ES2644801T3 - Antígenos de vacuna quimérica contra el virus de la hepatitis c - Google Patents
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Abstract
La presente invención describe antígenos vacunales quiméricos contra el virus de la hepatitis C (VHC) que comprenden regiones seleccionadas de diferentes antígenos de dicho virus, las que se ubican en un orden determinado dentro del polipéptido. Dichos antígenos quiméricos, además, pueden incluir epitopos específicos para linfocitos T auxiliadores, diseñados de forma artificial. Los antígenos quiméricos, así como las composiciones vacunales resultantes, son aplicables a la esfera de la medicina y la industria farmacéutica, y tienen un uso profiláctico y/o terapéutico contra el VHC. Las composiciones vacunales de la invención generan una respuesta inmune potente y de amplio espectro contra diferentes antígenos de dicho virus, con un mínimo de componentes.
Description
DESCRIPCIÓN
Antígenos de vacuna quimérica contra el virus de la hepatitis C
Campo técnico 5
La invención actual se refiere al campo médico y la industria farmacéutica, particularmente, al desarrollo de antígenos quiméricos contra el virus de la hepatitis C (HCV) y composiciones de vacuna que los comprenden. En esta invención, se utiliza una serie mínima de componentes debido a la selección precisa de regiones específicas de los antígenos HCV y la inclusión de epítopos artificiales, específicos para linfocitos T CD4+, agentes quiméricos 10 permiten inducir una potente y amplia respuesta inmunitaria contra HCV.
Antecedente de la invención
El HCV infecta aproximadamente 3% de la población mundial (Williams R. Hepatología 2006; 44: 521-526). La 15 mayoría de individuos infectados evoluciona hacia la cronicidad (Amoroso P, et al., J Hepatol 1998; 28: 939-944). La infección por hepatitis C es una de las causas principales del daño hepático crónico, cirrosis, falla hepática y cáncer de hígado (Hoofnagle JH. Hepatology 2002; 36 (5 Suppl 1): S21-S29). Actualmente, la infección por HCV es la causa principal de trasplante de hígado en países del primer mundo. Adicionalmente, la infección por HCV se ha relacionado con manifestaciones extra hepáticas como crioglobulinemia tipo II, glomerulonefritis 20 membranoproliferativa, porfiria cutánea tarda, entre otros. Actualmente, una vacuna preventiva contra este virus no está disponible y los tratamientos antivíricos convencionales en uso, basado en la combinación de interferón (IFN) pegilado + ribavirina, son efectivos en menos del 50% de los casos. Adicionalmente, los tratamientos mencionados anteriormente provocan múltiples eventos adversos (Ghany MG et al., Hepatology. 2009; 49 (4): 1335-74).
25
El HCV pertenece al género Hepacivirus de la familia Flaviviridae. Es un virus con envoltura, cuyas partículas víricas tienen aproximadamente 50 y 70 nm de diámetro y se asocian con lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) (Popescu Cl y Dubuisson J. Biol Cell. 2009; 102(1): 63-74). El genoma vírico es un ácido ribonucleico (ARN) de cadena positiva de aproximadamente 9,6 kb. El genoma codifica una poliproteína vírica que se procesa co y postraduccionalmente en por lo menos 10 proteínas víricas: Núcleo, E1, E2, p7 (proteínas estructurales) y proteínas 30 no estructurales: NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B (Bartenschlager R y Lohmann V. 2000. J Gen Virol. 81: 1631-48).
Existen diversos obstáculos importantes para el desarrollo de una vacuna efectiva contra HCV. Este patógeno es un virus de ARN que puede mutar rápidamente adaptándose al entorno del anfitrión. Esto contribuye a la alta diversidad 35 de los múltiples aislados víricos identificados en todo el mundo. Se han identificado seis genotipos de HCV principales, que pueden diferir hasta un 30% en la secuencia de nucleótidos (Simmonds P. J Hepatol. 1999; 31 Suppl 1:54-60). Se observa la mayor heterogeneidad en la región hipervariable de la proteína HCV E2, en el que se encuentra un epítopo potencialmente dirigido a neutralizar anticuerpos. De hecho, el HCV circula en el organismo como una población heterogénea de moléculas víricas, este fenómeno se conoce como cuasiespecies (Simmonds 40 P. J Gen Virol. 2004; 85 (Pt 11): 3173-88). Se ha demostrado que las mutaciones constituyen una forma de escape vírico a la respuesta inmunitaria celular y humoral específica desarrollada por el anfitrión.
Se debe enfatizar que el HCV provoca infección persistente en individuos inmunocompetentes, a pesar de la ocurrencia de una respuesta inmunitaria activa (Lechmann et al., Semin Liver Dis 2000, 20, 211-226). Actualmente, 45 diversos efectos víricos que contribuyen a la persistencia de la infección se han calculado al fomentar respuestas inmunitarias y relevantes y evitar una respuesta inmunitaria efectiva. Estos efectos se detectan sobre la inmunidad innata y adquirida (Grakoui A et al. Science 2003, 302 (5645): 659-62). Existen evidencias que soportan que una respuesta inmunitaria inefectiva contra HCV, no sólo falla en eliminar este patógeno, sino que también contribuye al daño hepático. 50
Hasta ahora, los parámetros inmunológicos que se correlacionan con la protección y clarificación contra HCV no se han definido completamente. Sin embargo, la inducción de la respuesta inmunitaria celular potente y sostenida contra diferentes antígenos HCV se considera particularmente importante (Lechmann et al., Semin Liver Dis 2000, 20, 211-226). En pacientes infectados crónicamente con HCV el deterioro de la respuesta de linfocitos T específicos 55 es particularmente significativo. Diversos mecanismos parecen contribuir a este efecto; uno de ellos es la acción de las células T reguladoras.
Se han intentado casi todas las estrategias de inmunización para desarrollar una vacuna contra HCV. Algunas de esas estrategias incluyen: proteínas recombinantes, péptidos sintéticos, partículas similares a virus, ácido 60 desoxirribonucleico (ADN) desnudo y virus recombinantes. Todos los antígenos víricos han sido evaluados como objetivos en candidatos de vacuna contra HCV. La mayoría de los candidatos de vacuna están en la etapa de estudios de inmunogenicidad en modelos animales. No obstante, actualmente algunos candidatos han alcanzado evaluación clínica, han demostrado ser seguros e inmunogénicos, pero aún no se ha demostrado un impacto clínico claro (Álvarez-Lajonchere L, Dueñas-Carrera S. Int Rev Immunol. 2012; 31(3): 223-42). 65
El desarrollo de un candidato de vacuna de proteína de subunidad fue una de las primeras estrategias evaluadas para obtener una vacuna HCV. Algunos de aquellos candidatos basados en antígenos estructurales han alcanzado protección limitada contra exposición vírica en modelos de animales. Tal es el caso de chimpancés inmunizados con un oligómero E1 y E2. Se inmunizaron siete chimpancés, cinco de ellos llegaron a protegerse y dos se infectaron, pero luego se aclaró el virus sin alcanzar cronicidad (Choo et al., Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91, 1294-1298). 5 Esta protección correlacionada con la presencia de anticuerpos capaces de inhibir la interacción entre proteínas E2 y células humanas (Rosa et al, Proc Natl Acad Sci USA 1996, 93, 1759-1763).
Una proteína E1 recombinante, de un aislado de genotipo 1b, se purifica como homodímeros (Maertens et al., Acta Gastroenterol Belg 2000, 63, 203). Se infectan crónicamente dos chimpancés con HCV, reciben 9 dosis de 50 μg de 10 esta proteína E1 recombinante. La vacunación mejoro la histología hepática, eliminó los antígenos víricos del hígado y redujo los niveles de alanina aminotransferasa. Sin embargo, los niveles de ARN en suero no cambian durante el tratamiento y reaparecen antígenos víricos e inflamación hepática después de terminación del tratamiento. Se observa una asociación entre altos niveles de anticuerpos anti-E1 y reducción de daños hepático (Maertens et al., Acta Gastroenterol Belg 2000, 63, 203). Se evalúa una variante de proteína E1 formulada en alúmina en humanos. 15 Este candidato es seguro e inmunogénico, induce anticuerpos específicos y respuestas linfoproliferativas (Nevens F, et al., Hepatology. 2003; 38 (5): 1289-96). Sin embargo, la administración de este candidato no afecta el curso clínico de la infección por HCV, ya que los pacientes no eliminan el virus, y no se observa mejora histológica hepática. El método de subunidades de proteína, como desventaja, no tiene inducida una fuerte respuesta inmunitaria celular en algunos casos. Este método puede tener otra desventaja: la inserción de regiones implicadas 20 en diferentes mecanismos de deterioro de respuesta inmunitaria específica para HCV inducida por el patógeno en diferentes niveles (Grakoui A et al, Science 2003, 302 (5645): 659-62).
