는 서열식별번호: 39의 핵산 서열은 발현 벡터 내 관심 핵산 서열에 대해 5'에 위치된 발현 카세트 내 모든 조절 요소를 포함한다.
V. 조성물
본원에 기재된 바와 같은 발현 벡터 또는 박테리아 서열-무함유 벡터를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.
다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 핵산의 세포로의 도입에 적합하다. 예는 전기천공, 인산칼슘 매개 전달, 뉴클레오펙션, 초음파천공, 열 충격, 자기감염, 리포솜 매개 전달, 미세주사, 미세투사체 매개 전달 (나노입자), 양이온성 중합체 매개 전달 (DEAE-덱스트란, 폴리에틸렌이민, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 등), 또는 세포 융합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
나노입자 담체, 예컨대 리포솜, 미셀 및 중합체성 나노입자는 다양한 메커니즘, 예를 들어 향상된 투과성 및 체류 (EPR) 효과를 통해 치료제의 생체이용률 및 약동학적 특성을 개선하기 위해 조사되었다.
표적 세포로의 선택적 전달을 달성하기 위해 표적화 리간드의 나노입자로의 접합에 의해 추가 개선이 달성될 수 있다. 예를 들어, 수용체-표적화된 나노입자 전달은 시험관내 및 생체내 모두에서 치료 반응을 개선하는 것으로 나타났다. 조사된 표적화 리간드는 폴레이트, 트랜스페린, 항체, 펩티드 및 압타머를 포함한다. 추가적으로, 다중 기능성은 예를 들어 이미지화를 가능하게 하고 세포내 약물 방출을 촉발하기 위해 나노입자의 설계에 혼입될 수 있다.
일부 측면에서, 조성물은 전달제를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 전달제는 나노입자이다. 일부 측면에서, 전달제는 리포솜, 비-지질 중합체성 분자, 엔도솜 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 측면에서, 전달제 (예를 들어, 나노입자)는 표적화 리간드를 포함한다.
일부 측면에서, 조성물은 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 추가로 포함한다. 예를 들어 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd ed. (2013)]을 참조한다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 대상체에게 무독성인 것들을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 조성물 또는 조성물의 하나 이상의 구성성분은 멸균이다. 멸균 구성성분은 예를 들어 여과 (예를 들어, 멸균 여과막) 또는 방사선조사 (예를 들어, 감마 방사선조사)에 의해 제조될 수 있다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 발현 벡터 또는 박테리아 서열-무함유 벡터를 포함하는 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 제약 조성물이다.
본 발명의 부형제는 제약 조성물에 첨가될 때 "제약상 허용되는" 부형제로서 기재될 수 있으며, 이는 부형제가 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 합리적 이익/위험 비율에 상응하는 원하는 접촉 지속시간에 걸쳐 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 문제가 되는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과의 접촉에 적합한 화합물, 물질, 조성물, 염 및/또는 투여 형태임을 의미한다. 일부 측면에서, 용어 "제약상 허용되는"은 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 기타 일반적으로 인정되는 국제 약전에 동물, 더욱 특히 인간에 사용하기 위해 등재된 것을 의미한다. 다양한 부형제가 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 부형제는 알칼리제, 안정화제, 항산화제, 접착제, 분리제, 코팅제, 외부 상 구성성분, 제어-방출 구성성분, 용매, 계면활성제, 습윤제, 완충제, 충전제, 연화제 또는 이들의 조합일 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 본원에 논의된 것 이외에 부형제는 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd ed. (2013)]에 나열된 부형제 (그러나 이에 제한되지는 않음)를 포함할 수 있다. 본원의 특정 분류에 부형제 (예를 들어, "용매")의 포함은 부형제의 역할을 제한하기보다는 예시하기 위한 것이다. 특정 부형제는 여러 분류에 속할 수 있다.
본 개시내용의 제약 조성물은 그의 의도된 투여 경로에 호환가능하도록 제형화된다. 예시적인 투여 경로는 장내, 국소, 비경구, 경구, 폐, 비강내, 정맥내, 표피, 경피, 피하, 근육내 또는 복강내 투여 또는 흡입을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같은 "비경구 투여"는 일반적으로 주사 또는 주입에 의한 장내 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하며, 제한 없이 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 림프내, 병변내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 거미막하, 척수내, 경막외, 흉막내 및 흉골내 주사 및 주입, 뿐만 아니라 생체내 전기천공을 포함한다. 일부 측면에서, 제형은 비-비경구 경로를 통해, 일부 측면에서 경구로 투여된다. 다른 비-비경구 경로는 국소, 표피 또는 점막 투여 경로, 예를 들어 비강내, 질, 직장, 설하 또는 국소 경로를 포함한다.
일부 측면에서, 제약 조성물은 동결건조된다.
VI. 치료 용도 및 방법
본원에 기재된 바와 같은 발현 벡터, 박테리아 서열-무함유 벡터 또는 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
발현 벡터, 박테리아 서열-무함유 벡터 또는 조성물은 질환 또는 장애를 치료하는데 효과적인 임의의 투여 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다.
일부 측면에서, 투여는 장내, 국소, 비경구, 경구, 폐, 비강내, 정맥내, 표피, 경피, 피하, 근육내, 척수강내 또는 복강내 투여, 흡입, 또는 뇌실내 (ICV) 주사, 거대 대조 투여 (ICM) 또는 요추 척수강내 천자 (LIT)를 통한 뇌척수액 (CSF)-기반 전달에 의해 이루어진다.
일부 측면에서, 투여는 비경구 또는 비-비경구 투여에 의해 이루어진다.
일부 측면에서, 비경구 투여는 주사 또는 주입에 의해 이루어진다.
일부 측면에서, 비경구 투여는 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 림프내, 병변내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 안와뒤, 뇌실내, 거미막하, 척수내, 경막외, 흉막내 또는 흉골내 주사 또는 주입, 또는 생체내 전기천공, 뉴클레오펙션, 미세기포 또는 초음파에 의해 이루어진다.
일부 측면에서, 비-비경구 투여는 경구, 국소, 표피, 점막, 비강내, 질, 직장 또는 설하 투여이다.
일부 측면에서, 투여는 경구, 폐, 비강내, 정맥내, 표피, 경피, 피하, 근육내 또는 복강내 투여, 또는 흡입에 의해 이루어진다.
일부 측면에서, 투여는 경구, 비강 또는 폐 투여에 의해 이루어진다. 일부 측면에서, 투여는 비강 투여에 의해 이루어진다.
투여는 예를 들어 1회, 복수회 및/또는 1회 이상의 연장된 기간에 걸쳐 수행될 수 있다. 일부 측면에서, 투여는 1회, 2회 (예를 들어, 제1 투여 후 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주 또는 그 이상 후에 제2 투여), 약 1주마다 1회, 약 1개월마다 1회, 약 2개월마다 1회, 약 3개월마다 1회, 약 4개월마다 1회, 약 6개월마다 1회, 약 1년마다 1회 또는 약 10년마다 1회이다.
본원에 기재된 바와 같은 발현 벡터, 박테리아 서열-무함유 벡터 또는 제약 조성물로부터의 관심 핵산 서열을 유전자 편집을 위한 표적 부위에 삽입하는 것을 포함하는 유전자 편집 방법이 본원에 제공된다.
일부 측면에서, 삽입은 비-상동성 말단 연결에 의해 이루어진다.
일부 측면에서, 삽입은 상동성 지정 복구에 의해 이루어진다. 일부 측면에서, 관심 핵산 서열은 본원에 기재된 바와 같은 5' 및 3' 상동성 아암에 의해 플랭킹된다.
일부 측면에서, 관심 핵산 서열은 유전자 편집을 위한 표적 부위와 상동성이고, 표적 부위와 비교하여 하나 이상의 뉴클레오티드 삽입, 결실, 역위 또는 재배열을 포함한다.
일부 측면에서, 관심 핵산 서열은 유전자 편집을 위한 표적 부위와 비-상동성이다.
일부 측면에서, 관심 핵산 서열은 누락된 기능을 복원하거나, 비정상적인 기능을 수정하거나, 유전자 편집을 위한 표적 부위와 연관된 추가 기능을 제공한다.
일부 측면에서, 관심 핵산 서열은 유전자 편집을 위한 표적 부위와 연관된 유전자 발현의 녹아웃을 위한 것이다.
일부 측면에서, 유전자 편집 방법은 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법이다.
일부 측면에서, 관심 핵산 서열은 생체내 유전자 편집을 위한 것이다.
일부 측면에서, 관심 핵산 서열은 시험관내 유전자 편집을 위한 것이다.
일부 측면에서, 관심 핵산 서열은 생체외 유전자 편집을 위한 것이다 (예를 들어, 세포 요법, 예컨대 CAR T 세포 요법).
일부 측면에서, 방법은 시험관내 방법이다. 일부 측면에서, 시험관내 방법은 발현 벡터, 박테리아 서열-무함유 벡터 또는 제약 조성물을 세포에 투여하는 것을 추가로 포함한다 (예를 들어, 시험관내 또는 생체외 유전자 편집을 위해). 일부 측면에서, 시험관내 방법은 유전자 편집을 위한 엔도뉴클레아제, 또는 게놈 편집 시스템 또는 이의 구성성분 (예를 들어, CRISPR-Cas 시스템을 위한 Cas 엔도뉴클레아제 및 gRNA)을 세포에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 게놈 편집 시스템은 CRISPR-Cas, TALEN, ZFN 또는 메가뉴클레아제 유전자 편집 시스템이다.
일부 측면에서, 방법은 생체내 방법이다. 일부 측면에서, 생체내 방법은 발현 벡터, 박테리아 서열-무함유 벡터 또는 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 생체내 방법은 유전자 편집을 위한 엔도뉴클레아제, 또는 게놈 편집 시스템 또는 이의 구성성분 (예를 들어, CRISPR-Cas 시스템을 위한 Cas 엔도뉴클레아제 및 gRNA)을 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 게놈 편집 시스템은 CRISPR-Cas, TALEN, ZFN 또는 메가뉴클레아제 유전자 편집 시스템이다.
유전자 편집을 위한 엔도뉴클레아제, 또는 게놈 편집 시스템 또는 이의 구성성분은 전기천공 또는 투여에 적용가능한 벡터를 통한 방법을 포함하여 세포 또는 대상체에 핵산 서열 및/또는 폴리펩티드를 투여하기 위해 본원에 기재되거나 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 임의의 방법에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, CRISPR-Cas 시스템을 포함하는 측면에서, Cas 및/또는 gRNA를 코딩하는 RNA가 투여될 수 있거나, Cas 및/또는 gRNA가 직접 투여될 수 있거나, Cas 및/또는 gRNA를 코딩하는 본원에 기재된 바와 같은 박테리아 서열-무함유 벡터 또는 발현 벡터가 투여될 수 있거나, 또는 Cas 및/또는 gRNA를 코딩하는 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 적합한 벡터가 투여될 수 있다.
일부 측면에서, 관심 핵산은 본원에 기재된 바와 같은 선형 공유 폐쇄형 박테리아 서열-무함유 벡터 (즉, msDNA)로 제공된다. 일부 측면에서, 유전자 편집에서 선형 공유 폐쇄형 박테리아 서열-무함유 벡터의 사용은 박테리아 서열-무함유 벡터의 말단이 폐쇄되고 이중 가닥 파단과 비-반응성이기 때문에 임의의 원치않는 비-상동성 말단 연결을 회피한다. 일부 측면에서, 유전자 편집에서 선형 공유 폐쇄형 박테리아 서열-무함유 벡터의 사용은 상동성-지정 복구를 향상시킨다. 일부 측면에서, 상동성-지정 복구를 위한 재조합 비율은 관심 핵산 서열이 원형 슈퍼코일링된 벡터에 의해 제공되는 경우보다 관심 핵산 서열이 본원에 기재된 바와 같은 선형 공유 폐쇄형 박테리아 서열-무함유 벡터에 의해 제공되는 경우 더 높다.
하기 실시예는 제한이 아닌 예시를 위해 제공된다.
실시예
실시예 1 - 키메라 인트론 또는 5'UTR을 함유하는 발현 벡터
A. 발현 벡터
부모 미니스트링 발현 벡터 (메디파지 바이오슈티칼스, 인크.(Mediphage Bioceuticals, Inc.), 캐나다 토론토, 미국 특허 번호 9,290,778 및 9,862,954)의 eGFP 코딩 서열인 pGL2-SS*-CAG-eGFP-BGpA-SS*를, 부모 벡터의 2개의 특수화된 슈퍼 서열 (SS*) 부위 사이의 향상된 녹색 형광 단백질 (eGFP) 및 세포외 발현을 위한 분비 서열로 변형된 NanoLuc® 루시퍼라제 리포터 (NLuc, 프로메가 코포레이션)를 코딩하는 발현 카세트로 대체함으로써 다유전자성 발현 벡터를 제조하였다.
부모 벡터 및 다유전자성 벡터의 발현 카세트는 CAG 프로모터를 함유하였으며, 이는 사이토메갈로바이러스 (CMV) 인핸서, 닭 β-액틴으로부터의 프로모터 및 키메라 인트론을 포함하는 합성 프로모터이다.
다유전자성 발현 벡터의 맵은 도 1에 표시되어 있으며 (pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*), 이는 CAG 프로모터를 함유하는 다유전자성 발현 카세트를 플랭킹하는 레콤비나제 표적 서열 (telL, FRT (minimal)(FRT (최소)) 및 loxP)을 갖는 특수화된 슈퍼 서열 부위 (SS*), P2A 및 T2A 자기-절단 펩티드에 의해 연결된 향상된 녹색 형광 단백질 (eGFP) 및 분비된 나노-루시퍼라제 (SecNLuc)를 코딩하는 서열 (SecNLuc-2A-eGFP), 및 토끼 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호 (BGpA)를 함유한다. 벡터에 대한 핵산 서열은 서열식별번호: 19로서 제공된다.
5'UTR과 함께 동일한 eGFP 및 Nluc 서열을 pcDNA3.1 벡터 (써모피셔 사이언티픽)에 클로닝함으로써 제2 다유전자성 발현 벡터를 제조하였다. 발현 벡터의 맵은 도 2에 표시되어 있으며 (벡터 pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA), 이는 CMV 인핸서/프로모터를 함유하는 다유전자성 발현 카세트, P2A 자기-절단 펩티드에 의해 연결된 eGFP 및 SecNLuc를 코딩하는 서열 (SecNLuc-P2A-eGFP), 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호 (bGHpA)를 함유한다. 벡터에 대한 핵산 서열은 서열식별번호: 20으로서 제공된다.
