KR102093495B1 - C형 간염 바이러스에 대한 키메라 백신 항원 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 C형 간염 바이러스(HCV)에 대한 키메라 백신 항원에 관한 것으로서, 이것은 폴리펩티드 내에 미리 정해진 순서로 위치된 상기 바이러스의 상이한 항원들의 선택된 영역들을 포함한다. 또한, 상기 키메라 항원은 보조 T 헬퍼 림프구를 위한 인공적으로 형성된 특이적 에피토프를 포함할 수 있다. 키메라 항원 및 최종 백신 조성물은 의약 및 제약 산업에서 사용하기에 적합할 뿐만 아니라, HCV에 대한 예방적 및/또는 치료적 사용에도 적합하다. 본 발명의 백신 조성물은 최소한의 수의 성분을 사용하여 바이러스의 상이한 항원들에 대한 강력하고 광범위한 면역 반응을 생성한다.

Description

C형 간염 바이러스에 대한 키메라 백신 항원{CHIMERIC VACCINE ANTIGENS AGAINST HEPATITIS C VIRUS}
본 발명은 의료 분야 및 제약 산업에 관한 것으로서, 특히 C형 간염 바이러스(HCV)에 대한 키메라 항원 및 이들을 포함하는 백신 조성물의 개발에 관한 것이다. 본 발명에서는, 최소한의 수의 성분들이 사용되는데, 이는 HCV 항원의 특정 영역에 대한 정확한 선택과 CD4+ T 림프구에 특이적인 인공 에피토프의 포함이 키메라 항원에 의한 HCV에 대한 강력하며 광범위한 면역 반응의 유도를 가능하게 하기 때문이다.
HCV는 전세계 인구의 약 3%를 감염시킨다(Williams R. Hepatology 2006; 44: 521-526). 감염된 개체는 대부분 만성으로 진행된다(Amoroso P, y cols., J Hepa-tol 1998; 28: 939-944). C형 간염 감염은 만성 간 손상, 간경변, 간부전 및 간암의 주요 원인 중 하나이다(Hoofnagle JH. Hepatology 2002; 36 (5 Suppl 1): S21-S29). 현재, HCV 감염은 선진국에서의 간이식의 주요 원인이다. 또한, HCV 감염은 특히 제II형 저온글로불린혈증, 막성증식성사구체신염, 만발성피부포르피린증과 같은 간외 징후와 관련되어 있다. 현재, 이 바이러스에 대한 이용가능한 예방적 백신은 없으며, 페그화 인터페론(IFN) + 리바비린의 조합에 기초하여 사용중인 종래의 항바이러스 치료는 50% 미만의 사례에만 효과적이다. 또한, 전술한 치료는 다수의 부작용을 야기한다(Ghany MG y cols., Hepatology. 2009; 49 (4):1335-74).
HCV는 플라비비리다에(Flaviviridae) 과의 헤파시바이러스(Hepacivirus) 속에 속한다. 이 바이러스는 외피보유(enveloped) 바이러스로서, 바이러스 입자의 직경은 약 50 및 70nm이고, 초저밀도 리포단백질(VLDL)과 관련된다(Popescu CI y Dubuisson J. Biol Cell. 2009; 102 (1):63-74). 바이러스 게놈은 대략 9.6 kb의 양성 가닥 리보핵산(RNA)이다. 이 게놈은 적어도 10개의 바이러스 단백질에서 공-번역 및 번역-후 가공된 바이러스성 폴리단백질을 암호화하는데, 10개의 바이러스 단백질은 코어, E1, E2, p7(구조 단백질) 및 비구조 단백질: NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B이다(Bartenschlager R y Lohmann V. 2000. J Gen Virol. 81:1631-48).
HCV에 대한 효과적인 백신의 개발에는 몇 가지 중요한 난관이 있다. 이 병원균은 숙주 환경에 적응하여 빠르게 돌연변이할 수 있는 RNA 바이러스이다. 이로인해 전세계에서 확인된 다수의 바이러스 분리주들은 높은 다양성을 보인다. 6개의 주요 HCV 유전자형이 확인되었으며, 이들은 뉴클레오티드 서열에 최대 30%의 차이를 보일 수 있다(Simmonds P. J Hepatol. 1999; 31 Suppl 1:54-60). HCV E2 단백질의 초가변 영역에서 최대 이종성이 관찰되며, 이 영역에서 중화 항체에 의해서 잠재적으로 표적화되는 에피토프가 발견된다. 실제로 HCV는 바이러스 분자들의 이종성 집단으로서 체내를 순환한다(Simm-onds P. J Gen Virol. 2004; 85 (Pt 11):3173-88). 돌연변이가 숙주에 의해서 발생된 특이적 체액성 및 세포성 면역반응에 따른 바이러스의 탈출로를 구성한다는 것이 증명되었다.
활성 면역 반응의 발생에도 불구하고 면역능력 개체에서 HCV의 지속적 감염이 야기된다(Lechmann et al., Semin Liver Dis 2000, 20, 211-226). 현재, 무관한 면역 반응을 조장하고 유효 면역 반응을 방지함으로써, 이러한 감염의 지속성에 기여하는 몇 가지 바이러스 효과가 설명되었다. 이러한 효과는 선천적 면역과 후천적 면역에서 모두 관찰된다(Grakoui A y cols. Science 2003, 302 (5645): 659-62). HCV에 대한 효과적이지 않은 면역 반응은 이 병원균을 제거하는데 실패할 뿐만 아니라 간을 손상시킨다는 것이 증명되었다.
지금까지, HCV에 대한 보호 및 정화와 관련된 면역학적 변수들은 완전히 정의되지 않았다. 그러나, 상이한 HCV 항원들에 대한 강력하고 지속적인 세포성 면역 반응의 유도가 특히 이와 관련된다고 생각된다(Lechmann et al., Semin Liver Dis 2000, 20, 211-226). HCV 만성 감염 환자에서는 특이적 T 림프구 반응의 손상이 특히 유의하다. 몇 가지 메커니즘이 이 효과에 기여하는 것으로 추정되는데, 이들 중 하나는 조절성 T 세포의 작용이다.
거의 모든 면역화 전략은 HCV에 대한 백신을 개발하려고 시도했다. 이들 전략들 중 일부는 재조합 단백질, 합성 펩티드, 바이러스 유사 입자, 네이키드 데옥시리보핵산(DNA) 및 재조합 바이러스를 포함한다. 모든 바이러스 항원이 HCV에 대한 백신 후보 표적으로서 평가되었다. 대부분의 백신 후보는 동물 모델을 대상으로 한 면역원성 연구 단계에 있다. 또한, 현재 일부 후보는 임상 평가까지 도달했으며, 이들은 안전하고 면역원성인 것으로 증명되었지만, 명백한 임상적 영향은 아직까지 증명되지 않았다(Alvarez-Lajonchere L, Duenas-Carrera S. Int Rev Immunol. 2012;31 (3):223-42).
서브유닛 단백질 백신 후보의 개발은 HCV 백신을 얻기 위해서 평가된 첫번째 전략 중 하나였다. 구조 항원에 기초한 이들 후보들 중 일부는 동물 모델에서 바이러스 시험감염에 대한 제한된 보호를 달성했다. E1 및 E2 올리고머로 면역화된 침팬지의 사례가 그러하다. 7마리의 침팬지가 면역화되었고, 그중 5마리가 보호되었으며, 2마리가 감염되었지만 이후 만성에는 도달하지 않고 바이러스가 제거되었다(Choo y cols., Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91, 1294-1298). 이 보호는 사람 세포와 E2 단백질 간의 상호작용을 억제할 수 있는 항체의 존재와 관련되었다(Rosa y cols., Proc Natl Acad Sci USA 1996, 93, 1759-1763).
1b 유전자형 분리주로부터의 재조합 E1 단백질이 호모다이머로부터 정제되었다(Maertens y cols., Acta Gastroenterol Belg 2000, 63, 203). HCV로 만성 감염된 2마리의 침팬지에게 이 재조합 E1 단백질 50μg을 9회 용량으로 주입시켰다. 백신접종은 간 조직을 개선했고, 간으로부터 바이러스 항원을 제거했으며, 알라닌 아미노트랜스페라아제 수준을 감소시켰다. 그러나, 혈청 RNA 수준은 치료 동안 변하지 않았으며, 치료 종료 후에 간 염증 및 바이러스 항원이 다시 나타났다. 항-E1 항체의 높은 수준과 간 손상의 감소 간의 연관성이 관찰되었다(Maertens et al., Acta Gastroenterol Belg 2000, 63, 203). 명반 중에 조제된 E1 단백질 변이체가 사람에서 평가되었다. 이 후보는 안전했고 면역원성이었으며, 특이적 항체와 린포증식성 반응을 유도한다(Nevens F, y col., Hepatology. 2003; 38 (5):1289-96). 그러나, 이 후보의 투여는 HCV 감염의 임상 경과에 영향을 미치지 않았으며, 환자에서 바이러스가 제거되지 않았고, 간 조직학적 개선도 관찰되지 않았다. 단백질 서브유닛 접근법의 단점은 일부 사례에서 강한 세포성 면역 반응을 유도하지 않는 다는 것이다. 이 접근법의 다른 다른 단점은 상이한 수준의 병원균에 의해서 유도된 HCV-특이적 면역 반응 손상의 상이한 메커니즘에 수반된 영역의 삽입이다(Grakoui A y cols., Science 2003, 302(5645): 659-62).
T 림프구 에피토프를 포함하는 합성 펩티드들의 혼합물에 기초한 2개의 백신 후보가 또한 임상 시험까지 도달했다(Yutani y cols., Cancer Sci 2009.100 (10): 1935-42, Klade y cols., Gastroenterology 2008.134 (5):1385-95). 두 후보는 모두 특이적 면역 반응을 유도했고, 지금까지 제I 상 및 제II 상 임상 시험 동안 HCV 만성 감염 환자에서 낮은 이상반응(reactogenicity)을 보였다(Alvarez-Lajonchere L, Duenas-Carrera S. Int Rev Immunol. 2012; 31 (3):223-42). 그렇지만 이들 백신 후보들은 바이러스 로드에 대해 유의한 효과를 나타내지 않았거나, 또는 일시적인 효과를 보였다. 이들 후보들이 간 조직학을 넘어서는 어떤 개선을 유도하지 않았음을 고려하면, 이들의 임상적 영향은 아직 증명되어야 한다. 바이러스 제거에 중요할 수 있는 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 대한 상이한 에피토프들이 HCV 폴리단백질 전체에서 확인되었다. 이런 발견은 합성 펩티드 기초 백신 전략을 지지한다. 지질 부분과 함께 또는 단독으로, 코어, NS4 및 NS5 에피토프를 포함하는 상이한 펩티드들은 마우스에서 강한 T 세포독성 반응을 유도했다(Shirai et al., J Infect Dis 1996, 173, 24-31; Hiranuma et al., J Gen Virol 1999, 80, 187-193; Oseroff et al., Vaccine 1998, 16, 823-833). 이 접근법의 주요 단점은 T 헬퍼 기능이 없는 펩티드는 불량한 면역원일 수 있다는 것이다. 게다가, 백신의 효능은 몇 가지 항원에 대한 다가 및 광범위한 면역 반응의 유도에 주로 의존한다. 백신에 포함된 펩티드의 수가 증가함에 따라 제제 복잡성이 모든 관점에서 상승한다. 이러한 제한들이 이 접근법의 약점이다.