Dos candidatos de vacunas basados en mezclas de péptidos sintéticos, que incluyen epítopos de linfocitos T, también se han alcanzados en ensayos clínicos (Yutani et al., Cancer Sci 2009.100(10): 1935-42, Klade et al., 25 Gastroenterology: 2008.134(5) de 1385-95). Los candidatos inducen respuestas inmunitarias específicas y tienen baja reactogenicidad en pacientes infectados crónicamente con HCV durante estudios clínicos fase I y II realizados hasta ahora (Álvarez-Lajonchere L, Dueñas-Carrera S. Int Rev Immunol. 2012; 31 (3): 223-42). No obstante, estos candidatos de vacuna han mostrado efecto significativo sobre la carga vírica y han tenido un efecto transitorio. Teniendo en cuenta que estos candidatos no han inducido ninguna mejora sobre la histología hepática, su impacto 30 clínico aún se tiene que demostrar. Diferentes epítopos para células CD4+ y T CD8+ que pueden ser importantes para la eliminación vírica Se han identificado a través de la poliproteína HCV. Estos hallazgos soportan los péptidos sintéticos basados en la estrategia de vacuna. Diferentes péptidos que incluyen epítopos Núcleo, NS4 y NS5, solos o con grupos funcionales de lípidos, han inducido fuertes respuestas citotóxicas T en ratones (Shirai et al., J infec Dis 1996, 173, 24-31; Hiranuma et al., J Gen Virol 1999, 80, 187-193; Oseroff et al., 1998, Vaccine 16, 823-833). La 35 principal desventaja de este método es que aquellos péptidos sin la función auxiliar T pueden ser pobres inmunógenos. Adicionalmente, la eficacia de la vacuna depende frecuentemente de la inducción de una respuesta inmunitaria de amplio espectro y multivalente contra varios antígenos. Como el número de péptidos incluidos en una vacuna aumenta, la complejidad de la formulación aumenta desde todos puntos de vista. Estas limitaciones son debilidades de este método. 40
En el documento US 2011/0256098 A1 se describen los usos de otras composiciones inmunoterapéuticas, en el que se utilizan composiciones inmunoterapéuticas en combinación con Estándar de Cuidado (SOC), o terapia de interferón en combinación con terapia antivírica, para el tratamiento de infección crónica por virus de la hepatitis C (HCV) y afecciones relacionadas. Los antígenos de HCV se emplean en estas composiciones inmunoterapéuticas. 45
De otra parte, se han evaluado diferentes vectores víricos recombinantes como candidatos de vacuna para HCV. Los adenovirus recombinantes defectuosos son candidatos atractivos, debido a su tropismo de hígado, su capacidad para inducir respuestas inmunitarias celulares humorales y la posibilidad de ser administrados mediante rutas parenterales y orales. Proteínas estructurales HCV que expresan adenovirus recombinantes incluyen respuestas de 50 anticuerpos contra cada una de estas proteínas (Makimura et al., 1996 Vaccine, 14, 28-36). Adicionalmente, después de la inmunización de ratones con adenovirus recombinante Núcleo y E1, se detecta una respuesta inmunitaria citotóxica T específica contra estos antígenos (Bruna-Romero et al., Hepatology 1997, 25, 470-477). Aunque estos son resultados alentadores; algunos problemas relacionados con el uso de adenovirus recombinantes en terapia génica han generado dudas acerca de su seguridad en humanos. Actualmente, un candidato de vacuna 55 basado en adenovirus recombinantes HCV está siendo evaluado en ensayos clínicos con buenos resultados en inmunogenicidad, pero sin evidencia de impacto clínico (Barnes et al., Sci Transl Med 2012; 4(115): 115). El uso de otros vectores víricos recombinantes, tal como vaccinia, viruela aviar y viruela canaria que contiene diferentes genes de HCV han inducido fuertes respuestas auxiliares y citotóxicas T en ratones (Shirai et al, J Virol 1994, 68, 3334-3342; Large et al., J Immunol 1999, 162, 931-938). Particularmente, un virus vaccinia modificada Ankara, 60 recombinante para antígenos NS3-NS5 no estructurales HCV, ha sido evaluado en ensayos clínicos en humanos (Fournillier et al., Vaccine. 2007; 25 (42): 7339-53). Este candidato fue inmunogénico y bien tolerado en un ensayo clínico fase I en pacientes infectados crónicamente con HCV. Del mismo modo que el método de péptidos, el efecto sobre la carga vírica fue transitorio y se observó solamente en una fracción de las vacunas; por lo tanto, aún el impacto clínico se tiene que demostrar. En general, los candidatos de vacuna basados en virus recombinantes están 65 obstaculizados por asuntos reglamentarios y de seguridad con relación a su aplicación.
La inmunización del ADN ha sido estudiada extensamente como una estrategia para el desarrollo de vacunas HCV. Los estudios en modelos animales han mostrado capacidad de estos candidatos para inducir respuestas inmunitarias celulares y humorales contra casi todos los antígenos HCV (Álvarez-Lajonchere L, Dueñas-Carrera S, Hum Vaccin. 2009; 5 (8): 568-71). Dos candidatos de vacunas que incluyen plásmidos de inmunización de ADN 5 contienen secuencias que codifican antígenos HCV están en ensayos clínicos en humanos (Álvarez-Lajonchere L, Dueñas Carrera S, Int Rev Immunol. 2012; 31 (3): 223-42). En un caso, es una vacuna de ADN que expresa proteínas NS3, NS5, administradas mediante electroporación (Sällberg M, et al., Expert Opin Biol Ther. 2009; 9 (7): 805-15). En el otro caso, su composición de vacuna basada en la mezcla de una proteína Núcleo recombinante y un plásmido de ADN que expresa antígenos estructurales HCV (Castellanos M, et al., J Gene Med. 2010; 12 (1): 107-10 16). Ambos candidatos han demostrado ser seguros, bien tolerados y respuestas inmunitarias específicas inducidas en sujetos inmunizados (Álvarez-Lajonchere L, Dueñas Carrera S, Int Rev Immunol. 2012; 31 (3): 223-42). En ninguno de estos dos casos, el efecto sobre el curso de la infección por HCV o una mejora histológica sostenida, han sido demostrados. Vacunas de ADN, a pesar de sus ventajas potenciales relacionados con su simplicidad y estabilidad, enfrentan retos regulatorios importantes. Su principal limitación parece estar relacionada con su 15 insuficiente inmunogenicidad en humanos, un fenómeno no entendido completamente hasta ahora, y que difiere considerablemente con los resultados obtenidos en modelos animales.
De acuerdo con los elementos mencionados anteriormente, el desarrollo de una vacuna profiláctica o terapéutica contra HCV es un problema no resuelto. La presente invención se dirige precisamente hacia esta meta. 20
Descripción de la invención
La presente invención resuelve el problema mencionado anteriormente al proporcionar un antígeno de vacuna quimérica de acuerdo con la reivindicación 1. También se describe aquí un antígeno de vacuna quimérico contra el 25 virus de la hepatitis C (HCV) que comprende: a) un primer segmento que corresponde a la región E2 (aminoácidos 408-540) de poliproteína de HCV, b) un segundo segmento que corresponde a la región de E1 (aminoácidos, 190-222) de la poliproteína HCV y c) un tercer segmento que corresponde a la región Núcleo (aminoácidos 1-50) de la poliproteína del HCV, en ese orden.
30
La novedad de la invención radica en la selección específica de epítopos y el orden en que se colocan en las variantes de proteína generadas. Este diseño de antígeno vacunal hace posible reducir el número de componentes necesarios para ampliar y potenciar el espectro de respuesta inmunitaria contra diferentes antígenos de HCV. Se describe aquí, por primera vez, una proteína de fusión que comprende una única región de poliproteína HCV de antígeno quimérico que corresponde a E2 (aminoácidos 408-540), E1 (aminoácidos, 190-222) y Núcleo 35 (aminoácidos 1-50) particularmente en ese orden. La respuesta inmunitaria es importante y se dirige, por lo tanto, contra un amplio espectro de antígenos víricos.
La selección de regiones específicas del HCV evita el uso de las regiones de proteínas víricas que pueden ejercer efectos inmunosupresores. De la misma manera evita el uso de otras regiones que pueden ser inmunodominantes 40 sobre aquella seleccionadas en la presente invención y que, si se incluye en el antígeno designado, limitaría la inducción de respuesta inmunitaria específica contra las regiones seleccionadas en la presente invención. De otra parte, la invención incluye el orden en el que se colocan las regiones seleccionadas en el antígeno de proteína artificial, dado el hecho de que este elemento influencia significativamente la inducción de la respuesta inmunitaria contra HCV, debido a diferencias en la exposición de epítopo y proceso de presentación al sistema inmunitario. De 45 hecho, en los antígenos quiméricos de la presente invención las regiones de núcleo, proteínas E1 y E2 se colocan en orden inverso con respecto aquel de la poliproteína vírica natural.
En una realización de la invención, la secuencia del antígeno de vacuna quimérico se seleccionada entre el grupo compuesto de la SEQ ID No. 10 (antígeno Eq1) y SEQ ID No. 16 (antígeno Eq1b). 50
Los antígenos quiméricos de la invención pueden incluir adicionalmente en su secuencia de por lo menos un epítopo específico de linfocito auxiliar T. En la materialización de la invención, el epítopo específico de linfocito auxiliar T incluido en los antígenos quiméricos es un epítopo de las proteínas no estructurales HCV. En una realización particular, la proteína no estructural es NS3. Más particularmente, la invención proporciona un antígeno de vacuna 55 quimérico caracterizado por la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID No. 14 (antígeno EqNS3).
Adicionalmente se describe aquí, que el epítopo específico de linfocito T auxiliar incluido en los antígenos quiméricos es un epítopo artificial de linfocitos T CD4+. En el contexto de la invención, el término epítopo artificial define un epítopo cuya secuencia de aminoácidos no existe en forma natural; en cambio se diseña por bioinformática. La 60 selección e inclusión de los epítopos artificiales, que se reconocen mediante los linfocitos auxiliares T, contribuye a la inducción de una respuesta inmunitaria específica contra los epítopos HCV incluidos en las variantes antigénicas quiméricas. Por primera vez, se describe aquí como epítopos artificiales para los epítopos de los linfocitos auxiliares T son P1M (SEQ ID No. 17) y P2B (SEQ ID No. 18). Estos epítopos se diseñan para contener un motivo de Unión HLA-DR13 y HLA-DR11. Por lo tanto, se describe aquí un epítopo específico de linfocito auxiliar T cuya secuencia 65 de aminoácidos corresponde a aquella identificada como SEQ ID No. 17 o SEQ ID No. 18.