B. HEK293 세포의 형질감염
접착성 인간 배아 신장 293 (HEK293) 세포를 1x105개 세포/웰로 24-웰 플레이트에 시딩하였다.
발현 벡터 (1 μg) 및 리포펙타민 (3 μL)의 복합체를 제조하고, (1) pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*, (2) pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA, 및 (3) pGL2-SS*-CAG-eGFP-BGpA-SS* 각각에 대한 표준 작업 절차를 사용하여 인큐베이션하였다.
3개의 복합체를 사용하여 개별 웰에서 전기천공을 통해 HEK293 세포를 별도로 형질감염시킨 후, 48시간 동안 인큐베이션하였다. 다른 웰의 HEK293 세포를 음성 대조군으로서 플라스미드를 함유하지 않는 3 μL 리포펙타민으로 처리하였다.
형질감염 48시간 후 세포질성 GFP 발현 및 루시퍼라제 발현에 대해 세포를 평가하였다.
C. 세포질성 GFP 발현
다유전자성 발현 벡터에 의한 형질감염 효율 및 유전자 발현 수준의 척도로서 세포질성 GFP 발현을 사용하였다. 형광 현미경검사에 의해 발현을 평가하고, 실험적 발현 벡터 (pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS* 및 pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA)의 평균 GFP 발현/강도를 음성 대조군 (플라스미드 없이 리포펙타민으로 처리된 세포) 및 양성 대조군 (pGL2-SS*-CAG-eGFP-BGpA-SS*) (본원에서 부모 플라스미드 CAG-GFP, 즉, PP-CAG-GFP로도 지칭됨)에 비해 측정하였다.
자동 노출 모드 하에 형광 세포의 라이브 이미지화는 실험적 발현 벡터가 유사한 발현을 갖는 pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*의 키메라 인트론 및 pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA의 5'UTR과 함께 GFP를 생산하였음을 나타내었다. 도 3 및 4를 참조한다. 실험적 발현 벡터에 의한 다유전자성 발현은 양성 대조군과 비교하여 평균 상대적 형광 강도에 기초한 GFP 발현에 영향을 미치지 않았다. Id. 실험적 발현 벡터로 형질감염된 세포의 평균 형광 강도는 음성 대조군 세포보다 적어도 3배 더 높았다. 도 4를 참조한다.
D. 루시퍼라제 발현
제조업체 프로토콜에 따라 나노-글로(Nano-Glo)® 루시퍼라제 검정 시스템 (프로메가)을 사용하여 형질감염된 세포 및 음성 대조군 세포의 배지에서 분비된 루시퍼라제의 강도를 측정함으로써 루시퍼라제 발현을 평가하였다. 두 실험적 발현 벡터는 모두 루시퍼라제를 발현하였다. 도 5를 참조한다. 실험적 발현 벡터로 형질감염된 세포의 배지에서 평균 상대적 루시퍼라제 강도는 음성 대조군 세포의 배지에서보다 적어도 300배 더 높았다. Id.
실시예 2 - WPRE 및 조작된 5'UTR을 함유하는 발현 벡터
A. 발현 벡터
도 1의 발현 벡터에서 eGFP 및 BGpA를 코딩하는 서열 사이에 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소 (WPRE)를 클로닝함으로써 다유전자성 발현 벡터를 제조하였다. 생성된 발현 벡터의 맵은 도 6에 표시되어 있다 (pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*). 벡터에 대한 핵산 서열은 서열식별번호: 21로서 제공된다.
도 6의 CAG 프로모터 대신 CMV 인핸서/프로모터 및 내부 최소 인트론 서열을 함유하는 조작된 5'UTR (즉, 5'UTR1, 서열식별번호: 2)을 함유하는 또 다른 다유전자성 발현 벡터를 제조하였다. 생성된 발현 벡터의 맵은 도 7에 표시되어 있다 (pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*). 벡터에 대한 핵산 서열은 서열식별번호: 22로서 제공된다.
도 6의 CAG 프로모터 대신 CMV 인핸서/프로모터 및 통합된 MAR-5를 갖는 인트론을 함유하는 조작된 5'UTR (즉, 5'UTR2, 서열식별번호: 5)을 함유하는 추가의 다유전자성 발현 벡터를 제조하였다. 생성된 발현 벡터의 맵은 도 8에 표시되어 있다 (pGL2-SS*-CMV-UTR2-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*). 벡터에 대한 핵산 서열은 서열식별번호: 23으로서 제공된다.
B. 루시퍼라제 발현 수준 및 내구성
접착성 HEK293 세포를 분리하고, 전기천공 배지에서 분해하고, 1x106개 세포/튜브로 계수하였다.
발현 벡터 (1 μg)를 제조하고, (1) pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS* (실시예 1 참조), (2) pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*, (3) pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*, 및 (4) pGL2-SS*-CMV-UTR2-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS* 각각에 대한 표준 작업 절차를 사용하여 세포와 함께 인큐베이션하였다.
포유동물 발현 카세트가 결여된 puc57 플라스미드로 전기천공된 HEK293 세포는 음성 대조군으로서 사용되었다.
전기천공 후, HEK293 세포를 시딩하고, 3x105개 세포/웰로 웰에 접착시켰다.
전기천공 후 2, 6, 10, 14, 17, 20, 27 및 34일차에, 제조업체 프로토콜에 따라 나노-글로® 루시퍼라제 검정 시스템 (프로메가)을 사용하여 4회의 형질감염 각각 및 음성 대조군에 대해 삼중으로 20 μL의 세포 배양 배지에서 분비된 루시퍼라제의 강도를 측정함으로써 루시퍼라제 발현을 평가하였다. 바이오텍(BioTek)® 플레이트 판독기를 사용하여 루시퍼라제 활성을 측정하고, 상대적 루미노미터 단위 (RLU)로 표시하였다. 루시퍼라제 활성의 통계적 분석을 스튜던트 T-테스트에 의해 수행하였다. 도 9를 참조하며, 이는 음성 대조군 (Neg. Ctl. (플라스미드 없음))과 비교하여 pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS* (pGL2-SecNLuc-eGFP), pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS* (WPRE), pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS* (5'UTR1+WPRE), 또는 pGL2-SS*-CMV-UTR2-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS* (5'UTR2+WPRE)로 형질감염된 세포로부터의 배지 내 발현 수준을 보여준다. * = p<0.05, ** = p<0.01, *** = p<0.001 및 **** = p<0.0001.
4개의 발현 벡터 중 임의의 것으로 형질감염된 세포로부터 실험 지속시간 내내 루시퍼라제 발현을 검출하였다. pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*, pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*, 및 pGL2-SS*-CMV-UTR2-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*는 모두 pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*와 비교하여 유의하게 더 높은 루시퍼라제 발현을 나타내었으며, pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*는 가장 높은 발현 향상을 나타내었다.
C. 딸 세포로의 벡터 확장 및 루시퍼라제 발현
본 실시예의 파트 B에 기재된 바와 같이 음성 대조군으로서 4개의 발현 벡터 또는 puc57 플라스미드로 HEK293 세포를 형질감염시켰다. 세포를 계대 동안 매주 5회 계대배양하였다. 세포 계대 시, 계대 번호 1-3의 경우 세포를 원래 세포 밀도의 1/6로, 계대 번호 4-5의 경우 원래 세포 밀도의 1/10로 재시딩하였다. 각 세포 계대에 대해, 분비된 루시퍼라제 발현을 본 실시예의 파트 B에 기재된 바와 같이 세포 재시딩 후 6-8일에 측정하였다. 도 10을 참조하며, 이는 각 계대 번호에서 음성 대조군과 비교하여 벡터로 형질감염된 세포로부터의 배지 내 발현 수준을 보여준다. 통계적 분석 및 p 값은 본 실시예의 파트 B에 언급된 바와 같다.
각 계대 번호에서 4개의 발현 벡터 중 임의의 것으로 형질감염된 세포로부터 루시퍼라제 발현을 검출하였으며, 이는 벡터가 루시퍼라제의 내구성 있는 발현을 갖는 딸 세포로 계대되었음을 보여준다. pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*, pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*, 및 pGL2-SS*-CMV-UTR2-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*는 모두 각 계대 번호에서 pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*와 비교하여 유의하게 더 높은 루시퍼라제 발현을 나타내었으며, pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*는 가장 높은 발현 향상을 나타내었다.
후속 연구에서, 루시퍼라제의 내구성 있는 발현을 갖는 딸 세포로의 msDNA 확장이 또한 관찰되었다.
간략하게, 본원 및 미국 특허 번호 9,290,778 및 9,862,954에 기재된 방법을 사용하여 유도성 이. 콜라이 벡터 생산 시스템에서 pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*로부터 msDNA를 생산하였다. (1) msDNA (즉, msDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA) (2) 부모 플라스미드 (즉, pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*), 및 (3) 루시퍼라제 발현 카세트를 갖는 통상적인 플라스미드 (즉, pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA)를 사용하여 리포펙타민과의 별도의 복합체를 제조하였다. HEK293 세포를 총 0.25 pmol 벡터/웰에 대해 개별 웰에서 전기천공을 통해 벡터로 별도로 형질감염시켰다. 세포를 7회 계대배양하였으며, 각 계대마다 10배 세포 희석을 수행하였다. 상대적 루시퍼라제 강도를 계대 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7에 대해 각각 8, 15, 24, 31, 38, 45 및 52일차에 결정하였다.
도 11에 나타낸 바와 같이, pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS* (즉, pDNA (CMV+U1+W)) 및 msDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA (즉, msDNA (CMV+U1+W)는 pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA (즉, 슈퍼서열을 함유하지 않는 통상적인 플라스미드 (통상적인 pcDNA))보다 모든 계대 번호에 걸쳐 훨씬 더 높은 수준에서 내구성 있는 트랜스진 발현을 나타내었다. 통상적인 플라스미드 데이터세트와 비교하여 ** = p<0.01, *** = p<0.001 및 **** = p<0.0001.
D. 딸 세포로의 벡터 확장 및 eGFP 발현
pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS* (pGL2-SecNLuc-eGFP) 또는 pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS* (5'UTR1+WPRE)로 형질감염되고 본 실시예의 파트 C에 따라 계대된 세포를 eGFP 발현에 대해 분석하였다.
각 계대 번호에 대해 세포 계대 후 6 내지 8일에 이미지화를 수행하였다. 바이오텍® 사이테이션™ 5 플레이트 판독기를 사용하여 라이브 세포 이미지화를 수행하였다. 도 12A를 참조하며, 이는 계대 번호 1, 2, 3 및 5에서 HEK-293 세포 내 형광의 대표적인 현미경사진을 보여준다. 각 계대 번호에서 발현 벡터 중 하나로 형질감염된 세포로부터 eGFP 발현을 검출하였으며, 이는 벡터가 eGFP의 내구성 있는 발현을 갖는 딸 세포로 계대되었음을 보여준다. pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*는 pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*와 비교하여 각 계대 번호에서 가장 강한 형광 신호를 나타내었으며, 이는 더 높은 형질감염 효율을 나타낸다.
각 발현 벡터에 대해 각 삼중 웰로부터 하나의 대표적인 이미지를 채취하고, 이미지제이(ImageJ) 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 수동 세포 계수에 의해 eGFP 발현 세포 (GFP+)를 정량화하였다. 스튜던트 t-테스트를 사용하여 GFP+ 세포의 통계적 분석을 수행하였다. 도 12B를 참조하며, 이는 각 계대 번호에서 삼중 라이브 형광 이미지로부터 관측 시야에서 관찰된 GFP+ 세포의 선 그래프를 보여준다 (삼중 이미지의 변동으로 인해 유의하지 않음 (ns) = p>0.05).
이미지제이 소프트웨어를 사용하여 각 GFP+ 세포를 수동으로 선택하고, 픽셀 강도에 기초하여 각 세포에 대한 평균 형광 강도 (MFI)를 측정하였다. 각 세포에 대한 최종 MFI 값을 계산하기 위해, 하기 공식을 사용하였다 (최종 MFI = 세포 MFI - 배경 MFI). 각 처리군에 대해 촬영된 3개의 이미지 각각으로부터 적어도 50개의 세포에 대해 MFI 측정을 수득하였다. 그 후, 모든 MFI 측정을 풀링하고, 도트 플롯을 생성하는데 사용하였다. 스튜던트 t-테스트를 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. 도 12C를 참조하며, 이는 계대 번호 5에서 MFI의 도트 플롯을 보여준다 (pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*의 경우 n = 257 세포 및 pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*의 경우 n = 414 세포, ****=p<0.0001). 도 12C의 기본 막대 그래프는 모든 측정된 GFP+ 세포에 대한 평균 MFI 값을 보여준다. pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*의 MFI는 pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*보다 약 3배 더 높은 것으로 측정되었다.
실시예 4 - 동물 모델에서 msDNA를 사용한 비바이러스 전달
msDNA의 간, 망막 및 뇌로의 표적화된 전달을 평가하기 위한 연구를 수행하였다. 각 표적 조직에 대해, 상이한 투여 경로 (ROA), 용량, 투약 요법 및 전달 기술을 평가하였다. 분비된 루시퍼라제 발현 동역학, 세포질성 eGFP 발현 수준, 및 형질감염 효율 (TE)을 평가하였다. 또한, 생리학적 평가, 조직 형태학 분석, 혈장 시토카인 검정 및 간 독성 분석에 의해 단일 또는 다중 주사 후 msDNA에 대한 관용성을 평가하였다.
모든 전달 기술에 걸쳐, msDNA는 각각 다중 뇌실내 (ICV) 또는 유체역학적 주사 (HDI) 및 정맥내 (IV) 주사를 통해 뇌 및 간 조직에서 강한 효능 및 관용성 프로파일을 나타내었다. msDNA로 처리된 성체 마우스는 단일 IV 주사 후 지속적인 분비된 루시퍼라제 수준 (>108 RLU/mg 단백질)을 나타내었다. msDNA는 단일 IV 주사 후 간 조직에서 내구성 있는 (>100일) 발현을 나타내었다. 심부 조직 영역에 대한 유의한 생체분포가 또한 입증되었으며, 뇌간, 소뇌, 피질 및 시상에서 80% 내지 97% TE가 있다. 나노담체-msDNA 복합체를 사용한 삼중 ICV 주사는 어떠한 부작용도 나타내지 않았다.
