KR20220016485A - 미엘린 단백질 제로 프로모터를 갖는 aav 벡터, 및 샤르코-마리-투스 질환과 같은 슈반 세포-관련 질환을 치료하기 위한 이의 용도 - Google Patents

미엘린 단백질 제로 프로모터를 갖는 aav 벡터, 및 샤르코-마리-투스 질환과 같은 슈반 세포-관련 질환을 치료하기 위한 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 슈반(Schwann) 세포에 특이적으로 폴리뉴클레오티드를 전달하는 것과, 슈반 세포 특이적 발현을 달성하는 것에 의한, 슈반 세포와 관련된 질환의 치료 및 예방에서 사용하기 위한 바이러스 벡터를 제공한다. 본 발명은 샤르코-마리-투스(Charcot-Marie-Tooth) 질환 및 다른 탈미엘린성(demyelinating) 신경장해의 치료 및 예방에서 특정 용도를 갖는다. 바람직한 벡터는 미엘린 단백질 제로(Mpz: Myelin Protein Zero, P0) 또는 최소 Mpz 프로모터로부터의 슈반 세포-특이적 프로모터를 갖는 아데노-관련 벡터(AAV: adeno-associated vector)이다.

Description

미엘린 단백질 제로 프로모터를 갖는 AAV 벡터, 및 샤르코-마리-투스 질환과 같은 슈반 세포-관련 질환을 치료하기 위한 이의 용도
본 발명은 슈반(Schwann) 세포와 관련된 질환을 표적으로 하는 바이러스 벡터에 관한 것이다.
샤르코-마리-투스(CMT: Charcot-Marie-Tooth) 질환은 수많은 유형의 비증후군성 유전적 신경장해를 포함하며, 이환 개체 대 일반 인구의 빈도가 1:2500에 이르는 가장 통상적인 신경원성 장애 중 하나로 여겨진다(1, 2). CMT 신경장해는 상이한 유전자에 의해 야기되는 표현형 중첩 및 원인 유전자의 수를 계속 증가시키는 개입을 특징으로 한다. 또한, 여러 상이한 유전자는 동일한 표현형을 야기할 수 있다. CMT 신경장해를 기반으로 하는 복잡한 유전적 기초 및 다양한 질환 메커니즘의 이해가 증가하고 있음에도 불구하고, 현재 CMT 형태 중 어느 하나에 대한 효과적인 치료법이 없고, 오로지 대증 및 지지 요법만이 환자에게 제공될 수 있다. 따라서, CMT에 관한 새로운 치료 전략에 대한 많은 요구가 존재한다. 지난 20년 동안 CMT의 치료를 위한 유전자 요법을 개발하려는 노력이 있었다. 상이한 유전자 요법은 중추 및 말초 신경계(PNS: peripheral nervous system)의 질환을 치료할 미래 잠재력이 있는 반면, 극복되어야 하는 많은 과제가 남아있다(3).
예를 들어, (49)는 렌티바이러스 벡터를 사용한 CMT4C의 치료에서 치료적 효과를 어떻게 달성할 수 있는지를 보여준다. 그러나, 이러한 효과는 부분적이었고, 렌티바이러스 벡터는 생체내(in vivo) 인간 요법에 대한 안전성 제한을 갖는다. 이전에는, 다른 벡터 예컨대 아데노-관련 바이러스 벡터(AAV: adeno-associated viral vector)는, 더 안정하고 호스트 게놈에 통합되지 않음에도 불구하고, 길이 약 4.4 kb의 삽입물의 이의 최대 패키징 용량으로 인하여, 특히 대체되는 유전자가 비교적 긴 경우에 유전자 요법 전략에서의 AAV의 유용성이 제한되기 때문에, 유용한 것으로 여겨지지 않았다.
슈반 세포를 표적으로 하는 유전자 요법 기술은 CMT 이외에 슈반 세포와 관련된 많은 다른 질환, 예를 들어 운동 뉴런 질환(MND: motor neuron disease)에 적용될 수 있고, 유전적 인자에 의해서만 야기되지는 않는 것을 포함한다. 이러한 질환 중 대부분은 다양한 원인을 갖고 잘 알려져 있지 않았으므로, 바이러스 벡터를 사용하여 이러한 질환을 표적으로 하는 것이 특히 유리할 수 있다.
전반적으로, 더 나은 치료적 효과를 달성하기 위하여, CMT와 같은 탈미엘린성(demyelinating) 신경장해를 포함하여, 슈반 세포와 관련된 질환을 표적으로 하는 개선된 방법에 대한 요구가 있다.
본 발명자들은 말초 신경계(PNS)의 슈반 세포에 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 치료적 폴리뉴클레오티드를 전달하고 슈반 세포에서 특이적으로 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하는 유용한 수단을 처음으로 개발하였다. 본 발명은 슈반 세포와 관련된 질환의 치료에 적용될 수 있고, 탈미엘린성 신경장해 예컨대 샤르코-마리-투스 질환(CMT)의 치료에 적용될 때 특히 유익한 것으로 여겨진다. 그러나, 본 발명의 기본 메커니즘은 슈반 세포에 영향을 주는 많은 다른 질환에 적용가능한 것으로 여겨지고, 또한 슈반 세포에 대한 폴리뉴클레오티드의 전달이 예를 들어 슈반 세포의 영상화에서 유리한 것으로 여겨지는 임의의 상황에서 일반적 유용성을 갖는 것으로 여겨진다.
본 발명의 한 양태의 특징은 PNS의 슈반 세포에서 특이적으로 관심 대상인 제1 폴리뉴클레오티드의 생성을 야기하는 제1 핵산의 전사를 달성하기 위한 AAV 벡터의 사용이다. 일부 구현예에서, 이러한 세포-유형 특이적 발현은 미엘린 특이적 프로모터를 사용하여 달성되고, 일부 구현예에서 이는 미엘린 특이적 프로모터의 최소 버전을 사용하여 달성된다.
본 발명의 또다른 특징은 최소 미엘린 특이적 프로모터의 제공이고, 이는 일부 구현예에서 전장 미엘린 단백질 제로(Mpz: myelin protein zero) 프로모터의 서열을 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 더 짧은 최소 프로모터를 포함하는 바이러스 벡터는 더 큰 핵산 서열, 예를 들어 치료적 핵산 서열이 벡터에 포함되고 슈반 세포에 전달되는 것을 허용한다. 이는 슈반 세포에 대한 핵산의 전달을 위한 보편적 벡터를 제공하는 유리한 특성을 갖는 것으로 여겨지며, 현재의 접근은 예를 들어 그 크기로 인해 바이러스 벡터로부터 발현될 수 있는 유전자가 제한되기 때문에, 넓은 범위의 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 청구항에 의해 정의된 바와 같다.
본 발명은 일반적으로 의약에서 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 바이러스 벡터를 제공하고, 또한 본 발명에 따른 벡터의 투여, 예를 들어 본원에 기재된 수단 중 어느 하나에 의한 투여를 포함하는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 제1 양태는 슈반 세포와 관련된 질환의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 바이러스 벡터를 제공한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 제1 폴리뉴클레오티드로 전사될 수 있는 제1 핵산 서열을 포함한다.
바이러스 벡터는 임의의 바이러스 벡터일 수 있다.
바이러스 벡터는 당업계에 익히 공지되어 있고, 예는 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 아데노-관련 바이러스 벡터(AAV 벡터); 렌티바이러스 벡터(예를 들어 인간 면역결핍 바이러스(HIV: Human Immunodeficiency Virus)로부터 유래된 것); 레트로바이러스 벡터(예를 들어 MMLV).
일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스 벡터(AAV 벡터)이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 슈반 세포와 관련된 질환의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 AAV 벡터를 제공하고, 여기서 AAV 벡터는 제1 폴리뉴클레오티드로 전사될 수 있는 제1 핵산 서열을 포함한다.
제1 핵산 서열이 전사되는 경우, 예를 들어 표적 세포 또는 표적 유기체로 전사되는 경우가 바람직하다. 따라서, 추가 구현예는 슈반 세포와 관련된 질환의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 바이러스 벡터를 제공하고, 여기서 바이러스 벡터는 제1 폴리뉴클레오티드로 전사되는 제1 핵산 서열을 포함한다.
추가 구현예는 슈반 세포와 관련된 질환의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 AAV를 제공하고, 여기서 바이러스 벡터는 제1 폴리뉴클레오티드로 전사되는 제1 핵산 서열을 포함한다.
제1 핵산 서열은 표적 세포 또는 표적 유기체에서 제1 폴리뉴클레오티드로 전사될 수 있고, 예를 들어 슈반 세포에서 전사된다. 슈반 세포는 생체내에 있을 수 있고, 예를 들면 예를 들어 인간, 고양이, 개, 마우스, 토끼, 말일 수 있는 포유류 유기체에 있을 수 있다.
슈반 세포는 감각 및 운동 뉴런의 축삭(axon) 주변을 감싸고, 주변의 미엘린초(myelin sheath)를 생성하는 말초 신경계(PNS)의 신경교 세포(glial cell)이다. 미엘린초는 여러 단백질 구성요소(예를 들어 미엘린 단백질 제로)로 구성되고, 신경을 따라 신경 충동(활동 전위)의 빠른 전도를 허용하는 뉴론의 필수 절연 구성요소이다.
일부 현재의 바이러스-벡터 기반 치료 전략은 바람직하지 않은 특성을 갖는 벡터를 이용한다. 예를 들어, 일부 바이러스 벡터는 명백한 잠재적인 해로운 결과와 함께 호스트 게놈에 통합된다. 따라서, 한 구현예에서 바이러스 벡터는 호스트 세포의 게놈에 통합되는 바이러스 벡터가 아니고, 예를 들어 슈반 세포의 핵산에 통합되지 않을 것이다. 호스트 게놈에 통합되는 것으로 여겨지지 않는 바이러스 벡터는 일부 구현예에서 특히 바람직하고, AAV 및 아데노바이러스 벡터를 포함한다. AAV 벡터는 표적 세포를 감염시키고, 전달된 유전 물질은 호스트 세포의 게놈에 통합되지 않는다. 대신에, 전달된 유전 물질은 에피솜으로 남아있다.
호스트 게놈에 통합되는 것으로 여겨지는 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 따라서, 한 구현예에서 바이러스 벡터는 호스트 게놈에 통합되는 벡터가 아니고, 예를 들어 레트로바이러스 벡터가 아니고, 예를 들어 렌티바이러스 벡터가 아니다.
일부 벡터는 또한 슈반 세포를 형질도입(transduce)시킬 수 없다. 당업자는 슈반 세포를 형질도입시킬 수 있는 벡터 및 형질도입시킬 수 없는 벡터의 유형을 이해할 것이다. 따라서, 한 구현예에서 본 발명의 바이러스 벡터는 슈반 세포를 형질도입시킬 수 없는 바이러스 벡터가 아니다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 슈반 세포를 형질도입시키는 능력을 갖는다. "형질도입"이란, 바이러스 벡터가 표적 세포를 감염시키고 그 내에서 발견되는 폴리뉴클레오티드 작제물(construct)을 표적 세포로 전달할 수 있음을 의미한다. 상기 벡터의 예는 AAV 및 렌티바이러스 벡터를 포함한다.
한 구현예에서 벡터는 제한된 크기의 삽입물만이 불안정해지기 전에 혼입될 수 있는 벡터이다. 예를 들어, 상기 벡터는 AAV 벡터를 포함한다.
바람직하게는, 바이러스 벡터는 AAV 벡터이고, 일부 구현예에서, AAV 벡터는 하기를 포함하거나 이로 이루어지는 군으로부터 선택된다: AAV9 및 AAVrh10. 특히 바람직한 구현예에서, AAV는 AAV9이다.
제1 핵산의 전사가 슈반 세포에서만 발생하거나, 실질적으로 슈반 세포에서만 발생하는 것이 바람직하다. 따라서, 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 또한 제1 핵산에 작동가능하게 연결된 슈반 세포 특이적 프로모터를 함유한다.
"슈반 세포 특이적 프로모터"란, 슈반 세포에서 유의한 발현을 야기하고 비(非)슈반 세포에서 낮은 발현을 야기하거나 발현을 야기하지 않는 프로모터의 의미를 포함한다. 예를 들어, 슈반 세포 특이적 프로모터는 슈반 세포에서 제1 핵산으로부터 높은 전사 수준을 유도할 수 있는 반면(예를 들어 슈반 세포에서 전체 발현의 95% 이상이 발생함), 제1 폴리뉴클레오티드의 발현은 다른 세포 유형, 예를 들어 중추 신경계의 것에서 낮다(예를 들어, 전체 발현의 5% 미만이 슈반 세포 이외의 유전자를 세포에서 발생함). 예를 들어, 한 구현예에서, 슈반 세포 대 비슈반 세포의 전사 비율은 적어도 100:0; 95:5; 90:10; 85:15; 80:20; 75:25; 70:30; 65:35; 60:40; 또는 55:45이다.
한 구현예에서 슈반 세포에서 전사 수준은 임의의 다른 비슈반 세포에서보다 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 250, 500, 750, 1000, 2500, 5000, 7500, 10000배 더 높다.
한 구현예에서 슈반 세포 특이적 프로모터는 비슈반 세포보다는 슈반 세포에서 발생하는 발현의 대부분을 야기한다.
당업자는 심지어 매우 특이적인 프로모터가 다른 세포 또는 조직에서 일부 발현을 야기할 수 있음을 이해할 것이다. 당업자는 프로모터를 세포 또는 조직 특이적, 예를 들어 슈반 세포 특이적으로 분류하는데 필요한 표적 세포 또는 조직과 비표적 세포 또는 조직과의 사이의 차등적 발현 수준을 잘 알고 있다. 예를 들어, (66) 및 (67)은 중추 신경계(CNS)에서 세포-특이적 프로모터의 식별을 입증한다. 당업자는 프로모터가 세포-특이적이기 위해서는 이는 특정 세포 유형에서만 프로모터를 활성화시키는 조절 요소(예를 들어 전사 인자에 대한 결합 부위)를 함유해야 하고, 프로모터는 시험관내(in vitro) 및 생체내에서 리포터 유전자 또는 다른 유전자의 입증가능한 발현을 유도할 수 있어야 한다는 것을 알고 있을 것이다.
바람직하게는 슈반 세포 특이적 프로모터는 슈반 세포에서만 검출가능한 수준에서 제1 핵산의 전사를 야기한다. 당업자는 전사를 검출하는 통상적 방법, 예를 들어 노던 블롯(northern blot), PCR 기반 기술 및 면역형광 라벨링을 잘 알고 있다. 한 구현예에서 슈반 세포 특이적 프로모터는 슈반 세포에서 제1 핵산의 검출가능한 전사를 야기하지만, 비슈반 세포에서, 예를 들어 검출이 노던 블롯 분석을 사용하여 수행될 때 말초 신경계 또는 뇌의 다른 세포에서 제1 핵산의 전사의 검출가능한 수준을 야기하지 않는다. 또다른 구현예에서 슈반 세포 특이적 프로모터는 슈반 세포에서 제1 핵산의 검출가능한 전사를 야기하지만, 비슈반 세포에서, 예를 들어 검출이 세포 마커를 사용한 면역형광 라벨링 분석을 사용하여 수행될 때 말초 신경계 또는 뇌의 다른 세포에서 제1 핵산의 전사의 검출가능한 수준을 야기하지 않는다.
예를 들어 (32) 및 (33)은 슈반 세포 특이적 발현이 렌티바이러스 벡터를 사용하는 전장 Mpz 프로모터에 의해 유도된 작제물을 사용하여 시험관내 및 생체내 모두에서 달성될 수 있음을 입증한다.
슈반 세포 특이적 프로모터는 일부 구현예에서, 미엘린 특이적 프로모터를 포함한다. "미엘린 특이적 프로모터"란, 미엘린초를 구성하는 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현을 전형적으로 유도하는 프로모터를 의미한다. 미엘린 특이적 프로모터의 예는 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 미엘린 단백질 제로(Mpz) 프로모터; 말초 미엘린 단백질 22(PMP22) 프로모터; 미엘린 관련 당단백질(Mag) 프로모터.
일부 구현예에서, 제1 폴리뉴클레오티드의 발현은 전장 미엘린 단백질 제로(Mpz) 프로모터, 예컨대 전장 랫트 미엘린 단백질 제로(Mpz) 프로모터의 제어 하에 있고, 이의 서열은 SEQ ID NO. 4에 정의되어 있다. 일부 구현예에서, Mpz 프로모터의 서열은 SEQ ID NO. 4와 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%인, 선택적으로 SEQ ID NO. 4와 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%인 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 프로모터 서열은 인간 또는 인간화 프로모터 서열로부터 유래되는 것이 바람직함이 당업자에게 명백할 것이다. 일부 구현예에서, 제1 폴리뉴클레오티드의 발현은 전장 인간 미엘린 단백질 제로(hP0) 프로모터의 제어 하에 있고, 이의 서열은 SEQ ID NO. 18에 정의되어 있다. 일부 구현예에서, hP0 프로모터의 서열은 SEQ ID NO. 18과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%인, 선택적으로 SEQ ID NO. 18과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%인 서열을 갖는다.
상기 논의된 바와 같이, 프로모터가 가능한 한 짧은 경우, 특히 벡터가 불안정해지기 전에 오로지 제한된 삽입 크기만을 취급할 수 있는 벡터인 경우, 유리한 것으로 여겨진다. 따라서, 일부 구현예에서, 제1 폴리뉴클레오티드의 발현은 길이 100bp 내지 1100bp인 프로모터의 제어 하에 있고, 선택적으로 프로모터는 길이 200bp 내지 900bp, 길이 300bp 내지 800bp, 길이 400bp 내지 700bp이고, 선택적으로 프로모터는 길이 500bp 내지 600 bp, 예를 들어 길이 410bp이다. 동일한 또는 다른 구현예에서, 프로모터는 길이 1100bp 미만이고, 예를 들어 길이 1000bp, 900bp, 800bp, 700bp, 600bp, 500bp, 400bp, 300bp, 200bp 미만 또는 100bp 미만이다.
일부 구현예에서, 프로모터는 본원에 정의된 길이의 자연 발생 Mpz 프로모터이다. 대안적 구현예에서, 프로모터는 본원에 정의된 길이의 조작된 Mpz 프로모터이다. "자연 발생 프로모터"란, 야생형 슈반 세포에서 발견되는 상응하는 프로모터 서열에 비해 변형, 단축 또는 연장되지 않은 프로모터를 의미한다. "조작된 프로모터"란, 어떠한 방식으로 변경된 야생형 프로모터를 의미한다. 예를 들어, 서열은 예를 들어 자연 발생 프로모터 서열과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%이도록, 선택적으로 자연 발생 프로모터 서열과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%이도록 변형될 수 있다. 또다른 또는 동일한 구현예에서, 프로모터는 또한 길이가 변형될 수 있고, 예를 들어 야생형 프로모터의 길이는 더 긴 서열로부터 예를 들어 길이 100bp 내지 1100bp, 선택적으로 길이 200bp 내지 900bp, 길이 300 bp 내지 800bp, 길이 400bp 내지 700bp, 선택적으로 길이 500bp 내지 600 bp로 감소될 수 있고, 예를 들어 길이 410bp이거나, 길이 1100bp 미만이거나, 예를 들어 길이 1000bp, 900bp, 800bp, 700bp, 600bp, 500bp, 400bp, 300bp, 200bp 미만 또는 길이 100bp 미만이다.
또다른 구현예에서, 프로모터 길이는 야생형 프로모터에 비해 증가될 수 있다.
당업자는 프로모터인 것으로 여겨지는 특정 핵산 영역의 일부만이 실제로 프로모터 활성에 요구되는 것이 가능함을 이해할 것이다. 또다른 예에서, 조작된 프로모터는 야생형 프로모터의 서열의 일부를 포함하거나, 더 긴 프로모터 서열의 일부로서 야생형 프로모터의 전체 서열을 포함한다. 논의되는 바와 같이, 바람직하게는 프로모터는 슈반 세포에서 특이적으로 활성이다. 당업자는 예를 들어 슈반 세포에서 리포터 유전자의 발현에 관한 스크리닝에 의해, 전장 프로모터의 특정 절편이 상기 프로모터 절편의 제어 하에 단백질의 슈반 세포 특이적 발현을 야기하는지 여부를 시험할 수 있을 것이다. 일부 예에서 리포터 유전자는 EGFP이다.
또다른 구현예에서, 조작된 프로모터는 야생형 프로모터의 절단된 버전이고, 예를 들어, 자연 발생 프로모터 서열과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%일 수 있고, 선택적으로 자연 발생 프로모터 서열과 적어도 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%일 수 있다.
네이티브(native) 프로모터의 절단된 버전인 것 이외에, 조작된 프로모터는 추가로 또는 대안적으로 네이티브 프로모터 서열에 비해 돌연변이, 치환, 결실(deletion) 및 삽입을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조작된 프로모터는 하나의 연속적인 서열에서 네이티브 프로모터의 다양한 상이한 영역을 포함할 수 있다.
상응하는 네이티브 또는 야생형 프로모터보다 길이가 더 짧은 조작된 프로모터는 최소 프로모터로 칭해질 수 있다.
일부 구현예에서, 조작된 프로모터는 이것이 유래되는 상응하는 자연 발생 프로모터와 동일한 기능을 유지하는데, 즉 이는 여전히 프로모터가 작동가능하게 연결되는 핵산 서열로부터의 폴리뉴클레오티드 서열의 전사를 효과적으로 유도할 수 있고, 바람직한 예에서 세포-특이적 방식으로, 즉 슈반 세포 특이적 방식으로 전사를 효과적으로 유도할 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 폴리뉴클레오티드의 발현은 예를 들어 본원에서 최소 미엘린 특이적 프로모터로 칭해지는 단축된 자연 발생 미엘린 특이적 프로모터의 제어 하에 있을 수 있고, 선택적으로 이는 최소 미엘린 단백질 제로(Mpz) 프로모터이다. 일부 구현예에서, 최소 미엘린 특이적 프로모터의 서열은 전장 랫트 Mpz 프로모터 서열로부터 유래되는 SEQ ID NO. 5에 정의된 바와 같은 410bp 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 최소 미엘린 특이적 프로모터는 SEQ ID NO. 5와 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%인, 선택적으로 SEQ ID NO. 5와 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%인 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 최소 프로모터가 인간 또는 인간화 프로모터 서열로부터 유래되는 것이 바람직하다. 일부 구현예에서, 최소 미엘린 특이적 프로모터의 서열은 전장 인간 hP0 프로모터 서열로부터 유래되는 SEQ ID NO. 22에 정의된 바와 같은 429bp 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 최소 미엘린 특이적 프로모터는 SEQ ID NO. 22와 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%인, 선택적으로 SEQ ID NO. 22와 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%인 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 랫트 Mpz 또는 인간 hP0으로부터 유래되는 최소 미엘린 특이적 프로모터는 본원에서 miniMpz로 칭해진다.
"서열 동일성" 또는 "서열 상동성"이란, 특정 DNA 영역에서의 염기쌍의 동일한 서열을 의미한다. 예를 들어, 참조 서열과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 75%인 서열에서, 염기쌍의 75%가 동일하다.
2개의 폴리펩티드 사이의 서열 동일성 백분율은 적합한 컴퓨터 프로그램, 예를 들어, University of Wisconsin Genetic Computing Group의 GAP 프로그램을 사용하여 결정될 수 있고, 동일성 백분율은 서열이 최적으로 정렬된 폴리펩티드에 관해 계산되는 것으로 이해될 것이다.
정렬은 대안적으로 Clustal W 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다(문헌[Thompson et al., (1994) Nucleic Acids Res 22, 4673-80]). 사용되는 매개변수는 하기와 같을 수 있다:
패스트 페어와이즈 정렬(Fast pairwise alignment) 매개변수: K-튜플(K-tuple)(단어) 크기; 1, 윈도우 크기; 5, 갭 패널티; 3, 탑 디아고날(top diagonal)의 수; 5. 채점 방법: x 백분율.
다중 정렬 매개변수: 갭 오픈 패널티; 10, 갭 익스텐션 패널티; 0.05.
채점 매트릭스: BLOSUM.
한 구현예에서, 본원에 기재된 최소 Mpz 프로모터는 전장 프로모터, 예를 들어 전장 미엘린 단백질 제로(Mpz) 프로모터의 시작 코돈의 업스트림에서 410 염기쌍 영역을 취함으로써 실시예 9에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다. 또다른 구현예에서 본원에 기재된 최소 Mpz 프로모터는 실시예 13에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다. AAV 벡터는 약 4.4kb의 폴리뉴클레오티드를 운반하는 최대 용량을 가지므로, 길이 약 1.1kb인 전장 Mpz 프로모터보다는, 본원에 기재된 더 짧은 Mpz 프로모터의 사용이 더 긴 제1 핵산 서열이 AAV에 패키징하기 위한 프로모터 영역에 작동가능하게 연결되는 것을 가능하게 하는 이점을 갖는다. 일부 구현예에서, 프로모터가 예를 들어 길이 100bp 내지 1100bp, 길이 200bp 내지 900bp, 300 bp 내지 800bp, 400bp 내지 700bp, 500bp 내지 600 bp, 또는 410bp인 길이, 또는 길이 1100bp 미만인 길이, 예를 들어 1000bp, 900bp, 800bp, 700bp, 600bp, 500bp, 400bp, 300bp, 200bp 미만 또는 100bp 미만인 길이를 갖는 더 짧은 프로모터, 예를 들어 조작된 프로모터 또는 최소 프로모터인 경우, 이는 본 발명이 전장 프로모터를 이용하는 AAV 벡터보다 더 큰 길이의 더 넓은 범위의 유전자에 적용되는 것을 허용한다. 예를 들어, 현재, 핵산의 길이는 더 긴 프로모터, 예를 들어 전장 Mpz 프로모터가 사용될 때 AAV의 최대 용량을 초과할 수 있기 때문에, AAV에 특정 길이의 핵산 서열, 예를 들어 유전자를 삽입할 수 없는 일부 상황이 있다. 예를 들어, 제1 핵산, 예를 들어 치료적 유전자가 길이3.0 내지 3.3kb(4.4kb - 1.1kb = 3.3kb) 보다 더 긴 경우이다. 이러한 경우, 본원에 기재된 유리한 더 짧은 프로모터, 예를 들어 최소 미엘린 특이적 프로모터의 사용은, 본 발명이 예를 들어 더 큰 유전자, 예컨대 길이 약 3.9kb인 CMT 유형 4C(CMT4C)를 야기하는 SH3TC2 유전자의 대체에 적용되는 것을 허용한다. AAV의 안정성 한계에 근접할 수 있고, 이에 따라 최소 Mpz 프로모터 하에 최적으로 전달될 다른 슈반 세포-관련 유전자는, CMT4E와 관련된 EGR2(2.98 kb) 및 CMT4H와 관련된 FGD4(2.3 kb)를 포함한다.
추가 구현예에서, 본원에 기재된 벡터는 그 크기를 추가로 감소시키기 위해 역 말단 반복 세그먼트에서 변형될 수 있다. 예를 들어, 실시예 1에 기재된 바와 같은 우드척(woodchuck) 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE)는 제거될 수 있고/있거나 polyA 서열은 최소 합성 polyA로 대체될 수 있다(68, 69). 상기 변형은 벡터의 크기를 추가로 감소시켜, 이것이 AAV의 최대 용량 내에서 재전송하는 것을 허용하고 더 큰 유전자를 전달할 때 효율적 패키징을 허용할 수 있다. 추가 구현예에서, 벡터의 크기는 예를 들어 또한 전달되는 단백질 코딩 유전자의 최소 버전을 사용하여 추가로 감소될 수 있고, 여기서 단백질 코딩 유전자의 최소 버전은 여전히 기능 단백질을 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바이러스 벡터는 실시예 12에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 제거된 WPRE를 갖고 합성 polyA 서열을 갖는, SEQ ID NO: 20에 나타낸 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 합성 polyA 서열은 mRNA 작제물의 효율적인 폴리아데닐화에 필요한 최소 서열을 포함하거나 이로 이루어진다(68, 69). 일부 구현예에서, 합성 polyA 서열은 SEQ ID NO: 20 및 21의 서열에 포함되는, SEQ ID NO: 24의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 구현예에서 합성 polyA 서열은 SEQ ID NO. 24와 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%이다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 또한 Egr2 및 Sox10 전사 인자에 대한 결합 부위를 함유한다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 또한 전사 인자 예컨대 Egr2 및 Sox10이 결합할 수 있는 인핸서(enhancer) 요소를 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 제1 핵산은 일부 구현예에서 제1 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하고 이로 번역되는 제1 폴리뉴클레오티드로 전사된다. 일부 구현예에서, 제1 핵산은 유전자 서열 또는 유전자 서열에 상응하는 cDNA의 개방형 해독 프레임(ORF: open reading frame)이다. 일부 구현예에서, 제1 핵산은 야생형 또는 다른 치료적으로 유익한 유전자 서열의 ORF 또는 cDNA이다. 바람직한 구현예에서, 제1 핵산은 신경장해-관련 유전자의 야생형 또는 치료적으로 유익한 서열의 ORF 또는 cDNA이고, 선택적으로 신경장해는 탈미엘린성 신경장해이다.
"야생형 또는 치료적으로 유익한 형태"란, 슈반 세포와 관련된 질환을 효과적으로 치료하는데 사용될 수 있는 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 유전자 서열의 임의의 형태를 포함한다. 당업자는 이것이 전형적으로, 슈반 세포에 의해 폴리펩티드의 야생형 형태의 과소생산을 통해 질환이 발생하는 상황에서는 단백질의 야생형 형태(즉, 슈반 세포에서 자연 발생하는 것)일 것이라는 것, 또한 야생형 서열과 비교하여 돌연변이 또는 삽입을 갖거나 절단된 단백질의 형태를 포함하여, 치료적 이점, 예를 들어 증가된 발현 수준, 분해에 대한 저항성, 증가된 안정성, 증가된 활성, 또는 유리한 기능 획득을 제공하거나, 기능의 독성적 획득(toxic gain of function)을 억제한다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 후자의 경우에, 폴리펩티드는 기능의 독성적 획득 돌연변이체에 결합할 수 있는 항체일 수 있고, 독성을 억제한다.
당업자는 단백질 발현이 관련 유전자의 ORF 또는 cDNA를 바이러스 벡터에 도입함으로써 통상적으로 수행된다는 것을 알 것이다. 한 구현예에서 제1 핵산은 전사될 때 제1 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 제1 폴리뉴클레오티드를 생성하는 cDNA 서열이다. 예를 들어, cDNA는 Cx32 단백질로 이후 번역되는 GJB1 mRNA로 전사되는 cDNA 서열일 수 있다.
당업자는 ORF 서열이 cDNA에서 발견되는 추가적 비(非)코딩 요소를 결여하고 크기가 더 작기 때문에, cDNA 서열보다 ORF 서열의 사용이 일부 경우에 바람직할 수 있고, 이는 바이러스 벡터가 크기가 특정 임계값을 초과하여 증가할 때 불안정해지는 벡터일 때 본 발명에서 특히 유리함을 이해할 것이다.
일부 추가 구현예에서, 본원에 기재된 제1 핵산 서열은 또한 선택적으로 유전자의 cDNA 또는 ORF 이외의 다른 조절 요소를 함유한다. 이러한 추가 요소는 ORF의 다운스트림에 있을 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 본 발명은 슈반 세포와 관련된 질환의 예방 또는 치료에서 유용성을 갖는다. "슈반 세포와 관련된 질환"이란, 슈반 세포의 비정상적 기능과 관련된 모든 질환의 의미를 포함한다. 이는 슈반 세포에 의해 형성된 미엘린초의 파괴와 관련된 질환 및/또는 슈반 세포에 의해 형성된 미엘린초의 감소된 발현과 관련된 질환을 포함한다. 일부 구현예에서, 슈반 세포와 관련된 질환은 탈미엘린성 신경장해이다. 탈미엘린성 신경장해의 예는 샤르코-마리-투스 질환(CMT)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"슈반 세포와 관련된 질환"은 또한 그 의미에 있어서 슈반 세포와 관련되나, 또한 예를 들어 다른 세포 유형 또는 조직과 관련된 질환을 포함한다. 본 발명은 슈반 세포의 기능에 있어서의 개선이 심지어 본 발명이 질환과 관련된 임의의 다른 세포 유형을 표적으로 하지 않는 경우에도, 일부 증상을 완화시킬 수 있기 때문에 상기 상황에 있어서 유용한 것으로 여겨진다.
따라서, 한 구현예에서, 본원에 기재된 바이러스 벡터는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질환의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 것일 수 있다: 샤르코-마리-투스 질환(CMT); 압박 마비 유전 신경장해(HNPP: hereditary neuropathy with liability to pressure palsies); 당뇨병성 및 다른 독성 말초 신경장해; 운동 뉴런 질환(MND).
일부 특정 구현예에서, 본원에 기재된 바이러스 벡터는, 샤르코-마리-투스 유형 1X(CMT1X); 샤르코-마리-투스 유형 1A 내지 1F(즉, CMT1A, CMT1B, CMT1C, CMT1D, CMT1E 및 CMT1F); 샤르코-마리-투스 유형 4A 내지 4H(즉, CMT4A, CMT4B, CMT4C, CMT4D, CMT4E, CMT4F, CMT4G 및 CMT4H)의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 것일 수 있다. 더 특정한 구현예에서, 본원에 기재된 바이러스 벡터는 샤르코-마리-투스 유형 1X의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다. 대안적인 더 특정한 구현예에서, 본원에 기재된 바이러스 벡터는 샤르코-마리-투스 질환 유형 4C의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
샤르코-마리 투스 질환(CMT)은 표현형의 중첩을 야기하는 수많은 상이한 유전자의 돌연변이에 의해 야기된 탈미엘린성 신경장해의 군이다. 샤르코-마리-투스 유형 1X(CMT1X) 신경장해는 두 번째로 가장 통상적인 CMT 형태이고(4, 5), 말단 다리 근육에서 시작되는 진행성 쇠약 및 위축, 달리기의 어려움 및 자주 염좌되는 발목을 포함하는 특징적인 CMT1 증상을 나타내고, 대부분의 이환 남성에서 10세 또는 그 이전에 발병한다(6-8). 질환은 천천히 진행되어, 청소년기 후반 또는 성인 초기에 앞다리 근육의 약화, 발처짐, 발 기형, 손 근육 약화, 및 말단 감각 상실과 함께 때때로 고통스러운 감각이상을 야기하고, 일생에 걸쳐 천천히 진행된다. CMT1X를 갖는 이질접합(heterozygous) 여성은 무증상이거나 더 나이가 들어서 더 경미한 임상적 징후를 발현할 수 있지만, 예외적으로 중증의 신경장해가 보고되었다(9, 10). 일시적 CNS 징후는 일부, 더 어린 CMT1X 환자에서 발생할 수 있다(11). 운동 신경 전도 속도(MNCV: motor nerve conduction velocity)의 중간 감속(30 내지 40 m/s) 및 길이-의존적 축삭 변성으로 인한 운동 단위의 점진적 상실은 전형적인 전기생리학적 특징이다(6, 7). 신경 생검은 혼합된 축삭 및 탈미엘린성 이상(12, 13)과 함께 얇은 미엘린초 및 재생 축삭 클러스터로 대체된 큰 미엘린화 섬유의 상실(6, 14)을 나타낸다.
Cx32는 말초 신경계(PNS)에서 미엘린성 슈반 세포에 의해, 뿐만 아니라 CNS에서의 올리고덴드로사이트(oligodendrocyte)의 서브세트(subset)에 의해 특이적으로 발현되는 비압축 미엘린 층을 통해 갭 접합(GJ) 채널을 형성하는 막관통 단백질이다. Cx32에 의해 형성된 GJ 채널은 미엘린 및 축삭의 기능 및 생존에 필수적인 중요한 항상성 및 신호전달 기능을 한다(4, 5). Cx32를 인코딩하는 상응하는 유전자는 GJB1이다.