En una materialización de la invención los agentes quiméricos contienen una secuencia de aminoácidos que es seleccionada del grupo compuesto de la SEQ ID No. 12 (antígeno NSEq2), SEQ ID No. 13 (antígeno EqNSb) y SEQ ID No. 15 (antígeno EqP1), y ellos contienen por lo menos uno de los epítopos específicos de linfocito auxiliar T.
5
Los siguientes antígenos quiméricos tienen las características resumidas adelante: el antígeno Eq1 quimérico (SEQ ID No. 10) comprende las regiones E2 (aminoácidos 408-540), E1 (aminoácidos, 190-222) y Núcleo (aminoácidos 1-50) de la poliproteína HCV en ese orden particular. El antígeno NSEq2 quimérico (SEQ ID No. 12) incluye epítopos P2B y P1M, en ese orden, insertados en Eq1, entre las regiones E1 (aminoácidos, 190-222) y Núcleo (aminoácidos 1-50). El antígeno EqNSb quimérico (SEQ ID No. 13) incluye el epítopo P2B insertado en Eq1 entre las regiones E1 10 (aminoácidos, 190-222) y Núcleo (aminoácidos 1-50). El antígeno EqNS3 quimérico (SEQ ID No. 14) incluye las regiones 1242-1415 de aminoácidos de la poliproteína HCV insertada en Eq1, entre las regiones E1 (aminoácidos, 190-222) y Núcleo (aminoácidos 1-50). El antígeno EqP1 quimérico (SEQ ID No. 15) incluye el epítopo P1M, insertado en Eq1, entre las regiones E1 (aminoácidos, 190-222) y Núcleo (aminoácidos 1-50). El antígeno Eq1b quimérico (SEQ ID No. 16) comprende las regiones E2 (aminoácidos 408-540), E1 (aminoácidos, 190-222) y Núcleo 15 (aminoácidos 1-50) de la poliproteína HCV, en ese orden particular, pero cuyo caso la secuencia de aminoácidos corresponde al genotipo 1 HCV una variante H77 (Secuencia de referencia NCBI: NC_004102.1).
Se describe aquí que el antígeno quimérico se obtiene mediante tecnología de ADN recombinante, a partir de bacterias transformadas con plásmidos descritos en el ejemplo 1. No obstante, los expertos en esta técnica saben 20 que dichos antígenos se pueden obtener de otros anfitriones y se pueden purificar mediante procedimientos ampliamente conocidos, para ser utilizados para inmunización.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición de vacuna que comprende un antígeno de vacuna quimérico contra HCV que está compuesto de a) un primer segmento que consiste de la región E2 (aminoácidos 408 25 540) de poliproteína de HCV, b) un segundo segmento que consiste de la región E1 (aminoácidos, 190-222) de la poliproteína HCV y c) un tercer segmento que consiste de la región Núcleo (aminoácidos 1-50) de la poliproteína HCV, en ese orden; y un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o adyuvante.
En una materialización de la invención, la composición de vacuna comprende los antígenos identificados como SEQ 30 ID No. 10 (antígeno Eq1), SEQ ID No. 16 (antígeno Eq1b), SEQ ID No. 14 (antígeno EqNS3), SEQ ID No. 12 (antígeno NSEq2), SEQ ID No. 13 (antígeno EqNSb) o SEQ ID No. 15 (antígeno EqP1).
Para los propósitos de la invención, un amplio rango de adyuvantes farmacéuticamente aceptables, que están comercialmente disponibles o aquellas en etapas de desarrollo, se pueden utilizar para potenciar la respuesta 35 inmunitaria contra antígenos quiméricos contenidos en las composiciones de vacuna objeto de la invención.
Las composiciones de vacuna de la invención también pueden comprender una variante de proteína recombinante de antígenos estructurales HCV o NS3. Adicionalmente, las composiciones de vacuna de la invención pueden comprender un plásmido para inmunización de ADN, que expresa antígenos estructurales HCV. En otra realización 40 de la invención, los antígenos quiméricos se pueden formular con un plásmido para inmunización de ADN, que expresa antígenos estructurales HCV y una proteína de cápsida recombinante HCV, simultáneamente.
En otro aspecto, la invención incluye que la composición de vacuna que comprende un antígeno quimérico de vacuna contra HCV incluye: a) un primer segmento que consiste de la región E2 (aminoácidos 408 540) de 45 poliproteína HCV, b) un segundo segmento que consiste de la región E1 (aminoácidos, 190-222) de la poliproteína HCV y c) un tercer segmento que consiste de la región Núcleo (aminoácidos1-50) de la poliproteína HCV, en ese orden, que puede ser administrados de sensibilización/refuerzo junto con preparaciones basadas en plásmidos para inmunización de ADN, variantes de recombinación de proteínas estructurales HCV o una mezcla de los mismos.
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Las composiciones de vacuna que son objetos de la presente invención tienen la ventaja de inducir tanto respuestas inmunitarias humorales como celulares contra diversos antígenos HCV, por lo tanto, son activas contra un amplio espectro de aislados víricos y son capaces de inducir protección en un modelo de exposición vírico subrogado.
Las composiciones de vacuna se pueden administrar mediante rutas intramusculares, intradérmicas, 55 intraperitoneales, subcutáneas, intravenosa, intramucosa, o sublingual o cualquier otra ruta conocida por los expertos en el campo. De otra parte, la administración puede ser por medio de jeringas, pulverización o cualquier otro dispositivo de administración.
La invención también proporciona un antígeno de vacuna quimérico, o composición de vacuna que lo comprende, 60 para uso de acuerdo con la reivindicación 11. También se describe aquí el uso antígenos de vacuna quiméricos compuestos de un primer segmento que consiste de la región E2 (aminoácidos 408-540) de la poliproteína HCV, un segundo segmento que consiste de la región E1 (aminoácidos, 190-222) de la poliproteína HCV en un tercer segmento que consiste de la región Núcleo (aminoácidos 1-50) de la poliproteína de HCV, en ese orden, para la fabricación de una vacuna para inducir una respuesta inmunitaria contra HCV. Se describe aquí que la vacuna 65 mencionada anteriormente es capaz de inducir protección in vivo en un modelo de exposición vírico subrogado.
De otra parte, las vacunas de la invención son capaces de inducir respuestas en individuos saludables o en pacientes infectados con HCV. Por lo tanto, se describe aquí un método para la inducción de respuesta inmunitaria contra HCV. Este método se caracteriza por la administración del agente quimérico compuesto de un primer segmento que consiste de la región E2 (aminoácidos 408-540) de la poliproteína HCV, un segundo segmento 5 consiste de la región E1 (aminoácidos, 190-222) de la poliproteína HCV y un tercer segmento consiste de la región Núcleo (aminoácidos 1-50) de la poliproteína HCV, en ese orden, o una composición de vacuna que contiene el antígeno mencionado anteriormente, a un individuo saludable o afectado con HCV.
Cabe observar que el método mencionado anteriormente, el antígeno de vacuna quimérico, o la composición de 10 vacuna que lo contiene, se administra en programas de exposición/refuerzo con preparaciones basadas de plásmidos inmunización de ADN, variantes de recombinación de antígenos estructurales HCV o una mezcla de ambos.
Para el tratamiento de pacientes infectados con HCV, los antígenos de la invención o las composiciones de vacunas 15 que los contienen se pueden administrar simultáneamente con los medicamentos incluidos en el estándar de cuidado para este tipo de pacientes.
Breve descripción de las figuras
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Figura 1. Mapas de plásmidos que contienen la secuencia que codifica los diferentes antígenos quiméricos. A: plMCo64K, plásmido para la expresión del antígeno Coq1. B: plME64K, plásmido para la expresión del antígeno Eq1. C: plME164K, plásmido para la expresión de antígeno E1q1. D: plNSE64K, plásmido para la expresión del antígeno NSEq2. E: plENSb, plásmido para la expresión de antígeno EqNSb. F: plENS3, plásmido para la expresión del antígeno EqNS3. G: plMP1E64K, plásmido para la expresión del antígeno EqP1. H: plME64Kb, plásmido para la 25 expresión de antígeno Eq1b.
Figura 2. Representación esquemática de los diferentes antígenos quiméricos. A: antígeno Coq1, comprende regiones Núcleo (aminoácidos 1-50), E1 (aminoácidos 190-222) y E2 (aminoácidos 408-540) de poliproteína VHC. B: antígeno Eq1, comprende E2 (aminoácidos 408-540), E1 (aminoácidos 190-222) y Núcleo (aminoácidos 1-50) de 30 poliproteína HCV. C: antígeno E1q1, comprende E1 (aminoácidos 190-222), E2 (aminoácidos 408-540) y Núcleo (aminoácidos 1-50) de la poliproteína HCV. D: antígeno NSEq2, que incluye los epítopos P2B y P1M, insertados en Eq1 entre regiones E1 (aminoácidos 190-222) y Núcleo (aminoácidos 1-50). E: antígeno EqNSb, incluye epítopo P2B insertado en Eq1, entre regiones E1 (aminoácidos, 190-222) y Núcleo (aminoácidos 1-50). F: antígeno EqNS3, incluye regiones 1242-1415 de aminoácidos de poliproteína HCV, insertado entre regiones E1 (aminoácidos 190-35 222) y Núcleo (aminoácidos 1-50) en Eq1. G: antígeno EqP1, incluye el epítopo P1M insertado en Eq1, entre regiones E1 (aminoácidos 190-222) y Núcleo (aminoácidos 1-50). H: antígeno Eq1b, comprende regiones E2 (aminoácidos 408-540), E1 (aminoácidos, 190-222) y Núcleo (aminoácidos 1-50) del genotipo 1 una variante H77 de la poliproteína HCV.
