MX2015005651A - Antigenos vacunales quimericos contra el virus de la hepatitis c. - Google Patents
Antigenos vacunales quimericos contra el virus de la hepatitis c.Info
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Abstract
La presente invención describe antígenos vacunales quiméricos contra el virus de la hepatitis C (VHC) que comprenden regiones seleccionadas de diferentes antígenos de dicho virus, las que se ubican en un orden determinado dentro del polipéptido; dichos antígenos quiméricos, además, pueden incluir epítopos específicos para linfocitos T auxiliadores, diseñados de forma artificial; los antígenos quiméricos, así como las composiciones vacunales resultantes, son aplicables a la esfera de la medicina y la industria farmacéutica, y tienen un uso profiláctico y/o terapéutico contra el VHC; las composiciones vacunales de la invención generan una respuesta inmune potente y de amplio espectro contra diferentes antígenos de dicho virus, con un mínimo de componentes.
Description
ANTÍGENOS VACUNALES QUIMÉRICOS CONTRA EL VIRUS DE LA HEPATITIS C
CAMPO TÉCNICO
La presente invención está relacionada con la rama de la medicina y la industria farmacéutica, particularmente con el desarrollo de antígenos quiméricos contra el virus de la hepatitis C (VHC), y composiciones vacunales que los contengan. En la invención se emplea un número mínimo de componentes, ya que los antígenos quiméricos son capaces de inducir una respuesta inmune potenciada y diversa contra los antígenos del VHC, mediante la selección precisa de regiones específicas de dichos antígenos, y la inclusión de epítopos artificiales específicos para linfocitos T CD4+.
ANTECEDENTESDELAINVENCIÓN
El VHC infecta al 3% de la población mundial, aproximadamente (Williams R. Hepatology 2006; 44: 521-526). La mayoría de los individuos infectados transitan hacia la cronicidad (Amoroso P, y cois., J Hepatol 1998; 28: 939-944). La hepatitis C es una de las causas principales de daño hepático crónico, cirrosis, fallo hepático y cáncer de hígado (Hoofnagle JH. Hepatology 2002; 36 (5 Suppl 1): S21-S29). Actualmente es la principal causa de trasplante hepático en los países del primer mundo. Adiclonalmente, la infección por el VHC se ha relacionado con manifestaciones extrahepáticas, como crioglobulinemia de tipo II, glomerulonefritis membranoproliferativa, porfiria cutánea tarda, entre otras. No existe una vacuna preventiva contra este virus, y los tratamientos antivirales en uso, basados en la combinación del ¡nterferón (IFN) pegilado + ribavirina, son efectivos en menos del 50% de los casos. Además, estos ocasionan múltiples eventos adversos (Ghany MG y cois., Hepatology. 2009; 49 (4): 1335-74).
El VHC es un virus perteneciente a la familia Flaviviridae, género hepacivirus. Es un virus envuelto, cuya partícula viral tiene un tamaño entre 50 y 70 nm, y se encuentra asociada a lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL, del inglés "very low density lipoproteins") (Popescu CI y Dubuisson J. Biol Cell. 2009; 102 (l):63-74). El genoma viral es un ácido ribonucleico (ARN) de simple cadena, de polaridad positiva, de aproximadamente 9,6 kb. El genoma codifica para una poliproteína viral, que se procesa co- y post-traduccionalmente en al menos 10 proteínas virales: Core, El, E2, p7 (proteínas estructurales) y proteínas no estructurales: NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B (Bartenschlager R y Lohmann V. 2000. J Gen Virol .81: 1631-48).
Existen varios obstáculos importantes para la obtención de una vacuna efectiva contra el VHC. Este patógeno es un virus de ARN, que puede mutar rápidamente en adaptación al ambiente hospedero. Esto contribuye a la elevada diversidad de secuencias de los múltiples
aislamientos virales identificados en el mundo. Se han descrito seis genotipos principales, los cuales pueden llegar a diferenciarse hasta en 30% a nivel de secuencia nucleotídica (Simmonds P. J Hepatol. 1999; 31 Suppl 1:54-60). La mayor heterogeneidad se concentra en la región hipervariable de la proteína E2 del VHC, donde precisamente existe un posible epítopo diana para anticuerpos neutralizantes. De hecho, el VHC circula en el organismo como una población heterogénea de moléculas virales, fenómeno conocido como "cuasiespecies" (Simmonds P. J Gen Virol. 2004; 85 (Pt ll):3173-88). Se ha evidenciado que las mutaciones constituyen una vía de escape a la respuesta inmune, tanto humoral como celular, específica desarrollada por el hospedero.
Debe resaltarse que el VHC causa infección persistente en individuos inmunocompetentes, a pesar de la existencia de una respuesta inmune activa (Lechmann et al., Semin Liver Dis 2000, 20, 211-226). Actualmente se han esclarecido varios efectos virales sobre el sistema inmune que contribuyen a la persistencia viral, propiciando el desarrollo de respuestas inmunes irrelevantes e impidiendo el desarrollo de las respuestas verdaderamente efectivas para su eliminación. Estos efectos se aprecian tanto en la inmunidad innata como en la adquirida (Grakoui A y cois., Science 2003, 302 (5645): 659-62). Existen evidencias de que la respuesta inmune inefectiva contra el VHC no solo no logra la eliminación de este patógeno, sino que además contribuye al daño hepático.
Hasta el momento, no se han definido completamente los parámetros inmunológicos que correlacionan con la protección frente a la infección por el VHC o la clarificación viral. Sin embargo, se estima que es particularmente relevante la inducción de una respuesta inmune celular vigorosa y sostenida contra diferentes antígenos virajes (Lechmann et al., Semin Liver Dis 2000, 20, 211-226). En los individuos crónicamente 'Infectados por el VHC es particularmente notable la afectación de la respuesta de linfocitos T específicos. Varios mecanismos parecen tributar a este efecto, uno de ellos es la acción de células T regulatorias.
Prácticamente todas las estrategias de inmunización han sido estudiadas para desarrollar una vacuna contra el VHC. Entre estas se destacan el empleo de: proteínas recombinantes, péptidos sintéticos, partículas semejantes a virus, ácido desoxirribonucleico (ADN) desnudo y virus recombinantes. Todos los antígenos virales han sido evaluados como dianas de candidatos vacunales contra el VHC. La mayoría de los candidatos vacunales se concentran aún en la fase de estudios de inmunogenicidad en modelos animales, aunque actualmente varios candidatos se encuentran en fase clínica, evidenciando ser seguros e inmunogénicos, pero sin demostración de impacto clínico todavía (Alvarez-Lajonchere L, Dueñas-Carrera S. Int Rev Immunol. 2012;31(3):223-42).
El desarrollo de una vacuna basada en subunldades proteicas fue una de las primeras estrategias evaluadas para el VHC. Algunas de las propuestas basadas en antígenos de la
región estructural del VHC han logrado protección limitada frente al virus en modelos animales. Tal es el caso de los chimpancés inmunizados con un oligómero formado por las proteínas El y E2. Se vacunaron siete chimpancés, dé los cuales cinco fueron protegidos y dos contrajeron la enfermedad, pero se curaron sin avanzar a la fase crónica (Choo y cois., Proc Nati Acad Sci USA 1994, 91, 1294-1298). Dicha protección ha estado correlacionada con la presencia de anticuerpos (Acs) capaces de inhibir la unión de E2 a células humanas (Rosa y cois., Proc Nati Acad Sel USA 1996, 93, 1759-1763).
La proteína recombinante El, proveniente de un aislamiento del genotipo 1 b, fue purificada como homodímeros (Maertens y cois., Acta Gastroenterol Belg 2000, 63, 203). Dos chimpancés infectados crónicamente con VHC recibieron 9 dosis de 50 mg de proteína El recombinante. La vacunación mejoró la histología hepática, determinó la desaparición de los antígenos virales del hígado y disminuyó los niveles de alanina aminotransferasa (ALT). Aunque los niveles de ARN viral en suero no cambiaron durante el tratamiento, reaparecieron la inflamación hepática y los antígenos virales después de concluir el tratamiento. Se observó una asociación entre los altos niveles de anticuerpos contra El y la reducción del daño hepático (Maertens et al., Acta Gastroenterol Belg 2000, 63, 203). Una variante proteica de la El del VHC, formulada en Alúmina, fue evaluada incluso en humanos. Este candidato vacunal resultó ser seguro e inmunogénico, siendo capaz de inducir respuesta de anticuerpos, así como respuesta linfoproliferativa específica (Nevens F, y col., Hepatology. 2003; 38 (5):1289-96). Sin embargo, la administración de este candidato vacunal no logró impactar clínicamente en la infección por el VHC, puesto que no se logró la clarificación viral en los pacientes, ni se observó una mejoría significativa de la enfermedad hepática. El enfoque de inmunización con subunidades proteicas completas ha tenido la desventaja de no inducir una fuerte respuesta celular, en algunos casos. Este enfoque corre el riesgo, además, de incluir regiones involucradas en los diferentes mecanismos de afectación de la respuesta inmune anti-VHC Inducida por este patógeno a los diferentes niveles (Grakoui A y cois., Science 2003, 302 (5645): 659-62).