하기를 포함하여, 개방형 해독 프레임(ORF) 전반에 걸쳐 발생하고 하나 초과의 패밀리에서 많은 400개 초과의 GJB1 돌연변이가 현재까지 보고되었다: 498개의 미스센스(missense)(71%); 3개의 스톱-로스트(stop-lost); 49개의 인프레임(Inframe) INDEL(7%); 25개의 스톱-게인(Stop-Gained)(4%); 및 122개의 프레임시프트(Frameshift) INDEL(17%)(http://hihg.med.miami.edu/code/http/cmt/public_html/index.html#/). 여러 돌연변이가 비코딩(non-coding) GJB1 영역에서 또한 보고되었다. 프레임시프트, 조기 스톱 및 비코딩 돌연변이는 단백질 합성의 완전한 상실 또는 급속한 분해를 야기할 가능성이 있고, 임의의 우성-네거티브 효과를 야기할 것으로 예상되지 않는다. 시험관 내에서 발현된 여러 미스센스 및 인프레임 돌연변이는 기능적 채널을 형성하는데 실패하는 ER 및/또는 골지(Golgi)(17 내지 21)에서 세포내 보존(15 내지 17)을 나타냈다. 일부는 또한 공동-발현된 WT Cx32에 대한 우성-네거티브 효과를 발휘하였다(15). 다른 돌연변이체는 변경된 생물물리학적 특징을 갖는 기능적 채널을 형성하였다(19). Gjb1/Cx32 유전자의 완전 결실을 갖는 Cx32 녹아웃(KO) 마우스는 감소된 좌골 MNCV 및 운동 진폭과 함께 약 3개월에 시작되는 진행성, 주로 운동 탈미엘린성 말초 신경장해를 발현시킨다(24, 25). 랫트 Mpz/P0 프로모터에 의해 유도된 WT 인간 Cx32 단백질의 발현은 Cx32 KO 마우스에서의 탈미엘린화를 방지하여(26), Cx32의 슈반 세포 자율 발현의 상실이 CMT1X 병리학을 야기하는데 충분함을 확인하였다.
따라서, CMT1X 돌연변이체의 여러 시험관내 및 생체내 연구는 Cx32 기능의 상실이 주로 CMT1X에서 신경장해를 야기한다는 전체적 결론을 지지한다(8, 17 내지 19, 21 내지 23). 따라서, 한 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 바이러스 벡터 및 치료 방법을 사용한 유전자 대체 요법은, 예를 들어 바이러스 벡터가 야생형 또는 치료적으로 유익한 Cx32 단백질을 인코딩하는 제1 핵산 서열을 포함할 때, CMT1X를 치료 또는 예방하는데 사용된다.
KO 백그라운드에서 CMT1X를 야기하는 돌연변이를 갖는 형질전환 마우스는 175fs 돌연변이체 계통에서 검출가능한 Cx32 단백질을 나타내지 않은 반면(27), R142W, T55I, R75W 및 N175D 형질전환 마우스는 시험관내 패턴과 유사한 핵주위 영역에서의 돌연변이 단백질의 보유를 나타냈고(위), Cx32 KO 마우스와 유사한 탈미엘린성 신경장해를 발현시켰다(22, 28, 29). 골지-보유 R142W, R75W 및 N175D 돌연변이체의 존재(그러나, ER-보유 T55I 돌연변이체는 제외) 하에, 내인성 마우스 WT Cx32의 발현이 감소하여, 골지-보유 돌연변이체가 WT Cx32에 대한 우성-네거티브 효과를 가질 수 있음을 나타냈다. 이는 각각의 세포에서 오로지 하나의 GJB1 대립유전자(allele)만을 발현하는 CMT1X 환자에게 임상적으로 관련이 없지만, 유전자 추가 요법을 계획할 때 고려되어야 한다. 생체내에서 발현된 돌연변이체 중 어떠한 것도 다른 공동-발현된 코넥신에 대해 임의의 다른 독성 또는 우세한 효과를 갖지 않았다(22, 28). C-말단 돌연변이체 C280G 및 S281X는 Cx32 KO 마우스에서 적절하게 국소화되고 탈미엘린화를 방지하여, 이들이 인간에서 신경장해를 어떻게 야기하는지 불분명하게 남겨두었다(30).
따라서, CMT1X는 또한 Cx32 단백질에서 우성 네거티브 돌연변이에 의해 야기될 수 있다. 이러한 경우, 당업자는 본 발명의 바이러스 벡터가 그 자체가 돌연변이체 Cx32 mRNA로 향하여 돌연변이체 단백질의 번역을 방지하는 비코딩 RNA로 전사되는 제1 핵산을 포함하는 경우 유익하다는 것을 이해할 것이다. 당업자는 예를 들어, 돌연변이체 Cx32 mRNA를 표적으로 하지만 야생형 또는 치료적으로 유리한 Cx32 mRNA는 표적으로 하지 않는 적합한 핵산 서열에 어떻게 도달하는지 이해할 것이다. 이러한 방식으로, 한 구현예에서, 대상체는 돌연변이체 Cx32를 표적으로 하는 비코딩 RNA로 전사되는 제1 핵산을 포함하는 바이러스 벡터로 치료될 수 있고, 대상체는 또한 제2 바이러스 벡터가 야생형 또는 치료적으로 유리한 Cx32 단백질을 인코딩하는 제2 핵산을 포함하는 본 발명에 따른 제2 바이러스 벡터로 치료될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 핵산은 본 발명에 따른 동일한 바이러스 벡터 상에 있을 수 있다. 유사한 접근이 본원에 기재된 임의의 슈반 세포 관련 질환의 치료 또는 예방에서 취해질 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 핵산은 신경장해 관련 유전자의 야생형 유전자 서열의 ORF 또는 cDNA일 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 핵산은 갭 접합 베타 1(GJB1) 유전자의 야생형 서열의 cDNA일 수 있고, 이는 SEQ ID NO. 6에 정의된 서열을 갖는 것으로 여겨진다. 일부 구현예에서, 제1 핵산은 SEQ ID NO. 6과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%이고, 선택적으로 SEQ ID NO. 6과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%이다. 다른 구현예에서, 제1 핵산은 GJB1의 ORF 서열과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%이고, 선택적으로 GJB1의 ORF 서열과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%이다.
CMT1X는 야생형 기능 Cx32 단백질의 과소발현을 야기하는, GJB1 유전자에서의 돌연변이에 의해 야기된다. 결과적으로, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바이러스 벡터가 GJB1 유전자의 개방형 해독 프레임 또는 cDNA의 야생형 카피 또는 다른 치료적으로 유익한 카피의 전달에 의한 CMT1X의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 것일 수 있다.
샤르코-마리-투스 유형 4C(CMT4C) 질환은 모든 CMT4 사례 중 거의 절반을 차지하는, 신경장해의 전반적으로 희귀한 열성 탈미엘린성 CMT4 형태 중에 가장 일반적인 것으로 드러난 상염색체 열성 유전적 신경장해이다(35). CMT4C를 갖는 환자는 일반적으로 발 기형 및 척추측만증, 쇠약, 반사신경 및 감각 상실과 함께 생후 10년 내에 나타난다(36 내지 38). 청력 손상, 느린 동공 반사, 및 혀 속상수축(lingual fasciculation)을 동반한 뇌 신경 관여가 통상적이고, 동일한 돌연변이를 갖는 환자에서의 표현형 변형이 기재되었다(39 내지 41). CMT4C 환자에서의 전기생리학적 연구는 22.6 m/s에서 평균 운동 신경 전도 속도(NCV)를 갖는 탈미엘린성 과정을 확인한다. 신경 생검 발견은 미엘린화, 탈미엘린화, 및 비미엘린화(unmyelinated) 축삭 주변의 기저 막의 증가, 비교적 적은 양파 구근형(onion bulb), 및 가장 전형적으로 슈반 세포의 큰 세포질 확장을 특징으로 한다(36, 37, 42).
CMT4C의 분자 유전학: 연관 분석 연구 및 동형접합 매핑(mapping)(43)은 염색체 5q32에서 질환 유전자좌(disease locus)의 발견, 이후 대부분 절단(truncating)이지만 또한 미스센스인 SH3TC2 유전자에서의 11개의 상이한 돌연변이의 초기 발견을 야기하였다(42). 적어도 28개의 상이한 SH3TC2 돌연변이가 현재까지 기재되었고, 이는 시조 효과(39)와 함께 특정 인종 집단(44) 중에서 더 통상적일 수 있다. 전체 전사체 cDNA 길이는 3864 bp이다. SH3TC2는 공지된 기능을 갖는 임의의 다른 인간 단백질과 전반적으로 유의한 유사성을 공유하지 않는 2개의 Src 상동성 3(SH3) 및 10개의 테트라트리코펩티드 반복(TPR) 도메인을 함유하는 1,288 aa의 단백질을 인코딩한다. SH3 및 TPR 도메인의 존재는 SH3TC2가 스캐폴드 단백질로서 작용할 수 있음을 제안한다(42). SH3TC2는 척추동물 종 중에서 잘 보존되는 반면, 비척추동물 오르소로그(ortholog)는 식별되지 않았다. SH3TC2는 초기 및 후기 엔도솜, 및 트랜스-골지 네트워크에 근접한 및 원형질 막 내의 클라트린-코팅된 소포를 포함하는 세포내이입 경로(endocytic pathway)의 여러 구성요소에 존재한다. 이러한 국소화는 CMT4C에서 변경된다(45).
CMT4C의 Sh3tc2-/- KO 마우스 모델은, 운동 및 감각 신경 전도 속도의 감속 및 조기 발병 저미엘린화를 갖는 조기 발병이지만 진행성인 말초 신경장해를 발현시킨다(46, 47). 이러한 표현형은 생후 2개월 및 12개월에 미엘린 병리가 증가함에 따라 진행된다. 쥐류 Sh3tc2는 슈반 세포에서 특이적으로 발현되고, 원형질 막 및 핵주위 세포내이입 리사이클링 구획에 국소화되어, 미엘린화에서 및/또는 축삭교(axoglial) 상호작용의 영역에서 가능한 기능을 제안한다(48). 돌연변이 마우스의 말초 신경에서 미엘린의 초미세구조 분석은, CMT4C 환자로부터의 신경 생검에서 확인된 표현형인 랑비에 결절(node of Ranvie)의 비정상적 조직을 나타냈다. 이러한 발견은 미엘린화 및 랑비에 결절의 완전성에서 SH3TC2 유전자 생성물에 대한 역할을 제안하였다(46). 따라서, Sh3tc2-/- 마우스는 CMT4C 질환의 모든 주요 특징을 요약하고, 요법을 시험하기 위한 관련 모델을 제공한다.
따라서, 일부 구현예에서, 제1 핵산은 유전자 SH3 도메인 및 테트라트리코펩티드 반복체 2(SH3TC2) 유전자의 야생형 서열의 ORF 또는 cDNA일 수 있다. SH3TC2의 ORF는 SEQ ID NO. 7에서 정의된 서열을 갖는 것으로 여겨진다. 일부 구현예에서, 제1 핵산은 SEQ ID NO. 7과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%이고, 선택적으로 SEQ ID NO. 7과 적어도 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%이다. 다른 구현예에서, 제1 핵산은 SH3TC2의 cDNA 서열과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%이고, 선택적으로 SH3TC2의 cDNA 서열과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%이다.
상기 논의된 바와 같이, CMT4C는 야생형 기능 SH3TC2 단백질의 과소발현을 야기하는, SH3TC2 유전자에서의 돌연변이에 의해 야기된다. 결과적으로, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바이러스 벡터는 예를 들어 야생형 SH3TC2의 발현을 증가시키기 위한 SH3TC2의 개방형 해독 프레임 또는 cDNA의 야생형 카피 또는 다른 치료적으로 유익한 카피의 전달에 의한 CMT4C의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 것일 수 있다.
또다른 구현예에서, 본원에 기재된 바이러스 벡터는 상염색체 우성 탈미엘린성 CMT의 다른 유형의 치료 또는 예방 방법에서 사용될 수 있다.
CMT1B는 야생형 기능 Mpz 단백질의 과소발현을 야기하는, 미엘린 단백질 제로(Mpz) 유전자에서의 돌연변이에 의해 야기된다.
따라서, 일부 구현예에서, 제1 핵산은 미엘린 단백질 제로(MPZ) 유전자의 야생형 서열의 ORF 또는 cDNA일 수 있다. MPZ의 ORF는 SEQ ID NO. 9에서 정의된 서열을 갖는 것으로 여겨진다. 일부 구현예에서, 제1 핵산은 SEQ ID NO. 9와 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%이고, 선택적으로 SEQ ID NO. 9와 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%이다. 다른 구현예에서, 제1 핵산은 MPZ의 cDNA 서열과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%이고, 선택적으로 MPZ의 cDNA 서열과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%이다.
결과적으로, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바이러스 벡터는 MPZ 유전자의 개방형 해독 프레임 또는 cDNA의 야생형 카피 또는 다른 치료적으로 유익한 카피의 전달 이외에 MPZ 유전자의 독성 돌연변이 대립유전자를 표적으로 하고 녹다운(knocking down)시키는 본원에 기재된 비코딩 RNA의 전달에 의한 CMT1B의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 것일 수 있다.
CMT1D는 야생형 기능 EGR2 단백질의 과소발현을 야기하는, EGR2 유전자에서의 돌연변이에 의해 야기된다.
따라서, 일부 구현예에서, 제1 핵산은 조기 성장 반응 2(EGR2) 유전자의 야생형 서열의 ORF 또는 cDNA일 수 있다. EGR2의 ORF는 SEQ ID NO. 10에 정의된 서열을 갖는 것으로 여겨진다. 일부 구현예에서, 제1 핵산은 SEQ ID NO. 10과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%이고, 선택적으로 SEQ ID NO. 10과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%이다. 다른 구현예에서, 제1 핵산은 EGR2의 cDNA 서열과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%이고, 선택적으로 EGR2의 cDNA 서열과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%이다.
결과적으로, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바이러스 벡터는 EGR2 유전자의 개방형 해독 프레임 또는 cDNA의 야생형 카피 또는 다른 치료적으로 유익한 카피의 전달에 의한 CMT1D의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 것일 수 있다.
또다른 구현예에서, 본원에 기재된 바이러스 벡터는 상염색체 열성 탈미엘린성 CMT의 다른 유형의 치료 또는 예방 방법에서 사용될 수 있다. CMT4A는 야생형 기능 GDAP1 단백질의 과소발현을 야기하는, GDAP1 유전자에서의 돌연변이에 의해 야기된다.
따라서, 일부 구현예에서, 제1 핵산은 강글리오시드 유도된 분화 관련 단백질 1(GDAP1) 유전자의 야생형 서열의 ORF일 수 있다. GDAP1의 ORF는 SEQ ID NO. 11에 정의된 서열을 갖는 것으로 여겨진다. 일부 구현예에서, 제1 핵산은 SEQ ID NO. 11과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%이고, 선택적으로 SEQ ID NO. 11과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%이다. 다른 구현예에서, 제1 핵산은 GDAP1의 cDNA 서열과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%이고, 선택적으로 GDAP1의 cDNA 서열과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%이다.
결과적으로, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바이러스 벡터는 GDAP1 유전자의 개방형 해독 프레임 또는 cDNA의 야생형 카피 또는 다른 치료적으로 유익한 카피의 전달에 의한 CMT4A의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 것일 수 있다.
CMT4D는 야생형 기능 NDRG1 단백질의 과소발현을 야기하는, NDRG1 유전자에서의 돌연변이에 의해 야기된다.
따라서, 일부 구현예에서, 제1 핵산은 N-Myc 다운스트림 조절된 1(NDRG1) 유전자의 야생형 서열의 ORF 또는 cDNA일 수 있다. NDRG1의 ORF는 SEQ ID NO. 12에 정의된 서열을 갖는 것으로 여겨진다. 일부 구현예에서, 제1 핵산은 SEQ ID NO. 12와 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%이고, 선택적으로 SEQ ID NO. 12와 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%이다. 다른 구현예에서, 제1 핵산은 NDRG1의 cDNA 서열과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%이고, 선택적으로 NDRG1의 cDNA 서열과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%이다.
결과적으로, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바이러스 벡터는 NDRG1 유전자의 개방형 해독 프레임 또는 cDNA의 야생형 카피 또는 다른 치료적으로 유익한 카피의 전달에 의한 CMT4D의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 것일 수 있다.
CMT4E는 야생형 기능 EGR2 단백질의 과소발현을 야기하는, EGR2 유전자에서의 돌연변이에 의해 야기된다.
따라서, 일부 구현예에서, 제1 핵산은 조기 성장 반응 2(EGR2) 유전자의 야생형 서열의 ORF 또는 cDNA일 수 있다. EGR2의 ORF는 SEQ ID NO. 10에 정의된 서열을 갖는 것으로 여겨진다. 일부 구현예에서, 제1 핵산은 SEQ ID NO. 10과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%이고, 선택적으로 SEQ ID NO. 10과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%이다. 다른 구현예에서, 제1 핵산은 EGR2의 cDNA 서열과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%이고, 선택적으로 EGR2의 cDNA 서열과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%이다.
결과적으로, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바이러스 벡터는 EGR2 유전자의 개방형 해독 프레임 또는 cDNA의 야생형 카피 또는 다른 치료적으로 유익한 카피의 전달에 의한 CMT4E의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 것일 수 있다.
압박 마비 유전 신경장해(HNPP)는 야생형 기능 PMP22 단백질의 과소발현을 야기하는, PMP22 유전자에서의 돌연변이와 관련된다.
따라서, 일부 구현예에서, 제1 핵산은 말초 미엘린 단백질 22(PMP22) 유전자의 야생형 서열의 ORF 또는 cDNA일 수 있다. PMP22의 ORF는 SEQ ID NO. 8에 정의된 서열을 갖는 것으로 여겨진다. 일부 구현예에서, 제1 핵산은 SEQ ID NO. 8과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%이고, 선택적으로 SEQ ID NO. 8과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%이다. 다른 구현예에서, 제1 핵산은 PMP22의 cDNA 서열과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%이고, 선택적으로 PMP22의 cDNA 서열과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%이다.
결과적으로, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바이러스 벡터는 PMP22 유전자의 개방형 해독 프레임 또는 cDNA의 야생형 카피 또는 다른 치료적으로 유익한 카피의 전달에 의한 HNPP의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 것일 수 있다.
또다른 구현예에서, 제1 핵산은 탈미엘린성 신경장해 및/또는 슈반 세포 기능장애와 관련된 또다른 유전자의 ORF 또는 cDNA일 수 있다. 결과적으로, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바이러스 벡터는 상기 질환과 관련된 유전자의 개방형 해독 프레임 또는 cDNA의 야생형 카피 또는 다른 치료적으로 유익한 카피의 전달에 의한 탈미엘린성 신경장해 및/또는 슈반 세포 기능장애와 관련된 질환의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 것일 수 있다.
운동 뉴런 질환(MND)(또한 근위축성 측삭 경화증으로 칭함)은 완전히 결정되지 않은 복잡한 원인을 갖는 신경퇴행성 장애이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바이러스 벡터는 영양 인자(예를 들어 뇌-유래된 신경영양 인자(BDNF), 신경교 세포-유래된 신경영양 인자(GDNF), 뉴트로핀-3(NT-3), 혈관 내피 성장 인자(VEGF))를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 전달하는데 사용될 수 있다. 표적 세포에서 상기 영양 인자의 발현은 스트레스 받은 운동 뉴런을 재생시키고 구하는데 유용한 것으로 여겨진다.
결과적으로, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바이러스 벡터는 MND의 치료 또는 예방 방법에서 사용하기 위한 것이다.
본원에 개시된 단백질의 야생형 또는 치료적으로 유익한 형태는 전체 유전자의 뉴클레오티드 서열로부터, 단지 개방형 해독 프레임 서열(ORF)로부터, 또는 단지 cDNA 서열로부터 발현될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 모든 이러한 유형의 서열은 서열 데이터베이스 예를 들어 GenBank(여기에서 접속 가능: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)에 의해 당업자가 쉽게 접근할 수 있을 것이다.
일부 구현예에서, 제1 폴리뉴클레오티드는 제1 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하고 이로 번역된다. 일부 구현예에서, 제1 폴리뉴클레오티드는 단백질의 야생형 형태를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 단백질의 야생형 형태는 이를 필요로 하는 대상체에 의해 발현되는 동일한 단백질의 돌연변이 형태의 발현을 대체하거나 보충하기 위해 사용된다.
일부 구현예에서, 제1 폴리뉴클레오티드는 하기 단백질 중 하나 이상의 야생형 또는 치료적으로 유익한 형태를 인코딩할 수 있다: 코넥신-32(Cx32); SH3 도메인 및 테트라트리코펩티드 반복체 2(SH3TC2); 말초 미엘린 단백질 22(PMP22); 미엘린 단백질 제로(MPZ); 조기 성장 반응 2(EGR2); 강글리오시드 유도된 분화 관련 단백질 1(GDAP1); N-Myc 다운스트림 조절 1(NDRG1). 당업자는 본원에 개시된 단백질의 아미노산 서열은 서열 데이터베이스, 예를 들어 NCBI 단백질 데이터베이스(여기에서 접속 가능: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein)로부터 쉽게 접근가능할 수 있음을 이해할 것이다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 대체되는 유전자의 야생형 형태 또는 다른 치료적으로 유익한 형태를 함유하는 AAV 벡터를 제공하는 것에 의한 유전자 대체 방법에 적용될 수 있다. 일부 비제한적인 예에서, 대체되는 유전자는, 이것이 단백질을 인코딩하지 않거나, 이것이 야생형 단백질의 절단된 버전을 인코딩하거나(예를 들어, 조기 스탑 코돈이 있음), 이것이 감소된 양의 기능 단백질을 인코딩하거나, 이것이 단백질의 비기능 돌연변이 형태를 인코딩하는 방식으로 돌연변이될 수 있다.
추가적 또는 대안적 구현예에서, 제1 핵산은 영양 인자(예를 들어 뇌-유래된 신경영양 인자(BDNF), 신경교 세포-유래된 신경영양 인자(GDNF), 뉴트로핀-3(NT-3), 혈관 내피 성장 인자(VEGF))를 인코딩하고 이로 번역된다. 영양 인자란, 발달 및 성숙 뉴론의 성장, 분화 및/또는 발달을 지원하는 생체분자(예를 들어 단백질 또는 펩티드)를 포함한다. 또다른 추가적 또는 대안적 구현예에서, 제1 폴리뉴클레오티드는 재생 인자(예를 들어 안지오제닌, Oct-6, Egr2, Sox-10)를 인코딩한다. 또다른 추가적 또는 대안적 구현예에서, 제1 폴리뉴클레오티드는 성장 인자(예를 들어 IGF)를 인코딩한다.
상기 기재된 영양 인자, 재생 인자 및/또는 성장 인자를 인코딩하는 핵산을 전달하는데 본원에 기재된 벡터를 사용하는 것은, 일부 구현예에서 후천적 말초 신경 장애를 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 한 예에서, 당뇨병성 및 다른 독성 말초 신경장해는 슈반 세포 및 축삭에 영양 인자 및/또는 성장 인자를 인코딩하는 본원에 기재된 벡터를 전달함으로써 치료될 수 있다. 또다른 예에서, 운동 뉴런 질환(MND)(또한 근위축성 측삭 경화증으로 공지됨)은 상기 운동 뉴런을 소급하여 구하기 위해 스트레스 받은 운동 뉴런의 축삭에 전달될 수 있는 영양 인자를 인코딩하는 본원에 기재된 벡터를 전달함으로써 치료될 수 있다.
또다른 구현예에서, 제1 단백질 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산을 포함하는 바이러스 벡터의 투여는 슈반 세포의 개선된 기능 및/또는 미엘린초의 증가된 형성을 야기한다. 일부 구현예에서, 이러한 기능의 개선은 치료 이전 대상체에서의 슈반 세포에 의한 미엘린초의 형성과 비교했을 때, 슈반 세포에 의한 미엘린초의 증가된 형성에 의해 달성되고, 기능의 개선은 미엘린초의 증가된 생성의 검출을 통해 검출될 수 있다. 일부 구현예에서, 기능의 개선은 치료 이전의 대상체에서의 이러한 측정값과 비교했을 때 근육 강도의 개선 및/또는 개선된 좌골 신경 전도 속도 및/또는 혈액 바이오마커의 잠재적 반응에 대한 변화에 의해 측정될 수 있다. 당업자는 슈반 세포의 기능의 개선 및/또는 미엘린초의 증가된 형성을 측정하기 위한 기술을 알고 있다. 일부 상기 기술이 실시예에 제공된다.
일부 특정 구현예에서, 슈반 세포에 의한 미엘린초의 증가된 형성은 말초 신경의 개선된 미엘린화를 야기한다. 말초 신경의 개선된 미엘린화란, 치료 이전의 대상체에 비하여 말초 신경의 증가된 미엘린화가 존재함을 의미한다. 이는 탈미엘린화 및 재미엘린화 섬유의 감소 및/또는 비정상적으로 미엘린화된 섬유의 감소를 포함한다. 개선된 미엘린화는 또한 일부 구현예에서 염증의 마커인, 포말 대식세포(foamy macrophage)의 수의 감소와 관련될 수 있다. 개선된 미엘린화는 또한 증가된 미엘린 두께 및 감소된 g-비율(축삭 직경을 미엘린화 섬유 직경으로 나눔)과 관련될 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 제1 핵산은 예를 들어 생단백질(native protein)이 정상 기능을 야기하기에 너무 낮은 수준으로 돌연변이 또는 발현되는 경우, 치료적 이점을 갖는 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩할 수 있다.
대안적 구현예에서, 제1 핵산은 mRNA가 아닌, 즉 단백질로 번역되는 RNA가 아닌 RNA로 전사될 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 제1 핵산은 비코딩 RNA로 전사될 수 있다.
"비코딩 RNA"란, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되지 않는 임의의 RNA 분자를 의미한다. 당업자는 상기 RNA 중합체 및 어떻게 이들이 폴리펩티드의 발현에 영향을 주는데 사용될 수 있는지를 알 것이다. 한 구현예에서 제1 핵산은 비코딩 마이크로-RNA(miR)로 전사된다. 추가적인 대안적 구현예에서, 제1 핵산은 짧은-헤어핀(short-hairpin) RNA(shRNA)로 전사된다. 추가적 구현예에서, 제1 핵산은 예를 들어 CRISPR-기반 시스템의 일부로서 가이드 RNA(gRNA)로 전사된다.
바이러스 벡터가 표적 유기체에 있을 때 상기 기재된 비코딩 RNA의 발현은, 표적 폴리뉴클레오티드의 발현의 감소를 야기할 수 있고, 선택적으로 표적 폴리뉴클레오티드는 표적 유기체에 배치된 유전자이고, 선택적으로 이는 표적 유기체 내의 세포에 배치된다. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 유전자 서열이다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 본 발명은 표적 유전자의 녹-다운 발현에 사용될 수 있다. "녹-다운"이란, 표적 유전자의 발현이 바이러스 벡터에 의한 치료 이전의 발현 수준에 비해 감소됨을 의미한다.
예를 들어, 본 발명은 표적 핵산, 예를 들어 표적 유전자가 과발현되는 상황에 적용될 수 있다. 바이러스 벡터는, 예를 들어 이것이 분해에 대해 과발현되는 유전자에 의해(예를 들어 당업계에 익히 공지된 RISC 복합체에 의해) 생성된 mRNA를 표적화하기 위해 또는 상기 mRNA의 단백질로의 번역을 직접 차단하기 위해, 비코딩 RNA로 전사되는 제1 핵산을 전달하는데 사용될 수 있다. 이러한 본 발명의 구현예는 또한 표적 핵산이 비코딩 RNA로 전사된 그 자체인 상황에 적용되고, 세포에서의 호스트 비코딩 RNA의 수준을 감소시키는 것이 유익하다.
이러한 본 발명의 구현예는 또한 해로운 기능 획득(deleterious gain-of-function) 돌연변이체를 표적으로 하고, 이의 단백질 또는 mRNA 발현 수준을 감소시키는데 사용될 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 비코딩 RNA의 발현은 표적 핵산, 폴리뉴클레오티드 또는 유전자의 발현의 감소를 야기한다. 한 구현예에서, 표적 유기체에서 표적 폴리뉴클레오티드의 발현 또는 과발현은 슈반 세포와 관련된 질환과 관련되는 것으로 여겨지고, 선택적으로 질환은 우성 탈미엘린성 신경장해(CMT1)이고, 선택적으로 표적 폴리뉴클레오티드는 미엘린 단백질 제로(Mpz/P0)의 돌연변이된 대립유전자이고 슈반 세포와 관련된 질환은 CMT1B이거나, 표적 폴리뉴클레오티드는 CMT1과 관련된 또다른 우성 유전자이다.
일부 구현예에서, 제1 핵산을 인코딩하는 바이러스 벡터의 투여는 슈반 세포의 개선된 기능을 야기하는 비코딩 RNA의 발현을 야기한다. 상기 논의된 바와 같이, 일부 구현예에서, 이러한 기능의 개선은 치료 이전 대상체에서의 슈반 세포에 의한 미엘린초의 형성과 비교했을 때 슈반 세포에 의한 미엘린초의 증가된 형성에 의해 달성된다. 일부 구현예에서, 이러한 기능의 개선은 치료 이전의 대상체에서의 이러한 측정값과 비교했을 때 근육 강도의 개선 및/또는 개선된 좌골 신경 전도 속도 및/또는 혈액 바이오마커의 잠재적 반응에 대한 변화에 의해 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바이러스 벡터는 제1 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하고, 벡터는 비코딩 RNA로 전사되는 제2 핵산을 또한 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 일부 구현예에서, 비코딩 RNA를 사용하여 돌연변이 유전자의 발현을 녹-다운시키고, 상기 유전자의 야생형 카피로 돌연변이 유전자를 대체하여, 완전한 유전자 대체를 야기하는데 사용될 수 있다. 이러한 접근법은 치료를 필요로 하는 대상체가 특정 단백질에서 기능 돌연변이의 획득을 갖는 경우에 특히 유용한 것으로 여겨진다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 또한 슈반 세포 특이적 프로모터, 선택적으로 본원에 정의된 바와 같은 미엘린 특이적 프로모터 또는 최소 미엘린 특이적 프로모터로부터 발현 또는 증가된 발현을 유도할 수 있는 전사 인자를 인코딩하는 제2 또는 제3 핵산 서열을 함유한다. 슈반 세포 특이적 프로모터의 제어 하에 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도할 수 있는 상기 전사 인자의 예는 Egr2 및 Sox10을 포함한다.
바이러스 벡터는 또한 Cas9 폴리펩티드 또는 CRISPR 기술 및 그 변형에서 통상적으로 사용되는 유사체, 예컨대 데드(dead)-Cas9를 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 바이러스 벡터는 다양한 방식으로 대상체에 투여될 수 있음이 이해될 것이다. 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 바이러스 벡터는 척수강내 주사에 의해 투여된다. "척수강내 주사"란, 그 결과 주사된 물질이 뇌척수액(CSF)에 도달하는 척추관에의 주사를 포함한다. 특히 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 바이러스 벡터는 요추 척수강내 주사에 의해 투여된다. 본원에 기재된 바이러스 벡터는 흉부 척수강내 주사 또는 자궁경부 척수강내 주사에 의한 투여에 또한 적합하다. 대안적으로, 본원에 기재된 바이러스 벡터는 말초 신경에의 직접 주사에 의해 투여될 수 있다. 대안적으로, 본원에 기재된 바이러스 벡터는 직접 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있다.
척수강내 주사는 다른 투여 방법 예컨대 신경내 및 정맥내 주사에 비해 이점을 제공한다. 신경내 주사에 비하여, 척수강내 주사는 다중 척수근 및 신경에 대한 더 광범위한 분포를 제공한다. 대조적으로, 신경내 주사는 주사된 신경 내에서만 분포를 제공한다. 또한, 척수강내 주사는 임상에서 통상적으로 이루어질 수 있고, 외과적 처치를 필요로 하지 않고, 안전한 것으로 여겨지는 반면, 신경내 주사는 외과적 처치를 필요로 하고, 다중 신경이 노출되고, 위험성이 더 높아, 임상에서 실행으로 옮기기 훨씬 더 어려울 것이다.
정맥내 주사는 임상에서 투여하기 더 쉬운 반면, 척수강내 전달에 비해 신경계에 도달하는데 벡터의 훨씬 더 높은 투여량을 필요로 한다는 단점을 갖는다. 정맥내 전달은 또한 바이러스의 더 높은 투여량 및 간 독성 위험성으로 인해, 더 많은 독성을 야기할 수 있다. 또한, 정맥내 주사는 더 많은 면역 반응을 야기할 수 있는 반면, 척수강내 전달은 더 낮은 면역 반응과 함께 면역계를 회피할 가능성을 제공한다.
본원에 기재된 AAV 벡터가 표적 세포를 형질도입시키면, 전달되는 유전 물질은, 성숙 슈반 세포를 사용한 경우와 같이, 표적 세포가 분화되고 나뉘어지지 않는다면, 안정하고 에피솜을 유지한다. 따라서, AAV 벡터의 단일 투여는 치료적 효과를 달성하는데 충분해야 하고, 일부 구현예에서 본원에 기재된 바이러스 벡터는 단일 척수강내 주사에 의해 투여된다. 그러나, 일부 경우에, 상이한 시점에 대상체에 상이한 AAV 벡터의 다중 투여량을 투여하는 것이 필요할 수 있다. 이러한 상이한 벡터는 상이한 제1 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있거나, 동일한 제1 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있고, 사용되는 AAV의 유형이 상이하다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바이러스 벡터는 다수의 상이한 유전자와 관련되는 슈반 세포와 관련된 질환의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다.
본원에 개시된 바이러스 벡터는 인간 대상체에서 사용하기에 적합한 것으로 이해될 것이다. 바이러스 벡터는 또한 일반적으로 고양이, 개, 마우스, 토끼, 말과 같은 포유류에서 사용하기에 적합하다. 대상체는 슈반 세포와 관련된 질환의 증상의 발병 이전에 또는 상기 질환의 증상의 발병 이후에 본원에 개시된 바이러스 벡터로 치료될 수 있다. 치료되는 대상체는 치료 개시시에 임의의 연령일 수 있다. 예를 들어, 대상체는 대상체가 슈반 세포의 성능을 손상시키는 돌연변이 또는 다른 결함을 가짐이 확인되자 마자 본 발명의 벡터(들)로 치료될 수 있다. 이는 임의의 증상이 나타나기 전일 수 있다.
사용된 바이러스 벡터의 투여량은 이를 필요로 하는 대상체의 요건에 따라 조정될 것이고, 예를 들어 대상체의 연령, 체중 또는 키로 인해 조정될 수 있음이 이해될 것이다. 일반적 예에서, 3.5 x 1013 벡터 게놈(vg), 1.2 x 1014 vg의 3.3 x 더 높은 투여량, 및 1.8 x 1014 vg의 5배 더 높은 투여량으로 투여량을 증가시키는 (척수강내 전달을 위한) 투여량이 사용될 수 있다. 이와 같은 투여량은 AAV를 사용한 임상 시험에서 이전에 사용되었고(예를 들어 https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02362438), 당업자는 이것이 본 발명에 적용될 수 있음을 알 것이다.
슈반 세포와 관련된 질환을 예방 또는 치료하는 치료 방법 이외에, 본 발명은 또한 바이러스 벡터 그 자체를 제공함이 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 또다른 양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 핵산 서열을 포함하는 본원에 기재된 바이러스 벡터를 제공한다. 바람직한 구현예에서, 바이러스 벡터는 AAV이다. 특히 바람직한 구현예에서, AAV는 AAV9이다. 이러한 양태의 특징에 대한 선호도는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같고, 예를 들어 벡터, 핵산, 프로모터, 슈반 세포 관련된 질환에 대한 선호도는 본원에 정의된 바와 같다.
추가 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO. 5에 정의된 바와 같은 서열 또는 SEQ ID NO. 5와 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%이고, 선택적으로 SEQ ID NO. 5와 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%인 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 최소 미엘린 특이적 프로모터를 제공한다. 이러한 양태의 특징에 대한 선호도는 본 명세서에 기재된 바와 같고, 예를 들어 벡터, 핵산, 프로모터, 슈반 세포 관련된 질환에 대한 선호도는 본원에 정의된 바와 같다.