한편, 상이한 재조합 바이러스 벡터들이 HCV에 대한 백신 후보로서 평가되었다. 결함성 재조합 아데노바이러스가 이들의 간 굴성, 체액성 및 세포성 면역 반응을 유도할 수 있는 능력 및 경구 및 비경구 경로에 의해서 투여될 수 있는 가능성으로 인해 매력적인 후보이다. HCV 구조 단백질을 발현하는 재조합 아데노바이러스는 이들 단백질 각각에 대한 항체 반응을 유도한다(Makimura et al., Vaccine 1996, 14, 28-36). 게다가, 코어 및 E1 재조합 아데노바이러스에 의한 마우스 면역화 후, 특이적 T 세포독성 면역 반응이 이들 항원에 대해 검출된다(Bruna-Romero et al., Hepatology 1997, 25, 470-477). 이들은 고무적인 결과이지만, 유전자 요법에서 재조합 아데노바이러스의 사용과 관련된 일부 문제는 사람에서 이들의 안전성에 대한 의심을 불러일으켰다. 현재, HCV 재조합 아데노바이러스에 기초한 백신 후보에 대한 임상 시험 평가중인데, 면역원성에 대해서는 우수한 결과를 보이고 있지만, 임상적 영향에 대한 증거는 없는 상황이다(Barnes y cols., Sci Transl Med. 2012; 4 (115):115). 상이한 HCV 유전자를 함유하는 우두, 계두 및 카나리아 두창과 같은 다른 재조합 바이러스 벡터를 마우스에서 사용한 결과 강한 T 세포독성과 헬퍼 반응이 유도되었다(Shirai et al., J Virol 1994, 68, 3334-3342; Large et al., J Immunol 1999, 162, 931-938). 특히 비구조 항원 NS3-NS5에 대한 재조합 변형 우두 바이러스 앙카라가 사람을 대상으로 한 임상 시험에서 평가되었다(Fournillier y cols., Vaccine. 2007; 25 (42):7339-53). 이 후보는 면역원성이었고, HCV 만성 감염 환자에 대한 제I 상 임상 시험에서 우수하게 관용되었다. 펩티드 접근법과 유사하게, 바이러스 로드를 넘어서는 효과는 일시적이었으며, 백신 접종자의 일부에서만 효과가 관찰되었다. 따라서, 임상적 영향은 더 증명되어야 한다. 일반적으로, 재조합 바이러스에 기초한 백신 후보들은 이들의 적용과 관련된 안전성 및 조절성 문제에 의해서 제한된다.
DNA 면역화가 HCV 백신 개발을 위한 전략으로서 광범하게 연구되었다. 동물 모델에서의 연구 결과 거의 모든 HCV 항원에 대해서 세포성 및 체액성 면역 반응을 유도할 수 있는 이들 후보들의 능력이 확인 되었다(Alvarez-Lajonchere L, Duenas-Carrera S, Hum Vaccin. 2009; 5(8):568-71). HCV 항원을 암호화하는 서열을 함유하는 DNA 면역화 플라스미드를 포함하는 2개의 백신 후보가 사람을 대상으로 임상 시험중이다(Alvarez-Lajonchere L, Duenas-Carrera S, Int Rev Immunol. 2012; 31 (3):223-42). 한 사례는 NS3 내지 NS5 단백질을 발현하는 DNA 백신인데, 이는 전기천공에 의해서 투여된다(Sallberg M, y cols., Expert Opin Biol Ther. 2009; 9 (7): 805-15). 나머지 사례는 HCV 구조 항원을 발현하는 DNA 플라스미드와 재조합 코어 단백질의 혼합물에 기초한 백신 조성물이다(Castellanos M, y cols., J Gene Med. 2010; 12 (1):107-16). 두 후보 모두 안전하며 잘 관용되고 면역화된 대상에서 특이적 면역 반응을 유도한다는것이 증명되었다(Alvarez-Lajonchere L, Duenas-Carrera S, Int Rev Immunol. 2012; 31 (3):223-42). 이들 두 사례 모두 HCV 감염 경과나 지속적인 조직학적 개선을 넘어서는 효과는 증명되지 않았다. DNA 백신은 간단성 및 안정성과 관련된 잠재적 이점에도 불구하고 중요한 조절성 과제에 직면해 있다. 이들의 주요 제한은 사람에서의 불충분한 면역원성과 관련되는데, 이것은 아직 완전히 이해되지 않았으며, 동물 모델에서 얻어진 결과와도 상당히 상이하다.
전술한 바와 같이, HCV에 대한 예방적 또는 치료적 백신의 개발은 아직 해결되지 않은 문제이다. 본 발명 목적은 이와 관련된 것이다.
본 발명은 전술한 문제를 해결하며, (a) HCV 폴리단백질의 E2 영역(아미노산 408-540)으로 구성된 제1 세그먼트, (b) HCV 폴리단백질의 E1 영역(아미노산 190-222)으로 구성된 제2 세그먼트 및 (c) HCV 폴리단백질의 코어 영역(아미노산 1-50)으로 구성된 제3 세그먼트를 순서대로 포함하는 C형 간염 바이러스(HCV)에 대한 키메라 백신 항원을 제공한다.
본 발명의 신규성은 특정 에피토프들의 선택과 이들이 생성된 단백질 변이체에서 위치되는 순서에 있다. 이 백신 항원의 설계는 상이한 HCV 항원들에 대한 면역 반응 스펙트럼을 넓히고 강화하는데 필요한 성분들의 수를 감소시킬 수 있게한다. 본 발명은 단일 키메라 항원 HCV 폴리단백질에 E2(아미노산 408-540), E1(아미노산 190-222) 및 코어(아미노산 1-50)에 상응하는 영역들을 특히 이 순서대로 포함하는 융합 단백질을 최초로 개시한다. 이는 최종 면역 반응과 관련되며, 따라서 광범위한 바이러스 항원에 대해 지정된다.
HCV의 특정 영역을 선택함으로써, 면역 억제 효과를 발휘할 수 있는 바이러스 단백질 영역의 사용을 회피한다. 또한, HCV의 특정 영역을 선택함으로써, 본 발명에서 선택된 것들을 넘어서서 면역 우성일 수 있고, 설계된 항원에 포함된경우 본 발명에서 선택된 영역에 대한 특이적 면역 반응의 유도를 제한할 다른 영역의 사용을 회피한다. 한편, 본 발명은 선택된 영역들이 인공 단백질 항원에 위치되는 순서를 포함하며, 이것은 이 요소가 에피토프 전시 및 면역 시스템에 따른 가공/표출의 차이로 인하여 HCV에 대한 면역 반응의 유도에 유의하게 영향을 미친다는 사실에 근거한다. 실제로, 본 발명의 키메라 항원에서는 코어, E1 및 E2 단백질로부터의 영역이 자생 바이러스 폴리단백질의 것에 관해서 역순으로 위치된다.
본 발명의 구현에서, 키메라 백신 항원의 서열은 서열번호 10(Eq 항원) 및 서열번호 16(Eq1b 항원)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 키메라 항원은 추가로 그 서열에 적어도 하나의 T 헬퍼 림프구-특이적 에피토프를 포함할 수 있다. 본 발명의 구체화에서, 키메라 항원에 포함된 T 헬퍼 림프구-특이적 에피토프는 HCV 비구조 단백질로부터의 하나의 에피토프이다. 특정한 구현에서, 상기 비구조 단백질은 NS3이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 서열번호 14(EqNS3 항원)으로 확인된 아미노산 서열을 특징으로 하는 키메라 백신 항원을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에서, 키메라 항원에 포함된 T 헬퍼 림프구-특이적 에피토프는 CD4+ T 림프구 인공 에피토프이다. 본 발명에 있어서, 용어 인공 에피토프는 아미노산 서열이 천연 형태로 존재하지 않고 생물정보학에 의해 설계된 에피토프로 정의한다. T 헬퍼 림프구에 의해서 인식되는 인공 에피토프를 선택하고 포함함으로써 키메라 항원 변이체에 포함된 HCV 에피토프에 대한 특이적 면역 반응을 유도하게 된다. 본 발명은 T 헬퍼 림프구 에피토프 P1M(서열번호 17) 및 P2B(서열번호 18)에 대한 인공 에피토프를 최초로 개시한다. 이들 에피토프들은 HLA-DR13 및 HLA-DR11 결합 모티브를 함유하도록 설계되었다. 따라서, 본 발명은 아미노산 서열이 서열번호 17 또는 서열번호 18로 확인된 것에 상응하는 T 헬퍼 림프구 특이적 에피토프를 제공한다.
본 발명의 구체화에서, 키메라 항원은 서열번호 12(NSEq2 항원), 서열번호 13(EqNSb 항원) 및 서열번호 15(EqP1 항원)으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 함유하며, T 헬퍼 림프구 특이적 에피토프들 중 적어도 하나를 함유한다.