Dos candidatos vacunales, basados en mezclas de péptidos sintéticos que comprenden epítopos del VHC específicos de linfocitos T, han alcanzado también la fase de evaluación clínica en humanos (Yutani y cois., Cáncer Sci 2009.100(10): 1935-42, Klade y cois., Gastroenterology 2008.134(5): 1385-95). Ambos candidatos vacunales han evidenciado la capacidad para inducir una respuesta Inmune específica, y han resultado ser poco reactogénicos en los estudios clínicos Fase I y II realizados hasta el momento, en individuos crónicamente infectados por el VHC (Alvarez-Lajonchere L, Dueñas-Carrera S. Int Rev Immunol. 2012; 31 (3):223-42). Sin embargo, no han logrado impactar de manera significativa en la carga viral de los pacientes, o lo han hecho solo de forma temporal. Dado que tampoco han evidenciado ser capaces de mejorar los parámetros de histología hepática de los pacientes, el impacto clínico de estos candidatos vacunales está por demostrar. La identificación de varios epítopos para células T CD4+ y CD8+ en la poliproteína viral
del VHC, que pudieran ser importantes en la clarificación viral, apoyan la estrategia de usar péptidos sintéticos como candidatos vacunales contra este patógeno. Diferentes péptidos solos o lipidados, conteniendo epítopos de Core, NS4 y NS5, han inducido una fuerte respuesta de tipo T citotóxica en ratones (Shirai et al., J Infect Dls 1996, 173, 24-31; Hiranuma et al., J Gen Viral 1999, 80, 187-193; Oseroff et al., Vaccine 1998, 16, 823-833). El principal obstáculo para el enfoque de vacunas peptídicas radica en que aquellos péptidos sin función auxiliadora pueden ser pobres inmunógenos; además, con frecuencia la efectividad de una vacuna se basa en la inducción de una respuesta multivalente de amplio espectro contra diferentes antígenos. En la medida en que el número de péptidos incluidos en la preparación vacunal aumenta la complejidad de la formulación se hace mayor, desde todos los puntos de vista. Estas limitaciones representan debilidades de esta estrategia.
Por otra parte, se han evaluado diferentes vectores virales recombinantes en el desarrollo de una vacuna contra el VHC. Los adenovirus recombinantes defectivos son candidatos atractivos, debido a su hepatotropismo, su potencia para inducir inmunidad, tanto humoral como celular, y la posibilidad de ser administrados tanto por vía parenteral como oral. Adenovirus recombinantes que contienen los genes codificantes para las proteínas estructurales del VHC inducen una respuesta de anticuerpos contra cada una de estas proteínas (Makimura et al., Vaccine 1996, 14, 28-36). Además, después de inmunizar ratones con adenovirus recombinantes para Core y El, se detecta una respuesta de tipo T citotóxica específica contra estos antígenos (Bruña-Romero et al., Hepatology 1997, 25, 470-477). Aunque estos resultados han sido alentadores, algunos problemas con el uso de adenovirus recombinantes en terapia génica han creado incógnitas sobre su uso seguro en humanos. En este momento, se encuentra en evaluación en humanos un candidato vacunal basado en adenovirus recombinantes, que va demostrando ser inmunogénico, pero sin impacto clínico demostrado (Barnes y cois., Sci Transí Med. 2012; 4(115): 115). El empleo de otros virus recombinantes de tipo vaccinia, canary-pox y fowl-pox, conteniendo diferentes genes del VHC ha permitido la inducción de fuertes respuestas de tipo T citotóxicas y auxiliadoras en ratones (Shirai et al., J Viral 1994, 68, 3334-3342; Large et al., J Immunol 1999, 162, 931-938). Particularmente, una variante de virus vaccinia Ankara modificado, recombinante para los antígenos no estructurales del VHC, de NS3 a NS5, ha sido evaluada en estudios clínicos en humanos (Fournillier y cois., Vaccine. 2007; 25 (42):7339-53). Este candidato ha resultado inmunogénico, y bien tolerado, en un estudio clínico Fase I en individuos crónicamente infectados por el VHC. Al igual que en la variante basada en péptidos, el impacto de la inmunización con este candidato vacunal sobre la carga viral se ha observado solo en una fracción de los vacunados, y de manera temporal. Por tanto, de igual forma, el impacto clínico está por demostrar. En sentido general, las variantes vacunales basadas en virus recombinantes se ven afectadas por las cuestiones de seguridad y las regulatorias relacionadas
con su aplicación.
La inmunización con ADN ha sido ampliamente estudiada para el posible desarrollo de vacunas contra el VHC. Los estudios en modelos animales han evidenciado la capacidad de esta estrategia de inmunización para inducir respuesta inmune específica, tanto humoral como celular, contra prácticamente todos los antígenos del VHC (Alvarez-Lajonchere L, Dueñas-Carrera S, Hum Vaccin. 2009; 5 (8):568-71). Dos candidatos vacunales, que tienen como componentes plasmidios para la inmunización con ADN que expresan antígenos del VHC, se encuentran en estudios clínicos en humanos (Alvarez-Lajonchere L, Dueñas-Carrera S, Int Rev Immunol. 2012; 31 (3):223-42). En un caso, se trata de una vacuna de ADN que expresa una variante NS3 a NS5, que se administra por electroporación (Sállberg M, y cois., Expert Opin Biol Ther. 2009; 9 (7):805-15). En el otro caso, se trata de una composición vacunal basada en la mezcla de una proteína recombinante de la cápsida con un plasmidio para la inmunización con ADN, que expresa los antígenos estructurales del VHC (Castellanos M, y cois., J Gene Med. 2010; 12 (1): 107-16). Los dos candidatos vacunales han demostrado ser seguros, bien tolerados y han sido capaces de inducir respuesta inmune específica en los sujetos inmunizados (Alvarez-Lajonchere L, Dueñas-Carrera S, Int Rev Immunol. 2012; 31 (3):223-42). En ambos casos, al igual que en los candidatos vacunales anteriormente referidos en etapa clínica, el impacto sobre la infección con el VHC, o sobre la mejoría histológica sostenida, no ha sido demostrado. Las vacunas de ADN, aunque presentan ventajas potenciales relacionadas con su relativa simplicidad y estabilidad, enfrentan importantes retos regulatorios. Su principal limitación parece estar relacionada con la posible insuficiente inmunogenicidad en humanos, fenómeno no completamente entendido hasta el momento, que difiere sustancialmente de lo acontecido en modelos animales.
De acuerdo a los elementos previamente referidos, el desarrollo de una vacuna preventiva o terapéutica contra la infección por el VHC es un problema no resuelto. La presente invención se dirige precisamente a este objetivo.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención resuelve el problema antes mencionado al proveer un antígeno vacunal quimérico contra el virus de la hepatitis C (VHC) que comprende: a) un primer segmento que consiste en la región E2 (aminoácidos 408-540) de la poliproteína del VHC, b) un segundo segmento que consiste en la región El (aminoácidos 190-222) de la poliproteína del VHC, y c) un tercer segmento que consiste en la región Core (aminoácidos 1 al 50) de la poliproteína del VHC, en ese orden.
La novedad de la invención está dada por la selección específica de epítopos y el
orden en que se ubican los mismos en las variantes proteicas generadas. Este diseño de antígeno vacunal permite reducir el número de componentes necesarios para ampliar y potenciar el espectro de respuesta inmune contra diferentes antígenos del VHC. Se describe, por primera vez, una proteína de fusión que comprende en un solo antígeno quimérico las regiones E2 (aminoácidos 408-540), El (aminoácidos 190-222) y Core (aminoácidos 1-50) de la poliproteína del VHC, en ese orden particularmente. La respuesta inmune resultante es relevante y va dirigida, por tanto, contra un amplio espectro de antígenos virales.
La selección de las regiones específicas del VHC evita el empleo de otras regiones de proteínas virales que pueden tener efectos inmunosupresores. Igualmente, evita el empleo de otras regiones de proteínas virales que pudieran ser inmunodominantes sobre las seleccionadas en la presente invención, y que de incluirse en el propio antígeno limitarían la inducción de respuesta inmune contra las regiones seleccionadas en ia presente invención. Por otra parte, la invención incluye el orden en que las regiones seleccionadas son dispuestas en el antígeno proteico artificial, dado que este elemento influye, de manera significativa, en la inducción de respuesta inmune contra el VHC, debido a diferencias en la exposición de los epítopos, y en su procesamiento/presentación al sistema inmune. De hecho, en los antígenos quiméricos de la presente invención las regiones de los antígenos Core, El y E2 se disponen en orden inverso a como se encuentran en la poliproteína viral nativa.
En una realización de la invención, el antígeno vacunal quimérico se caracteriza porque su secuencia de aminoácidos se selecciona dentro del grupo compuesto por SEQ ID No. 10 (antígeno Eql) y SEQ ID No. 16 (antígeno Eqlb).
Los antígenos quiméricos de la invención, además, pueden comprender en su secuencia al menos un epítopo específico de linfocitos T auxiliadores. En una modalidad de la invención, el epítopo específico de linfocitos T auxiliadores que se incluye dentro de los antígenos quiméricos es un epítopo de las proteínas no estructurales del VHC. En una realización particular, la proteína no estructural es la proteína NS3. Más particularmente, la invención provee un antígeno vacunal quimérico que se caracteriza porque su secuencia de aminoácidos es la secuencia identificada como SEQ ID No. 14 (antígeno EqNS3).
En otro aspecto de la invención, el epítopo específico de linfocitos T auxiliadores que se incluye dentro de los antígenos quiméricos es un epítopo para linfocitos T CD4+ artificial. En el contexto de la invención, se entiende por epítopo artificial aquel epítopo cuya secuencia de aminoácidos no existe de forma natural, sino que se diseña a partir de elementos bioinformáticos. La selección e inclusión de los epítopos artificiales, que son reconocidos por linfocitos T auxiliadores, contribuye a la inducción de respuesta inmune específica contra los epítopos del VHC incluidos en las variantes antigénicas quiméricas. Por primera vez, en la invención se describen como epítopos
artificiales para linfocitos T auxiliadores los epítopos P1M (SEQ ID No. 17) y P2B (SEQ ID No. 18). Estos epítopos fueron diseñados para tener un motivo de unión de HLA-DR13 y HLA-DR11. Por tanto, la invención provee un epítopo específico de linfocitos T auxiliadores cuya secuencia de aminoácidos corresponde a la identificada como SEQ ID No. 17 o SEQ ID No. 18.
En una modalidad de la invención los antígenos quiméricos poseen una secuencia de aminoácidos que se selecciona dentro del grupo compuesto por SEQ ID No. 12 (antígeno NSEq2), SEQ ID No. 13 (antígeno EqNSb) y SEQ ID No. 15 (antígeno EqPl), los que portan al menos uno de estos epítopos de linfocitos T auxiliadores.