A. 간
1. 담체-무함유 네이키드 플라스미드의 단일 높은 용량, 2 mg/kg (50 μg), 유체역학적 주사로부터 루시퍼라제의 발현
C57BL/6J 수컷 야생형 성체 8-12주령 마우스는 꼬리 정맥을 통해 유체역학적 주사 (HDI)에 의해 2 mg/kg (50 μg)의 담체-무함유 pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA (슈퍼서열을 함유하지 않는 양성 대조군), pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*, pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*, 또는 pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*의 단일 높은 용량을 투여받았다. 루시퍼라제 유전자 발현을 검사하기 위해 HDI 후 1, 3, 7, 10, 15, 22, 28, 42 및 56일차에 처리된 마우스의 혈장을 수집하였다. 벡터 투여 후 1일차에, 모든 마우스는 높은 수준의 루시퍼라제 발현을 나타내었다 (혈장 단백질 mg당 108 - 109 RLU). -7일차에, pCAGLuc 및 pCAGLuc-WPRE 처리된 마우스는 107 - 108 RLU/mg의 혈장 단백질을 생성하였지만, pGSNLuc-WPRE 처리된 마우스는 더 낮은 루시퍼라제 수준을 생성하였다 (~106 RLU/mg 단백질). 벡터 투여 후 8주 후에, 모든 마우스는 낮은 수준의 루시퍼라제 발현을 나타내었다 (약 105 RLU/mg 단백질). 루시퍼라제 수준의 급격한 감소는 플라스미드 처리된 마우스에서 유도된 체액성 또는 세포-매개 면역 반응으로부터 발생하였을 수 있다. 도 13-14를 참조한다.
2. 담체-무함유 네이키드 플라스미드의 단일 낮은 용량, 0.2 mg/kg (5 μg), 유체역학적 주사로부터 루시퍼라제의 발현
동물 모델에서 비바이러스 유전자 전달 후 플라스미드 DNA의 용량 반응을 테스트하기 위해, C57BL/6J 수컷 야생형 성체 8-12주령 마우스는 꼬리 정맥을 통해 HDI에 의해 0.2 mg/kg (5 μg)의 담체-무함유 pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA (슈퍼서열을 함유하지 않는 양성 대조군, 2마리 마우스), pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS* (2마리 마우스), 또는 pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS* (2마리 마우스)의 단일 낮은 용량을 투여받았다. 추가 2마리의 마우스는 주사받지 않았으며 음성 대조군으로서 사용되었다. 루시퍼라제 유전자 발현을 검사하기 위해 HDI 후 1, 3, 7, 10, 15, 22, 28, 42 및 56일차에 마우스의 혈장을 수집하였다. pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS* 및 pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*로 처리된 마우스는 벡터 투여 후 8주 초과 동안 지속적인 높은 수준의 루시퍼라제 발현 (107 -108 RLU/mg 단백질)을 나타내었고, 동질유전자 발현 카세트를 갖지만 슈퍼서열 (SS)을 갖지 않는 통상적인 대조군 플라스미드보다 100배 이상 더 높은 발현을 나타내었다. 도 15를 참조한다.
벡터의 HDI 24시간 후 플루오로푸리마진 (FFz)의 1:5 희석액을 복강내로 주사함으로써 IVIS를 사용한 생체내 전신 생물발광 이미지화 (BLI)를 수행하였다. BLI는 혈장 샘플 내 루시퍼라제 수준과 상관관계가 있는 것으로 나타났다 (데이터는 표시되지 않음).
3. 담체-무함유 네이키드 msDNA의 단일 낮은 용량, 0.2 mg/kg (5 μg), 유체역학적 주사로부터 루시퍼라제의 발현
본원 및 미국 특허 번호 9,290,778 및 9,862,954에 기재된 방법을 사용하여 유도성 이. 콜라이 벡터 생산 시스템에서 pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS* 및 pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*로부터 msDNA를 생산하였다.
C57BL/6J 수컷 야생형 성체 8-12주령 마우스는 꼬리 정맥을 통해 유체역학적 주사 (HDI)에 의해 0.2 mg/kg (5 μg)의 담체-무함유 pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA (양성 대조군, 5마리 마우스), msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA (5마리 마우스), 또는 msDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA (5마리 마우스)의 단일 낮은 용량을 투여받았다. 추가 2마리의 마우스는 주사받지 않았으며 음성 대조군으로서 사용되었다. 루시퍼라제 유전자 발현을 검사하기 위해 HDI 후 1, 3, 7, 10, 15, 22, 28, 42 및 56일차에 처리된 마우스의 혈장을 수집하였다.
플라스미드 처리된 마우스와 유사하게, msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA 처리된 마우스는 벡터 투여 후 8주 초과 동안 지속적인 높은 수준의 루시퍼라제 발현 (107 - 108 RLU/mg 단백질)을 생성한 반면, msDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA 처리된 마우스의 루시퍼라제 발현은 1개월도 안되어 낮은 수준 (~106 RLU/mg 단백질)으로 떨어졌다. msDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA 처리된 마우스에서 루시퍼라제 발현의 급격한 감소는 간세포에서 CMV 프로모터의 침묵으로 인한 것 같다.
IVIS를 사용한 전신 라이브 이미지화를 통해 루시퍼라제 유전자 발현을 확인하였다.
하기 표 1은 혈장 샘플 내 루시퍼라제 발현 (RLU/mg 단백질) 및 BLI (광자/초)에 의해 검출된 바와 같이 1, 7 및 28일차에 개별 마우스로부터의 데이터를 제공한다.
<표 1>
Figure pct00001
도 16에 나타낸 바와 같이, msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA로 처리된 마우스는 HDI 후 56일차에 부모 플라스미드, pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*와 비교하여 루시퍼라제 발현의 10배 증가를 나타내었다.
데이터는 마우스에서 msDNA를 사용한 비바이러스 전달이 고도로 효율적이었고 생성된 유전자 발현이 2개월 초과 동안 안정적이었음을 보여준다.
4. 담체-무함유 네이키드 msDNA의 단일 낮은 용량, 0.2 mg/kg (5 μg), 유체역학적 주사로부터의 eGFP의 발현
세포내 세포질성 eGFP 발현 수준을 ELISA에 의해 평가하였다. 간략하게, 파트 3에 기재된 바와 같이 0.2 mg/kg (5 μg)의 벡터의 단일 낮은 용량을 사용하여 HDI 후 56일에 마우스로부터 간 샘플을 수집하고, 단백질 추출을 위해 균질화하였다. 간 용해물로부터 총 단백질 농도를 결정하였다. 그 후, GFP 단백질 수준을 ELISA에 의해 분석하였다.
도 17의 데이터를 루시퍼라제에 대한 데이터와 비교함으로써 분명한 바와 같이, 세포질성 GFP 발현 수준은 동일한 구축물로부터의 루시퍼라제의 분비 수준과 직접적으로 상관관계가 있었다.
도 18에 나타낸 바와 같이, 5 μg의 담체-무함유 msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BgpA의 단일 HDI 꼬리 정맥 주사는 HDI 후 최소 56일 동안 간 조직에서 강하고 내구성 있는 세포질성 eGFP 발현을 보여주었다.
5. 낮은 용량 단일 정맥내 주사 후 간에서의 msDNA 발현 및 관용성 프로파일
C57BL/6J 수컷 야생형 성체 8-12주령 마우스는 단일 정맥내 꼬리 정맥 주사를 통해 지질 나노입자 담체로 리포플렉스된 0.3 mg/kg pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA (슈퍼서열을 함유하지 않는 양성 대조군), msDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA, pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*, msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA, 또는 pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*를 투여받았다. 담체는 또한 음성 비히클 대조군으로서 사용되었다.
벡터의 단일 IV 주사 후 1, 3, 10, 30, 58, 92, 119 및 174일차에 상기 기재된 바와 같이 IVIS를 사용한 생체내 전신 생물발광 이미지화 (BLI)를 수행하였다. 도 19에 나타낸 바와 같이, msDNA 구축물은 전구체 및 통상적인 플라스미드보다 성능이 뛰어나며 높고 지속적인 루시퍼라제 분비를 보여준다.
혈청 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) 수준, 간 세포독성 및 시토카인 반응을 또한 벡터 주사 후 평가하였다. CAG 프로모터를 함유하는 전구체 플라스미드 및 msDNA는 CMV 프로모터를 함유하는 구축물와 비교하여 더 높은 관용성 프로파일을 나타내었다. 그러나, CMV 프로모터를 함유하는 msDNA는 CMV 전구체 부모 및 통상적인 플라스미드와 비교하여 극적으로 더 낮은 시토카인 및 간 독성 반응을 나타내었다. 주사 후 4시간 및 14일에 간 기능 마커의 시토카인 농도 (pg/mL) 및 효소 농도 (U/L)를 보여주는 하기 표 2를 참조한다.
<표 2>
Figure pct00002
B. 뇌
본원 및 미국 특허 번호 9,290,778 및 9,862,954에 기재된 방법을 사용하여 유도성 이. 콜라이 벡터 생산 시스템에서 pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS* 및 pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*로부터 msDNA를 생산하였다.
성체 야생형 마우스는 이식 후 0, 14 및 28일차에 이식된 캐뉼라를 통해 각각 1 μg DNA의 3회 뇌실내 (ICV) 주사에 의해 나노담체로 제형화된 msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA (3마리 마우스) 또는 나노담체로 제형화된 msDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA (3마리 마우스)를 투여받았다. 이식 후 42일차에 동물을 안락사시키고, 피질, 시상, 뇌간 및 소뇌로부터 시상면 뇌 섹션을 수집하였다.
도 20은 msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA를 주사받은 처리군의 마우스 #1로부터의 피질, 시상, 뇌간 및 소뇌 섹션을 보여준다. 섹션의 msDNA에 대한 형질감염 효율은 피질, 시상, 뇌간 및 소뇌 (푸르킨예 세포)에서 각각 81.9%, 73.0%, 69.2% 및 96.0%로 결정되었다. 형질감염 효율은 모든 DAPI-양성 세포 중 GFP 및 DAPI 모두에 양성인 세포의 백분율로서 계산되었다.
msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA를 주사받은 처리군의 마우스 #1 및 대조군 플라스미드, pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA를 주사받은 마우스로부터의 피질, 시상 및 뇌간 섹션에서의 GFP 발현 간의 비교는 형질감염 효율 및 생성된 GFP 발현이 통상적인 플라스미드에 비해 msDNA에서 더 높았음을 나타내었다 (데이터는 표시되지 않음).
도 21은 피질 및 시상으로부터의 섹션을 보여주고, 도 22는 msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA를 주사받은 처리군의 마우스 #2로부터의 뇌간 및 소뇌로부터의 섹션을 보여준다. 뉴런은 뉴런 마커 NeuN으로 표시되었으며 형질감염된 세포는 GFP를 발현하는 것으로 나타났다. 형질감염 효율은 피질, 시상, 뇌간 및 소뇌 (푸르킨예 세포)에서 각각 99.6%, 98.8%, 98.5% 및 80.8%로 결정되었다. 형질감염 효율은 모든 NeuN-양성 세포 중 GFP 및 NeuN 모두에 대해 양성인 세포의 백분율로서 계산되었다.
도 23은 피질 및 시상으로부터의 섹션을 보여주고, 도 24는 msDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA를 주사받은 처리군의 마우스 #1로부터의 뇌간 및 소뇌로부터의 섹션을 보여준다. 뉴런은 뉴런 마커 NeuN으로 표시되었으며 형질감염된 세포는 GFP를 발현하는 것으로 나타났다. 형질감염 효율은 피질, 시상, 뇌간 및 소뇌 (푸르킨예 세포)에서 각각 91.1%, 88.8%, 73.7% 및 92.1%로 결정되었다. 형질감염 효율은 모든 NeuN-양성 세포 중 GFP 및 NeuN 모두에 대해 양성인 세포의 백분율로서 계산되었다.
하기 표 3은 msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA ("CAG-WPRE") 또는 msDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA ("CMV-WPRE")를 주사받은 마우스에 대해 상기 논의된 형질감염 효율을 요약한다.
<표 3>
Figure pct00003
이식된 캐뉼라를 통한 반복된 ICV 주사는 세포독성 또는 신경변성의 징후 없이 우수한 전체 조직 무결성을 초래하였다.
데이터는 msDNA가 재투여 가능하고 형태학적 유해 효과 없이 다중 뇌 영역에서 높은 형질감염 효율, 생체분포 및 트랜스진 발현을 초래하였음을 보여준다.
실시예 5 - 인간 세포에서의 효능 및 안전성
pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA (양성 대조군), msDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA, pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*, msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA, 또는 pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*를 각각 지질 나노입자 담체로 리포플렉스시켰다.
인간 T 세포 (Pan-T(TA+)) 및 간세포 (Huh7)를 0.3 μg/mL 또는 1 μg/mL 용량의 리포플렉스된 벡터에 의해 형질감염시켰다.
리포플렉스된 msDNA 벡터는 부모 및 통상적인 플라스미드와 비교하여 형질감염 후 3 및 5일차에 두 세포 유형 모두에서 높은 발현을 나타내었다. 도 25-26을 참조한다.
리포플렉스된 msDNA는 생체외 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서도 잘 관용되었다. 특히, msDNA는 통상적인 플라스미드와 비교하여 인간 PBMC에서 유의하게 더 낮은 시토카인 프로파일 수준을 나타내었다 (데이터는 표시되지 않음).
실시예 6 - msDNA를 사용한 상동성 지정 복구
통상적인 플라스미드 DNA와 비교하여 msDNA에 의해 매개되는 상동성 지정 복구를 평가하기 위한 연구를 수행하였다.
5' 및 3' 상동성 아암에 의해 플랭킹된 관심 유전자 (GOI)를 함유하는 발현 카세트 (플라스미드 DNA HDR-GOI-HDR)를 사용하여 통상적인 플라스미드를 생산하였다.
2개의 슈퍼 서열 부위에 의해 플랭킹된 통상적인 플라스미드에서 사용된 바와 동일한 HDR-GOI-HDR 서열을 사용하여 msDNA 발현 벡터를 생산하였다. 그 후, 본원 및 미국 특허 번호 9,290,778 및 9,862,954에 기재된 방법을 사용하여 유도성 이. 콜라이 벡터 생산 시스템에서 HDR-GOI-HDR을 함유하는 msDNA (msDNA HDR-GOI-HDR)를 생산하였다.
GOI의 상동성 지정 복구 녹인 (HDR KI)을 매개하기 위해 CRISPR 유전자 편집 시스템과 함께 동일한 몰량의 플라스미드 DNA HDR-GOI-HDR 또는 msDNA HDR-GOI-HDR로 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)를 형질감염시켰다.