추가 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO. 22에 정의된 바와 같은 서열 또는 SEQ ID NO. 22와 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%이고, 선택적으로 SEQ ID NO. 22와 적어도 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%인 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 최소 미엘린 특이적 프로모터를 제공한다. 이러한 양태의 특징에 대한 선호도는 본 명세서에 기재된 바와 같고, 예를 들어 벡터, 핵산, 프로모터, 슈반 세포 관련된 질환에 대한 선호도는 본원에 정의된 바와 같다. 일부 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO. 22와 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%, 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%인 인간 최소 미엘린 특이적 프로모터를 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 제1 폴리뉴클레오티드로 전사되는, 선택적으로 본원에 정의된 바와 같은 미엘린 단백질 제로(Mpz) 프로모터 또는 최소 미엘린 특이적 프로모터를 포함하는, 슈반 세포 특이적 프로모터, 선택적으로 미엘린 특이적 프로모터인, 제2 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 제1 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 작제물을 제공하고, 여기서 제2 핵산은 a) 개방형 해독 프레임 또는 cDNA 또는 유전자의 다른 요소이거나; b) 비코딩 RNA로 전사된다.
본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드 작제물을 포함하는 바이러스 벡터를 제공하고, 예를 들어 작제물을 포함하는 AAV 벡터를 제공한다. 이러한 양태의 특징에 대한 선호도는 본 명세서에 기재된 바와 같고, 예를 들어 벡터, 핵산, 프로모터, 슈반 세포 관련된 질환에 대한 선호도는 본원에 정의된 바와 같다. 예를 들어 한 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 작제물은 슈반 세포 특이적 프로모터를 포함하고, 여기서 프로모터는 a) 예를 들어 프로모터가 SEQ ID NO. 5 또는 SEQ ID NO. 22와 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%, 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%인 서열을 갖는 최소 슈반 세포 특이적 프로모터, 선택적으로 본원에 기재된 최소 Mpz 프로모터이거나; b) 선택적으로 프로모터가 SEQ ID NO. 4 또는 SEQ ID NO. 18과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%, 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%인 전장 Mpz 프로모터이다.
바람직하게는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 작제물은 본원에 기재된 인간 최소 Mpz 또는 인간 전장 Mpz 프로모터를 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 하기 바이러스 벡터를 제공한다:
a) AAV9 벡터, 미엘린 단백질 제로(Mpz) 프로모터 및 EGFP 리포터 유전자를 포함하는 AAV-Mpz.Egfp 벡터(SEQ ID NO. 1), 선택적으로 프로모터는 SEQ ID NO. 4 또는 SEQ ID NO. 18과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%, 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%인 서열을 가짐;
b) AAV9 벡터, 미엘린 단백질 제로(Mpz) 프로모터 및 갭 접합 베타 1(GJB1) 유전자의 개방형 해독 프레임(ORF)을 포함하는 AAV9-Mpz-GJB1 벡터(SEQ ID NO. 2), 선택적으로 프로모터는 SEQ ID NO. 4 또는 SEQ ID NO. 18과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%, 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%인 서열을 가짐;
c) AAV9 벡터, 최소 미엘린 단백질 제로(miniMpz) 프로모터 및 EGFP 리포터 유전자를 포함하는 AAV9-miniMpz.Egfp 벡터(SEQ ID NO. 3), 선택적으로 miniMPZ 프로모터는 SEQ ID NO. 5 또는 SEQ ID NO. 22와 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%, 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%인 서열 상동성을 가짐;
d) AAV9 벡터, 인간 미엘린 단백질 제로(hP0) 프로모터 및 갭 접합 베타 1(GJB1) 유전자의 개방형 해독 프레임(ORF)을 포함하는 AAV9-인간 Mpz-GJB1 벡터(SEQ ID NO. 17);
e) AAV9 벡터, 인간 미엘린 단백질 제로(hP0) 프로모터 및 EGFP 리포터 유전자를 포함하는 AAV9-인간 Mpz-Egfp 벡터(SEQ ID NO. 19);
f) AAV9 벡터, 최소 미엘린 단백질 제로(Mpz) 프로모터 및 SH3TC2 유전자의 개방형 해독 프레임(ORF)을 포함하는 AAV9-miniMpz-SH3TC2.myc.ITR 벡터(SEQ ID NO. 20);
g) AAV9 벡터, 인간 최소 미엘린 단백질 제로(hP0) 프로모터 및 SH3TC2 유전자의 개방형 해독 프레임(ORF)을 포함하는 AAV9-인간-miniMpz-SH3TC2 벡터(SEQ ID NO. 21);
h) AAV9 벡터, 인간 최소 미엘린 단백질 제로(hP0) 프로모터 및 EGFP 리포터 유전자를 포함하는 AAV9-인간-miniMpz-Egfp 벡터(SEQ ID NO. 23); 또는
i) 선택적으로 AAV 벡터가 AAV9인 AAV;
이러한 양태의 특징에 대한 선호도는 본 명세서에 기재된 바와 같고, 예를 들어 벡터, 핵산, 프로모터, 슈반 세포 관련된 질환에 대한 선호도는 본원에 정의된 바와 같다.
한 특정 구현예에서, 본 발명은 또한 슈반 세포와 관련된 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 슈반 세포와 관련된 질환의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 바이러스 벡터를 제공하고, 여기서 바이러스 벡터는 제1 폴리뉴클레오티드로 전사되는 제1 핵산 서열을 포함하고, 상기 제1 핵산의 전사는 선택적으로 SEQ ID NO. 5 또는 SEQ ID NO. 22에 정의되거나 SEQ ID NO. 5 또는 22와 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%이고, 선택적으로 SEQ ID NO. 5 또는 22와 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%인 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 최소 미엘린 특이적 프로모터의 제어 하에 있다. 한 구현예에서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터일 수 있다. 또다른 대안적 구현예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터일 수 있다. 이러한 양태의 특징에 대한 선호도는 본 명세서에 기재된 바와 같고, 예를 들어 벡터, 핵산, 프로모터, 슈반 세포 관련된 질환에 대한 선호도는 본원에 정의된 바와 같다.
또다른 양태에서, 본 발명은 또한 본원에 기재된 바이러스 벡터 중 어느 하나를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 약학 조성물은 적절량의 바이러스 벡터를 포함하고, 또한 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제, 담체, 완충액 또는 아쥬반트를 포함한다. 이러한 양태의 특징에 대한 선호도는 본 명세서에 기재된 바와 같고, 예를 들어 벡터, 핵산, 프로모터, 슈반 세포 관련된 질환에 대한 선호도는 본원에 정의된 바와 같다.
본원에 사용된 바와 같은, "약학 조성물" 은 슈반 세포와 관련된 질환의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 치료적으로 유효한 제형을 의미한다.
약학 조성물은, 충분히 저장 안정성이고 인간에게 투여하기에 적합한 당업계에 공지된 방식으로 제조될 수 있다.
"약학적으로 허용가능한"이란, 활성 성분, 즉 바이러스 벡터의 생물학적 활성의 유효성을 감소시키지 않는 비독성 물질을 의미한다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제는 당업계에 익히 공지되어 있다(문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A.R Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990)] 및 문헌[handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000)]를 참조하며, 이는 본원에서 참조 인용됨).
용어 "완충제"는 pH를 안정화시킬 목적을 갖는 산-염기 혼합물을 함유하는 수용액을 의미하는 것으로 의도된다. 완충제의 예는 Trizma, Bicine, Tricine, MOPS, MOPSO, MOBS, Tris, Hepes, HEPBS, MES, 포스페이트, 카르보네이트, 아세테이트, 시트레이트, 글리콜레이트, 락테이트, 보레이트, ACES, ADA, 타르트레이트, AMP, AMPD, AMPSO, BES, CABS, 카코딜레이트(cacodylate), CHES, DIPSO, EPPS, 에탄올아민, 글리신, HEPPSO, 이미다졸, 이미다졸락트산, PIPES, SSC, SSPE, POPSO, TAPS, TABS, TAPSO 및 TES이다.
용어 "희석제"는 바이러스 벡터를 약학 제제에 희석시킬 목적을 갖는 수용액 또는 비수용액을 의미하도록 의도된다. 희석제는 식염수, 물, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에탄올 또는 오일(예컨대, 홍화유(safflower oil), 옥수수유, 땅콩유, 면실유 또는 참기름) 중 하나 이상일 수 있다.
용어 "아쥬반트"는 바이러스 벡터의 생물학적 효과를 증가시키기 위해 제형에 첨가되는 임의의 화합물을 의미하도록 의도된다. 아쥬반트는 콜로이드성 은, 또는 상이한 음이온을 갖는 아연, 구리 또는 은 염, 예를 들어 비제한적으로, 상이한 아실 조성물의 플루오라이드, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 티오시아네이트, 술파이트, 히드록사이드, 포스페이트, 카르보네이트, 락테이트, 글리콜레이트, 시트레이트, 보레이트, 타르트레이트 및 아세테이트 중 하나 이상일 수 있다. 아쥬반트는 또한, 양이온성 중합체, 예컨대 PHMB, 양이온성 셀룰로오스 에테르, 양이온성 셀룰로오스 에스테르, 탈아세틸화 히알루론산, 키토산, 양이온성 덴드리머, 양이온성 합성 중합체, 예컨대 폴리(비닐 이미다졸), 및 양이온성 폴리펩티드, 예컨대 폴리히스티딘, 폴리라이신, 폴리아르기닌, 및 이러한 아미노산을 함유하는 펩티드일 수 있다.
부형제는 탄수화물, 중합체, 지질 및 미네랄 중 하나 이상일 수 있다. 탄수화물의 예는 락토오스, 수크로오스, 만니톨 및 시클로덱스트린을 포함하며, 이는 예를 들어 동결건조를 용이하게 하기 위해 조성물에 첨가된다. 중합체의 예는, 전분, 셀룰로오스 에테르, 셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 히드록시에틸 셀룰로오스, 에틸히드록시에틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 프로필 셀룰로오스, 알기네이트, 카라기난, 히알루론산 및 이의 유도체, 폴리아크릴산, 폴리술포네이트, 폴리에틸렌글리콜/폴리에틸렌 옥사이드, 폴리에틸렌옥사이드/폴리프로필렌 옥사이드 공중합체, 상이한 가수분해도의 폴리비닐알코올/폴리비닐아세테이트, 폴리(락트산), 폴리(글리콜산) 또는 다양한 조성을 갖는 이의 공중합체, 및 폴리비닐피롤리돈이고, 모두 상이한 분자량을 갖고, 이는 예를 들어 점도 조절, 생체접착의 달성, 또는 활성 성분의 화학적 단백질분해적 분해로부터의 보호를 위해 조성물에 첨가된다. 지질의 예는, 모두 상이한 아실 사슬 길이 및 포화도의 지방산, 인지질, 모노글리세리드, 디글리세리드, 트리글리세리드, 세라마이드, 스핑고지질 및 당지질, 달걀 레시틴, 대두 레시틴, 수소화된 달걀 및 대두 레시틴이며, 이는 중합체에 대한 것과 유사한 이유로 조성물에 첨가된다. 미네랄의 예는 탈크, 마그네슘 옥사이드, 아연 옥사이드 및 티타늄 옥사이드이며, 이는 액체 축적의 감소 또는 유리한 안료 특성과 같은 이득을 얻기 위해 조성물에 첨가된다.
또다른 양태에서, 본 발명은 슈반 세포와 관련된 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조 방법에서의 본원에 기재된 바이러스 벡터의 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, 질환은 슈반 세포에 의한 미엘린초의 파괴 및/또는 감소된 형성을 야기한다. 바람직한 구현예에서, 질환은 샤르코-마리-투스 질환이다. 이러한 양태의 특징에 대한 선호도는 본 명세서에 기재된 바와 같고, 예를 들어 벡터, 핵산, 프로모터, 슈반 세포 관련된 질환에 대한 선호도는 본원에 정의된 바와 같다.
보다 또다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바이러스 벡터 중 어느 하나를 사용하는 슈반 세포와 관련된 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 샤르코-마리-투스 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 질환은 샤르코-마리-투스 질환 유형 1X 또는 유형 4C이다. 이러한 양태의 특징에 대한 선호도는 본 명세서에 기재된 바와 같고, 예를 들어 벡터, 핵산, 프로모터, 슈반 세포 관련된 질환에 대한 선호도는 본원에 정의된 바와 같다.
당업자는 본원에 기재된 바이러스 벡터가 예를 들어 데드-Cas9 폴리펩티드를 사용하는 것에 의해, 유전자 편집 또는 유전자 침묵에 사용하기 위한 CRISPR/Cas 시스템에서 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 또다른 양태에서, 본 발명은 하기 중 어느 하나 이상을 포함하는 CRISPR/Cas9 시스템에서 사용하기 위한 본원에 기재된 바이러스 벡터 또는 폴리뉴클레오티드 작제물을 포함한다:
a) 관심 대상인 유전자를 표적으로 하는 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드;
b) Cas9 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드;
c) 관심 대상인 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
이러한 양태의 특징에 대한 선호도는 본 명세서에 기재된 바와 같고, 예를 들어 벡터, 핵산, 프로모터, 슈반 세포 관련된 질환에 대한 선호도는 본원에 정의된 바와 같다.
당업자는 본원에 개시된 바이러스 벡터가 슈반 세포와 관련된 질환의 치료 또는 예방 이외에 다양한 용도를 가질 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 본원에 개시된 바이러스 벡터는 예를 들어 형광 단백질, 예를 들어 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP), 또는 다른 비형광 리포터를 사용하여 슈반 세포를 라벨링하는 방법에서 사용될 수 있다. 일부 예에서, 슈반 세포의 라벨링은 슈반 세포와 관련된 질환의 진단 방법에서 사용될 수 있다.
이러한 양태의 특징에 대한 선호도는 본 명세서에 기재된 바와 같고, 예를 들어 벡터, 핵산, 프로모터, 슈반 세포 관련된 질환에 대한 선호도는 본원에 정의된 바와 같다.
또다른 예에서, 본원에 개시된 바이러스 벡터는 슈반 세포가 대안적 세포 유형, 예를 들어 뉴론, 올리고덴드로사이트, 또는 아스트로사이트로 분화하도록 유도하는 방법에서 사용될 수 있다.
보다 또다른 예에서, 본원에 개시된 바이러스 벡터는 예를 들어 부상 또는 외상 이후에, 재생을 지원하기 위해 슈반 세포를 자극하는 것을 필요로 하는 대상체에서 재생을 지원하기 위해 슈반 세포를 자극하는 방법에서 사용될 수 있다. 이러한 양태의 특징에 대한 선호도는 본 명세서에 기재된 바와 같고, 예를 들어 벡터, 핵산, 프로모터, 슈반 세포 관련된 질환에 대한 선호도는 본원에 정의된 바와 같다.
보다 또다른 예에서, 본원에 개시된 바이러스 벡터는 슈반 세포와 관련된 질환의 생체외(ex vivo) 치료 방법에서 사용하기에 적합할 수 있다. 예를 들어, 표적 세포는 치료를 필요로 하는 대상체로부터 제거되고, 대상체에 다시 도입되기 전에 본원에 기재된 바이러스 벡터로 형질도입될 수 있다.
이러한 양태의 특징에 대한 선호도는 본 명세서에 기재된 바와 같고, 예를 들어 벡터, 핵산, 프로모터, 슈반 세포 관련된 질환에 대한 선호도는 본원에 정의된 바와 같다.
본 발명은 또한 본 발명의 바이러스 벡터에 의해 형질도입되는 세포, 예를 들어 슈반 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 관련 프로모터 및 제1 핵산을 포함하는 본 발명의 핵산 작제물을 포함하는 세포를 제공한다. 당업자는 본 발명의 바이러스 벡터가 예를 들어 (58)에 기재된 바와 같이, 배양된 세포, 바람직하게는 HEK293 세포에서 생성될 수 있음을 알 것이다.
본원에 기재된 벡터 및 방법은 생체내에서 수행될 수 있지만, 또한 생체외 또는 시험관내에서 사용될 수 있고, 예를 들어 세포 예컨대 슈반 세포는 후속 치료적 또는 연구 목적으로 시험관내 또는 생체외에서 형질도입될 수 있음이 이해될 것이다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 바이러스 벡터 중 어느 하나를 구현하는데 사용될 수 있는 키트를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 키트가 하기 중 하나 이상을 포함하는 전술한 청구항 중 어느 하나의 바이러스 벡터 또는 폴리뉴클레오티드와 함께 사용하기 위한 키트를 제공한다:
a) 본원에 정의된 바이러스 벡터;
b) 본원에 정의된 폴리뉴클레오티드 작제물;
c) 바이러스 벡터;
d) 본원에 정의된 폴리뉴클레오티드 작제물을 포함하는 바이러스 벡터;
e) 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제;
f) 일회용 주사기, 예를 들어 척수강내 요추 주사에 적합한 일회용 주사기;
g) 사용 설명서.
한 구현예에서 키트는 하나 초과의 본 발명에 따른 바이러스 벡터를 포함하고, 예를 들어 키트는 2개의 상이한 본원에 정의된 바이러스 벡터를 포함할 수 있다.
본 발명의 치료적 용도 중 어느 하나에서, 본 발명에 따른 하나 초과의 바이러스 벡터가 대상체에 투여될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 일부 상황에서 이것이 유리하고, 예를 들어 하나 초과의 유전자가 슈반 세포 관련된 질환과 관련되는 것으로 공지된 경우, 다중 바이러스 벡터가 투여될 수 있고, 각각의 벡터가 상이한 치료적 단백질의 발현을 일으킨다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 대안적으로, 단일 벡터는 하나 초과의 치료적 단백질 또는 비코딩 RNA를 발현할 수 있다. 상기 기재된 것과 같은 다른 상황에서, 하나의 바이러스 벡터는 예를 들어 슈반 세포에서 Cas9 단백질을 발현하는데 사용될 수 있고, 상이한 바이러스 벡터는 필요한 핵산에 대해 Cas9를 표적으로 하기 위하여 관련 gRNA를 발현시키는데 사용될 수 있다.
본 명세서에서 명백하게 이전에 공개된 문서의 목록 또는 논의는 반드시 문서가 최신 기술의 일부이거나 통상적인 일반 지식이라는 인정으로 간주되지 않아야 한다.
본 발명의 주어진 양태, 특징 또는 매개변수에 대한 선호도 및 선택은 문맥상 다르게 지시하지 않는 한, 본 발명의 모든 다른 양태, 특징 및 매개변수에 대한 임의의 및 모든 선호도 및 선택과 조합되어 개시된 바로서 간주되어야 한다.
따라서, 본 발명의 하나의 양태의 개시가 어떻게 본 발명의 다른 양태와 관련되는지를 예시하고, 이러한 양태가 어떻게 조합될 수 있는지를 입증하기 위해, 본 발명은 일부 구현예에서 하기를 제공한다:
슈반 세포와 관련된 질환의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 바이러스 벡터로서, 여기서 바이러스 벡터는 AAV이고, 바이러스 벡터는 제1 폴리뉴클레오티드로 전사될 수 있는 제1 핵산을 포함하고, 제1 폴리뉴클레오티드의 발현은 최소 미엘린 특이적(Mpz) 프로모터의 제어 하에 있는, 바이러스 벡터;
슈반 세포와 관련된 질환의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 바이러스 벡터로서, 여기서 바이러스 벡터는 AAV이고, 바이러스 벡터는 제1 폴리뉴클레오티드로 전사될 수 있는 제1 핵산을 포함하고, 제1 폴리뉴클레오티드의 발현은 하기 a) 또는 b)의 제어 하에 있는, 바이러스 벡터: a) 미엘린 단백질 제로(Mpz) 프로모터, 선택적으로 프로모터는 SEQ ID NO. 4 또는 SEQ ID NO. 1과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%, 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%인 서열을 가짐; 또는
b) 선택적으로 SEQ ID NO. 5 또는 SEQ ID NO. 22에 정의된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 최소 미엘린 특이적 프로모터(miniMpz), 선택적으로 miniMPZ 프로모터는 SEQ ID NO. 5 또는 SEQ ID NO. 22와 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%, 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%인 서열 상동성을 가짐;
최소 미엘린 특이적(Mpz) 프로모터인, 제2 핵산 서열에 작동가능하게 연결되는 제1 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 작제물, 여기서 제2 핵산 서열은 유전자 서열의 개방형 해독 프레임이거나 비코딩 RNA를 인코딩함;
슈반 세포에서 높은 발현 수준을 유도하고 본원에 기재된 바이러스 벡터에서 사용하기에 적합한 최소 미엘린 특이적(Mpz) 프로모터.
본 발명은 또한 하기를 제공한다:
CMT1X의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 바이러스 벡터, 여기서 벡터는 GJB1 유전자에 작동가능하게 연결된 인간 Mpz 프로모터(SEQ ID NO: 18에 따름)를 포함하고, 바이러스 벡터는 AAV9임;
CMT1X의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조 방법에서 바이러스 벡터의 용도, 여기서 벡터는 GJB1 유전자에 작동가능하게 연결된 인간 Mpz 프로모터(SEQ ID NO: 18에 따름)를 포함하고, 바이러스 벡터는 AAV9임; 및
바이러스 벡터를 CMT1X의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, CMT1X의 치료 또는 예방 방법, 여기서 바이러스 벡터는 GJB1 유전자에 작동가능하게 연결된 인간 Mpz 프로모터(SEQ ID NO: 18에 따름)를 포함하고, 바이러스 벡터는 AAV9임.
본 발명은 또한 하기를 제공한다:
CMT4C의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 바이러스 벡터, 여기서 벡터는 SH3TC2 유전자에 작동가능하게 연결된 인간 최소 Mpz 프로모터(SEQ ID NO: 22에 따름)를 포함하고, 바이러스 벡터는 AAV9임;
CMT4C의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조 방법에서 바이러스 벡터의 용도, 여기서 벡터는 SH3TC2 유전자에 작동가능하게 연결된 인간 Mpz 프로모터(SEQ ID NO: 22에 따름)를 포함하고, 바이러스 벡터는 AAV9임; 및
바이러스 벡터를 CMT4C의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, CMT4C의 치료 또는 예방 방법, 여기서 바이러스 벡터는 SH3TC2 유전자에 작동가능하게 연결된 인간 Mpz 프로모터(SEQ ID NO: 22에 따름)를 포함하고, 바이러스 벡터는 AAV9임.
치료 또는 예방을 필요로 하는 환자는 증상을 나타내거나 다르게는 본원에 개시된 질환 중 하나의 진단을 받은 환자를 포함하고, 또한 본원에 개시된 질환 중 하나를 갖거나 이를 발현할 것으로 의심되는 환자를 포함한다.
도면의 설명
도 1: 슈반 세포-표적 유전자 발현을 위해 생성된 AAV 벡터 트랜스퍼 플라스미드: Cx32를 발현하는 인간 GJB1 개방형 해독 프레임을 함유하는 pAAV-Mbz.GJB1 벡터(Full) 및 리포터 유전자 EGFP를 발현하는 pAAV-Mpz.Egfp(Mock).
도 2: AAV9-매개된 슈반-세포 표적 유전자 발현. 도 2의 A 내지 도 2의 D: 2개월령 야생형(WT) 마우스에 AAV9-Mpz-Egfp 벡터의 요추 척수강내(i.th.) 주사 4주 이후, EGFP 항체(도 2의 A2, 도 2의 B)를 사용한 요추근(lumbar root) 절편의 면역염색(도 2의 A 내지 도 2의 B)은 낮은(좌) 및 높은(우) 배율에서의 슈반 세포의 서브세트에서 핵주위 발현(별표)을 나타낸다. EGFP 발현은 또한 항체 염색 없이 낮은 배율에서(도 2의 C2) 및 EGFP 항체로 면역염색된 갈래(teased) 좌골 신경 섬유의 높은 배율에서(도 2의 D2) 좌골 신경 절편에서 나타난다. 도 2의 A1, 도 2의 C1, 및 도 2의 D1은 도 2의 A2, 도 2의 C2, 도 2의 D2에서 나타낸 동일한 영역의 DAPI를 사용한 핵 염색만을 나타낸다. 도 2의 E: 요추근 및 좌골 신경에서 EGFP-포지티브 슈반 세포 비율의 정량화. 도 2의 F: 요추근에서의 벡터 카피 수(VCN), 좌골 신경의 근위 및 원위 절편은 척수강내 주사 이후 말초 신경에 대한 벡터의 생체분포의 구배를 입증한다. 도 2의 G: 상이한 마우스(1-4)로부터의 요추근(LR), 대퇴 신경(FN) 및 좌골 신경(SN) 분리물의 면역블롯 분석은 형질전환 샘플로부터의 포지티브 대조군(+)에 해당하는 주사된 마우스의 조직 중 대부분에서 특정 EGFP 특이적 밴드를 나타낸 반면, 이는 네거티브(-) 대조군에서는 부재한다(Kagiava 등, 미공개).
도 3: 2개월 Cx32KO 및 R75W KO 마우스에서 척수강내 전달된 AAV9-Mpz.GJB1 벡터의 발현. 도 3의 A. 관련 조직에서 벡터 카피 수(VCN). WT(도 3의 B) 및 Cx32 KO(도 3의 C) 좌골 갈래 섬유의 면역염색은, Cx32 KO에서 부재하는 WT 섬유에서의 파라노달(paranodal) 미엘린 영역에서의 특이적 Cx32 국소화(화살표)를 입증한다. AAV9-Mpz.GJB1 척수강내 주사는, 핵주위 영역에서의 R75W 돌연변이체의 존재에도 불구하고, Cx32 KO 좌골 섬유(도 3의 D) 뿐만 아니라 또한 R75W KO 섬유(도 3의 E)에서도 파라노달 Cx32 발현을 야기한다(별표 및 열린 화살촉). 도 3의 F: 요추근 및 좌골 신경 샘플에서 Cx32 발현의 웨스턴 블롯(Western blot) 분석(TG+: 형질전환-포지티브; KO: 비치료된 Cx32 KO-네거티브 대조군)(Kagiava 등, 미공개).
도 4: AAV9-Mpz.Egfp(mock) 치료된 한배새끼와 비교한, 발병 후 AAV9-Mpz.GJB1(full) 주사된 6개월령 Cx32 KO 마우스의 거동 분석. 나타낸 바와 같이, mock 치료된 Cx32 KO 마우스에 비하여 AAV9-Mpz.GJB1 치료된 것(GJB1)에서 운동 성능의 로타로드(rotarod)(좌) 및 발 그립(우) 시험의 결과. 각각의 군의 시간 경과 분석은, 주사 후 2개월(8개월령)에 로타로드 및 발 그립 분석에서 완전히 치료된 Cx32 KO 마우스의 개선된 운동 성능을 나타냈고, 이후 운동 성능은 10개월령까지 안정하게 유지되었다. 대조적으로 mock 치료된 마우스는 거동 시험 모두에 의해 나타나는 바와 같이, 시간이 지남에 따라 개선되지 않았다.
도 5: 좌골 신경 운동 전도 연구의 결과. 운동 신경 전도 속도(MNCV)는 mock 벡터 주사된 한배새끼에 비하여 10개월령의 완전히 치료된 Cx32 KO 마우스에서 개선되어, WT의 값에 접근하였다.
도 6: mock-치료된 마우스 벡터와 비교한, 발병 후 AAV9-Mpz.GJB1의 척수강내 전달 이후의 Cx32 KO 마우스의 전(anterior)척수근의 형태학적 분석. 10개월령(치료 이후 4개월)에서, 낮은(도 6의 A 내지 도 6의 B) 및 높은(도 6의 C 내지 도 6의 D) 배율에서 척수에 부착된 전요추 척수근의 반초박 절편의 대표적 이미지, 및 나타낸 바와 같은 mock 또는 full(GJB1) 벡터 치료된 마우스로부터의 형태적 분석 결과(도 6의 E 내지 도 6의 F). AAV9-Mpz.GJB1 주사된 마우스 근(root)(도 6의 B, 도 6의 D)은 더 적은 탈미엘린화(*) 및 재미엘린화(r) 섬유와 함께, mock-치료된 한배새끼(도 6의 A, 도 6의 C)의 근에 비해 개선된 미엘린화를 나타낸다. 다중 근에서 비정상적 미엘린화 섬유의 비율의 정량화는, mock 벡터 치료된 한배새끼에 비해 완전히 치료된 것에서 비정상적 미엘린화 섬유의 수의 유의한 개선(도 6의 E) 및 포말 대식세포의 수의 유의한 감소(도 6의 F)를 확인한다.
도 7: 발병 후 AAV9-Mpz.GJB1 벡터의 척수강내 전달 이후의 Cx32 KO 마우스의 좌골 신경의 형태학적 분석. 10개월령(치료 이후 4개월)에서, 낮은(도 7의 A 내지 도 7의 B) 및 높은(도 7의 C 내지 도 7의 D) 배율에서 좌골 신경의 반초박 절편의 대표적 이미지, 및 나타낸 바와 같은 mock 또는 full(GJB1) 벡터 치료된 마우스로부터의 형태적 분석 결과(도 7의 E 내지 도 7의 F). AAV9-Mpz.GJB1 주사된 마우스 신경(도 7의 B, 도 7의 D)은 더 적은 탈미엘린화(*) 및 재미엘린화(r) 섬유와 함께, mock-치료된 한배새끼의 신경(도 7의 A, 도 7의 C)에 비해 개선된 미엘린화를 나타낸다. 다중 신경에서 비정상적 미엘린화 섬유의 비율의 정량화는, mock 벡터 치료된 한배새끼에 비해 완전히 치료된 것에서 비정상적 미엘린화 섬유의 수의 유의한 개선(도 7의 E) 및 포말 대식세포의 수의 유의한 감소(도 7의 F)를 확인한다.
도 8: 발병 후 AAV9-Mpz.GJB1 벡터의 척수강내 전달 이후의 Cx32 KO 마우스의 대퇴 신경의 형태학적 분석. 10개월령(치료 이후 4개월)에서, 낮은(도 8의 A 내지 도 8의 B) 및 높은(도 8의 C 내지 도 8의 D) 배율에서 대퇴 신경의 반초박 절편의 대표적 이미지, 및 나타낸 바와 같은 mock 또는 full(GJB1) 벡터 치료된 마우스로부터의 형태적 분석 결과(도 8의 E 내지 도 8의 F). AAV9-Mpz.GJB1 주사된 마우스 신경(도 8의 B, 도 8의 D)은 더 적은 탈미엘린화(*) 및 재미엘린화(r) 섬유와 함께, mock-치료된 한배새끼의 신경(도 8의 A, 도 8의 C)에 비해 개선된 미엘린화를 나타낸다. 다중 신경에서 비정상적 미엘린화 섬유의 비율의 정량화는, mock 벡터 치료된 한배새끼에 비해 완전히 치료된 것에서 비정상적 미엘린화 섬유의 수의 유의한 개선(도 8의 E) 및 포말 대식세포의 수의 유의한 감소(도 8의 F)를 확인한다.
도 9: 1127 bp 전장 랫트 Mpz 프로모터로부터 410 bp 서열의 PCR 증폭 이후 AAV 트랜스퍼 플라스미드로 클로닝된 miniMpz-Egfp 작제물.
도 10: EGFP 항체를 갖는 2개월령 WT 마우스에서 AAV9-miniMpz-Egfp 벡터의 요추 척수강내 주사 4주 이후 요추근 및 좌골 신경 종단면의 면역염색은 슈반 세포의 서브세트에서 핵주위 발현을 나타낸다(도 10의 A, 도 10의 C). 도 10의 B 및 도 10의 C는 DAPI로 염색된 핵만을 나타내는 네거티브 대조군이다. 도 10의 E: EGFP-포지티브 슈반 세포의 백분율(n=5 내지 6마리의 마우스). 도 10의 F: 요추근 및 좌골 신경에서의 벡터 카피 수는 척수강내 주사 이후 벡터의 적절한 생체분포를 입증한다(n=6마리의 마우스).
도 11: AAV9-miniMpz-Egfp 벡터의 최소 CNS 발현. 세포 마커 NeuN(도 11의 A, 뉴론의 라벨링), GFAP(도11b, 아스트로사이트의 라벨링), CC-1(도 11의 C 내지 도 11의 D, 올리고덴드로사이트의 라벨링)과의 조합으로 EGFP 항체를 갖는 2개월령 WT 마우스에서의 AAV9-miniMpz-Egfp 벡터의 요추 척수강내 주사 4주 이후 요추 척수 종단면의 면역염색은, 각각의 세포 유형 중 오로지 몇 개의 세포만이 EGFP를 발현하는 반면(예는 화살표로 나타냄), 대부분은 EGFP-네거티브임을 나타낸다(예는 열린 화살촉으로 나타냄). 도 11의 E. 세포 마커 염색 마다 n=3 내지 5마리의 마우스에서의 정량화는 약 2 내지 3%의 모든 3개의 CNS 세포 유형에서 낮은 발현율을 나타낸다.
도 12: full 치료(AAV9-Mpz-GJB1) 벡터 또는 mock 벡터(AAV9-Mpz-Egfp)를 사용한 2개월령에 발병 전 치료된 Cx32 KO 마우스(CMT1X 모델)의 군에서의 운동 거동 시험. 발 그립 강도 시험은 치료 전(2개월령) 및 4개월령(도 12의 A) 및 6개월령(도 12의 B)에 수행되었다. 4개월 및 6개월에 치료된 군에서 유의한 기능 개선이 있다. 도 12의 C는 치료 이후 시간 경과에 따라 유의한 개선을 나타내는 반면, mock 치료된 마우스는 어떠한 개선도 나타내지 않았다.
도 13: 발병 전 치료된(full) 및 mock-치료된 6개월령 Cx32 KO 마우스의 전기생리학적 연구. 좌골 운동 신경 전도 연구는 6개월령에 수행되었고, mock 치료에 비해 2개월령에 유전자 요법 치료 이후 좌골 신경 전도 속도의 유의한 개선을 나타냈다.
도 14: 2개월령에 full 치료(AAV9-Mpz-GJB1) 벡터 또는 mock 벡터(AAV9-Mpz-Egfp)를 사용한 발병 전 치료 이후의 6개월령 Cx32 KO 마우스의 전(운동)요추근의 형태학적 분석. 전(운동)요추근의 반초박 절편의 대표적 이미지. AAV9-Mpz-GJB1 치료된 마우스(도 14의 B, 도 14의 D)는 더 적은 탈미엘린화(*) 및 재미엘린화(r) 섬유와 함께 mock 치료된 마우스(도 14의 A, 도 14의 C)에 비해 개선된 미엘린화를 나타낸다. 정량적 분석(도 14의 E, 도 14의 F)에 의해 확인된 바와 같이, mock 치료된 마우스에 비해 치료된 것에서 더 적은 탈미엘린화(*) 또는 재미엘린화(r) 섬유(도 14의 E) 및 더 적은 포말 대식세포(도 14의 F)가 발견되었다.
도 15: 2개월령에 full 치료(AAV9-Mpz-GJB1) 벡터 또는 mock 벡터(AAV9-Mpz-Egfp)를 사용한 발병 전 치료 이후의 6개월령 Cx32 KO 마우스의 중간-좌골 신경의 형태학적 분석. 중간-좌골 신경의 반초박 절편의 대표적 이미지. AAV9-Mpz-GJB1 치료된 마우스(도 15의 B, 도 15의 D)는 더 적은 탈미엘린화(*) 및 재미엘린화(r) 섬유와 함께 mock 치료된 마우스(도 15의 A, 도 15의 C)에 비해 개선된 미엘린화를 나타낸다. 정량적 분석(도 15의 E, 도 15의 F)에 의해 확인된 바와 같이, mock 치료된 마우스에 비해 치료된 것에서 더 적은 탈미엘린화(*) 또는 재미엘린화(r) 섬유(도 15의 E) 및 더 적은 포말 대식세포(도 15의 F)가 발견되었다.
도 16: 2개월령에 full 치료(AAV9-Mpz-GJB1) 벡터 또는 mock 벡터(AAV9-Mpz-Egfp)를 사용한 발병 전 치료 이후의 6개월령 Cx32 KO 마우스의 대퇴 운동 신경의 형태학적 분석. 대퇴 운동 신경의 반초박 절편의 대표적 이미지. AAV9-Mpz-GJB1 치료된 마우스(도 16의 B, 도 16의 D)는 더 적은 탈미엘린화(*) 및 재미엘린화(r) 섬유와 함께 mock 치료된 마우스(도 16의 A, 도 16의 C)에 비해 개선된 미엘린화를 나타낸다. 정량적 분석(도 16의 E, 도 16의 F)에 의해 확인된 바와 같이, mock 치료된 마우스에 비해 치료된 것에서 더 적은 탈미엘린화(*) 또는 재미엘린화(r) 섬유(도 16의 E) 및 더 적은 포말 대식세포(도 16의 F)가 발견되었다.