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Figura 3. Respuesta de anticuerpo contra proteínas HCV en los programas de inmunización con diferentes antígenos quiméricos. Los resultados se muestran en el eje Y como recíprocos del título de anticuerpo, definido como dilución máxima en el que el suero muestra una densidad óptica en 492 nm en por lo menos dos veces más que la densidad media óptica del suero del grupo de control negativo, determinado por ELISA. En el eje X, se muestran diferentes inmunógenos administrados a ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación 45 estándar de los valores medios de cada grupo. Se evalúa la respuesta inmunitaria utilizando variantes recombinantes de Núcleo (aminoácidos 1-120 de la proteína cápsida), E1 (aminoácidos 192-340 de la poliproteína HCV) y E2 (aminoácidos 384-680 de la poliproteína HCV) como antígenos de recubrimiento en el ELISA.
Figura 4. Respuesta proliferativa contra proteínas HCV en el programa de inmunización con diferentes antígenos 50 quiméricos. Los resultados se muestran en el eje Y como índice de estimulación, definido como la relación de células que proliferan en estimulación a células que proliferan sin estimulación, determinado en un ensayo de citometría con teñido CFSE. Un índice de estimulación mayor de dos se considera positivo. En el eje X, se muestran los diferentes inmunógenos administrados a ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de los valores promedio de cada grupo. La respuesta inmunitaria se evalúa utilizando variantes recombinantes de Núcleo 55 (aminoácidos 1-120 de la proteína cápside), E1 (aminoácidos 192-340 de la poliproteína HCV) y E2 (aminoácidos 384-680 de la poliproteína HCV) como antígenos estimulantes de células.
Figura 5. Respuesta de la secreción IFN gamma contra proteínas HCV en el programa de inmunización con diferentes antígenos quiméricos. El eje Y representa el número de puntos de red por millón de células, que se define 60 como el número de puntos detectados en la condición estimulada menos el número de puntos detectados en la condición no estimulada, determinado por ensayo ELISPOT de secreción IFN gamma. Sobre el eje X, se muestran los diferentes inmunógenos administrados a ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de los valores promedio de cada grupo. La respuesta inmunitaria fue evaluada utilizando variantes recombinantes de Núcleo (aminoácidos 1-120 de la proteína de cápsida), E1 (aminoácidos 192-340 de la poliproteína HCV) y E2 65 (aminoácidos 384-680 de la poliproteína HCV) como antígenos de estimulación celular.
Figura 6: Respuesta contra exposición vírica en el programa de inmunización con diferentes antígenos quiméricos. Los resultados se muestran en el eje Y como el logaritmo del título vírico, definido como el logaritmo del número de unidades formadoras de placa por mL, detectado en los ovarios de ratones hembra después de la exposición vírica. Los virus vaccinia utilizados para exposición vírica fueron los virus vvRE, virus vaccinia que expresa Núcleo, 5 antígenos E1 y E2 (región de aminoácidos 1-650 en la poliproteína HCV) y virus vaccinia WR que no expresa antígenos HCV. El eje X muestra los diferentes inmunógenos administrados a ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de los valores promedio de cada grupo.
Figura 7: Respuesta de anticuerpo contra proteínas HCV en el programa de inmunización con Eq1 mezclado con 10 NS3. Los resultados se muestran en el eje Y como el título de anticuerpo recíproco determinado por ELISA. El eje X muestra los diferentes inmunógenos administrados a ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de los valores medios de cada grupo. La respuesta se evalúa utilizando variantes recombinantes de la proteína Núcleo (aminoácidos 1-120 de la proteína de cápsida), E1 (aminoácidos 192-340 de la poliproteína HCV), E2 (aminoácidos 384-680 de la poliproteína HCV) y NS3 (aminoácidos 1192-1457 de la poliproteína HCV) como 15 antígenos de recubrimiento en el ELISA.
Figura 8: Respuesta proliferativa contra proteínas HCV en el programa de inmunización con Eq1 mezclado con NS3. Los resultados se muestran en el eje Y como el índice de estimulación, determinado en un ensayo de citometría con teñido CFSE. Un índice de estimulación mayor de dos se considera positivo. El eje X muestra los diferentes 20 inmunógenos administrados a ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de los valores promedio de cada grupo. La respuesta se evalúa utilizando variantes recombinantes de la proteína Núcleo (aminoácidos 1-120 de la proteína de cápsida), E1 (aminoácidos 192-340 de la poliproteína HCV) y NS3 (aminoácidos 1192-1457 de la poliproteína HCV) como antígenos de estimulación celular.
25
Figura 9: Respuesta de secreción IFN gamma contra proteínas HCV en el programa de inmunización con Eq1 mezclado con NS3. El eje Y representa el número de puntos de red por millón de células determinado por ensayo de ELISPOT de secreción IFN gamma. El eje X muestra los diferentes inmunógenos administrados a ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de los valores promedio de cada grupo. La respuesta se evalúa utilizando variantes recombinantes de la proteína Núcleo (aminoácidos 1-120 de la proteína de cápsida), E1 30 (aminoácidos 384-680 de la poliproteína HCV) y NS3 (aminoácidos 1192-1457 de la poliproteína HCV) como antígenos estimuladores celulares.
Figura 10: Respuesta contra exposición vírica en el programa de inmunización con Eq1 mezclado con NS3. Los resultados se muestran en el eje Y como el logaritmo del título vírico. Los virus vaccinia utilizados para exposición 35 vírica fueron vvRE y WR. El eje X muestra los diferentes inmunógenos administrados a ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de los valores promedio de cada grupo.
Figura 11: Respuesta de anticuerpos contra proteínas HCV en el programa de inmunización con Eq1 combinado con plásmidos para inmunización de ADN. Los resultados se muestran en el eje Y como el título de anticuerpo recíproco 40 determinado mediante ELISA. El eje X muestra los diferentes inmunógenos administrados a ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de los valores promedio de cada grupo. La respuesta se evalúa utilizando variantes recombinantes de la proteína Núcleo (aminoácidos 1-120 de la proteína de cápsida), E1 (aminoácidos 192-340 de la poliproteína HCV) y E2 (aminoácidos 384-680 de la poliproteína HCV) como agentes de recubrimiento en el ELISA. 45
Figura 12: Respuestas proliferativas contra proteínas HCV en el programa de inmunización con Eq1 combinado con plásmido para inmunización de ADN. Los resultados se muestran en el eje Y como el índice de estimulación, determinado en un ensayo de citometría con teñido CFSE. Un índice de estimulación mayor de dos se considera positivo. El eje X muestra diferentes inmunógenos administrados a ratones BALB/c. Las barras de error muestran la 50 desviación estándar de los valores promedio de cada grupo. La respuesta inmunitaria se evalúa utilizando variantes recombinantes de Núcleo (aminoácidos 1-120 de la proteína de cápsida), E1 (aminoácidos 192-340 de la poliproteína HCV) y E2 (aminoácidos 384-680 de la poliproteína HCV) como agentes de estimulación celular.
Figura 13: Respuesta de secreción IFN gamma contra proteínas HCV en el programa de inmunización con Eq1 55 combinado con plásmidos para inmunización de ADN. El eje Y representa el número de puntos de red por millón de células, determinado por el ensayo de ELISPOT de secreción IFN gamma. El eje X muestra los diferentes inmunógenos administrados a ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de los valores promedio de cada grupo. La respuesta se evalúa utilizando variantes recombinantes de la proteína Núcleo (aminoácidos 1-120 de la proteína de cápsida), E1 (aminoácidos 192-340 de la poliproteína HCV) y E2 (aminoácidos 60 384-680 de la poliproteína HCV) como agentes de estimulación celular.
Figura 14: Respuesta contra exposición vírica en el programa de inmunización con Eq1 combinado con plásmidos para inmunización de ADN. Los resultados se muestran en el eje Y como el logaritmo del título vírico detectado en ovarios de ratones hembra después de la exposición vírica. Para exposición vírica se utilizan los virus vvRE y WR. El 65
eje X muestra diferentes inmunógenos administrados a ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de los valores promedio de cada grupo.
Figura 15: Respuesta de anticuerpos contra proteínas HCV en el programa de inmunización con Eq1 mezclado con variantes recombinantes de las proteínas estructurales HCV. Los resultados se muestran en el eje Y como el título 5 de anticuerpo recíproco determinado por ELISA. El eje X muestra los diferentes inmunógenos administrados a ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de los valores promedio de cada grupo. La respuesta se evalúa utilizando variantes recombinantes de la proteína Núcleo (aminoácidos 1-120 de la proteína de cápsida), E1 (192-340 de la poliproteína HCV) y E2 (aminoácidos 384-680 de la poliproteína HCV) como antígenos de recubrimiento en el ELISA. 10
Figura 16. Respuesta proliferativa contra proteínas HCV en el programa de inmunización con Eq1 mezclado con variantes recombinantes de proteínas estructurales HCV. Los resultados se muestran como el índice de estimulación, determinado en un ensayo de citometría con teñido CFSE. Un índice de estimulación mayor de dos se considera positivo. Se muestran los diferentes inmunógenos administrados a ratones BALB/c. Las barras de error 15 muestran la desviación estándar de los valores promedio de cada grupo. Se evalúa la respuesta inmunitaria utilizando variantes recombinantes de Núcleo (aminoácidos 1-120 de la proteína de cápsida), E1 (aminoácidos 192-340 de la poliproteína HCV) y E2 (aminoácidos 384-680 de la poliproteína HCV) como antígenos de estimulación celular.