키메라 항원은 아래 요약된 특징을 가진다: 키메라 항원 Eq1(서열번호 10)은 HCV 폴리단백질의 영역 E2(아미노산 408-540), E1(아미노산 190-222) 및 코어(아미노산 1-50)를 순서대로 포함한다. 키메라 항원 NSEq2(서열번호 12)은 E1(아미노산 190-222)과 코어(아미노산 1-50) 영역 사이에 Eq1 상에 삽입된 에피토프 P2B와 P1M을 순서대로 포함한다. 키메라 항원 EqNSb(서열번호 13)는 E1(아미노산 190-222)과 코어(아미노산 1-50) 영역 사이에 Eq1 상에 삽입된 P2B 에피토프를 포함한다. 키메라 항원 EqNS3(서열번호 14)은 E1(아미노산 190-222)과 코어(아미노산 1-50) 영역 사이에 Eq1 상에 삽입된 HCV 폴리단백질의 아미노산 영역 1242-1415를 포함한다. 키메라 항원 EqP1(서열번호 15)은 E1(아미노산 190-222)과 코어(아미노산 1-50) 영역 사이에 Eq1에 삽입된 P1M 에피토프를 포함한다. 키메라 항원 Eq1b(서열번호 16)는 HCV 폴리단백질의 E2(아미노산 408-540), E1(아미노산 190-222) 및 코어(아미노산 1-50) 영역을 특정 순서로 포함하며, 이 경우에 아미노산 서열은 HCV 유전자형 1a H77 변이체(NCBI 기준 서열: NC_004102.1)에 상응한다.
본 발명의 구체화에서, 키메라 항원은 실시예 1에 설명된 플라스미드로 형질전환된 박테리아로부터, 재조합 DNA 기술에 의해서 얻어졌다. 그렇지만 당업자는 이러한 항원이 다른 숙주로부터도 얻어질 수 있으며, 면역화에 사용되기 위하여 널리 알려진 과정에 의해서 정제될 수 있다는 것을 알고 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 순서대로 (a) HCV 폴리단백질의 E2 영역(아미노산 408-540)으로 구성된 제1 세그먼트, (b) HCV 폴리단백질의 E1 영역(아미노산 190-222)으로 구성된 제2 세그먼트 및 (c) HCV 폴리단백질의 코어 영역(아미노산 1-50)으로 구성된 제3 세그먼트로 이루어진 HCV에 대한 키메라 백신 항원; 및 제약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 애쥬번트를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 구체화에서, 백신 조성물은 서열번호 10(Eq1 항원), 서열번호 16(Eq1b 항원), 서열번호 14(EqNS3 항원), 서열번호 12(NSEq2 항원), 서열번호 13(EqNSb 항원) 또는 서열번호 15(EqP1 항원)로 확인된 항원을 포함한다.
본 발명의 목적을 위하여, 상업적으로 이용가능하거나 개발 단계에 있는 광범한 제약학적으로 허용되는 애쥬번트들이 본 발명의 목적인 백신 조성물에 함유된 키메라 항원에 대한 면역 반응을 강화하기 위해서 사용될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 또한 HCV 구조 또는 NS3 항원의 재조합 단백질 변이체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 백신 조성물은 HCV 구조 항원을 발현하는 DNA 면역화를 위한 플라스미드를 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 구현에서, 키메라 항원은 HCV 구조 항원과 HCV 재조합 캡시드 단백질을 동시에 발현하는 DNA 면역화를 위한 플라스미드와 함께 조제될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 순서대로 (a) HCV 폴리단백질의 E2 영역(아미노산 408-540)으로 구성된 제1 세그먼트, (b) HCV 폴리단백질의 E1 영역(아미노산 190-222)으로 구성된 제2 세그먼트 및 (c) HCV 폴리단백질의 코어 영역(아미노산 1-50)으로 구성된 제3 세그먼트를 포함하는 HCV에 대한 백신 키메라 항원을 포함하는 백신 조성물이 DNA 면역화를 위한 플라스미드, HCV 구조 단백질의 재조합 변이체 또는 이들 두 가지의 혼합물에 기초한 제제와 함께 초회/보강 일정으로 투여될 수 있는 것을 포함한다.
본 발명의 목적인 백신 조성물은 몇 가지 HCV 항원에 대한 체액성 및 세포성 면역 반응을 모두 유도한다는 이점을 가지며, 따라서 이들은 광범위한 바이러스 분리주에 대해서 활성이고, 대용 바이러스 시험감염 모델에서 보호를 유도할 수 있다.
본 발명에서, 백신 조성물은 근육내, 피내, 복강내, 피하, 점막내, 정맥내 또는 설하 경로에 의해서, 또는 당업자에게 알려진 어떤 다른 경로에 의해서 투여될 수 있다. 한편, 투여는 주사기, 스프레이 또는 어떤 다른 투여 장치에 의해서 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명의 목적은 HCV 폴리단백질의 E2 영역(아미노산 408-540)으로 구성된 제1 세그먼트, HCV 폴리단백질의 E1 영역(아미노산 190-222)으로 구성된 제2 세그먼트 및 HCV 폴리단백질의 코어 영역(아미노산 1-50)으로 구성된 제3 세그먼트 순서대로 이루어진 키메라 백신 항원의 용도이며, 이 용도는 HCV에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 백신의 제작에 관한 것이다. 본 발명의 구체화에서, 전술한 백신은 대용 바이러스 시험감염 모델에서 생체내 보호를 유도할 수 있다.
한편, 본 발명의 백신은 건강한 개체에서 또는 HCV 감염된 환자에서 반응을 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 양태는 HCV에 대한 면역 반응의 유도 방법을 제공하는 것이다. 이 방법은 HCV 폴리단백질의 E2 영역(아미노산 408-540)으로 구성된 제1 세그먼트, HCV 폴리단백질의 E1 영역(아미노산 190-222)으로 구성된 제2 세그먼트 및 HCV 폴리단백질의 코어 영역(아미노산 1-50)으로 구성된 제3 세그먼트로 순서로 이루어진 키메라 항원, 또는 전술한 항원을 함유하는 백신 조성물을 건강한 또는 HCV 감염된 개체에 투여하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 전술한 방법에서 키메라 백신 항원, 또는 그것을 함유하는 백신 조성물이 DNA 면역화를 위한 플라스미드, HCV 구조 항원의 재조합 변이체 또는 이들 두 가지의 혼합물에 기초한 제제와 함께 초회/보강 일정으로 투여되는 것을 포함한다.
HCV 감염된 환자의 치료에서, 본 발명의 항원 또는 이들을 함유하는 백신 조성물은 이 타입의 환자를 위한 표준 간호에 포함된 의약과 동시에 투여될 수 있다.
도 1: 상이한 키메라 항원들을 암호화하는 서열을 함유하는 플라스미드들의 지도. A: pIMCo64K, Coq1 항원 발현을 위한 플라스미드. B: pIME64K, Eq1 항원 발현을 위한 플라스미드. C: pIME164K, E1q1 항원 발현을 위한 플라스미드. D: pINSE64K, NSEq2 항원 발현을 위한 플라스미드. E: pIENSb, EqNSb 항원 발현을 위한 플라스미드. F: pIENS3, EqNS3 항원 발현을 위한 플라스미드. G: pIMP1E64K, EqP1 항원 발현을 위한 플라스미드. H: pIME64Kb, Eq1b 항원 발현을 위한 플라스미드.
도 2: 상이한 키메라 항원들의 도식적 표현. A: Coq1 항원, HCV 폴리단백질의 코어(아미노산 1-50), E1(아미노산 190-222) 및 E2(아미노산 408-540) 영역을 포함한다. B:Eq1 항원, HCV 폴리단백질의 E2(아미노산 408-540), E1(아미노산 190-222) 및 코어(아미노산 1-50)를 포함한다. C: E1q1 항원, HCV 폴리단백질의 E1(아미노산 190-222), E2(아미노산 408-540) 및 코어(아미노산 1-50)를 포함한다. D: NSEq2 항원, E1(아미노산 190-222)과 코어(아미노산 1-50) 영역 사이에 Eq1 상에 삽입된 P2B 및 P1M 에피토프를 포함한다. E: EqNSb 항원, E1(아미노산 190-222)과 코어(아미노산 1-50) 영역 사이에 Eq1 상에 삽입된 P2B 에피토프를 포함한다. F: EqNS3 항원, Eq1 상에서 E1(아미노산 190-222)과 코어(아미노산 1-50) 영역 사이에 삽입된 HCV 폴리단백질의 아미노산 영역 1242-1415를 포함한다. G: EqP1 항원, E1(아미노산 190-222)과 코어(아미노산 1-50) 영역 사이에 Eq1 상에 삽입된 P1M 에피토프를 포함한다. H: Eq1b 항원, HCV 폴리단백질의 유전자형 1a H77 변이체의 E2(아미노산 408-540), E1(아미노산 190-222) 및 코어(아미노산 1-50) 영역을 포함한다.
도 3: 상이한 키메라 항원들을 사용한 면역화 일정에서 HCV 단백질에 대한 항체 반응. 이 결과는 ELISA에 의해, 492nm에서 혈청이 음성 대조군 혈청의 평균 광학 밀도보다 적어도 2배 더 높은 광학 밀도를 나타내는 최대 희석으로서 정의된 항체 역가의 역수로서 Y 축에 표시된다. X 축에는 BALB/c 마우스에 투여된 상이한 면역원들을 표시한다. 오차 막대는 각 그룹의 평균 값의 표준 편차를 나타낸다. 면역 반응은 ELISA의 코팅 항원으로서 코어(캡시드 단백질의 아미노산 1-120), E1 (HCV 폴리단백질의 아미노산 192-340) 및 E2(HCV 폴리단백질의 아미노산 384-680)의 재조합 변이체를 사용하여 평가되었다.
도 4: 상이한 키메라 항원들을 사용한 면역화 일정에서 HCV 단백질에 대한 증식 반응. 이 결과는 CFSE 염색에 의한 세포계수 분석에서 결정된, 자극 없이 증식한 세포에 대한 자극시 증식한 세포의 비율로서 정의된 자극 지수로서 Y 축에 표시된다. 2를 초과하는 자극 지수는 양성으로 간주된다. X 축에는 BALB/c 마우스에 투여된 상이한 면역원들이 표시된다. 오차 막대는 각 그룹의 평균 값의 표준 편차를 나타낸다. 면역 반응은 세포-자극 항원으로서 코어(캡시드 단백질의 아미노산 1-120), E1(HCV 폴리단백질의 아미노산 192-340) 및 E2(HCV 폴리단백질의 아미노산 384-680)의 재조합 변이체를 사용하여 평가되었다.