도 17: 신규한 치료적 벡터 AAV9-mini-Mpz-SH3TC2.myc의 척수강내 전달 이후 Sh3tc2-/- 마우스의 말초 신경계에서 SH3TC2의 발현 분석. Sh3tc2-/- 마우스에의 AAV9-miniMpz-SH3TC2myc 벡터의 척수강내 주사 4주 이후 요추근(도 17의 A) 및 좌골 신경(도 17의 D에서 절편 및 도 17의 F에서 갈래 섬유)에서의 주로 미엘린성 슈반 세포의 핵주위 세포질에서의 인간 정상 SH3TC2 단백질의 발현(적색). 비주사 마우스의 조직은 네거티브 대조군으로서 도 17의 A, 도 17의 C, 도 17의 E에 나타나있다. 세포 핵은 청색으로 염색된다. n=5마리의 마우스에서 요추근 및 좌골 신경에서의 발현율(% SH3TC2-포지티브 세포)의 정량화는 도 17의 G에 나타나있다.
서열
SEQ ID NO. 1: AAV-Mpz.Egfp 작제물
tagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttccttgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacgtagccatgctctaggtaccgggccccccctcgaggtcgacggtatcgataagcttcctgttcagactcgtttcctgctgtaccctttcaatggccccacatcaaatcaaacacagatggcacatatctactctaaatatatgcagagcttcacaaacgtcatacacgtacgtgtgtcacacacgcacacacacacccttccacctctgcccttacctttgctgtcccatctagacattatccctcccatccccttatttcccttatcaaaatggctgctccttcaaggttccaaataacactgcttcctggacctgactcctctttcctctgaacttcctgtgttaagtgtattcctagtgcactgtgccttggtagttgttgagattgccctctgcttctcccttctgcctcctcatctagtgatcttgagcttgtagaaagaactgaattaccattctaatacgagcattctcgaactctccaaatagccaccaagcaggacaataggcagtcttgatcatttaaactgctgcatggcaaaaggaatcgaaggatttcttaacagaagtgggggggggggagatctgggcttcttcctggaagtttcctgatagagaaaatcttctgcctgggtagaatctcccaggatgcagggagatggaaaaagtgttccccaaggactttgtagtctacaggttgtggagccatcggaacaacgagacaccctaatttgggagtgctctgaaagaaacttgcctctaggccctagggctctcaggcaaggaggctaagaaggaatcctttgctgtagccttttggatttaggtttctcagcttatctatccctcagagaagtgtgtctatgtcccttttctgtccctctgcctcaccccaccccaacattccaacctagggtagggggaggtcagtatacacaaagccctctgtgtaaggggtggtatgtgtccccccacccccctacccagagtatacaatgccccttctgctccatgcccctgccaccctcccaccacctctcaattgcacatgccaggctgcaattggtcactggctcaggacagccccctcatgctggggatccaggggattttaagcaggttccagaaaacaccactcagttccttgtcccccgctctctccaccccacagacgctctgccaagcttgatatcgaattgatccaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaaagcggccctagatcaagctt atcgataatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctcccc 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볼드체 = ITR 서열
이탤릭체 = Mpz 프로모터
밑줄 = EGFP
이탤릭체 밑줄 = WPRE 서열
SEQ ID NO. 2: AAV-Mpz.GJB1 작제물
tagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttccttgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacgtagccatgctctaggtacccctcgaagcttcctgttcagactcgtttcctgctgtaccctttcaatggccccacatcaaatcaaacacagatggcacatatctactctaaatatatgcagagcttcacaaacgtcatacacgtacgtgtgtcacacacgcacacacacacccttccacctctgcccttacctttgctgtcccatctagacattatccctcccatccccttatttcccttatcaaaatggctgctccttcaaggttccaaataacactgcttcctggacctgactcctctttcctctgaacttcctgtgttaagtgtattcctagtgcactgtgccttggtagttgttgagattgccctctgcttctcccttctgcctcctcatctagtgatcttgagcttgtagaaagaactgaattaccattctaatacgagcattctcgaactctccaaatagccaccaagcaggacaataggcagtcttgatcatttaaactgctgcatggcaaaaggaatcgaaggatttcttaacagaagtgggggggggggagatctgggcttcttcctggaagtttcctgatagagaaaatcttctgcctgggtagaatctcccaggatgcagggagatggaaaaagtgttccccaaggactttgtagtctacaggttgtggagccatcggaacaacgagacaccctaatttgggagtgctctgaaagaaacttgcctctaggccctagggctctcaggcaaggaggctaagaaggaatcctttgctgtagccttttggatttaggtttctcagcttatctatccctcagagaagtgtgtctatgtcccttttctgtccctctgcctcaccccaccccaacattccaacctagggtagggggaggtcagtatacacaaagccctctgtgtaaggggtggtatgtgtccccccacccccctacccagagtatacaatgccccttctgctccatgcccctgccaccctcccaccacctctcaattgcacatgccaggctgcaattggtcactggctcaggacagccccctcatgctggggatccaggggattttaagcaggttccagaaaacaccactcagttccttgtcccccgctctctccaccccacagacgctctgccaagcttcgagaatgaggcaggatgaactggacaggtttgtacaccttgctcagtggcgtgaaccggcattctactgccattggccgagtatggctctcggtcatcttcatcttcagaatcatggtgctggtggtggctgcagagagtgtgtggggtgatgagaaatcttccttcatctgcaacacactccagcctggctgcaacagcgtttgctatgaccaattcttccccatctcccatgtgcggctgtggtccctgcagctcatcctagtttccaccccagctctcctcgtggccatgcacgtggctcaccagcaacacatagagaagaaaatgctacggcttgagggccatggggaccccctacacctggaggaggtgaagaggcacaaggtccacatctcagggacactgtggtggacctatgtcatcagcgtggtgttccggctgttgtttgaggccgtcttcatgtatgtcttttatctgctctaccctggctatgccatggtgcggctggtcaagtgcgacgtctacccctgccccaacacagtggactgcttcgtgtcccgccccaccgagaaaaccgtcttcaccgtcttcatgctagctgcctctggcatctgcatcatcctcaatgtggccgaggtggtgtacctcatcatccgggcctgtgcccgccgagcccagcgccgctccaatccaccttcccgcaagggctcgggcttcggccaccgcctctcacctgaatacaagcagaatgagatcaacaagctgctgagtgagcaggatggctccctgaaagacatactgcgccgcagccctggcaccggggctgggctggctgaaaagagcgaccgctgctcggcctgctgaggatccctcgaggtcgacggtatcgataagctt atcgataatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctcccc gcatcgataccgtcgactcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctggggctcgactagagcatggctacgtagataagtagcatggcgggttaatcattaactacaaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagctttttgcaaaagcctaggcctccaaaaaagcctcctcactacttctggaatagctcagaggccgaggcggcctcggcctctgcataaataaaaaaaattagtcagccatggggcggagaatgggcggaactgggcggagttaggggcgggatgggcggagttaggggcgggactatggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacacctggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacaccctaactgacacacattccacagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccattcgacgctctcccttatgcgactcctgcattaggaagcagcccagtagtaggttgaggccgttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaaggagatggcgcccaacagtcccccggccacggggcctgccaccatacccacgccgaaacaagcgctcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttccccatcggtgatgtcggcgatataggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccggccacgatgcgtccggcgtagaggatctggctagcgatgaccctgctgattggttcgctgaccatttccgggtgcgggacggcgttaccagaaactcagaaggttcgtccaaccaaaccgactctgacggcagtttacgagagagatgatagggtctgcttcagtaagccagatgctacacaattaggcttgtacatattgtcgttagaacgcggctacaattaatacataaccttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaatacacggaattaattc
볼드체 = ITR 서열
이탤릭체 = Mpz 프로모터
밑줄 = Cx32
이탤릭체 밑줄 = WPRE 서열
SEQ ID NO. 3: AAV-miniMpz.Egfp 작제물
tagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttccttgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacgtagccatgctctaggtaccgctctcaggcaaggaggctaagaaggaatcctttgctgtagccttttggatttaggtttctcagcttatctatccctcagagaagtgtgtctatgtcccttttctgtccctctgcctcaccccaccccaacattccaacctagggtagggggaggtcagtatacacaaagccctctgtgtaaggggtggtatgtgtccccccacccccctacccagagtatacaatgccccttctgctccatgcccctgccaccctcccaccacctctcaattgcacatgccaggctgcaattggtcactggctcaggacagccccctcatgctggggatccaggggattttaagcaggttccagaaaacaccactcagttccttgtcccccgctctctccaccccacagacgctctgccaaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaaagcggccctagatcaagctt 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볼드체 = ITR 서열
이탤릭체 = mini-Mpz 프로모터
밑줄 = EGFP
이탤릭체 밑줄 = WPRE 서열
SEQ ID NO. 4: Mpz 프로모터
cctgttcagactcgtttcctgctgtaccctttcaatggccccacatcaaatcaaacacagatggcacatatctactctaaatatatgcagagcttcacaaacgtcatacacgtacgtgtgtcacacacgcacacacacacccttccacctctgcccttacctttgctgtcccatctagacattatccctcccatccccttatttcccttatcaaaatggctgctccttcaaggttccaaataacactgcttcctggacctgactcctctttcctctgaacttcctgtgttaagtgtattcctagtgcactgtgccttggtagttgttgagattgccctctgcttctcccttctgcctcctcatctagtgatcttgagcttgtagaaagaactgaattaccattctaatacgagcattctcgaactctccaaatagccaccaagcaggacaataggcagtcttgatcatttaaactgctgcatggcaaaaggaatcgaaggatttcttaacagaagtgggggggggggagatctgggcttcttcctggaagtttcctgatagagaaaatcttctgcctgggtagaatctcccaggatgcagggagatggaaaaagtgttccccaaggactttgtagtctacaggttgtggagccatcggaacaacgagacaccctaatttgggagtgctctgaaagaaacttgcctctaggccctagggctctcaggcaaggaggctaagaaggaatcctttgctgtagccttttggatttaggtttctcagcttatctatccctcagagaagtgtgtctatgtcccttttctgtccctctgcctcaccccaccccaacattccaacctagggtagggggaggtcagtatacacaaagccctctgtgtaaggggtggtatgtgtccccccacccccctacccagagtatacaatgccccttctgctccatgcccctgccaccctcccaccacctctcaattgcacatgccaggctgcaattggtcactggctcaggacagccccctcatgctggggatccaggggattttaagcaggttccagaaaacaccactcagttccttgtcccccgctctctccaccccacagacgctctgcc
SEQ ID NO. 5: MiniMpz 프로모터
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SEQ ID NO. 6: 코넥신-32(Cx32): GenBank: AY408135.1
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SEQ ID NO. 7: SH3 도메인 및 테트라트리코펩티드 반복체 2(SH3TC2): GenBank: BC114486.1
atgggtggctgcttctgcatccccagggagcggagtctgacccggggcccaggtaaagaaactccttccaaggatccaactgtatcgagtgagtgtatagcctcatctgaatacaaggaaaaatgttttctgccacagaacattaatccagacctgacactctccttctgtgtaaagagccgctccaggaggtgtgtaaatggacccctacaggaagctgctcggaggcggctctgggcactggagaatgaggaccaggaggtgcgcatgctgtttaaggacctctcagcaaggttggtcagtatccagtctcagagggcccagtttctcatcaccttcaagaccatggaggaaatctggaagttctccacctaccttaatttagaacatctcctctttgaccacaagtactggctcaactgcatattggtggaggatacagagatccaagtgtctgtagatgataaacacctggaaacaatatacctgggactcctgatacaggaaggccacttcttctgcagagccctgtgctccgtgactccaccagccgagaaggaaggggaatgcttgacactttgcaagaatgagttaatctcagtgaagatggcagaagctggctccgagttggaaggcgtgtctttggtgacaggtcagcggggcctggtactggtgtcagccttggagcctctgcctctccctttccaccagtggttcctaaagaattatccaggaagctgtggcctttccaggaagagggattggacaggctcctatcagattggcagaggacgctgtaaggccttgacgggttatgagccaggagaaaaggatgaactgaatttctaccagggagaaagcattgagatcatcggctttgtcatacctgggcttcagtggttcattggaaagtcgacaagttcaggacaagtgggctttgtccccaccaggaacatagatcctgattcttattccccaatgagcaggaactctgcctttctcagtgatgaggagagatgctccctgttggccctgggaagtgataagcagactgagtgttccagcttcctccacactcttgctcgcactgacatcacatctgtctaccggctcagtgggtttgaatccatccagaatcctccaaatgatctgagtgcatcccagcctgaaggcttcaaggaggtcaggcctggcagagcctgggaggagcatcaggccgtggggtccagacagtccagcagctctgaggactccagcctggaggaggagctcctctcggccacctcagacagctatcgcctgccggagcctgatgaccttgatgacccggaactgctcatggacctaagcactggtcaggaggaggaggctgagaacttcgcccccatattggcttttctggatcatgagggttatgctgaccactttaagagtctctatgacttctccttctctttcctcacttcttccttttatagcttctctgaggaggatgagtttgtggcctacctggaggcatcaagaaagtgggccaagaagagccacatgacctgggcccatgcccggctctgcttcctcctgggccggctgagcatcaggaaggtcaaactctctcaggccagggtgtacttcgaggaggccatccacattctcaatggagcatttgaggacctatccttggtggccactctgtacatcaatttggctgccatctacctgaaacagaggctgagacataaaggctccgccctgttggaaaaggcaggtgccctgctggcctgcctgcctgaccgtgagtctagtgccaagcatgaactcgacgtggtggcctacgtgctgcgccaggggattgtggtgggcagcagcccgctggaggccagggcctgctttctggccatccgcttgctcctgagcctaggccggcacgaggaggtcctgccctttgccgagcgcctgcagctcctctctggacaccctcctgcctctgaggctgtggccagtgttttgagttttctgtatgacaagaaatatcttccacaccttgcagtggcctctgtccagcaacatggtatccagagtgcccaagggatgtctcttcctatttggcaggtccaccttgtcctccagaacacaaccaagctccttggctttccttccccaggctggggtgaagtttctgccttggcctgcccaatgctcagacaggccctggctgcctgtgaggaactagcagaccggagcacccagagggccctgtgtctcatcctttccaaagtgtacctcgagcacaggtctcctgacggtgccatccactacctgagccaggccttggtgctagggcagctgctgggtgagcaggaatcctttgagtcttctctctgcctggcatgggcctatctcttagccagccaggccaagaaggctttggatgtgcttgagccactgctatgctccctgaaggagacagagagtctcactcaaaggggagtcatctataacctcctgggacttgcactccaaggtgaaggccgggtgaacagggcagccaagagctatcttcgggccttgaacagagcccaggaggtgggagatgtgcataaccaggcagtggctatggccaatcttggccacctgagccttaagtcctgggctcagcatccagccagaaactatctcctgcaggctgtacgactctattgtgaacttcaggccagtaaggagacagacatggaattagtacaggtgtttctctggttggcccaagttctggtgtctggacaccagctgacccatggccttctttgttatgaaatggcattgctgtttggcttaaggcatcgacatctaaagagtcagcttcaggccaccaaatccctctgccatttctacagctctgtgtccccaaaccctgaggcatgcatcacctaccatgagcactggctggccctggctcagcaactcagggaccgggagatggaagggaggctgctggagtccctggggcagctttatcggaacctaaataccgccaggtccctcaggaggtcactcacatgcatcaaggagagcctgcgtatcttcattgacctgggggagacagacaaggctgctgaggcctggcttggggcggggcgactccactacctcatgcaggaagacgagctggtggagctgtgcctgcaggcagccatccagacagccctgaagtcagaggagcctttgctggctctcaaactttatgaagaagcaggtgatgtgttcttcaatgggacccgccacaggcatcatgcagtggagtactaccgagctggagctgttcctttagcaaggaggttgaaggcggtgagaactgagctccggattttcaataagctgacagagctgcagattagcctcgaaggctatgagaaggctttggaatttgccaccctggccgccaggctcagcacagtcacaggagatcagaggcaagagctggtggcctttcaccgcctggctacagtgtactactccctgcacatgtatgagatggctgaggactgctacctgaagaccctgtccctctgtccaccctggctgcagagtcccaaggaggccctgtactatgccaaggtgtattatcgcctgggcagactcaccttctgccagctgaaggatgcccatgatgccactgagtacttccttctggccctggcagcagcggtcctgctgggtgatgaggagcttcaggacaccattaggagcaggctggacaacatctgccagagccccctgtggcacagcaggccctccgggtgctcctcagagagggcgcggtggctgagtggtggtggcctggccctctga
SEQ ID NO. 8: 말초 미엘린 단백질 22(PMP22): NCBI 참조 서열: NM_000304.4
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SEQ ID NO. 9: 미엘린 단백질 제로(MPZ): GenBank: AK313555.1
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SEQ ID NO. 10: 조기 성장 반응 2(EGR2): NCBI 참조 서열: NM_000399.5
aactgagcgaggagcaattgattaatagctcggcgaggggactcactgactgttataataacactacaccagcaactcctggcttcccagcagccggaacacagacaggagagagtcagtggcaaatagacatttttcttatttcttaaaaaacagcaacttgtttgctacttttatttctgttgatttttttttcttggtgtgtgtggtggttgtttttaagtgtggagggcaaaaggagataccatcccaggctcagtccaacccctctccaaaacggcttttctgacactccaggtagcgagggagttgggtctccaggttgtgcgaggagcaaatgatgaccgccaaggccgtagacaaaatcccagtaactctcagtggttttgtgcaccagctgtctgacaacatctacccggtggaggacctcgccgccacgtcggtgaccatctttcccaatgccgaactgggaggcccctttgaccagatgaacggagtggccggagatggcatgatcaacattgacatgactggagagaagaggtcgttggatctcccatatcccagcagctttgctcccgtctctgcacctagaaaccagaccttcacttacatgggcaagttctccattgaccctcagtaccctggtgccagctgctacccagaaggcataatcaatattgtgagtgcaggcatcttgcaaggggtcacttccccagcttcaaccacagcctcatccagcgtcacctctgcctcccccaacccactggccacaggacccctgggtgtgtgcaccatgtcccagacccagcctgacctggaccacctgtactctccgccaccgcctcctcctccttattctggctgtgcaggagacctctaccaggacccttctgcgttcctgtcagcagccaccacctccacctcttcctctctggcctacccaccacctccttcctatccatcccccaagccagccacggacccaggtctcttcccaatgatcccagactatcctggattctttccatctcagtgccagagagacctacatggtacagctggcccagaccgtaagccctttccctgcccactggacaccctgcgggtgccccctccactcactccactctctacaatccgtaactttaccctggggggccccagtgctggggtgaccggaccaggggccagtggaggcagcgagggaccccggctgcctggtagcagctcagcagcagcagcagccgccgccgccgccgcctataacccacaccacctgccactgcggcccattctgaggcctcgcaagtaccccaacagacccagcaagacgccggtgcacgagaggccctacccgtgcccagcagaaggctgcgaccggcggttctcccgctctgacgagctgacacggcacatccgaatccacactgggcataagcccttccagtgtcggatctgcatgcgcaacttcagccgcagtgaccacctcaccacccatatccgcacccacaccggtgagaagcccttcgcctgtgactactgtggccgaaagtttgcccggagtgatgagaggaagcgccacaccaagatccacctgagacagaaagagcggaaaagcagtgccccctctgcatcggtgccagccccctctacagcctcctgctctgggggcgtgcagcctgggggtaccctgtgcagcagtaacagcagcagtcttggcggagggccgctcgccccttgctcctctcggacccggacaccttgagatgagactcaggctgatacaccagctcccaaaggtcccggaggccctttgtccactggagctgcacaacaaacactaccaccctttcctgtccctctctccctttgttgggcaaagggctttggtggagctagcactgccccctttccacctagaagcaggttcttcctaaaacttagcccattctagtctctcttaggtgagttgactatcaacccaaggcaaaggggaggctcagaaggaggtggtgtggggacccctggccaagagggctgaggtctgaccctgctttaaagggttgtttgactaggttttgctaccccacttccccttattttgacccatcacaggtttttgaccctggatgtcagagttgatctaagacgttttctacaataggttgggagatgctgatcccttcaagtggggacagcaaaaagacaagcaaaactgatgtgcactttatggcttgggactgatttgggggacattgtacagtgagtgaagtatagcctttatgccacactctgtggccctaaaatggtgaatcagagcatatctagttgtctcaacccttgaagcaatatgtattataaactcagagaacagaagtgcaatgtgatgggaggaacatagcaatatctgctccttttcgagttgtttgagaaatgtaggctattttttcagtgtatatccactcagattttgtgtatttttgatgtacactgttctctaaattctgaatctttgggaaaaaatgtaaagcatttatgatctcagaggttaacttatttaagggggatgtacatatattctctgaaactaggatgcatgcaattgtgttggaagtgtccttggtgccttgtgtgatgtagacaatgttacaaggtctgcatgtaaatgggttgccttattatggagaaaaaaaatcactccctgagtttagtatggctgtatatttctgcctattaatatttggaattttttttagaaagtatatttttgtatgctttgttttgtgacttaaaagtgttacctttgtagtcaaatttcagataagaatgtacataatgttaccggagctgatttgtttggtcattagctcttaatagttgtgaaaaaataaatctattctaacgcaaaaccactaactgaagttcagataatggatggtttgtgactatagtgtaaataaatacttttcaacaata
SEQ ID NO. 11: 강글리오시드 유도된 분화 관련 단백질 1(GDAP1): NCBI 참조 서열: NM_018972.3
atggctgagaggcaggaagagcagagagggagcccgcccttgagggcggaaggcaaggccgacgcggaggttaagctcattctgtaccattggacgcattccttcagctctcaaaaggtgcgcttggtaattgctgaaaaggcattgaagtgcgaggaacatgatgtaagtctgcccttgagtgagcacaatgagccttggtttatgcgtttgaactcaactggagaagtgcctgtccttatccacggggaaaacataatttgtgaggccactcagatcattgattatcttgaacagactttcctggatgaaagaacacccaggttaatgcctgataaagaaagcatgtattacccacgggtacaacattaccgagagctgcttgactccttgccaatggatgcctatacacatggctgcattttacatcctgagttaactgtggactccatgatcccggcttatgcaactacaaggattcgtagccaaattggaaacacagagtctgagctgaagaaacttgctgaagaaaacccagatttacaagaagcatacattgcaaaacagaaacgacttaaatcaaagctgcttgatcatgacaatgtcaagtatttgaagaaaattcttgatgagttggagaaagtcttggatcaggttgaaactgaattgcaaagaagaaatgaagaaaccccagaagagggccagcaaccttggctctgcggtgaatccttcaccctggcagacgtctcactcgctgtcacattgcatcgactgaagttcctggggtttgcaaggagaaactggggaaacggaaagcgaccaaacttggaaacctattacgagcgtgtcttgaagagaaaaacatttaacaaggttttaggacatgtcaacaatatattaatctctgcagtgctgccaacagcattccgggtggccaagaaaagggccccaaaagttcttggcacgacccttgtggttggtttgcttgcaggagtgggatattttgcttttatgcttttcagaaagaggcttggcagcatgatattagcatttagacccagaccaaattatttctag
SEQ ID NO. 12: N-Myc 다운스트림 조절된 1(NDRG1): NCBI 참조 서열: NM_001135242.1
atgtctcgggagatgcaggatgtagacctcgctgaggtgaagcctttggtggagaaaggggagaccatcaccggcctcctgcaagagtttgatgtccaggagcaggacatcgagactttacatggctctgttcacgtcacgctgtgtgggactcccaagggaaaccggcctgtcatcctcacctaccatgacatcggcatgaaccacaaaacctgctacaaccccctcttcaactacgaggacatgcaggagatcacccagcactttgccgtctgccacgtggacgcccctggccagcaggacggcgcagcctccttccccgcagggtacatgtacccctccatggatcagctggctgaaatgcttcctggagtccttcaacagtttgggctgaaaagcattattggcatgggaacaggagcaggcgcctacatcctaactcgatttgctctaaacaaccctgagatggtggagggccttgtccttatcaacgtgaacccttgtgcggaaggctggatggactgggccgcctccaagatctcaggatggacccaagctctgccggacatggtggtgtcccacctttttgggaaggaagaaatgcagagtaacgtggaagtggtccacacctaccgccagcacattgtgaatgacatgaaccccggcaacctgcacctgttcatcaatgcctacaacagccggcgcgacctggagattgagcgaccaatgccgggaacccacacagtcaccctgcagtgccctgctctgttggtggttggggacagctcgcctgcagtggatgccgtggtggagtgcaactcaaaattggacccaacaaagaccactctcctcaagatggcggactgtggcggcctcccgcagatctcccagccggccaagctcgctgaggccttcaagtacttcgtgcagggcatgggatacatgccctcggctagcatgacccgcctgatgcggtcccgcacagcctctggttccagcgtcacttctctggatggcacccgcagccgctcccacaccagcgagggcacccgaagccgctcccacaccagcgagggcacccgcagccgctcgcacaccagcgagggggcccacctggacatcacccccaactcgggtgctgctgggaacagcgccgggcccaagtccatggaggtctcctgctag
SEQ ID NO. 17: AAV-인간-Mpz-GJB1 작제물
tagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttccttgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacgtagccatgctctaggtaccgcctggcataaacttcatttattaaagtttattttgtctttaatctctcatataacttagtcttcctgatattgcagctgtgtgtgcccctcttttgtactcccagcattttgttcattactaaaggaagtgtcatggcttattatacttgattgttgatgggtttgtcctctgatcttcccatctccacctccccaaaccaaattttcaactccttgctggaaggacttaatttttattcctctctctattacctgcattctcatactttacatattgctggcacttaatacaattttgtagccttgaaataaattgaaatggacttaaacagcagcatgaagcactgaaggacttcttgacaaacggaaaggtcaggggcttcttgcctggaaatagtccagtggagaaaaacttctgtctgggaagaatcgcacaggatgaagggaggtgcggggaaaaaaactcccataggacttggtcatctcaagaagtctgtaatgcagcccacattagaggagataacaggggatatcctattttcagagttctctgggggaaacctccctctagttcctagggctgtgaggcagcctctctcaggcaaggaggctgaggagaaatccctttttatggcctttaaattgaggttccatatctatccctcagagaagtgtgtctgtgtccctgtttttgtccctctccctcaccaccccccacaacattccagcctggggcagggggaggccagtggacacaaagccctctgtgtatggggtggtatgtgtccccccacccctccacccagactatacaatgccccttctgctccctgcactctgcccccctccccaccacctctcaactgcacatgccaggctgcaattggttactggctgaggacagccccctcatgctggggccctaggggattttaagcaggttccaggaaccccccgttcagttcctggtcccccactttctcaaccccacagatgctccgggcccctgcccctgccccagcaccggtcgcggatcctgaggcaggatgaactggacaggtttgtacaccttgctcagtggcgtgaaccggcattctactgccattggccgagtatggctctcggtcatcttcatcttcagaatcatggtgctggtggtggctgcagagagtgtgtggggtgatgagaaatcttccttcatctgcaacacactccagcctggctgcaacagcgtttgctatgaccaattcttccccatctcccatgtgcggctgtggtccctgcagctcatcctagtttccaccccagctctcctcgtggccatgcacgtggctcaccagcaacacatagagaagaaaatgctacggcttgagggccatggggaccccctacacctggaggaggtgaagaggcacaaggtccacatctcagggacactgtggtggacctatgtcatcagcgtggtgttccggctgttgtttgaggccgtcttcatgtatgtcttttatctgctctaccctggctatgccatggtgcggctggtcaagtgcgacgtctacccctgccccaacacagtggactgcttcgtgtcccgccccaccgagaaaaccgtcttcaccgtcttcatgctagctgcctctggcatctgcatcatcctcaatgtggccgaggtggtgtacctcatcatccgggcctgtgcccgccgagcccagcgccgctccaatccaccttcccgcaagggctcgggcttcggccaccgcctctcacctgaatacaagcagaatgagatcaacaagctgctgagtgagcaggatggctccctgaaagacatactgcgccgcagccctggcaccggggctgggctggctgaaaagagcgaccgctgctcggcctgctgactcgagatcgatatccatcacactggcggccgcaagctt 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볼드체 = ITR 서열
이탤릭체 = 인간 Mpz 프로모터
밑줄 = Cx32
이탤릭체 밑줄 = WPRE 서열
SEQ ID NO. 18: 인간 hP0 프로모터
gcctggcataaacttcatttattaaagtttattttgtctttaatctctcatataacttagtcttcctgatattgcagctgtgtgtgcccctcttttgtactcccagcattttgttcattactaaaggaagtgtcatggcttattatacttgattgttgatgggtttgtcctctgatcttcccatctccacctccccaaaccaaattttcaactccttgctggaaggacttaatttttattcctctctctattacctgcattctcatactttacatattgctggcacttaatacaattttgtagccttgaaataaattgaaatggacttaaacagcagcatgaagcactgaaggacttcttgacaaacggaaaggtcaggggcttcttgcctggaaatagtccagtggagaaaaacttctgtctgggaagaatcgcacaggatgaagggaggtgcggggaaaaaaactcccataggacttggtcatctcaagaagtctgtaatgcagcccacattagaggagataacaggggatatcctattttcagagttctctgggggaaacctccctctagttcctagggctgtgaggcagcctctctcaggcaaggaggctgaggagaaatccctttttatggcctttaaattgaggttccatatctatccctcagagaagtgtgtctgtgtccctgtttttgtccctctccctcaccaccccccacaacattccagcctggggcagggggaggccagtggacacaaagccctctgtgtatggggtggtatgtgtccccccacccctccacccagactatacaatgccccttctgctccctgcactctgcccccctccccaccacctctcaactgcacatgccaggctgcaattggttactggctgaggacagccccctcatgctggggccctaggggattttaagcaggttccaggaaccccccgttcagttcctggtcccccactttctcaaccccacagatgctccgggcccctgcccctgccccagc
SEQ ID NO. 19: AAV-인간-Mpz-Egfp mock 작제물
tagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttccttgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacgtagccatgctctaggtaccgcctggcataaacttcatttattaaagtttattttgtctttaatctctcatataacttagtcttcctgatattgcagctgtgtgtgcccctcttttgtactcccagcattttgttcattactaaaggaagtgtcatggcttattatacttgattgttgatgggtttgtcctctgatcttcccatctccacctccccaaaccaaattttcaactccttgctggaaggacttaatttttattcctctctctattacctgcattctcatactttacatattgctggcacttaatacaattttgtagccttgaaataaattgaaatggacttaaacagcagcatgaagcactgaaggacttcttgacaaacggaaaggtcaggggcttcttgcctggaaatagtccagtggagaaaaacttctgtctgggaagaatcgcacaggatgaagggaggtgcggggaaaaaaactcccataggacttggtcatctcaagaagtctgtaatgcagcccacattagaggagataacaggggatatcctattttcagagttctctgggggaaacctccctctagttcctagggctgtgaggcagcctctctcaggcaaggaggctgaggagaaatccctttttatggcctttaaattgaggttccatatctatccctcagagaagtgtgtctgtgtccctgtttttgtccctctccctcaccaccccccacaacattccagcctggggcagggggaggccagtggacacaaagccctctgtgtatggggtggtatgtgtccccccacccctccacccagactatacaatgccccttctgctccctgcactctgcccccctccccaccacctctcaactgcacatgccaggctgcaattggttactggctgaggacagccccctcatgctggggccctaggggattttaagcaggttccaggaaccccccgttcagttcctggtcccccactttctcaaccccacagatgctccgggcccctgcccctgccccagcaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaaagcggccctagatcaagctt 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볼드체 = ITR 서열
이탤릭체 = 인간 Mpz 프로모터
밑줄 = EGFP
이탤릭체 밑줄 = WPRE 서열
SEQ ID NO. 20: 치료적 SH3TC2 유전자 대체를 위한 AAV-minMpz-SH3TC2.myc.ITR
tagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttccttgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacgtagccatgctctaggtaccgctctcaggcaaggaggctaagaaggaatcctttgctgtagccttttggatttaggtttctcagcttatctatccctcagagaagtgtgtctatgtcccttttctgtccctctgcctcaccccaccccaacattccaacctagggtagggggaggtcagtatacacaaagccctctgtgtaaggggtggtatgtgtccccccacccccctacccagagtatacaatgccccttctgctccatgcccctgccacccctcccaccacctctcaattgcacatgccaggctgcaattggtcactggctcaggacagccccctcatgctggggatccaggggattttaagcaggttccagaaaacaccactcagttccttgtcccccgctctctccaccccacagacgctctgccaaccggtaccatgggtggctgcttctgcatccccagggagcggagtctgacccggggcccaggtaaagaaactccttccaaggatccaactgtatcgagtgagtgtatagcctcatctgaatacaaggaaaaatgttttctgccacagaacattaatccagacctgacactctccttctgtgtaaagagccgctccaggaggtgtgtaaatggacccctacaggaagctgctcggaggcggctctgggcactggagaatgaggaccaggaggtgcgcatgctgtttaaggacctctcagcaaggttggtcagtatccagtctcagagggcccagtttctcatcaccttcaagaccatggaggaaatctggaagttctccacctaccttaatttaggctacgtatccatgtgtctagaacatctcctctttgaccacaagtactggctcaactgcatattggtggaggatacagagatccaagtgtctgtagatgataaacacctggaaacaatatacctgggactcctgatacaggaaggccacttcttctgcagagccctgtgctccgtgactccaccagccgagaaggaaggggaatgcttgacactttgcaagaatgagttaatctcagtgaagatggcagaagctggctccgagttggaaggcgtgtctttggtgacaggtcagcggggcctggtactggtgtcagccttggagcctctgcctctccctttccaccagtggttcctaaagaattatccaggaagctgtggcctttccaggaagagggattggacaggctcctatcagattggcagaggacgctgtaaggccttgacgggttatgagccaggagaaaaggatgaactgaatttctaccagggagaaagcattgagatcatcggctttgtcatacctgggcttcagtggttcattggaaagtcgacaagttcaggacaagtgggctttgtccccaccaggaacatagatcctgattcttattccccaatgagcaggaactctgcctttctcagtgatgaggagagatgctccctgttggccctgggaagtgataagcagactgagtgttccagcttcctccacactcttgctcgcactgacatcacatctgtctaccggctcagtgggtttgaatccatccagaatcctccaaatgatctgagtgcatcccagcctgaaggtttcaaggaggtcaggcctggcagagcctgggaggagcatcaggccgtggggtccagacagtccagcagctctgaggactccagcctggaggaggagctcctctcggccacctcagacagctatcgcctgccggagcctgatgaccttgatgacccggaactgctcatggacctaagcactggtcaggaggaggaggctgagaacttcgcccccatattggcttttctggatcatgagggttatgctgaccactttaagagtctctatgacttctccttctctttcctcacttcttccttttatagcttctctgaggaggatgagtttgtggcctacctggaggcatcaagaaagtgggccaagaagagccacatgacctgggcccatgcccggctctgcttcctcctgggccggctgagcatcaggaaggtcaaactctctcaggccagggtgtacttcgaggaggccatccacattctcaatggagcatttgaggacctatccttggtggccactctgtacatcaatttggctgccatctacctgaaacagaggctgagacataaaggctccgccctgttggaaaaggcaggtgccctgctggcctgcctgcctgaccgtgagtctagtgccaagcatgaactcgacgtggtggcctacgtgctgcgccaggggattgtggtgggcagcagcccgctggaggccagggcctgctttctggccatccgcttgctcctgagcctaggccggcacgaggaggtcctgccctttgccgagcgcctgcagctcctctctggacaccctcctgcctctgaggctgtggccagtgttttgagttttctgtatgacaagaaatatcttccacaccttgcagtggcctctgtccagcaacatggtatccagagtgcccaagggatgtctcttcctatttggcaggtccaccttgtcctccagaacacaaccaagctccttggctttccttccccaggctggggtgaagtttctgccttggcctgcccaatgctcagacaggccctggctgcctgtgaggaactagcagaccggagcacccagagggccctgtgtctcatcctttccaaagtgtacctcgagcacaggtctcctgacggtgccatccactacctgagccaggccttggtgctagggcagctgctgggtgagcaggaatcctttgagtcttctctctgcctggcatgggcctatctcttagccagccaggccaagaaggctttggatgtgcttgagccactgctatgctccctgaaggagacagagagtctcactcaaaggggagtcatctataacctcctgggacttgcactccaaggtgaaggccgggtgaacagggcagccaagagctatcttcgggccttgaacagagcccaggaggtgggagatgtgcataaccaggcagtggctatggccaatcttggccacctgagccttaagtcctgggctcagcatccagccagaaactatctcctgcaggctgtacgactctattgtgaacttcaggccagtaaggagacagacatggaattagtacaggtgtttctctggttggcccaagttctggtgtctggacaccagctgacccatggccttctttgttatgaaatggcattgctgtttggcttaaggcatcgacatctaaagagtcagcttcaggccaccaaatccctctgccatttctacagctctgtgtccccaaaccctgaggcatgcatcacctaccatgagcactggctggccctggctcagcaactcagggaccgggagatggaagggaggctgctggagtccctggggcagctttatcggaacctaaataccgccaggtccctcaggaggtcactcacatgcatcaaggagagcctgcgtatcttcattgacctgggggagacagacaaggctgctgaggcctggcttggggcggggcgactccactacctcatgcaggaagacgagctggtggagctgtgcctgcaggcagccatccagacagccctgaagtcagaggagcctttgctggctctcaaactttatgaagaagcaggtgatgtgttcttcaatgggacccgccacaggcatcatgcagtggagtactaccgagctggagctgttcctttagcaaggaggttgaaggcggtgagaactgagctccggattttcaataagctgacagagctgcagattagcctcgaaggctatgagaaggctttggaatttgccaccctggccgccaggctcagcacagtcacaggagatcagaggcaagagctggtggcctttcaccgcctggctacagtgtactactccctgcacatgtatgagatggctgaggactgctacctgaagaccctgtccctctgtccaccatggctgcagagtcccaaggaggccctgtactatgccaaggtgtattatcgcctgggcagactcaccttctgccagctgaaggatgcccatgatgccactgagtacttccttctggccctggcagcagcggtcctgctgggtgatgaggagcttcaggacaccattaggagcaggctggacaacatctgccagagccccctgtggcacagcaggccctccgggtgctcctcagagagggcgcggtggctgagtggtggtggcctggccctcgagcagaagctgatcagcgaggaggacctgtaagatatccatcacactggcggccgc ggagctctcgagaggcctaataaagagctcagatgcatcgatcagagtgtgttggttttttgtgtgagatct 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볼드체 = ITR 서열
이탤릭체 = mini Mpz 프로모터
밑줄 = SH3TC2
이탤릭체 밑줄 = 합성 최소 polyA
SEQ ID NO. 21: AAV-인간-miniMpz-SH3TC2
tagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttccttgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacgtagccatgctctaggtacctctctcaggcaaggaggctgaggagaaatccctttttatggcctttaaattgaggttccatatctatccctcagagaagtgtgtctgtgtccctgtttttgtccctctccctcaccaccccccacaacattccagcctggggcagggggaggccagtggacacaaagccctctgtgtatggggtggtatgtgtccccccacccctccacccagactatacaatgccccttctgctccctgcactctgcccccctccccaccacctctcaactgcacatgccaggctgcaattggttactggctgaggacagccccctcatgctggggccctaggggattttaagcaggttccaggaaccccccgttcagttcctggtcccccactttctcaaccccacagatgctccgggcccctgcccctgccccagcggtaccatgggtggctgcttctgcatccccagggagcggagtctgacccggggcccaggtaaagaaactccttccaaggatccaactgtatcgagtgagtgtatagcctcatctgaatacaaggaaaaatgttttctgccacagaacattaatccagacctgacactctccttctgtgtaaagagccgctccaggaggtgtgtaaatggacccctacaggaagctgctcggaggcggctctgggcactggagaatgaggaccaggaggtgcgcatgctgtttaaggacctctcagcaaggttggtcagtatccagtctcagagggcccagtttctcatcaccttcaagaccatggaggaaatctggaagttctccacctaccttaatttaggctacgtatccatgtgtctagaacatctcctctttgaccacaagtactggctcaactgcatattggtggaggatacagagatccaagtgtctgtagatgataaacacctggaaacaatatacctgggactcctgatacaggaaggccacttcttctgcagagccctgtgctccgtgactccaccagccgagaaggaaggggaatgcttgacactttgcaagaatgagttaatctcagtgaagatggcagaagctggctccgagttggaaggcgtgtctttggtgacaggtcagcggggcctggtactggtgtcagccttggagcctctgcctctccctttccaccagtggttcctaaagaattatccaggaagctgtggcctttccaggaagagggattggacaggctcctatcagattggcagaggacgctgtaaggccttgacgggttatgagccaggagaaaaggatgaactgaatttctaccagggagaaagcattgagatcatcggctttgtcatacctgggcttcagtggttcattggaaagtcgacaagttcaggacaagtgggctttgtccccaccaggaacatagatcctgattcttattccccaatgagcaggaactctgcctttctcagtgatgaggagagatgctccctgttggccctgggaagtgataagcagactgagtgttccagcttcctccacactcttgctcgcactgacatcacatctgtctaccggctcagtgggtttgaatccatccagaatcctccaaatgatctgagtgcatcccagcctgaaggtttcaaggaggtcaggcctggcagagcctgggaggagcatcaggccgtggggtccagacagtccagcagctctgaggactccagcctggaggaggagctcctctcggccacctcagacagctatcgcctgccggagcctgatgaccttgatgacccggaactgctcatggacctaagcactggtcaggaggaggaggctgagaacttcgcccccatattggcttttctggatcatgagggttatgctgaccactttaagagtctctatgacttctccttctctttcctcacttcttccttttatagcttctctgaggaggatgagtttgtggcctacctggaggcatcaagaaagtgggccaagaagagccacatgacctgggcccatgcccggctctgcttcctcctgggccggctgagcatcaggaaggtcaaactctctcaggccagggtgtacttcgaggaggccatccacattctcaatggagcatttgaggacctatccttggtggccactctgtacatcaatttggctgccatctacctgaaacagaggctgagacataaaggctccgccctgttggaaaaggcaggtgccctgctggcctgcctgcctgaccgtgagtctagtgccaagcatgaactcgacgtggtggcctacgtgctgcgccaggggattgtggtgggcagcagcccgctggaggccagggcctgctttctggccatccgcttgctcctgagcctaggccggcacgaggaggtcctgccctttgccgagcgcctgcagctcctctctggacaccctcctgcctctgaggctgtggccagtgttttgagttttctgtatgacaagaaatatcttccacaccttgcagtggcctctgtccagcaacatggtatccagagtgcccaagggatgtctcttcctatttggcaggtccaccttgtcctccagaacacaaccaagctccttggctttccttccccaggctggggtgaagtttctgccttggcctgcccaatgctcagacaggccctggctgcctgtgaggaactagcagaccggagcacccagagggccctgtgtctcatcctttccaaagtgtacctcgagcacaggtctcctgacggtgccatccactacctgagccaggccttggtgctagggcagctgctgggtgagcaggaatcctttgagtcttctctctgcctggcatgggcctatctcttagccagccaggccaagaaggctttggatgtgcttgagccactgctatgctccctgaaggagacagagagtctcactcaaaggggagtcatctataacctcctgggacttgcactccaaggtgaaggccgggtgaacagggcagccaagagctatcttcgggccttgaacagagcccaggaggtgggagatgtgcataaccaggcagtggctatggccaatcttggccacctgagccttaagtcctgggctcagcatccagccagaaactatctcctgcaggctgtacgactctattgtgaacttcaggccagtaaggagacagacatggaattagtacaggtgtttctctggttggcccaagttctggtgtctggacaccagctgacccatggccttctttgttatgaaatggcattgctgtttggcttaaggcatcgacatctaaagagtcagcttcaggccaccaaatccctctgccatttctacagctctgtgtccccaaaccctgaggcatgcatcacctaccatgagcactggctggccctggctcagcaactcagggaccgggagatggaagggaggctgctggagtccctggggcagctttatcggaacctaaataccgccaggtccctcaggaggtcactcacatgcatcaaggagagcctgcgtatcttcattgacctgggggagacagacaaggctgctgaggcctggcttggggcggggcgactccactacctcatgcaggaagacgagctggtggagctgtgcctgcaggcagccatccagacagccctgaagtcagaggagcctttgctggctctcaaactttatgaagaagcaggtgatgtgttcttcaatgggacccgccacaggcatcatgcagtggagtactaccgagctggagctgttcctttagcaaggaggttgaaggcggtgagaactgagctccggattttcaataagctgacagagctgcagattagcctcgaaggctatgagaaggctttggaatttgccaccctggccgccaggctcagcacagtcacaggagatcagaggcaagagctggtggcctttcaccgcctggctacagtgtactactccctgcacatgtatgagatggctgaggactgctacctgaagaccctgtccctctgtccaccatggctgcagagtcccaaggaggccctgtactatgccaaggtgtattatcgcctgggcagactcaccttctgccagctgaaggatgcccatgatgccactgagtacttccttctggccctggcagcagcggtcctgctgggtgatgaggagcttcaggacaccattaggagcaggctggacaacatctgccagagccccctgtggcacagcaggccctccgggtgctcctcagagagggcgcggtggctgagtggtggtggcctggccctctgagcggccgc ggagctctcgagaggcctaataaagagctcagatgcatcgatcagagtgtgttggttttttgtgtgagatct aagcttagcatggctacgtagataagtagcatggcgggttaatcattaactacaaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagctttttgcaaaagcctaggcctccaaaaaagcctcctcactacttctggaatagctcagaggccgaggcggcctcggcctctgcataaataaaaaaaattagtcagccatggggcggagaatgggcggaactgggcggagttaggggcgggatgggcggagttaggggcgggactatggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacacctggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacaccctaactgacacacattccacagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccattcgacgctctcccttatgcgactcctgcattaggaagcagcccagtagtaggttgaggccgttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaaggagatggcgcccaacagtcccccggccacggggcctgccaccatacccacgccgaaacaagcgctcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttccccatcggtgatgtcggcgatataggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccggccacgatgcgtccggcgtagaggatctggctagcgatgaccctgctgattggttcgctgaccatttccgggtgcgggacggcgttaccagaaactcagaaggttcgtccaaccaaaccgactctgacggcagtttacgagagagatgatagggtctgcttcagtaagccagatgctacacaattaggcttgtacatattgtcgttagaacgcggctacaattaatacataaccttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaatacacggaattaattc
볼드체 = ITR 서열
이탤릭체 = mini-인간 hP0 프로모터
밑줄 = SH3TC2
이탤릭체 밑줄 = 합성 최소 polyA
SEQ ID NO. 22: Mini-인간 hP0 프로모터
tctctcaggcaaggaggctgaggagaaatccctttttatggcctttaaattgaggttccatatctatccctcagagaagtgtgtctgtgtccctgtttttgtccctctccctcaccaccccccacaacattccagcctggggcagggggaggccagtggacacaaagccctctgtgtatggggtggtatgtgtccccccacccctccacccagactatacaatgccccttctgctccctgcactctgcccccctccccaccacctctcaactgcacatgccaggctgcaattggttactggctgaggacagccccctcatgctggggccctaggggattttaagcaggttccaggaaccccccgttcagttcctggtcccccactttctcaaccccacagatgctccgggcccctgcccctgccccagc
SEQ ID NO. 23: AAV-인간-miniMpz-Egfp
tagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttccttgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacgtagccatgctctaggtacctctctcaggcaaggaggctgaggagaaatccctttttatggcctttaaattgaggttccatatctatccctcagagaagtgtgtctgtgtccctgtttttgtccctctccctcaccaccccccacaacattccagcctggggcagggggaggccagtggacacaaagccctctgtgtatggggtggtatgtgtccccccacccctccacccagactatacaatgccccttctgctccctgcactctgcccccctccccaccacctctcaactgcacatgccaggctgcaattggttactggctgaggacagccccctcatgctggggccctaggggattttaagcaggttccaggaaccccccgttcagttcctggtcccccactttctcaaccccacagatgctccgggcccctgcccctgccccagcaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaaagcggccctagatcaagctt 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볼드체 = ITR 서열
이탤릭체 = mini-인간 hP0 프로모터
밑줄 = EGFP
이탤릭체 밑줄 = WPRE 서열
SEQ ID NO. 24: 최소 합성 poly A 서열
ggagctctcgagaggcctaataaagagctcagatgcatcgatcagagtgtgttggttttttgtgtgagatct
실시예
본 발명은 이제 하기 비제한적 실시예를 참조로 기재될 것이다.
실시예 1: AAV 트랜스퍼 플라스미드 클로닝
AAV 벡터는, 모두 슈반 세포에서 특이적으로 발현을 유도하는 것으로 나타난 1.127 kB Mpz 프로모터 하에, Cx32(pAAV-Mpz.GJB1, full 벡터) 또는 리포터 유전자 EGFP(pAAV-Mpz.Egfp, mock 벡터)의 슈반 세포-특이적 발현을 제공하도록 디자인하였다(26, 32). 이러한 벡터를, AAV2 역 말단 반복체에 의해 플랭킹된 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(bGHpA) 및 우드척(woodchuck) 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE)를 함유하는 AAV 작제물 pAM/Mbp-EGFP-WPRE-bGH(57)을 출발 플라스미드로서 사용하여 클로닝하였다(도 1 및 도 9).
어떻게 3가지 작제물 AAV-Mpz.Egfp, AAV-Mpz.GJB1 및 AAV-miniMpz.Egfp를 클로닝하는지의 구체적 세부사항은 하기와 같다:
264-P0-EGFP-WPRE(=AAV- Mpz.Egfp - SEQ ID NO. 1)
XhoI 및 EcoRV 제한 효소를 사용하여 프로모터 서열을 절단(digest)하기 위해, Mpz 프로모터 서열을 함유하는 pBluescript SK+ 플라스미드를 사용하였다. AAV 벡터를 또한 동일한 효소를 사용하여 절단하였다. 연결(ligation) 및 형질전환 이후, 전체 코딩 서열을 커버하는 프라이머를 사용하여 제한 절단 맵핑 및 직접적 시퀀싱에 의해 발현 카세트의 정확한 어셈블리를 확인하였다.
264-Mpz(P0)-Cx32-WPRE(=AAV- Mpz.GJB1 - SEQ ID NO. 2)
이전에 만든 렌티바이러스 작제물로부터 Mpz/Cx32 ORF를 PCR 증폭시켰다. 증폭에 사용된 프라이머는 P0-Cx32-F 5'- AGGGGTACCCTTCCTGTTCAGACT-3'(SEQ ID NO. 13) 및 P0-Cx32- R 5'-CCGCTCGAGGGATCCTC AGCAG-3'(SEQ ID NO. 14)이었다. PCR 생성물(2030bp)을 Qiagen 겔 추출 키트를 사용하여 겔 정제하고, KpnI 및 XhoI로 절단하였다. AAV 벡터를 또한 동일한 제한 효소를 사용하여 절단하였다. 전체 발현 카세트는 ORF의 직접적 시퀀싱에 의해 확인하였다.
264-Mpz(P0) min-EGFP-WPRE(=AAV-mini Mpz.Egfp - SEQ ID NO. 3)
AAV 벡터 264는 HindIII로 절단하고, 자가-연결하였다. 이후 링커를 벡터에 삽입하였다. Mpzmin을 하기 프라이머: KpnI-P0-F: 5'-GGGGTACCGCTCTCAGGCAAG-3'(SEQ ID NO. 15) 및 AgeI-P0- R: 5'-AAACCGGTTGGCAGAGCGTCTGT-3'(SEQ ID NO. 16)을 사용하여 랫트 Mpz 프로모터 서열로부터 PCR 증폭하였다. 삽입물(420bp)을 이후 본 발명자들의 AAV 벡터 264에 방향성있게 클로닝(directionally clone)하였다. EGFP를 AgeI 및 HindIII을 사용하여 또다른 작제물로부터 절단하고, 직접 연결하였다.
실시예 2: AAV 벡터 생성, 정제 및 적정
AAV9 벡터의 생성을 공개된 프로토콜에 따라 수행하였다(58). pAAV-Mpz.Egfp 및 pAAV-Mpz.GJB1 플라스미드를 AAV9 캡시드(capsid)(스페인 소재의 University of Barcelona의 Dr. A. Bosch에 의해 제공된 캡시드 플라스미드, 및 미국 펜실베니아 소재의 University of Pennsylvania Vector Core의 Dr. James Wilson에 의해 독창적으로 개발된 캡시드)에 교차-패키징하였다.
유사형 9를 위한 AAV 바이러스 스톡을 이전에 기재된 바와 같이 생성하였다(59). 재조합 AAV(rAAV) 벡터를, 폴리에틸렌이민(PEI; 분지형, MW 25,000; Sigma)과 혼합된 250-μg의 pAAV, 250-μg의 pRepCap, 및 500-μg의 pXX6 플라스미드로 2×108 HEK293 세포의 삼중 형질감염에 의해 생성하였다. 간략하게, 형질감염 48시간 이후, 세포를 원심분리(200 g, 10-분)에 의해 수확하고; 30 ml의 20 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 및 50- mM Tris-HCl(pH 8.5)에 재현탁시키고, 3회 동결-해동 주기로 용해시켰다. 세포 용해물을 원심분리(2000 g, 10분)에 의해 정화하고, rAAV 입자를 하기와 같은 요오딕산올(iodixanol) 구배에 의해 상청액으로부터 정제하였다: 정화된 용해물을 50-U/ml의 벤조나아제(Novagen; 1시간, 37℃)로 처리하고, 원심분리(3000 g, 20분)하였다. 벡터-함유 상청액을 수집하고, 5 M 스톡 용액을 사용하여 200 mM NaCl로 조정하였다. 정화된 세포 용해물로부터 바이러스를 침전시키기 위해, 폴리에틸렌 글리콜(PEG 8000; Sigma)을 8%의 최종 농도로 첨가하고, 혼합물을 인큐베이션(3시간, 4℃)하고, 원심분리(8000 g, 15분)하였다. rAAV-함유 펠릿을 20 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 및 50 mM Tris-HCl(pH 8.5)에 재현탁시키고, 48시간 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. rAAV 입자는 기재된 바와 같은 요오딕산올 방법을 사용하여 정제될 것이다(59). 필요에 따라, rAAV를 농축시키고, Amicon Ultra-15 원심분리 여과 장치(Millipore)를 사용하여 PBSMK에서 탈염시켰다. 적정은 피코그린 정량화(picogreen quantification)(60)에 의해 평가하였고, 밀리리터 당 바이러스 게놈(vg/ml)으로서 계산하였다.
실시예 3: 척수강내 벡터 전달
척추를 시각화하기 위해 하부 요추 레벨을 따라 작은 피부 절개를 한 후, 5 μl/분의 느린 속도로 마취된 마우스의 L5-L6 추간 공간에 AAV 벡터를 전달하였다. 26-게이지 바늘에 연결된 50-μL 해밀턴(Hamilton) 주사기(루마니아 지아마타 소재의 Hamilton)를 사용하여, AAV 벡터의 0.5x1011 내지 1x1011 벡터 게놈(vg)을 함유하는 총 부피 20 μL를 주사하였다. 꼬리치는 것은 성공적인 척수강내 투여를 가리키는 것으로 여겨졌다.
실시예 4: AAV9-매개된 슈반-세포 표적 유전자 발현
2개월령 야생형 마우스를 상기 실시예 1 및 실시예 3에 기재된 AAV9-Mpz-Egfp 벡터를 사용하여 치료하였다. 샘플은 PNS 조직으로부터의 DNA 추출, 및 이전에 기재된 바와 같이 주사 후 4주 및 6주에 벡터 카피 수(VCN)로서 측정된 바이러스 DNA의 존재의 측정(표 1)에 의해 분석하였다(33). 요추근 절편의 면역형광 염색 및 요추근, 대퇴 신경 및 좌골 신경의 면역블롯을 또한 주사 후 4주 및 8주에 이하 기재된 바와 같이 수행하였다(표 2).
면역형광 염색: 면역염색을 위해, 마우스를 제도적으로 승인된 프로토콜에 따라 아베르틴에 의해 마취한 후, 생리식염수 이후 새로운 0.1 M PB 완충액 중 4% 파라포름알데히드에 의해 경심관류하였다. 척추근이 부착된 요추-천추 척수, 뿐만 아니라 양쪽 좌골 및 대퇴 운동 신경을 해부하였다. 모든 조직을 동결절편을 위해 동결시킨 한편, 좌골 및 대퇴 신경을 분리하고, 입체경 아래에서 섬유로 갈랐다. 갈래 섬유 또는 절편을 차가운 아세톤에서 투과시키고, 1시간 동안 0.5% Triton-X(독일 뮌헨 소재의 Sigma-Aldrich)를 함유하는 5% BSA(독일 뮌헨 소재의 Sigma-Aldrich)의 블로킹 용액으로 RT에서 인큐베이션하였다. 사용된 1차 항체는 하기와 같았다: 콘택틴-관련 단백질에 대한 마우스 단클론성 항체(Caspr, 1:50; Weizmann Institute of Science의 Dr Elior Peles의 기증), EGFP에 대한 토끼 항혈청(1:1,000; 미국 소재의 Invitrogen), Capr2(1:200, 이스라엘 소재의 Alomone Labs) 및 Cx32(1:50; 독일 뮌헨 소재의 Sigma), 모두 블로킹 용액 중에 희석되고 4℃에서 밤새 인큐베이션됨. 슬라이드를 이후 PBS 중에 세척하고, 플루오르세인- 및 로다민-접합된 마우스 및 토끼 교차-친화성 정제된 2차 항체(1:500; 미국 소재의 Jackson ImmunoResearch)와 함께 1시간 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 세포 핵을 DAPI(1 μg/ml; 독일 뮌헨 소재의 Sigma)로 시각화하였다. 슬라이드를 형광 봉입제(fluorescent mounting medium)로 마운팅하고, 이미지를 Axiovision 소프트웨어(Carl Zeiss MicroImaging; 독일 오버코헨 소재)를 사용한 디지털 카메라를 사용하여 형광 현미경 하에 촬영하였다.
Egfp 리포터 유전자에 대한 발현율을, 요추근 및 좌골 신경에서의 전체 슈반 세포의 백분율로서 EGFP-포지티브 슈반 세포의 수를 계수함으로써 정량화하였다. Cx32를 사용한 이중 염색에서 파라노달 곁(juxtaparanodal) Kv1.2 및 파라노달(paranodal) Caspr을 포함한 축삭 도메인 마커로 미엘린화 섬유의 결절 영역을 시각화함으로써 Cx32의 발현을 정량화하였다. Cx32 면역반응에 대해 포지티브인 결절 영역의 수를 요추근 및 좌골 신경에서의 총 결절 영역의 백분율로서 계수하였다.
면역블롯 검정: 근 및 말초 신경 용해물의 면역블롯 검정을 사용하여, 주사된 마우스의 조직에서의 리포터 유전자 Egfp 또는 Cx32의 발현을 검출하였다. 주사 후 4주에 수집된 요추근, 대퇴 및 좌골 신경 용해물의 면역블롯을 토끼 항-Egfp(1:1000; Abcam) 및 항-Cx32(clone 918, 1:3,000) 1차 항체 이후 HRP-접합된 항-토끼 2차 항체(Jackson ImmunoResearch, 희석됨 1:3,000)와 함께 인큐베이션하였다. 결합된 항체를 향상된 화학발광 시스템(GE Healthcare Life Sciences)을 사용하여 시각화하였다.
결과를 도 2 및 아래 표 1 및 표 2에 나타낸다. 요추 척수 신경근 및 원위 좌골 신경을 포함하는, PNS의 미엘린성 세포인 슈반 세포에서 특이적으로 리포터 유전자 EGFP의 높은 발현 수준(향상된 녹색 형광 단백질)을 검출할 수 있었고, 이는 요추근 및 좌골 신경 샘플에서 EGFP 리포터 유전자의 특이적 발현을 나타내어, 슈반 세포에서 조직 특이적 발현이 이러한 벡터 전달 시스템을 사용하여 달성되었음을 나타낸다.
Figure pct00001
Figure pct00002
실시예 5: 2개월 Cx32KO 및 R75W KO 마우스에서 척수강내 전달된 AAV9-Mpz.GJB1 벡터의 발현
상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 AAV9-Mpz.GJB1 벡터를 생성하였고(5x1012 vg/ml), 요추 척수강내(i.th.) 주사(20 μl 중 5x1010 vg)에 의해 2개월령 및 6개월령 Cx32 KO 마우스에 전달하였다. 상이한 조직에서의 세포 마다 이전에 기재된 바(33)와 같은 PNS 조직으로부터 추출된 DNA로부터의 VCN의 분석은, 간에서 가장 높은 수준과 함께 척수근 및 좌골 신경을 포함하여, 넓은 생체분포를 나타냈다(55)(도 3의 A). 면역염색 및 면역블롯 분석을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 요추 척수근 및 좌골 신경 섬유에서 미엘린성 슈반 세포 중 60 내지 70% 초과로 파라노달 미엘린 영역에서 Cx32가 발현되었다(도 3의 B 내지 도 3의 D). 높은 수준으로의 AAV9-전달된 Cx32 발현은, 또한 비주사된 Cx32 KO 마우스와 대조적으로 주사된 것으로부터의 PNS 조직 용해물의 웨스턴 블롯에 의해 또한 검출될 수 있다(도 3의 F).
더 높은 발현 수준을 허용하는 AAV9-Mpz.GJB1 바이러스 벡터가 본 발명자의 이전 연구(29, 34)에서의 렌티바이러스 벡터를 사용하여 관찰된 골지-보유 돌연변이체의 간섭 효과를 극복할 수 있는지 여부를 명확하게 하기 위해, 본 발명자들은 또한 2개월령 R75W 녹아웃(R75W KO) 마우스를 주사하였다. 중요하게는, AAV9-전달된 Cx32의 파라노달 국소화는 또한 전형적 핵주위 국소화를 나타내는 간섭 골지-보유 R75W 돌연변이체의 공동-발현에도 불구하고, R75W/KO 조직에서 또한 검출되었다(도 3의 E). 따라서, AAV9는 대표적인 골지-보유 CMT1X 돌연변이체의 간섭 효과를 또한 극복할 수 있는 광범위한, 높은 수준의 그리고 슈반-세포 표적된 유전자 발현을 제공할 잠재성을 나타낸다.
이러한 결과는 도 3 및 아래 표 3 및 표 4에 나타나 있어, 야생형 GJB1 유전자의 카피를 전달하기 위한 벡터의 사용이 Cx32 녹아웃 마우스 및 R75W 녹아웃 마우스 모두에서 Cx32의 성공적인 발현을 야기함을 입증한다. R75W 골지-보유 돌연변이체(도 3의 E)는 또한 핵주위 영역에서 R75W Cx32 돌연변이체 단백질의 존재에도 불구하고 Cx32의 발현을 달성한 반면, 이는 AAV 벡터를 사용하지 않는 이전 작업에서는 불가능했다.
Figure pct00003
Figure pct00004
실시예 6: AAV9-Mpz.Egfp(mock) 치료된 한배새끼에 비하여 AAV9-Mpz.GJB1(full) 주사된 6개월령 Cx32 KO 마우스의 거동 분석
마우스의 치료: 6개월령 Cx32 녹아웃(KO) 마우스의 2개의 군을 사용하여 유전자 요법 시험을 수행하였다. 측정된 각각의 결과에 대해 치료 군 당 최소 8 내지 12마리의 마우스가 유사한 모델을 사용한 이전의 연구를 기준으로 통계적으로 유의한 차이를 평가하는데 적절한 것으로 여겨졌다(32, 33). 동물은 병리 발병 이후(3개월령 이후 시작되는 것으로 공지됨)인, 6개월령에 치료되었다.
한배새끼 마우스를 무작위화하여, AAV9-Mpz.GJB1(full) 치료 또는 AAV9-Mpz.Egfp(mock 치료, 대조군으로서)를 받게 하고, 추가 식별을 위해 코딩 번호를 할당하였다.
거동 시험: 이후 마우스를 치료 전에 이하 제시된 바와 같은 거동 시험에 의해 평가하고, 또다시 8개월령 및 10개월령에 치료 조건에 대해 맹검인 시험자에 의해 평가하였다(도 4 및 표 5).
로타로드 시험: 가속 로타로드 장치(이탈리아 바레세 소재의 Ugo Basile)를 사용하여 이전에 기재된 바와 같이 운동 균형 및 협응을 측정하였다(61). 동물 훈련은 연속하여 3일 동안, 시험 사이에 15분 휴식 기간과 함께 일 마다 3회 시험으로 이루어졌다. 마우스를 막대 위에 놓고, 분 당 4회 회전(rpm)으로부터 40회 회전으로 점차 증가시켰다. 2가지 상이한 속도, 20 rpm 및 32 rpm을 사용하여 제4 일에 시험을 수행하였다. 떨어질 때까지 걸리는 시간(latency to fall)을 각각의 속도에 대해 계산하였다. 시험은 마우스가 막대로부터 떨어지거나 마우스가 600초 동안 막대에서 머무른 후 제거될 때까지 지속되었다. 각각의 마우스를 각각의 사용된 속도에서 3회 로타로드 위에 두고, 3개의 상이한 값을 각각의 속도에 대해 얻었다. 2가지 상이한 속도에서 각각의 마우스에 대해 평균 값을 사용하였다.
그립 강도 시험: 그립 강도를 시험하기 위해, 마우스를 꼬리를 잡고 마우스가 뒷발로 그리드(grid)를 잡을 때까지 장치(이탈리아 바레세 소재의 Ugo Basile) 쪽으로 내렸다. 마우스가 그리드를 놓을 때까지 마우스를 가볍게 뒤로 당겼다. g으로의 힘의 측정값은 장비에 나타나 있다. 각각의 세션은 연속 3회 시험으로 이루어졌고, 측정값을 평균을 냈다. 뒷다리 힘을 AAV9.Mpz-GJB1과 AAV9.Mpz-Egfp 치료된 마우스 사이에서 비교하였다.
AAV9-Mpz.GJB1 full 치료 벡터로 치료된 더 나이가 많은 Cx32 KO 마우스는 AAV9-Mpz.Egfp mock(비치료) 벡터 주사된 한배새끼에 비하여 이러한 시험에서 유의하게 더 양호하게 수행하였다(n=군 당 20마리의 마우스).
결과는 도 4 및 아래 표 5에 나타나 있고, 이는 GJB1 치료된 군에서 운동 성능(로타로드 및 발 그립 시험 모두에 의해 측정됨)이 주사 후 2개월(8개월령)에 개선되었고, 이러한 개선을 10개월령까지 안정하게 유지하였음을 보여준다. mock 치료된 마우스는 운동 성능의 개선을 나타내지 않았다.
Figure pct00005
실시예 7: 좌골 신경 운동 전도 연구
신경장해의 발병 이후, 6개월령에 상기 실시예 6에 기재된 바와 같이 Cx32 KO 마우스를 치료한 후, 10개월령에 아래 기재된 바와 같이 운동 신경 전도 연구를 수행하였다.
운동 신경 전도 속도(MNCV): 0.05 ms의 과최고 방형파 펄스(supramaximal square-wave pulse)(5V)를 갖는 쌍극 전극을 통해 좌골 노치에서 및 발목 원위에서의 마취된 동물의 자극 이후 양측 좌골 신경으로부터 공개된 방법(62)을 사용하여 MNCV를 생체내 측정하였다. 복합 근육 활동 전위(CMAP: compound muscle action potential)의 지연을 뒷발의 2번과 3번 발가락 사이에 삽입된 쌍극 전극에 의해 기록하고, 자극 흔적(stimulus artifact)으로부터 네거티브 M-파 편향의 개시까지 측정하였다. 자극 전극과 기록 전극 사이의 거리를 근위 지연으로부터 원위 지연을 뺀 결과로 나눔으로써 MNCV를 계산하였다.
10개월령에 수행된 MNCV 연구로부터의 결과를 도 5 및 아래 표 6에 나타냈고, 이는 운동 신경 전도 속도가 mock 치료된 대조군(n=10마리의 마우스)에 비하여, GJB1로 치료된 Cx32 KO 마우스에서 10개월에 측정될 때 개선되었고 야생형 수준에 근접함을 나타낸다.
Figure pct00006
실시예 8: mock-치료된 마우스 벡터에 비하여 AAV9-Mpz.GJB1의 척수강내 전달 이후 Cx32 KO 마우스의 전척수근, 좌골 신경 및 대퇴 신경의 형태학적 분석
Cx32 KO 마우스를 6개월령에 상기 실시예 6에 기재된 바와 같이 치료하고, 4개월 이후, 10개월령에 시험하였다.
마우스를 0.1 M PB 완충액 중 2.5% 글루타르알데히드로 경심 관류하였다. 다중 척수근이 부착된 요추 척수, 및 대퇴 및 좌골 신경을 절개하고, 4℃에서 밤새 고정한 후, 오스뮴산처리하고(osmicate), 탈수하고, 아랄다이트 수지에 포매하였다(모두 영국 에섹스 소재의 Agar Scientific로부터 구입). 근을 갖는 요추 척수 및 대퇴 운동 신경과 좌골 신경의 중간 부분의 가로 반초박 절편(1 μm)을 얻고, 알칼리성 톨루이딘 블루(독일 뮌헨 소재의 Sigma-Aldrich)로 염색하였다. 절편을 10×, 20×, 및 40× 대물 렌즈로 시각화하고, Nikon DS-L3 카메라(Nikon Eclipse-Ni; 일본 도쿄 소재)로 캡처하였다. 전체 근 또는 가로 신경 절편의 이미지를 100× 내지 200× 최종 배율로 얻고, 근 또는 신경의 단면적을 커버하는 일련의 부분적 중첩 필드를 400× 최종 배율로 캡처하였다. 이러한 이미지를 상기 기재된 바와 같은 군 모두에서 비정상적 미엘린화의 정도를 시험하는데 사용하였다(22, 32, 63). 간략하게, 모든 탈미엘린화, 재미엘린화 및 정상적 미엘린화 축삭을 하기 기준을 사용하여 계수하였다: 미엘린초가 없는 1 μm 초과의 축삭은 탈미엘린화로 고려하고, "양파 구근형"(즉, 원주 방향으로 배열된 슈반 세포 돌기 및 세포외 매트릭스)에 의해 둘러싸인 축삭 및/또는 축삭 직경의 <10%의 미엘린초를 갖는 축삭은 재미엘린화로 고려하고, 다른 미엘린화 축삭은 정상 미엘린화로 고려함.
또한, 각각의 근 또는 신경의 전체 단면 내에 존재하는 포말 대식세포의 수는 염증의 지표로 계수되었다. 대식세포는 이전에 기재된 바와 같이, 400× 배율에서 반초박 절편에서, 미엘린 파편이 있고, 기저막이 없고, 작은, 미세융모형 돌기가 확장된 세포로서 식별되었다(64, 65). 대식세포 계수는 상이한 척수근과 신경 사이의 크기 차이에 대해 계수하기 위해, 1,000개의 미엘린화 섬유 당 비율로서 계산하였다. 모든 병리학적 분석은 각각의 마우스의 치료 조건에 대해 맹검으로 수행되었다.
결과는 도 6 및 표 7(전척수근), 도 7 및 표 8(좌골 신경) 및 도 8 및 표 9(대퇴 운동 신경)에 나타낸다. 이러한 결과는, 비정상적 미엘린화 섬유의 개선된 비율과 함께, 탈미엘린화 및 재미엘린화 섬유가 더 적은, mock-치료된 대조군에 비해 개선된 척수근, 좌골 신경 및 대퇴 신경의 미엘린화를 나타낸다. 모든 샘플은 GJB1 치료된 군에서 포말 대식세포의 수의 감소를 나타내어, 치료군에서 염증의 감소를 나타냈다.
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
실시예 9: 최소 프로모터(miniMpz) 요소에 의해 유도된 슈반 세포 표적 발현을 위한 AAV 벡터의 개발
상기 실시예에 기재된 AAV9-기반 접근법은 CMT4C를 포함하는 다른 탈미엘린성 CMT 유형을 치료하기 위한 임상적 번역에 대한 높은 잠재성을 갖는다. 그러나, AAV 벡터에서 더 작은 이식유전자 용량의 한계가 극복되는 것이 필요하다.