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Figura 17. Respuesta de secreción IFN gamma contra proteínas HCV en el programa de inmunización con Eq1 mezclado con variantes recombinantes de proteínas estructurales HCV. Los resultados se muestran como puntos de red por millón de células determinado en un ensayo ELISPOT IFN gamma. Se muestran diferentes inmunógenos administrados a ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de los valores promedio de cada grupo. Se evalúa la respuesta inmunitaria utilizando variantes recombinantes de Núcleo (aminoácidos 1-120 de 25 la proteína de cápsida), E1 (aminoácidos 192-340 de poliproteína HCV) y E2 (aminoácidos 384-680 de poliproteína HCV) como antígenos estimuladores celulares.
Figura 18. Respuesta contra exposición vírica en el programa de inmunización con Eq1 mezclado con variantes recombinantes de proteínas estructurales HCV. Se muestran resultados como el logaritmo del título vírico detectado 30 en los ovarios de ratones hembra después de exposición vírica. Se utilizan virus vaccinia vvRE y WR para exposición vírica. Se muestran diferentes inmunógenos administrados a ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de los valores promedio de cada grupo.
Figura 19. Respuesta de anticuerpo contra proteínas HCV en el programa de inmunización con diferentes antígenos 35 quiméricos que incluyen epítopos artificiales y epítopos de la proteína NS3. Los resultados se muestran como títulos de anticuerpos medios recíprocos, determinados por ELISA. Se muestran diferentes inmunógenos administrados a ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de los valores promedio de cada grupo. Se evalúa la respuesta inmunitaria utilizando variantes recombinantes de Núcleo (aminoácidos 1-120 de la proteína de cápsida), E1 (aminoácidos 192-340 de la poliproteína HCV) y E2 (aminoácidos 384-680 de la poliproteína HCV) y 40 NS3 (aminoácidos 1192-1457 de la poliproteína HCV) como antígenos de recubrimiento en el ELISA.
Figura 20. Respuesta proliferativa contra proteínas HCV en el programa de inmunización con diferentes antígenos quiméricos que incluyen epítopos artificiales y epítopos de la proteína NS3. Los resultados se muestran como índice de estimulación, determinado en un ensayo de citometría con teñido CFSE. Un índice de estimulación mayor de dos 45 se considera positivo. Se muestran los diferentes inmunógenos administrados a ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de los valores promedio de cada grupo. Se evalúa la respuesta inmunitaria utilizando variantes recombinantes de Núcleo (aminoácidos 1-120 de la proteína de cápsida), E1 (aminoácidos 192-340 de la poliproteína HCV) y E2 (aminoácidos 384-680 de la poliproteína HCV) y NS3 (aminoácidos 1192-1457 de la poliproteína HCV) como antígenos estimuladores celulares. 50
Figura 21. Respuesta de secreción IFN gamma contra proteínas HCV en el programa de inmunización con diferentes antígenos quiméricos que incluyen epítopos artificiales y epítopos de la proteína NS3. Los resultados se muestran como puntos de red por millón de células determinados por un ensayo ELISPOT IFN-gamma. Se muestran los diferentes inmunógenos administrados a ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de los 55 valores promedio de cada grupo. Se evalúa la respuesta inmunitaria utilizando variantes recombinantes de Núcleo (aminoácidos 1-120 de la proteína de cápsida), E1 (aminoácidos 192-340 de la poliproteína HCV) y E2 (aminoácidos 384-680 de la poliproteína HCV) y NS3 (aminoácidos 1192-1457 de la poliproteína HCV) como agentes de estimulación celular.
60
Figura 22. Respuesta contra exposición vírica en el programa de inmunización con diferentes antígenos quiméricos que incluyen epítopos artificiales y epítopos de la proteína NS3. Se muestran los resultados como el logaritmo de título vírico detectado en ovarios de ratones hembra después de exposición vírica. Los virus vaccinia vvRE y WR se utilizan para exposición vírica. Se muestran diferentes inmunógenos administrados a ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de los valores promedio de cada grupo. 65
Figura 23. Respuesta de anticuerpo contra proteínas HCV en el programa de inmunización con antígenos Eq1 quiméricos y Eq1b. Se muestran los resultados como el título de anticuerpo promedio recíproco, determinado por ELISA. Se muestran los diferentes inmunógenos administrados a ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de los valores promedio de cada grupo. Se evalúa la respuesta inmunitaria utilizando variantes recombinantes de Núcleo (aminoácidos 1-120 de la proteína de cápsida), E1 (aminoácidos 192-340 de la 5 poliproteína HCV) y E2 (aminoácidos 384-680 de la poliproteína HCV) como antígenos de recubrimiento en el ELISA.
Figura 24. Respuesta proliferativa contra proteínas HCV en el programa de inmunización con antígenos Eq1 y Eq1b quiméricos. Los resultados se muestran como el índice de estimulación, determinado en un ensayo de citometría con 10 teñido CFSE. Un índice de estimulación mayor de dos se considera positivo. Se muestran los diferentes inmunógenos administrados a ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de los valores promedio de cada grupo. Se evalúa la respuesta inmunitaria utilizando variantes recombinantes de Núcleo (aminoácidos 1-120 de la proteína de cápsida), E1 (aminoácidos 192-340 de la poliproteína HCV) y E2 (aminoácidos 384-680 de la poliproteína HCV) como antígenos estimuladores celulares. 15
Figura 25. Respuesta contra exposición vírica en el programa de inmunización con antígenos Eq1 y Eq1b quiméricos. Se muestran los resultados como el logaritmo del título vírico detectado en los ovarios de ratones hembra después de exposición vírica. Se utilizan virus vaccinia vvRE y WR para exposición vírica. Se muestran los diferentes inmunógenos administrados a ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de los 20 valores promedio de cada grupo.
Exposición detallada de los modos experimentales / Ejemplos de desempeño
Ejemplo 1. Generación de diferentes antígenos quiméricos que incluyen epítopos HCV 25
Como se muestra en la figura 1, se obtienen los plásmidos plMCo64K (SEQ ID No. 1), plME64K (SEQ ID No. 2), plME164K (SEQ ID No. 3), plNSE64K (SEQ ID No. 4), plENSb (SEQ ID No. 5), plENS3 (SEQ ID No. 6), plMP1E64K (SEQ ID No. 7), plME64Kb (SEQ ID No. 8). Los plásmidos permiten la expresión de Escherichia coli de los antígenos quiméricos Coq1 (SEQ ID No. 9), Eq1 (SEQ ID No. 10), E1q1 (SEQ ID No. 11), NSEq2 (SEQ ID No. 12), EqNSb 30 (SEQ ID No. 13), EqNS3 (SEQ ID No. 14), EqP1 (SEQ ID No. 15) y Eq1b (SEQ ID No. 16), respectivamente, representado en la figura 2. En todos los casos, con la excepción del antígeno Eq1 b (cuya secuencia viene de la cepa H77 de HCV, genotipo 1a), la secuencia de aminoácidos viene del genotipo 1b de HCV aislado (González-Horta EE, Eur Rev Med Pharmacol SCI. 2011; 15 (11): 1320-7).
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Como se muestra en la figura 2, el antígeno Coq1 quimérico (SEQ ID No. 9) comprende las regiones Núcleo (aminoácidos 1-50), E1 (aminoácidos, 190-222) y E2 (aminoácidos 408-540) de la poliproteína HCV, ubicada en este orden particular. El antígeno Eq1 quimérico (SEQ ID No. 10) comprende, igualmente, las regiones E2 (aminoácidos 408-540, E1 (aminoácidos, 190-222) y Núcleo (aminoácidos 1-50) de la poliproteína HCV, pero en este otro orden particular. El antígeno E1q1 quimérico (SEQ ID No. 11) comprende las mismas regiones, pero en el siguiente orden: 40 E1 (aminoácidos 190-222), E2 (aminoácidos 408-540), y Núcleo (aminoácidos 1-50) de la poliproteína HCV. El antígeno quimérico NSEq2 (SEQ ID No. 12) incluye los epítopos P2B y P1M, en este orden, insertado en Eq1, regiones entre E1 (aminoácidos 190-222) y Núcleo (aminoácidos 1-50). De otra parte, el antígeno EqNSb quimérico (SEQ ID No. 13) incluye el epítopo P2B insertado en Eq1 entre las regiones E1 (aminoácidos 190-222) y Núcleo (aminoácidos 1-50). El antígeno EqNS3 quimérico (SEQ ID No. 14) incluye la región de aminoácidos 1242-1415 de 45 la poliproteína HCV, insertada entre las regiones E1 (aminoácidos 190-222) y Núcleo (aminoácidos 1-50) del antígeno Eq1 quimérico. El antígeno EqP1 quimérico (SEQ ID No. 15) incluye el epítopo P1M insertado en Eq1, entre las regiones E1 (aminoácidos, 190-222) y Núcleo (aminoácidos 1-50). El antígeno Eq1b quimérico (SEQ ID No. 16) comprende las regiones E2 (aminoácidos 408-540), E1 (aminoácidos 190-222) y Núcleo (aminoácidos 1-50) de la poliproteína HCV, en este orden particular, pero en este caso la secuencia de aminoácidos corresponde a la cepa 50 H77 HCV, genotipo 1 a (secuencia de referencia NCBI: Inc_004102.1).
Los epítopos P1M y P2B artificiales, incluidos en algunos de los antígenos quiméricos se diseñan mediante bioinformática que se va a reconocer por los linfocitos auxiliares T humanos. Los motivos de unión para HLA-DR13 y HLA-DR11 se estudian, utilizando los programas Rankpep, SYFPETHI y ProPred, con el fin de proponer las 55 variantes de aminoácidos por posición en los epítopos artificiales, de acuerdo con la frecuencia de aparición. Como epítopos artificiales específicos para linfocitos auxiliares T, se describe P1M, de 14 aminoácidos, cuya secuencia es LPEYVIMVKLPSRA (SEQ ID No. 17); y P2B de 15 aminoácidos, cuya secuencia es GYKVIVLNPRVASTL (SEQ ID No. 18).