GOI의 상동성 지정 복구 녹인 (HDR KI) 효율은 형질감염 후 3, 7 및 15일차에 형질감염된 세포의 총 수에 비해 표면에 GOI를 발현한 통합된 건강한 iPSC의 총 수를 계수함으로써 형광 활성화 세포 분류 (FACS)로 평가되었다. 도 27B, 28B 및 29A의 Q3에 나타낸 바와 같이, HDR KI 효율은 각각 형질감염 후 3, 7 및 15일에 통상적인 플라스미드에 대해 각각 8.60%, 7.76% 및 8.05%였다. 도 27C, 28C 및 29B의 Q3에 나타낸 바와 같이, 각각 15.4%, 15.4% 및 15.7%의 더 높은 HDR KI 효율이 각각 형질감염 후 3, 7 및 15일에 msDNA에 대해 관찰되었다.
실시예 7 - 조절 서열 변형을 함유하는 발현 벡터
A. 발현 벡터
실시예 1 및 2에 기재된 바와 같은 2개의 슈퍼 서열 부위, CMV 인핸서/프로모터, 내부 최소 인트론 서열을 함유하는 조작된 5'UTR, 및 eGFP 및 Nluc를 코딩하는 다유전자성 발현 카세트를 함유하는 발현 벡터는 또한 인간 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호의 2개 카피 및 120개의 아데닌 뉴클레오티드 (즉, 2huBGpA-A120, 서열식별번호: 17) 및 하기 중 하나 이상을 함유하는 3'UTR을 함유하도록 설계되었다: (1) CMV 인핸서의 5' 말단에 위치된 합성 인핸서 (즉, 인핸서-1 (E1), 서열식별번호: 12), (2) 3'UTR의 5' 말단에 위치된 WPRE, (3) 5' 슈퍼 서열의 3' 말단에 위치된 SRF-UCOE; 및 (4) eGFP의 3' 말단에 위치된 인간 CSP-B MAR (huMAR). 설계된 벡터의 맵은 도 30-38에 표시되어 있다. 도 30은 3'UTR을 함유하는 발현 벡터의 맵을 보여준다 (SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*, 서열식별번호: 24). 도 31은 E1 및 3'UTR을 함유하는 발현 벡터의 맵을 보여준다 (SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*, 서열식별번호: 25). 도 32는 E1, WPRE 및 3'UTR을 함유하는 발현 벡터의 맵을 보여준다 (SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*, 서열식별번호: 26). 도 33은 UCOE, E1, WPRE 및 3'UTR을 함유하는 발현 벡터의 맵을 보여준다 (SS*-UCOE-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*, 서열식별번호: 27). 도 34는 E1, huMAR 및 3'UTR을 함유하는 발현 벡터의 맵을 보여준다 (SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-huMAR-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*, 서열식별번호: 28). 도 35는 UCOE, E1, huMAR 및 3'UTR을 함유하는 발현 벡터의 맵을 보여준다 (SS*-UCOE-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-huMAR-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*, 서열식별번호: 29). 도 36은 UCOE, E1, WPRE 및 3'UTR을 함유하는 발현 벡터의 맵을 보여준다 (SS*-UCOE-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*, 서열식별번호: 30). 도 37은 E1, huMAR, WPRE 및 3'UTR을 함유하는 발현 벡터의 맵을 보여준다 (SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-huMAR-WPRE-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*, 서열식별번호: 31). 도 38은 UCOE, E1, huMAR, WPRE 및 3'UTR을 함유하는 발현 벡터의 맵을 보여준다 (SS*-UCOE-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-huMAR-WPRE-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*, 서열식별번호: 32).
B. 루시퍼라제 발현 수준
HEK293 세포를 표준 작업 절차를 사용하여 (1) 도 2에 나타낸 바와 같은 통상적인 플라스미드, pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA, (2) SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*, (3) S*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*, 및 (4) SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*로 별도로 형질감염시켰다.
전기천공 후 2, 3, 7, 10, 14, 21 및 28일차에, 실시예 2B에 기재된 바와 같이 배양된 세포의 배지로부터 분비된 루시퍼라제의 강도를 측정함으로써 루시퍼라제 발현을 평가하였다. 도 39를 참조하며, 이는 pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA (통상적인 pDNA CMV-U), SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS* (A: CMV-U1-3'UTR), SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS* (B: E1-CMV-U1-3'UTR), 및 SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS* (C: E1-CMV-U1-WPRE-3'UTR)로 형질감염된 세포로부터의 배지 내 발현 수준을 보여준다.
도 39에 나타낸 바와 같이, 동일한 프로모터 및 다유전자성 발현 카세트를 갖는 통상적인 플라스미드와 비교하여 3'UTR을 함유하는 msDNA 발현 벡터에서 루시퍼라제 발현이 증가되고 내구성 있었다. msDNA 발현 벡터에 E1 (A 대 B) 및 WPRE (B 대 C) 유전적 요소의 첨가에 따라 발현이 더욱 증가되었으며, E1 및 WPRE 유전적 요소의 부가적 효과는 구축물 C와 연관된 가장 높은 루시퍼라제 발현을 초래하였다. t-테스트를 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. * = p<0.05 및 ** = p<0.01.
C. 딸 세포로의 벡터 확장 및 루시퍼라제 발현
본 실시예의 파트 B에 기재된 4개의 발현 벡터로 HEK293 세포를 형질감염시켰다. 세포를 계대 동안 7일마다 5회 계대배양하였다. 세포 계대 시, 세포를 원래 세포 밀도의 1/10로 재시딩하였다. 각 세포 계대에 대해, 분비된 루시퍼라제 발현을 실시예 2B에 기재된 바와 같이 측정하였다. 도 40을 참조하며, 이는 통상적인 플라스미드와 비교하여 msDNA 발현 벡터로 형질감염된 세포로부터의 배지 내 발현 수준을 보여준다. 통계적 분석 및 p 값은 본 실시예의 파트 B에 언급된 바와 같다.
각 계대 번호에서 msDNA 발현 벡터 중 임의의 것으로 형질감염된 세포로부터 루시퍼라제 발현을 검출하였으며, 이는 벡터가 루시퍼라제의 내구성 있는 발현을 갖는 딸 세포로 계대되었음을 보여준다.
도 40에 나타낸 바와 같이, E1 및 WPRE 유전적 요소의 부가적 효과는 각 계대 번호에서 구축물 C와 연관된 가장 높은 루시퍼라제 발현을 초래하였으며, 다중 계대 후에 가장 내구성 있는 발현을 초래하였다.
실시예 8 - 합성 프로모터 서열을 함유하는 발현 벡터
A. 발현 벡터
5개의 합성 프로모터 서열을 생산하였다: (1) 합성 인핸서 E1의 3개 카피 (즉, 서열식별번호: 12의 3개 카피), 닭 β-액틴 프로모터 및 키메라 인트론을 함유하는 CAG [E1X3+CBA 프로모터+인트론] (서열식별번호: 35), (2) E2 (U100), 닭 β-액틴 프로모터 및 키메라 인트론을 함유하는 CAG [E2+CBA 프로모터+인트론] (서열식별번호: 36), (3) 합성 인핸서 E1의 3개 카피, 닭 β-액틴 프로모터 및 5'UTR1 (즉, 서열식별번호: 2)을 함유하는 CAG [E1X3+CBA 프로모터+UTR1] (서열식별번호: 37), (4) E2 (U100), 닭 β-액틴 프로모터 및 5'UTR1을 함유하는 CAG [E2 (U100)+CBA 프로모터+UTR1] (서열식별번호: 38), 및 (5) CMV 인핸서, EF1a 짧은 프로모터 및 5'UTR1을 함유하는 CMV 인핸서-EF1-UTR1 (서열식별번호: 39).
실시예 1 및 2에 기재된 바와 같은 CMV 인핸서, 닭 β-액틴 프로모터, 및 키메라 인트론 및 eGFP 및 Nluc를 코딩하는 다유전자성 발현 카세트를 함유하는 통상적인 플라스미드를 생산하였다. 통상적인 플라스미드의 맵은 도 41에 표시되어 있다 (pGL2-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-b글로빈 폴리A, 서열식별번호: 34).
2개의 슈퍼 서열 부위, CMV 인핸서, 닭 β-액틴 프로모터, 키메라 인트론, eGFP 및 Nluc를 코딩하는 다유전자성 발현 카세트, WPRE 및 3'UTR을 함유하는 msDNA 발현 벡터를 생산하였다. 벡터의 맵은 도 42에 표시되어 있다 (4-1 pGL2-SS*-CAG [CMV 인핸서+CBA 프로모터+인트론]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR(108 - 120 폴리A)-SS*, 서열식별번호: 40).
상기 기재된 바와 같은 합성 프로모터 (1)-(5) 중 하나와 함께 2개의 슈퍼 서열 부위, eGFP 및 Nluc를 코딩하는 다유전자성 발현 카세트, WPRE 및 3'UTR을 함유하는 5개의 msDNA 발현 벡터를 생산하였으며, 각각의 벡터 맵은 도 43 (4-2 pGL2-SS*-CAG [E1 X3+CBA 프로모터+인트론]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR(108 - 120 폴리A)-SS*, 서열식별번호: 41), 도 44 (4-3 pGL2-SS*-CAG [E2(U100)+CBA 프로모터+인트론]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR(108 - 120 폴리A)-SS*, 서열식별번호: 42), 도 45 (4-4 pGL2-SS*-CAG [E1 X3+CBA 프로모터+UTR1]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR(108 - 120 폴리A)-SS*, 서열식별번호: 43), 도 46 (4-5-pGL2-SS*-CAG [E2 (U100)+CBA 프로모터+UTR1]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR (108 - 120 폴리A)-SS*, 서열식별번호: 44), 및 도 47 (4-6-pGL2-SS*-CMV 인핸서-EF1-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR(108 - 120 폴리A)-SS*, 서열식별번호: 45)에 표시되어 있다.
B. 루시퍼라제 발현 수준
HEK293 세포를 1x105개 세포/웰로 24-웰 플레이트에 시딩하고, 본 실시예의 파트 A에 기재된 벡터 및 리포펙타민의 복합체로 0.25 pmol DNA/웰로 별도로 형질감염시켰다. 형질감염 후 3 및 6일에 실시예 2B에 기재된 바와 같이 분비된 루시퍼라제 발현을 측정하였다. 도 48을 참조하며, 이는 통상적인 플라스미드와 비교하여 msDNA 발현 벡터로 형질감염된 세포로부터의 배지 내 발현 수준을 보여준다. 통상적인 플라스미드에 비해 이원 Anova 분석을 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. * = p<0.05, ** = p<0.01, 및 ****= p<0.0001.
루시퍼라제 발현 수준은 통상적인 플라스미드와 비교하여 모든 msDNA 발현 벡터에 대해 더 높았다. 가장 높은 발현은 4-6-pGL2-SS*-CMV 인핸서-EF1-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR(108 - 120 폴리A (4-6: CMV-EF1-UTR1-W-3'UTR)에서 관찰되었으며, 이는 CMV 인핸서 및 5'UTR1과 조합하여 EF-1 프로모터 요소를 함유한다.
실시예 9 - SS 및 발현 카세트 변형
본 개시내용에 기재된 바와 같은 발현 벡터의 슈퍼 서열 (SS) 및 발현 카세트에 대한 변형의 영향은 형질감염 효율, 관심 핵산 서열의 발현 (리포터 유전자, 예컨대 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같은 다유전자성 GFP 및 루시퍼라제 발현 카세트 포함), 및 분열하는 세포에서 벡터의 내구성/확장 (신속 및 느린 분열 세포 포함) 측면에서 평가될 것이다. SS에 대한 변형은 또한 이들 부위에 대한 제한 효소 활성에 대해 평가될 것이다.
변형은 개별 변형 및 조합, 예컨대 벡터 백본과 레콤비나제에 대한 절단 부위 사이의 SS에서 레콤비나제에 대한 비-결합 영역에 통합된 엔도뉴클레아제 표적 서열, 제1 레콤비나제에 대한 제1 표적 서열의 3' 말단 (즉, 5' SS의 3' 말단)과 발현 카세트 내 프로모터의 5' 사이에 통합된 CAG 프로모터, 제1 레콤비나제에 대한 제1 표적 서열의 3' 말단 (즉, 5' SS의 3' 말단)과 발현 카세트 내 프로모터의 5' 사이에 통합된 CMV 인핸서, CMV 인핸서에 대해 5' 및/또는 UCOE, CMV, EF1, SV40, CAG, Rho, VDM2, HCR 또는 HLP 프로모터 또는 이의 변이체에 대해 3'에 위치된 인핸서-1 서열, CMV 프로모터 변이체, EF1-알파 프로모터, 합성 프로모터, 인트론 내에 통합된 비-코딩 서열을 갖는 또는 갖지 않는 프로모터와 관심 핵산 서열 사이에서 발현 카세트에 통합된 인트론을 포함하는 5'UTR (예를 들어, 서열식별번호: 2-5 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함하는 5'UTR), 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된 척추동물 염색질 인슐레이터, 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소, 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된 스캐폴드/매트릭스 부착 영역, 발현 카세트 내 프로모터에 대해 5'에 위치된 유비쿼터스 염색질 개방 요소 (예를 들어, 5' SS의 3'에 및 발현 카세트 내 다른 서열 앞), 관심 핵산과 3' SS 사이에서 발현 카세트에 통합된 3'UTR (예컨대 정지 코돈 바로 후에) (예를 들어, 서열식별번호: 13-16 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함하는 3'UTR), 및/또는 100 내지 120개의 아데닌 뉴클레오티드를 포함하는 폴리(A) 꼬리 (예를 들어, 3'UTR의 3' 말단으로서) (그러나 이에 제한되지는 않음)를 포함할 것이다.