도 5: 상이한 키메라 항원들을 사용한 면역화 일정에서 HCV 단백질에 대한 IFN 감마 분비 반응. Y 축은 IFN-감마 분비 ELISPOT 분석에서 결정된, 자극 조건에서 검출된 스팟의 수 - 비자극 조건에서 검출된 스팟의 수로서 정의된, 100만개 세포당 순 스팟의 수를 표시한다. X 축에는 BALB/c 마우스에 투여된 상이한 면역원들이 표시된다. 오차 막대는 각 그룹의 평균 값의 표준 편차를 나타낸다. 면역 반응은 세포-자극 항원으로서 코어(캡시드 단백질의 아미노산 1-120), E1(HCV 폴리단백질의 아미노산 192-340) 및 E2(HCV 폴리단백질의 아미노산 384-680)의 재조합 변이체를 사용하여 평가되었다.
도 6: 상이한 키메라 항원들을 사용한 면역화 일정에서 바이러스 시험감염에 대한 반응. 이 결과는 바이러스 시험감염 후 암컷 마우스의 난소에서 검출된 mL당 플라크 형성 단위의 수의 로그로서 정의된 바이러스 역가의 로그로서 Y 축에 표시된다. 바이러스 시험감염에서 사용된 우두 바이러스는 vvRE 바이러스, 코어, E1 및 E2 항원(HCV 폴리단백질에서 1-650 아미노산 영역)을 발현하는 우두 바이러스 및 HCV 항원을 발현하지 않는 WR 우두 바이러스였다. X 축은 BALB/c 마우스에 투여된 상이한 면역원들을 표시한다. 오차 막대는 각 그룹의 평균 값의 표준 편차를 나타낸다.
도 7: NS3과 혼합된 Eq1을 사용한 면역화 일정에서 HCV 단백질에 대한 항체 반응. 이 결과는 ELISA에 의해 결정된 역 평균 항체 역가로서 Y 축에 표시된다. X 축은 BALB/c 마우스에 투여된 상이한 면역원들을 표시한다. 오차 막대는 각 그룹의 평균 값의 표준 편차를 나타낸다. 반응은 ELISA의 코팅 항원으로서 코어 단백질(캡시드 단백질의 아미노산 1-120), E1(HCV 폴리단백질의 아미노산 192-340), E2(HCV 폴리단백질의 아미노산 384-680) 및 NS3(HCV 폴리단백질의 아미노산 1192-1457)의 재조합 변이체를 사용하여 평가되었다.
도 8: NS3과 혼합된 Eq1을 사용한 면역화 일정에서 HCV 단백질에 대한 증식 반응. 이 결과는 CFSE 염색에 의한 세포계수 분석에서 결정된 자극 지수로서 Y 축에 표시된다. 2를 초과하는 자극 지수는 양성으로 간주된다. X 축은 BALB/c 마우스에 투여된 상이한 면역원들을 표시한다. 오차 막대는 각 그룹의 평균 값의 표준 편차를 나타낸다. 반응은 세포-자극 항원으로서 코어 단백질(캡시드 단백질의 아미노산 1-120), E1(HCV 폴리단백질의 아미노산 192-340) 및 NS3(HCV 폴리단백질의 아미노산 1192-1457)의 재조합 변이체를 사용하여 평가되었다.
도 9: NS3과 혼합된 Eq1을 사용한 면역화 일정에서 HCV 단백질에 대한 IFN 감마 분비 반응. Y 축은 IFN-감마 ELISPOT 분석에서 결정된 100만개 세포당 순 스팟의 수를 표시한다. X 축은 BALB/c 마우스에 투여된 상이한 면역원들을 표시한다. 오차 막대는 각 그룹의 평균 값의 표준 편차를 나타낸다. 반응은 세포-자극 항원으로서 코어 단백질(캡시드 단백질의 아미노산 1-120), E1(HCV 폴리단백질의 아미노산 192-340) 및 NS3(HCV 폴리단백질의 아미노산 1192-1457)의 재조합 변이체를 사용하여 평가되었다.
도 10: NS3과 혼합된 Eq1을 사용한 면역화 일정에서 바이러스 시험감염에 대한 반응. 이 결과는 바이러스 역가의 로그로서 Y 축에 표시된다. 바이러스 시험감염에서 사용된 우두 바이러스는 vvRE와 WR였다. X 축은 BALB/c 마우스에 투여된 상이한 면역원들을 표시한다. 오차 막대는 각 그룹의 평균 값의 표준 편차를 나타낸다.
도 11: DNA 면역화를 위한 플라스미드와 조합된 Eq1을 사용한 면역화 일정에서 HCV 단백질에 대한 항체 반응. 이 결과는 ELISA에 의해 결정된 역 평균 항체 역가로서 Y 축에 표시된다. X 축은 BALB/c 마우스에 투여된 상이한 면역원들을 표시한다. 오차 막대는 각 그룹의 평균 값의 표준 편차를 나타낸다. 반응은 ELISA의 코팅 항원으로서 코어 단백질(캡시드 단백질의 아미노산 1-120), E1 (HCV 폴리단백질의 아미노산 192-340) 및 E2(HCV 폴리단백질의 아미노산 384-680)의 재조합 변이체를 사용하여 평가되었다.
도 12: DNA 면역화를 위한 플라스미드와 조합된 Eq1을 사용한 면역화 일정에서 HCV 단백질에 대한 증식 반응. 이 결과는 CFSE 염색에 의한 세포계수 분석에서 결정된 자극 지수로서 Y 축에 표시된다. 2를 초과하는 자극 지수는 양성으로 간주된다. X 축은 BALB/c 마우스에 투여된 상이한 면역원들을 표시한다. 오차 막대는 각 그룹의 평균 값의 표준 편차를 나타낸다. 면역 반응은 세포-자극 항원으로서 코어(캡시드 단백질의 아미노산 1-120), E1(HCV 폴리단백질의 아미노산 192-340) 및 E2(HCV 폴리단백질의 아미노산 384-680)의 재조합 변이체를 사용하여 평가되었다.
도 13: DNA 면역화를 위한 플라스미드와 조합된 Eq1을 사용한 면역화 일정에서 HCV 단백질에 대한 IFN 감마 분비 반응. Y 축은 IFN-감마 ELISPOT 분석에서 결정된 100만개 세포당 순 스팟의 수를 표시한다. X 축은 BALB/c 마우스에 투여된 상이한 면역원들을 표시한다. 오차 막대는 각 그룹의 평균 값의 표준 편차를 나타낸다. 반응은 세포-자극 항원으로서 코어 단백질(캡시드 단백질의 아미노산 1-120), E1(HCV 폴리단백질의 아미노산 192-340) 및 E2(HCV 폴리단백질의 아미노산 384-680)의 재조합 변이체를 사용하여 평가되었다.
도 14: DNA 면역화를 위한 플라스미드와 조합된 Eq1을 사용한 면역화 일정에서 바이러스 시험감염에 대한 반응. 이 결과는 바이러스 시험감염 후 암컷 마우스의 난소에서 검출된 바이러스 역가의 로그로서 Y 축에 표시된다. 바이러스 시험감염에는 vvRE와 WR 바이러스가 사용되었다. X 축은 BALB/c 마우스에 투여된 상이한 면역원들을 표시한다. 오차 막대는 각 그룹의 평균 값의 표준 편차를 나타낸다.
도 15: HCV 구조 단백질의 재조합 변이체와 혼합된 Eq1을 사용한 면역화 일정에서 HCV 단백질에 대한 항체 반응. 이 결과는 ELISA에 의해 결정된 역 평균 항체 역가로서 Y 축에 표시된다. X 축은 BALB/c 마우스에 투여된 상이한 면역원들을 표시한다. 오차 막대는 각 그룹의 평균 값의 표준 편차를 나타낸다. 반응은 ELISA의 코팅 항원으로서 코어 단백질(캡시드 단백질의 아미노산 1-120), E1 (HCV 폴리단백질의 아미노산 192-340) 및 E2(HCV 폴리단백질의 아미노산 384-680)의 재조합 변이체를 사용하여 평가되었다.
도 16: HCV 구조 단백질의 재조합 변이체와 혼합된 Eq1을 사용한 면역화 일정에서 HCV 단백질에 대한 증식 반응. 이 결과는 CFSE 염색에 의한 세포계수 분석에서 결정된 자극 지수로서 표시된다. 2를 초과하는 자극 지수는 양성으로 간주된다. BALB/c 마우스에 투여된 상이한 면역원들이 도시된다. 오차 막대는 각 그룹의 평균 값의 표준 편차를 나타낸다. 면역 반응은 세포-자극 항원으로서 코어(캡시드 단백질의 아미노산 1-120), E1(HCV 폴리단백질의 아미노산 192-340) 및 E2 (HCV 폴리단백질의 아미노산 384-680)의 재조합 변이체를 사용하여 평가되었다.
도 17: HCV 구조 단백질의 재조합 변이체와 혼합된 Eq1을 사용한 면역화 일정에서 HCV 단백질에 대한 IFN 감마 분비 반응. 이 결과는 IFN-감마 ELISPOT 분석에서 결정된 100만개 세포당 순 스팟으로서 표시된다. BALB/c 마우스에 투여된 상이한 면역원들이 도시된다. 오차 막대는 각 그룹의 평균 값의 표준 편차를 나타낸다. 면역 반응은 세포-자극 항원으로서 코어(캡시드 단백질의 아미노산 1-120), E1(HCV 폴리단백질의 아미노산 192-340) 및 E2(HCV 폴리단백질의 아미노산 384-680)의 재조합 변이체를 사용하여 평가되었다.
도 18: HCV 구조 단백질의 재조합 변이체와 혼합된 Eq1을 사용한 면역화 일정에서 바이러스 시험감염에 대한 반응. 이 결과는 바이러스 시험감염 후 암컷 마우스의 난소에서 검출된 바이러스 역가의 로그로서 표시된다. 우두 바이러스 vvRE 및 WR이 바이러스 시험감염에 사용되었다. BALB/c 마우스에 투여된 상이한 면역원들이 도시된다. 오차 막대는 각 그룹의 평균 값의 표준 편차를 나타낸다.
도 19: NS3 단백질의 에피토프 및 인공 에피토프를 포함하는 상이한 키메라 항원들을 사용한 면역화 일정에서 HCV 단백질에 대한 항체 반응. 이 결과는 ELISA에 의해 결정된 역 평균 항체 역가로서 표시된다. BALB/c 마우스에 투여된 상이한 면역원들이 도시된다. 오차 막대는 각 그룹의 평균 값의 표준 편차를 나타낸다. 면역 반응은 ELISA의 코팅 항원으로서 코어(캡시드 단백질의 아미노산 1-120), E1 (HCV 폴리단백질의 아미노산 192-340) 및 E2(HCV 폴리단백질의 아미노산 384-680) 및 NS3(HCV 폴리단백질의 아미노산 1192-1457)의 재조합 변이체를 사용하여 평가되었다.