Los siguientes antígenos quiméricos tienen las características que se resumen a continuación: El antígeno quimérico Eql (SEQ ID No. 10) comprende las regiones E2 (aminoácidos 408-540), El (aminoácidos 190-222) y Core (aminoácidos 1-50) de la poliproteína del VHC, en ese orden particularmente. El antígeno quimérico NSEq2 (SEQ ID No. 12) incluye los epítopos P2B y P1M, en ese orden, insertados dentro de Eql, entre las regiones de El (aminoácidos 190-222) y Core (aminoácidos 1-50). El antígeno quimérico EqNSb (SEQ ID No. 13) incluye el epítopo P2B insertado en Eql, entre las regiones de El (aminoácidos 190-222) y Core (aminoácidos 1-50). El antígeno quimérico EqNS3 (SEQ ID No. 14) incluye la región de aminoácidos 1242-1415 en la poliproteína del VHC, insertada en Eql, entre las regiones de El (aminoácidos 190-222) y Core (aminoácidos 1-50). El antígeno quimérico EqPl (SEQ ID No. 15) incluye el epítopo P1M, insertado en Eql, entre las regiones de El (aminoácidos 190-222) y Core (aminoácidos 1-50). El antígeno quimérico Eqlb (SEQ ID No. 16) comprende las regiones E2 (aminoácidos 408-540), El (aminoácidos 190-222) y Core (aminoácidos 1-50) de la poliproteína del VHC, en ese orden particularmente, pero en ese caso la secuencia de aminoácidos corresponde a la de la variante H77 del VHC de genotipo la (NCBI Reference Sequence: NC_004102.1).
En una modalidad de la invención, los antígenos quiméricos de la misma se obtuvieron por la vía del ADN recombinante, a partir de una bacteria transformada con los plasmidios que se describen en el Ejemplo 1. Sin embargo, los versados en esta rama de la téenica conocen que dichos antígenos se pueden obtener empleando otros hospederos, y purificarse mediante técnicas ampliamente conocidas, con vistas a emplearse para la inmunización.
En otro aspecto, la invención provee una composición vacunal que comprende un antígeno vacunal quimérico contra el VHC que comprende: a) un primer segmento que consiste en la región E2 (aminoácidos 408-540) de la poliproteína del VHC, b) un segundo segmento que consiste en la región El (aminoácidos 190-222) de la poliproteína del VHC, y c) un tercer segmento que consiste en la región Core (aminoácidos 1 al 50) de la poliproteína del VHC, en ese orden; y excipientes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables.
En una modalidad de la invención, la composición vacunal comprende los antígenos
identificados como SEQ ID No. 10 (antígeno Eql), SEQ ID No. 16 (antígeno Eqlb), SEQ ID No. 14 (antígeno EqNS3), SEQ ID No. 12 (antígeno NSEq2), SEQ ID No. 13 (antígeno EqNSb) o SEQ ID No. 15 (antígeno EqPl).
A los propósitos de la invención, se puede emplear una amplia gama de adyuvantes farmacéuticamente aceptables, que están disponibles comercialmente, o aquellos que se encuentran en etapas de desarrollo, para potenciar la respuesta inmune contra los antígenos quiméricos, dentro de las composiciones vacunales objeto de la invención.
Las composiciones vacunales de la invención adicionalmente pueden comprender una variante proteica recombinante de los antígenos estructurales o del antígeno NS3 del VHC. También, las composiciones vacunales de la invención adicionalmente pueden comprender un plasmidio para la inmunización con ADN que expresa los antígenos estructurales del VHC. En otra realización de la invención, los antígenos quiméricos se pueden formular con un plasmidio para la inmunización con ADN que expresa los antígenos estructurales del VHC, y una proteína recombinante de la cápsida del VHC, simultáneamente.
En otro aspecto, la invención contempla que la composición vacunal basada en antígenos quiméricos que comprende un antígeno vacunal quimérico contra el VHC que comprende: a) un primer segmento que consiste en la región E2 (aminoácidos 408-540) de la poliproteína del VHC, b) un segundo segmento que consiste en la región El (aminoácidos 190-222) de la poliproteína del VHC, y c) un tercer segmento que consiste en la región Core (aminoácidos 1 al 50) de la poliproteína del VHC, en ese orden, puedan administrarse en esquemas de sensibilización/recuerdo con preparaciones basadas en plasmidios para la inmunización con ADN, proteínas recombinantes de los antígenos estructurales del VHC, o una mezcla de ambas.
Las composiciones vacunales objeto de la presente invención tienen la ventaja de inducir una respuesta inmune contra el VHC tanto humoral como celular, contra varios antígenos del VHC, por lo que son activas contra un amplio espectro de aislamientos virales, siendo capaces de proteger en un modelo de reto con virus sustituto.
En la invención, las composiciones vacunales pueden ser administradas por vía intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, ¡ntramucosal, intravenosa, sublingual, u otras que son conocidas por aquellos versados en esta rama de la téenica. Por otra parte, la administración puede ser mediante jeringuillas, spray u otros dispositivos de administración.
Es también objeto de la invención, el uso de los antígenos vacunales quiméricos que comprenden un primer segmento que consiste en la región E2 (aminoácidos 408-540) de la poliproteína del VHC, un segundo segmento que consiste en la región El (aminoácidos 190-222) de la poliproteína del VHC, y un tercer segmento que consiste en la región Core (aminoácidos 1 al 50) de la poliproteína del VHC, en ese orden, para la fabricación de una vacuna para la inducción de
respuesta inmune contra el VHC. En una modalidad de la invención, dicha vacuna es capaz de proteger in vivo en un modelo de reto con virus sustituto.
Por otra parte, las vacunas de la invención son capaces de inducir respuesta en individuos sanos o en pacientes infectados por el VHC. Por tanto, es también un aspecto de la invención, el proveer de un método para la inducción de respuesta inmune contra el VHC que se caracteriza porque se administra a un individuo sano, o a un paciente infectado por el VHC, el antígeno vacunal quimérico que comprende un primer segmento que consiste en la región E2 (aminoácidos 408-540) de la poliproteína del VHC, un segundo segmento que consiste en la región El (aminoácidos 190-222) de la poliproteína del VHC, y un tercer segmento que consiste en la región Core (aminoácidos 1 al 50) de la poliproteína del VHC, en ese orden; o una composición vacunal que lo comprende.
La invención también contempla que, en dicho método, el antígeno vacunal quimérico o dicha composición vacunal que lo comprende se administra en esquemas de sensibilización/recuerdo con preparaciones basadas en plasmidios para la inmunización con ADN, proteínas recombinantes de los antígenos estructurales del VHC, o una mezcla de ambas.
Para el tratamiento de los pacientes infectados por el VHC, los antígenos de la invención, o las composiciones que los contienen se pueden administrar de forma simultánea con los medicamentos que están comprendidos dentro de la terapia estándar para este tipo de pacientes.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figuras 1A a 1H. Mapas de los plasmidios que contienen las secuencias codificantes para los diferentes antígenos quiméricos. Figura 1A: pIMCo64K, plasmidio para la expresión del antígeno Coql. Figura IB: pIME64K, plasmidio para la expresión del antfgeno Eql. Figura 1C: pIME164K, plasmidio para la expresión del antígeno Elql. Figura ID: pINSE64K, plasmidio para la expresión del antígeno NSEq2. Figura 1E: pIENSb, plasmidio para la expresión del antígeno EqNSb. Figura 1F: pIENS3, plasmidio para la expresión del antígeno EqNS3. Figura 1G: pIMPlE64K, plasmidio para la expresión del antígeno EqPl. Figura 1H: pIME64Kb, plasmidio para la expresión del antígeno Eqlb.
Figuras 2A a 2H. Representación esquemática de los diferentes antígenos quiméricos. Figura 2A: antígeno Coql, comprende las regiones Core (aminoácidos 1-50), El (aminoácidos 190-222) y E2 (aminoácidos 408-540) de la poliproteína del VHC. Figura 2B: antígeno Eql, comprende E2 (aminoácidos 408-540), El (aminoácidos 190-222) y Core (aminoácidos 1-50) de la poliproteína del VHC. Figura 2C: antígeno Elql, comprende El (aminoácidos 190-222), E2 (aminoácidos 408-540), y Core (aminoácidos 1-50) de la poliproteína del VHC. Figura 2D: antígeno
NSEq2, incluye los epftopos P2B y P1M, Insertados en Eql entre las regiones de El (aminoácidos 190-222) y Core (aminoácidos 1-50). Figura 2E: antígeno EqNSb, incluye el epítopo P2B insertado en Eql, entre las regiones de El (aminoácidos 190-222) y Core (aminoácidos 1-50). Figura 2F: antígeno EqNS3, incluye la región de aminoácidos 1242-1415 de la pollproteína del VHC, insertada entre las reglones de El (aminoácidos 190-222) y Core (aminoácidos 1-50) en Eql. Figura 2G: antígeno EqPl, incluye el epítopo P1M insertado en Eql, entre las regiones de El (aminoácidos 190-222) y Core (aminoácidos 1-50). Figura 2H: antígeno Eqlb, comprende las regiones E2 (aminoácidos 408-540), El (aminoácidos 190-222) y Core (aminoácidos 1-50) de la poliproteína del VHC, de la variante H77 del VHC de genotipo la.
Figura 3. Respuesta de anticuerpos contra proteínas del VHC en esquema de inmunización con diferentes antígenos quiméricos. Los resultados se muestran en el eje de las Y, como el recíproco del título de anticuerpos, que se define como la máxima dilución de los sueros que muestra una densidad óptica a 492 nm al menos dos veces superior al promedio de la densidad óptica detectada en los sueros del grupo control negativo, determinada por ELISA. En el eje de las X se muestran los diferentes inmunógenos administrados a los ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de la media de los animales de un mismo grupo. La respuesta evaluada se detectó empleando variantes recombinantes de la proteína Core (aminoácidos 1-120 de la proteína de la cápsida), El (aminoácidos 192-340 de la poliproteína del VHC) y E2 (aminoácidos 384-680 de la poliproteína del VHC) como antígenos de recubrimiento en el ELISA.