AAV-매개된 슈반 세포 표적 유전자 발현을 촉진하기 위해, 본 발명자들은 Mpz 프로모터의 최소 버전을 클로닝하였다. 1.127 kb 전장 Mpz 프로모터(SEQ ID NO. 4)로부터 출발하고, 전장 Mpz 프로모터의 기능 조절 요소(Egr2 및 Sox10 결합 부위)가 출발 코돈의 업스트림에 400 bp 이내에 배치됨을 나타내는 인핸서/ChIP-seq 데이터를 기반으로 하여(56), 본 발명자들은 AAV 벡터의 운반 용량 이내에서 유지하기 위해 최소 크기 프로모터로 슈반 세포에서 표적화된 발현을 달성하는 이러한 전략을 선택하였다. 본 발명자들은 스타트 코돈의 업스트림에서 Mpz 프로모터로부터 410 bp를 PCR-증폭시켰고, 이후 이러한 miniMpz 프로모터를, 리포터 유전자로서 다운스트림 Egfp와 함께 AAV 트랜스퍼 플라스미드에 클로닝하고, AAV9-miniMpz.Egfp 벡터를 생성하였다(SEQ ID NO. 3 및 도 9).
이러한 AAV9-miniMpz.Egfp 벡터를 또한 단일 요추 척수강내 주사에 의해 실시예 3에 기재된 바와 동일한 전달 방법을 사용하여 2개월령 야생형(WT) 마우스에서 생체내에서 검증하였고, PNS 전반에 걸쳐 미엘린성 슈반 세포의 높은 백분율에서 리포터 유전자 EGFP의 발현을 유도하는 것으로 나타났다. 이는 요추 척수근 및 말초 신경에서의 50% 초과의 발현 비율 및 높은 벡터 카피 수(VCN)와 함께, PNS 조직에서 미엘린성 슈반 세포로 주로 제한된 벡터의 광범위한 발현을 나타냈다(도 10).
EGFP와 조합된 백질 및 회백질에서 뉴론 NeuN, 성상 세포 GFAP, 및 올리고덴드로사이트 CC-1을 포함하는 세포 마커를 사용하여 실시예 4에 기재된 바와 유사하게 수행된 AAV9-miniMpz-Egfp 주사된 마우스로부터의 척수 조직의 면역염색은, n=3 내지 5마리의 마우스로부터 정량화된 CNS에서 뉴론 및 교질 세포 모두의 약 2 내지 3%의 매우 작은 서브세트에서만 miniMpz-유도된 작제물의 발현을 나타냈다(도 11).
결과는 도 10(요추근 및 좌골 신경) 및 도 11(요추 척수)에 나타나 있고, EGFP 발현이 요추근 및 좌골 신경에서 적절하게 분포되고, 요추 척수에서 최소 발현이 있음을 입증하여, 주사 이후 말초 신경계에서 슈반 세포에서의 EGFP 리포터 단백질의 발현 및 벡터의 생체분포가 있음을 나타낸다.
실시예 10: 신경장해의 초기에 발병 전 치료될 때 CMT1X의 모델에서 유전자 요법 치료의 효능
2개월령 Cx32 녹아웃(KO) 마우스의 군, CMT1X의 모델(n=군 당 10마리의 마우스)을 치료적(full) AAV9-Mpz-GJB1 벡터 또는 네거티브 대조군(mock) 벡터 AAV9-Mpz-Egfp로 2개월령에 주사하였다. 치료 전, 및 4개월령 및 6개월령에 거동 분석을 수행하였다. 6개월령에 전기생리학적 분석을 수행하고, 이후 말초 신경 조직의 반초박 절편의 형태학적 분석을 수행하였다. 마우스가 2개월령에 치료된 것 이외에는, 상기 실시예 6 내지 실시예 8에 기재된 바와 동일한 프로토콜을 사용하였다.
이러한 데이터는 6개월의 후기에 발병 이후 치료(실시예 6 내지 실시예 8) 이외에, 신경병증의 초기(2개월령)에 마우스의 발병 전 치료를 위한 모델을 제공한다.
mock-치료된 6개월령 Cx32 KO 마우스에 비하여 치료된 것에서의 거동 결과
치료적(full) 또는 네거티브 대조군(mock) 벡터로, CMT1X의 모델인 2개월령 Cx32 녹아웃(KO) 마우스의 군의 치료를 수행하였고, 마우스를 4개월령 및 6개월령에 운동 강도에 대해 시험하였다. 완전히 치료된 군은 mock-치료된 군에 비하여 두 시점 모두에서 유의하게 개선된 근육 강도를 나타냈다(도 12의 A 및 도 12의 B). 완전히 치료된 군은 또한 치료 이후 시간 경과에 따라 유의한 개선을 나타낸 반면(도 12의 C), mock 치료된 마우스는 어떠한 개선도 나타내지 않았다.
mock-치료된 6개월령 Cx32 KO 마우스에 비하여 발병 전 치료된 것에서의 전기생리학적 연구
치료된(full) 및 mock-치료된 6개월령 Cx32 KO 마우스에서의 전기생리학적 연구는 유전자 요법 치료 이후 좌골 신경 전도 속도의 유의한 개선을 나타냈고, 도 13에 나타나 있다.
도 13은 mock 벡터 치료된 Cx32 KO 마우스에 비하여 발병 전 치료된 AAV9-Mpz-GJB1(full 벡터)에서의 유의하게 개선된 좌골 신경 전도 속도를 나타낸다.
mock-치료된 6개월령 Cx32 KO 마우스에 비하여 치료된 것에서의 말초 신경 조직에서의 형태학적 연구
mock-치료된 6개월령 Cx32 KO 마우스에 비하여 치료된 것에서의 말초 신경 조직에서의 형태학적 연구. 전요추근(도 14), 중간-좌골 신경(도 15), 및 대퇴 운동 신경(도 16)의 반초박 절편을 시험하였고, 비정상적 미엘린화 섬유의 비율 및 대식세포의 수를 6개월령에 mock-치료된Cx32 KO 마우스와 비교하여 완전히 치료된 군에서 정량화하였다.
도 14, 도 15 및 도 16 각각에 나타낸 바와 같이, mock 치료된 마우스에 비해 치료된 것에서 더 적은 탈미엘린화(*) 또는 재미엘린화(r) 섬유 및 더 적은 포말 대식세포가 발견되었다. 이는 치료된 군에서의 개선된 미엘린화 및 염증의 감소를 나타낸다.
실시예 11: CMT1X를 치료하기 위한 인간화 치료 벡터의 개발
실시예 1에 기재된 벡터는 랫트 Mpz 프로모터에 의해 제어된다. 이러한 작제물을 인간화하고 이를 임상 적용에 더 적합하게 만들기 위해, 본 발명자들은 또한 전임상 투약량-반응 시험 및 비인간 영장류(NHP) 독성 및 생체분포 연구에 사용될 수 있는 인간 hP0 프로모터(SEQ ID NO: 18)를 사용하여 인간-Mpz-GJB1 작제물(SEQ ID NO: 17)을 클로닝하였다. KpnI 및 AgeI 제한 효소를 도입하기 위해 프라이머를 사용하여 게놈 DNA로부터 인간 P0 서열을 PCR 증폭시켰다. 프라이머는 하기였다: KpnhP0-F- 5'-AGGGGTACCGCCTGGCATAAAC-3'(SEQ ID NO. 25) 및 AgehP0-R-5'- AATTTACCGGTGCTGGGGCAG-3'(SEQ ID NO. 26). hP0의 연결 이후, BamHI 및 XhoI를 사용하여 기존 작제물로부터 Cx32 ORF를 잘라냈다. Cx32를 AAV 전달 작제물에 연결하고, 제한 절단 맵핑 및 직접적 시퀀싱에 의해 발현 카세트의 정확한 어셈블리를 확인하였다.
인간화 mock 벡터 플라스미드(인간-Mpz-Egfp)를 또한 대조군으로서 사용하기 위해 생성하였다(SEQ ID NO: 19).
실시예 12: CMT4C를 치료하기 위한 치료적 벡터의 개발 및 발현 분석
상기 SEQ ID NO. 5의 mini Mpz 랫트 유도된 프로모터를 이용하는 실시예 9에 기재된 것과 유사한 mini-Mpz-SH3TC2.myc 작제물을, SH3TC2 유전자 삽입, 및 AAV9에의 효율적인 패키징을 허용하기 위해 약 4700 bp 한계 이내에서 유지하기 위한 ITR-ITR 세그먼트의 추가 변형(WPRE의 제거 및 polyA의 최소 합성 polyA로의 대체를 포함함)(68, 69)을 사용하여 개발하였다. 이러한 치료적 벡터의 서열은 SEQ ID NO: 20에 나타나 있다.
이러한 신규한 치료적 벡터(mini-Mpz-SH3TC2.myc)의 발현 분석은 CMT4C 모델 마우스의 군에서 수행하였다. 이러한 결과는 상기 실시예 9에 기재된 리포터 유전자 발현을 유도하는 최소 Mpz 프로모터 벡터의 개발을 보완한다.
신규한 AAV-miniMpz-SH3TC2.myc 작제물이 생성되고, AAV9 혈청형으로 패키징되어, 5x1012 vg/ml의 역가를 달성하였다. 벡터(20 μl의 부피 중 총 1x1011 vg)를 5개월령 Sh3tc2-/- 마우스(n=5)에 요추 척수강내 주사로 전달하고, 고정된 요추 척수근 및 양쪽 좌골 신경 절편에서 주사 이후 5주에 발현을 시험하였다.
SH3TC2의 발현은 근 및 좌골 신경을 포함한 PNS 전반에 걸쳐 미엘린성 슈반 세포의 높은 백분율로, 특징적인 핵주위 과립성 외관으로, 및 때때로 슈반 세포의 전체 길이를 따라 검출되었다(도 17의 A 내지 도 17의 F). SH3TC2-면역반응성 슈반 세포의 백분율의 정량화는 요추근에서 평균 54.67% 발현율 및 좌골 신경에서 45.39% 발현율을 나타냈다(도 17의 G).
이러한 결과는 작제물이 PNS 전반에 걸친 미엘린성 슈반 세포에서의 양호한 발현 수준을 달성했음을 나타낸다.
실시예 13: CMT4C를 치료하기 위한 인간화 치료적 벡터의 개발
임상전 시험에 매우 적합한(전임상 발현 분석을 용이하게 하기 위한 SH3TC2 상의 myc 태그 및 랫트 Mpz 프로모터의 최소 버전의 포함으로 인함) mini-Mpz-SH3TC2.myc(SEQ ID NO: 20) 작제물(상기 실시예 12에 기재됨)을 임상 적용에 더 적합하게 하기 위해 개질시켰다(SEQ ID NO: 21).
myc 태그는 제거되었고, 랫트 프로모터의 최소 버전은 최소 인간 Mpz 프로모터의 상응하는 서열로 대체되었다(SEQ ID NO: 22). 이러한 벡터는 임상 적용을 진행하기 전에 최종 전임상 투약량-반응 시험 및 NHP 독성 및 생체분포 연구에 사용될 수 있다. 인간화 mock 벡터 플라스미드(인간-miniMpz-Egfp)를 또한 생성하였다(SEQ ID NO: 23).
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본 발명의 구현예는 이제 하기 번호가 매겨진 단락에서 기재될 것이다:
1. 바이러스 벡터가 제1 폴리뉴클레오티드로 전사될 수 있는 제1 핵산 서열을 포함하고 바이러스 벡터가 AAV 벡터인, 슈반 세포와 관련된 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 슈반 세포와 관련된 질환의 치료 또는 예방에서의 사용을 위한 바이러스 벡터.
2. 제1 폴리뉴클레오티드가 슈반 세포 특이적 프로모터, 선택적으로 미엘린 특이적 프로모터의 제어 하에 있는, 단락 1의 사용을 위한 바이러스 벡터.
3. 제1 폴리뉴클레오티드의 발현이 전장 미엘린 단백질 제로(Mpz) 프로모터의 제어 하에 있고, 전장 프로모터가 전장 랫트 또는 인간 미엘린 단백질 제로 프로모터인, 단락 1 또는 단락 2의 사용을 위한 바이러스 벡터.
4. 제1 폴리뉴클레오티드의 발현이 길이 100bp 내지 1100bp인 프로모터의 제어 하에 있고, 선택적으로 프로모터가 길이 200bp 내지 900bp, 길이 300bp 내지 800bp, 길이 400bp 내지 700bp의 범위이고, 선택적으로 프로모터가 길이 500bp 내지 600bp의 범위이고, 선택적으로 프로모터가 길이 410bp인, 단락 1 내지 단락 3의 사용을 위한 바이러스 벡터.
5. 프로모터가 전장 또는 최소 미엘린 특이적 프로모터, 선택적으로 최소 미엘린 단백질 제로(Mpz) 프로모터이고, 선택적으로 프로모터가 SEQ ID NO. 5 또는 SEQ ID NO. 22와 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%이고, 선택적으로 SEQ ID NO. 5 또는 SEQ ID NO. 22.와 적어도 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%인 서열을 갖는, 단락 4의 사용을 위한 바이러스 벡터.
6. 벡터가 슈반 세포를 형질도입시키는 능력을 갖는, 단락 1 내지 단락 5 중 어느 하나의 사용을 위한 바이러스 벡터.
7. 벡터가 호스트 세포의 게놈에 통합되지 않는, 단락 1 내지 단락 6 중 어느 하나의 사용을 위한 바이러스 벡터.
8. AAV 벡터가 하기를 포함하는 군으로부터 선택되는, 단락 1 내지 단락 7 중 어느 하나의 사용을 위한 바이러스 벡터: AAV9 및 AAVrh10.
9. AAV 벡터가 AAV9인, 단락 8의 사용을 위한 바이러스 벡터.
10. 제1 폴리뉴클레오티드가 제1 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하고 이로 번역되는, 단락 1 내지 단락 9 중 어느 하나의 사용을 위한 바이러스 벡터.
11. 제1 핵산이 하기를 포함하고:
a) 선택적으로 하기 유전자 중 어느 하나를 포함하거나 이로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 신경장해-관련 유전자의 야생형 또는 치료적으로 유익한 서열: 갭 접합 베타 1(GJB1); SH3 도메인 및 테트라트리코펩티드 반복체 2(SH3TC2); 말초 미엘린 단백질 22(PMP22); 미엘린 단백질 제로(MPZ); 조기 성장 반응 2(EGR2); 강글리오시드 유도된 분화 관련 단백질 1(GDAP1); N-Myc 다운스트림 조절된 1(NDRG1) 또는 탈미엘린성 신경장해 및 슈반 세포 기능장애와 관련된 다른 유전자; 또는
b) 신경장해-관련 유전자, 예를 들어 하기 유전자 중 하나의 야생형 서열과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%이고, 선택적으로 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%인 서열: 갭 접합 베타 1(GJB1); SH3 도메인 및 테트라트리코펩티드 반복체 2(SH3TC2); 말초 미엘린 단백질 22(PMP22); 미엘린 단백질 제로(MPZ); 조기 성장 반응 2(EGR2); 강글리오시드 유도된 분화 관련 단백질 1(GDAP1); N-Myc 다운스트림 조절된 1(NDRG1) 또는 탈미엘린성 신경장해 및 슈반 세포 기능장애와 관련된 다른 유전자;
선택적으로 제1 핵산이 SEQ ID NO. 6 내지 12와 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%이고, 선택적으로 SEQ ID NO. 6 내지 12와 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%인 서열을 포함하는, 단락 10의 사용을 위한 바이러스 벡터.
12. 제1 핵산이, 하나 이상의 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드로 전사되는 개방형 해독 프레임(ORF) 또는 cDNA의 야생형 형태를 포함하는, 단락 10 또는 단락 11의 사용을 위한 바이러스 벡터로서, 선택적으로 상기 폴리펩티드는 코넥신-32(Cx32); SH3 도메인 및 테트라트리코펩티드 반복체 2(SH3TC2); 말초 미엘린 단백질 22(PMP22); 미엘린 단백질 제로(MPZ); 조기 성장 반응 2(EGR2); 강글리오시드 유도된 분화 관련 단백질 1(GDAP1); N-Myc 다운스트림 조절된 1(NDRG1)을 포함하거나 이로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 사용을 위한 바이러스 벡터.
13. 제1 핵산이 갭 접합 베타 1(GJB1) 유전자의 야생형 개방형 해독 프레임(ORF)을 포함하는, 단락 10 또는 단락 11의 사용을 위한 바이러스 벡터.
14. 벡터가 제1 폴리뉴클레오티드로부터의 발현을 유도할 수 있고, 선택적으로 제1 폴리펩티드의 발현을 유도할 수 있고, 선택적으로 제1 폴리펩티드가 코넥신 32(Cx32) 단백질, 선택적으로 야생형 Cx32인, 단락 1 내지 단락 13 중 어느 하나의 사용을 위한 바이러스 벡터.
15. 제1 폴리뉴클레오티드가 하기 중 하나 이상을 인코딩하는, 단락 1 내지 단락 10 중 어느 하나의 사용을 위한 바이러스 벡터: 영양 인자(예를 들어 BDNF, GDNF, NT-3, VEGF), 재생 인자(예를 들어 안지오제닌, Oct-6, Egr2, Sox-10), 성장 인자(예를 들어 IGF).
16. 바이러스 벡터의 투여가 슈반 세포의 개선된 기능 및/또는 미엘린초의 증가된 형성을 초래하는 제1 폴리뉴클레오티드로부터의 제1 단백질의 발현을 야기하는, 단락 1 내지 단락 15 중 어느 하나의 사용을 위한 바이러스 벡터.
17. 제1 폴리뉴클레오티드가 폴리펩티드를 인코딩하지 않고, 선택적으로 제1 폴리뉴클레오티드가 비코딩 RNA인, 단락 1 내지 단락 9의 사용을 위한 바이러스 벡터.
18. 비코딩 RNA가 짧은 헤어핀 RNA(shRNA); 마이크로RNA(miRNA); 가이드 RNA(gRNA)인, 단락 17의 사용을 위한 바이러스 벡터.
19. 바이러스 벡터가 표적 유기체에 있고, 비코딩 RNA의 발현이 표적 폴리뉴클레오티드의 발현의 감소를 야기하고, 선택적으로 표적 폴리뉴클레오티드가 표적 유기체에 배치된, 선택적으로 표적 유기체 내의 세포에 배치된 유전자인, 단락 17 또는 단락 18의 사용을 위한 바이러스 벡터.
20. 표적 유기체에서 표적 폴리뉴클레오티드의 발현 또는 과발현이 슈반 세포와 관련된 질환과 관련되는 것으로 여겨지고, 선택적으로 질환이 우성 탈미엘린성 신경장해(CMT1)이고, 선택적으로 표적 폴리뉴클레오티드가 미엘린 단백질 제로(Mpz/P0)의 돌연변이된 대립유전자이고 슈반 세포와 관련된 질환이 CMT1B이거나, 표적 폴리뉴클레오티드가 CMT1과 관련된 또다른 우성 유전자인, 단락 19의 사용을 위한 바이러스 벡터.
21. 바이러스 벡터의 투여가 슈반 세포의 개선된 기능 및/또는 미엘린초의 증가된 형성을 야기하는, 단락 17 내지 단락 20 중 어느 하나의 사용을 위한 바이러스 벡터.
22. 슈반 세포와 관련된 질환이 슈반 세포에 의한 미엘린초의 파괴 및/또는 감소된 형성을 야기하는, 선행하는 단락들 중 어느 하나의 사용을 위한 바이러스 벡터.
23. 질환이 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 선행하는 단락들 중 어느 하나의 사용을 위한 바이러스 벡터: 샤르코-마리-투스 질환(CMT); 압박 마비 유전 신경장해(HNPP); 당뇨병성 및 다른 독성 말초 신경장해; 운동 뉴런 질환(MND).
24. 질환이 샤르코-마리-투스 질환(CMT)인, 선행하는 단락들 중 어느 하나의 사용을 위한 바이러스 벡터.
25. 질환이 하기로부터 선택되는, 단락 24의 사용을 위한 바이러스 벡터: 샤르코-마리-투스 유형 1X(CMT1X); 샤르코-마리-투스 유형 1A 내지 1F(CMT1A 내지 1F); 샤르코-마리-투스 유형 4A 내지 4H(CMT4A 내지 4H).
26. 질환이 샤르코-마리-투스 유형 1X(CMT1X)인, 단락 25의 사용을 위한 바이러스 벡터.
27. 질환이 샤르코-마리-투스 유형 4C(CMT4C)인, 단락 25의 사용을 위한 바이러스 벡터.
28. 개선된 기능이 치료 이전 대상체에서의 슈반 세포에 의한 미엘린초의 형성과 비교했을 때 슈반 세포에 의한 미엘린초의 증가된 형성으로부터 야기되는, 단락 16 또는 단락 21의 사용을 위한 바이러스 벡터.
29. 슈반 세포에 의한 미엘린초의 증가된 형성이 치료 이전 대상체와 비교했을 때, 하기 매개변수 중 어느 하나 이상의 개선을 야기하는, 단락 28의 사용을 위한 바이러스 벡터:
a) 근육 강도;
b) 좌골 신경 전도 속도; 및/또는
c) 혈액 바이오마커의 반응
.
30. 슈반 세포에 의한 미엘린초의 개선된 형성이 말초 신경의 개선된 미엘린화를 야기하는, 단락 28 또는 단락 29의 사용을 위한 바이러스 벡터.
31. AAV가 척수강내 주사 또는 정맥내 주사에 의해 대상체에 투여되고, 바람직하게는 AAV가 척수강내 주사에 의해 투여되는, 선행하는 단락들 중 어느 하나의 사용을 위한 바이러스 벡터.
32. AAV가 하기 경로 중 하나에 의해 투여되는, 단락 31의 사용을 위한 바이러스 벡터: 요추 척수강내 주사; 흉부 척수강내 주사; 자궁경부 척수강내 주사.
33. 바이러스 벡터가 요추 척수강내 주사에 의해 투여되는, 단락 32의 사용을 위한 바이러스 벡터.
34. AAV가 단일 척수강내 주사에 의해 투여되는, 단락 31 내지 단락 33의 사용을 위한 바이러스 벡터.
35. 슈반 세포와 관련된 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체가 인간 대상체인, 선행하는 단락들 중 어느 하나의 사용을 위한 바이러스 벡터.
36. 선행하는 단락들 중 어느 하나에 의해 정의된 바이러스 벡터.
37. 선행하는 단락들 중 어느 하나에 의해 정의된 바이러스 벡터가 형질도입된 세포로서, 선택적으로 슈반 세포인 세포.
38. SEQ ID NO. 5 또는 SEQ ID NO. 22와 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%이고, 선택적으로 SEQ ID NO. 5 또는 SEQ ID NO. 22와 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%인 서열 상동성을 갖는 최소 미엘린 특이적 프로모터.
39. SEQ ID NO. 5 또는 SEQ ID NO. 22의 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 최소 미엘린 특이적 프로모터.
40. 선택적으로 단락 38 또는 단락 39에 정의된 바와 같은 미엘린 단백질 제로(Mpz) 프로모터 또는 최소 미엘린 특이적 프로모터를 포함하는, 슈반 세포 특이적 프로모터, 선택적으로 미엘린 특이적 프로모터인, 제2 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 제1 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 작제물로서, 제2 핵산이 제1 폴리뉴클레오티드로 전사되고, 제2 핵산 서열이 a) 개방형 해독 프레임 또는 cDNA 또는 유전자의 다른 요소이거나; b) 비코딩 RNA로 전사되는, 폴리뉴클레오티드 작제물.
41. 단락 38 또는 단락 39에 따른 최소 미엘린 특이적 프로모터 또는 단락 40의 폴리뉴클레오티드 작제물을 포함하는 바이러스 벡터.
42. 벡터가 슈반 세포를 형질도입시키는 능력을 갖는, 단락 1 내지 단락 35 중 어느 하나의 사용을 위한 바이러스 벡터 또는 단락 36 또는 단락 41의 바이러스 벡터.
43. 벡터가 호스트 세포의 게놈에 통합되지 않는, 선행하는 단락들 중 어느 하나의 사용을 위한 바이러스 벡터.
44. 하기를 포함하는, 단락 42 또는 단락 43 중 어느 하나에 따른 바이러스 벡터:
a) 선택적으로 AAV 벡터가 AAV9인, AAV;
b) AAV9 벡터, 미엘린 단백질 제로(Mpz) 프로모터 및 EGFP 리포터 유전자를 포함하는 AAV-Mpz.Egfp 벡터;
c) AAV9 벡터, 미엘린 단백질 제로(Mpz) 프로모터 및 갭 접합 베타 1(GJB1) 유전자의 개방형 해독 프레임(ORF)을 포함하는 AAV9-Mpz-GJB1 벡터;
d) AAV9 벡터, 최소 미엘린 단백질 제로(miniMpz) 프로모터 및 EGFP 리포터 유전자를 포함하는 AAV9-miniMpz.Egfp 벡터;
e) AAV9 벡터, 전장 인간 미엘린 단백질 제로(hP0) 프로모터 및 갭 접합 베타 1(GJB1) 유전자의 개방형 해독 프레임(ORF)을 포함하는 AAV9-인간 Mpz-GJB1 벡터(SEQ ID NO. 17);
f) AAV9 벡터, 전장 인간 미엘린 단백질 제로(hP0) 프로모터 및 EGFP 리포터 유전자를 포함하는 AAV9-인간 Mpz-Egfp 벡터(SEQ ID NO. 19);
g) AAV9 벡터, 최소 랫트 미엘린 단백질 제로(Mpz) 프로모터 및 SH3TC2 유전자의 개방형 해독 프레임(ORF)을 포함하는 AAV9-miniMpz-SH3TC2.myc.ITR 벡터(SEQ ID NO. 20);
h) AAV9 벡터, 인간 최소 미엘린 단백질 제로(hP0) 프로모터 및 SH3TC2 유전자의 개방형 해독 프레임(ORF)을 포함하는 AAV9-인간-miniMpz-SH3TC2 벡터(SEQ ID NO. 21); 또는
i) AAV9 벡터, 인간 최소 미엘린 단백질 제로(hP0) 프로모터 및 EGFP 리포터 유전자를 포함하는 AAV9-인간-miniMpz-Egfp 벡터(SEQ ID NO. 23).
45. 선행하는 단락들 중 어느 하나의 바이러스 벡터를 포함하는, 약학 조성물.
46. 단락 45에 있어서, 조성물이 적절량의 바이러스 벡터를 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 추가로 포함하는, 약학 조성물.
45. 선택적으로 질환이 슈반 세포에 의한 미엘린초의 파괴 및/또는 감소된 형성을 야기하고, 선택적으로 질환이 샤르코-마리-투스 질환인, 슈반 세포와 관련된 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조 방법에서의 선행하는 단락들 중 어느 하나에 따른 바이러스 벡터의 용도.
46. 바이러스 벡터 또는 폴리뉴클레오티드가 하기 중 어느 하나 이상을 포함하는, CRISPR/Cas9 시스템에서 사용하기 위한 선행하는 단락들 중 어느 하나에 따른 바이러스 벡터 또는 폴리뉴클레오티드 작제물:
a) 관심 대상인 유전자를 표적으로 하는 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드;
b) Cas9 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드;
c) 관심 대상인 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
47. 선택적으로 슈반 세포의 라벨링이 슈반 세포와 관련된 질환의 진단 방법에서 사용될 수 있는, 슈반 세포의 라벨링 방법, 예를 들어 형광 단백질, 예를 들어 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP), 또는 다른 비형광 리포터를 사용한 라벨링 방법에서 사용하기 위한, 선행하는 단락들 중 어느 하나에 따른 바이러스 벡터.
48. 슈반 세포가 대안적 세포 유형(예를 들어 올리고덴드로사이트, 아스트로사이트 또는 뉴론)으로 분화하도록 유도되는 방법에서 사용하기 위한, 단락 1 내지 단락 43 중 어느 하나에 따른 바이러스 벡터.
49. 선택적으로 부상 또는 외상 이후에, 재생을 지원하기 위해 슈반 세포를 자극하는 것을 필요로 하는 대상체에서의 재생을 지원하기 위해 슈반 세포를 자극하는 방법에서 사용하기 위한, 단락 1 내지 단락 43 중 어느 하나에 따른 바이러스 벡터.
50. 하기 중 하나 이상을 포함하는, 슈반 세포와 관련된 질환의 예방 또는 치료, 슈반 세포의 라벨링, 또는 슈반 세포의 재생에서 사용하기 위한 키트:
a) 선행하는 단락들 중 어느 하나에 정의된 바이러스 벡터;
b) 단락 40에 의해 정의된 폴리뉴클레오티드 작제물;
c) 바이러스 벡터;
d) 단락 40에 의해 정의된 폴리뉴클레오티드 작제물을 포함하는 바이러스 벡터;
e) 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제;
f) 일회용 주사기, 예를 들어 척수강내 요추 주사에 적합한 일회용 주사기;
g) 사용 설명서.
51. 키트가 선행하는 단락들 중 어느 하나에 의해 정의된 하나 초과의 바이러스 벡터를 포함하고, 선택적으로 키트가 선행하는 단락들 중 어느 하나에 의해 정의된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 상이한 바이러스 벡터를 포함하는, 단락 50에 따른 키트.
52. 슈반 세포와 관련된 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서의 슈반 세포와 관련된 질환의 치료 또는 예방에서의 사용을 위한 바이러스 벡터로서, 바이러스 벡터가 제1 폴리뉴클레오티드로 전사될 수 있는 제1 핵산 서열을 포함하고, 상기 제1 폴리뉴클레오티드의 발현이 선택적으로 SEQ ID NO. 5 또는 SEQ ID NO. 22에 정의된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 최소 미엘린 특이적 프로모터의 제어 하에 있고, 선택적으로 바이러스 벡터가 AAV 벡터인, 바이러스 벡터.