도 20: NS3 단백질의 에피토프 및 인공 에피토프를 포함하는 상이한 키메라 항원들을 사용한 면역화 일정에서 HCV 단백질에 대한 증식 반응. 이 결과는 CFSE 염색에 의한 세포계수 분석에서 결정된 자극 지수로서 표시된다. 2를 초과하는 자극 지수는 양성으로 간주된다. BALB/c 마우스에 투여된 상이한 면역원들이 도시된다. 오차 막대는 각 그룹의 평균 값의 표준 편차를 나타낸다. 면역 반응은 세포-자극 항원으로서 코어(캡시드 단백질의 아미노산 1-120), E1(HCV 폴리단백질의 아미노산 192-340) 및 E2(HCV 폴리단백질의 아미노산 384-680) 및 NS3(HCV 폴리단백질의 아미노산 1192-1457)의 재조합 변이체를 사용하여 평가되었다.
도 21: NS3 단백질의 에피토프 및 인공 에피토프를 포함하는 상이한 키메라 항원들을 사용한 면역화 일정에서 HCV 단백질에 대한 IFN 감마 분비 반응. 이 결과는 IFN-감마 ELISPOT 분석에서 결정된 100만개 세포당 순 스팟으로서 표시된다. BALB/c 마우스에 투여된 상이한 면역원들이 도시된다. 오차 막대는 각 그룹의 평균 값의 표준 편차를 나타낸다. 면역 반응은 세포-자극 항원으로서 코어(캡시드 단백질의 아미노산 1-120), E1(HCV 폴리단백질의 아미노산 192-340) 및 E2(HCV 폴리단백질의 아미노산 384-680) 및 NS3(HCV 폴리단백질의 아미노산 1192-1457)의 재조합 변이체를 사용하여 평가되었다.
도 22: NS3 단백질의 에피토프 및 인공 에피토프를 포함하는 상이한 키메라 항원들을 사용한 면역화 일정에서 바이러스 시험감염에 대한 반응. 이 결과는 바이러스 시험감염 후 암컷 마우스의 난소에서 검출된 바이러스 역가의 로그로서 표시된다. 우두 바이러스 vvRE 및 WR이 바이러스 시험감염에 사용되었다. BALB/c 마우스에 투여된 상이한 면역원들이 도시된다. 오차 막대는 각 그룹의 평균 값의 표준 편차를 나타낸다.
도 23: 키메라 항원 Eq1 및 Eq1b를 사용한 면역화 일정에서 HCV 단백질에 대한 항체 반응. 이 결과는 ELISA에 의해 결정된 역 평균 항체 역가로서 표시된다. BALB/c 마우스에 투여된 상이한 면역원들이 도시된다. 오차 막대는 각 그룹의 평균 값의 표준 편차를 나타낸다. 면역 반응은 ELISA의 코팅 항원으로서 코어(캡시드 단백질의 아미노산 1-120), E1(HCV 폴리단백질의 아미노산 192-340) 및 E2(HCV 폴리단백질의 아미노산 384-680)의 재조합 변이체를 사용하여 평가되었다.
도 24: 키메라 항원 Eq1 및 Eq1b를 사용한 면역화 일정에서 HCV 단백질에 대한 증식 반응. 이 결과는 CFSE 염색에 의한 세포계수 분석에서 결정된 자극 지수로서 표시된다. 2를 초과하는 자극 지수는 양성으로 간주된다. BALB/c 마우스에 투여된 상이한 면역원들이 도시된다. 오차 막대는 각 그룹의 평균 값의 표준 편차를 나타낸다. 면역 반응은 세포-자극 항원으로서 코어(캡시드 단백질의 아미노산 1-120), E1(HCV 폴리단백질의 아미노산 192-340) 및 E2(HCV 폴리단백질의 아미노산 384-680)의 재조합 변이체를 사용하여 평가되었다.
도 25: 키메라 항원 Eq1 및 Eq1b를 사용한 면역화 일정에서 바이러스 시험감염에 대한 반응. 이 결과는 바이러스 시험감염 후 암컷 마우스의 난소에서 검출된 바이러스 역가의 로그로서 표시된다. 우두 바이러스 vvRE 및 WR이 바이러스 시험감염에 사용되었다. BALB/c 마우스에 투여된 상이한 면역원들이 도시된다. 오차 막대는 각 그룹의 평균 값의 표준 편차를 나타낸다.
실시예 1: HCV 에피토프를 포함하는 상이한 키메라 항원들의 생성
도 1에 도시된 대로, 플라스미드 pIMCo64K(서열번호 1), pIME64K(서열번호 2), pIME164K(서열번호 3), pINSE64K(서열번호 4), pIENSb(서열번호 5), pIENS3(서열번호 6), pIMP1E64K(서열번호 7) 및 pIME64Kb(서열번호 8)를 얻었다. 이들 플라스미드들은 도 2에 각각 나타낸 키메라 항원 Coq1(서열번호 9), Eq1(서열번호 10), E1q1(서열번호 11), NSEq2(서열번호 12), EqNSb(서열번호 13), EqNS3(서열번호 14), EqP1(서열번호 15) 및 Eq1b(서열번호 16)의 대장균(Escherichia coli)에서의 발현을 허용한다. 항원 Eq1b(이것의 서열은 HCV 균주 H77, 유전자형 1a로부터 유래한다)를 제외하고 모든 경우에 아미노산 서열은 HCV 유전자형 1b 분리주(Gonzalez-Horta EE, Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2011; 15(11): 1320-7)로부터 유래한다.
도 2에 도시된 대로, 키메라 항원 Coq1(서열번호 9)은 이런 특정한 순서로 위치된 HCV 폴리단백질의 코어(아미노산 1-50), E1(아미노산 190-222) 및 E2(아미노산 408-540) 영역을 포함한다. 키메라 항원 Eq1(서열번호 10)도 HCV 폴리단백질의 E2(아미노산 408-540), E1(아미노산 190-222) 및 코어(아미노산 1-50)를 똑같이 포함하지만, 이들은 이처럼 다른 특정한 순서로 위치된다. 키메라 항원 E1q1(서열번호 11)는 동일한 영역들을 포함하지만, 다음의 순서로 위치된다: HCV 폴리단백질의 E1(아미노산 190-222), E2(아미노산 408-540) 및 코어(아미노산 1-50). 키메라 항원 NSEq2(서열번호 12)은 E1(아미노산 190-222)과 코어(아미노산 1-50) 영역 사이에서 Eq1에 삽입된 에피토프 P2B와 P1M을 이 순서로 포함한다. 한편, 키메라 항원 EqNSb(서열번호 13)는 E1(아미노산 190-222)과 코어(아미노산 1-50) 영역 사이에서 Eq1에 삽입된 에피토프 P2B를 포함한다. 키메라 항원 EqNS3(서열번호 14)은 키메라 항원 Eq1의 E1(아미노산 190-222)과 코어(아미노산 1-50) 영역 사이에 삽입된 HCV 폴리단백질의 아미노산 1242-1415의 영역을 포함한다. 키메라 항원 EqP1(서열번호 15)은 E1(아미노산 190-222)과 코어(아미노산 1-50) 영역 사이에서 Eq1에 삽입된 에피토프 P1M을 포함한다. 키메라 항원 Eq1b(서열번호 16)는 HCV 폴리단백질의 E2(아미노산 408-540), E1(아미노산 190-222) 및 코어(아미노산 1-50) 영역을 이런 특정 순서로 포함하지만, 이 경우 아미노산 서열은 HCV 균주 H77 유전자형 1a(NCBI 기준 서열: NC_004102.1)에 상응한다.
키메라 항원의 일부에 포함된 인공 에피토프 P1M과 P2B는 사람 T 헬퍼 림프구에 의해서 인식되도록 생물정보학에 의해서 설계되었다. 출현 빈도에 따라서 인공 에피토프들의 위치마다 아미노산 변이체를 제안하기 위하여 Rankpep, SYFPETHI 및 ProPred 프로그램을 사용하여 HLA-DR13 및 HLA-DR11에 대한 결합 모티프가 연구되었다. T 헬퍼 림프구에 특이적인 인공 에피토프로서 서열이 LPEYVIMVKLPSRA(서열번호 17)인 14개 아미노산의 P1M; 및 서열이 GYKVIVLNPRVASTL(서열번호 18)인 15개 아미노산의 P2B가 개시된다.
재조합 단백질 항원의 발현을 위해서, 박테리아 균주 E. Coli GC-366의 컴페턴트 세포가 각 플라스미드로 형질전환되었다. 최소 세포배양 배지를 이용하여 재조합 단백질의 발현을 37℃에서 12h 동안 전개시켰다. 모든 단백질 항원은 단백질 발현을 위하여 이 기능에 대해 이전에 공지된 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)의 P64K 단백질로부터 유래하는 단편을 N-말단에 포함했다(Yero D y cols., Biotechnol Appl Biochem. 2006; 44(Pt 1):27-34). 한편, 단백질 변이체는 C-말단에 단백질 정제를 용이하게 할 목적으로 6-히스티딘 태그를 포함한다. 실제로 단백질은 세포 파괴로부터 유래하는 불용성 분획의 가용화를 통해서 정제되었으며, 이 경우 탄산염-중탄산염 pH 9.6 버퍼, 유레아 8M, 및 후기 금속 킬레이팅 친화성 크로마토그래피가 사용되었다.
실시예 2: 마우스에서 HCV 에피토프를 포함하는 상이한 키메라 항원들의 면역원성 연구
그룹당 17마리의 8주령된 암컷 BALB/c 16-18g 중량의 마우스를 면역화했다. 면역화 그룹은 다음과 같았다: 그룹 1, 명반 중에 조제된 키메라 항원 Coq1; 그룹 2, 명반 중에 조제된 항원 E1q1; 그룹 3, 명반 중에 조제된 항원 Eq1; 그룹 4, 명반(대조군 그룹). 모든 경우, 재조합 항원 20μg이 투여되었다. 면역화는 근육내 주사에 의해서 0주, 2주 및 4주째에 수행되었다.