Figura 4. Respuesta proliferativa contra proteínas del VHC en esquema de inmunización con diferentes antígenos quiméricos. Los resultados se muestran en el eje de las Y como el índice de estimulación, que se define como la relación entre células que proliferan en la condición de estimulación y las células que proliferan en la condición de no estimulación, determinada en un ensayo de citometría mediante tinción con CFSE (del inglés "carboxyfluorescein succinimidyl ester"). El índice de estimulación superior a dos se considera como respuesta positiva. En el eje de las X se muestran los diferentes inmunógenos administrados a los ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de la media de los animales de un mismo grupo. La respuesta evaluada se detectó empleando variantes recombinantes de la proteína Core (aminoácidos 1-120 de la proteína de la cápsida), El (aminoácidos 192-340 de la poliproteína del VHC) y E2 (aminoácidos 384-680 de la poliproteína del VHC) como antígenos para la estimulación de las células.
Figura 5. Respuesta de secreción de IFN gamma contra proteínas del VHC en esquema de inmunización con diferentes antígenos quiméricos. Los resultados se muestran en el eje de las Y como Spots netos por millón de células, que se define como el número de spots detectados en la condición de estimulación menos el numero de spots detectado en la condición de no
estimulación, determinada en un ensayo de ELISPOT de secreción de IFN gamma. En el eje de las X se muestran los diferentes inmunógenos administrados a los ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de la media de los animales de un mismo grupo. La respuesta evaluada se detectó empleando variantes recombinantes de la proteína Core (aminoácidos 1-120 de la proteína de la cápsida), El (aminoácidos 192-340 de la poliproteína del VHC) y E2 (aminoácidos 384-680 de la poliproteína del VHC) como antígenos para la estimulación de las células.
Figura 6. Respuesta frente al reto viral en esquema de inmunización con diferentes antígenos quiméricos. Los resultados se muestran en el eje de las Y como el logaritmo del título viral, que se define como el logaritmo del número de unidades formadoras de placas por mL, detectadas en ovarios de ratones hembras después del reto viral. Para el reto viral se emplearon los virus wRE, virus vaccinia que expresa los antígenos Core, El y E2 (región aminoácidos 1-650 en la poliproteína del VHC) y WR, virus vaccinia que no expresa antígenos del VHC. En el eje de las X se muestran los diferentes inmunógenos administrados a los ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de la media de los animales de un mismo grupo.
Figura 7. Respuesta de anticuerpos contra proteínas del VHC en esquema de inmunización con Eql mezclada con NS3. Los resultados se muestran en el eje de las Y como el recíproco del título de anticuerpos, determinado por ELISA. En el eje de las X se muestran los diferentes inmunógenos administrados a los ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de la media de los animales de un mismo grupo. La respuesta evaluada se detectó empleando variantes recombinantes de la proteína Core (aminoácidos 1-120 de la proteína de la cápsida), El (aminoácidos 192-340 de la poliproteína del VHC), E2 (aminoácidos 384-680 de la poliproteína del VHC) y NS3 (aminoácidos 1192 al 1457 en la poliproteína del VHC) como antígenos de recubrimiento en el ELISA.
Figura 8. Respuesta proliferativa contra proteínas del VHC en esquema de inmunización con Eql mezclada con NS3. Los resultados se muestran en el eje de las Y como el índice de estimulación, determinado en un ensayo de citometría mediante tinción con CFSE. El índice de estimulación superior a dos se considera como respuesta positiva. En el eje de las X se muestran los diferentes inmunógenos administrados a los ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de la media de los animales de un mismo grupo. La respuesta evaluada se detectó empleando variantes recombinantes de la proteína Core (aminoácidos 1-120 de la proteína de la cápsida), El (aminoácidos 192-340 de la poliproteína del VHC), E2 (aminoácidos 384-680 de la poliproteína del VHC) y NS3 ((aminoácidos 1192 al 1457 en la poliproteína del VHC) como antígenos para la estimulación de las células.
Figura 9. Respuesta de secreción de IFN gamma contra proteínas del VHC en esquema de inmunización con Eql mezclada con NS3. Los resultados se muestran en el eje de las Y
como Spots netos por millón de células, determinado en un ensayo de ELISPOT de secreción de IFN gamma. En el eje de las X se muestran los diferentes inmunógenos administrados a los ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de la media de los animales de un mismo grupo. La respuesta evaluada se detectó empleando variantes recombinantes de la proteína Core (aminoácidos 1-120 de la proteína de la cápslda), El (aminoácidos 192-340 de la pollproteína del VHC), E2 (aminoácidos 384-680 de la pollproteína del VHC) y NS3 (aminoácidos 1192 al 1457 en la pollproteína del VHC) como antígenos para la estimulación de las células.
Figura 10. Respuesta frente al reto viral en esquema de Inmunización con Eql mezclada con NS3. Los resultados se muestran en el eje de las Y como el logaritmo del título viral. Para el reto viral se emplearon los virus wRE y WR. En el eje de las X se muestran los diferentes Inmunógenos administrados a los ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de la media de los animales de un mismo grupo.
Figura 11. Respuesta de anticuerpos contra proteínas del VHC en esquema de inmunización con Eql combinado con plasmldio para la inmunización con ADN. Los resultados se muestran en el eje de las Y como el recíproco del título de anticuerpos, determinado por ELISA. En el eje de las X se muestran los diferentes Inmunógenos administrados a los ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de la media de los animales de un mismo grupo. La respuesta evaluada se detectó empleando variantes recombinantes de la proteína Core (aminoácidos 1-120 de la proteína de la cápsida), El (aminoácidos 192-340 de la pollproteína del VHC) y E2 (aminoácidos 384-680 de la pollproteína del VHC) como antígenos de recubrimiento en el ELISA.
Figura 12. Respuesta proliferativa contra proteínas del VHC en esquema de inmunización con Eql combinado con plasmldio para la inmunización con ADN. Los resultados se muestran en el eje de las Y como el índice de estimulación, determinado en un ensayo de cltometría mediante tinción con CFSE. El índice de estimulación superior a dos se considera como respuesta positiva. En el eje de las X se muestran los diferentes inmunógenos administrados a los ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de la media de los animales de un mismo grupo. La respuesta evaluada se detectó empleando variantes recomblnantes de la proteína Core (aminoácidos 1-120 de la proteína de la cápsida), El (aminoácidos 192-340 de la pollproteína del VHC) y E2 (aminoácidos 384-680 de la pollproteína del VHC), como antígenos para la estimulación de las células.
Figura 13. Respuesta de secreción de IFN gamma contra proteínas del VHC en esquema de inmunización con Eql combinado con plasmldio para la inmunización con ADN. Los resultados se muestran en el eje de las Y como Spots netos por millón de células, determinados en un ensayo de ELISPOT de secreción de IFN gamma. En el eje de las X se muestran los diferentes inmunógenos administrados a los ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación
estándar de la media de los animales de un mismo grupo. La respuesta evaluada se detectó empleando variantes recombinantes de la proteína Core (aminoácidos 1-120 de la proteína de la cápsida), El (aminoácidos 192-340 de la poliproteína del VHC) y E2 (aminoácidos 384-680 de la poliproteína del VHC), como antígenos para la estimulación de las células.
Figura 14. Respuesta frente al reto viral en esquema de inmunización con Eql combinado con plasmidio para la inmunización con ADN. Los resultados se muestran en el eje de las Y como el logaritmo del título viral, detectado en ovarios de ratones hembras después del reto viral. Para el reto viral se emplearon los virus wRE y WR. En el eje de las X se muestran los diferentes inmunógenos administrados a los ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de la media de los animales de un mismo grupo.
Figura 15. Respuesta de anticuerpos contra proteínas del VHC en esquema de inmunización con Eql mezclada con variantes recombinantes de proteínas estructurales del VHC. Los resultados se muestran en el eje de las Y como el recíproco del título de anticuerpos, determinado por ELISA. En el eje de las X se muestran los diferentes inmunógenos administrados a los ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de la media de los animales de un mismo grupo. La respuesta evaluada se detectó empleando variantes recombinantes de la proteína Core (aminoácidos 1-120 de la proteína de la cápsida), El (aminoácidos 192-340 de la poliproteína del VHC) y E2 (aminoácidos 384-680 de la poliproteína del VHC), como antígenos de recubrimiento en el ELISA.
Figura 16. Respuesta proliferativa contra proteínas del VHC en esquema de inmunización con Eql mezclada con variantes recombinantes de proteínas estructurales del VHC. Los resultados se muestran en el eje de las Y como el índice de estimulación, determinado en un ensayo de citometría mediante tinción con CFSE. El índice de estimulación superior a dos se considera como respuesta positiva. En el eje de las X se muestran los diferentes inmunógenos administrados a los ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de la media de los animales de un mismo grupo. La respuesta evaluada se detectó empleando variantes recombinantes de la proteína Core (aminoácidos 1-120 de la proteína de la cápsida), El (aminoácidos 192-340 de la poliproteína del VHC) y E2 (aminoácidos 384-680 de la poliproteína del VHC), como antígenos para la estimulación de las células.
Figura 17. Respuesta de secreción de IFN gamma contra proteínas del VHC en esquema de inmunización con Eql mezclada con variantes recombinantes de proteínas estructurales del VHC. Los resultados se muestran en el eje de las Y como Spots netos por millón de células, determinado en un ensayo de ELISPOT de secreción de IFN gamma. En el eje de las X se muestran los diferentes inmunógenos administrados a los ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de la media de los animales de un mismo grupo. La respuesta evaluada se
detectó empleando variantes recombinantes de la proteína Core (aminoácidos 1-120 de la proteína de la cápsida), El (aminoácidos 192-340 de la poliproteína del VHC) y E2 (aminoácidos 384-680 de la poliproteína del VHC), como antígenos para la estimulación de las células.
Figura 18. Respuesta frente al reto viral en esquema de inmunización con Eql mezclada con variantes recombinantes de proteínas estructurales del VHC. Los resultados se muestran en el eje de las Y como el logaritmo del título viral, detectado en ovarios de ratones hembras después del reto viral. Para el reto viral se emplearon los virus wRE y WR. En el eje de las X se muestran los diferentes inmunógenos administrados a los ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de la media de los animales de un mismo grupo.