서열
서열식별번호: 1 인공 인트론
Figure pct00004
서열식별번호: 2 5'UTR1
Figure pct00005
서열식별번호: 3 MAR-5 삽입을 갖는 5'UTR1
Figure pct00006
서열식별번호: 4 5'UTR
Figure pct00007
서열식별번호: 5 5'UTR2 (MAR-5 삽입을 갖는 서열식별번호: 4의 5'UTR)
Figure pct00008
서열식별번호: 6 A2UCOE 요소
Figure pct00009
서열식별번호: 7 SRF-UCOE
Figure pct00010
서열식별번호: 8 cHS4 인슐레이터
Figure pct00011
서열식별번호: 9 MAR-5
Figure pct00012
서열식별번호: 10 인간 CSP-B MAR (huMAR)
Figure pct00013
서열식별번호: 11 WPRE
Figure pct00014
서열식별번호: 12 인핸서-1
Figure pct00015
서열식별번호: 13 제노푸스 라에비스 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호의 2개 카피 (2xlBGpA)
Figure pct00016
서열식별번호: 14 인간 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호의 2개 카피 (2huBGpA)
Figure pct00017
서열식별번호: 15 하이브리드 제노푸스 라에비스 및 인간 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호 (xlhuBGpA)
Figure pct00018
서열식별번호: 16 2xlBGpA-A120
Figure pct00019
서열식별번호: 17 2huBGpA-A120
Figure pct00020
서열식별번호: 18 xlhuBGpA-A120
Figure pct00021
서열식별번호: 19 pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
서열식별번호: 20 pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
서열식별번호: 21 pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
서열식별번호: 22 pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*
Figure pct00031
Figure pct00032
서열식별번호: 23 pGL2-SS*-CMV-UTR2-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*
Figure pct00033
Figure pct00034
서열식별번호: 24 SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-3'UTR[2huBGpA-A120]-SS*
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
서열식별번호: 25 SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-3'UTR[2huBGpA-A120]-SS*
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
서열식별번호: 26 SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR[2huBGpA-A120]-SS*
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
서열식별번호: 27 SS*-UCOE-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR[2huBGpA-A120]-SS*
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
서열식별번호: 28 SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-huMAR-3'UTR[2huBGpA-A120]-SS*
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
서열식별번호: 29 SS*-UCOE-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-huMAR-3'UTR[2huBGpA-A120]-SS*
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
서열식별번호: 30 SS*-UCOE-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR[2huBGpA-A120]-SS*
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
서열식별번호: 31 SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-MAR-WPRE-3'UTR[2huBGpA-A120]-SS*
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060
Figure pct00061
서열식별번호: 32 SS*-UCOE-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-MAR-WPRE-3'UTR[2huBGpA-A120]-SS*
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064
Figure pct00065
서열식별번호: 33 (슈퍼 서열, SS*)
Figure pct00066
서열식별번호: 34 pGL2-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-b글로빈 폴리A
Figure pct00067
Figure pct00068
Figure pct00069
서열식별번호: 35 CAG [E1X3+CBA 프로모터+인트론]
Figure pct00070
서열식별번호: 36 CAG [E2+CBA 프로모터+인트론]
Figure pct00071
서열식별번호: 37 CAG [E1X3+CBA 프로모터+UTR1]
Figure pct00072
서열식별번호: 38 CAG [E2 (U100)+CBA 프로모터+UTR1]
Figure pct00073
서열식별번호: 39 CMV 인핸서-EF1-UTR1
Figure pct00074
서열식별번호: 40 4-1 pGL2-SS*-CAG [CMV 인핸서+CBA 프로모터+인트론]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR(108 - 120 폴리A)-SS*
Figure pct00075
Figure pct00076
Figure pct00077
Figure pct00078
서열식별번호: 41 4-2 pGL2-SS*-CAG [E1 X3+CBA 프로모터+인트론]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR(108 - 120 폴리A)-SS*
Figure pct00079
Figure pct00080
Figure pct00081
서열식별번호: 42 4-3 pGL2-SS*-CAG [E2(U100)+CBA 프로모터+인트론]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR(108 - 120 폴리A)-SS*
Figure pct00082
Figure pct00083
Figure pct00084
Figure pct00085
서열식별번호: 43 4-4 pGL2-SS*-CAG [E1 X3+CBA 프로모터+UTR1]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR(108 - 120 폴리A)-SS*
Figure pct00086
Figure pct00087
Figure pct00088
서열식별번호: 44 4-5-pGL2-SS*-CAG [E2 (U100)+CBA 프로모터+UTR1]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR (108 - 120 폴리A)-SS*
Figure pct00089
Figure pct00090
Figure pct00091
서열식별번호: 45 4-6-pGL2-SS*-CMV 인핸서-EF1-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR(108 - 120 폴리A)-SS*
Figure pct00092
Figure pct00093
Figure pct00094
서열식별번호: 46 인핸서-1의 3개 카피
Figure pct00095
서열식별번호: 47 키메라 인트론
Figure pct00096
* * *
본 개시내용은 본원에 기재된 특정 측면에 의해 범위가 제한되지 않아야 한다. 실제로, 설명된 것 외에 본 개시내용의 다양한 변형이 전술한 설명 및 첨부 도면으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범위 내에 속하도록 의도된다.
다른 측면은 하기 청구범위 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> MEDIPHAGE BIOCEUTICALS, INC. SLAVCEV, RODERICK NAFISSI, NAFISEH <120> EXPRESSION VECTORS, BACTERIAL SEQUENCE-FREE VECTORS, AND METHODS OF MAKING AND USING THE SAME <130> 4471.007PC03 <150> US 63/331,638 <151> 2022-04-15 <150> US 63/306,015 <151> 2022-02-02 <150> US 63/211,343 <151> 2021-06-16 <160> 47 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 144 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial intron <400> 1 gtaagtcgac gggccgggcc tgggccgggt ccgggccggg tcgttggatc cccactacag 60 cccgatactc aagcttgacg aattcgagta tccaaggtag tggactagtg tgacgctgct 120 gacccctttc tttcccttct gcag 144 <210> 2 <211> 190 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'UTR1 <400> 2 ctgccttctc cctcctgtga gtttggtaag tcgacgggcc gggcctgggc cgggtccggg 60 ccgggtcgtt ggatccccac tacagcccga tactcaagct tgacgaattc gagtatccaa 120 ggtagtggac tagtgtgacg ctgctgaccc ctttctttcc cttctgcagg ttggtgtaca 180 gtagcttcca 190 <210> 3 <211> 771 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'UTR1 with MAR-5 insertion <400> 3 ctgccttctc cctcctgtga gtttggtaag tcgacgggcc gggcctgggc cgggtccggg 60 ccgggtatcc atagctgatt ggtctaaaat gagatacatc aacgctcctc catgtttttt 120 gttttctttt taaatgaaaa actttatttt ttaagaggag tttcaggttc atagcaaaat 180 tgagaggaag gtacattcaa gctgaggaag ttttcctcta ttcctagttt actgagagat 240 tgcatcatga atgggtgtta aattttgtca aatgcttttt ctgtgtctat caatatgacc 300 atgtgatttt cttctttaac ctgttgatgg gacaaattac gttaattgat tttcaaacgt 360 tgaaccaccc ttacatatct ggaataaatt ctacttggtt gtggtgtata ttttttgata 420 cattcttgga ttctttttgc taatattttg ttgaaaatgt ttgtatcttt gttcatgaga 480 gatattggtc tgttgttttc ttttcttgta atgtcatttt ctagttccgg tattaaggta 540 atgctggcct agttgaatga tttaggaagt attccctctg cttctgtctt ctgaaagaga 600 ttgtagaaag ttgatacaat ttttttttct ttaaatatct tgatagtcgt tggatcccca 660 ctacagcccg atactcaagc ttgacgaatt cgagtatcca aggtagtgga ctagtgtgac 720 gctgctgacc cctttctttc ccttctgcag gttggtgtac agtagcttcc a 771 <210> 4 <211> 117 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'UTR <400> 4 attgggatct tcacacagca ggtaaggttg cgggccgggc ctgggccggg tccgggccgg 60 gccgcactga cccctggtgt tgcttttttt ttttaggccg caagctgaag cgtgtcc 117 <210> 5 <211> 698 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'UTR2 (5'UTR of SEQ ID NO:4 with MAR-5 insertion) <400> 5 attgggatct tcacacagca ggtaaggttg cgggccgggc ctgggccggg tccgggccgg 60 gtatccatag ctgattggtc taaaatgaga tacatcaacg ctcctccatg ttttttgttt 120 tctttttaaa tgaaaaactt tattttttaa gaggagtttc aggttcatag caaaattgag 180 aggaaggtac attcaagctg aggaagtttt cctctattcc tagtttactg agagattgca 240 tcatgaatgg gtgttaaatt ttgtcaaatg ctttttctgt gtctatcaat atgaccatgt 300 gattttcttc tttaacctgt tgatgggaca aattacgtta attgattttc aaacgttgaa 360 ccacccttac atatctggaa taaattctac ttggttgtgg tgtatatttt ttgatacatt 420 cttggattct ttttgctaat attttgttga aaatgtttgt atctttgttc atgagagata 480 ttggtctgtt gttttctttt cttgtaatgt cattttctag ttccggtatt aaggtaatgc 540 tggcctagtt gaatgattta ggaagtattc cctctgcttc tgtcttctga aagagattgt 600 agaaagttga tacaattttt ttttctttaa atatcttgat agccgcactg acccctggtg 660 ttgctttttt tttttaggcc gcaagctgaa gcgtgtcc 698 <210> 6 <211> 1579 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A2UCOE element <400> 6 gcggccgcac gcgtggccct ccgcgcctac agctcaagcc acatccgaag ggggagggag 60 ccgggagctg cgcgcggggc cgccgggggg aggggtggca ccgcccacgc cgggcggcca 120 cgaagggcgg ggcagcgggc gcgcgcgcgg cggggggagg ggccggcgcc gcgcccgctg 180 ggaattgggg ccctaggggg agggcggagg cgccgacgac cgcggcactt accgttcgcg 240 gcgtggcgcc cggtggtccc caaggggagg gaagggggag gcggggcgag gacagtgacc 300 ggagtctcct cagcggtggc ttttctgctt ggcagcctca gcggctggcg ccaaaaccgg 360 actccgccca cttcctcgcc cgccggtgcg agggtgtgga atcctccaga cgctggggga 420 gggggagttg ggagcttaaa aactagtacc cctttgggac cactttcagc agcgaactct 480 cctgtacacc aggggtcagt tccacagacg cgggccaggg gtgggtcatt gcggcgtgaa 540 caataatttg actagaagtt gattcgggtg tttccggaag gggccgagtc aatccgccga 600 gttggggcac ggaaaacaaa aagggaaggc tactaagatt tttctggcgg gggttatcat 660 tggcgtaact gcagggacca cctcccgggt tgagggggct ggatctccag gctgcggatt 720 aagcccctcc cgtcggcgtt aatttcaaac tgcgcgacgt ttctcacctg ccttcgccaa 780 ggcaggggcc gggaccctat tccaagaggt agtaactagc aggactctag ccttccgcaa 840 ttcattgagc gcatttacgg aagtaacgtc gggtactgtc tctggccgca agggtgggag 900 gagtacgcat ttggcgtaag gtggggcgta gagccttccc gccattggcg gcggataggg 960 cgtttacgcg acggcctgac gtagcggaag acgccttagt gggggggaag gttctagaaa 1020 agcggcggca gcggctctag cggcagtagc agcagcgccg ggtcccgtgc ggaggtgctc 1080 ctcgcagagt tgtttctcca gcagcggcag ttctcactac agcgccagga cgagtccggt 1140 tcgtgttcgt ccgcggagat ctctctcatc tcgctcggct gcgggaaatc gggctgaagc 1200 gactgagtcc gcgatggagg taacgggttt gaaatcaatg agttattgaa aagggcatgg 1260 cgaggccgtt ggcgcctcag tggaagtcgg ccagccgcct ccgtgggaga gaggcaggaa 1320 atcggaccaa ttcagtagca gtggggctta aggtttatga acggggtctt gagcggaggc 1380 ctgagcgtac aaacagcttc cccaccctca gcctcccggc gccatttccc ttcactgggg 1440 gtgggggatg gggagctttc acatggcgga cgctgccccg ctggggtgaa agtggggcgc 1500 ggaggcggga cttcttattc cctttctaaa gcacgctgct tcgggggcca cggcgtctcc 1560 tcggacggcc gggcgcgcc 1579 <210> 7 <211> 761 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRF-UCOE <400> 7 gcacacgacc acaattccac tgaaagcatt ttaatacgga acttgtcact cccagggagc 60 ctccgctcag ccggcagttg gttcatttca atccccacga caacccttca aagtgcaggg 120 cagacagcag gtggctctgc ccaggcgcct ggatcacagc ccggcctgca gccctcacct 180 gggcgcgggg agaccctgag gacgctcctc caggcggcgc tggccggggc ctgcggacac 240 ggacgggcgg gctgagctcc gggacccctc cccgcgcccc gcaccccgca ccccgcaccc 300 cgcaccccgc acccggcgct cacccgtccc agccccgccg cccgcagccc cagctgcaac 360 gcagccaccg ccgccatcgc acccggcccc gcgggcgctt ccgggacgca ggaggcatct 420 gcatccgggg cgccgctgag tcccgcccag agccccgccc ccggctccag gttctgcgag 480 cggcttccgc cgggctgctc cgcgggcgcg tcggccatga gcgagttgcc gggcgacgtg 540 cgggcgtttc tgcgggagca cccgagcctg cggctccaga cggacgcccg caaggttcgc 600 agcgcgggag gggaacggag tggcggagaa gggcgcagtt gggatgaggg gctgagggga 660 gggcagggga gaggagaggg caggggagag gggagagggg agagcaggag agaggggaag 720 gcaggggaga gggcgcggcg ggatcagggg aggagaggga a 761 <210> 8 <211> 478 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cHS4 insulator <400> 8 ggggagctca cggggacagc ccccccccaa agcccccagg gatgtaatta cgtccctccc 60 ccgctagggg gcagcagcga ccgcccgggg ctccgctccg gtccggcgct ccccccgcat 120 cccgagccgg cagcgtgcgg ggacagcccg ggcacgggga aggtggcacg ggatcgcttt 180 cctctgaacg cttctcgctg ctctttgagc ctgcagacac ctgggggata cggggaaaag 240 gggagctcac ggggacagcc cccccccaaa gcccccaggg atgtaattac gtccctcccc 300 cgctaggggg cagcagcgac cgcccggggc tccgctccgg tccggcgctc cccccgcatc 360 ccgagccggc agcgtgcggg gacagcccgg gcacggggaa ggtggcacgg gatcgctttc 420 ctctgaacgc ttctcgctgc tctttgagcc tgcagacacc tgggggatac ggggaaaa 478 <210> 9 <211> 581 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAR-5 <400> 9 tatccatagc tgattggtct aaaatgagat acatcaacgc tcctccatgt tttttgtttt 60 ctttttaaat gaaaaacttt attttttaag aggagtttca ggttcatagc aaaattgaga 120 ggaaggtaca ttcaagctga ggaagttttc ctctattcct agtttactga gagattgcat 180 catgaatggg tgttaaattt tgtcaaatgc tttttctgtg tctatcaata tgaccatgtg 240 attttcttct ttaacctgtt gatgggacaa attacgttaa ttgattttca aacgttgaac 300 cacccttaca tatctggaat aaattctact tggttgtggt gtatattttt tgatacattc 360 ttggattctt tttgctaata ttttgttgaa aatgtttgta tctttgttca tgagagatat 420 tggtctgttg ttttcttttc ttgtaatgtc attttctagt tccggtatta aggtaatgct 480 ggcctagttg aatgatttag gaagtattcc ctctgcttct gtcttctgaa agagattgta 540 gaaagttgat acaatttttt tttctttaaa tatcttgata g 581 <210> 10 <211> 1233 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CSP-B MAR (huMAR) <400> 10 ggatcccatt ctccttgatg tactaatttt tctttaaaag tgataataat agctcccatt 60 tagaattttt aaataacaca acaaatgtaa agtaactaat gtgtcctctg gatcatggta 120 agtaatgaat aaatttaact ccctttacct tctccctttg ctattttttc catgctagga 180 tttatacatt tttaaaaaac taaatctgct atcaaatgac agctttaaat ttacttttta 240 aaatttgtta ttgtatatat ttatggggta taaagtgatg ttatgatata tatatacaca 300 atgtacactg attaaatcaa gccaattaac attttatcat ctcaaatact taacattttt 360 tgtagtgaga acatttgaaa tttactttta gcaatttcaa aacatacatt attattatta 420 actatagtca ccatgatgta ccatagatct ttaaaaactt attcttcctg cctaactgaa 480 actttgtact ctttgactaa catcttttca ttcccccact tcccagcctc tggtaatcac 540 cattacacac tctgcttcta tgagttcaat tgctttagac tccacgtaat aaatgagatc 600 atgcagcatt tggctttctg tgcctggctt atccttgctt agcatggtgt cttacaggtt 660 catccatgtt gcaacaaata acagaatctc attctttgtt