60
Para la expresión de los antígenos de proteína recombinante, las células competentes de la cepa bacteriana E.coli GC-366 se transforman con plásmidos respectivos. La expresión de las proteínas recombinantes se desarrolla durante 12h a 37 grados Celsius, empleando medio de cultivo celular mínimo. Todos los antígenos de proteína están comprendidos para expresión de proteína, en el terminal N, un fragmento proveniente de proteína P64K Neisseria meningitidis, previamente conocida por esta función (Yero D et al., Biotechnol Appl Biochem. 2006; 44 (Pt 1): 27-34). 65 Por otra parte, las variantes de proteína comprenden en el terminal C una etiqueta seis-histidina con el objetivo de
facilitar la purificación de proteínas. De hecho, las proteínas se purifican a través de la solubilización de la fracción insoluble que proviene de la interrupción celular, con regulador pH 9.6 de carbonato-bicarbonato, Urea 8M y cromatografía de afinidad de quelación de metal posterior.
Ejemplo 2. Estudio de inmunogenicidad en ratones de diferentes antígenos quiméricos que comprenden epítopos 5 HCV
Se inmunizan ratones BALB/c, de 8 semanas de edad, de 16-18 g de peso, 17 animales por grupo. Los grupos de inmunización fueron como sigue: Grupo 1, agente Coq1 quimérico formulado en alúmina; Grupo 2, antígeno E1q1 formulado en alúmina; Grupo 3, antígeno Eq1 formulado en alúmina; Grupo 4, alúmina (grupo de control). En todos 10 los casos, se administra 20 μg de antígenos recombinantes. Las inmunizaciones se llevan a cabo en las semanas 0, 2 y 4, mediante inyección intramuscular.
Se llevó a cabo recolección sanguínea en las semanas 0 y 6 para estudiar la respuesta de anticuerpos contra los antígenos HCV. Más aún, se sacrifican 5 ratones por grupo en la semana 6 para estudiar la respuesta celular 15 específica. Adicionalmente, se inoculan 5 animales por grupo con el virus vvRE vaccinia recombinante (Álvarez-Lajonchere et al., Biotecnología Aplicada 2007; 24 (3-4): 246-253), que expresan las proteínas estructurales HCV y otros 5 animales con el virus WR vaccinia de control, en la semana 6. Cinco días después de inoculación, se sacrifican los ratones y se determina el título vírico en ovarios, como se describió previamente (Álvarez-Lajonchere et al., Biotechnol Appl Biochem. 2008; 51 (Pt 2): 97-105). 20
En las figuras 3 a 5 se muestra la respuesta inmunitaria específica contra antígenos HCV. La respuesta evaluada fue detectada empleando variantes recombinantes de la proteína Núcleo (aminoácidos 1-120, vacuna Alvarez-Obregon JC et al. 2001; 19:3940-3946), E1 (aminoácidos 192-340 de la poliproteína HCV, Lorenzo LJ et al., Biotechnol Appl Biochem 2000; 32(2): 137-143) y E2 (aminoácidos 384-680 de la poliproteína HCV, Martínez-Donato et al., Mol 25 Biotechnol. 2007; 35(3): 225-36) como antígenos de captura en ELISA, o como antígenos para la estimulación en los ensayos para determinar la respuesta inmunitaria celular. Como se muestra en la figura 3, la respuesta de anticuerpo contra proteínas estructurales HCV fue mayor en el grupo inmunizado con Eq1 (p <0.0001; pruebas de comparación múltiple de Kruskal Wallis y Dunn), contra todos los antígenos evaluados. Se observó un comportamiento similar para la respuesta proliferativa (Figura 4) y para secreción IFN gamma (Figura 5), 30 respectivamente. Adicionalmente, como se muestra en la figura 6, el grupo inmunizado con la proteína Eq1 fue solamente uno capaz de controlar significativamente la viremia específica (después de exposición con vvRE), en el modelo de exposición subrogado (p=0.0069, pruebas de comparaciones múltiples de Kruskal Wallis y Dunn).
Estos resultados evidencian la capacidad que tiene el antígeno Eq1 quimérico para inducir una respuesta inmunitaria 35 específica, tanto humoral como celular, contra diversos antígenos HCV, con actividad funcional in vivo, en razón a que es capaz de provocar la protección en un modelo de inoculación subrogado. Adicionalmente, se evidencia que el orden en el que las regiones seleccionadas de proteínas estructurales HCV se ubican en los antígenos quiméricos es crítico para la inducción de respuesta inmunitaria específica y para el desarrollo de una respuesta inmunitaria funcionalmente protectora en un modelo de inoculación, en razón a que las variantes Coq1 y E1q1 no inducen este 40 tipo de respuesta inmunitaria. Por lo tanto, no es suficiente tener los epítopos en el antígeno sino tenerlos en el contexto correcto.
Ejemplo 3. Estudio de inmunogenicidad en ratones de antígeno Eq1 mezclado con NS3
45
Se inmunizan ratones BALB/c hembra, de 8 semanas de edad, 16-18 g de peso, 17 animales por grupo. Los grupos de inmunización son como sigue: Grupo 1, antígeno Eq1 formulado en alúmina; Grupo 2, antígeno Eq1 mezclado con proteína NS3 recombinante (Palenzuela D et al., Biotecnología Aplicada 2006; 23: 94-98) formulada en alúmina; Grupo 3, proteína NS3 recombinante, formulada en alúmina; Grupo 4, alúmina (grupo de control). En todos los casos, 20 μg de antígeno Eq1 recombinante y 10 μg de proteína NS3 se administran en los grupos 50 correspondientes. Se llevaron a cabo inmunizaciones en las semanas 0, 2 y 4, mediante inyección intramuscular.
La recolección de sangre se lleva a cabo en la semana 0 y 6 para estudiar la respuesta de los anticuerpos contra los antígenos HCV. Más aún, se sacrifican 5 ratones por grupo en la semana 6 para estudiar la respuesta celular específica. Adicionalmente, se inoculan 5 animales por grupo con el virus vaccinia recombinante vvRE (Álvarez-55 Lajonchere et al., Biotecnología Aplicada 2007; 24 (3-4): 246-253), que expresa proteínas estructurales HCV y otros 5 animales con el virus WR vaccinia de control, en la semana 6. Cinco días después de inoculación, se sacrifican los ratones y se determina el título vírico en ovarios, como se describió anteriormente.
En la figura 7 a 9 se muestra la respuesta inmunitaria específica contra antígenos HCV. Se detecta la respuesta 60 inmunitaria evaluada empleando variantes recombinantes de la proteína Núcleo (aminoácidos 1-120), E1 (aminoácidos 192-340 de la poliproteína HCV), E2 (aminoácidos 384-680 de la poliproteína HCV) y NS3 (aminoácidos 1192-1457 en la poliproteína HCV), como antígenos de captura en ELISA, o como antígenos para la estimulación en los ensayos para determinar la respuesta inmunitaria celular. Como se muestra en la figura 7, la respuesta de anticuerpos se induce contra antígenos estructurales HCV en los grupos inmunizados con Eq1 65 individualmente o mezclados con NS3, sin diferencias estadísticamente significativas entre ellos. Sin embargo, la
respuesta de anticuerpo contra NS3 fue significativamente superior en el grupo de la mezcla de NS3 y Eq1 (p=0.0001, prueba de Mann Whitney).
De otra parte, el análisis de la respuesta proliferativa, representada en la figura 8, evidencia una respuesta significativamente superior contra antígenos Núcleo, E2 y NS3, en el grupo administrado con la mezcla de Eq1 con 5 NS3, con respecto a la administración de los antígenos individuales (p <0.05, pruebas de comparaciones múltiples ANOVA y Newman-Keuls). No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos inmunizados con Eq1 individualmente o mezclados con NS3 con respecto a la respuesta contra E1.
Con respecto a la respuesta de secreción IFN gamma específica, que se representa en la figura 9, se induce con 10 diferencias estadísticamente significativas entre las variantes inmunizadas con las proteínas recombinantes, solamente con respecto al antígeno E2, que muestra una respuesta significativamente superior en el grupo inmunizado con la mezcla Eq1 y NS3 (p <0.05, pruebas de comparación múltiple ANOVA y Newman-Keuls).
Adicionalmente, como se muestra en la figura 10, el grupo inmunizado con la proteína Eq1 individualmente o 15 mezclado con NS3 controla significativamente la viremia específica (inoculación con vvRE), en el modelo de inoculación subrogado (p <0.05, pruebas de comparación múltiple Kruskal Wallis y Dunns).
Estos resultados evidencian que la preparación basada en la mezcla de antígeno Eq1 con NS3 es capaz de inducir un aumento de respuesta inmunitaria específico, tanto humoral como celular contra antígenos estructurales HCV y 20 NS3, con actividad funcional in vivo, en razón a que es capaz de proporcionar protección en un modelo de inoculación vírico subrogado.