Figura 19. Respuesta de anticuerpos contra proteínas del VHC en esquema de inmunización con diferentes antígenos quiméricos que incluyen epítopos artificiales y de la proteína NS3. Los resultados se muestran en el eje de las Y como el recíproco del título de anticuerpos, determinado por ELISA. En el eje de las X se muestran los diferentes inmunógenos administrados a los ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de la media de los animales de un mismo grupo. La respuesta evaluada se detectó empleando variantes recombinantes de la proteína Core (aminoácidos 1-120 de la proteína de la cápsida), El (aminoácidos 192-340 de la poliproteína del VHC), E2 (aminoácidos 384-680 de la poliproteína del VHC) y NS3 ((aminoácidos 1192 al 1457 en la poliproteína del VHC), como antígenos de recubrimiento en el ELISA.
Figura 20. Respuesta proliferativa contra proteínas del VHC en esquema de inmunización con diferentes antígenos quiméricos que incluyen epítopos artificiales y de la proteína NS3. Los resultados se muestran en el eje de las Y como el índice de estimulación, determinado en un ensayo de citometría mediante tinción con CFSE. En el eje de las X se muestran los diferentes inmunógenos administrados a los ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de la media de los animales de un mismo grupo. La respuesta evaluada se detectó empleando variantes recombinantes de la proteína Core (aminoácidos 1-120 de la proteína de la cápsida), El (aminoácidos 192-340 de la poliproteína del VHC), E2 (aminoácidos 384-680 de la poliproteína del VHC) y NS3 ((aminoácidos 1192 al 1457 en la poliproteína del VHC), como antígenos para la estimulación de las células.
Figura 21. Respuesta de secreción de IFN gamma contra proteínas del VHC en esquema de inmunización con diferentes antígenos quiméricos que incluyen epítopos artificiales y de la proteína NS3. Los resultados se muestran en el eje de las Y como Spots netos por millón de células, determinados en un ensayo de ELISPOT de secreción de IFN gamma. En el eje de las X se muestran los diferentes inmunógenos administrados a los ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de la media de los animales de un mismo grupo. La respuesta evaluada se detectó empleando variantes recombinantes de la proteína Core (aminoácidos 1-120 de
la proteína de la cápsida), El (aminoácidos 192-340 de la poliproteína del VHC), E2 (aminoácidos 384-680 de la poliproteína del VHC) y NS3 (aminoácidos 1192 al 1457 en la poliproteína del VHC), como antígenos para la estimulación de las células.
Figura 22. Respuesta frente al reto viral en esquema de inmunización con diferentes antígenos quiméricos que incluyen epítopos artificiales y de la proteína NS3. Los resultados se muestran en el eje de las Y como el logaritmo del título viral, detectado en ovarios de ratones hembras después del reto viral. Para el reto viral se emplearon los virus vvRE y WR. En el eje de las X se muestran los diferentes inmunógenos administrados a los ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de la media de los animales de un mismo grupo.
Figura 23. Respuesta de anticuerpos contra proteínas del VHC en esquema de inmunización con antígenos quiméricos Eql y Eqlb. Los resultados se muestran en el eje de las Y como el recíproco del título de anticuerpos, determinado por ELISA. En el eje de las X se muestran los diferentes inmunógenos administrados a los ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de la media de los animales de un mismo grupo. La respuesta evaluada se detectó empleando variantes recombinantes de la proteína Core (aminoácidos 1-120 de la proteína de la cápsida), El (aminoácidos 192-340 de la poliproteína del VHC) y E2 (aminoácidos 384-680 de la poliproteína del VHC), como antígenos de recubrimiento en el ELISA.
Figura 24. Respuesta proliferativa contra proteínas del VHC en esquema de inmunización con antígenos quiméricos Eql y Eqlb. Los resultados se muestran en el eje de las Y como el índice de estimulación, determinado en un ensayo de citometría mediante tinción con CFSE. El índice de estimulación superior a dos se considera como respuesta positiva. En el eje de las X se muestran los diferentes inmunógenos administrados a los ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de la media de los animales de un mismo grupo. La respuesta evaluada se detectó empleando variantes recombinantes de la proteína Core (aminoácidos 1-120 de la proteína de la cápsida), El (aminoácidos 192-340 de la poliproteína del VHC) y E2 (aminoácidos 384-680 de la poliproteína del VHC), como antígenos para la estimulación de las células.
Figura 25. Respuesta frente al reto viral en esquema de inmunización con antígenos quiméricos Eql y Eqlb. Los resultados se muestran en el eje de las Y como el logaritmo del título viral, detectado en ovarios de ratones hembras después del reto viral. Para el reto viral se emplearon los virus vvRE y WR. En el eje de las X se muestran los diferentes inmunógenos administrados a los ratones BALB/c. Las barras de error muestran la desviación estándar de la media de los animales de un mismo grupo.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
EJEMPLOS
EJEMPLO 1
Obtención de diferentes antíaenos quimericos aue comprenden eoítopos del VHC
Como se muestra en las Figuras 1A a 1H, se obtuvieron los plasmidios pIMCo64K (SEQ ID No. 1), pIME64K (SEQ ID No. 2), pIME164K (SEQ ID No. 3), pINSE64K (SEQ ID No. 4), pIENSb (SEQ ID No. 5), pIENS3 (SEQ ID No. 6), pIMPlE64K (SEQ ID No. 7), pIME64Kb (SEQ ID No. 8). Estos plasmidios permiten la expresión en Escherichia coli de los antígenos quiméricos Coql (SEQ ID No. 9), Eql (SEQ ID No. 10), Elql (SEQ ID No. 11), NSEq2 (SEQ ID No. 12), EqNSb (SEQ ID No. 13), EqNS3 (SEQ ID No. 14), EqPl (SEQ ID No. 15) y Eqlb (SEQ ID No. 16), respectivamente, representados en la Figura 2. En todos los casos, con excepción del antígeno Eqlb (cuya secuencia proviene de la variante VHC H77 de genotipo la), la secuencia de aminoácidos provino de un aislamiento VHC de genotipo Ib (González-Horta EE, Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2011; 15 (11): 1320-7).
Como se muestra en las Figuras 2A a 2H, el antígeno quimérico Coql (SEQ ID No. 9) comprende las regiones Core (aminoácidos 1-50), El (aminoácidos 190-222) y E2 (aminoácidos 408-540) de la poliproteína del VHC, dispuestas en ese orden, particularmente. El antígeno quimérico Eql (SEQ ID No. 10) comprende, igualmente, las regiones E2 (aminoácidos 408-540), El (aminoácidos 190-222) y Core (aminoácidos 1-50) de la poliproteína del VHC, pero en ese orden particular. El antígeno quimérico Elql (SEQ ID No. 11) comprende las mismas regiones, pero en el orden El (aminoácidos 190-222), E2 (aminoácidos 408-540) y Core (aminoácidos 1-50) de la poliproteína del VHC. El antígeno quimérico NSEq2 (SEQ ID No. 12) incluye los epítopos P2B y P1M, en ese orden, insertados en Eql, entre las regiones de El (aminoácidos 190-222) y Core (aminoácidos 1-50). Por otro lado, el antígeno quimérico EqNSb (SEQ ID No. 13) incluye el epítopo P2B insertado en Eql entre las regiones de El (aminoácidos 190-222) y Core (aminoácidos 1-50). El antígeno quimérico EqNS3 (SEQ ID No. 14) incluye la región de aminoácidos 1242-1415 en la poliproteína del VHC, insertada entre las regiones de El (aminoácidos 190-222) y Core (aminoácidos 1-50) del antígeno quimérico Eql. El antígeno quimérico EqPl (SEQ ID No. 15) incluye el epítopo P1M insertado en Eql, entre las regiones de El (aminoácidos 190-222) y Core (aminoácidos 1-50). El antígeno quimérico Eqlb (SEQ ID No. 16) comprende las regiones E2 (aminoácidos 408-540), El (aminoácidos 190-222) y Core (aminoácidos 1-50) de la poliproteína del VHC, en ese orden particular, pero en este caso la secuencia de aminoácidos corresponde a la de la variante H77 del VHC de genotipo la (NCBI Reference Sequence: NC_004102.1).
Los epítopos artificiales P1M y P2B, incluidos en algunas de los antígenos quiméricos, se diseñaron por bioinformática, para ser reconocidos por linfocitos T auxiliadores humanos. Se estudiaron los motivos de unión a HLA-DR13 y HLA-DR11, usando los programas Rankpep, SYFPETHI y ProPred, para proponer las variantes de aminoácidos por posición en los epítopos artificiales, de acuerdo principalmente a la frecuencia de aparición. Se describen como epítopos artificiales para linfocitos T auxiliadores los epítopos P1M, de 14 aminoácidos, cuya secuencia es LPEYVIMVKLPSRA (SEQ ID No. 17); y P2B, de 15 aminoácidos, cuya secuencia es GYKVIVLN PRVASTL (SEQ ID No. 18).
Para la expresión de los antígenos proteicos recombinantes se transformaron células competentes de la cepa de £ coli GC-366 con los respectivos plasmidios. La expresión de las proteínas recombinantes se desarrolló durante 12 h a 37 grados Celsius, empleando medio mínimo para los cultivos celulares. Todos los antígenos proteicos contienen en el extremo N-terminal un fragmento estabilizador de la expresión, proveniente de la proteína P64K de Neisseria meningitidis, previamente conocido para esta función (Yero D y cois., Biotechnol Appl Biochem. 2006; 44 (Pt l):27-34). Por otra parte, las variantes proteicas comprenden en el extremo C-terminal una cola de 6 Histidinas, con el objetivo de facilitar su purificación. De hecho, las proteínas se purificaron mediante solubilización de la fracción insoluble proveniente de la ruptura celular con tampón carbonato-bicarbonato pH 9,6, Urea 8M, y posterior cromatografía de afinidad por quelatos metálicos.
EJEMPLO 2
Estudio de inmunoaenicidad en ratones de diferentes antígenos quiméricos que comprenden epítopos del VHC
Se inmunizaron ratones BALB/c, hembras de 8 semanas, de 16-18 g de peso, 17 animales por grupo. Los grupos de inmunización fueron los siguientes: Grupo 1, antígeno quimérico Coql adyuvado en alúmina; Grupo 2, antígeno Elql adyuvado en alúmina; Grupo 3, antígeno Eql adyuvado en alúmina; Grupo 4, alúmina (grupo control). En todos los casos se administraron 20 mg de antígeno recombinante. Las inmunizaciones se realizaron en las semanas 0, 2 y 4, por inyección intramuscular.