aaggctgaat actattccat 720 tgggtatata taccacattt tccttatcca ttaatccact gatggaccct taggttgttg 780 attccatata ttggctattg taaatagtgc agcaatgaac atgagagtgc aactatctct 840 tcaatgtact gatttcgaat ccttcggatc tatctcagaa gtgagattgc aggatcatat 900 aattctactt ttagtctttt gaggagctcc atacagcttt ccatatggcc atactaatta 960 cattctcatc aacagtgtac aatggtttcc ttttctccac atcctcacca acatttataa 1020 ttttttgtct ttttgataat agccatctga caggtgtaaa gtgatagctc attgcagttt 1080 taatttgcat tttttgatga ttagtaatgt tgagaatttt ttcatatatc tcttggccag 1140 ttgcatgtct tctttggaaa aatgtctatt cagttccttt gcccattttt taattgggat 1200 ttttggtttc ttgctattga gttgtttgaa ttc 1233 <210> 11 <211> 597 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WPRE <400> 11 tcgacaatca acctctggat tacaaaattt gtgaaagatt gactggtatt cttaactatg 60 ttgctccttt tacgctatgt ggatacgctg ctttaatgcc tttgtatcat gctattgctt 120 cccgtatggc tttcattttc tcctccttgt ataaatcctg gttgctgtct ctttatgagg 180 agttgtggcc cgttgtcagg caacgtggcg tggtgtgcac tgtgtttgct gacgcaaccc 240 ccactggttg gggcattgcc accacctgtc agctcctttc cgggactttc gctttccccc 300 tccctattgc cacggcggaa ctcatcgccg cctgccttgc ccgctgctgg acaggggctc 360 ggctgttggg cactgacaat tccgtggtgt tgtcggggaa gctgacgtcc tttccatggc 420 tgctcgcctg tgttgccacc tggattctgc gcgggacgtc cttctgctac gtcccttcgg 480 ccctcaatcc agcggacctt ccttcccgcg gcctgctgcc ggctctgcgg cctcttccgc 540 gtcttcgcct tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg ggccgcctcc ccgcctg 597 <210> 12 <211> 111 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Enhancer-1 <400> 12 gggactttcc ggggcggggc acgtggtgca cgggactttc cgtgcacgtg cacgggactt 60 tccgggactt tccgggactt tccgtgcacc acgtggggac tttccgtgca c 111 <210> 13 <211> 252 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2 copies of Xenopus leavis beta-globin polyadenylation signal (2xlBGpA) <400> 13 aaccagcctc aagaacaccc gaatggagtc tctaagctac ataataccaa cttacacttt 60 acaaaatgtt gtcccccaaa atgtagccat tcgtatctgc tcctaataaa aagaaagttt 120 cttcacaacc agcctcaaga acacccgaat ggagtctcta agctacataa taccaactta 180 cactttacaa aatgttgtcc cccaaaatgt agccattcgt atctgctcct aataaaaaga 240 aagtttcttc ac 252 <210> 14 <211> 268 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2 copies of human beta-globin polyadenylation signal (2huBGpA) <400> 14 gctcgctttc ttgctgtcca atttctatta aaggttcctt tgttccctaa gtccaactac 60 taaactgggg gatattatga agggccttga gcatctggat tctgcctaat aaaaaacatt 120 tattttcatt gcaagctcgc tttcttgctg tccaatttct attaaaggtt cctttgttcc 180 ctaagtccaa ctactaaact gggggatatt atgaagggcc ttgagcatct ggattctgcc 240 taataaaaaa catttatttt cattgcaa 268 <210> 15 <211> 260 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hybrid Xenopus leavis and human beta-globin polyadenylation signal (xlhuBGpA) <400> 15 aaccagcctc aagaacaccc gaatggagtc tctaagctac ataataccaa cttacacttt 60 acaaaatgtt gtcccccaaa atgtagccat tcgtatctgc tcctaataaa aagaaagttt 120 cttcacgctc gctttcttgc tgtccaattt ctattaaagg ttcctttgtt ccctaagtcc 180 aactactaaa ctgggggata ttatgaaggg ccttgagcat ctggattctg cctaataaaa 240 aacatttatt ttcattgcaa 260 <210> 16 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2xlBGpA-A120 <400> 16 aaccagcctc aagaacaccc gaatggagtc tctaagctac ataataccaa cttacacttt 60 acaaaatgtt gtcccccaaa atgtagccat tcgtatctgc tcctaataaa aagaaagttt 120 cttcacaacc agcctcaaga acacccgaat ggagtctcta agctacataa taccaactta 180 cactttacaa aatgttgtcc cccaaaatgt agccattcgt atctgctcct aataaaaaga 240 aagtttcttc acaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360 aaaaaaaaaa aa 372 <210> 17 <211> 388 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2huBGpA-A120 <400> 17 gctcgctttc ttgctgtcca atttctatta aaggttcctt tgttccctaa gtccaactac 60 taaactgggg gatattatga agggccttga gcatctggat tctgcctaat aaaaaacatt 120 tattttcatt gcaagctcgc tttcttgctg tccaatttct attaaaggtt cctttgttcc 180 ctaagtccaa ctactaaact gggggatatt atgaagggcc ttgagcatct ggattctgcc 240 taataaaaaa catttatttt cattgcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 388 <210> 18 <211> 380 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> xlhuBGpA-A120 <400> 18 aaccagcctc aagaacaccc gaatggagtc tctaagctac ataataccaa cttacacttt 60 acaaaatgtt gtcccccaaa atgtagccat tcgtatctgc tcctaataaa aagaaagttt 120 cttcacgctc gctttcttgc tgtccaattt ctattaaagg ttcctttgtt ccctaagtcc 180 aactactaaa ctgggggata ttatgaaggg ccttgagcat ctggattctg cctaataaaa 240 aacatttatt ttcattgcaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 380 <210> 19 <211> 7011 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS* <400> 19 ccgggaggta ccgagctctt acgcgtgcta gaattaaagt aacccaatca gcacacaatt 60 gccattatac gcgcgtataa tggactattg tgtgctgata aacctatttc agcatactac 120 gcgcgtagta tgctgaaata ggtgactaga agttcctata ctttctagag aataggaact 180 tcataacttc gtataatgta tgctatacga agttatgggt tactttaatt tggttgctga 240 ctaattgaga tgcatgcttt gcatacttct gcctgctggg gagcctgggg actttccaca 300 cctggttgct gactaattga gatgcatgct ttgcatactt ctgcctgctg gggagcctgg 360 ggactttcca cacccctggg tcgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt 420 acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat 480 ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt 540 cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa 600 actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc 660 aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct 720 acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtcgaggt gagccccacg 780 ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc tccccacccc caattttgta tttatttatt 840 ttttaattat 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gcgccggcgg ctgtcgaggc gcggcgagcc gcagccattg ccttttatgg 1740 taatcgtgcg agagggcgca gggacttcct ttgtcccaaa tctgtgcgga gccgaaatct 1800 gggaggcgcc gccgcacccc ctctagcggg cgcggggcga agcggtgcgg cgccggcagg 1860 aaggaaatgg gcggggaggg ccttcgtgcg tcgccgcgcc gccgtcccct tctccctctc 1920 cagcctcggg gctgtccgcg gggggacggc tgccttcggg ggggacgggg cagggcgggg 1980 ttcggcttct ggcgtgtgac cggcggctct agagcctctg ctaaccatgt tcatgccttc 2040 ttctttttcc tacagctcct gggcaacgtg ctggttattg tgctgtctca tcattttggc 2100 aaagaattga ttaattcgag cgaacgcgtc gccaccatga actccttctc cacaagcgcc 2160 ttcggtccag ttgccttctc cctgggcctg ctcctggtgt tgcctgctgc cttccctgcc 2220 ccagtcttca cactcgaaga tttcgttggg gactggcgac agacagccgg ctacaacctg 2280 gaccaagtcc ttgaacaggg aggtgtgtcc agtttgtttc agaatctcgg ggtgtccgta 2340 actccgatcc aaaggattgt cctgagcggt gaaaatgggc tgaagatcga catccatgtc 2400 atcatcccgt atgaaggtct gagcggcgac caaatgggcc agatcgaaaa aatttttaag 2460 gtggtgtacc ctgtggatga tcatcacttt aaggtgatcc tgcactatgg cacactggta 2520 atcgacgggg 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atacgctgct ttaatgcctt 2700 tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt tcattttctc ctccttgtat aaatcctggt 2760 tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg ttgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg 2820 tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg gcattgccac cacctgtcag ctcctttccg 2880 ggactttcgc tttccccctc cctattgcca cggcggaact catcgccgcc tgccttgccc 2940 gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca ctgacaattc cgtggtgttg tcggggaaat 3000 catcgtcctt tccttggctg ctcgcctgtg ttgccacctg gattctgcgc gggacgtcct 3060 tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag cggaccttcc ttcccgcggc ctgctgccgg 3120 ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc gccctcagac gagtcggatc tccctttggg 3180 ccgcctcccc gcgctcgctt tcttgctgtc caatttctat taaaggttcc tttgttccct 3240 aagtccaact actaaactgg gggatattat gaagggcctt gagcatctgg attctgccta 3300 ataaaaaaca tttattttca ttgcaagctc gctttcttgc tgtccaattt ctattaaagg 3360 ttcctttgtt ccctaagtcc aactactaaa ctgggggata ttatgaaggg ccttgagcat 3420 ctggattctg cctaataaaa aacatttatt ttcattgcaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3480 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 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ctctcctgtt ccgaccctgc 4380 cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct 4440 cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 4500 aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 4560 cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga 4620 ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa 4680 gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta 4740 gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc 4800 agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg 4860 acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga 4920 tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg 4980 agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct 5040 gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg 5100 agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc 5160 cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa 5220 ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc 5280 cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt 5340 cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc 5400 ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt 5460 tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc 5520 catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt 5580 gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata 5640 gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga 5700 tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag 5760 catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa 5820 aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt 5880 attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga 5940 aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgcgccct 6000 gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg 6060 ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg 6120 gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac 6180 ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct 6240 gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt 6300 tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt 6360 tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt 6420 ttaacaaaat attaacgctt acaatttgcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg 6480 aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagcc caagctacca tgataagtaa 6540 gtaatattaa ggtacgtgga ggttttactt gctttaaaaa acctcccaca cctccccctg 6600 aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact tgtttattgc agcttataat 6660 ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat 6720 tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatg gtactgtaac tgagctaaca 6780 taa 6783 <210> 45 <211> 6832 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-6-pGL2-SS*-CMV enhancer-EF1-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR(108 to 120 polyA)-SS* <400> 45 cccgggaggt accgagctct tacgcgtgct agaattaaag taacccaatc agcacacaat 60 tgccattata cgcgcgtata atggactatt gtgtgctgat aaacctattt cagcatacta 120 cgcgcgtagt atgctgaaat aggtgactag aagttcctat actttctaga gaataggaac 180 ttcataactt cgtataatgt atgctatacg aagttatggg ttactttaat ttggttgctg 240 actaattgag atgcatgctt tgcatacttc tgcctgctgg ggagcctggg gactttccac 300 acctggttgc tgactaattg agatgcatgc tttgcatact tctgcctgct ggggagcctg 360 gggactttcc acacccctgg gtcgacgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc 420 aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt 480 aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta 540 tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg 600 gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga 660 cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt 720 tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggggc agagcgcaca 780 tcgcccacag tccccgagaa gttgggggga ggggtcggca attgaaccgg tgcctagaga 840 aggtggcgcg gggtaaactg ggaaagtgat gtcgtgtact ggctccgcct ttttcccgag 900 ggtgggggag aaccgtatat aagtgcagta gtcgccgtga acgttctttt tcgcaacggg 960 tttgccgcca gaacacagct gccttctccc tcctgtgagt ttggtaagtc gacgggccgg 1020 gcctgggccg ggtccgggcc gggtcgttgg atccccacta cagcccgata ctcaagcttg 1080 acgaattcga gtatccaagg tagtggacta gtgtgacgct gctgacccct ttctttccct 1140 tctgcaggtt ggtgtacagt agcttccaaa ttgattaatt cgagcgaacg cgtcgccacc 1200 atgaactcct tctccacaag cgccttcggt ccagttgcct tctccctggg cctgctcctg 1260 gtgttgcctg ctgccttccc tgccccagtc ttcacactcg aagatttcgt tggggactgg 1320 cgacagacag ccggctacaa cctggaccaa gtccttgaac agggaggtgt gtccagtttg 1380 tttcagaatc tcggggtgtc cgtaactccg atccaaagga ttgtcctgag cggtgaaaat 1440 gggctgaaga tcgacatcca tgtcatcatc ccgtatgaag gtctgagcgg cgaccaaatg 1500 ggccagatcg aaaaaatttt taaggtggtg taccctgtgg atgatcatca ctttaaggtg 1560 atcctgcact atggcacact ggtaatcgac ggggttacgc cgaacatgat cgactatttc 1620 ggacggccgt atgaaggcat cgccgtgttc gacggcaaaa agatcactgt aacagggacc 1680 ctgtggaacg gcaacaaaat tatcgacgag cgcctgatca accccgacgg ctccctgctg 1740 ttccgagtaa ccatcaacgg agtgaccggc tggcggctgt gcgaacgcat tctggcggct 1800 agcgctacta acttcagcct gctgaagcag gctggagacg tggaggagaa ccctggacct 1860 ggaagcggag agggcagagg aagtctgcta