HCV 항원에 대한 항체 반응을 연구하기 위하여 0주 및 6주째에 채혈을 수행했다. 또한, 그룹당 5마리 마우스를 특이적 세포 반응의 연구를 위해 6주째에 죽였다. 그리고, 6주째에 그룹당 5마리를 HCV 구조 단백질을 발현하는 재조합 우두 바이러스 vvRE(Alvarez-Lajonchere y cols., Biotecnologia Aplicada 2007; 24(3-4): 246-253)로 시험감염시켰고, 다른 5마리를 대조군 우두 바이러스 WR로 시험감염시켰다. 시험감염 후 5일 뒤에 마우스를 죽이고, 앞서 설명된 대로 난소에서 바이러스 역가를 결정했다(Alvarez-Lajonchere y cols., Biotechnol Appl Biochem. 2008; 51(Pt 2):97-105).
HCV 항원에 대한 특이적 면역 반응이 도 3 내지 5에 도시된다. 평가된 반응은 ELISA에서 캡처 항원으로서, 또는 세포성 면역 반응을 결정하기 위한 분석에서 자극 항원으로서, 코어 단백질(아미노산 1-120, Alvarez-Obregon JC y cols. Vacc-ine 2001; 19: 3940-3946), E1(HCV 폴리단백질의 아미노산 192-340, Lorenzo LJ y cols., Biotechnol Appl Biochem 2000; 32(2):137-143) 및 E2(HCV 폴리단백질의 아미노산 384-680, Martinez-Donato y cols., Mol Biotechnol. 2007; 35(3): 225-36)의 재조합 변이체를 이용하여 검출되었다. 도 3에 도시된 대로, HCV 구조 단백질에 대한 항체 반응은 모든 평가된 항원에 대해서 Eq1으로 면역화된 그룹에서 더 높았다(p<0.0001; Kruskal Wallis 및 Dunns 다중 비교 시험). 유사한 거동이 증식 반응(도 4)과 IFN 감마 분비(도 5)에 대해서 각각 관찰되었다. 또한, 도 6에 도시된 대로, Eq1으로 면역화된 그룹은 대용 시험감염 모델에서 특이적 바이러스 혈증(vvRE로 시험감염 후)을 유의하게 제어할 수 있는 유일한 것이었다(p=0.0069, Kruskal Wallis 및 Dunns 다중 비교 시험).
이들 결과는 대용 시험감염 모델에서 보호를 도출할 수 있으므로 생체내 기능적 활성과 함께 몇 가지 HCV 항원에 대해서 체액성 및 세포성 모두의 특이적 면역 반응을 유도할 수 있는 키메라 항원 Eq1의 능력을 증명했다. 또한, 변이체 Coq1과 E1q1은 이 타입의 면역 반응을 유도하는데 실패했기 때문에 HCV 구조 단백질의 선택된 영역이 키메라 항원에 위치되는 순서가 특이적 면역 반응 유도와 시험감염 모델에서 기능적 보호 면역 반응의 발생에 중요하다는 것이 증명된다. 따라서, 항원에 에피토프를 갖는 것만으로는 충분하지 않고, 이들은 올바른 전후관계를 가져야 한다.
실시예 3: 마우스에서 NS3과 혼합된 Eq1 항원의 면역원성 연구
그룹당 17마리의 8주령된 암컷 BALB/c 16-18g 중량의 마우스를 면역화했다. 면역화 그룹은 다음과 같았다: 그룹 1, 명반에 조제된 항원 Eq1; 그룹 2, 명반 중에 조제된 재조합 단백질 NS3(Palenzuela D et al., Biotecnologia Aplicada 2006; 23: 94-98)와 혼합된 항원 Eq1; 그룹 3, 명반 중에 조제된 재조합 단백질 NS3: 그룹 4, 명반(대조군 그룹). 모든 경우, 재조합 항원 Eq1 20μg와 NS3 단백질 10μg이 상응하는 그룹별로 투여되었다. 면역화는 근육내 주사에 의해서 0주, 2주 및 4주째에 수행되었다.
HCV 항원에 대한 항체 반응을 연구하기 위하여 0주 및 6주째에 채혈을 수행했다. 또한, 그룹당 5마리 마우스를 특이적 세포 반응의 연구를 위해 6주째에 죽였다. 그리고, 6주째에 그룹당 5마리를 HCV 구조 단백질을 발현하는 재조합 우두 바이러스 vvRE(Alvarez-Lajonchere y cols., Biotecnologia Aplicada 2007; 24(3-4): 246-253)로 시험감염시켰고, 다른 5마리를 대조군 우두 바이러스 WR로 시험감염시켰다. 시험감염 후 5일 뒤에 마우스를 죽이고, 앞서 설명된 대로 난소에서 바이러스 역가를 결정했다.
HCV 항원에 대한 특이적 면역 반응이 도 7 내지 9에 도시된다. 평가된 면역 반응은 ELISA에서 캡처 항원으로서, 또는 세포성 면역 반응을 결정하기 위한 분석에서 자극 항원으로서, 코어 단백질(아미노산 1-120), E1(HCV 폴리단백질의 아미노산 192-340), E2(HCV 폴리단백질의 아미노산 384-680) 및 NS3(HCV 폴리단백질에서 아미노산 1192-1457)의 재조합 변이체를 이용하여 검출되었다. 도 7에 도시된 대로, 항체 반응은 개별적으로 또는 NS3과 혼합된 Eq1으로 면역화된 그룹들에서 그룹들 간에 통계적으로 유의한 차이 없이 HCV 구조 항원에 대해서 유도된다. 그러나, NS3에 대한 항체 반응은 NS3와 Eq1 혼합물 그룹에서 유의하게 월등했다(p=0.0001, Mann Whitney 시험).
한편, 도 8에 나타낸 증식 반응의 분석은 개별 항원의 투여에 대하여 Eq1과 NS3의 혼합물이 투여된 그룹에서 코어, E2 및 NS3 항원에 대해 유의하게 월등한 반응을 증명했다(p<0.05, ANOVA 및 Newman-Keuls 다중 비교 시험). E1에 대한 반응에 대하여 개별적으로 또는 NS3과 혼합된 Eq1으로 면역화된 그룹들 간에 통계적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
도 9에 나타낸 특이적 IFN 감마 분비 반응과 관련하여, E2 항원에 대하여만 재조합 단백질로 면역화된 변이체들 간에 통계적으로 유의한 차이를 가지고 유도되었는데, 이것은 Eq1과 NS3의 혼합물로 면역화된 그룹에서 유의하게 월등한 반응을 보인다(p<0.05, ANOVA 및 Newman-Keuls 다중 비교 분석).
또한, 도 10에 도시된 대로, 개별적으로 또는 NS3와 혼합된 Eq1 단백질로 면역화된 그룹은 모두 대용 시험감염 모델에서 특이적 바이러스 혈증(vvRE로의 시험감염)을 유의하게 제어했다(p<0.05, Kruskal Wallis 및 Dunns 다중 비교 시험).
이들 결과는 항원 Eq1과 NS3의 혼합물에 기초한 제제는 대용 바이러스 시험감염 모델에서 보호를 제공할 수 있으므로 생체내 기능적 활성과 함께 HCV 구조 항원에 대해서 체액성 및 세포성 모두의 증가된 특이적 면역 반응을 유도할 수 있다는 것을 증명했다.
실시예 4: 마우스에서 DNA 면역화를 위한 플라스미드와 혼합된 키메라 항원 Eq1의 면역원성 연구
그룹당 17마리의 8주령된 암컷 BALB/c 16-18g 중량의 마우스를 면역화했다. 면역화 그룹은 다음과 같았다: 그룹 1, 명반 중에 조제된 Eq1 항원; 그룹 2, 식염수 용액 중에서 DNA 면역화를 위한 플라스미드 pIDKE2(Duenas-Carreraycols., Bio-technol Appl Biochem. 2004; 39: 249-55)와 혼합된 Eq1 항원; 그룹 3, 식염수 용액 중에서 pIDKE2 플라스미드 및 Co.120 단백질(Duenas-Carreraycols., Biotechno-logia Aplicada 1999; 16(4), 226-231)과 혼합된 Eq1 항원; 그룹 4, 0 및 3주째에 식염수 용액 중에서 pIDKE2 플라스미드와 혼합된 Co.120 단백질, 6주째에 명반 중에 조제된 Eq1 항원; 그룹 5, 0, 3 및 6주째에 식염수 용액 중의 pIDKE2 플라스미드; 그룹 6, 명반(대조군); 그룹 7, 식염수 용액(대조군). 마우스는 상응하는 그룹별로 키메라 Eq1 항원 20μg 및 Co.120 재조합 단백질 10μg을 제공 받았다. 플라스미드 pIDKE2의 경우, 각 용량으로 100μg이 투여되었다. 면역화는 근육내 주사에 의해서 0주, 3주 및 6주째에 수행되었다.
HCV 항원에 대한 항체 반응을 연구하기 위하여 0주 및 6주째에 채혈을 수행했다. 또한, 그룹당 5마리 마우스를 특이적 세포 반응의 연구를 위해 6주째에 죽였다. 그리고, 8주째에 그룹당 5마리를 HCV 구조 단백질을 발현하는 재조합 우두 바이러스 vvRE로 시험감염시켰고, 다른 5마리를 대조군 우두 바이러스 WR로 시험감염시켰다. 시험감염 후 5일 뒤에 마우스를 죽이고, 앞서 설명된 대로 난소에서 바이러스 역가를 결정했다.
HCV 항원에 대한 특이적 면역 반응이 도 11 내지 13에 도시된다. 평가된 반응은 ELISA에서 캡처 항원으로서, 또는 세포성 면역 반응을 결정하기 위한 분석에서 자극 항원으로서, 코어 단백질(아미노산 1-120), E1(HCV 폴리단백질의 아미노산 192-340) 및 E2(HCV 폴리단백질의 아미노산 384-680)의 재조합 변이체를 이용하여 검출되었다. 도 11에 도시된 대로, HCV 구조 항원에 대한 항체 반응은 대조군을 제외하고 모든 면역화된 그룹에서 유도된다. E1 및 E2에 대한 유의하게 더 높은 항체 반응이 단독 pIDKE2 플라스미드로 면역화된 그룹에 비해서 pIDKE2 플라스미드와 Eq1 단백질 및 Co.120의 혼합물로 면역화된 그룹에서 관찰되었다(p<0.05, Kruskal Wallis 및 Dunns 다중 비교 시험). 이들 두 그룹들 간에 통계적으로 유의한 차이는 코어, E1 및 E2에 대한 증식 반응에 대하여도 마찬가지로 관찰되었다(도 12)(p<0.05, Kruskal Wallis 및 Dunns 다중 비교 시험). 실제로, pIDKE2 플라스미드와 Eq1 단백질 및 Co.120의 혼합물로 면역화된 그룹은 E1 및 E2 항원에 대한 증식 반응을 유도했으며, 이것은 초회/보강 일정으로 면역화된 그룹(그룹 4)을 제외하고 나머지 그룹에서 유도된 것보다 유의하게 월등했다(p<0,05, ANOVA 및 Newman-Keuls 다중 비교 시험).