Se realizaron extracciones de sangre en las semanas 0 y 6 para estudiar la respuesta de anticuerpos contra los antígenos del VHC. Además, se sacrificaron 5 ratones por grupo, en la semana 6, para el estudio de la respuesta celular específica. Adicionalmente, 5 animales por grupo se retaron con virus vaccinia recombinante vvRE (Alvarez-Lajonchere y cois., Bioteenología Aplicada 2007; 24 (3-4): 246-253), que expresa los antígenos estructurales del VHC, y otros 5 animales con el virus vaccinia control WR, en la semana 6. Cinco días después, los ratones se sacrificaron, y se
determinó el título viral en ovarios, como se ha descrito previamente (Alvarez-Lajonchere y cois., Biotechnol Appl Biochem. 2008; 51 (Pt 2):97-105).
La respuesta inmune específica contra los antígenos del VHC se muestra en las Figuras 3 a la Figura 5. La respuesta evaluada se detectó empleando variantes recombinantes de la proteína Core (aminoácidos 1-120 de la proteína de la cápsida, Alvarez-Obregon JC y cois. Vaccine 2001; 19: 3940-3946), El (aminoácidos 192-340 de la poliproteína del VHC, Lorenzo U y cois., Biotechnol Appl Biochem 2000; 32(2): 137-143), y E2 (aminoácidos 384-680 de la poliproteína del VHC, Martinez-Donato y cois., Mol Biotechnol. 2007; 35(3): 225-36) como antígenos de recubrimiento en el ELISA, o como antígenos para la estimulación en los ensayos de respuesta celular. Como se aprecia en la Figura 3, la respuesta de anticuerpos contra los antígenos estructurales del VHC fue superior en el grupo inmunizado con Eql (yCKO.0001; Prueba de Kruskal Wallis y Prueba de comparaciones múltiples de Dunn), contra todos los antígenos evaluados. Un comportamiento similar se apreció para la respuesta linfoproliferativa (Figura 4) y de células secretoras de IFN gamma (Figura 5), respectivamente. Adicionalmente, como se muestra en la Figura 6, el grupo inmunizado con la proteína Eql fue el único capaz de controlar significativamente la viremia específica (reto con vvRE), en el modelo de reto con virus sustituto (¿?=0.0069, Prueba de Kruskal Wallis y Prueba de comparaciones múltiples de Dunn).
Estos resultados evidencian la capacidad del antígeno quimérico Eql para inducir una respuesta inmune específica, tanto humoral como celular, contra varios antígenos del VHC, con actividad funcional in vivo, pues resulta capaz de proteger frente al modelo de reto con virus sustituto. Adicionalmente, se evidencia que el orden en que se ubican las regiones seleccionadas de los antígenos estructurales del VHC, en los antígenos quiméricos, resulta crítico para la inducción de respuesta inmune, y para el desarrollo de una respuesta funcionalmente protectora en un modelo de reto, pues las variantes Coql y Elql no indujeron este tipo de respuesta. Por tanto, no basta con que los epítopos estén presentes en el antígeno quimérico, deben estar en el contexto adecuado.
EJEMPLO 3.
Estudio de inmunoaenicidad en ratones del antígeno Eql mezclado con NS3
Se inmunizaron ratones BALB/c, hembras de 8 semanas, 16-18 g de peso, 17 animales por grupo. Los grupos de inmunización fueron los siguientes: Grupo 1, antígeno Eql adyuvado en alúmina; Grupo 2, antígeno Eql mezclado con proteína recombinante NS3 (Palenzuela D et al., Bioteenología Aplicada 2006; 23: 94-98) adyuvados en alúmina; Grupo 3, proteína recombinante NS3 adyuvada en alúmina; Grupo 4, alúmina (grupo control). Se administraron 20 pg de antígeno quimérico recombinante Eql y 10 mg de proteína recombinante NS3 en los grupos correspondientes. Las inmunizaciones se realizaron en las semanas 0, 2 y 4, por inyección
intramuscular.
Se realizaron extracciones de sangre en las semanas 0 y 6, para estudiar la respuesta de anticuerpos contra los antígenos del VHC. Además, se sacrificaron 5 ratones por grupo en la semana 6, para el estudio de la respuesta celular específica. Adicionalmente, 5 animales por grupo fueron retados con virus vaccinia recomblnante vvRE, que expresa los antígenos estructurales del VHC, y otros 5 animales con el virus vaccinia control WR, en la semana 6. Cinco días después los ratones fueron sacrificados y se determinó el título viral en ovarios como se ha descrito previamente.
La respuesta inmune específica contra los antígenos del VHC se muestra en las Figuras 7 a la Figura 9. La respuesta evaluada se detectó empleando variantes recombinantes de la proteína Core (aminoácidos 1-120 de la proteína de la cápsida, El (aminoácidos 192-340 de la pollproteína del VHC), E2 (aminoácidos 384-680 de la poliproteína del VHC), y NS3 (aminoácidos 1192 al 1457 en la poliproteína del VHC), como antígenos de recubrimiento en el ELISA, o como antígenos para la estimulación en los ensayos de respuesta celular. Como se aprecia en la Figura 7, se induce respuesta de anticuerpos contra los antígenos estructurales del VHC en los grupos inmunizados con Eql de forma individual o mezclada con NS3, sin diferencias estadísticamente significativas entre ellos. En cambio, la respuesta de Acs contra NS3 fue significativamente superior en el grupo de la mezcla de NS3 con Eql (p= 0.0001, Prueba de Mann Whitncy).
Por otra parte, el análisis de la respuesta proliferativa, representada en la Figura 8, evidenció una respuesta significativamente superior contra los antígenos Core, E2 y NS3, en el grupo administrado con la mezcla de Eql con NS3, con respecto a la administración de las variantes individuales (,cx0.05, ANOVA y Prueba de comparaciones múltiples de Newman-Keuls). No se apreció diferencia estadísticamente significativa entre los grupos inmunizados con Eql individual o mezclada con NS3 con relación a la respuesta contra el antígeno El.
Con relación a la respuesta de células T secretoras de IFN gamma, que se representa en la Figura 9, se indujo respuesta específica de este tipo, existiendo diferencias estadísticamente significativa entre las variantes inmunizadas con las proteínas recombinantes, solo con relación al antígeno E2, que mostró una respuesta significativamente superior en el grupo inmunizado con la mezcla de Eql con NS3 ( <0.05, ANOVA y Prueba de comparaciones múltiples de Newman-Keuls).
Adicionalmente, como se muestra en la Figura 10, tanto el grupo inmunizado con la proteína Eql de forma individual como mezclada con NS3 controlaron significativamente la viremia específica (reto con vvRE), en el modelo de reto con virus sustituto, ( <0.05, Prueba de Kruskal Wallis y Prueba de comparaciones múltiples de Dunn).
Estos resultados evidencian que la preparación basada en la mezcla del antígeno Eql con NS3 resulta capaz de inducir una respuesta inmune específica incrementada, tanto humoral
como celular, contra los antígenos estructurales y NS3 del VHC, con actividad funcional ¡n vivo, pues resulta capaz de proteger frente al modelo de reto con virus sustituto.
EJEMPLO 4.
Estudio de inmunoqenicidad en ratones del antíaeno quimerico Eal mezclado con un plasmidio para la inmunización con ADN
Se inmunizaron ratones BALB/c, hembras de 8 semanas, 16-18 g de peso, 17 animales por grupo. Los grupos de inmunización fueron los siguientes: Grupo 1, antígeno Eql adyuvado en alúmina; Grupo 2, antígeno Eql mezclado con el plasmidio para la inmunización con ADN pIDKE2 (Dueñas-Carrera y cois., Biotechnol Appl Biochem. 2004; 39: 249-55) en solución salina; Grupo 3, antígeno Eql mezclado con el plasmidio pIDKE2 y con la proteína recombinante Co.120 (Dueñas-Carrera y cois., Bioteenología Aplicada 1999; 16(4), 226-231) en solución salina; Grupo 4, proteína recombinante Co.120 mezclada con el plasmidio pIDKE2 en solución salina, en las semanas 0 y 3, con una dosis de antígeno quimérico Eql adyuvado en alúmina en la semana 6; Grupo 5, plasmidio pIDKE2 en solución salina en las semanas 0, 3 y 6; Grupo 6, alúmina (control); Grupo 7, solución salina (control). Se administraron 20 mg de antígeno quimérico Eql y 10 pg de proteína recombinante Co.120 en los grupos correspondientes. Se administraron 100 pg del plasmidio pIDKE2. Las inmunizaciones se realizaron en las semanas 0, 3 y 6 por inyección intramuscular.
Se realizaron extracciones de sangre en las semanas 0 y 8, para estudiar la respuesta de anticuerpos contra los antígenos del VHC. Además, se sacrificaron 5 ratones por grupo en la semana 8 para el estudio de la respuesta celular específica. Adicionalmente, 5 animales por grupo fueron retados con virus vaccinia recombinante wRE, que expresa los antígenos estructurales del VHC, y otros 5 animales con el virus vaccinia control WR, en la semana 8. Cinco días después los ratones fueron sacrificados y se determinó el título viral en ovarios como se ha descrito previamente.
La respuesta inmune específica contra los antígenos del VHC se muestra en las Figuras 11 a la Figura 13. La respuesta evaluada se detectó empleando variantes recombinantes de la proteína Core (aminoácidos 1-120 de la proteína de la cápsida), El (aminoácidos 192-340 de la poliproteína del VHC) y E2 (aminoácidos 384-680 de la poliproteína del VHC), como antígenos de recubrimiento en el ELISA, o como antígenos para estimulación en los ensayos de respuesta celular. Como se aprecia en la Figura 11, se induce respuesta de anticuerpos contra los antígenos estructurales del VHC en todos los grupos inmunizados, con excepción de los controles. Se indujo una respuesta significativamente superior de anticuerpos contra los antígenos El y E2 en el grupo inmunizado con la mezcla de las proteínas Eql y Co.120 con el plasmidio pIDKE2, con relación al
grupo inmunizado con el plasmidio pIDKE2 solo (/X0.05, Prueba de Kruskal Wallis y Prueba de comparaciones múltiples de Dunn). Igualmente, se apreciaron diferencias estadísticamente significativas entre estos dos grupos con relación a la respuesta proliferativa (Figura 12), inducida contra Core, El y E2 ( <0.05, Prueba de Kruskal Wallis y Prueba de comparaciones múltiples de Dunn). De hecho, el grupo inmunizado con la mezcla de las proteínas Eql y Co.120 con el plasmidio pIDKE2 indujo una respuesta proliferativa contra los antígenos El y E2 significativamente superior a la inducida por el resto de los grupos ( <0.05, ANOVA y Prueba de comparaciones múltiples de Newman-Keuls), con excepción del inmunizado en esquema sensibilización/recuerdo (Grupo 4).