acatgcggtg acgtcgagga gaatcctgga 1920 cctggatccg gaatggtgag caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg 1980 gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc 2040 gatgccacct acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg 2100 ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc 2160 gaccacatga agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag 2220 cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag 2280 ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac 2340 atcctggggc acaagctgga gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac 2400 aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc 2460 gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg 2520 cccgacaacc actacctgag cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc 2580 gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag 2640 ctgtacaagt aaaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt 2700 aactatgttg ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct 2760 attgcttccc gtatggcttt cattttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt 2820 tatgaggagt tgtggcccgt tgtcaggcaa cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac 2880 gcaaccccca ctggttgggg cattgccacc acctgtcagc tcctttccgg gactttcgct 2940 ttccccctcc ctattgccac ggcggaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca 3000 ggggctcggc tgttgggcac tgacaattcc gtggtgttgt cggggaaatc atcgtccttt 3060 ccttggctgc tcgcctgtgt tgccacctgg attctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc 3120 ccttcggccc tcaatccagc ggaccttcct tcccgcggcc tgctgccggc tctgcggcct 3180 cttccgcgtc ttcgccttcg ccctcagacg agtcggatct ccctttgggc cgcctccccg 3240 cgctcgcttt cttgctgtcc aatttctatt aaaggttcct ttgttcccta agtccaacta 3300 ctaaactggg ggatattatg aagggccttg agcatctgga ttctgcctaa taaaaaacat 3360 ttattttcat tgcaagctcg ctttcttgct gtccaatttc tattaaaggt tcctttgttc 3420 cctaagtcca actactaaac tgggggatat tatgaagggc cttgagcatc tggattctgc 3480 ctaataaaaa acatttattt tcattgcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3540 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3600 aaaaaaaaaa aaaaactcgg aaggacatgg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc 3660 agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca ggtgtggaaa gtccccaggc 3720 tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac caaattaaag 3780 taacccataa cttcgtatag catacattat acgaagttat gaagttccta ttctctagaa 3840 agtataggaa cttctagtca cctatttcag catactacgc gcgtagtatg ctgaaatagg 3900 tttatcagca cacaatagtc cattatacgc gcgtataatg gcaattgtgt gctgattggg 3960 ttactttaat ttggatccgt cgaccgatgc ccttgagagc cttcaaccca gtcagctcct 4020 tccggtgggc gcggggcatg actatcgtcg ccgcacttat gactgtcttc tttatcatgc 4080 aactcgtagg acaggtgccg gcagcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc 4140 tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc 4200 acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg 4260 aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat 4320 cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag 4380 gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga 4440 tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg 4500 tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt 4560 cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac 4620 gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc 4680 ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt 4740 ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc 4800 ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc 4860 agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg 4920 aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag 4980 atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg 5040 tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt 5100 tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca 5160 tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca 5220 gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc 5280 tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt 5340 ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg 5400 gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc 5460 aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg 5520 ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga 5580 tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga 5640 ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta 5700 aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg 5760 ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact 5820 ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata 5880 agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt 5940 tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa 6000 ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgcgccctg tagcggcgca 6060 ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta 6120 gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt 6180 caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac 6240 cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt 6300 tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga 6360 acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg 6420 gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaata 6480 ttaacgctta caatttgcca ttcgccattc aggctgcgca actgttggga agggcgatcg 6540 gtgcgggcct cttcgctatt acgccagccc aagctaccat gataagtaag taatattaag 6600 gtacgtggag gttttacttg ctttaaaaaa cctcccacac ctccccctga acctgaaaca 6660 taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata 6720 aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg 6780 tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatgg tactgtaact gagctaacat aa 6832 <210> 46 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3 copies of Enhancer-1 <400> 46 gggactttcc ggggcggggc acgtggtgca cgggactttc cgtgcacgtg cacgggactt 60 tccgggactt tccgggactt tccgtgcacc acgtggggac tttccgtgca cgggactttc 120 cggggcgggg cacgtggtgc acgggacttt ccgtgcacgt gcacgggact ttccgggact 180 ttccgggact ttccgtgcac cacgtgggga ctttccgtgc acgggacttt ccggggcggg 240 gcacgtggtg cacgggactt tccgtgcacg tgcacgggac tttccgggac tttccgggac 300 tttccgtgca ccacgtgggg actttccgtg cac 333 <210> 47 <211> 1016 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric intron <400> 47 ggagtcgctg cgttgccttc gccccgtgcc ccgctccgcg ccgcctcgcg ccgcccgccc 60 cggctctgac tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg 120 ggctgtaatt agcgcttggt ttaatgacgg ctcgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc 180 cttaaagggc tccgggaggg ccctttgtgc gggggggagc ggctcggggg gtgcgtgcgt 240 gtgtgtgtgc gtggggagcg ccgcgtgcgg ctccgcgctg cccggcggct gtgagcgctg 300 cgggcgcggc gcggggcttt gtgcgctccg cagtgtgcgc gaggggagcg cggccggggg 360 cggtgccccg cggtgcgggg ggggctgcga ggggaacaaa ggctgcgtgc ggggtgtgtg 420 cgtggggggg tgagcagggg gtgtgggcgc ggcggtcggg ctgtaacccc cccctgcacc 480 cccctccccg agttgctgag cacggcccgg cttcgggtgc ggggctccgt acggggcgtg 540 gcgcggggct cgccgtgccg ggcggggggt ggcggcaggt gggggtgccg ggcggggcgg 600 ggccgcctcg ggccggggag ggctcggggg aggggcgcgg cggcccccgg agcgccggcg 660 gctgtcgagg cgcggcgagc cgcagccatt gccttttatg gtaatcgtgc gagagggcgc 720 agggacttcc tttgtcccaa atctgtgcgg agccgaaatc tgggaggcgc cgccgcaccc 780 cctctagcgg gcgcggggcg aagcggtgcg gcgccggcag gaaggaaatg ggcggggagg 840 gccttcgtgc gtcgccgcgc cgccgtcccc ttctccctct ccagcctcgg ggctgtccgc 900 ggggggacgg ctgccttcgg gggggacggg gcagggcggg gttcggcttc tggcgtgtga 960 ccggcggctc tagagcctct gctaaccatg ttcatgcctt cttctttttc ctacag 1016

Claims (135)

  1. 하기를 포함하는 발현 벡터:
    (a) 백본 서열,
    (b) 하기를 포함하는 서열:
    (i) 관심 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트,
    (ii) 발현 카세트의 5' 측면을 플랭킹하는 제1 레콤비나제에 대한 제1 표적 서열,
    (iii) 발현 카세트의 3' 측면을 플랭킹하는 제1 레콤비나제에 대한 제2 표적 서열, 및
    (iv) 제1 레콤비나제에 대한 비-결합 영역 내 제1 및 제2 표적 서열 내에 통합된 하나 이상의 추가 레콤비나제에 대한 하나 이상의 추가 표적 서열, 및
    (c) 하기 중 하나 이상:
    (i) 제1 레콤비나제 및 하나 이상의 추가 레콤비나제에 대한 비-결합 영역 내 제1 레콤비나제에 대한 제1 및/또는 제2 표적 서열 내에 통합된 엔도뉴클레아제 표적 서열, 여기서 엔도뉴클레아제 표적 서열은 백본 서열과 제1 레콤비나제 및 하나 이상의 추가 레콤비나제에 대한 절단 부위 사이에 있음,
    (ii) 제1 레콤비나제에 대한 제1 표적 서열의 3' 말단과 발현 카세트 내 또 다른 인핸서 또는 프로모터의 5' 말단 사이에 통합된 서열식별번호: 12와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 합성 인핸서,
    (iii) 제1 레콤비나제에 대한 제1 표적 서열의 3' 말단과 발현 카세트 내 프로모터의 5' 말단 사이에 통합된 사이토메갈로바이러스 (CMV) 인핸서,
    (iv) 인트론을 포함하는 5' 비번역 영역 (5'UTR), 여기서 5'UTR은 프로모터와 관심 핵산 서열 사이에서 발현 카세트에 통합됨,
    (v) 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된 척추동물 염색질 인슐레이터,
    (vi) 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소 (WPRE),
    (vii) 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된 스캐폴드/매트릭스 부착 영역 (S/MAR), 또는
    (viii) 제1 레콤비나제 및 하나 이상의 추가 레콤비나제에 대한 비-결합 영역 내 제1 레콤비나제에 대한 제1 및/또는 제2 표적 서열 내에 통합된 DNA 핵 표적화 서열 (DTS), 여기서 DTS는 발현 카세트와 제1 레콤비나제 및 하나 이상의 추가 레콤비나제에 대한 절단 부위 사이에 있음.
  2. 제1항에 있어서, 제1 레콤비나제 및 하나 이상의 추가 레콤비나제에 대한 비-결합 영역 내 제1 레콤비나제에 대한 제1 및/또는 제2 표적 서열 내에 통합된 엔도뉴클레아제 표적 서열을 포함하고, 여기서 엔도뉴클레아제 표적 서열이 백본 서열과 제1 레콤비나제 및 하나 이상의 추가 레콤비나제에 대한 절단 부위 사이에 있는 것인 발현 벡터.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 레콤비나제에 대한 제1 및 제2 표적 서열 내에 통합된 엔도뉴클레아제 표적 서열을 포함하는 발현 벡터.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도뉴클레아제 표적 서열이 귀소 엔도뉴클레아제에 대한 것인 발현 벡터.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도뉴클레아제 표적 서열이 I-AniI, I-CeuI, I-ChuI, I-CpaI, I-CpaII, I-CreI, I-DmoI, H-DreI, I-HmuI, I-HmuII, I-LlaI, I-MsoI, PI-PfuI, PI-PkoII, I-PorI, I-PpoI, PI-PspI, I-ScaI, I-SceI, PI-SceI, I-SceII, I-SecIII, I-SceIV, I-SceV, I-SceVI, I-SceVII, I-Ssp6803I, I-TevI, I-TevII, I-TevIII, PI-TliI, PI-TliII, I-Tsp061I 또는 I-Vdi141I에 대한 것인 발현 벡터.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도뉴클레아제 표적 서열이 I-SceI에 대한 것인 발현 벡터.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도뉴클레아제 표적 서열이 PI-SceI에 대한 것인 발현 벡터.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도뉴클레아제 표적 서열이 Cas 엔도뉴클레아제에 대한 것인 발현 벡터.
  9. 제8항에 있어서, Cas 엔도뉴클레아제가 Cas9인 발현 벡터.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 레콤비나제에 대한 제1 표적 서열의 3' 말단과 발현 카세트 내 또 다른 인핸서 또는 프로모터의 5' 말단 사이에 통합된 서열식별번호: 12와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 합성 인핸서를 포함하는 발현 벡터.
  11. 제10항에 있어서, 합성 인핸서가 서열식별번호: 12와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열의 다중 인접 카피를 포함하는 것인 발현 벡터.
  12. 제11항에 있어서, 합성 인핸서가 서열식별번호: 46과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 것인 발현 벡터.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 인핸서가 닭 β-액틴 프로모터의 5' 말단에 통합되는 것인 발현 벡터.
  14. 제13항에 있어서, 닭 β-액틴 프로모터의 3' 말단 및 관심 핵산 서열의 5'에 통합된 서열식별번호: 47과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 키메라 인트론을 포함하는 발현 벡터.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 레콤비나제에 대한 제1 표적 서열의 3' 말단과 발현 카세트 내 프로모터의 5' 말단 사이에 통합된 CMV 인핸서를 포함하는 발현 벡터.
  16. 제15항에 있어서, CMV 인핸서가 서열식별번호: 12 또는 서열식별번호: 46과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 합성 인핸서의 3' 말단에 통합되는 것인 발현 벡터.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, CMV 프로모터가 CMV 인핸서의 3' 말단 및 관심 핵산 서열의 5'에 통합되는 것인 발현 벡터.
  18. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 레콤비나제에 대한 제1 표적 서열과 관심 핵산 서열 사이에 통합된 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 38 또는 서열식별번호: 39와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
  19. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 인트론을 포함하는 5'UTR을 포함하고, 여기서 5'UTR이 프로모터와 관심 핵산 서열 사이에서 발현 카세트에 통합되는 것인 발현 벡터.
  20. 제19항에 있어서, 인트론이 서열식별번호: 1과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 것인 발현 벡터.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 인트론 내에 통합된 비-코딩 서열을 추가로 포함하는 발현 벡터.
  22. 제20항에 있어서, 서열식별번호: 1의 위치 25 내지 55로부터의 임의의 2개의 뉴클레오티드에 상응하는 인트론 내 2개의 뉴클레오티드 사이에 통합된 비-코딩 서열을 추가로 포함하는 발현 벡터.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 비-코딩 서열이 S/MAR인 발현 벡터.
  24. 제23항에 있어서, S/MAR이 MAR-5인 발현 벡터.
  25. 제19항에 있어서, 5'UTR이 서열식별번호: 3과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 것인 발현 벡터.
  26. 제19항에 있어서, 5'UTR이 서열식별번호: 5와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 것인 발현 벡터.
  27. 제19항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터가 닭 β-액틴 프로모터인 발현 벡터.
  28. 제19항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터가 CMV 프로모터인 발현 벡터.
  29. 제19항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터가 CMV 인핸서의 3' 말단에 통합되는 것인 발현 벡터.
  30. 제29항에 있어서, CMV 인핸서가 서열식별번호: 12 또는 서열식별번호: 46과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 합성 인핸서의 3' 말단에 통합되는 것인 발현 벡터.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리아데닐화 신호가 관심 핵산 서열의 3' 말단에 통합되는 것인 발현 벡터.
  32. 제31항에 있어서, 폴리아데닐화 신호가 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14 또는 서열식별번호: 15와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 것인 발현 벡터.
  33. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된 척추동물 염색질 인슐레이터를 포함하는 발현 벡터.
  34. 제33항에 있어서, 척추동물 염색질 인슐레이터가 5'-HS4 닭-β-글로빈 인슐레이터 (cHS4)인 발현 벡터.
  35. 제1항 내지 제30항, 제33항 및 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된 WPRE를 포함하는 발현 벡터.
  36. 제1항 내지 제30항 및 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된 S/MAR을 포함하는 발현 벡터.
  37. 제36항에 있어서, S/MAR이 MAR-5인 발현 벡터.