IFN 감마 분비 반응과 관련하여, 모든 그룹은 HCV 구조 단백질에 대해 검출가능한 반응을 유도했다(도 13)(대조군을 제외하고). 면역원성 변이체로 백신접종된 그룹들 간에 E1 및 E2에 대한 반응과 관련하여 통계적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았으며, 예외적으로 단독 pIDKE2 플라스미드로 면역화된 그룹(그룹 5)에 비해서 개별적으로 Eq1으로 면역화된 그룹(그룹 1)에서 E2에 대해 유도된 반응의 우월성이 관찰되었다(p<0.05, ANOVA 및 Newman-Keuls 다중 비교 시험). 그러나, 코어 항원에 대한 IFN 감마 분비 반응은 초회/보강 일정으로 면역화된 그룹(그룹 4)을 제외하고 나머지 그룹에 비해서 pIDKE2 플라스미드와 Eq1 및 Co.120 단백질의 혼합물로 면역화된 그룹에서 유의하게 월등했다(p<0.05; ANOVA 및 Newman-Keuls 다중 비교 시험).
또한, 키메라 Eq1 항원의 투여를 수반한 모든 그룹(그룹 1 내지 4)은 대용 시험감염 모델에서 특이적 바이러스 혈증(vvRE로의 시험감염)을 유의하게 제어할 수 있었지만(도 14)(p<0.05, Kruskal Wallis 및 Dunns 다중 비교 시험), 나머지 그룹은 아니었다.
이 결과는 pIDKE2 및 Co.120 단백질과 혼합된 Eq1의 투여에 기초한, 또는 초회/보강 일정의 백신 조성물은 대용 시험감염 모델에서 보호를 유도할 수 있으므로 생체내 기능적 활성과 함께 HCV 구조 항원에 대해서 체액성 및 세포성 모두의 증가된 특이적 면역 반응의 유도를 허용한다는 것을 증명했다.
실시예 5: 마우스에서 HCV 구조 단백질의 재조합 단백질 변이체와 혼합된 키메라 항원 Eq1의 면역원성 연구
그룹당 17마리의 8주령된 암컷 BALB/c 16-18g 중량의 마우스를 면역화했다. 면역화 그룹은 다음과 같았다: 그룹 1, 명반 중에 조제된 Eq1 항원; 그룹 2, 0 및 2주째에 명반 중에 조제된 Co.120, E1.340(Lorenzo LJ y cols., Biotechnol Appl Bi-ochem 2000; 32(2):137-143) 및 E2.680(Martinez-Donato y cols., Mol Biotechnol. 2007; 35(3): 225-36) 단백질의 혼합물, 4주째에 명반 중에 조제된 키메라 Eq1 항원; 그룹 3, 0주째에 명반 중에 조제된 키메라 Eq1 항원, 및 2 및 4주째에 명반 중에 조제된 Co.120, E1.340 및 E2.680 단백질의 혼합물; 그룹 4, 명반 중에 조제된 Co.120, E1.340, E2.680 및 Eq1 단백질의 혼합물; 그룹 5, 명반 중에 조제된 Co.120, E1.340 및 E2.680 단백질의 혼합물; 그룹 6, 명반(대조군). 마우스는 상응하는 그룹별로 키메라 Eq1 항원 20μg; E1 및 E2 단백질 16.7μg, 그리고 Co.120 단백질 0.1μg을 제공 받았다. 면역화는 근육내 주사에 의해서 0주, 2주 및 4주째에 수행되었다.
HCV 항원에 대한 항체 반응을 연구하기 위하여 0주 및 6주째에 채혈을 수행했다. 또한, 그룹당 5마리 마우스를 특이적 세포 반응의 연구를 위해 6주째에 죽였다. 그리고, 8주째에 그룹당 5마리를 HCV 구조 단백질을 발현하는 재조합 우두 바이러스 vvRE로 시험감염시켰고, 다른 5마리를 대조군 우두 바이러스 WR로 시험감염시켰다. 시험감염 후 5일 뒤에 마우스를 죽이고, 앞서 설명된 대로 난소에서 바이러스 역가를 결정했다.
HCV에 대한 특이적 면역 반응이 도 15 내지 17에 도시된다. 평가된 반응은 ELISA에서 캡처 항원으로서, 또는 세포성 면역 반응을 결정하기 위한 분석에서 자극 항원으로서, 코어(아미노산 1-120), E1(HCV 폴리단백질의 아미노산 192-340) 및 E2(HCV 폴리단백질의 아미노산 384-680)의 재조합 변이체를 사용하여 검출되었다. 도 15에서 관찰된 대로, 대조군을 제외하고 모든 면역화된 그룹은 HCV 구조 항원에 대해 특이적 항체 반응을 유도했다. 그룹들 간에 코어 단백질에 대한 항체 반응에 대하여 통계적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 반면에, 구조 단백질들의 혼합물로 면역화된 그룹(그룹 5)과 구조 단백질과 Eq1의 혼합물로 면역화된 그룹(그룹 4)는 개별적으로 Eq1으로 면역화된 그룹보다 E1 및 E2에 대해 유의하게 더 높은 항체 반응을 보였다(p<0,05, Kruskal Wallis 및 Dunn의 다중 비교 시험).
한편, HCV 항원에 대한 증식 반응이 도 16에서 관찰된 대로 대조군을 제외하고 모든 그룹에서 유도되었다. 그룹들 간에 통계적으로 유의한 차이는 E1 및 E2에 대한 증식 반응에 대하여 관찰되지 않았다. 그러나, 어떤 조합으로든 키메라 Eq1 항원을 받은 모든 그룹(그룹 1 내지 4)은 HCV 구조 단백질들의 혼합물에 의해서 유도된 그룹(그룹 5)보다 유의하게 월등한 코어에 대한 증식 반응을 유도했다(p<0.05, ANOVA 및 Newman-Keuls 다중 비교 시험).
도 17에 도시된 대로, IFN 감마 분비 반응은 증식 반응에서 관찰된 것과 유사한 거동을 가졌다. 이 경우, HCV 구조 단백질들의 혼합물로 면역화된 그룹(그룹 5)은 개별적으로 키메라 Eq1 항원으로 면역화된 그룹(그룹 1) 및 HCV 구조 단백질과 Eq1의 혼합물로 면역화된 그룹(그룹 4)에서 유도된 것보다 유의하게 더 낮은 코어에 대한 IFN 감마 분비 반응을 가졌다(p<0.05, ANOVA 및 Newman-Keuls 다중 비교 시험).
또한, 대조군을 제외하고 모든 그룹은 바이러스 대용 시험감염 모델에서 특이적 바이러스 혈증(vvRE로의 시험감염)을 유의하게 제어할 수 있었다(도 18)(p< 0.05, Kruskal Wallis 및 Dunn의 다중 비교 시험).
이 결과는 HCV 구조 항원들 코어, E1 및 E2의 재조합 단백질 변이체를 포함하는 제제와 혼합된 키메라 Eq1 항원의 투여에 기초한 백신 조성물은 바이러스 대용 시험감염 모델에서 보호를 제공할 수 있으므로 생체내 기능적 활성과 함께 HCV 구조 단백질에 대해 체액성 및 세포성 모두의 증가된 특이적 면역 반응의 유도를 허용한다는 것을 증명했다.
실시예 6: 마우스에서 HCV 에피토프 및 T 헬퍼 림프구에 특이적인 인공 에피토프를 포함하는 상이한 키메라 항원들의 면역원성 연구
그룹당 17마리의 8주령된 암컷 BALB/c 16-18g 중량의 마우스를 면역화했다. 면역화 그룹은 다음과 같았다: 그룹 1, 명반 중에 조제된 키메라 Eq1 항원; 그룹 2, 명반 중에 조제된 키메라 NSEq2 항원; 그룹 3, 명반 중에 조제된 키메라 EqNSb 항원; 그룹 4, 명반 중에 조제된 키메라 EqNS3 항원; 그룹 5, 명반 중에 조제된 키메라 EqP1 항원; 그룹 6, 명반(대조군). 마우스는 상응하는 그룹별로 재조합 키메라 항원 20μg을 제공받았다. 면역화는 근육내 주사에 의해서 0주, 2주 및 4주째에 수행되었다.
HCV 항원에 대한 항체 반응을 연구하기 위하여 0주 및 6주째에 채혈을 수행했다. 또한, 그룹당 5마리 마우스를 특이적 세포 반응의 연구를 위해 6주째에 죽였다. 그리고, 8주째에 그룹당 5마리를 HCV 구조 단백질을 발현하는 재조합 우두 바이러스 vvRE로 시험감염시켰고, 다른 5마리를 대조군 우두 바이러스 WR로 시험감염시켰다. 시험감염 후 5일 뒤에 마우스를 죽이고, 앞서 설명된 대로 난소에서 바이러스 역가를 결정했다.
HCV 항원에 대한 특이적 면역 반응이 도 19 내지 21에 도시된다. 평가된 반응은 ELISA에서 캡처 항원으로서, 또는 세포성 면역 반응을 결정하기 위한 분석에서 자극 항원으로서, 코어(아미노산 1-120), E1(HCV 폴리단백질의 아미노산 192-340), E2(HCV 폴리단백질의 아미노산 384-680) 및 NS3(HCV 폴리단백질에서 아미노산 1192 내지 1457) 단백질의 재조합 변이체를 이용하여 검출되었다. 도 19에 도시된 대로, 대조군을 제외하고 모든 그룹에서 상이한 키메라 항원들로 면역화된 그룹들 간에 통계적으로 유의한 차이 없이 특이적 항체 반응이 HCV 구조 단백질에 대해 유도되었다. HCV NS3의 영역을 포함하는 그룹 2, 3 및 4만 이 바이러스 항원에 대해서 항체 반응을 유도했으며, 이것은 그룹 2 및 3에 비해서 그룹 4에서 유의하게 월등했다(p<0.05, ANOVA 및 Newman-Keuls 다중 비교 시험).