Ejemplo 4. Estudio de inmunogenicidad en ratones del antígeno Eq1 quimérico mezclado con un plásmido para inmunización de ADN 25
Se inmunizan ratones BALB/c hembras, de 8 semanas de edad, de 16-18 g de peso, 17 animales por grupo. Los grupos de inmunización fueron como sigue: Grupo 1, antígeno Eq1 formulado en alúmina; Grupo 2, antígeno Eq1 mezclado con el plásmido para inmunización de ADN plDKE2 (Dueñas-Carrera et al., Biotechnol Appl Biochem. 2004; 39: 249-55) en solución salina; Grupo 3, antígeno Eq1 mezclado con plásmido plDKE2 y con proteína Co.120 30 (Dueñas-Carrera et al., Biotecnologia Aplicada 1999; 16(4), 226-231) en solución salina; Grupo 4, proteína Co.120 mezclada con el plásmido plDKE2 en solución salina, en las semanas 0 y 3, con una dosis de antígeno Eq1 formulada en alúmina en la semana 6; Grupo 5, plásmido plDKE2 en solución salina en las semanas 0, 3 y 6; Grupo 6, alúmina (control); Grupo 7, solución salina (control). Los ratones reciben 20 μg de antígeno Eq1 quimérico y 10 μg de proteína Co.120 recombinante en los grupos correspondientes. En el caso del plásmido plDKE2, se administra 35 100 μg en cada dosis. Las inmunizaciones se llevan a cabo en las semanas 0, 3 y 6 mediante inyección intramuscular.
La recolección sanguínea se lleva a cabo en las semanas 0 y 8 para estudiar la respuesta de los anticuerpos contra los antígenos HCV. Más aún, se sacrifican 5 ratones por grupo en la semana 8 para estudiar la respuesta celular 40 específica. Adicionalmente, se inoculan 5 animales por grupo con el virus vvRE vaccinia recombinante, que expresa proteínas estructurales HCV, y otros 5 animales con el virus WR vaccinia de control, en la semana 8. Cinco días después de inoculación, se sacrifican los ratones y se determinan los títulos víricos en ovarios, como se describió anteriormente.
45
La respuesta inmunitaria específica contra antígenos HCV se muestra en las figuras 11 a 13. La respuesta evaluada se detecta empleando variantes recombinantes de proteína Núcleo (aminoácidos 1-120), E1 (aminoácidos 192-340 de poliproteína HCV) y E2 (aminoácidos 384-680 de poliproteína HCV) como antígenos de captura en ELISA, o como antígenos para la estimulación en los ensayos para determinar respuesta inmunitaria celular. Como se muestra en la figura 11, se induce una respuesta de anticuerpo contra antígenos estructurales HCV en todos los 50 grupos inmunizados, con la excepción de los controles. Una respuesta de anticuerpo significativamente mayor contra E1 y E2 fue detectada en el grupo inmunizado con la mezcla de proteína Eq1 y Co.120 con el plásmido plDKE2, con respecto al grupo inmunizado solo con el plásmido plDKE2 (p <0.05, pruebas de comparación múltiple de Kruskal Wallis and Dunns). Del mismo modo, se observaron diferencias estadísticamente significativas entre estos dos grupos con respecto a la respuesta proliferativa (Figura 12), contra Núcleo, E1 y E2 (p < 0.05, pruebas de 55 comparación múltiple de Kruskal Wallis y Dunns). De hecho, el grupo inmunizado con la mezcla de proteína Eq1 y Co.120 con el plásmido plDKE2 induce una respuesta proliferativa contra antígenos E1 y E2, que fue significativamente superior aquella inducida en los grupos restantes (p <0.05, pruebas de comparación múltiple ANOVA y Newman-Keuls), con la excepción del grupo inmunizado en el programa de exposición/refuerzo (grupo 4).
60
Con respecto a la respuesta de secreción IFN gamma, todos los grupos indujeron una respuesta detectable (figura 13) contra proteínas estructurales HCV (con la excepción de controles). No se observaron diferencias estadísticamente significativas en respuestas contra E1 y E2 entre los grupos vacunados con las variantes inmunogénicas, con la excepción de la superioridad observada (p <0.05, pruebas de comparación múltiples ANOVA y Newman-Keuls) en la respuesta inducida contra E2, en el grupo inmunizado con Eq1 individualmente (Grupo 1) 65 con respecto al grupo inmunizado solo con el plásmido plDKE2 (Grupo 5). Sin embargo, si la respuesta de secreción
IFN gamma contra el antígeno Núcleo fue significativamente superior en el grupo inmunizado con la mezcla de proteínas Eq1 y Co.120 con el plásmido plDKE2, con respecto al resto de grupos (p <0,05; pruebas de comparación múltiples ANOVA y Newman-Keuls), con la excepción del grupo inmunizado en el programa de exposición/refuerzo (grupo 4).
5
Adicionalmente, todos los grupos implican la administración del antígeno quimérico Eq1 (grupos 1 a 4) que fueron capaces de controlar significativamente la viremia específica (inoculación con vvRE) en el modelo de inoculación subrogado (figura 14) (p <0.05, pruebas de comparación múltiple Kruskal Wallis and Dunns), pero no el resto de grupos.
10
Los resultados evidenciaron una composición de vacuna con base en la administración de Eq1 mezclado con el plásmido plDKE2 y la proteína Co.120, o en los programas de exposición/refuerzo, que permiten la inducción de un aumento de respuesta inmunitaria específica, tanto humoral como celular, contra antígenos estructurales HCV, con actividad funcional in vivo, en razón a que es capaz de inducir protección en un modelo de inoculación subrogado.
15
Ejemplo 5. Estudio de inmunogenicidad en ratones del antígeno EQ1quimérico mezclado con variantes de proteína recombinantes de proteínas estructurales HCV
Se inmunizaron ratones BALB/c hembra, de 8 semanas de edad, 16-18 g de peso, 17 animales por grupo. Los grupos de inmunización fueron como sigue: Grupo 1, antígeno Eq1 formulado en alumina; Grupo 2, mezclas de 20 proteínas Co.120, E1.340 (Lorenzo LJ et al., Biotechnol Appl Biochem 2000; 32(2):137-143) y E2.680 (Martinez-Donato et al., Mol Biotechnol. 2007; 35(3): 225-36), formulado en alúmina en la semana 0 y 2, con dosis de antígeno Eq1 quimérico formulado en alúmina en la semana 4; Grupo 3, antígeno Eq1 quimérico formulado en alúmina en la semana 0 y dosis de la mezcla de proteínas Co.120, E1.340 y E2.680, formulado en alúmina, en las semanas 2 y 4; Grupo 4, mezcla de proteínas Co.120, E1.340, E2.680 y Eq1, formuladas en alúmina; Grupo 5, mezcla de proteínas 25 Co.120, E1.340 y E2.680, formuladas en alúmina; Grupo 6, alúmina (control). Los ratones recibieron 20 μg de antígeno Eq1 quimérico; 16.7 μg de proteínas E1 y E2, así como 0.1 μg de proteínas Co.120, en los grupos correspondientes. Se llevaron a cabo inmunizaciones en las semanas 0, 2 y 4 mediante inyección intramuscular.
Se llevó a cabo recolección de sangre en las semanas 0 y 6 para estudiar la respuesta de anticuerpos contra 30 antígenos HCV. Mas aun, se sacrificaron 5 ratones por grupo en la semana 6 para estudiar la respuesta celular específica. Adicionalmente, se expusieron 5 animales por grupo con el virus vvRE vaccinia recombinante, que expresan proteínas estructurales HCV y otros 5 animales con el virus WR vaccinia de control, en la semana 8. Cinco días después de inoculación, se sacrificaron los ratones y se determinaron los títulos víricos en ovarios, como se describió anteriormente. 35
La respuesta inmunitaria específica contra HCV se muestra en las figuras 15 a 17. La respuesta evaluada fue detectada utilizando variantes recombinantes de proteína Núcleo (aminoácidos 1-120), E1 (aminoácidos 192-340 de poliproteína HCV) y E2 (aminoácidos 384-680 de poliproteína HCV), como antígenos de captura en ELISA, o como antígenos para estimulación en los ensayos para determinar respuesta inmunitaria celular. Como se observa en la 40 figura 15, todos los grupos inmunizados, con la excepción de los controles, inducen respuesta de anticuerpos específica contra antígenos estructurales HCV. No se observaron diferencias estadísticamente significativas con respecto a la respuesta de los anticuerpos contra la proteína Núcleo entre los grupos. En contraste, los grupos inmunizados con la mezcla de las proteínas estructurales (Grupo 5) y el grupo inmunizado con la mezcla de proteínas estructurales más Eq1 (grupo 4) tuvo una respuesta de anticuerpos significativamente mayor contra E1 y 45 E2 que el grupo inmunizado con Eq1 individualmente (p <0.05, pruebas de comparación múltiple Kruskal Wallis and Dunns).
De otra parte, la respuesta proliferativa contra antígenos HCV se indujo en todos los grupos, con la excepción del control, como se observa en la figura 16. No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los 50 grupos con respecto a la respuesta proliferativa contra E1 y E2. Sin embargo, todos los grupos recibieron el antígeno Eq1 quimérico, en cualquiera de las combinaciones (grupos 1 a 4), indujeron una respuesta proliferativa contra Núcleo significativamente superior a la inducida por la mezcla de proteínas estructurales HCV (Grupo 5) (p <0.05, pruebas de comparación múltiple ANOVA y Newman-Keuls).
55
Como se muestra en la figura 17, la respuesta de secreción IFN gamma tuvo un comportamiento similar a aquel observado para la respuesta proliferativa. En este caso, el grupo inmunizado con la mezcla de proteínas estructurales HCV (Grupo 5) tuvo una respuesta de secreción IFN gamma contra Núcleo significativamente menor que el inducido en los grupos inmunizados con el antígeno Eq1 quimérico individualmente (Grupo 1) y la mezcla de Eq1 con las proteínas estructurales HCV (grupo 4) (p <0.05, pruebas de comparación múltiples ANOVA y Newman-60 Keuls).