Con relación a la respuesta de células secretoras de IFN gamma, todos los grupos indujeron respuesta inmune (Figura 13) contra los antígenos estructurales del VHC (con excepción de los controles). No se detectaron diferencias estadísticamente significativas en las respuestas contra los antígenos El y E2 entre los grupos inmunizados con las variantes inmunogénicas, con excepción de la superioridad observada (¿xO.05, ANOVA y Prueba de comparaciones múltiples de Newman-Keuls) en la respuesta inducida contra el antígeno E2, en el grupo inmunizado con Eql de forma individual (Grupo 1) con relación al grupo inmunizado con pIDKE2 solo (Grupo 5). Sin embargo, la respuesta de células secretoras de IFN gamma contra el antígeno del Core fue significativamente superior en el grupo inmunizado con la mezcla de las proteínas Eql y Co.120 con el plasmidio pIDKE2, con relación al resto de los grupos ( <0.05; ANOVA y Prueba de comparaciones múltiples de Newman-Keuls), con excepción del grupo inmunizado en esquema sensibilización/recuerdo (Grupo 4).
Adicionalmente, todos los grupos que comprendían la administración del antígeno quimérico Eql (Grupos del 1 al 4) fueron capaces de controlar significativamente la viremia específica (reto con vvRE) en el modelo de reto (Figura 14) con virus sustituto ( <0.05, Prueba de Kruskal Wallis y Prueba de comparaciones múltiples de Dunn), no así el resto de los grupos.
Los resultados evidencian que una composición vacunal basada en la administración de Eql mezclada con el plasmidio pIDKE2 y la proteína Co.120, o en esquemas de sensibilización/recuerdo, permite la inducción de una respuesta inmune específica incrementada, tanto humoral como celular, contra los antígenos estructurales del VHC, con actividad funcional in vivo, pues resulta capaz de proteger frente al modelo de reto con virus sustituto.
EJEMPLO 5.
Estudio de inmunoqenicidad en ratones del antíaeno quimerico Eal mezclado con variantes proteicas recombinantes de los antíaenos estructurales del VHC
Se inmunizaron ratones BALB/c, hembras de 8 semanas, 16-18g de peso, 17 animales por grupo. Los grupos de inmunización fueron los siguientes: Grupo 1, antígeno Eql adyuvado en alúmina; Grupo 2, mezcla de proteínas Co.120, El.340 (Lorenzo U y cois., Biotechnol Appl Biochem 2000; 32(2): 137-143) y E2.680 (Martinez-Donato y cois., Mol Biotechnol. 2007; 35(3): 225-36), adyuvadas en alúmina en las semanas 0 y 2, con dosis del antígeno quimérico Eql adyuvado en alúmina en la semana 4; Grupo 3, antígeno quimérico Eql adyuvado en alúmina en la semana 0, y dosis de la mezcla de proteínas Co.120, El.340 y E2.680, adyuvadas en alúmina, en las semanas 2 y 4; Grupo 4, mezcla de las proteínas Co.120, El.340, E2.680 y Eql, adyuvadas en alúmina; Grupo 5, mezcla de las proteínas Co.120, El.340 y E2.680, adyuvadas en alúmina; Grupo 6, alúmina (control). Se administraron 20 mg de antígeno quimérico Eql; 16,7 pg de las proteínas El y E2, así como 0.1 pg de proteína Co.120, en los grupos correspondientes. Las inmunizaciones se realizaron en las semanas 0, 2 y 4 por inyección intramuscular.
Se realizaron extracciones de sangre en las semanas 0 y 6, para estudiar la respuesta de anticuerpos contra los antígenos del VHC. Además, se sacrificaron 5 ratones por grupo en la semana 6, para el estudio de la respuesta celular específica. Adicionalmente, 5 animales por grupo fueron retados con virus vaccinia recombinante wRE, que expresa los antígenos estructurales del VHC, y otros 5 animales con el virus vaccinia control WR, en la semana 6. Cinco días después los ratones fueron sacrificados y se determinó el título viral en ovarios, como se ha descrito previamente.
La respuesta inmune específica contra los antígenos del VHC se muestra en las Figuras 15 a la 17. La respuesta evaluada se detectó empleando variantes recombinantes de la proteína Core (aminoácidos 1-120 de la proteína de la cápsida), El (aminoácidos 192-340 de la poliproteína del VHC) y E2 (aminoácidos 384-680 de la poliproteína del VHC), como antígenos de recubrimiento en el ELISA, o como antígenos para estimulación en los ensayos de respuesta celular. Como se aprecia en la Figura 15, todos los grupos inmunizados, con excepción de los controles, indujeron respuesta de anticuerpos contra los antígenos estructurales del VHC. No existieron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos en cuanto a la respuesta de anticuerpos contra la proteína Core. En cambio, los grupos inmunizados con la mezcla de proteínas estructurales (Grupo 5) y el grupo inmunizado con la mezcla de las proteínas estructurales + Eq 1 (Grupo 4) tuvieron una respuesta de anticuerpos contra El y E2 significativamente superior al grupo inmunizado con la proteína Eql de forma individual (/xO.05, Prueba de Kruskal Wallis y Prueba de
comparaciones múltiples de Dunn).
Por otra parte, se indujo respuesta proliferativa contra los antígenos del VHC en todos los grupos, con excepción del control, como se observa en la Figura 16. No se apreciaron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos que recibieron las variantes inmunogénicas con respecto a la respuesta proliferativa contra los antígenos El y E2. En cambio, todos los grupos que recibieron antígeno quimérico Eql, en cualquiera de las combinaciones (Grupos 1 al 4), indujeron una respuesta proliferativa contra Core significativamente superior a la inducida por la mezcla de proteínas estructurales del VHC (Grupo 5) (/7<0.05, ANOVA y Prueba de comparaciones múltiples de Newman-Keuls).
Como se aprecia en la Figura 17, la respuesta de células secretoras de IFN gamma tuvo un comportamiento similar al observado para la respuesta proliferativa. En este caso, el grupo inmunizado con la mezcla de proteínas estructurales del VHC (grupo 5) tuvo una respuesta de células secretoras de IFN gamma contra Core significativamente inferior a la inducida en los grupos inmunizados con el antígeno quimérico Eql solo (Grupo 1) y la mezcla de Eql con las proteínas estructurales del VHC (Grupo 4) (p<0.05, ANOVA y Prueba de comparaciones múltiples de Newman-Keuls).
Adicionalmente, todos los grupos, con excepción del control, fueron capaces de controlar significativamente la viremia específica (reto con vvRE) en el modelo de reto (Figura 18) con virus sustituto (/c0.05, Prueba de Kruskal Wallis y Prueba de comparaciones múltiples de Dunn).
Los resultados evidencian que una composición vacunal basada en la administración del antígeno quimérico Eql mezclado con una preparación que comprende variantes proteicas recombinantes de los antígenos estructurales Core, El y E2, permite la inducción de una respuesta inmune específica incrementada tanto humoral como celular contra los antígenos estructurales del VHC, con actividad funcional in vivo, pues resulta capaz de proteger frente al modelo de reto con virus sustituto.
EJEMPLO 6.
Estudio de inmunoaenicidad en ratones de diferentes antíaenos quiméricos aue comprenden epítopos del VHC v eoítopos artificiales específicos para linfocitos T
auxiliadores
Se inmunizaron ratones BALB/c, hembras de 8 semanas, 16-18 g de peso, 17 animales por grupo. Los grupos de inmunización fueron los siguientes: Grupo 1, antígeno quimérico Eql adyuvado en alúmina; Grupo 2, antígeno quimérico NSEq2 adyuvado en alúmina;
Grupo 3, antígeno quimérico EqNSb adyuvado en alúmina; Grupo 4, antígeno quimérico EqNS3 adyuvado en alúmina; Grupo 5, antígeno quimérico EqPl adyuvado en alúmina; Grupo 6, alúmina (control). Se administraron 20 mg de los antígenos quiméricos recombinantes, en los grupos correspondientes. Las inmunizaciones se realizaron en las semanas 0, 2 y 4, por inyección intramuscular.
Se realizaron extracciones de sangre en las semanas 0 y 6, para estudiar la respuesta de anticuerpos contra los antígenos del VHC. Además, se sacrificaron 5 ratones por grupo en la semana 6, para el estudio de la respuesta celular específica. Adicionalmente, 5 animales por grupo fueron retados con virus vaccinia recombinante wRE, que expresa los antígenos estructurales del VHC, y otros 5 animales con el virus vaccinia control WR, en la semana 6. Cinco días después, los ratones fueron sacrificados, y se determinó el título viral en ovarios como se ha descrito previamente.
La respuesta inmune específica contra los antígenos del VHC se muestra en las Figuras 19 a la 21. La respuesta evaluada se detectó empleando variantes recombinantes de la proteína Core (aminoácidos 1-120 de la proteína de la cápsida), El (aminoácidos 192-340 de la poliproteína del VHC), E2 (aminoácidos 384-680 de la poliproteína del VHC) y NS3 (aminoácidos 1192 al 1457 en la poliproteína del VHC), como antígenos de recubrimiento en el ELISA, o como antígenos para estimulación en los ensayos de respuesta celular. Como se aprecia en la Figura 19, en todos los grupos, con excepción del control, se indujo una respuesta específica de anticuerpos contra los antígenos estructurales del VHC, sin diferencias estadísticamente significativas entre los grupos inmunizados con los diferentes antígenos quiméricos recombinantes. Solo los grupos 2, 3 y 4, que comprendían regiones de la proteína NS3 del VHC indujeron respuesta de respuesta de anticuerpos contra este antígeno viral, siendo significativamente superior en el Grupo 4 con relación a los Grupos 2 y 3 (¿K0.05, ANOVA y Prueba de comparaciones múltiples de Newman-Keuls).