도 20에 도시된 대로, 대조군을 제외하고 모든 그룹에서 특이적 증식 반응이 HCV 구조 항원에 대해 도출되었다. 이 경우, 코어 및 E1 항원에 대한 증식 반응은 그룹 1에 비해서 그룹 2, 3 및 5에서 유의하게 더 높았다(p<0.05, Newman-Keuls 다중 비교 시험 및 ANOVA). E2에 대한 증식 반응에 대하여 상이한 키메라 항원들로 면역화된 그룹들 간에 통계적으로 유의한 차이는 검출되지 않았다. HCV NS3의 영역을 포함하는 그룹 2, 3 및 4만 이 바이러스 항원에 대해서 증식 반응을 도출했으며, 이것은 그룹 2 및 3에 비해서 그룹 4에서 유의하게 월등했다(p<0.05, ANOVA 및 Newman-Keuls 다중 비교 시험).
특이적 IFN 감마 분비 반응의 분석(도 21)결과, 대조군을 제외하고 모든 그룹에서 HCV 구조 항원에 대하여 감마 분비 반응이 통계적으로 유의한 차이 없이 유도됨이 증명되었다. HCV NS3의 영역을 포함하는 그룹 2, 3 및 4만 이들 간 통계적으로 유의한 차이 없이 이 바이러스 항원에 대해서 IFN 감마 분비 반응을 유도했다.
또한, 대조군을 제외하고 모든 그룹은 바이러스 대용 시험감염 모델에서 특이적 바이러스 혈증(vvRE로의 시험감염)을 유의하게 제어할 수 있었다(도 22)(p <0.05, Kruskal Wallis 및 Dunn의 다중 비교 시험).
이 결과는 Eq1의 서열에 HCV NS3의 에피토프 또는 영역의 삽입이 HCV 구조 항원에 대해서 유도된 면역 반응에 영향 없이 이 바이러스 항원에 대한 특이적 면역 반응의 유도를 허용한다는 것을 증명했다. 또한, Eq1 단백질의 서열에 인공 에피토프 P1M과 P2B의 포함은 그것이 바이러스 대용 시험감염 모델에서 보호를 제공할 수 있으므로 이들 항원 또는 E2에 대한 특이적 체액성 또는 세포성 면역 반응을 유도하는 능력에 영향 없이 생체내 기능적 활성을 또한 유도하면서 코어 및 E1 항원에 대한 증식 반응의 유의한 증가를 허용한다.
실시예 7: 마우스에서 키메라 항원 Eq1 및 Eq1b의 비교 면역원성 연구
그룹당 17마리의 8주령된 암컷 BALB/c 16-18g 중량의 마우스를 면역화했다. 면역화 그룹은 다음과 같았다: 그룹 1, 명반 중에 조제된 키메라 Eq1b 항원; 그룹 2, 명반 중에 조제된 키메라 Eq1 항원; 그룹 3, 명반(대조군). 마우스는 상응하는 그룹별로 키메라 항원 20μg을 제공 받았다. 면역화는 근육내 주사에 의해서 0주, 2주 및 4주째에 수행되었다.
HCV 항원에 대한 항체 반응을 연구하기 위하여 0주 및 6주째에 채혈을 수행했다. 또한, 그룹당 5마리 마우스를 특이적 세포 반응의 연구를 위해 6주째에 죽였다. 그리고, 8주째에 그룹당 5마리를 HCV 구조 단백질을 발현하는 재조합 우두 바이러스 vvRE로 시험감염시켰고, 다른 5마리를 대조군 우두 바이러스 WR로 시험감염시켰다. 시험감염 후 5일 뒤에 마우스를 죽이고, 앞서 설명된 대로 난소에서 바이러스 역가를 결정했다.
HCV 항원에 대한 특이적 면역 반응이 도 23 및 24에 도시된다. 평가된 반응은 ELISA에서 캡처 항원으로서, 또는 세포성 면역 반응을 결정하기 위한 분석에서 자극 항원으로서, 코어(아미노산 1-120), E1(HCV 폴리단백질의 아미노산 192-340) 및 E2(HCV 폴리단백질의 아미노산 384-680) 단백질의 재조합 변이체를 이용하여 검출되었다. 상기 언급된 도면에 도시된 대로, 대조군에서는 아니지만 단백질로 면역화된 그룹에서 HCV 구조 항원에 대한 특이적 항체 및 증식 반응이 재조합 단백질로 면역화된 그룹들 간에 통계적으로 유의한 차이 없이 유도되었다.
한편, 대조군은 아니지만 키메라 항원으로 면역화된 그룹은 재조합 단백질로 면역화된 그룹들 간에 차이 없이 바이러스 대용 시험감염 모델에서 특이적 바이러스 혈증(vvRE로의 시험감염)을 유의하게 제어할 수 있었다(도 25)(p<0.05; Kruskal Wallis 및 Dunn의 다중 비교 시험).
<110> Center for Genetic Engineering and Biotechnology <120> CHIMERIC VACCINE ANTIGENS AGAINST HEPATITIS C VIRUS <130> HCV chim antigens <160> 18 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 3370 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence Description: Sequence corresponding to pIMCo64K plasmid <400> 1 cgggcacacc atcaccatca ccattaagat ccggtggatg accttttgaa tgacctttaa 60 tagattatat tactaattaa ttggggaccc tagaggtccc ttttttattt taaaaatttt 120 ttcacaaaac ggtttacaag cataaagctc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga 180 gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg 240 tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag 300 aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc 360 gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca 420 aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt 480 ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc 540 tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca 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315 320 Val Val Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His 325 330 335 Pro Asn Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe 340 345 350 Tyr Gly Lys Ala Ile Pro Leu Glu Val Ile Lys Gly Gly Arg His Leu 355 360 365 Ile Phe Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu 370 375 380 Val Ala Leu Gly Ile Asn Ala Val Leu Glu Met Ser Thr Asn Pro Lys 385 390 395 400 Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg Pro Gln Asp Val 405 410 415 Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro 420 425 430 Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg Gly Ser Arg Ala 435 440 445 His His His His His His 450 <210> 15 <211> 292 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence Description: Sequence corresponding to EqP1 antigen <400> 15 Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu Leu Lys Val Pro Asp Ile 1 5 10 15 Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala Val Glu Val Asn Val Gly 20 25 30 Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile Thr Leu Asp Leu Asp Ser 35 40 45 Gln Lys Ile Gln Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg 50 55 60 Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu Gln Thr Gly Phe Leu Ala Ala 65 70 75 80 Leu Phe Tyr Val His Arg Phe Asn Ser Ser Gly Cys Ser Asp Arg Met 85 90 95 Ala Ser Cys Arg Pro Ile Asp Thr Phe Asp Gln Gly Trp Gly Pro Ile 100 105 110 Thr Tyr Ala Glu Pro Arg Ser Leu Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His 115 120 125 Tyr Ala Pro Gln Pro Cys Gly Ile Val Pro Ala Ala Glu Val Cys Gly 130 135 140 Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp 145 150 155 160 Arg Ser Gly Val Pro Thr Tyr Asn Trp Gly Glu Asn Glu Thr Asp Val 165 170 175 Leu Leu Leu Lys Ala Ser Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Ala Ser Gly 180 185 190 Val Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu 195 200 205 Ala Asp Asp Met Ile Met Leu Glu Leu Pro Glu Tyr Val Ile Met Val 210 215 220 Lys Leu Pro Ser Arg Ala Leu Glu Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln 225 230 235 240 Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe 245 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epitope <400> 18 Gly Tyr Lys Val Ile Val Leu Asn Pro Arg Val Ala Ser Thr Leu 1 5 10 15

Claims (22)

  1. a) HCV 폴리단백질의 408-540 아미노산으로 구성된 E2 영역인 제1 세그먼트, b) HCV 폴리단백질의 190-222 아미노산으로 구성된 E1 영역인 제2 세그먼트 및 c) 이 단백질의 1-50 아미노산으로 구성된 코어 영역인 제3 세그먼트를 이 특정 순서대로 포함하는 C형 간염 바이러스(HCV)에 대한 키메라 백신 항원.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 항원의 아미노산 서열이 Eq1 항원인 서열번호 10, 및 Eq1b 항원인 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 키메라 백신 항원.
  3. 제 1 항에 있어서, T 헬퍼 림프구에 특이적인 적어도 하나의 에피토프를 상기 항원의 아미노산 서열에 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 백신 항원.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 T 헬퍼 림프구에 특이적인 에피토프가 HCV 비구조 단백질의 에피토프인 것을 특징으로 하는 키메라 백신 항원.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 비구조 단백질은 NS3인 것을 특징으로 하는 키메라 백신 항원.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 항원의 아미노산 서열이 EqNS3 항원인 서열번호 14인 것을 특징으로 하는 키메라 백신 항원.
  7. 제 3 항에 있어서, 상기 T 헬퍼 림프구에 특이적인 에피토프가 인공 에피토프인 것을 특징으로 하는 키메라 백신 항원.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 인공 에피토프는 서열번호 17의 에피토프 P1M, 및 서열번호 18의 에피토프 P2B로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 키메라 백신 항원.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 항원의 아미노산 서열은 NSEq2 항원인 서열번호 12, EqNSb 항원인 서열번호 13 및 EqP1 항원인 서열번호 15로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 키메라 백신 항원.
  10. a) HCV 폴리단백질의 408-540 아미노산으로 구성된 E2 영역인 제1 세그먼트, b) HCV 폴리단백질의 190-222 아미노산으로 구성된 E1 영역인 제2 세그먼트 및 c) HCV 폴리단백질의 1-50 아미노산으로 구성된 코어 영역인 제3 세그먼트를 이 특정 순서대로 포함하는 HCV에 대한 키메라 백신 항원; 및 부형제 또는 약학적으로 허용되는 애쥬번트를 포함하는 백신 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 제 2 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 키메라 백신 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  12. 제 10 항에 있어서, HCV 구조 항원 또는 HCV NS3 항원의 재조합 단백질 변이체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  13. 제 10 항에 있어서, 상기 HCV 구조 항원을 발현하는 DNA 면역화를 위한 플라스미드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  14. 제 10 항에 있어서, 상기 HCV 구조 항원을 발현하는 DNA 면역화를 위한 플라스미드, 및 HCV의 재조합 캡시드 단백질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  15. 제 10 항에 있어서, DNA 면역화를 위한 플라스미드, HCV 구조 항원의 재조합 단백질 또는 이들 두 가지의 혼합물에 기초한 제제와 함께 초회/보강 일정으로 투여될 수 있는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
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