현재 본원에 기재된 바람직한 구현예에 대한 다양한 변화 및 수정이 당업자에게 명백할 것임이 이해되어야 한다. 상기 변화 및 수정은 본 발명의 취지 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 그리고 이의 의도된 이점을 감소시키지 않으면서 이루어질 수 있다. 따라서, 상기 변화 및 수정은 하기 청구항에 의해 포함됨이 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> The Cyprus Foundation for Muscular Dystrophy Research <120> Methods <130> CYPBD/P73471PC <150> GB 1907882.3 <151> 2019-06-03 <160> 26 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 6323 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV-Mpz.Egfp construct <400> 1 tagctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gcccgggcaa agcccgggcg tcgggcgacc 60 tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc 120 actaggggtt ccttgtagtt aatgattaac ccgccatgct acttatctac gtagccatgc 180 tctaggtacc gggccccccc tcgaggtcga cggtatcgat aagcttcctg ttcagactcg 240 tttcctgctg taccctttca atggccccac atcaaatcaa acacagatgg cacatatcta 300 ctctaaatat atgcagagct tcacaaacgt catacacgta cgtgtgtcac acacgcacac 360 acacaccctt ccacctctgc ccttaccttt gctgtcccat ctagacatta tccctcccat 420 ccccttattt cccttatcaa aatggctgct ccttcaaggt tccaaataac actgcttcct 480 ggacctgact cctctttcct ctgaacttcc tgtgttaagt gtattcctag tgcactgtgc 540 cttggtagtt gttgagattg ccctctgctt ctcccttctg cctcctcatc tagtgatctt 600 gagcttgtag aaagaactga attaccattc taatacgagc attctcgaac tctccaaata 660 gccaccaagc aggacaatag gcagtcttga tcatttaaac tgctgcatgg caaaaggaat 720 cgaaggattt cttaacagaa gtgggggggg gggagatctg ggcttcttcc tggaagtttc 780 ctgatagaga aaatcttctg cctgggtaga atctcccagg atgcagggag atggaaaaag 840 tgttccccaa ggactttgta gtctacaggt tgtggagcca tcggaacaac gagacaccct 900 aatttgggag tgctctgaaa gaaacttgcc tctaggccct agggctctca ggcaaggagg 960 ctaagaagga atcctttgct gtagcctttt ggatttaggt ttctcagctt atctatccct 1020 cagagaagtg tgtctatgtc ccttttctgt ccctctgcct caccccaccc caacattcca 1080 acctagggta gggggaggtc agtatacaca aagccctctg tgtaaggggt ggtatgtgtc 1140 cccccacccc cctacccaga gtatacaatg ccccttctgc tccatgcccc tgccaccctc 1200 ccaccacctc tcaattgcac atgccaggct gcaattggtc actggctcag gacagccccc 1260 tcatgctggg gatccagggg attttaagca ggttccagaa aacaccactc agttccttgt 1320 cccccgctct ctccacccca cagacgctct gccaagcttg atatcgaatt gatccaccgg 1380 tcgccaccat ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc atcctggtcg 1440 agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc gagggcgatg 1500 ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct 1560 ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc 1620 acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc caggagcgca 1680 ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg 1740 acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc 1800 tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg gccgacaagc 1860 agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc 1920 agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg 1980 acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc 2040 acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt 2100 acaagtaaag cggccctaga tcaagcttat cgataatcaa cctctggatt acaaaatttg 2160 tgaaagattg actggtattc ttaactatgt tgctcctttt acgctatgtg gatacgctgc 2220 tttaatgcct ttgtatcatg ctattgcttc ccgtatggct ttcattttct cctccttgta 2280 taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga gttgtggccc gttgtcaggc aacgtggcgt 2340 ggtgtgcact gtgtttgctg acgcaacccc cactggttgg ggcattgcca ccacctgtca 2400 gctcctttcc gggactttcg ctttccccct ccctattgcc acggcggaac tcatcgccgc 2460 ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg gctgttgggc actgacaatt ccgtggtgtt 2520 gtcggggaaa tcatcgtcct ttccttggct gctcgcctgt gttgccacct ggattctgcg 2580 cgggacgtcc ttctgctacg tcccttcggc cctcaatcca gcggaccttc cttcccgcgg 2640 cctgctgccg gctctgcggc ctcttccgcg tcttcgcctt cgccctcaga cgagtcggat 2700 ctccctttgg gccgcctccc cgcatcgata ccgtcgactc gctgatcagc ctcgactgtg 2760 ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa 2820 ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt 2880 aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa 2940 gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg cttctgaggc ggaaagaacc 3000 agctggggct cgactagagc atggctacgt agataagtag catggcgggt taatcattaa 3060 ctacaaggaa cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac 3120 tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg cctcagtgag 3180 cgagcgagcg cgcagagctt tttgcaaaag cctaggcctc caaaaaagcc tcctcactac 3240 ttctggaata gctcagaggc cgaggcggcc tcggcctctg cataaataaa aaaaattagt 3300 cagccatggg gcggagaatg ggcggaactg ggcggagtta ggggcgggat gggcggagtt 3360 aggggcggga ctatggttgc tgactaattg agatgcatgc tttgcatact tctgcctgct 3420 ggggagcctg gggactttcc acacctggtt gctgactaat tgagatgcat gctttgcata 3480 cttctgcctg ctggggagcc tggggacttt ccacacccta actgacacac attccacagc 3540 tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg 3600 cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc 3660 actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt 3720 gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc 3780 ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa 3840 acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc 3900 ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg 3960 cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc 4020 tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc 4080 gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca 4140 ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact 4200 acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg 4260 gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt 4320 ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct 4380 tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga 4440 gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa 4500 tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac 4560 ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga 4620 taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc 4680 cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca 4740 gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta 4800 gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg 4860 tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc 4920 gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg 4980 ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt 5040 ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt 5100 cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata 5160 ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc 5220 gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac 5280 ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa 5340 ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct 5400 tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat 5460 ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc 5520 cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca 5580 cgaggccctt tcgtctcgcg cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga cacatgcagc 5640 tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg 5700 gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gctggcttaa ctatgcggca tcagagcaga 5760 ttgtactgag agtgcaccat tcgacgctct cccttatgcg actcctgcat taggaagcag 5820 cccagtagta ggttgaggcc gttgagcacc gccgccgcaa ggaatggtgc atgcaaggag 5880 atggcgccca acagtccccc ggccacgggg cctgccacca tacccacgcc gaaacaagcg 5940 ctcatgagcc cgaagtggcg agcccgatct tccccatcgg tgatgtcggc gatataggcg 6000 ccagcaaccg cacctgtggc gccggtgatg ccggccacga tgcgtccggc gtagaggatc 6060 tggctagcga tgaccctgct gattggttcg ctgaccattt ccgggtgcgg gacggcgtta 6120 ccagaaactc agaaggttcg tccaaccaaa ccgactctga cggcagttta cgagagagat 6180 gatagggtct gcttcagtaa gccagatgct acacaattag gcttgtacat attgtcgtta 6240 gaacgcggct acaattaata cataacctta tgtatcatac acatacgatt taggtgacac 6300 tatagaatac acggaattaa ttc 6323 <210> 2 <211> 6429 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV-Mpz.GJB1 construct <400> 2 tagctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gcccgggcaa agcccgggcg tcgggcgacc 60 tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc 120 actaggggtt ccttgtagtt aatgattaac ccgccatgct acttatctac gtagccatgc 180 tctaggtacc cctcgaagct tcctgttcag actcgtttcc tgctgtaccc tttcaatggc 240 cccacatcaa atcaaacaca gatggcacat atctactcta aatatatgca gagcttcaca 300 aacgtcatac acgtacgtgt gtcacacacg cacacacaca cccttccacc tctgccctta 360 cctttgctgt cccatctaga cattatccct cccatcccct tatttccctt atcaaaatgg 420 ctgctccttc aaggttccaa ataacactgc ttcctggacc tgactcctct ttcctctgaa 480 cttcctgtgt taagtgtatt cctagtgcac tgtgccttgg tagttgttga gattgccctc 540 tgcttctccc ttctgcctcc tcatctagtg atcttgagct tgtagaaaga actgaattac 600 cattctaata cgagcattct cgaactctcc aaatagccac caagcaggac aataggcagt 660 cttgatcatt taaactgctg catggcaaaa ggaatcgaag gatttcttaa cagaagtggg 720 ggggggggag atctgggctt cttcctggaa gtttcctgat agagaaaatc ttctgcctgg 780 gtagaatctc ccaggatgca gggagatgga aaaagtgttc cccaaggact ttgtagtcta 840 caggttgtgg agccatcgga acaacgagac accctaattt gggagtgctc tgaaagaaac 900 ttgcctctag gccctagggc tctcaggcaa ggaggctaag aaggaatcct ttgctgtagc 960 cttttggatt taggtttctc agcttatcta tccctcagag aagtgtgtct atgtcccttt 1020 tctgtccctc tgcctcaccc caccccaaca ttccaaccta gggtaggggg aggtcagtat 1080 acacaaagcc ctctgtgtaa ggggtggtat gtgtcccccc acccccctac ccagagtata 1140 caatgcccct tctgctccat gcccctgcca ccctcccacc acctctcaat tgcacatgcc 1200 aggctgcaat tggtcactgg ctcaggacag ccccctcatg ctggggatcc aggggatttt 1260 aagcaggttc cagaaaacac cactcagttc cttgtccccc gctctctcca ccccacagac 1320 gctctgccaa gcttcgagaa tgaggcagga tgaactggac aggtttgtac accttgctca 1380 gtggcgtgaa ccggcattct actgccattg gccgagtatg gctctcggtc atcttcatct 1440 tcagaatcat ggtgctggtg gtggctgcag agagtgtgtg gggtgatgag aaatcttcct 1500 tcatctgcaa cacactccag cctggctgca acagcgtttg ctatgaccaa ttcttcccca 1560 tctcccatgt gcggctgtgg tccctgcagc tcatcctagt ttccacccca gctctcctcg 1620 tggccatgca cgtggctcac cagcaacaca tagagaagaa aatgctacgg cttgagggcc 1680 atggggaccc cctacacctg gaggaggtga agaggcacaa ggtccacatc tcagggacac 1740 tgtggtggac ctatgtcatc agcgtggtgt tccggctgtt gtttgaggcc gtcttcatgt 1800 atgtctttta tctgctctac cctggctatg ccatggtgcg gctggtcaag tgcgacgtct 1860 acccctgccc caacacagtg gactgcttcg tgtcccgccc caccgagaaa accgtcttca 1920 ccgtcttcat gctagctgcc tctggcatct gcatcatcct caatgtggcc gaggtggtgt 1980 acctcatcat ccgggcctgt gcccgccgag cccagcgccg ctccaatcca ccttcccgca 2040 agggctcggg cttcggccac cgcctctcac ctgaatacaa gcagaatgag atcaacaagc 2100 tgctgagtga gcaggatggc tccctgaaag acatactgcg ccgcagccct ggcaccgggg 2160 ctgggctggc tgaaaagagc gaccgctgct cggcctgctg aggatccctc gaggtcgacg 2220 gtatcgataa gcttatcgat aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg 2280 gtattcttaa ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt 2340 atcatgctat tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc 2400 tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt 2460 ttgctgacgc aacccccact ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga 2520 ctttcgcttt ccccctccct attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct 2580 gctggacagg ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat 2640 cgtcctttcc ttggctgctc gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct 2700 gctacgtccc ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc 2760 tgcggcctct tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg 2820 cctccccgca tcgataccgt cgactcgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca 2880 gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac 2940 tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat 3000 tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca 3060 tgctggggat gcggtgggct ctatggcttc tgaggcggaa agaaccagct ggggctcgac 3120 tagagcatgg ctacgtagat aagtagcatg gcgggttaat cattaactac aaggaacccc 3180 tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac 3240 caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca 3300 gagctttttg caaaagccta ggcctccaaa aaagcctcct cactacttct ggaatagctc 3360 agaggccgag gcggcctcgg cctctgcata aataaaaaaa attagtcagc catggggcgg 3420 agaatgggcg gaactgggcg gagttagggg cgggatgggc ggagttaggg gcgggactat 3480 ggttgctgac taattgagat gcatgctttg catacttctg cctgctgggg agcctgggga 3540 ctttccacac ctggttgctg actaattgag atgcatgctt tgcatacttc tgcctgctgg 3600 ggagcctggg gactttccac accctaactg acacacattc cacagctgca ttaatgaatc 3660 ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact 3720 gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta 3780 atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag 3840 caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc 3900 cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta 3960 taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg 4020 ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc 4080 tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac 4140 gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac 4200 ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg 4260 aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga 4320 agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt 4380 agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag 4440 cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct 4500 gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg 4560 atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat 4620 gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc 4680 tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg 4740 gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct 4800 ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca 4860 actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg 4920 ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg 4980 tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc 5040 cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag 5100 ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg 5160 ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag 5220 tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat 5280 agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg 5340 atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca 5400 gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca 5460 aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat 5520 tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag 5580 aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa 5640 gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt 5700 ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc 5760 acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt 5820 gttggcgggt gtcggggctg gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg 5880 caccattcga cgctctccct tatgcgactc ctgcattagg aagcagccca gtagtaggtt 5940 gaggccgttg agcaccgccg ccgcaaggaa tggtgcatgc aaggagatgg cgcccaacag 6000 tcccccggcc acggggcctg ccaccatacc cacgccgaaa caagcgctca tgagcccgaa 6060 gtggcgagcc cgatcttccc catcggtgat gtcggcgata taggcgccag caaccgcacc 6120 tgtggcgccg gtgatgccgg ccacgatgcg tccggcgtag aggatctggc tagcgatgac 6180 cctgctgatt ggttcgctga ccatttccgg gtgcgggacg gcgttaccag aaactcagaa 6240 ggttcgtcca accaaaccga ctctgacggc agtttacgag agagatgata gggtctgctt 6300 cagtaagcca gatgctacac aattaggctt gtacatattg tcgttagaac gcggctacaa 6360 ttaatacata accttatgta tcatacacat acgatttagg tgacactata gaatacacgg 6420 aattaattc 6429 <210> 3 <211> 5549 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV-miniMpz.Egfp construct <400> 3 tagctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gcccgggcaa agcccgggcg tcgggcgacc 60 tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc 120 actaggggtt ccttgtagtt aatgattaac ccgccatgct acttatctac gtagccatgc 180 tctaggtacc gctctcaggc aaggaggcta agaaggaatc ctttgctgta gccttttgga 240 tttaggtttc tcagcttatc tatccctcag agaagtgtgt ctatgtccct tttctgtccc 300 tctgcctcac cccaccccaa cattccaacc tagggtaggg ggaggtcagt atacacaaag 360 ccctctgtgt aaggggtggt atgtgtcccc ccacccccct acccagagta tacaatgccc 420 cttctgctcc atgcccctgc caccctccca ccacctctca attgcacatg ccaggctgca 480 attggtcact ggctcaggac agccccctca tgctggggat ccaggggatt ttaagcaggt 540 tccagaaaac accactcagt tccttgtccc ccgctctctc caccccacag acgctctgcc 600 aaccggtcgc caccatggtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc 660 tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg 720 gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc aagctgcccg 780 tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc 840 ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg 900 agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg 960 agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca 1020 acatcctggg gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat atcatggccg 1080 acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca 1140 gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc 1200 tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc 1260 gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg 1320 agctgtacaa gtaaagcggc cctagatcaa gcttatcgat aatcaacctc tggattacaa 1380 aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata 1440 cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc 1500 cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg 1560 tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact ggttggggca ttgccaccac 1620 ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct attgccacgg cggaactcat 1680 cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt 1740 ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc gcctgtgttg ccacctggat 1800 tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc aatccagcgg accttccttc 1860 ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag 1920 tcggatctcc ctttgggccg cctccccgca tcgataccgt cgactcgctg atcagcctcg 1980 actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc 2040 ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt 2100 ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat 2160 tgggaagaca atagcaggca tgctggggat gcggtgggct ctatggcttc tgaggcggaa 2220 agaaccagct ggggctcgac tagagcatgg ctacgtagat aagtagcatg gcgggttaat 2280 cattaactac aaggaacccc tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc 2340 gctcactgag gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc 2400 agtgagcgag cgagcgcgca gagctttttg caaaagccta ggcctccaaa aaagcctcct 2460 cactacttct ggaatagctc agaggccgag gcggcctcgg cctctgcata aataaaaaaa 2520 attagtcagc catggggcgg agaatgggcg gaactgggcg gagttagggg cgggatgggc 2580 ggagttaggg gcgggactat ggttgctgac taattgagat gcatgctttg catacttctg 2640 cctgctgggg agcctgggga ctttccacac ctggttgctg actaattgag atgcatgctt 2700 tgcatacttc tgcctgctgg ggagcctggg gactttccac accctaactg acacacattc 2760 cacagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct 2820 cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat 2880 cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga 2940 acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt 3000 ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt 3060 ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc 3120 gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa 3180 gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct 3240 ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta 3300 actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg 3360 gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc 3420 ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta 3480 ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg 3540 gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt 3600 tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg 3660 tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta 3720 aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg 3780 aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg 3840 tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc 3900 gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg 3960 agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg 4020 aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag 4080 gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat 4140 caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc 4200 cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc 4260 ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa 4320 ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac 4380 gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt 4440 cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc 4500 gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa 4560 caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca 4620 tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat 4680 acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa 4740 aagtgccacc tgacgtctaa gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc 4800 gtatcacgag gccctttcgt ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca 4860 tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc 4920 gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggctg gcttaactat gcggcatcag 4980 agcagattgt actgagagtg caccattcga cgctctccct tatgcgactc ctgcattagg 5040 aagcagccca gtagtaggtt gaggccgttg agcaccgccg ccgcaaggaa tggtgcatgc 5100 aaggagatgg cgcccaacag tcccccggcc acggggcctg ccaccatacc cacgccgaaa 5160 caagcgctca tgagcccgaa gtggcgagcc cgatcttccc catcggtgat gtcggcgata 5220 taggcgccag caaccgcacc tgtggcgccg gtgatgccgg ccacgatgcg tccggcgtag 5280 aggatctggc tagcgatgac cctgctgatt ggttcgctga ccatttccgg gtgcgggacg 5340 gcgttaccag aaactcagaa ggttcgtcca accaaaccga ctctgacggc agtttacgag 5400 agagatgata gggtctgctt cagtaagcca gatgctacac aattaggctt gtacatattg 5460 tcgttagaac gcggctacaa ttaatacata accttatgta tcatacacat acgatttagg 5520 tgacactata gaatacacgg aattaattc 5549 <210> 4 <211> 1127 <212> DNA <213> Rattus sp. <220> <223> Mpz promoter <400> 4 cctgttcaga ctcgtttcct gctgtaccct ttcaatggcc ccacatcaaa tcaaacacag 60 atggcacata tctactctaa atatatgcag agcttcacaa acgtcataca cgtacgtgtg 120 tcacacacgc acacacacac ccttccacct ctgcccttac ctttgctgtc ccatctagac 180 attatccctc ccatcccctt atttccctta tcaaaatggc tgctccttca aggttccaaa 240 taacactgct tcctggacct gactcctctt tcctctgaac ttcctgtgtt aagtgtattc 300 ctagtgcact gtgccttggt agttgttgag attgccctct gcttctccct tctgcctcct 360 catctagtga tcttgagctt gtagaaagaa ctgaattacc attctaatac gagcattctc 420 gaactctcca aatagccacc aagcaggaca ataggcagtc ttgatcattt aaactgctgc 480 atggcaaaag gaatcgaagg atttcttaac agaagtgggg gggggggaga tctgggcttc 540 ttcctggaag tttcctgata gagaaaatct tctgcctggg tagaatctcc caggatgcag 600 ggagatggaa aaagtgttcc ccaaggactt tgtagtctac aggttgtgga gccatcggaa 660 caacgagaca ccctaatttg ggagtgctct gaaagaaact tgcctctagg ccctagggct 720 ctcaggcaag gaggctaaga aggaatcctt tgctgtagcc ttttggattt aggtttctca 780 gcttatctat ccctcagaga agtgtgtcta tgtccctttt ctgtccctct gcctcacccc 840 accccaacat tccaacctag ggtaggggga ggtcagtata cacaaagccc tctgtgtaag 900 gggtggtatg tgtcccccca cccccctacc cagagtatac aatgcccctt ctgctccatg 960 cccctgccac cctcccacca cctctcaatt gcacatgcca ggctgcaatt ggtcactggc 1020 tcaggacagc cccctcatgc tggggatcca ggggatttta agcaggttcc agaaaacacc 1080 actcagttcc ttgtcccccg ctctctccac cccacagacg ctctgcc 1127 <210> 5 <211> 410 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MiniMpz promoter <400> 5 gctctcaggc aaggaggcta agaaggaatc ctttgctgta gccttttgga tttaggtttc 60 tcagcttatc tatccctcag agaagtgtgt ctatgtccct tttctgtccc tctgcctcac 120 cccaccccaa cattccaacc tagggtaggg ggaggtcagt atacacaaag ccctctgtgt 180 aaggggtggt atgtgtcccc ccacccccct acccagagta tacaatgccc cttctgctcc 240 atgcccctgc caccctccca ccacctctca attgcacatg ccaggctgca attggtcact 300 ggctcaggac agccccctca tgctggggat ccaggggatt ttaagcaggt tccagaaaac 360 accactcagt tccttgtccc ccgctctctc caccccacag acgctctgcc 410 <210> 6 <211> 852 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Connexin-32 (Cx32): GenBank: AY408135.1 <400> 6 atgaactgga caggtttgta caccttgctc agtggcgtga accggcattc tactgccatt 60 ggccgagtat ggctctcggt catcttcatc ttcagaatca tggtgctggt ggtggctgca 120 gagagtgtgt ggggtgatga gaaatcttcc ttcatctgca acacactcca gcctggctgc 180 aacagcgttt gctatgacca attcttcccc atctcccatg tgcggctgtg gtccctgcag 240 ctcatcctag tttccacccc agctctcctc gtggccatgc acgtggctca ccagcaacac 300 atagagaaga aaatgctacg gcttgagggc catggggacc ccctacacct ggaggaggtg 360 aagaggcaca aggtccacat ctcagggaca ctgtggtgga cctatgtcat cagcgtggtg 420 ttccggctgt tgtttgaggc cgtcttcatg tatgtctttt atctgctcta ccctggctat 480 gccatggtgc ggctggtcaa gtgcgacgtc tacccctgcc ccaacacagt ggactgcttc 540 gtgtcccgcc ccaccgagaa aaccgtcttc accgtcttca tgctagctgc ctctggcatc 600 tgcatcatcc tcaatgtggc cgaggtggtg tacctcatca tccgggcctg tgcccgccga 660 gcccagcgcc gctccaatcc accttcccgc aagggctcgg gcttcggcca ccgcctctca 720 cctgaataca agcagaatga gatcaacaag ctgctgagtg agcaggatgg ctccctgaaa 780 gacatactgc gccgcagccc tggcaccggg gctgggctgg ctgaaaagag cgaccgctgc 840 tcggcctgct ga 852 <210> 7 <211> 3846 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> SH3 domain and tetratricopeptide repeats 2 (SH3TC2): GenBank: BC114486.1 <400> 7 atgggtggct gcttctgcat ccccagggag cggagtctga cccggggccc aggtaaagaa 60 actccttcca aggatccaac tgtatcgagt gagtgtatag cctcatctga atacaaggaa 120 aaatgttttc tgccacagaa cattaatcca gacctgacac tctccttctg tgtaaagagc 180 cgctccagga ggtgtgtaaa tggaccccta caggaagctg ctcggaggcg gctctgggca 240 ctggagaatg aggaccagga ggtgcgcatg ctgtttaagg acctctcagc aaggttggtc 300 agtatccagt ctcagagggc ccagtttctc atcaccttca agaccatgga ggaaatctgg 360 aagttctcca cctaccttaa tttagaacat ctcctctttg accacaagta ctggctcaac 420 tgcatattgg tggaggatac agagatccaa gtgtctgtag atgataaaca cctggaaaca 480 atatacctgg gactcctgat acaggaaggc cacttcttct gcagagccct gtgctccgtg 540 actccaccag ccgagaagga aggggaatgc ttgacacttt gcaagaatga gttaatctca 600 gtgaagatgg cagaagctgg ctccgagttg gaaggcgtgt ctttggtgac aggtcagcgg 660 ggcctggtac tggtgtcagc cttggagcct ctgcctctcc ctttccacca gtggttccta 720 aagaattatc caggaagctg tggcctttcc aggaagaggg attggacagg ctcctatcag 780 attggcagag gacgctgtaa ggccttgacg ggttatgagc caggagaaaa ggatgaactg 840 aatttctacc agggagaaag cattgagatc atcggctttg tcatacctgg gcttcagtgg 900 ttcattggaa agtcgacaag ttcaggacaa gtgggctttg tccccaccag gaacatagat 960 cctgattctt attccccaat gagcaggaac tctgcctttc tcagtgatga ggagagatgc 1020 tccctgttgg ccctgggaag tgataagcag actgagtgtt ccagcttcct ccacactctt 1080 gctcgcactg acatcacatc tgtctaccgg ctcagtgggt ttgaatccat ccagaatcct 1140 ccaaatgatc tgagtgcatc ccagcctgaa ggcttcaagg aggtcaggcc tggcagagcc 1200 tgggaggagc atcaggccgt ggggtccaga cagtccagca gctctgagga ctccagcctg 1260 gaggaggagc tcctctcggc cacctcagac agctatcgcc tgccggagcc tgatgacctt 1320 gatgacccgg aactgctcat ggacctaagc actggtcagg aggaggaggc tgagaacttc 1380 gcccccatat tggcttttct ggatcatgag ggttatgctg accactttaa gagtctctat 1440 gacttctcct tctctttcct cacttcttcc ttttatagct tctctgagga ggatgagttt 1500 gtggcctacc tggaggcatc aagaaagtgg gccaagaaga gccacatgac ctgggcccat 1560 gcccggctct gcttcctcct gggccggctg agcatcagga aggtcaaact ctctcaggcc 1620 agggtgtact tcgaggaggc catccacatt ctcaatggag catttgagga cctatccttg 1680 gtggccactc tgtacatcaa tttggctgcc atctacctga aacagaggct gagacataaa 1740 ggctccgccc tgttggaaaa ggcaggtgcc ctgctggcct gcctgcctga ccgtgagtct 1800 agtgccaagc atgaactcga cgtggtggcc tacgtgctgc gccaggggat tgtggtgggc 1860 agcagcccgc tggaggccag ggcctgcttt ctggccatcc gcttgctcct gagcctaggc 1920 cggcacgagg aggtcctgcc ctttgccgag cgcctgcagc tcctctctgg acaccctcct 1980 gcctctgagg ctgtggccag tgttttgagt tttctgtatg acaagaaata tcttccacac 2040 cttgcagtgg cctctgtcca gcaacatggt atccagagtg cccaagggat gtctcttcct 2100 atttggcagg tccaccttgt cctccagaac acaaccaagc tccttggctt tccttcccca 2160 ggctggggtg aagtttctgc cttggcctgc ccaatgctca gacaggccct ggctgcctgt 2220 gaggaactag cagaccggag cacccagagg gccctgtgtc tcatcctttc caaagtgtac 2280 ctcgagcaca ggtctcctga cggtgccatc cactacctga gccaggcctt ggtgctaggg 2340 cagctgctgg gtgagcagga atcctttgag tcttctctct gcctggcatg ggcctatctc 2400 ttagccagcc aggccaagaa ggctttggat gtgcttgagc cactgctatg ctccctgaag 2460 gagacagaga gtctcactca aaggggagtc atctataacc tcctgggact tgcactccaa 2520 ggtgaaggcc gggtgaacag ggcagccaag agctatcttc gggccttgaa cagagcccag 2580 gaggtgggag atgtgcataa ccaggcagtg gctatggcca atcttggcca cctgagcctt 2640 aagtcctggg ctcagcatcc agccagaaac tatctcctgc aggctgtacg actctattgt 2700 gaacttcagg ccagtaagga gacagacatg gaattagtac aggtgtttct ctggttggcc 2760 caagttctgg tgtctggaca ccagctgacc catggccttc tttgttatga aatggcattg 2820 ctgtttggct taaggcatcg acatctaaag agtcagcttc aggccaccaa atccctctgc 2880 catttctaca gctctgtgtc cccaaaccct gaggcatgca tcacctacca tgagcactgg 2940 ctggccctgg ctcagcaact cagggaccgg gagatggaag ggaggctgct ggagtccctg 3000 gggcagcttt atcggaacct aaataccgcc aggtccctca ggaggtcact cacatgcatc 3060 aaggagagcc tgcgtatctt cattgacctg ggggagacag acaaggctgc tgaggcctgg 3120 cttggggcgg ggcgactcca ctacctcatg caggaagacg agctggtgga gctgtgcctg 3180 caggcagcca tccagacagc cctgaagtca gaggagcctt tgctggctct caaactttat 3240 gaagaagcag gtgatgtgtt cttcaatggg acccgccaca ggcatcatgc agtggagtac 3300 taccgagctg gagctgttcc tttagcaagg aggttgaagg cggtgagaac tgagctccgg 3360 attttcaata agctgacaga gctgcagatt agcctcgaag gctatgagaa ggctttggaa 3420 tttgccaccc tggccgccag gctcagcaca gtcacaggag atcagaggca agagctggtg 3480 gcctttcacc gcctggctac agtgtactac tccctgcaca tgtatgagat ggctgaggac 3540 tgctacctga agaccctgtc cctctgtcca ccctggctgc agagtcccaa ggaggccctg 3600 tactatgcca aggtgtatta tcgcctgggc agactcacct tctgccagct gaaggatgcc 3660 catgatgcca ctgagtactt ccttctggcc ctggcagcag cggtcctgct gggtgatgag 3720 gagcttcagg acaccattag gagcaggctg gacaacatct gccagagccc cctgtggcac 3780 agcaggccct ccgggtgctc ctcagagagg gcgcggtggc tgagtggtgg tggcctggcc 3840 ctctga 3846 <210> 8 <211> 1828 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Peripheral myelin protein 22 (PMP22): NCBI Reference Sequence: NM_000304.4 <400> 8 agttacaggg agcaccacca gggaacatct cggggagcct ggttggaagc tgcaggctta 60 gtctgtcggc tgcgggtctc tgactgccct gtggggaggg tcttgcctta acatcccttg 120 catttggctg caaagaaatc tgcttggaag aaggggttac gctgtttggc cgggcagaaa 180 ctccgctgag cagaacttgc cgccagaatg ctcctcctgt tgctgagtat catcgtcctc 240 cacgtcgcgg tgctggtgct gctgttcgtc tccacgatcg tcagccaatg gatcgtgggc 300 aatggacacg caactgatct ctggcagaac tgtagcacct cttcctcagg aaatgtccac 360 cactgtttct catcatcacc aaacgaatgg ctgcagtctg tccaggccac catgatcctg 420 tcgatcatct tcagcattct gtctctgttc ctgttcttct gccaactctt caccctcacc 480 aaggggggca ggttttacat cactggaatc ttccaaattc ttgctggtct gtgcgtgatg 540 agtgctgcgg ccatctacac ggtgaggcac ccggagtggc atctcaactc ggattactcc 600 tacggtttcg cctacatcct ggcctgggtg gccttccccc tggcccttct cagcggtgtc 660 atctatgtga tcttgcggaa acgcgaatga ggcgcccaga cggtctgtct gaggctctga 720 gcgtacatag ggaagggagg aagggaaaac agaaagcaga caaagaaaaa agagctagcc 780 caaaatccca aactcaaacc aaaccaaaca gaaagcagtg gaggtggggg ttgctgttga 840 ttgaagatgt atataatatc tccggtttat aaaacctatt tataacactt tttacatata 900 tgtacatagt attgtttgct ttttatgttg accatcagcc tcgtgttgag ccttaaagaa 960 gtagctaagg aactttacat cctaacagta taatccagct cagtattttt gttttgtttt 1020 ttgtttgttt gttttgtttt acccagaaat aagataactc catctcgccc cttccctttc 1080 atctgaaaga agatacctcc ctcccagtcc acctcattta gaaaaccaaa gtgtgggtag 1140 aaaccccaaa tgtccaaaag cccttttctg gtgggtgacc cagtgcatcc aacagaaaca 1200 gccgctgccc gaacctctgt gtgaagcttt acgcgcacac ggacaaaatg cccaaactgg 1260 agcccttgca aaaacacggc ttgtggcatt ggcatacttg cccttacagg tggagtatct 1320 tcgtcacaca tctaaatgag aaatcagtga caacaagtct ttgaaatggt gctatggatt 1380 taccattcct tattatcact aatcatctaa acaactcact ggaaatccaa ttaacaattt 1440 tacaacataa gatagaatgg agacctgaat aattctgtgt aatataaatg gtttataact 1500 gcttttgtac ctagctaggc tgctattatt actataatga gtaaatcata aagccttcat 1560 cactcccaca tttttcttac ggtcggagca tcagaacaag cgtctagact ccttgggacc 1620 gtgagttcct agagcttggc tgggtctagg ctgttctgtg cctccaagga ctgtctggca 1680 atgacttgta ttggccacca actgtagatg tatatatggt gcccttctga tgctaagact 1740 ccagaccttt tgtttttgct ttgcattttc tgattttata ccaactgtgt ggactaagat 1800 gcattaaaat aaacatcaga gtaactca 1828 <210> 9 <211> 810 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Myelin Protein Zero (MPZ): GenBank: AK313555.1 <400> 9 agttcctggt cccccacttt ctcaacccca cagatgctcc gggcccctgc ccctgcccca 60 gctatggctc ctggggctcc ctcatccagc cccagcccta tcctggctgt gctgctcttc 120 tcttctttgg tgctgtcccc ggcccaggcc atcgtggttt acaccgacag ggaggtccat 180 ggtgctgtgg gctcccgggt gaccctgcac tgctccttct ggtccagtga gtgggtctca 240 gatgacatct ccttcacctg gcgctaccag cccgaagggg gcagagatgc catttcgatc 300 ttccactatg ccaagggaca accctacatt gacgaggtgg ggaccttcaa agagcgcatc 360 cagtgggtag gggaccctcg ctggaaggat ggctccattg tcatacacaa cctagactac 420 agtgacaatg gcacgttcac ttgtgacgtc aaaaaccctc cagacatagt gggcaagacc 480 tctcaggtca cgctgtatgt ctttgaaaaa gtgccaacta ggtacggggt cgttctggga 540 gctgtgatcg ggggtgtcct cggggtggtg ctgttgctgc tgctgctttt ctacgtggtt 600 cggtactgct ggctacgcag gcaggcggcc ctgcagagga ggctcagtgc tatggagaag 660 gggaaattgc acaagccagg aaaggacgcg tcgaagcgcg ggcggcagac gccagtgctg 720 tatgcaatgc tggaccacag cagaagcacc aaagctgtca gtgagaagaa ggccaagggg 780 ctgggggagt ctcgcaagga taagaaatag 810 <210> 10 <211> 2979 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Early Growth Response 2 (EGR2): NCBI Reference Sequence: NM_000399.5 <400> 10 aactgagcga ggagcaattg attaatagct cggcgagggg actcactgac tgttataata 60 acactacacc agcaactcct ggcttcccag cagccggaac acagacagga gagagtcagt 120 ggcaaataga catttttctt atttcttaaa aaacagcaac ttgtttgcta cttttatttc 180 tgttgatttt tttttcttgg tgtgtgtggt ggttgttttt aagtgtggag ggcaaaagga 240 gataccatcc caggctcagt ccaacccctc tccaaaacgg cttttctgac actccaggta 300 gcgagggagt tgggtctcca ggttgtgcga ggagcaaatg atgaccgcca aggccgtaga 360 caaaatccca gtaactctca gtggttttgt gcaccagctg tctgacaaca tctacccggt 420 ggaggacctc gccgccacgt cggtgaccat ctttcccaat gccgaactgg gaggcccctt 480 tgaccagatg aacggagtgg ccggagatgg catgatcaac attgacatga ctggagagaa 540 gaggtcgttg gatctcccat atcccagcag ctttgctccc gtctctgcac ctagaaacca 600 gaccttcact