Como se muestra en la Figura 20, en todos los grupos, con excepción del control, se indujo una respuesta proliferativa específica contra los antígenos estructurales del VHC. En este caso, la respuesta proliferativa inducida contra los antígenos Core y El fue significativamente superior en los Grupos 2, 3 y 5 con respecto al Grupo 1 (p<0.05, ANOVA y Prueba de comparaciones múltiples de Newman-Keuls). No existieron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos inmunizados con los diferentes antígenos quiméricos recombinantes con respecto a la respuesta proliferativa contra la proteína E2. Solo los Grupos 2, 3 y 4, que comprendían regiones de la proteína NS3 del VHC indujeron respuesta proliferativa contra este antígeno viral, siendo significativamente superior en el Grupo 4 con relación a los grupos 2 y 3 (/K0.05, ANOVA y Prueba de comparaciones múltiples de Newman-Keuls).
El análisis de la respuesta de células secretoras de IFN gamma, Figura 21, evidenció
la inducción de respuesta específica de esta naturaleza contra los antígenos estructurales del VHC en todos los grupos, con excepción del control, sin diferencias estadísticamente significativas entre ellos. Solo los Grupos 2, 3 y 4, que comprendían regiones de la proteína NS3 del VHC, indujeron respuesta de células secretoras de IFN gamma contra este antígeno viral, sin diferencias estadísticamente significativas entre ellos.
Adicionalmente, todos los grupos, con excepción del control, fueron capaces de controlar significativamente la viremia específica (reto con vvRE) en el modelo de reto (Figura 22) con virus sustituto (/x0.05, Prueba de Kruskal Wallis y Prueba de comparaciones múltiples de Dunn).
Los resultados evidencian que la inserción de epítopos o regiones de la NS3 en la secuencia de Eql permite la inducción de respuesta inmune específica contra este antígeno viral sin afectar la respuesta inmune contra los antígenos estructurales del VHC. Además, la inclusión de los epítopos artificiales P1M y P2B en la secuencia de la proteína Eql permite incrementar de forma significativa la respuesta inmune proliferativa contra los antígenos Core y El, sin afectar la capacidad para inducir respuesta inmune humoral ni celular contra esos mismos antígenos o la E2, manteniendo la actividad funcional in vivo, pues resulta capaz de proteger frente al modelo de reto con virus sustituto.
EJEMPLO 7.
Estudio de ¡nmunoaenicidad comparativa en ratones de los antíaenos quiméricos Eal v
Ealb
Se inmunizaron ratones BALB/c, hembras de 8 semanas, 16-18 g de peso, 17 animales por grupo. Los grupos de inmunización fueron los siguientes: Grupo 1, antígeno quimérico Eqlb adyuvado en alúmina; Grupo 2, antígeno quimérico Eql adyuvado en alúmina; Grupo 3, alúmina (control). Se administraron 20 mg de los antígenos quiméricos recombinantes, en los grupos correspondientes. Las inmunizaciones se realizaron en las semanas 0, 2 y 4, por inyección intramuscular.
Se realizaron extracciones de sangre en las semanas 0 y 6 para estudiar la respuesta de anticuerpos contra los antígenos del VHC. Además, se sacrificaron 5 ratones por grupo en la semana 6, para el estudio de la respuesta celular específica. Adicionalmente, 5 animales por grupo fueron retados con virus vaccinia recombinante vvRE, que expresa los antígenos estructurales del VHC, y otros 5 animales con el virus vaccinia control WR, en la semana 6. Cinco días después los ratones fueron sacrificados, y se determinó el título viral en ovarios como se ha descrito previamente.
La respuesta inmune específica contra los antígenos del VHC se muestra en las Figuras 23 y 24. La respuesta evaluada se detectó empleando variantes recombinantes de la proteína Core (aminoácidos 1-120 de la proteína de la cápsida), El (aminoácidos 192-340 de la poliproteína del VHC) y E2 (aminoácidos 384-680 de la poliproteína del VHC), como antígenos de recubrimiento en el ELISA, o como antígenos para estimulación en los ensayos de respuesta celular. Como se aprecia en las figuras mencionadas, en los grupos inmunizados con proteínas, no así en el control, se indujo una respuesta específica de anticuerpos y linfoproliferativa contra los antígenos estructurales del VHC, sin diferencias estadísticamente significativas entre los grupos inmunizados con las proteínas recombinantes.
Por otra parte, los grupos inmunizados con los antígenos quiméricos, no así el control, fueron capaces de controlar significativamente la viremia específica (reto con vvRE) en el modelo de reto (Figura 25) con virus sustituto ( KO.05; Prueba de Kruskal Wallis y Prueba de comparaciones múltiples de Dunn), sin diferencias entre los grupos inmunizados con las proteínas recombinantes.
Claims (24)
1. Un antígeno vacunal quimérico contra el virus de la hepatitis C (VHC) que comprende: a) un primer segmento que consiste en la región E2 (aminoácidos 408-540) de la poliproteína del VHC, b) un segundo segmento que consiste en la región El (aminoácidos 190-222) de la poliproteína del VHC, y c) un tercer segmento que consiste en la región Core (aminoácidos 1 al 50) de la poliproteína del VHC, en ese orden.
2. El antígeno vacunal quimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque su secuencia de aminoácidos se selecciona dentro del grupo compuesto por SEQ ID No. 10 (antígeno Eql) y SEQ ID No. 16 (antígeno Eqlb).
3. El antígeno vacunal quimérico de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque además comprende en su secuencia al menos un epítopo específico de linfocitos T auxiliadores.
4. El antígeno vacunal quimérico de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el epítopo específico de linfocitos T auxiliadores es un epítopo de las proteínas no estructurales del VHC.
5. El antígeno vacunal quimérico de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque la proteína no estructural es la proteína NS3.
6. El antígeno vacunal quimérico de conformidad con la reivindicación 5 caracterizado porque su secuencia de aminoácidos es la secuencia identificada como SEQ ID No. 14 (antígeno EqNS3).
7. El antígeno vacunal quimérico de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el epítopo específico de linfocitos T auxiliadores es un epítopo artificial.
8. El antígeno vacunal quimérico de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el epítopo artificial se selecciona del grupo compuesto por el epítopo P1M (SEQ ID No. 17) y el epítopo P2B (SEQ ID No. 18).
9. El antígeno vacunal quimérico de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque su secuencia de aminoácidos es una secuencia que se selecciona dentro del grupo compuesto por SEQ ID No. 12 (antígeno NSEq2), SEQ ID No. 13 (antígeno EqNSb) y SEQ ID No. 15 (antígeno EqPl).
10. Una composición vacunal que comprende un antígeno vacunal quimérico contra el VHC que comprende: a) un primer segmento que consiste en la región E2 (aminoácidos 408-540) de la poliproteína del VHC, b) un segundo segmento que consiste en la región El (aminoácidos 190- 222) de la poliproteína del VHC, y c) un tercer segmento que consiste en la región Core (aminoácidos 1 al 50) de la poliproteína del VHC, en ese orden; y excipientes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables.
11. La composición vacunal de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque comprende el antígeno vacunal quimérico de cualquiera de las reivindicaciones de la 2 a la 9.
12. La composición vacunal de conformidad con las reivindicaciones 10 y 11, caracterizada además porque adicionalmente comprende una variante proteica recombinante de los antígenos estructurales o del antígeno NS3 del VHC.
13. La composición vacunal de conformidad con las reivindicaciones 10 y 11, caracterizada además porque adicionalmente comprende un plasmidio para la inmunización con ADN que expresa los antígenos estructurales del VHC.
14. La composición vacunal de conformidad con las reivindicaciones 10 y 11, caracterizada además porque adicionalmente comprende un plasmidio para la inmunización con ADN que expresa los antígenos estructurales del VHC, y una proteína recombinante de la cápsida del VHC.
15. La composición vacunal de conformidad con las reivindicaciones 10 y 11, caracterizada además porque está adaptada para ser administrable en esquemas de sensibilización/recuerdo con preparaciones basadas en plásmidos para la inmunización con ADN, proteínas recombinantes de los antígenos estructurales del VHC, o una mezcla de ambas.
16. El uso de los antígenos vacunales quiméricos como los que se reclaman en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 9 para la fabricación de una vacuna para la inducción de respuesta inmune contra el VHC.
17. El uso como el que se reclama en la reivindicación 16, en donde dicha vacuna es capaz de proteger in vivo en un modelo de reto con virus sustituto.
18. El uso como el que se reclama en la reivindicación 16, en donde dicha vacuna es capaz de inducir respuesta en individuos sanos o en pacientes infectados por el VHC.
19. El uso como el que se reclama en la reivindicación 16, en donde dicha vacuna está adaptada para ser administrable en esquemas de sensibilización/recuerdo con preparaciones basadas en plásmidos para la inmunización con ADN, proteínas recombinantes de los antígenos estructurales del VHC, o una mezcla de ambas.
20. Un epítopo específico de linfocitos T auxiliadores que se caracteriza porque consiste en la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID No. 17 o SEQ ID No. 18.
21. Un antígeno vacunal quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para usarse en la inducción de respuesta inmune contra el VHC.
22. El antfgeno vacunal quimérico para usarse de conformidad con la reivindicación 21, en donde dicho antígeno es capaz de proteger in vivoe n un modelo de reto con virus sustituido.
23. El antígeno vacunal quimérico para usarse de conformidad con la reivindicación 21, en donde dicho antígeno es capaz de inducir respuesta en individuos sanos o en pacientes infectados por el VHC.
24. El antígeno vacunal quimérico para usarse de conformidad con la reivindicación 21, en donde dicho antígeno está adaptado para ser administrable en esquemas de sensibilización/recuerdo con preparaciones basadas en plásmidos para la inmunización con ADN, proteínas recombinantes de los antígenos estructurales del VHC, o una mezcla de ambas.
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