  38. 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리아데닐화 신호가 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14 또는 서열식별번호: 15와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 것인 발현 벡터.
  39. 제2항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 레콤비나제에 대한 제1 및 제2 표적 서열의 각 측면을 플랭킹하는 인핸서 서열을 추가로 포함하는 발현 벡터.
  40. 제39항에 있어서, 제1 레콤비나제에 대한 제1 및 제2 표적 서열의 각 측면을 플랭킹하는 적어도 2개의 인핸서 서열을 포함하는 발현 벡터.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 인핸서 서열이 SV40 인핸서 서열인 발현 벡터.
  42. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 레콤비나제 및 하나 이상의 추가 레콤비나제에 대한 비-결합 영역 내 제1 레콤비나제에 대한 제1 및/또는 제2 표적 서열 내에 통합된 DTS를 포함하고, 여기서 DTS는 발현 카세트와 제1 레콤비나제 및 하나 이상의 추가 레콤비나제에 대한 절단 부위 사이에 있는 것인 발현 벡터.
  43. 제42항에 있어서, DTS가 SV40 인핸서 서열인 발현 벡터.
  44. 제42항에 있어서, DTS가 세포-특이적인 발현 벡터.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 표적 서열 및 하나 이상의 추가 표적 서열이 PY54 pal 부위, N15 telRL 부위, loxP 부위, φK02 telRL 부위, FRT 부위, phiC31 attP 부위 및 λ attP 부위로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 발현 벡터.
  46. 제45항에 있어서, 각각의 표적 서열을 포함하는 발현 벡터.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, pal 부위 및 pal 부위 내에 통합된 telRL, loxP 및 FRT 레콤비나제 표적 결합 서열을 포함하는 발현 벡터.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 레콤비나제에 대한 제1 및 제2 표적 서열이 각각 서열식별번호: 33의 핵산 서열을 포함하는 것인 발현 벡터.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 서열-무함유 벡터를 생산하기 위한 발현 벡터.
  50. 제49항에 있어서, 박테리아 서열-무함유 벡터가 원형 공유 폐쇄형 벡터인 발현 벡터.
  51. 제49항에 있어서, 박테리아 서열-무함유 벡터가 선형 공유 폐쇄형 벡터인 발현 벡터.
  52. 유도성 프로모터의 제어 하에 레콤비나제를 코딩하는 재조합 세포를 포함하는 벡터 생산 시스템으로서, 재조합 세포는 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 발현 벡터를 포함하고, 여기서 레콤비나제는 제1 레콤비나제에 대한 제1 및 제2 표적 서열 또는 발현 벡터 내 하나 이상의 추가 레콤비나제에 대한 하나 이상의 추가 표적 서열 중 하나를 표적화하는 것인 벡터 생산 시스템.
  53. 제52항에 있어서, 레콤비나제가 TelN, Tel, Cre 또는 Flp인 벡터 생산 시스템.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 재조합 세포가 유도성 프로모터의 제어 하에 엔도뉴클레아제를 추가로 코딩하고, 여기서 엔도뉴클레아제가 엔도뉴클레아제 표적 서열을 포함하는 발현 벡터 내 엔도뉴클레아제 표적 서열을 표적화하는 것인 벡터 생산 시스템.
  55. 제54항에 있어서, 엔도뉴클레아제가 귀소 엔도뉴클레아제인 벡터 생산 시스템.
  56. 제55항에 있어서, 귀소 엔도뉴클레아제가 I-AniI, I-CeuI, I-ChuI, I-CpaI, I-CpaII, I-CreI, I-DmoI, H-DreI, I-HmuI, I-HmuII, I-LlaI, I-MsoI, PI-PfuI, PI-PkoII, I-PorI, I-PpoI, PI-PspI, I-ScaI, I-SceI, PI-SceI, I-SceII, I-SecIII, I-SceIV, I-SceV, I-SceVI, I-SceVII, I-Ssp6803I, I-TevI, I-TevII, I-TevIII, PI-TliI, PI-TliII, I-Tsp061I 또는 I-Vdi141I인 벡터 생산 시스템.
  57. 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도뉴클레아제가 I-SceI인 벡터 생산 시스템.
  58. 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도뉴클레아제가 PI-SceI인 벡터 생산 시스템.
  59. 제54항에 있어서, 재조합 세포가 엔도뉴클레아제를 포함하는 뉴클레아제 게놈 편집 시스템을 코딩하는 것인 벡터 생산 시스템.
  60. 제59항에 있어서, 뉴클레아제 게놈 편집 시스템이 가이드 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제를 포함하는 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문구조 반복부 (CRISPR) 뉴클레아제 시스템인 벡터 생산 시스템.
  61. 제60항에 있어서, Cas 엔도뉴클레아제가 Cas9인 벡터 생산 시스템.
  62. 제52항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 유도성 프로모터가 열-조절성, 화학적-조절성, IPTG 조절성, 글루코스-조절성, 아라비노스 유도성, T7 폴리머라제 조절성, 저온-충격 유도성, pH 유도성, 또는 이들의 조합인 벡터 생산 시스템.
  63. 레콤비나제의 발현에 적합한 조건 하에 제52항 내지 제62항 중 어느 한 항의 벡터 생산 시스템을 인큐베이션하는 것을 포함하는, 박테리아 서열-무함유 벡터를 생산하는 방법.
  64. 제63항에 있어서, 엔도뉴클레아제의 발현에 적합한 조건 하에 제38항 내지 제46항 중 어느 한 항의 벡터 생산 시스템을 인큐베이션하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  65. 제63항 또는 제64항에 있어서, 뉴클레아제 게놈 편집 시스템의 발현에 적합한 조건 하에 제59항 내지 제62항 중 어느 한 항의 벡터 생산 시스템을 인큐베이션하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  66. 제63항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 서열-무함유 벡터를 수확하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  67. 제63항 내지 제66항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 박테리아 서열-무함유 벡터.
  68. 하기를 포함하는 박테리아 서열-무함유 벡터:
    (a) 관심 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트, 및
    (b) 하기 중 하나 이상:
    (i) 발현 카세트 내 또 다른 인핸서 또는 프로모터에 대해 5'에 위치된 서열식별번호: 12와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 합성 인핸서,
    (ii) 발현 카세트 내 프로모터에 대해 5'에 위치된 CMV 인핸서,
    (iii) 인트론을 포함하는 5'UTR, 여기서 5'UTR은 프로모터와 관심 핵산 서열 사이에서 발현 카세트에 통합됨,
    (iv) 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된 척추동물 염색질 인슐레이터,
    (v) 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된 WPRE,
    (vi) 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된 S/MAR, 또는
    (vii) 발현 카세트에 대해 5'에 위치된 DTS.
  69. 제68항에 있어서, 발현 카세트 내 또 다른 인핸서 또는 프로모터에 대해 5'에 위치된 서열식별번호: 12와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 합성 인핸서를 포함하는 박테리아 서열-무함유 벡터.
  70. 제69항에 있어서, 합성 인핸서가 서열식별번호: 12와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열의 다중 인접 카피를 포함하는 것인 박테리아 서열-무함유 벡터.
  71. 제70항에 있어서, 합성 인핸서가 서열식별번호: 46과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 것인 박테리아 서열-무함유 벡터.
  72. 제69항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 인핸서가 닭 β-액틴 프로모터의 5' 말단에 통합되는 것인 박테리아 서열-무함유 벡터.
  73. 제72항에 있어서, 닭 β-액틴 프로모터의 3' 말단 및 관심 핵산 서열의 5'에 통합된 서열식별번호: 47과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 키메라 인트론을 포함하는 박테리아 서열-무함유 벡터.
  74. 제68항에 있어서, 발현 카세트 내 프로모터에 대해 5'에 위치된 CMV 인핸서를 포함하는 박테리아 서열-무함유 벡터.
  75. 제74항에 있어서, CMV 인핸서가 서열식별번호: 12 또는 서열식별번호: 46과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 합성 인핸서의 3' 말단에 통합되는 것인 박테리아 서열-무함유 벡터.
  76. 제74항 또는 제75항에 있어서, CMV 프로모터가 CMV 인핸서의 3' 말단 및 관심 핵산 서열의 5'에 통합되는 것인 박테리아 서열-무함유 벡터.
  77. 제68항에 있어서, 관심 핵산 서열에 대해 5'에 위치된 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 38 또는 서열식별번호: 39와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 박테리아 서열-무함유 벡터.
  78. 제68항에 있어서, 인트론을 포함하는 5'UTR을 포함하고, 여기서 5'UTR이 프로모터와 관심 핵산 서열 사이에서 발현 카세트에 통합되는 것인 박테리아 서열-무함유 벡터.
  79. 제78항에 있어서, 인트론이 서열식별번호: 1과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 것인 박테리아 서열-무함유 벡터.
  80. 제78항 또는 제79항에 있어서, 인트론 내에 통합된 비-코딩 서열을 추가로 포함하는 박테리아 서열-무함유 벡터.
  81. 제79항에 있어서, 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 위치 25 및 55로부터의 임의의 2개의 뉴클레오티드에 상응하는 인트론 내 2개의 뉴클레오티드 사이에 통합된 비-코딩 서열을 추가로 포함하는 박테리아 서열-무함유 벡터.
  82. 제80항 또는 제81항에 있어서, 비-코딩 서열이 S/MAR인 박테리아 서열-무함유 벡터.
  83. 제82항에 있어서, S/MAR이 MAR-5인 박테리아 서열-무함유 벡터.
  84. 제78항에 있어서, 5'UTR이 서열식별번호: 3과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 것인 박테리아 서열-무함유 벡터.
  85. 제78항에 있어서, 5'UTR이 서열식별번호: 5와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 것인 박테리아 서열-무함유 벡터.
  86. 제78항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터가 닭 β-액틴 프로모터인 박테리아 서열-무함유 벡터.
  87. 제78항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터가 CMV 프로모터인 박테리아 서열-무함유 벡터.
  88. 제78항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터가 CMV 인핸서의 3' 말단에 통합되는 것인 박테리아 서열-무함유 벡터.
  89. 제88항에 있어서, CMV 인핸서가 서열식별번호: 12 또는 서열식별번호: 46과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 합성 인핸서의 3' 말단에 통합되는 것인 박테리아 서열-무함유 벡터.
  90. 제68항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리아데닐화 신호가 관심 핵산 서열의 3' 말단에 통합되는 것인 박테리아 서열-무함유 벡터.
  91. 제90항에 있어서, 폴리아데닐화 신호가 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14 또는 서열식별번호: 15와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 것인 박테리아 서열-무함유 벡터.
  92. 제68항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된 척추동물 염색질 인슐레이터를 포함하는 박테리아 서열-무함유 벡터.
  93. 제92항에 있어서, 척추동물 염색질 인슐레이터가 cHS4인 박테리아 서열-무함유 벡터.
  94. 제68항 내지 제89항, 제92항 및 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된 WPRE를 포함하는 박테리아 서열-무함유 벡터.
  95. 제68항 내지 제89항 및 제92항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 핵산과 폴리아데닐화 신호 사이에서 발현 카세트에 통합된 S/MAR을 포함하는 박테리아 서열-무함유 벡터.
  96. 제95항에 있어서, S/MAR이 MAR-5인 박테리아 서열-무함유 벡터.
  97. 제92항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리아데닐화 신호가 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14 또는 서열식별번호: 15와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 것인 박테리아 서열-무함유 벡터.
  98. 제68항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 카세트의 각 측면을 플랭킹하는 인핸서 서열을 추가로 포함하는 박테리아 서열-무함유 벡터.
  99. 제98항에 있어서, 발현 카세트의 각 측면을 플랭킹하는 적어도 2개의 인핸서 서열을 포함하는 박테리아 서열-무함유 벡터.
  100. 제98항 또는 제99항에 있어서, 인핸서 서열이 SV40 인핸서 서열인 박테리아 서열-무함유 벡터.
  101. 제68항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 카세트에 대해 5'에 위치된 DTS를 포함하는 박테리아 서열-무함유 벡터.
  102. 제101항에 있어서, DTS가 SV40 인핸서 서열인 박테리아 서열-무함유 벡터.
  103. 제101항에 있어서, DTS가 세포-특이적인 박테리아 서열-무함유 벡터.
  104. 제68항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 원형 공유 폐쇄형 벡터인 박테리아 서열-무함유 벡터.
  105. 제68항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 선형 공유 폐쇄형 벡터인 박테리아 서열-무함유 벡터.
  106. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 발현 벡터 또는 제67항 내지 제105항 중 어느 한 항의 박테리아 서열-무함유 벡터를 포함하는 재조합 세포.
  107. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 발현 벡터 또는 제67항 내지 제105항 중 어느 한 항의 박테리아 서열-무함유 벡터를 포함하는 조성물.
  108. 제107항에 있어서, 전달제를 추가로 포함하는 조성물.
  109. 제108항에 있어서, 전달제가 나노입자인 조성물.
  110. 제108항 또는 제109항에 있어서, 전달제가 표적화 리간드를 포함하는 것인 조성물.
  111. 제107항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 제약 조성물인 조성물.
  112. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 발현 벡터, 제67항 내지 제105항 중 어느 한 항의 박테리아 서열-무함유 벡터, 또는 제111항의 제약 조성물을 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
  113. 서열식별번호: 1과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  114. 서열식별번호: 2와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  115. 서열식별번호: 3과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  116. 서열식별번호: 5와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  117. 서열식별번호: 12와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  118. 서열식별번호: 46과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  119. 서열식별번호: 13과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  120. 서열식별번호: 14와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  121. 서열식별번호: 15와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  122. 제86항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 서열의 3' 말단에 100 내지 120개의 아데닌 뉴클레오티드를 추가로 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  123. 서열식별번호: 16과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  124. 서열식별번호: 17과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  125. 서열식별번호: 18과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  126. 서열식별번호: 35와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  127. 서열식별번호: 36과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  128. 서열식별번호: 37과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  129. 서열식별번호: 38과 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  130. 서열식별번호: 39와 적어도 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  131. 제113항 내지 제130항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  132. 제114항 내지 제116항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 및 제119항 내지 제125항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  133. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 발현 벡터, 제67항 내지 제105항 중 어느 한 항의 박테리아 서열-무함유 벡터, 또는 제107항 내지 제111항 중 어느 한 항의 제약 조성물로부터의 관심 핵산 서열을 유전자 편집을 위한 표적 부위에 삽입하는 것을 포함하는 유전자 편집 방법.
  134. 제133항에 있어서, 유전자 편집이 비-상동성 말단 연결에 의한 것인 방법.
  135. 제133항에 있어서, 유전자 편집이 상동성-지정 복구에 의한 것인 방법.
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