tacatgggca agttctccat tgaccctcag taccctggtg ccagctgcta 660 cccagaaggc ataatcaata ttgtgagtgc aggcatcttg caaggggtca cttccccagc 720 ttcaaccaca gcctcatcca gcgtcacctc tgcctccccc aacccactgg ccacaggacc 780 cctgggtgtg tgcaccatgt cccagaccca gcctgacctg gaccacctgt actctccgcc 840 accgcctcct cctccttatt ctggctgtgc aggagacctc taccaggacc cttctgcgtt 900 cctgtcagca gccaccacct ccacctcttc ctctctggcc tacccaccac ctccttccta 960 tccatccccc aagccagcca cggacccagg tctcttccca atgatcccag actatcctgg 1020 attctttcca tctcagtgcc agagagacct acatggtaca gctggcccag accgtaagcc 1080 ctttccctgc ccactggaca ccctgcgggt gccccctcca ctcactccac tctctacaat 1140 ccgtaacttt accctggggg gccccagtgc tggggtgacc ggaccagggg ccagtggagg 1200 cagcgaggga ccccggctgc ctggtagcag ctcagcagca gcagcagccg ccgccgccgc 1260 cgcctataac ccacaccacc tgccactgcg gcccattctg aggcctcgca agtaccccaa 1320 cagacccagc aagacgccgg tgcacgagag gccctacccg tgcccagcag aaggctgcga 1380 ccggcggttc tcccgctctg acgagctgac acggcacatc cgaatccaca ctgggcataa 1440 gcccttccag tgtcggatct gcatgcgcaa cttcagccgc agtgaccacc tcaccaccca 1500 tatccgcacc cacaccggtg agaagccctt cgcctgtgac tactgtggcc gaaagtttgc 1560 ccggagtgat gagaggaagc gccacaccaa gatccacctg agacagaaag agcggaaaag 1620 cagtgccccc tctgcatcgg tgccagcccc ctctacagcc tcctgctctg ggggcgtgca 1680 gcctgggggt accctgtgca gcagtaacag cagcagtctt ggcggagggc cgctcgcccc 1740 ttgctcctct cggacccgga caccttgaga tgagactcag gctgatacac cagctcccaa 1800 aggtcccgga ggccctttgt ccactggagc tgcacaacaa acactaccac cctttcctgt 1860 ccctctctcc ctttgttggg caaagggctt tggtggagct agcactgccc cctttccacc 1920 tagaagcagg ttcttcctaa aacttagccc attctagtct ctcttaggtg agttgactat 1980 caacccaagg caaaggggag gctcagaagg aggtggtgtg gggacccctg gccaagaggg 2040 ctgaggtctg accctgcttt aaagggttgt ttgactaggt tttgctaccc cacttcccct 2100 tattttgacc catcacaggt ttttgaccct ggatgtcaga gttgatctaa gacgttttct 2160 acaataggtt gggagatgct gatcccttca agtggggaca gcaaaaagac aagcaaaact 2220 gatgtgcact ttatggcttg ggactgattt gggggacatt gtacagtgag tgaagtatag 2280 cctttatgcc acactctgtg gccctaaaat ggtgaatcag agcatatcta gttgtctcaa 2340 cccttgaagc aatatgtatt ataaactcag agaacagaag tgcaatgtga tgggaggaac 2400 atagcaatat ctgctccttt tcgagttgtt tgagaaatgt aggctatttt ttcagtgtat 2460 atccactcag attttgtgta tttttgatgt acactgttct ctaaattctg aatctttggg 2520 aaaaaatgta aagcatttat gatctcagag gttaacttat ttaaggggga tgtacatata 2580 ttctctgaaa ctaggatgca tgcaattgtg ttggaagtgt ccttggtgcc ttgtgtgatg 2640 tagacaatgt tacaaggtct gcatgtaaat gggttgcctt attatggaga aaaaaaatca 2700 ctccctgagt ttagtatggc tgtatatttc tgcctattaa tatttggaat tttttttaga 2760 aagtatattt ttgtatgctt tgttttgtga cttaaaagtg ttacctttgt agtcaaattt 2820 cagataagaa tgtacataat gttaccggag ctgatttgtt tggtcattag ctcttaatag 2880 ttgtgaaaaa ataaatctat tctaacgcaa aaccactaac tgaagttcag ataatggatg 2940 gtttgtgact atagtgtaaa taaatacttt tcaacaata 2979 <210> 11 <211> 1077 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Ganglioside induced differentiation associated protein 1 (GDAP1): NCBI Reference Sequence: NM_018972.3 <400> 11 atggctgaga ggcaggaaga gcagagaggg agcccgccct tgagggcgga aggcaaggcc 60 gacgcggagg ttaagctcat tctgtaccat tggacgcatt ccttcagctc tcaaaaggtg 120 cgcttggtaa ttgctgaaaa ggcattgaag tgcgaggaac atgatgtaag tctgcccttg 180 agtgagcaca atgagccttg gtttatgcgt ttgaactcaa ctggagaagt gcctgtcctt 240 atccacgggg aaaacataat ttgtgaggcc actcagatca ttgattatct tgaacagact 300 ttcctggatg aaagaacacc caggttaatg cctgataaag aaagcatgta ttacccacgg 360 gtacaacatt accgagagct gcttgactcc ttgccaatgg atgcctatac acatggctgc 420 attttacatc ctgagttaac tgtggactcc atgatcccgg cttatgcaac tacaaggatt 480 cgtagccaaa ttggaaacac agagtctgag ctgaagaaac ttgctgaaga aaacccagat 540 ttacaagaag catacattgc aaaacagaaa cgacttaaat caaagctgct tgatcatgac 600 aatgtcaagt atttgaagaa aattcttgat gagttggaga aagtcttgga tcaggttgaa 660 actgaattgc aaagaagaaa tgaagaaacc ccagaagagg gccagcaacc ttggctctgc 720 ggtgaatcct tcaccctggc agacgtctca ctcgctgtca cattgcatcg actgaagttc 780 ctggggtttg caaggagaaa ctggggaaac ggaaagcgac caaacttgga aacctattac 840 gagcgtgtct tgaagagaaa aacatttaac aaggttttag gacatgtcaa caatatatta 900 atctctgcag tgctgccaac agcattccgg gtggccaaga aaagggcccc aaaagttctt 960 ggcacgaccc ttgtggttgg tttgcttgca ggagtgggat attttgcttt tatgcttttc 1020 agaaagaggc ttggcagcat gatattagca tttagaccca gaccaaatta tttctag 1077 <210> 12 <211> 1185 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> N-Myc downstream regulated 1 (NDRG1): NCBI Reference Sequence: NM_001135242.1 <400> 12 atgtctcggg agatgcagga tgtagacctc gctgaggtga agcctttggt ggagaaaggg 60 gagaccatca ccggcctcct gcaagagttt gatgtccagg agcaggacat cgagacttta 120 catggctctg ttcacgtcac gctgtgtggg actcccaagg gaaaccggcc tgtcatcctc 180 acctaccatg acatcggcat gaaccacaaa acctgctaca accccctctt caactacgag 240 gacatgcagg agatcaccca gcactttgcc gtctgccacg tggacgcccc tggccagcag 300 gacggcgcag cctccttccc cgcagggtac atgtacccct ccatggatca gctggctgaa 360 atgcttcctg gagtccttca acagtttggg ctgaaaagca ttattggcat gggaacagga 420 gcaggcgcct acatcctaac tcgatttgct ctaaacaacc ctgagatggt ggagggcctt 480 gtccttatca acgtgaaccc ttgtgcggaa ggctggatgg actgggccgc ctccaagatc 540 tcaggatgga cccaagctct gccggacatg gtggtgtccc acctttttgg gaaggaagaa 600 atgcagagta acgtggaagt ggtccacacc taccgccagc acattgtgaa tgacatgaac 660 cccggcaacc tgcacctgtt catcaatgcc tacaacagcc ggcgcgacct ggagattgag 720 cgaccaatgc cgggaaccca cacagtcacc ctgcagtgcc ctgctctgtt ggtggttggg 780 gacagctcgc ctgcagtgga tgccgtggtg gagtgcaact caaaattgga cccaacaaag 840 accactctcc tcaagatggc ggactgtggc ggcctcccgc agatctccca gccggccaag 900 ctcgctgagg ccttcaagta cttcgtgcag ggcatgggat acatgccctc ggctagcatg 960 acccgcctga tgcggtcccg cacagcctct ggttccagcg tcacttctct ggatggcacc 1020 cgcagccgct cccacaccag cgagggcacc cgaagccgct cccacaccag cgagggcacc 1080 cgcagccgct cgcacaccag cgagggggcc cacctggaca tcacccccaa ctcgggtgct 1140 gctgggaaca gcgccgggcc caagtccatg gaggtctcct gctag 1185 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P0-Cx32 forward primer <400> 13 aggggtaccc ttcctgttca gact 24 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P0-Cx32 reverse primer <400> 14 ccgctcgagg gatcctcagc ag 22 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KpnI-P0 forward primer <400> 15 ggggtaccgc tctcaggcaa g 21 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AgeI-P0 reverse primer <400> 16 aaaccggttg gcagagcgtc tgt 23 <210> 17 <211> 6324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV-human-Mpz-GJB1 construct <400> 17 tagctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gcccgggcaa agcccgggcg tcgggcgacc 60 tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc 120 actaggggtt ccttgtagtt aatgattaac ccgccatgct acttatctac gtagccatgc 180 tctaggtacc gcctggcata aacttcattt attaaagttt attttgtctt taatctctca 240 tataacttag tcttcctgat attgcagctg tgtgtgcccc tcttttgtac tcccagcatt 300 ttgttcatta ctaaaggaag tgtcatggct tattatactt gattgttgat gggtttgtcc 360 tctgatcttc ccatctccac ctccccaaac caaattttca actccttgct ggaaggactt 420 aatttttatt cctctctcta ttacctgcat tctcatactt tacatattgc tggcacttaa 480 tacaattttg tagccttgaa ataaattgaa atggacttaa acagcagcat gaagcactga 540 aggacttctt gacaaacgga aaggtcaggg gcttcttgcc tggaaatagt ccagtggaga 600 aaaacttctg tctgggaaga atcgcacagg atgaagggag gtgcggggaa aaaaactccc 660 ataggacttg gtcatctcaa gaagtctgta atgcagccca cattagagga gataacaggg 720 gatatcctat tttcagagtt ctctggggga aacctccctc tagttcctag ggctgtgagg 780 cagcctctct caggcaagga ggctgaggag aaatcccttt ttatggcctt taaattgagg 840 ttccatatct atccctcaga gaagtgtgtc tgtgtccctg tttttgtccc tctccctcac 900 caccccccac aacattccag cctggggcag ggggaggcca gtggacacaa agccctctgt 960 gtatggggtg gtatgtgtcc ccccacccct ccacccagac tatacaatgc cccttctgct 1020 ccctgcactc tgcccccctc cccaccacct ctcaactgca catgccaggc tgcaattggt 1080 tactggctga ggacagcccc ctcatgctgg ggccctaggg gattttaagc aggttccagg 1140 aaccccccgt tcagttcctg gtcccccact ttctcaaccc cacagatgct ccgggcccct 1200 gcccctgccc cagcaccggt cgcggatcct gaggcaggat gaactggaca ggtttgtaca 1260 ccttgctcag tggcgtgaac cggcattcta ctgccattgg ccgagtatgg ctctcggtca 1320 tcttcatctt cagaatcatg gtgctggtgg tggctgcaga gagtgtgtgg ggtgatgaga 1380 aatcttcctt catctgcaac acactccagc ctggctgcaa cagcgtttgc tatgaccaat 1440 tcttccccat ctcccatgtg cggctgtggt ccctgcagct catcctagtt tccaccccag 1500 ctctcctcgt ggccatgcac gtggctcacc agcaacacat agagaagaaa atgctacggc 1560 ttgagggcca tggggacccc ctacacctgg aggaggtgaa gaggcacaag gtccacatct 1620 cagggacact gtggtggacc tatgtcatca gcgtggtgtt ccggctgttg tttgaggccg 1680 tcttcatgta tgtcttttat ctgctctacc ctggctatgc catggtgcgg ctggtcaagt 1740 gcgacgtcta cccctgcccc aacacagtgg actgcttcgt gtcccgcccc accgagaaaa 1800 ccgtcttcac cgtcttcatg ctagctgcct ctggcatctg catcatcctc aatgtggccg 1860 aggtggtgta cctcatcatc cgggcctgtg cccgccgagc ccagcgccgc tccaatccac 1920 cttcccgcaa gggctcgggc ttcggccacc gcctctcacc tgaatacaag cagaatgaga 1980 tcaacaagct gctgagtgag caggatggct ccctgaaaga catactgcgc cgcagccctg 2040 gcaccggggc tgggctggct gaaaagagcg accgctgctc ggcctgctga ctcgagatcg 2100 atatccatca cactggcggc cgcaagctta tcgataatca acctctggat tacaaaattt 2160 gtgaaagatt gactggtatt cttaactatg ttgctccttt tacgctatgt ggatacgctg 2220 ctttaatgcc tttgtatcat gctattgctt cccgtatggc tttcattttc tcctccttgt 2280 ataaatcctg gttgctgtct ctttatgagg agttgtggcc cgttgtcagg caacgtggcg 2340 tggtgtgcac tgtgtttgct gacgcaaccc ccactggttg gggcattgcc accacctgtc 2400 agctcctttc cgggactttc gctttccccc tccctattgc cacggcggaa ctcatcgccg 2460 cctgccttgc ccgctgctgg acaggggctc ggctgttggg cactgacaat tccgtggtgt 2520 tgtcggggaa atcatcgtcc tttccttggc tgctcgcctg tgttgccacc tggattctgc 2580 gcgggacgtc cttctgctac gtcccttcgg ccctcaatcc agcggacctt ccttcccgcg 2640 gcctgctgcc ggctctgcgg cctcttccgc gtcttcgcct tcgccctcag acgagtcgga 2700 tctccctttg ggccgcctcc ccgcatcgat accgtcgact cgctgatcag cctcgactgt 2760 gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga 2820 aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag 2880 taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga 2940 agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg gcttctgagg cggaaagaac 3000 cagctggggc tcgactagag catggctacg tagataagta gcatggcggg ttaatcatta 3060 actacaagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca 3120 ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga 3180 gcgagcgagc gcgcagagct ttttgcaaaa gcctaggcct ccaaaaaagc ctcctcacta 3240 cttctggaat agctcagagg ccgaggcggc ctcggcctct gcataaataa aaaaaattag 3300 tcagccatgg ggcggagaat gggcggaact gggcggagtt aggggcggga tgggcggagt 3360 taggggcggg actatggttg ctgactaatt gagatgcatg ctttgcatac ttctgcctgc 3420 tggggagcct ggggactttc cacacctggt tgctgactaa ttgagatgca tgctttgcat 3480 acttctgcct gctggggagc ctggggactt tccacaccct aactgacaca cattccacag 3540 ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc 3600 gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 3660 cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 3720 tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 3780 cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 3840 aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 3900 cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 3960 gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 4020 ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 4080 cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 4140 aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 4200 tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 4260 ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 4320 tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 4380 ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 4440 agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 4500 atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca 4560 cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 4620 ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac 4680 ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc 4740 agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct 4800 agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc 4860 gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg 4920 cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc 4980 gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat 5040 tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag 5100 tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat 5160 aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg 5220 cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca 5280 cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga 5340 aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc 5400 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cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca agcccgtcag 7260 ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggctggctta actatgcggc atcagagcag 7320 attgtactga gagtgcacca ttcgacgctc tcccttatgc gactcctgca ttaggaagca 7380 gcccagtagt aggttgaggc cgttgagcac cgccgccgca aggaatggtg catgcaagga 7440 gatggcgccc aacagtcccc cggccacggg gcctgccacc atacccacgc cgaaacaagc 7500 gctcatgagc ccgaagtggc gagcccgatc ttccccatcg gtgatgtcgg cgatataggc 7560 gccagcaacc gcacctgtgg cgccggtgat gccggccacg atgcgtccgg cgtagaggat 7620 ctggctagcg atgaccctgc tgattggttc gctgaccatt tccgggtgcg ggacggcgtt 7680 accagaaact cagaaggttc gtccaaccaa accgactctg acggcagttt acgagagaga 7740 tgatagggtc tgcttcagta agccagatgc tacacaatta ggcttgtaca tattgtcgtt 7800 agaacgcggc tacaattaat acataacctt atgtatcata cacatacgat ttaggtgaca 7860 ctatagaata cacggaatta attc 7884 <210> 22 <211> 429 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mini-human hP0 promoter <400> 22 tctctcaggc aaggaggctg aggagaaatc cctttttatg gcctttaaat tgaggttcca 60 tatctatccc tcagagaagt gtgtctgtgt ccctgttttt gtccctctcc ctcaccaccc 120 cccacaacat tccagcctgg ggcaggggga ggccagtgga cacaaagccc tctgtgtatg 180 gggtggtatg tgtcccccca cccctccacc cagactatac aatgcccctt ctgctccctg 240 cactctgccc ccctccccac cacctctcaa ctgcacatgc caggctgcaa ttggttactg 300 gctgaggaca gccccctcat gctggggccc taggggattt taagcaggtt ccaggaaccc 360 cccgttcagt tcctggtccc ccactttctc aaccccacag atgctccggg cccctgcccc 420 tgccccagc 429 <210> 23 <211> 5567 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV-human-miniMpz-Egfp <400> 23 tagctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gcccgggcaa agcccgggcg tcgggcgacc 60 tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc 120 actaggggtt ccttgtagtt aatgattaac ccgccatgct acttatctac gtagccatgc 180 tctaggtacc tctctcaggc aaggaggctg aggagaaatc cctttttatg gcctttaaat 240 tgaggttcca tatctatccc tcagagaagt gtgtctgtgt ccctgttttt gtccctctcc 300 ctcaccaccc cccacaacat tccagcctgg ggcaggggga ggccagtgga cacaaagccc 360 tctgtgtatg gggtggtatg tgtcccccca cccctccacc cagactatac aatgcccctt 420 ctgctccctg cactctgccc ccctccccac cacctctcaa ctgcacatgc caggctgcaa 480 ttggttactg gctgaggaca gccccctcat gctggggccc taggggattt taagcaggtt 540 ccaggaaccc cccgttcagt tcctggtccc ccactttctc aaccccacag atgctccggg 600 cccctgcccc tgccccagca ccggtcgcca ccatggtgag caagggcgag gagctgttca 660 ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg 720 tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca 780 ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc 840 agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc 900 ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc 960 gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg 1020 acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga gtacaactac aacagccaca 1080 acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc 1140 acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg 1200 gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag cacccagtcc gccctgagca 1260 aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga 1320 tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt aaagcggccc tagatcaagc ttatcgataa 1380 tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt attcttaact atgttgctcc 1440 ttttacgcta tgtggatacg ctgctttaat gcctttgtat catgctattg cttcccgtat 1500 ggctttcatt ttctcctcct tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg aggagttgtg 1560 gcccgttgtc aggcaacgtg gcgtggtgtg cactgtgttt gctgacgcaa cccccactgg 1620 ttggggcatt gccaccacct gtcagctcct ttccgggact ttcgctttcc ccctccctat 1680 tgccacggcg gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt 1740 gggcactgac aattccgtgg tgttgtcggg gaaatcatcg tcctttcctt ggctgctcgc 1800 ctgtgttgcc acctggattc tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt cggccctcaa 1860 tccagcggac cttccttccc gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc cgcgtcttcg 1920 ccttcgccct cagacgagtc ggatctccct ttgggccgcc tccccgcatc gataccgtcg 1980 actcgctgat cagcctcgac tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc 2040 cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag 2100 gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag 2160 gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct 2220 atggcttctg aggcggaaag aaccagctgg ggctcgacta gagcatggct acgtagataa 2280 gtagcatggc gggttaatca ttaactacaa ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc 2340 ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg 2400 ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcaga gctttttgca aaagcctagg 2460 cctccaaaaa agcctcctca ctacttctgg aatagctcag aggccgaggc ggcctcggcc 2520 tctgcataaa taaaaaaaat tagtcagcca tggggcggag aatgggcgga actgggcgga 2580 gttaggggcg ggatgggcgg agttaggggc gggactatgg ttgctgacta attgagatgc 2640 atgctttgca tacttctgcc tgctggggag cctggggact ttccacacct ggttgctgac 2700 taattgagat gcatgctttg catacttctg cctgctgggg agcctgggga ctttccacac 2760 cctaactgac acacattcca cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg 2820 gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc 2880 ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag 2940 gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa 3000 aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc 3060 gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc 3120 ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg 3180 cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt 3240 cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc 3300 gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc 3360 cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag 3420 agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg 3480 ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa 3540 ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag 3600 gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact 3660 cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa 3720 attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt 3780 accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag 3840 ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca 3900 gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc 3960 agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt 4020 ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg 4080 ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca 4140 gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg 4200 ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca 4260 tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg 4320 tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct 4380 cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca 4440 tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca 4500 gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg 4560 tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac 4620 ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt 4680 attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc 4740 cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt atcatgacat 4800 taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtct cgcgcgtttc ggtgatgacg 4860 gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg taagcggatg 4920 ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt cggggctggc 4980 ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccattcgacg ctctccctta 5040 tgcgactcct gcattaggaa gcagcccagt agtaggttga ggccgttgag caccgccgcc 5100 gcaaggaatg gtgcatgcaa ggagatggcg cccaacagtc ccccggccac ggggcctgcc 5160 accataccca cgccgaaaca agcgctcatg agcccgaagt ggcgagcccg atcttcccca 5220 tcggtgatgt cggcgatata ggcgccagca accgcacctg tggcgccggt gatgccggcc 5280 acgatgcgtc cggcgtagag gatctggcta gcgatgaccc tgctgattgg ttcgctgacc 5340 atttccgggt gcgggacggc gttaccagaa actcagaagg ttcgtccaac caaaccgact 5400 ctgacggcag tttacgagag agatgatagg gtctgcttca gtaagccaga tgctacacaa 5460 ttaggcttgt acatattgtc gttagaacgc ggctacaatt aatacataac cttatgtatc 5520 atacacatac gatttaggtg acactataga atacacggaa ttaattc 5567 <210> 24 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Minimal synthetic poly A sequence <400> 24 ggagctctcg agaggcctaa taaagagctc agatgcatcg atcagagtgt gttggttttt 60 tgtgtgagat ct 72 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KpnhP0 forward primer <400> 25 aggggtaccg cctggcataa ac 22 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AgehP0 reverse primer <400> 26 aatttaccgg tgctggggca g 21

Claims (34)

  1. 바이러스 벡터가 제1 폴리뉴클레오티드로 전사될 수 있는 제1 핵산 서열을 포함하고 바이러스 벡터가 AAV 벡터인, 슈반(Schwann) 세포와 관련된 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 슈반 세포와 관련된 질환의 치료 또는 예방에서의 사용을 위한 바이러스 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드가 슈반 세포 특이적 프로모터, 선택적으로 미엘린 특이적 프로모터의 제어 하에 있고, 선택적으로 미엘린 특이적 프로모터가 하기인, 사용을 위한 바이러스 벡터:
    a) 전장 미엘린 단백질 제로(Mpz: myelin protein zero) 프로모터로서, 선택적으로 전장 Mpz 프로모터가 전장 랫트 또는 전장 인간 Mpz 프로모터인 전장 미엘린 단백질 제로 프로모터,
    선택적으로 당해 프로모터는 SEQ ID NO. 4 또는 SEQ ID NO. 18과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%이고, 선택적으로 SEQ ID NO. 4 또는 SEQ ID NO. 18과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%인 서열을 가짐; 또는
    b) 최소 미엘린 단백질 제로(miniMpz) 프로모터로서, 선택적으로 최소 Mpz 프로모터가 랫트 또는 인간 최소 Mpz 프로모터인 최소 미엘린 단백질 제로 프로모터, 선택적으로 당해 프로모터는 SEQ ID NO. 5 또는 SEQ ID NO. 22와 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%이고, 선택적으로 SEQ ID NO. 5 또는 SEQ ID NO. 22와 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%인 서열을 가짐.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드의 발현이 하기와 같은 프로모터의 제어 하에 있는, 사용을 위한 바이러스 벡터:
    a) 길이 100bp 내지 1100bp이고, 선택적으로 프로모터가 길이 200bp 내지 900bp, 길이 300bp 내지 800bp, 길이 400bp 내지 700bp의 범위이고, 선택적으로 프로모터가 길이 500bp 내지 600bp의 범위이고, 선택적으로 프로모터가 길이 410bp임; 및/또는
    b) 길이 1100bp, 1000bp, 900bp, 800bp, 700bp, 600bp, 500bp, 450bp, 400bp, 350bp, 300bp, 250bp, 200bp, 150bp, 100bp 미만임.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 벡터가 AAV9 및 AAVrh10을 포함하는 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 AAV 벡터가 AAV9인, 사용을 위한 바이러스 벡터.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 핵산이 제1 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하고 이로 번역되는, 사용을 위한 바이러스 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 제1 핵산이 하기 a) 또는 b)를 포함하고,
    a) 선택적으로 하기 유전자 중 어느 하나를 포함하거나 이로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 신경장해-관련 유전자의 야생형 또는 치료적으로 유익한 서열: 갭 접합 베타 1(GJB1); SH3 도메인 및 테트라트리코펩티드 반복체 2(SH3TC2); 말초 미엘린 단백질 22(PMP22); 미엘린 단백질 제로(MPZ); 조기 성장 반응 2(EGR2); 강글리오시드 유도된 분화 관련 단백질 1(GDAP1); N-Myc 다운스트림 조절된 1(NDRG1); 또는 탈미엘린성(demyelinating) 신경장해 및 슈반 세포 기능장애와 관련된 다른 유전자; 또는
    b) 신경장해-관련 유전자, 예를 들어 하기 유전자 중 하나의 야생형 서열과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%이고, 선택적으로 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%인 서열: 갭 접합 베타 1(GJB1); SH3 도메인 및 테트라트리코펩티드 반복체 2(SH3TC2); 말초 미엘린 단백질 22(PMP22); 미엘린 단백질 제로(MPZ); 조기 성장 반응 2(EGR2); 강글리오시드 유도된 분화 관련 단백질 1(GDAP1); N-Myc 다운스트림 조절된 1(NDRG1); 또는 탈미엘린성 신경장해 및 슈반 세포 기능장애와 관련된 다른 유전자;
    선택적으로 제1 핵산이 SEQ ID NO. 6 내지 12와 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%이고, 선택적으로 SEQ ID NO. 6 내지 12와 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%인 서열을 포함하는, 사용을 위한 바이러스 벡터.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 제1 핵산이, 하나 이상의 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드로 전사되는 개방형 해독 프레임(ORF: open reading frame) 또는 cDNA의 야생형 형태를 포함하는, 사용을 위한 바이러스 벡터로서, 선택적으로 상기 폴리펩티드는 코넥신-32(Cx32); SH3 도메인 및 테트라트리코펩티드 반복체 2(SH3TC2); 말초 미엘린 단백질 22(PMP22); 미엘린 단백질 제로(MPZ); 조기 성장 반응 2(EGR2); 강글리오시드 유도된 분화 관련 단백질 1(GDAP1); N-Myc 다운스트림 조절된 1(NDRG1)을 포함하거나 이로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 사용을 위한 바이러스 벡터.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 제1 핵산으로부터의 발현을 유도할 수 있고, 선택적으로 제1 폴리펩티드의 발현을 유도할 수 있고, 선택적으로 제1 폴리펩티드가 코넥신-32(Cx32); SH3 도메인 및 테트라트리코펩티드 반복체 2(SH3TC2); 말초 미엘린 단백질 22(PMP22); 미엘린 단백질 제로(MPZ); 조기 성장 반응 2(EGR2); 강글리오시드 유도된 분화 관련 단백질 1(GDAP1); N-Myc 다운스트림 조절된 1(NDRG1)을 포함하거나 이로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 사용을 위한 바이러스 벡터.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 핵산이 하기 중 하나 이상을 인코딩하는, 사용을 위한 바이러스 벡터: 영양 인자(예를 들어 BDNF, GDNF, NT-3, VEGF), 재생 인자(예를 들어 안지오제닌, Oct-6, Egr2, Sox-10), 성장 인자(예를 들어 IGF).
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 핵산이 폴리펩티드를 인코딩하지 않고, 선택적으로 제1 폴리뉴클레오티드가 비코딩(non-coding) RNA이고, 선택적으로
    비코딩 RNA가 짧은 헤어핀(short hairpin) RNA(shRNA); 마이크로RNA(miRNA); 가이드 RNA(gRNA)인, 사용을 위한 바이러스 벡터.
  11. 제10항에 있어서, 바이러스 벡터가 표적 유기체에 있고, 비코딩 RNA의 발현이 표적 폴리뉴클레오티드의 발현의 감소를 야기하고, 선택적으로 표적 폴리뉴클레오티드가 표적 유기체에 배치된, 선택적으로 표적 유기체 내의 세포에 배치된 유전자인, 사용을 위한 바이러스 벡터.
  12. 제11항에 있어서, 표적 유기체에서 표적 폴리뉴클레오티드의 발현 또는 과발현이 슈반 세포와 관련된 질환과 관련되는 것으로 여겨지고, 선택적으로 질환이 우성 탈미엘린성 신경장해(CMT1)이고, 선택적으로 표적 폴리뉴클레오티드가 미엘린 단백질 제로(Mpz/P0)의 돌연변이된 대립유전자(allele)이고 슈반 세포와 관련된 질환이 CMT1B이거나, 표적 폴리뉴클레오티드가 CMT1과 관련된 또다른 우성 유전자인, 사용을 위한 바이러스 벡터.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 슈반 세포와 관련된 질환이 슈반 세포에 의한 미엘린초(myelin sheath)의 파괴 및/또는 감소된 형성을 야기하고, 선택적으로
    질환이 샤르코-마리-투스 질환(CMT: Charcot-Marie-Tooth disease); 압박 마비 유전 신경장해(HNPP: hereditary neuropathy with liability to pressure palsies); 당뇨병성 및 다른 독성 말초 신경장해; 운동 뉴런 질환(MND: motor neuron disease)으로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
    바람직하게는 질환이 샤르코-마리-투스 질환(CMT)이고, 선택적으로
    질환이 샤르코-마리-투스 유형 1X(CMT1X); 샤르코-마리-투스 유형 1A 내지 1F(즉, CMT1A, CMT1B, CMT1C, CMT1D, CMT1E 및 CMT1F); 샤르코-마리-투스 유형 4A 내지 4H(즉, CMT4A, CMT4B, CMT4C, CMT4D, CMT4E, CMT4F, CMT4G 및 CMT4H)로부터 선택되고, 선택적으로
    질환이 샤르코-마리-투스 유형 1X(CMT1X)이거나, 또는
    질환이 샤르코-마리-투스 유형 4C(CMT4C)인, 사용을 위한 바이러스 벡터.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 이전 대상체에서의 슈반 세포에 의한 미엘린초의 형성과 비교했을 때, 바이러스 벡터의 투여가 슈반 세포의 개선된 기능 및/또는 슈반 세포에 의한 미엘린초의 증가된 형성을 야기하고, 선택적으로
    슈반 세포에 의한 미엘린초의 증가된 형성이 말초 신경의 개선된 미엘린화를 야기하는, 사용을 위한 바이러스 벡터.
  15. 제14항에 있어서, 슈반 세포의 개선된 기능 및/또는 슈반 세포에 의한 미엘린초의 증가된 형성이 하기 매개변수:
    a) 근육 강도;
    b) 좌골 신경 전도 속도; 및/또는
    c) 혈액 바이오마커의 반응
    중 어느 하나 이상의 평가에 의해 검출되고,
    슈반 세포의 개선된 기능 및/또는 슈반 세포에 의한 미엘린초의 증가된 형성이 치료 이전의 대상체 또는 비치료된 대상체와 비교했을 때, 상기 매개변수 중 어느 하나 이상의 개선을 야기하는, 사용을 위한 바이러스 벡터.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, AAV가 척수강내 주사 또는 정맥내 주사에 의해 대상체에 투여되고, 바람직하게는 AAV가 척수강내 주사에 의해 투여되고, 선택적으로
    AAV가 하기 경로: 요추 척수강내 주사; 흉부 척수강내 주사; 자궁경부 척수강내 주사 중 하나에 의해 투여되고, 바람직하게는 바이러스 벡터가 요추 척수강내 주사에 의해 투여되는, 사용을 위한 바이러스 벡터.
  17. 제16항에 있어서, AAV가 단일 척수강내 주사에 의해 투여되는, 사용을 위한 바이러스 벡터.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 슈반 세포와 관련된 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체가 인간 대상체인, 사용을 위한 바이러스 벡터.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 의해 정의된 바이러스 벡터.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 세포로서, 선택적으로 슈반 세포인, 세포.
  21. 최소 미엘린 특이적 프로모터로서, 최소 미엘린 단백질 제로(miniMpz)이고, 선택적으로 최소 미엘린 특이적 프로모터가 SEQ ID NO. 5 또는 SEQ ID NO. 22와 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%이고, 선택적으로 SEQ ID NO. 5 또는 SEQ ID NO: 22와 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%인 서열을 갖거나, 최소 미엘린 특이적 프로모터가 SEQ ID NO. 5 또는 SEQ ID NO. 22의 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 최소 미엘린 특이적 프로모터.
  22. 인간 최소 미엘린 특이적 프로모터가 SEQ ID NO. 22와 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%, 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%인 서열 상동성을 갖는, 인간 최소 미엘린 특이적 프로모터.
  23. 폴리뉴클레오티드 작제물(construct)로서:
    슈반 세포 특이적 프로모터인 제1 핵산 서열로서, 선택적으로 슈반 세포 특이적 프로모터가,
    a) 전장 Mpz 프로모터, 선택적으로 SEQ ID NO. 4 또는 SEQ ID NO. 18과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%, 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%인 서열을 가지는 전장 Mpz 프로모터; 또는
    b) 최소 슈반 세포 특이적 프로모터, 선택적으로 제21항 또는 제22항에 따른 최소 Mpz 프로모터인, 제2 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 제1 핵산 서열을 포함하고;
    제2 핵산이 제1 폴리뉴클레오티드로 전사되고, 제2 핵산이 a) 개방형 해독 프레임 또는 cDNA 또는 유전자의 다른 요소이거나; b) 비코딩 RNA로 전사되는, 폴리뉴클레오티드 구성체.
  24. 하기를 포함하는 바이러스 벡터:
    a) 제21항 또는 제22항에 따른 최소 미엘린 특이적 프로모터;
    b) 전장 Mpz 프로모터, 선택적으로 SEQ ID NO. 4 또는 SEQ ID NO. 18과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%, 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%인 서열을 가지는 전장 Mpz 프로모터; 또는
    c) 또는 제23항의 폴리뉴클레오티드 작제물.
  25. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항 또는 제24항에 있어서, 벡터가 슈반 세포를 형질도입시키는 능력을 갖고/갖거나
    벡터가 호스트 세포의 게놈에 통합되지 않는, 사용을 위한 바이러스 벡터 또는 바이러스 벡터.
  26. 제25항에 있어서, 하기를 포함하는 바이러스 벡터:
    a) AAV, - 선택적으로 AAV 벡터는 AAV9임 -;
    b) AAV9 벡터, 미엘린 단백질 제로(Mpz) 프로모터 및 EGFP 리포터 유전자를 포함하는 AAV-Mpz.Egfp 벡터, - 선택적으로 당해 프로모터는 SEQ ID NO. 4 또는 SEQ ID NO. 18과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%, 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%인 서열을 가짐 -;
    c) AAV9 벡터, 미엘린 단백질 제로(Mpz) 프로모터 및 갭 접합 베타 1(GJB1) 유전자의 개방형 해독 프레임(ORF)을 포함하는 AAV9-Mpz-GJB1 벡터, - 선택적으로 당해 프로모터는 SEQ ID NO. 4 또는 SEQ ID NO. 18과 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%, 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%인 서열을 가짐 -;
    d) AAV9 벡터, 최소 미엘린 단백질 제로(miniMpz) 프로모터 및 EGFP 리포터 유전자를 포함하는 AAV9-miniMpz.Egfp 벡터, - 선택적으로 miniMPZ 프로모터는 SEQ ID NO. 5 또는 SEQ ID NO. 22와 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%, 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%인 서열 상동성을 가짐 -;
    e) AAV9 벡터, 인간 미엘린 단백질 제로(hP0) 프로모터 및 갭 접합 베타 1(GJB1) 유전자의 개방형 해독 프레임(ORF)을 포함하는 AAV9-인간 Mpz-GJB1 벡터(SEQ ID NO. 17);
    f) AAV9 벡터, 인간 미엘린 단백질 제로(hP0) 프로모터 및 EGFP 리포터 유전자를 포함하는 AAV9-인간 Mpz-Egfp 벡터(SEQ ID NO. 19);
    g) AAV9 벡터, 최소 미엘린 단백질 제로(Mpz) 프로모터 및 SH3TC2 유전자의 개방형 해독 프레임(ORF)을 포함하는 AAV9-miniMpz-SH3TC2.myc.ITR 벡터(SEQ ID NO. 20);
    h) AAV9 벡터, 인간 최소 미엘린 단백질 제로(hP0) 프로모터 및 SH3TC2 유전자의 개방형 해독 프레임(ORF)을 포함하는 AAV9-인간-miniMpz-SH3TC2 벡터(SEQ ID NO. 21);
    i) AAV9 벡터, 인간 최소 미엘린 단백질 제로(hP0) 프로모터 및 EGFP 리포터 유전자를 포함하는 AAV9-인간-miniMpz-Egfp 벡터(SEQ ID NO. 23); 또는
    j) AAV9 벡터, 최소 미엘린 단백질 제로(miniMpz) 프로모터 및 갭 접합 베타 1(GJB1) 유전자의 개방형 해독 프레임(ORF)을 포함하는 AAV9-Mpz-GJB1 벡터, - 선택적으로 miniMpz 프로모터는 SEQ ID NO. 5 또는 SEQ ID NO. 22와 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%, 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%인 서열 상동성을 가짐 -.
  27. 선행하는 항들 중 어느 한 항의 바이러스 벡터를 포함하는 약학 조성물로서, 선택적으로 치료적 적절량의 바이러스 벡터를 포함하고 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 추가로 포함하는, 약학 조성물.
  28. 슈반 세포와 관련된 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조 방법에서의 선행하는 항들 중 어느 한 항에 따른 바이러스 벡터의 용도로서, 선택적으로 질환이 슈반 세포에 의한 미엘린초의 파괴 및/또는 감소된 형성을 야기하고, 선택적으로 질환이 샤르코-마리-투스 질환이고, 선택적으로 샤르코-마리-투스 질환이 샤르코-마리-투스 유형 1X(CMT1X); 샤르코-마리-투스 유형 1A 내지 1F(즉, CMT1A, CMT1B, CMT1C, CMT1D, CMT1E 및 CMT1F); 샤르코-마리-투스 유형 4A 내지 4H(즉, CMT4A, CMT4B, CMT4C, CMT4D, CMT4E, CMT4F, CMT4G 및 CMT4H)을 포함하는 군으로부터 선택되고, 선택적으로
    질환이 샤르코-마리-투스 유형 1X(CMT1X)이거나, 또는
    질환이 샤르코-마리-투스 유형 4C(CMT4C)인, 용도.
  29. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터 또는 폴리뉴클레오티드가 하기 중 어느 하나 이상을 포함하는, CRISPR/Cas9 시스템에서 사용하기 위한, 바이러스 벡터 또는 폴리뉴클레오티드 작제물:
    a) 관심 대상인 유전자를 표적으로 하는 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드;
    b) Cas9 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드;
    c) 관심 대상인 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  30. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 하기에서 사용하기 위한, 바이러스 벡터:
    a) 선택적으로 슈반 세포의 라벨링이 슈반 세포와 관련된 질환의 진단 방법에서 사용될 수 있는, 슈반 세포의 라벨링 방법, 예를 들어 형광 단백질, 예를 들어 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP), 또는 또다른 비형광 리포터를 사용한 라벨링 방법;
    b) 슈반 세포가 대안적 세포 유형(예를 들어 올리고덴드로사이트, 아스트로사이트 또는 뉴론)으로 분화하도록 유도되는 방법; 또는
    c) 선택적으로 부상 또는 외상 이후에, 재생을 지원하기 위해 슈반 세포를 자극하는 것을 필요로 하는 대상체에서의 재생을 지원하기 위해 슈반 세포를 자극하는 방법.
  31. 슈반 세포와 관련된 질환의 예방 또는 치료, 슈반 세포의 라벨링, 또는 슈반 세포의 재생에서 사용하기 위한 키트로서,
    a) 선행하는 항들 중 어느 한 항에 정의된 바이러스 벡터;
    b) 제23항에 의해 정의된 폴리뉴클레오티드 작제물;
    c) 바이러스 벡터;
    d) 제23항에 의해 정의된 폴리뉴클레오티드 작제물을 포함하는 바이러스 벡터;
    e) 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제;
    f) 일회용 주사기, 예를 들어 척수강내 요추 주사에 적합한 일회용 주사기;
    g) 사용 설명서;
    중 하나 이상을 포함하고,
    선택적으로 키트는 선행하는 항들 중 어느 한 항에 의해 정의된 바이러스 벡터 하나 초과를 포함하고, 선택적으로 키트는 선행하는 항들 중 어느 한 항에 의해 정의된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 상이한 바이러스 벡터를 포함하는, 키트.
  32. 슈반 세포와 관련된 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 슈반 세포와 관련된 질환의 치료 또는 예방에서의 사용을 위한 바이러스 벡터로서, 바이러스 벡터가 제1 폴리뉴클레오티드로 전사될 수 있는 제1 핵산 서열을 포함하고, 상기 제1 폴리뉴클레오티드의 발현이 하기의 제어 하에 있는, 사용을 위한 바이러스 벡터:
    a) 미엘린 단백질 제로(Mpz) 프로모터, - 선택적으로 서열 상동성 또는 서열 동일성이 SEQ ID NO. 4 또는 SEQ ID NO. 1과 적어도 75%, 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%인 서열을 가지는 미엘린 단백질 제로(Mpz) 프로모터; 또는
    b) 선택적으로 SEQ ID NO. 5 또는 SEQ ID NO. 22에 정의된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 최소 미엘린 특이적 프로모터(miniMpz), 선택적으로 SEQ ID NO. 5 또는 SEQ ID NO. 22와 서열 상동성 또는 서열 동일성이 적어도 75%, 80%, 또는 82%, 또는 84%, 또는 86%, 또는 88%, 또는 90%, 또는 92%, 또는 94%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 100%인 서열 상동성을 가지는 miniMPZ 프로모터.
  33. 제32항에 있어서, 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터 또는 AAV인, 사용을 위한 바이러스 벡터.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 슈반 세포와 관련된 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서의 슈반 세포와 관련된 질환이 샤르코-마리-투스 질환(CMT)이고, 선택적으로 질환이 샤르코-마리-투스 유형 1X(CMT1X); 샤르코-마리-투스 유형 1A 내지 1F(즉, CMT1A, CMT1B, CMT1C, CMT1D, CMT1E 및 CMT1F); 샤르코-마리-투스 유형 4A 내지 4H(즉, CMT4A, CMT4B, CMT4C, CMT4D, CMT4E, CMT4F, CMT4G 및 CMT4H)로부터 선택되고, 선택적으로
    질환이 샤르코-마리-투스 유형 1X(CMT1X)이거나, 또는
    질환이 샤르코-마리-투스 유형 4C(CMT4C)인, 사용을 위한 바이러스 벡터.
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