Adicionalmente, todos los grupos, con la excepción del control, fueron capaces de controlar significativamente la viremia específica (exposición con vvRE) en el modelo de exposición de subrogado vírico (Figura 18) (p <0.05, pruebas de comparación múltiples de Kruskal Wallis and Dunn). Los resultados evidenciaron que la composición de 65 vacuna basada en la administración del antígeno Eq1 quimérico mezclado con una preparación que comprende
variantes de proteínas recombinantes de antígenos estructurales HCV Núcleo, E1 y E2, permiten la inducción de aumento de respuesta inmunitaria específica, tanto humoral como celular contra proteínas estructurales HCV, con actividad funcional in vivo, en razón a que es capaz de proporcionar protección en el modelo de inoculación de subrogado vírico.
5
Ejemplo 6. Estudio de inmunogenicidad en ratones de diferentes antígenos quiméricos que comprenden epítopos HCV y epítopos artificiales específicos para linfocitos auxiliares T
Se inmunizaron ratones BALB/c hembra, de 8 semanas de edad, de 16-18 g de peso, 17 animales por grupo. Los grupos de inmunización fueron como sigue: Grupo 1, antígeno Eq1 quimérico formulado en alúmina; Grupo 2, 10 antígeno NSEq2 quimérico formulado en alúmina; Grupo 3, antígeno EqNSb quimérico formulado en alúmina; Grupo 4, antígeno EqNS3 quimérico formulado en alúmina; Grupo 5, antígeno EqP1 quimérico formulado en alúmina; Grupo 6, alúmina (control). Los ratones reciben 20 μg de los antígenos quiméricos recombinantes, en los grupos correspondientes. Se llevaron a cabo inmunizaciones en las semanas 0, 2 y 4, mediante inyección intramuscular.
15
Se lleva a cabo recolección sanguínea en las semanas 0 y 6 para estudiar la respuesta de los anticuerpos contra antígenos HCV. Más aun, se sacrifican 5 ratones por grupo en la semana 6 para estudiar la respuesta celular específica. Adicionalmente, se inoculan 5 animales por grupo con el virus vvRE vaccinia recombinante, que expresa las proteínas estructurales HCV y otros 5 animales con el virus WR vaccinia de control, en la semana 8. Cinco días después de exposición, los ratones se sacrifican y se determinan los títulos víricos en ovarios, como se describió 20 anteriormente.
En las figuras 19 a 21 se muestra la respuesta inmunitaria específica contra antígenos HCV. La respuesta evaluada se detecta empleando variantes recombinantes de proteínas Núcleo (aminoácidos 1-120), E1 (aminoácidos 192-340 de poliproteína HCV), E2 (aminoácidos 384-680 de poliproteína HCV) y NS3 (aminoácidos 1192 a 1457 en la 25 poliproteína HCV), como antígenos de captura en ELISA, o como antígenos para la estimulación en los ensayos para determinar respuesta inmunitaria celular. Como se muestra en la figura 19, en todos los grupos, con la excepción del grupo de control, se induce una respuesta de anticuerpo específica contra proteínas estructurales HCV, sin diferencias estadísticamente significativas entre los grupos inmunizados con los diferentes antígenos quiméricos. Solamente los grupos 2, 3 y 4, comprenden regiones de respuesta de anticuerpo inducida por NS3 HCV 30 contra este agente viral, que es significativamente superior en el grupo 4 con respecto a los grupos 2 y 3 (p <0.05, pruebas de comparación múltiple ANOVA y Newman-Keuls).
Como se muestra en la figura 20, en todos los grupos, con la excepción del control, se provoca una respuesta proliferativa específica contra antígenos estructurales HCV. En este caso, la respuesta proliferativa contra antígenos 35 Núcleo y E1 fue significativamente mayor en los grupos 2, 3 y 5 con respecto al grupo 1 (p<0.05, Prueba de comparaciones múltiples ANOVA y Newman-Keuls). No se detectaron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos inmunizados con los diferentes antígenos quiméricos con respecto a la respuesta proliferativa contra E2. Solamente los grupos 2, 3 y 4, que comprende regiones de HCV NS3 provocaron respuesta proliferativa contra este agente vírico, que es significativamente superior en el grupo 4 con respecto a los grupos 2 y 3 (p <0.05, 40 pruebas de comparación múltiple ANOVA y Newman-Keuls).
Los análisis de respuesta de secreción IFN gamma específica (figura 21), evidenciaron su inducción contra antígenos estructurales HCV en todos los grupos, con la excepción del control, sin diferencias estadísticamente significativas entre ellas. Solamente los grupos 2, 3 y 4, que comprenden regiones HCV NS3, inducen respuesta de 45 secreción IFN gamma contra este antígeno vírico, sin diferencias estadísticamente significativas entre ellas. Adicionalmente, todos los grupos, con la excepción del grupo de control, fueron capaces de controlar significativamente la viremia específica (exposición con vvRE) en el modelo de inoculacion de subrogado vírico (figura 22) (p <0.05, pruebas de comparación múltiple Kruskal Wallis y Dunn). Los resultados evidencian que la inserción de los epítopos o regiones de HCV NS3 en la secuencia de Eq1 permiten la inducción de respuesta 50 inmunitaria específica contra este antígeno vírico sin afectar la respuesta inmunitaria inducida contra los antígenos estructurales HCV. Sin embargo, la inclusión de epitopos P1M y P2B artificiales en la secuencia de la proteína Eq1 permite el aumento significativo de respuesta proliferativa contra antígenos Núcleo y E1, sin afectar la capacidad de inducir respuesta inmunitaria humoral o celular específica contra estos antígenos o E2 y también la actividad funcional in vivo, en razón a que es capaz de proporcionar protección en el modelo de inoculación de subrogado 55 vírico.
Ejemplo 7. Estudio de inmunogenicidad comparativo en ratones de antígenos Eq1 y Eq1b quiméricos
se inmunizan ratones BALB/c hembras, de 8 semanas de edad, de 16-18 g de peso, 17 animales por grupo. Los 60 grupos de inmunización fueron como sigue: Grupo 1, antígeno de Eq1b quimérico en alúmina; Grupo 2, antígeno Eq1 quimérico formulado en alúmina; Grupo 3, alúmina (control). Los ratones reciben 20 μg de antígenos quiméricos, en los grupos correspondientes. Se llevan a cabo inmunizaciones en las semanas 0, 2 y 4, mediante inyección intramuscular.
65
Claims (12)
- REIVINDICACIONES1. Un antígeno de vacuna quimérica contra el virus de la hepatitis C (HCV) que comprendea) un primer segmento de la región E2, dicho segmento consiste de aminoácidos 408-540 de la poliproteína HCV, 5b) un segundo segmento de la región E1, dicho segmento consiste de los aminoácidos 190-222 de la poliproteína HCV, yc) un tercer segmento de la región Núcleo, dicho segmento consiste de los aminoácidos 1 a 50 de la poliproteína 10 HCV, en este orden particular.
- 2. El antígeno de vacuna quimérica de la reivindicación 1, en el que su secuencia de aminoácidos se selecciona del grupo compuesto de la SEQ ID No. 10 y SEQ ID No. 16.15
- 3. El antígeno de vacuna quimérica de la reivindicación 1, caracterizado porque comprende adicionalmente en su secuencia por lo menos un epítopo adicional específico para linfocitos auxiliares T, preferiblemente un epítopo de proteínas no estructurales HCV, preferiblemente de NS3.
- 4. El antígeno de vacuna quimérica de la reivindicación 3, caracterizado porque está de su secuencia de 20 aminoácidos es SEQ ID No. 14.
- 5. El antígeno de vacuna quimérica de la reivindicación 3, en el que el epítopo específico para linfocitos auxiliares T es un epítopo artificial, seleccionado preferiblemente del grupo compuesto del epítopo P1M de la SEQ ID No. 17 y el epítopo P2B de la SEQ ID No. 18. 25
- 6. El antígeno de vacuna quimérica de la reivindicación 5, caracterizado porque su secuencia de aminoácidos se selecciona del grupo compuesto por la SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 13 y SEQ ID No. 15.
- 7. Una composición de vacuna que comprende un antígeno de vacuna quimérico contra el HCV que comprende: a) 30 un primer segmento de la región E2, consistiendo dicho segmento de los aminoácidos 408-540 de la poliproteína HCV, b) un segundo segmento de la región E1, consistiendo dicho segmento de los aminoácidos 190-222 de la poliproteína HCV, y c) un tercer segmento de la región Núcleo, consistiendo dicho segmento de aminoácidos 1 a 50 de la poliproteína HCV, en este orden particular; y excipientes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables, preferiblemente que comprende un antígeno de vacuna quimérica de cualquiera de las reivindicación 2 a 6. 35
- 8. La composición de vacuna de la reivindicación 7, que comprende adicionalmente una variante de proteína recombinante de antígenos estructurales HCV o el antígeno HCV NS3.
- 9. La composición de vacuna de la reivindicación 7, que comprende adicionalmente un plásmido para inmunización 40 de ADN que expresa los antígenos estructurales HCV, y preferiblemente una proteína de cápsida recombinante de HCV.
- 10. La composición de la vacuna de la reivindicación 7, que se puede administrar en programas de exposición/refuerzo con preparaciones basada en plásmidos para inmunizaciones de ADN, proteínas recombinantes 45 de antígenos estructurales HCV o una mezcla de ambos.
- 11. Un antígeno de vacuna quimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o una composición de vacuna que comprende, para uso en un método para la inducción de respuesta inmunitaria específica contra HCV en un individuo saludable o en un paciente infectado con HCV. 50
- 12. El antígeno de vacuna quimérica, o una composición de vacuna que lo comprende, para uso de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado porque dicho antígeno de vacuna quimérica, o dicha composición de vacuna, es para administración en programas de exposición/refuerzo con preparaciones basadas en plásmidos para inmunización de ADN, proteínas recombinantes de antígenos de estructural HCV o una mezcla de ambos. 55
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